מיקרוסקופיה ברזולוציית-על

מיקרוסקופיה ברזולוציית-על היא שם כולל לטכניקות המאפשרות קבלת תמונה של מבנים ברזולוציה הגבוהה מהרזולוציה של מיקרוסקופיית אור, אשר מוגבלת על ידי דיפרקציה. המיפוי העדין של מבנים תאיים חושף מידע ביולוגי רב יותר כאשר המבנים אינם מוגבלים על ידי דיפרקציה, ועל כן ניתן לקבל תמונה חדה וברורה יותר, ברמת תתי האברונים.

מיקרוסקופיה ברזולוציית-על מציעה טכניקות שונות כדי להגיע לרזולוציות שבעבר רק מיקרוסקופ אלקטרוני יכול היה להגיע אליהם, תוך כדי יישום של היתרונות השונים בשיטות במערכות ביולוגיות.

ב-2014 קיבלו אריק בציג, ויליאם מורנר וסטפן הל פרס נובל עבור פיתוח שיטות לעקיפת מגבלת דיפרקציית האור למיקרוסקופיה ברזולוציית-על.

רקע
חלק גדול מהידע של תהליכים ביולוגים ברמת התאים ותתי-התאים נבע מהיכולת לתאר אותם בצורה ישירה. בין הטכניקות המיקרוסקופיות השונות, מיקרוסקופיה פלואורוסצנטית היא טכניקה נפוצה בגלל שני יתרונות עיקריים: ניתן לצפות בחלקים ספציפיים של התא בעזרת ניתוח המבנה המולקולרי שלו, ומיקרוסקופיית אור מאפשרת לצפות במבנים תאיים בזמן אמת. בהשוואה לטכניקות הדמיה אחרות כגון מיקרוסקופ אלקטרוני, מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי מוגבל על ידי רזולוציה מרחבית נמוכה יחסית, בשל אינטראקציות בין האור הנראה לבין הסביבה הקרובה והעקיפה של האור.

אפשר להסתכל על מיקרוסקופ אופטי כעל מערכת של עדשות המייצרות תמונה מוגדלת של עצם קטן. בתהליך זה, קרני אור היוצאות מכל הנקודות בעצם מתכנסות לנקודה אחת במישור התמונה. עם זאת, דיפרקציה של האור מונעת את ההתכנסות המדויקת של הקרניים, מה שגורם לנקודה באובייקט להיות מתורגמת לנקודה מטושטשת בגודל סופי בתמונה. ההתפלגות התלת־ממדית של עוצמת התמונה של עצם נקודתי נקראת פונקציית ההתפלגות הנקודתית  (PSF). הגודל של ה-PSF קובע את הרזולוציה של המיקרוסקופ: כאשר המרחק בין שתי נקודות קטן יותר מהרוחב חצי מקסימום (FWHM) של ה-PSF, תתקבל חפיפה בין תמונות שתי הנקודות הגורמת לאיבוד מידע בתמונה.

ה-FWHM של ה-PSF בכיוון הרוחבי (בציר ה-xy המאונך לציר אופטי) מוערך כ- Δxy ≈0.61λ/NA, כאשר λ הוא אורך הגל של האור, ו NA הוא המפתח הנומרי של המטרה המוגדר כ-NA = nsinα, כאשר n הוא מקדם השבירה של התווך ו- α הוא הזווית של חצי קונוס האור הממוקד היוצא מהמטרה. ה-PSF בכיוון הרוחבי (מישור XY) גדול פי 2–3 מהכיוון הצירי (ציר Z) עבור עצמים עם מפתח נומרי רגיל. כאשר עורכים הדמיה בטווח האור הנראה (λ ≈ 550 ננומטר), עבור מטרה קטנה בעלת מפתח נומרי NA = 1.40 יתקבל PSF בגודל רוחבי שקרוב ל 200 ננומטר וגודל צירי הקרוב ל ל-500 ננומטר. עבור עצמית הגדולים מרזולוציה זו, למשל האיברים והרקמות, מגבלת הדיפרקציה אינה משמעותית, עם זאת, כאשר מתמקדים בתאים, אשר בהם מספר רב של מבנים תת-תאיים הקטנים מאורך הגל של האור ויכולים להגיע למספר ננומטרים, מגבלת הדיפרקציה הופכת להיות מכשול להבנת מבנים אלו. מכאן נבע הצורך לפיתוח טכניקות חדשות המאשרות צפייה ברזולוציה גבוהה יותר.

