אופרון הלקטוז

אופרון הלקטוז (באנגלית: Lac Operon), הוא אופרון הדרוש לפירוק ושינוע של הסוכר לקטוז בחיידק E.coli וביצורים פרוקריוטים נוספים. האופרון מכיל שלושה גנים מבניים המקודדים לחלבונים שונים, וכן קדם (פרומוטר), אתר מפעיל (אופרטור) וטרמינטור. פעילות האופרון מתאפשרת על ידי נוכחות או העדר של הסוכרים גלוקוז ולקטוז בתא.

אופרון זה הוא מנגנון הבקרה הגנטי הראשון שפוענח ביצורים פרוקריוטים ולכן משמש כמודל ללימוד בקרת גנים. פעולת אופרון זה נתגלתה ונחקרה לראשונה על ידי צמד הביולוגים ז'אק מונו ופרנסואה ז'קוב, אשר זכו בשל כך בפרס נובל לפיזיולוגיה ורפואה בשנת 1965.

מבנה האופרון

אופרון הלקטוז מורכב משלושה גנים רצופים המקודדים לשלושה חלבונים שונים. לפני גנים אלה מופיעים הקדם והאתר המפעיל, ואחריהם מופיע הסיום. הגנים המקודדים לחלבון מכונים בשמות: lacY, lacZ ו־lacA. (ראו תרשים לעיל)

 הגן lacZ מקודד לחלבון β-galactosidase, אנזים תוך תאי המפרק את הלקטוז שהוא דו סוכר אל רכיביו גלוקוז וגלקטוז. דבר המאפשר לחיידק לנצל את האנרגיה האגורה בסוכר זה.
 הגן lacY מקודד לחלבון β-galactoside permease, נשא המסייע בהכנסת לקטוז אל התא.
 הגן lacA מקודד לחלבון β-galactoside transacetylase, אנזים המעביר קבוצת אצטיל מ־Acetyl CoA אל β-galactosides.

שלושת הגנים הנמצאים באופרון סמוכים זה לזה, כך שניתן לשעתקם למולקולת mRNA אחת ארוכה, אשר ממנה הם מתורגמים לחלבונים השונים (mRNA פוליציסטרוני). תעתוק הגנים מתחיל עם קשירת האנזים RNA פולימראז לקדם, שהוא אתר הקשירה והזיהוי של האופרון הנמצא מעט לפני הגנים ברצף ה־DNA של החיידק.

בקרה באמצעות ה־lac repressor

האופרון אינו מתורגם לחלבון כל העת מכיוון שזהו תהליך הדורש אנרגיה ומשאבים מן החיידק. תרגום האופרון תלוי בזמינות הלקטוז ובהיעדר גלוקוז – כאשר החיידק מצוי בסביבה ענייה בלקטוז או סביבה המכילה גם גלוקוז, הגנים אינם באים לידי ביטוי והחיידק מנצל מקורות אנרגיה חלופיים, ואילו כאשר החיידק מצוי בסביבה עשירה בלקטוז וענייה בגלוקוז, החלבונים מיוצרים והחיידק מפרק את הלקטוז כמפורט לעיל.

לצורך הבקרה על תעתוק האופרון נעשה שימוש בחלבון בקרה הנקרא דכאן (repressor) lac. הגן המקודד לחלבון זה הוא lacl, הנמצא בסמוך לאופרון על רצף ה־DNA, והוא תמיד מתורגם לחלבון, כך שתא החיידק תמיד מכיל דכאן זה. כאשר זמינות הלקטוז יורדת ובתא החיידק אין לקטוז, הדכאן נקשר אל האתר המפעיל של האופרון, בצורה שהוא מפריע לקשירה של RNA פולימראז אל הקדם. עקב כך הגנים lacZYA משועתקים ל־mRNA ולחלבון ברמות נמוכות ביותר.

כאשר החיידק נמצא בסביבת לקטוז, הלקטוז מפורק על ידי מעט החלבונים שמתורגמים באופן תמידי, וכתוצר לוואי מיוצר אלולקטוז, אשר הוא מתפקד כמשרן (inducer) ונקשר לאתר אלוסטרי בדכאן. כתוצאה מכך משנה הדכאן את צורתו והוא אינו מסוגל עוד להיקשר אל האתר המפעיל. בשלב זה יכול RNA פולימראז להיקשר לקדם (פרומוטר) ולשעתק את הגנים שבאופרון. הגנים עוברים תרגום ונוצרות כמויות גדולות של החלבונים הדרושים לפירוק ושינוע הלקטוז.

