מיצוי נוגדני של כרומטין

מיצוי נוגדני של כרומטין (באנגלית: Chromatin Immunoprecipitation; בראשי תיבות: ChIP) הוא שיטה הבוחנת אינטראקציות בין חלבונים לחומצות גרעין בתאים, באמצעות הליך הנקרא מיצוי נוגדני. מטרת השיטה היא לזהות חלבונים מסוימים הבאים במגע עם אתרים מסוימים בגנום של התא, כגון פקטורי שעתוק הבאים במגע עם פרומוטורים או אתרי קישור DNA אחרים, והגדרה של ציסטרומים (cistromes)
. כמו כן מיצוי נוגדני של כרומטין משמש לזיהוי אתרים ספציפיים בגנום שבהם בוצעו עריכות היסטונים (histone remodeling), ולזיהוי אתרי המטרה של חלבונים עורכי היסטונים.

בקצרה, השיטה מתבצעת כדלהלן: חלבונים וכרומטין נמצאים בקישור זמני במיצוי תאים, גדילי הDNA נחתכים ותלכיד החלבון – DNA הקשורים לחלבונים ספציפיים מושקעים על ידי שימוש בנוגדנים ספציפיים להם, גדילי DNA אלו מנוקים ונבדקים ולעיתים מרוצפים. ניתן להסיק שרצפי DNA אלו באים במגע עם החלבון הנבדק בתוך התא (in vivo).

מיצוי נוגדני של כרומטין טיפוסי 
ישנן שתי שיטות עיקריות של מיצוי נוגדני של כרומטין, והשלב השונה ביניהן הוא הכנת מיצוי התאים וצורת חיתוך גדילי ה-DNA. הראשונה משתמשת בטכניקת הצלבה הפיכה וחיתוך גדילי ה-DNA באמצעות סוניקציה ונקראת מיצוי נוגדני של כרומטין בקיבוע צולב (XChIP), בעוד השיטה השנייה אינה מבצעת הצלבה ובה חיתוך ה-DNA מבוצע באמצעות אנזימים המעכלים DNA המופקים מחיידקי המיקרוקוקוס.

מיצוי נוגדני של כרומטין בקיבוע צולב (XChIP)
מיצוי נוגדני של כרומטין בקיבוע צולב היא שיטה למפות אתרי קישור של פקטורי שעתוק, וחלבונים קושרי כרומטין אחרים על גבי ה-DNA. חומרי המוצא שלו הוא מיצוי תאים שעבר קיבוע הצלבה הפיך. קיבוע זה נעשה באמצעות פורמלדהיד או קרינה אולטרה סגולית (UV).

תיאור השיטה
מצוי תאים עובר תהליך של קיבוע הצלבה הפיכה באחת השיטות המוזכרות לעיל.
לאחר קיבוע ההצלבה גדילי ה-DNA מפורקים בדרך כלל על ידי סוניקציה, תהליך המותיר מקטעים באורך של בין 300–1000 בסיסים חנקניים.
מקטעים באורכים של בין 400–500 בסיסים מתאימים ביותר לזיהוי מוטיבים של קישור מאחר שהם באורך קורלטיבי למספר נוקלאוזומים בודד ומאפשרים הסקה של קישור על פי מבנה מרחבי.
שאר מיצוי התא מופרד מהתמיסה בהשקעה, ותלכידי חלבון-DNA מושקעים בהשקעה באמצעות נוגדנים ספציפיים לחלבון הנבדק. נוגדנים אלו בדרך כלל מחוברים לחומר המאפשר הפרדה פשוטה, כגון : אגרוז, ספרוז או חלקיקים מגנטיים. התלכידים הנוגדניים המושקעים (כלומר, החלקיק-הנוגדן-חלבון המטרה-ה-DNA) נאספים ונשטפים על מנת להפריד כרומטין שנקשר בצורה לא ספציפית. תלכידים אלו מעוכלים בפרוטאז K, על מנת לשחרר את ה-DNA להמשך אבחון.
גרסאות מתויגות של החלבון הנבדק או ביוטינילציה של החלבון יכולים לשמש במקום נוגדנים ספציפיים לחלבון ולאפשר להפרידו ביעילות גבוהה ובעלות נמוכה משעולה לייצר נוגדן חד שבטי.
ניתן לזהות את גדיל ה-DNA שהופרד מהתלכיד במספר שיטות, כגון: ריאקציית PCR, שבב, ריצוף מולקולרי, ריצוף מהיר-עיבוד.