ישנן שתי קבוצות עיקריות של שיטות:

רזולוציית-על דטרמיניסטית (Deterministic super-resolution): פלורופור – הכימיקל הנפוץ ביותר בשימושים של מיקרוסקופ ביולוגי, מגיב בצורה לא ליניארית לעירור, וניתן לנצל תגובה זו כדי לשפר את הרזולוציה. חלק משיטות אלו כוללות את STED ,SSIM,GSD, ו-RESOLFT.

רזולוציית-על סטוכסטית (Stochastic super-resolution): ההרכב הכימי של מקורות אור מולקולריים רבים מאופיינת בהתנהגות מורכבת, וניתן להשתמש בהם כדי לגרום לפלורופורים שונים לפלוט אור בזמנים שונים, ועל ידי כך להבין את המבנה הפנימי של הדגימה. שיטות אלה כוללות תנודות אופטיים ברזולוציה גבוהה (SOFI), שיטות מיקום מולקולה יחידה (SMLM) – כגון SPDM ,PALM,FPALM,STORM ו- dSTORM.

השיטות השונות

מיקרוסקופיה ברזולוציית-על באמצעות תבנית עירור מרחבית
בשיטה זו, כדי להגיע לרזולוציה גבוהה יותר מהרזלוציה שמוגבלת על ידי דיפרקציה, משתמשים במאפיינים השונים של תבנית העירור כדי שניתן יהיה לחלץ מהם מידע בסדר גודל קטן שמתורגם לרזולוציית-על. גישה זו נקראת "תבנית עירור מרחבית", הכוללת חלק מהשיטות הבאות:

מיקרוסקופיה בשיטת דיכוי באמצעות פליטה מאולצת 
עקרון הפעולה של STED הוצע לראשונה בשנת 1994, ולאחר מכן הוכח בניסוי. עקרון הפעולה הכללי הוא שימוש בלייזר (לייזר STED) כדי לדכא את הזהירה של פלורופורים הממוקמים מחוץ למרכז הפוקוס. דיכוי הזהירה מושג על ידי פליטה מאולצת: כאשר פלורופור מעורר נפגש עם פוטון המתאים להפרשי האנרגיה בין מצב היסוד למצב המעורר, הוא יכול לחזור לרמת היסוד בעקבות הפליטה המאולצת, לפני שמתבצעת פליטה פלואורסצנטית ספונטנית. תהליך זה גורם לדיכוי הזהירה של הפלורופורים.

כדי לחדד את התמונה בעזרת שימוש ב-STED, הלייזר צריך להיות בעל תבנית של עוצמה המתאפסת במרכז הפוקוס, ועוצמה גדולה יותר ביתר האזורים. למרות זאת, תבנית זו מוגבלת גם היא על ידי דיפרקציית האור, לכן האפקט של STED לבדו אינו מספיק. המפתח להשגת רזולוציית-על הוא התלות הלא ליניארית של דילול הזהירה בעוצמה של לייזר ה-STED, קרוב למצב הרוויה של הלייזר. אם העוצמה המקומית של לייזר ה-STED גבוהה מרמה מסוימת, תדוכא הזהירה. על ידי הגברת עצמת הלייזר, גדל האזור בו הזהירה מדוכאת, ללא השפעה משמעותית על הזהירה בנקודת הפוקוס, כיוון שבנקודה זו עצמת לייזר ה-STED קרובה ל-0. כתוצאה מכך, ניתן להבחין בזהירה רק באזור קטן סביב נקודות הפוקוס, דבר המשפר את רזולוציית התמונה. גודלו של אזור זה מוגבל על ידי עצמת לייזר הSTED, במקום להיות מוגבל על ידי דיפרקציית האור. בדרך זו ניתן לקבל תמונות ברזולוציות גבוהות, ורמת הטשטוש קטנה.