בקרה באמצעות cyclic AMP
בסדרת הניסויים לחקר האופרון השתמשו מונו וז'קוב בחיידק המעבדה הנפוץ E.coli, אך רבים ממנגנוני בקרת הגנים אותם גילו נכונים גם לאורגניזמים נוספים. הקונספט הראשי המנחה את בקרת הגנים הוא שחלבונים אינם מיוצרים כאשר הם אינם דרושים. כלומר, החיידק שומר על משאבי התא ועל האנרגיה בכך שהוא אינו יוצר את שלושת חלבוני ה־lac כאשר אין צורך בפירוק לקטוז, למשל כאשר סוכרים אחרים זמינים לשימוש (כמו גלוקוז). חלק זה עוסק באופן בו החיידק E.coli מבקר גנים מסוימים כתגובה לצרכים מטבוליים.

במהלך מלחמת העולם השנייה, חקר מונו את השפעות השילוב בין סוכרים שונים כמקורות מזון לחיידק E.coli. הוא גילה כי גידול במספר חיידקים הנמצאים במצע המכיל שני סוכרים מתבצע ברוב המקרים בשני שלבים. לדוגמה, כאשר גלוקוז ולקטוז סופקו לחיידקים, הגלוקוז נוצל ראשון (שלב I בגרף) ורק לאחר מכן נוצל הלקטוז (שלב II בגרף). 

פירוק הלקטוז, אפוא, אינו מתבצע בשלב הראשון של הגידול מכיוון ש־β-galactosidase אינו מיוצר כאשר גם גלוקוז וגם לקטוז נמצאים במצע הגידול. מכאן שישנו מנגנון בקרה נוסף מלבד העדר לקטוז בתא.

ההסבר לכך דורש אפיון של מנגנונים נוספים המשפיעים על ביטוי גני ה־lac שאינם נכללים במודל הקלאסי שתואר לעיל. שני גנים נוספים, cya ו־crp, שמופו באזור רחוק יחסית מ־lac הם הגורמים לבקרה הנוספת. כאשר בגנים אלה אירעה מוטציה, נצפו רמות ביטוי נמוכות של גני lac גם בנוכחות קבועה של אנלוג של לקטוז (IPTG) המחקה את פעולתו וגם בזני חיידקים בהם הייתה מוטציה בדכאן. עם גילוי ה־cAMP באוקריוטים בשנת 1957 ועשור מאוחר יותר ב־E.coli, התברר שכאשר מוסף ה־cyclic AMP למצע בקטריות בעלות מוטציות בגנים אלו הן שבות לפעילות מלאה.

הגן cya מקודד ל־adenylate cyclase, ממנו נוצר cAMP. כאשר מתרחשת מוטציה הפוגעת בגן cya המחסור ב־cAMP גורם לביטוי נמוך עד פי 10 של הגנים lacZYA. הוספה של cAMP מתקנת את בעיית הביטוי הנמוך האופיינית למוטנטים לגן cya. הגן השני, crp, מקודד לחלבון הנקרא catabolite activator protein או בקיצור (CAP), כינוי נוסף לחלבון הוא cAMP receptor protein – CRP. כאשר ה־cAMP זמין (אין גלוקוז) הוא נקשר אל cap באתר אלוסטרי המביא לשינוי קונפורמציה והגדלת הזיקה (אפיניות) לקשירת cap אל ה־DNA. יחדיו הם יוצרים פיתול ב־DNA מעט לפני הקדם דבר שמסייע ל־RNA פולימראז להיקשר אליו ומגביר בצורה משמעותית את ביטוי הגנים lacZYA. בנוכחות גלוקוז יצירת cAMP מעוכבת, כך שלא ניתן ליצור את הקומפלקס cap-cAMP המגביר ביטוי הגנים. זהו למעשה הבסיס למנגנון בקרה זה – רמות גלוקוז גבוהות מביאות לביטוי נמוך לגנים המפרקים לקטוז, וזאת מכיוון שניתן לפרק את הגלוקוז הזמין. 

הבקרה הכפולה גורמת לביטוי נמוך של הגנים מפרקי הלקטוז בנוכחות גלוקוז ולקטוז בתא (רמת הביטוי הנמוכה מכונה leakage), אך כאשר יש רמות גבוהות של cAMP (מחסור בגלוקוז) ונוכחות של לקטוז (המונע קשירת הדכאן) רמות הביטוי של הגנים גבוהות. הביטוי הנמוך מסייע בפירוק מעט לקטוז לאחר שמלאי הגלוקוז אזל ולפני שביטוי הגנים נכנס לפעולה מלאה.