מיצוי נוגדני של כרומטין בתנאים טבעיים (NChIP)
שיטה זו בעיקר משמשת למיפוי אתרי מטרה של חלבונים עורכי היסטונים. חומר המוצא הוא מיצוי תאים טבעי ללא טיפולים. ה-DNA במצבו הטבעי מלופף סביב ההיסטונים ליצירת הנוקלאוזומים. חותכים את ה-DNA באמצעות אנזימים המעכלים DNA המופקים מחיידקי המיקרוקוקוס, אשר חותכים DNA בין הנוקלאוזומים ומשאירים את הנוקלוזומים שלמים, מקטעי ה-DNA נעים באורכם בין 200 בסיסים (נוקלאוזום בודד), עד לכ-1000 בסיסים (חמישה נוקלאוזומים).
שאר הטכניקה זהה לזו המתוארת במיצוי הכרומטין בקיבוע הצולב (XChIP), בנוגע לניקוי, מיצוי, הפקה ואנליזה של DNA מופרד.

השוואה בין שתי שיטות המיצוי
היתרון העיקרי בתנאים טבעיים הוא ספציפיות הנוגדנים. הנוגדנים החד שבטיים בהם נעשה שימוש מתוכננים לזהות רצפים חלבוניים סינתטיים קצרים, ולאחר קיבוע צולב בפורמלין תיתכן פגיעה במבנה החלבון ואתרי המטרה של נוגדנים אלו. אתרי המטרה פגיעים במיוחד לשינויים בחומצת האמינו ליזין בקצה החנקני. עובדה זו מסבירה את היעילות הנמוכה של מיצוי נוגדנים בקיבוע צולב לעומת בתנאים טבעיים.
אך המטרות של שתי השיטות הן שונות כך שהיתרונות של שיטה אחת על האחרת הם יחסיים. קיבוע צולב משמש לזיהוי אתרי פעילות של פקטורי שעתוק וחלבונים קושרי כרומטין אחרים, בעוד מיצוי בתנאים טבעיים בוחן עריכות להיסטונים (ראה טבלה 1).

טבלה 1 היתרונות והחסרונות של מיצוי נוגדני של כרומטין בקיבוע צולב ובתנאים טבעיים

ההיסטוריה של טכניקות מיצוי נוגדני של כרומטין

בשנת 1984 ג'ון ליס (John T. Lis) וחוקר במעבדתו דוד גילמור (David Gilmour), השתמשו בקרינה אולטרה סגולית על מנת לעשות קיבוע צולב של חלבונים ל-DNA בתאי חיידקים חיים. לאחר מיצוי תכולת התאים הם השקיעו באמצעות נוגדנים כנגד RNA פולימראז חיידקי, את ה-DNA שהושקע הם בדקו עם גלאים לאזורים שונים בגנום החיידק כדי לזהות פיזור וצפיפות של RNA פולימראז באזורי הגנים השונים.
ב-1985 הם השתמשו באותה השיטה רק הפעם לבדיקת RNA פולימראז 2 באוקריוים בתאי זבוב הפירות, ובדיקה של גלאים של גני עקת חום.
עבודות אלו מוגדרות כפריצות הדרך של עבודה עם מיצוי נוגדני של כרומטין.
מיצוי נוגדני של כרומטין בקיבוע צולב שופר ופותח על ידי אלכסנדר ורשבסקי (Alexander Varshavsky) ושותפים, שבדקו את הנוכחות של היסטון H4 על גני עקת חום, במקום להשתמש בקרינה אולטרה סגולית הם השתמשו בפורמלדהיד על מנת לקבע.
טכניקות אלו שופרו ופותחו מאוד מאז.
מיצוי נוגדני של כרומטין בתנאים טבעיים (NChIP) תואר לראשונה על ידי מעבדתו של הביס (Hebbes) ב-1988, וגם שיטה זו פותח ושופרה רבות לשימוש נפוץ.
שיטת המיצוי המקורית לוקחת כ 4–5 ימים ודורשת כ106- 107 תאים. שיטות חדשות מאפשרות לבצע את התהליך תוך יום אחד ודורשות הרבה פחות תאים כ-100–1000.

מיצוי נוגדני של כרומטין באמצעות נשא - (Carrier ChIP (CChIP
שיטה זו יכולה להיות יעילה גם בשימוש של רק כ-100 תאים, על ידי הוספה של תאי זבוב פירות (Drosophila) ככרומטין נשא, ובכך להפחית את אובדן הכרומטין הנבדק בהשקעה, על ידי הטיית שיווי המשקל של ההשקעה. אך כמובן הוא דורש גלאים ספציפיים שיוכלו לזהות את הDNA הנבדק על גבי הרקע של הכרומטין הנשא, שיטה זו לוקחת כיומיים שלושה.