מיקרוסקופיה בשיטת ההארה התבניתית
בשיטה זו מופעלת תבנית הארה על הדגימה, כאשר התדרים המרחביים של תבנית ההארה מתערבבים עם אלה של הדגימה, וכך תדירויות גבוהות מתורגמות לתדירות נמוכות, אשר ניתנות להבחנה במיקרוסקופ.

ניתן לקבל תבנית ההארה מחזורית על ידי התאבכות של מקורות אור בכיוון הרוחבי, הצירי, או שילוב של שניהם. לאחר קבלת מספר רב של תמונות באמצעות סריקה וסיבוב של תבניות ההארה, ניתן לשחזר את מבנה הדגימה ולקבל תמונה ברזולוציית-על. בגלל שתבנית ההארה עצמה מוגבלת אף היא על ידי דיפרקציית האור, שיפור הרזולוציה במיקרוסקופיית SIM מוגבל לעד פי 2, על ידי שילוב של שני מקורות אור המוגבלים על ידי דיפרקציה. רזולוציה רוחבית של ~ 100 ננומטר ורזולוציה צירית של ~ 300 ננומטר הושגה בשיטה זו.

מיקרוסקופיה בשיטת הארה תבניתית רוויה (Saturated structured illumination microscopy - SSIM) מבוססת על שיטת SIM. עיקרון פעולתה הוא הבאת העצמה הפלואורסצנטית לרוויה, כאשר פלורופור מואר בעצמה גבוה של אור מערר . תחת תנאים אלו, בכל פעם שהפלורופור מגיע לרמת היסוד, הוא מייד קופץ לרמה המעוררת. כתוצאה מכך, כאשר העצמה הפלואורסצנטית של הפלורופור מתקרבת לרוויה, היא כבר לא פרופורציונלית לעצמת האור המערר. ב-SSIM, הדגימה מוארת באור מערר ועצמתי בעל תבנית סינוסיאלית, כך ששיאי תבנית העירור "משוטחים" בעקבות ההגעה לרוויה, כך שבאזורים אילו אין זהירה. לעומת זאת בנקודות האפס של תבנית הארה מתקבלת זהירה בעקבות ירידת הפלורופור לרמת היסוד, וכתוצאה מכך מתקבלת תבנית עירור חדה של אזורים חשוכים, וביניהם פסים דקים מוארים. האפקטים הללו מוסיפים תדרים מסדר גבוה יותר לתבנית העירור. בשיטה זו, הרזולוציה המרחבית כבר לא מוגבלת על ידי עקיפת האור, אלה רק על ידי זמן החיים של הפליטה הספונטנית.