נקודות מרכזיות:
 כאשר לקטוז אינו נמצא יש רמות ביטוי נמוכות מאוד של הגנים (הדכאן קשור לאתר המפעיל ואינו מאפשר תעתוק).
 כאשר לקטוז נמצא בנוסף למקור אנרגיה מועדף (כמו גלוקוז), ביטוי הגנים יהיה נמוך באופן יחסי (הדכאן לא קשור לאתר המפעיל אך אין cAMP).
 כאשר לקטוז הוא מקור האנרגיה המועדף (כאשר אין גלוקוז) הקומפלקס cap-cAMP נוצר וגורם לביטוי מקסימלי של הגנים (הדכאן אינו קשור לאתר המפעיל ויש ייצור של cAMP).

העיכוב בין שני שלבי הגדילה נובע מהזמן הדרוש על מנת ליצור כמות מספקת של אנזימים הדרושים לניצול הלקטוז. ראשית נקשר הקומפלקס cap־cAMP אל הקדם ומביא לעלייה משמעותית ביצירת mRNA של גני lac, לאחר מכן מתורגם ה־mRNA בעזרת הריבוזום. תוצרי התרגום הם האנזים β-galactosidase המפרק את הלקטוז והחלבון לקטוז permease המסייע בהכנסתו אל התא. לאחר ייצור רכיבים אלו ברמה מספקת מסוגל החיידק לבצע מטבוליזם של לקטוז, בשלב זה הוא נכנס לשלב גדילה מהיר נוסף (שלב II בגרף).

האופן בו משפיע גלוקוז על ייצור cAMP אינו מובן באופן מוחלט. נראה כי קצב הכניסה של גלוקוז אל התא הוא שמשפיע על האנזים adenylate cyclase (המייצר cAMP) ולא רמת הגלוקוז בתא. תופעה שנייה הנגרמת כתוצאה מכניסת גלוקוז אל התא היא הפסקת פעילותו של החלבון לקטוז permease המוביל לקטוז אל התא. שאלה נוספת העולה ממנגנון בקרה זה היא, מדוע החיידק אינו מנצל באופן תמידי את הלקטוז שהרי הוא דו־סוכר המורכב מגלוקוז וגלקטוז כאשר אין העדפה אנרגטית ברורה לטובת פירוק הגלוקוז. אין תשובה מוחלטת לשאלה זו ולכן נותר רק לשער כי החיידק E.coli, כמו מרבית חיידקי המעיים, מפרקים גלוקוז כמקור אנרגיה מועדף, ככל הנראה מכיוון שזהו הסוכר הנפוץ בסביבה בה הם חיים. במהלך האבולוציה השתרשה תכונה זו של החיידק בצורת מנגנוני הבקרה שפורטו. אפשרות נוספת היא הבדלים אנרגטיים מזעריים הגורמים לכך שכדאיות הפירוק של גלוקוז תהיה גדולה יותר לחיידק מאשר לקטוז.

סיווג מוטציות בגורמי הבקרה

הפריצה הגדולה אותה הביאו ז'קוב ומונו היא ההבחנה בין הגורמים המבקרים את הגן לבין האזורים עליהם הם פועלים על מנת לשנות את ביטוי הגן. הבחנה זו מהווה את הבסיס לסדרת הניסויים שערכו השניים במטרה להבין את מנגנוני הבקרה של האופרון. 

כדי לבצע את מחקרם יצרו השניים תא דיפלואידי לגני ה־lac ואזורי הבקרה (קדם, אתר מפעיל), כשלשאר התכונות נשאר התא הפלואידי. התרבית המכילה חיידק דיפלואידי לגני lac והפלואידי לשאר התכונות נבדקה במצבים שונים תוך התבוננות בפנוטיפ. בכל ניסוי נבדק הביטוי לגנים lacZ ו־lacY בהיעדר IPTG (אנלוג של לקטוז המדמה את פעולתו). סוג זה של ניסוי, בו נבדקת פעולת זוגות גנים, נקרא ניסוי השלמה (קומפלמנטציה).

הניסוי מתואר בתרשים, כאשר הגן lacA אינו נכלל בו מטעמי נוחות ומכיוון שהוא איננו משפיע על המטבוליזם של לקטוז. בשלבי הניסוי הרלוונטיים מופיע הגן בצורה דיפלואיטית. חלק a מציג את מצב הדיכוי ללא מוטציות וללא לקטוז, b מציג מצב בו הדכאן מנוטרל בשל נוכחות IPTG (אנלוג ללקטוז), בחלקים c ו־d מוצגים שני מקרים של מוטציות המונעים מהדכאן לדכא את הביטוי, באחד מדובר במוטציה בגן עצמו ובשני מוטציה באתר המפעיל. בחלק e נראה מבחן השלמה לגן lacl המקודד לדכאן. ניתן לראות שגם כאשר ישנה מוטציה באחד מהעותקים של lacl, לא משועתקים הגנים Z ו־Y. כלומר, ישנה השלמה בעזרת הגן התקין. ההסבר ליכולת ההשלמה הוא שהדכאן הוא חלבון קטן יחסית כך שהוא נייד בתא. החלבונים מהעותק התקין מסוגלים להגיע ולהקשר גם אל האתר המפעיל המרוחק יותר ולמנוע את ביטוי הגנים. פעולה זו של רכיב מרוחק מכונת לעיתים פעולה בטרנס (trans).