מיצוי מהיר נוגדני של כרומטין - (Fast ChIP (qChIP
שיטה זו מאיצה את התהליך על ידי האצה של שני שלבים במהלך המיצוי :
1. אמבט אולטראסוני מאיץ את תהליך הקשירה של הנוגדנים לחלבוני המטרה ובכך מאיץ את תהליך ההשקעה.
2. פרוטוקול מבוסס שרף (Chelex-100) להפרדת DNA מקצר את הפקת הDNA והיפוך הקיבוע הצולב.
הניצולת של תהליך זה אינה גבוהה ולכן צריך תמצית תאים המופקת מכמות תאים רבה (כ106~ 107). ניתן לייצר באמצעות שיטה זו עד 24 מקטעי DNA מוכנים לPCR בתוך 5 שעות, שיטה זו מאפשרת בדיקה של פעילות מספר פקטורי שעתוק בו זמנית ולהסתכל על שינויים באוכלוסיות תאים לאורך זמן.

מיצוי נוגדני של כרומטין מהיר וכמותי (Quick and quantitative ChIP (Q2ChIP
שיטה זו משתמשת בחומר מוצא מיצוי של 105 תאים, ומאפשרת בדיקה של 1000 היסטונים או 100 פקטורי שעתוק. בשיטה זו דוגמאות כרומטין רבות יכולות להיות מוכנות במקביל ולהיבדק במקביל. אורך הבדיקה הוא כיום
.

מיקרו מיצוי נוגדני של כרומטין (MicroChIP (µChIP
שיטה זו בדרך כלל משתמשת במיצוי מכ-1000 תאים, ומאפשרת לבצע 8 תהליכי מיצוי ללא שימוש בנשא. שיטה זה יכולה להיעשות גם ממיצוי 100 תאים בלבד אך תהליך מיצוי בודד. כמו כן ניתן להשתמש ברקמת ביופסיה של 1 ממ</sup>3<sup> . שיטה זו מבוצעת תוך יום אחד.

מיצוי נוגדני של כרומטין במיקרו-פלטה - Matrix ChIP
שיטה זו מאפשרת רמה גבוהה יותר של עיבוד ומפשטת את התהליך, כל תהליך מבוצע במיקרו-פלטה ומאפשר את הפוטנציאל של אוטומציה. בתהליך זה ניתן לעשות 96 מיצויים במקביל, וכל התהליך לוקח יום בודד.

מיצוי נוגדני של כרומטין נעשה גם על גנום שלם באמצעות טכנולוגיית "מיצוי נוגדני של כרומטין על שבב" (ChIP-on-chip) או טכנולוגיית ריצוף DNA חדשניות (Chip-Sequencing). כמו כן ניתן לשלב שיטה זו עם טכניקת "ריצוף קצוות מזווגים מתויגים" (paired end tags sequencing) בשיטה הנקראת "בחינת אינטראקציות כרומטין באמצעות ריצוף קצוות מזווגים" Chromatin Interaction Analysis using Paired End Tag sequencing (ChIA-PET), שיטה שנועדה לבחינה של אינטראקציות של כרומטין במבנה מרחבי של יצורים אוקריוטים.

הגבלות של מיצוי נוגדני של כרומטין
 בדיקה רחבת טווח באמצעות מיצוי נוגדני של כרומטין היא מאתגרת. מאחר שצריך ליצור נוגדן ספציפי לכל פקטור שעתוק, או אורגניזם מהונדס המכיל פקטורי שעתוק מתויגים.
 חקר דוגמאות ביטוי בשיטה זו מהווה בעיה מאחר שישנם שינויים בביטוי בתאים מסוימים בתנאים שונים לחלונות זמן מאוד קטנים.
 שיטות אלו מתקשות בהבדלה בין איזופומים שונים של פקטורי שעתוק.

ראו גם 
 RIP-Chip שיטה דומה המנתחת אינטראקציות בין חלבונים ל-RNA
 DamID שיטה חלופית שאינה דורשת ייצור של נוגדנים ספציפיים
 ChIP-exo שיטה המוסיפה נוקלאזות לתהליך ומקטינה את תוצרי ההפקה למקטעים הקושרים.
 ChIP-on-chip שילוב של שיטת המיצוי עם טכנולוגיית המעבדה על שבב.
 ChIP-seq
 FISH - עוד שיטה לצביעת RNA

קישורים חיצוניים

ביאורים

הערות שוליים 

גנומיקה
שיטות מחקר גנומיות