רזולוציית-על בשיטת מיקום מולקולה יחידה
מבנה ביולוגי מוגדר על ידי מיקום המולקולות המרכיבות את המבנה. באופן דומה, תמונה פלואורסצנטית מוגדרת על ידי הקואורדינטות המרחביות של הפלורופורים היוצרים את התמונה. אפשר לנצל זאת, ועל ידי מציאת מיקום הזהירה במדגם ברמת דיוק גבוהה ניתן להגיע לרזולוציית-על. למרות שהתמונה המתקבלת מפלורופור בודד היא נקודה בגודל סופי, קביעת מיקום הפלורופור מהתמונה המתקבלת יכולה להיות מדויקת הרבה יותר מגבול הדיפרקציה, כל עוד התמונה מתקבלת ממספר רב של פוטונים אשר נפלטים מהפלורופור. אפשר להתייחס להרכבת תמונה בעזרת N פוטונים כאל מדידת מיקומם של N פלורופורים, עם אי ודאות המוערך על ידי Δloc≈ Δ/√N כאשר Δloc הוא אי ודאות המיקום, ו-Δ הוא אי ודאות של מדידת מיקום בודדת. קנה מידה זה מאפשר מיקרוסקופיה ברזולוציית-על, אשר לא מוגבלת על ידי דיפרקציית האור. מדידה בדיוק גבוה של מקורות אור, כמו חלקיקים פלואורוצנטים, נפוצה בניסויים ביופיזיקליים, והגיע לרמת דיוק שקרובה ל 1Å(אנגסטרום). דגימה ביולוגית-פלואורוצנטית אופיינת מכילה אלפי, או אפילו מיליונים פלורופורים בצפיפות גבוהה, דבר המקשה על קבלת תמונה ברורה בשיטת ה-SMLM. על ידי שימוש בגשושיות פלואורוצנטיות (פלורופורים) הניתנות לשליטה (photoswitchable probes), היכולות להחליף בין מצב חשוך למצב פולט אור, אפשר לחלק את תמונת הזהירה המתקבלת לתחומי זמן שונים, כך בעיית התמונה החופפת שמתקבלת ממולקולות שונות ניתנת לפתרון. בשיטה זו, מולקולות הנמצאות בתחומי דיפרקציית האור יכולות להיות להיות "מצולמות" בנקודות זמן שונות, כך שעבור מולקולות חופפות, ניתן לצלם מולקולה מסוימת, לאחר מכן "לכבות" את המולקולה ולצלם את המולקולה הבאה, כך שהתמונה הכוללת המתקבלת כבר לא תהיה מוגבלת על ידי החפיפה. בצורה זו קואורדינטות הפלורופורים ממופות, ונבנית תמונה ברזולוציית-על. שיטה זו תוכננה ויושמה באופן עצמאי על ידי שלוש מעבדות, והיא קיבלה את השמות STORM PALM ו- FPALM בהתאמה. שלושת המעבדות השתמשו בתחילה בפלורופורים אשר עשויים מצבעים או חלבונים פלואורסצנטיים המופעלים על ידי אור הדמיה חלש, המפעיל רק חלק קטן מהם. הפרדה זאת מאפשרת שליטה על כמות המולקולות הנמצאות במצב פלואורסצנטי מסוים בזמן נתון, כך שהמולקולות המופעלות ניתנות להפרדה ומיקומם מתקבל. חזרה על התהליך מאפשר למפות את מיקומי הפלורופורים בדיוק רב, ולקבל תמונה ברזולוציית-על.

המאפיינים הפיזיים והכימיים של הפלורופורים קריטיים לקבלת תמונה ברזולציית על בשיטת ה-SMLM. עד כה נעשה שימוש במספר גדול של פלורופורים הניתנים לשליטה על ידי אותות אופטיים. הפלורופורים הללו יכולות להיות עשויות ממגוון רחב של חומרים, החל מצבעים אורגנים עד לחלבונים פלואורסצנטים, המאפשרים סיווג של דגימות ביולוגיות בעזרת מגוון של שיטות. הרזולוציה של טכניקה זו מוגבלת על ידי מספר הפוטונים שנקלטו בכל אירוע של פליטת אור מהפלורופור, אשר משתנה ממאות עבור חלבונים פלואורוצנטים, עד אלפים עבור צבעים אורגניים מסוג ציאנין, כגון Cy5. מספרים אלה מאפשרים שיפור של יותר מסדר גודל אחד ברזולוציה המרחבית של המיקרוסקופ. בפועל, חוקרים הצליחה להגיעה לרזולוציה רוחבית של 20 ננומטר באמצעות שימוש בפלורופורים העשויים מציאנין. שיטה זו אפשרה להגיע לרזולוציות גבוהות בחקר מבנה ה-DNA ומבנה החלבונים השונים המרכיבים אותו, בנוסף למבנים תאיים אחרים.

התקדמויות אחרונות במיקרוסקופיה ברזולוציית-על
בשנים האחרונות נעשתה התקדמות בתחום של רזולוציית-על, המאפשרת יישומים חדשים בדגימות ביולוגיות. ההתקדמות הטכנית הזו התאפשרה באמצעות פיתוח השיטות של הדמיה אופטית ושימוש בפלורופורים בעלי מגוון רחב של תכונות.

הדמיה מרובת צבעים

קבלת תמונה של מבנה ביולוגי חשובה כדי להבין את הפונקציונליות שלו, אך אין זה תמיד מספיק כיוון שתהליכים ביולוגיים רבים מעורבים באינטראקציות בין מבנים ותתי מבנים שונים. אחת מהדרכים להתמודד עם אינטראקציות אלה היא באמצעות שימוש במיקרוסקופיה מרובת צבעים, בה מרכיבים שונים במבנה מסומנים בצבעים שונים. הצבעים השונים בתמונה משמשים כאינדיקטורים לאינטראקציות אפשריות, אך רמת הדיוק בשיטה זו מוגבלת על ידי הרזולוציה של שיטת ההדמיה. הדמיה מרובת צבעים ברזולוציית-על מאפשרת לקדם באופן ניכר את ההבנה של אינטראקציות מולקולריות בתאים.

