חזרת הפלואורסצנציה לאחר הלבנתה

חזרת הפלואורסצנציה לאחר הלבנתה (באנגלית: Fluorescence Recovery After Photobleaching או FRAP) היא שיטה מיקרוסקופית אופטית למדידה של דינמיקה בתאים חיים. השיטה מבוססת על שילוב של מספר שיטות הכוללות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, שימוש בקרן לייזר לביצוע הלבנה של הפלואורסצנציה וכן שימוש בשיטות סימון של חלבונים (או מבנים ביולוגיים אחרים) בעזרת חלבונים פלואורסצנטיים כמו GFP. חלבון הנמצא בתא החי נע בדרך כלל בתנועה אקראית, או בדיפוזיה, ובנוסף הוא יכול להתקשר ולהתנתק לחלבונים או מבנים אחרים. 

הדיפוזיה מתאפיינת על ידי מקדם הדיפוזיה D, שאכן ניתן למדוד אותו בעזרת FRAP. בנוסף, אם החלבון יכול להתקשר לחלבונים אחרים או למבנים אחרים, ניתן ללמוד בעזרת שיטת FRAP על קצב הקישור של החלבון ועל קצב ההתנתקות שלו.

מה מודדת השיטה 

עקרון הפעולה של שיטת FRAP תקף עבור חלבונים, אך ניתן להשתמש בשיטה זו גם לחקר הדינמיקה של מולקולות ומבנים אחרים. 

על מנת לבצע את פעולתם בתאים חיים, החלבונים צריכים ליישם שתי יכולות: להגיע לאתר שבו הם צריכים לפעול; להתקשר לאתר ובדרך כלל גם להתנתק ממנו.

ההגעה של חלבונים לאתר שבו הם פועלים נעשית בדרך כלל בתנועה אקראית, או דיפוזיה, כפי שנקרא התחום העוסק בתנועה האקראית של חלקיקים. תנועה זו איטית יחסית וחסרת כוון מוגדר היטב, אך היא עדיין יעילה מאוד כאשר התחום שבו נע החלקיק קטן יחסית. כאשר חלקיק או גוף כלשהו נע בתנועה קבועה, ניתן לאפיין את התנועה על ידי מהירות החלקיק; באופן דומה, כאשר חלקיק נע בתנועה אקראית, ניתן לאפיין את תנועתו על ידי מקדם הדיפוזיה, שבדרך כלל מסומן בעזרת האות D. מקדם הדיפוזיה הוא אחד מהמשתנים שאותם ניתן למדוד בעזרת שיטת FRAP.

כשהחלבונים נמצאים בסביבת האתר שאליו הם נקשרים, כמו למשל חלבונים הנקשרים לממברנה של התא, אזי קיים קצב התחברות שקובע כמה זמן יעבור בממוצע עד שחלבון בודד יקשר לאתר. קצב זה מאופיין על ידי קבוע הקישור. בנוסף, כאשר החלבון קשור כבר לאתר, יהיה לו גם קצב התנתקות כלשהו, שאופייני לסוג הקשר ולחוזק שלו. קצב הניתוק מאופיין על ידי קבוע ההתנתקות. שיטת FRAP מאפשרת גם למדוד את קבוע ההתחברות וההתנתקות של חלבון.

קישורים חיצוניים

מיקרוסקופיה
ביופיזיקה