בחלק f בוצע ניסוי דומה רק שהפעם נבדקה מוטציה באתר המפעיל, מוטציה זו יוצרת אתר מפעיל קונסטיטוטיבי (OC) הגורם לביטוי הגן בלי קשר למצב הדכאן. ניתן לראות שעל אף שהדכאן תקין הוא אינו יכול למנוע את ביטוי הגנים lacZ ו־lacY. ניתן לראות גם כי מוטציה זו השפיעה רק בגדיל ה־DNA בו היא התרחשה ובגדיל השני הבקרה תקינה ואין ביטוי לגנים אלו. מכאן ניתן להסיק כי האתר המפעיל משפיע על הגדיל בו הוא נמצא ופועל בצורה דומיננטית.

ניסוי מורכב יותר מתואר בחלק g. בניסוי זה ישנה מוטציה באחד הגדילים בגן lacZ ובגדיל השני ישנה מוטציה בגן lacY. באופן זה ניתן להסיק מנוכחות החלבון מאיזה גדיל הוא נוצר, משום שישנה אפשרות אחת בלבד. בגדיל המסוגל ליצור רק lacZ ישנה בנוסף מוטציה באתר המפעיל כמו בניסוי הקודם כך שגם בנוכחות דכאן יש ביטוי לחלבון. בצורה זו ניתן לראות בוודאות כי המוטציה באתר המפעיל פועלת רק בגדיל בו היא מתרחשת כלומר היא מוטציה דומיננטית הפועלת ב־cis.

לכאורה נראה כאילו הניסוי תוכנן לאחר הבנת המנגנון, בפועל ז'קוב ומונו הניחו כי ישנו אתר ב־DNA בעל התכונות של האתר המפעיל ותכננו את ניסוי ההשלמה כדי להוכיח זאת.

אנלוגים של לקטוז
במהלך סדרת הניסויים השתמשו ז'קוב ומונו בתחליפים או נגזרות של לקטוז. זאת מכיוון שההרכב הכימי שלהם אינו מאפשר לחיידק לפרקם ולכן מקל על עריכת הניסוי. מרכיבים אלה מכונים בשם אנלוגים של לקטוז מכיוון שהם בעלי מבנה כימי דומה לזה של הלקטוז ומבנה זה מאפשר להם לדמות נוכחות של לקטוז. במרבית האנלוגים מוחלפת המחצית של הגלוקוז בקבוצה כימית אחרת דומה בצורתה.

Isopropyl-β-D-thio-galactoside או IPTG הוא אנלוג נפוץ המשמש כמשרן לפעולת אופרון הלקטוז. הוא מסוגל להקשר אל הדכאן ולנטרל אותו, אך הוא איננו מהווה מצע לאנזים β-galactosidase. הדבר מהווה יתרון בעריכת הניסוי, מכיוון שהוא איננו מפורק על ידי החיידק E.coli, רמתו נשארת קבועה בתא וקצב ביטוי הגנים נותר קבוע. מנגנון כניסת ה־IPTG לחיידק משתנה בין חיידקים שונים. בעוד שבחיידק P. fluorescens כניסתו מתווכת על ידי החלבון לקטוז פרמאז (lacY), בחיידקי E.Coli הוא מסוגל לחצות את קרום התא.

 Phenyl-β-D-galactose או phenyl-Gal הוא אנלוג נוסף המסוגל לשמש כמצע ל־β-galactosidase, הוא איננו מנטרל את הדכאן ולכן איננו משרן. חיידקים ללא מוטציה אינם מייצרים β-galactosidase ללא נוכחות גלוקוז ולכן אינם יכולים להתקיים מהאנלוג. לעומתם חיידקים בעלי מוטציה בדכאן מסוגלים להתקיים ממנו. בעזרת אנלוג זה ניתן לבצע סלקציה לחיידקים בעלי מוטציה בגן המקודד לדכאן.

קישורים חיצוניים

 פעילות אופרון הלקטוז, אנימציה
 ריצוף הגנים באופרון הלקטוז

הערות שוליים 

גנטיקה מולקולרית