הדמיה מרובת צבעית בשיטת תבנית העירור המרחבית
הדמיה מרובת צבעים בשיטת STED ניתנת לביצוע באמצעות פלורופורים בעלי דרגת עירור ופליטת אורך גל שונה. כדי לקבל הדמיה מרובת צבעים, יש להשתמש בלפחות שני סוגי פלורופורים. באמצעות שימוש בזוג צבעים פלואורסצנטיים ואלומות לייזר STED, ניתן לקבל הדמיה של קולוקליזציה (Colocalization) בין אשכולות החלבון הסינפטי והמיטוכונדריה, ברזולוציה שמגיעה ל 5 ננומטר. שימושים נוספים בשיטה זו איפשרו לדמות את קרום הממברנה החיצוני של המיטוכונדריה בשלושה ממדים.

הדמיה מרובת צבעית בשיטת ה-SMLM
המפתח להדמיה רב צבעית בשיטת מיקום מולקולה יחידה היא להבדיל בין התכונות של כל אחת מהגשושיות הפלואורסצנטיות המורכבת מהפלורופורים. מלבד פליטה של גל כתוצאה מעירור, אורך הגל המשמש להפעלה יכול לשמש כחתימה של הפלורופורים. לכן הדרישה המוקדמת של הדמיה בשיטה זו היא שהגשושיות הפלואוסנטיות יהיו בעלי אורכי גל שונים עבור עירור, פליטה או הפעלה, דבר המאפשר הבדלה ביניהם. גשושיות אלו נוצרו על בסיס צבעים אורגנים-פלואורסצנטיים מסוג ציאנין. הגשושיות מורכבות מפלורופור "מדווח", שיכול להפוך לחשוך כאשר מעורר על ידי אור ההדמיה, ופלורופור "מפעיל", אשר מאפשר את ההפעלה של הפלורופור ה"מדווח" כאשר מואר על ידי אור באור גל מתאים. צבעי ציאנין בתחומים שונים החל מאדום כהה עד אינפרא-אדום, מתפקדים כ"מדווחים" הניתנים לשליטה, וגם לצבעי הציאנין עבור ה"מפעילים" יש מגוון רחב של אפשרויות, החל מסגול ועד צהוב. שילוב של "המדווחים" וה"מפעילים" יוצר מגוון רחב של גשושיות פלואורצנטיות הנבדלות באורכי גל ההפעלה והפליטה. הדמיה תלת-צבעית של מולקולות DNA, הדמיה דו-צבעית של מיקרוטובולים בתאים והדמיה דו-צבעית תלת-ממדית של מיקרוטובלים ומיטוכונדריה הושגו באמצעות שיטה זו.

הדמיית תאים חיים
אחד מהיתרונות של מיקרוסקופיית אור הוא היכולת ליצור הדמיה של תאים חיים. ישנן שתי דרישות עיקריות כדי לערוך הדמיית תאים חיים: יש לסווג את התאים, ולוודא שרזולוציית הזמן גבוהה מספיק כדי לעקוב אחרי התנועות בתא. השיטות ברזולוציית-על שיושמו עד כה, כוללות את שיטת תבנית העירור המרחבית ושיטת מיקום המולקולה היחידה. שתי שיטות ההדמיה איטיות באופן יחסי. האחרונה כרוכה בהכנסת גשושיות פלואורסצנטיות לתאים חיים, מה שמוסיף אתגר נוסף. עם זאת, מספר רב של חומרים התגלו כניתנים לשליטה על ידי אותות אופטיים, דבר שהקנה גמישות.

הדמיית תאים חיים בעזרת שיטת תבנית העירור המרחבית:

בגלל שהרזולוציה בשיטת STED גדולה הרבה יותר מאשר שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית, כך הזמן הדרוש לביצוע סריקה של דגימה גם הוא ארוך יותר בצורה משמעותית. באמצעות הגדלת זמן הסריקה והגבלת שדה התמונה למספר מיקרו-מטרים, הצליחו לצפות בתנועה בראונית של חלקיקים בגודל של מספר ננומטרים בקצב של 80 פריימים לשנייה. לאחרונה הצליחו מדענים לדמות נוירונים בהיפוקמפוס ולהבחין בתנועת שלפוחית סינפטית בודדה ברזולוציה של 60–80 ננומטרים.

הדמיית תאים חיים בשיטת ה-SMLM:

הדמיה ברזולוציית-על בשיטת ה-SMLM גם היא איטית יחסית, כיוון שהתמונה הסופית היא למעשה מפה של מיקומי הפלורופורים שהצטברו על פני מחזורים רבים. הדמיה ברזולוציה גדולה מגבול הדיפרקציה של חלבוני אדהזיה פוקליים(focal adhesion proteins) הושגה לאחרונה. בעזרת שימוש בחלבון פלואורסצנטי הניתן לשליטה באמצעות אותות אופטיים (EosFP), הצליחו לקבל הדמיה ברורה של החלבון פקסילין . רזולציית הזמן אשר הושגה הייתה בין 25–60 פריימים לשנייה, ובמהלך פרק זמן זה, הופעלו כ-103 פלורופורים בכל מיקרומטר מקובע, והושגה רזולוציה של 60–70 ננומטר. לאחרונה הצליחו להכניס חלבון פלואורסצנטי צהוב הניתן לשליטה לתוך תא בקטריה חי, דבר האפשר מעקב אחרי חלבון ה-MreB .

 גשושיות פלואורסצנטיות יכולות להקל מאוד על מעקב אחר החלקיקים. בניגוד לניסויים קונבנציונלים של מעקב אחרי חלקיק יחיד, שבו מתבצע סיווג ומעקב רק אחר חלק קטן של המטרות, השימוש בגשושיות הפלואורסצנטיות מאפשרות לעקוב אחר מטרות בצפיפות גבוהה יותר. למרות שניתן להפעיל את הגשושיות רק בחלק קטן של המבנים בזמן נתון, לאחר מחזורי פעולה רבים מתקבלת מפה מפורטת של מסלולי החלקיקים. גישה זו שימשה לבדיקת קיומם של מיקרו-מבנים בממברנה על ידי בחינת תכונות המפה המרחבית של החלבונים בממברנה.

הדמיה תלת־ממדית

מרבית המבנים התאיים הם תלת־ממדיים מטבעם, והיכולת לפענח מבנה תלת־ממדי מוגבלת על ידי המימד בעל הרזולוציה הנמוכה ביותר. מכאן נבע הצורך לפתח שיטות המאפשרות קבלת רזולציית על בשלושה ממדית.

הדמיה תלת־ממדית בשיטת ה-SMLM זו יושמה לראשונה באמצעות שיטת אסטיגמציה למיקום הצירים. בשיטה זו מוכנסת למכשיר עדשה גלילית, המאפשרת פוקוס שונה בכיווני x ו- y. כתוצאה מכך, התמונה המתקבלת מפלורופור יחיד הופכת לאליפטית, דבר המאפשר מדידה בו זמנית של המיקום הצירי שלה מפחיסות האליפסה, ואת המיקום הרוחבי ממרכז התמונה. שיטה זו הגיעה לדיוק רוחבי של ~ 25 ננומטר ודיוק צירי של ~ 50 ננומטר. תיאור מלא של מבנים ביולוגים, לדוגמה הדמיה מלאה של תאי יונקים, הושגו באמצעות שיטה זו .

יישום נוסף של הדמיה תלת־ממדית נעשה על ידי הדמיה על שני מישורים שונים, בהם האור הנפלט מהדגימה מפוצל ומגיע לאזורים שונים במצלמה. אורכי הדרכים השונות בהם עבר האור מאפשרים לקבוע את הקואורדינטות בציר Z, ובכך לקבל תמונה תלת־ממדית.

שיטה נוספת להדמיה תלת־ממדית היא שילוב של STORM עם הנדסת פונקציית ההתפלגות הנקודתית (PSF engineering): צורות ההארה של המולקולות הפלואורסצנטיות הבודדות המתקבלות במהלך הניסוי כוללות בתוכן אינפורמציה תלת־ממדית. שיטה זו כוללת אנליזה חישובית מתקדמת כדי לקבוע את מיקום המולקולות במרחב. בשיטה זו אין צורך לסרוק את נפח הדגימה כדי לקבל תמונה תלת־ממדית .

רמת הדיוק של מיקרוסקופיה ברזולוציית-על
שיטות מיקרוסקופיות מספקות יכולת לבחון את המבנה המרחבי של הדגימה ולראות כיצד הדגימה משתנה בזמן. הרזולוציה המרחבית ורזולוציית הזמן של הטכניקות קובעת באיזו רמת דיוק ניתן לראות את פרטי המבנה, ובאיזה מהירות ניתן לצפות בתהליך. כאשר מתקרבים לרזולוציות גבוהות, גורמים שונים מהווים בעיה ומורידים מהדיוק.

הרזולוציה האופטית
הרזולוציה האופטית מהווה את היכולת הבסיסית של שיטות המיקרוסקופיה השונות לקבלת תמונת המבנים. ניתן להגדיר אותה כהיכולת להבחין בין שני מקורות נקודתיים קרובים. עבור שיטות תבנית העירור המרחבית, הרזולוציה האופטית מיוצגת על ידי הגודל האפקטיבי של ה-PSF. עבור שיטות ה-SMLM, הדיוק של קביעת מיקום הגשושיות הפלואורסצנטיות הוא העיקרון של מדידת הרזולוציה האופטית.

הרזולוציה האופטית בשיטת תבנית העירור המרחבית:

בשיטה זו, קבלת רזולוציית-על מושגת על ידי יצירת תחום עירור בעל ממדים הקטנים בצורה משמעותית מאשר גבול העקיפה. עבור STED לדוגמה, החדות של ה-PSF נובעת מדיכוי הזהירה של פלורופורים הממוקמים מחוץ למרכז הפוקוס. עם הגדלת עצמת הלייזר, האזור של דיכוי הזהירה מתרחב ומתקרב אל נקודת הפוקוס, אך הפלורופורים בנקודת הפוקוס אינם מושפעים ידי לייזר ה-STED אם עצמת הלייזר נשמרת על אפס בנקודת הפוקוס. באופן תאורטי, ניתן להגיע לרזולוציה מרחבית בלתי מוגבלת אם תבנית דלדול העצמה סביב נקודת הפוקוס אידיאלית.

בפועל, תבנית דילול העצמה היא לא אידיאלית, ויכולה לנבוע ממספר רב של גורמים, המגבילים את רמת הרזולוציה. לדוגמה, עצמת לייזר בנקודת הפוקוס של 1% מעוצמת השיא מאפשרת להגיע לשיפור של עד פי 7 ברזולוציה האופטית לעומת מיקרוסקופיה קונפוקלית, ואילו עבור עצמה של 0.1% בנקודת האפס ניתן להגיע לשיפור של עד פי 20 ברזולוציה. לעצמת הלייזר בנקודת בפוקוס יש חשיבות דומה גם עבור SSIM.

הסיבות השונות שגורמות לתבנית דלדול לא אידיאלית, כוללות פגמים במצב הלייזר, אברציה כדורית הנגרמת ממקדמי השבירה השונים, וגורמים נוספים.

רזולוציה אופטית בשיטת מיקום מולקולה יחידה:

בשיטה זו קבלה של רזולוציית-על מושגת באמצעות בדיקת המיקום של פלורופורים בודדים בדיוק גבוה. מספר הפוטונים הנאספים מכל פלורופור הוא הגורם העיקרי להגבלת הרזולוציה.

דרך קפדנית לאפיין את דיוק המיקום בשיטת ה-SLML הוא באמצעות בדיקת מיקום חוזרת של הפלורופורים הניתנים לשליטה. לחלופין אפשר לקבל את הדיוק מההתפלגות של המיקומים שנמדדו על ידי מספר רב של גשושיות במבנה מוגדר היטב, למשל משטח שטוח המאפשר למדוד את הדיוק בציר Z. עבור צבעי הציאנין, דיוק המיקום אשר התקבל באופן ניסיוני הוא ~ 20 ננומטר לרוחב. לעומת זאת, הרזולוציה התאורטית עבור צבעי ציאנין היא 6 ננומטר. סיבות אפשריות לפער בין הערך התאורטי לערך הנמדד הוא שה-PSF של הפלורופורים אינו פונקציה גאוסית מושלמת, התמונה המתקבלת מפלורופור רוטט אינה סימטרית עקב פליטה הנובעת מהדיפול של הפלורופור, גודלי הפיקסלים השונים במצלמה אינם זהים לחלוטין, יציבות המכשיר, ועוד. אם כן, צריך לקחת מספר רב של גורמים בחשבון בשביל להעריך נכונה את רזולוציית השיטה.

גורמים המשפיעים על הרזולוציה המרחבית
הרזולוציה האופטית, כפי שפורט לעיל, מגדירה את הגבול של המבנה הקטן ביותר בו השיטה יכולה להבחין. כאשר עורכים הדמיה על דגימה ביולוגית, הרזולוציה האפקטיבית מושפעת גם ממספר גורמים נוספים הכוללים את צפיפות המדגם, והגודל הפיסי של הגשושית.

צפיפות המדגם:

במיקרוסקופיה ברזולוציית-על, הרזולוציה האופטית עשויה להתקרב לגודל של המרחק בין גשושיות פלואורצנטיות סמוכות, לכן צפיפות המדגם יכולה להיות גורם המגביל את הרזולוציה המרחבית האפקטיבית. הגבלה זו חלה על כל שיטות המיקרוסקופיה ברזולוציית-על. כאשר מספר המולקולות הממופות בדגימה אינו מספיק, מופיעים פגמים בתמונה, היכולים לגרום, לדוגמה, למבנה רציף להיראות כלא רציף.

ממדי הגשושיות:

גודלה של הגשושית מגביל את האופן שבו התמונה משקפת את המבנה בפועל. לדוגמה, עבור אימונופלואורסצנציה  בלתי ישירה (indirect immunofluorescence), קשירת הנוגדנים הראשיים והמשניים  מגדיל את הקוטר של המיקרוטובול מ-25 ננומטר ל-60 ננומטר. הפתרון האולטימטיבי של הבעיה היא שימוש בפלורופורים אורגנים, המגיעים לגודל של ~ 1 ננומטר, כך שהשפעתם על תמונת המבנה פחות משמעותית.

יישומים נוספים במערכות ביולוגיות
בנוסף למבנים ביו-מולקולריים שנבחנו, כגון DNA, שימוש בשיטות התוארו לעיל נעשה גם על מספר רב של מבניים תאיים.

הדגימה הנפוצה בה משתמשים לחקר המיקרוסקופיה ברזולוציית-על הוא שלד התא של יונקים, במיוחד המיקרוטובול. מבנים אחרים של שלד התא שצולמו עד כה כוללים סיבי אקטין של למליפודיום , סיבי ביניים של קרטין, נוירופילמנטים  ועוד. הדמיות אלו מדגימות את היכולת של מיקרוסקופיה ברזולוציית-על להבחין ולהבדיל בין סיבים שונים בחלבונים, כמו כן להבין את המבנה התלת-ממדי של שלד התא בתאים של יונקים.

לאברונים שונים, דוגמת הרשתית תוך-פלזמית, ליזוזום ומיטוכונדריה נעשתה הדמיה בעזרת השיטות שתוארו. לדוגמה, בשיטת מיקום המולקולה היחידה, ניתן היה לקבל תמונה ברורה של צורת ההמיספירה של הקלטרין, אשר מופיעים רק ככתמים במיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבציואונלי. בעזרת שימוש בשיטת STED ניתן לראות את הצורה החלולה של הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה, ואת האינטראקציות שלהם עם המיקרוטובול.

ההדמיות בשיטות השונות של סוגי מבנים תאיים רבים מדגימות את היתרונות הרבים שיש למיקרוסקופיה ברזולוציית-על על פני מיקרוסקופיה קונבנציאונלית.

הערות שוליים

2017 06
ביופיזיקה
מיקרוסקופיה