ELISA

באימונולוגיה, ELISA או אלייזה (ראשי תיבות של: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) היא שיטה ביוכימית לגילוי נוכחות חלבונים או אנטיגן בדגימה. את הבדיקה מבצעים על ידי קשירת אנזים לנוגדן או לאנטיגן, הנצבע אחר כך בתגובה כימית.

באופן בסיסי הבדיקה מתבצעת על מצע קשיח, בדרך-כלל פלסטיק, אליו נספחים אנטיגנים (בדרך-כלל חלבונים). לאחר מכן נעשה שימוש בשני נוגדנים לפחות: נוגדן ראשון, הספציפי לאנטיגן מסוים ונוגדן שני, הנקשר לנוגדן הראשון ומוצמד לאנזים. כאשר סובסטרט בא במגע עם האנזים, מתרחשת תגובה כימית והוא משנה את צבעו וכך נותן אינדיקציה לנוכחות האנטיגן. הוספת חומצה חזקה כמו חומצה גופרתית מסיימת את התגובה. כמות הצבע שנוצרה נמדדת על ידי ספקטרופוטומטר באורך גל מתאים, בצורה זאת ניתן לקבוע אם אנטיגן מסוים קיים בדוגמה או לא (אנליזה איכותית) וכן לכמת אנטיגן ספציפי (אנליזה כמותית).

שימושי השיטה 

שיטת ELISA נחשבת לשיטה המדויקת ביותר לגילוי אנטיגנים וחלבונים. לשיטה אלפי שימושים קליניים, מחקריים וסביבתיים כגון: מציאת דם בשתן, אבחון של נוגדנים בסרום (כמו בבדיקת HIV), גילוי הורמונים בבדיקת היריון, בדיקת סמים בדם, גילוי יצורים מיקרוסקופיים במקווה מים ועוד.

ישנן עשרות וריאציות בהתאם לאופי הבדיקה. לדוגמה, ניתן להגביר את רגישות ה-ELISA הבסיסית, המבוססת על ספיחת אנטיגן למצע מוצק, על ידי אלייזת סנדוויץ'. גם בצורת מתקן ה-ELISA יש שינויים גדולים בהתאם לכמויות הדוגמאות הנבדקות ורמת ההדירות של הבדיקה:
 בדיקות ביתיות חד פעמיות, כמו בדיקת היריון, אינן מחייבות כל מכשור פרט לערכת הבדיקה.
 בבדיקות בקנה מידה מחקרי נבדקות עשרות או מאות דוגמאות. בדיקות אלו נעשות לרוב בפלטות של 96 "בארות" אליהן מוסיף החוקר ידנית את החומרים השונים לבדיקה. בסוף הבדיקה הפלטה נקראת על ידי ספקטרופוטומטר.
 בדיקות לאבחון קליני מצריכות דיוק רב ומבוצעות לעיתים באלפי דגימות ביום, לשם כך נעשה שימוש במכשור אוטומטי (רובוטי), בתהליך סטנדרטי ומבוקר, עם התערבות מינימלית של אדם, בכך מתאפשר ביצוע במהלך 24 שעות ביממה וקטן הסיכוי לשגיאות.

ELISA בסיסית 

תהליך הבדיקה מבוסס על מספר שלבים:
 תמיסה ובה אנטיגן (בדרך כלל חלבון או מספר חלבונים) מונחת על פלטה סופחת, בדרך כלל מפלסטיק. לשימוש מעבדתי נהוג להשתמש בפלטה המכילה 96 בארות, שלכל אחת ניתן להכניס דוגמה שונה.
 התמיסה מוצאת מן הפלטה, שאריות התמיסה נשטפת בתמיסה פיזיולוגית (בדרך כלל PBS עם דטרגנט).
 כדי להבטיח שנוגדנים לא יספחו לפלטה, הפלטה נחסמת על ידי חלבונים שאינם מוכרים על ידי הנוגדנים שבהם יעשה שימוש בהמשך. בדרך כלל תמיסת החסימה היא חלב דל שומן. לאחר מכן גם תמיסת החסימה נשטפת.
 נוגדן ראשוני מוסף, הנוגדן ספציפי לאחד החלבונים בתמיסה, תמיסת הנוגדן נשטפת כך שרק נוגדנים שנקשרו לאנטיגן נותרים. נוגדן ראשוני מופק בדרך כלל מעכברים במקרה של נוגדן חד שבטי או מארנב במקרה של נוגדן רב שבטי.
 נוגדן שניוני המצומד לאנזים (בדרך כלל HRP) מוסף. נוגדן זה נקשר באופן ספציפי לנוגדנים מסוג אלה שבהם נעשה שימוש כנוגדן ראשוני, עודפי הנוגדן נשטפים. בדרך כלל נוגדן שניוני מופק מבעלי חיים גדולים באופן יחסי כגון עז, כבש, חמור או ארנב.
 סובסטרט מוסף לפלטה, אנזים המצומד לנוגדן השניוני משנה את הרכבו של הסובסטרט ובכך הופך אותו לצבעוני.
 כאשר יש מספר דוגמאות יש לסיים את הראקציה לפני שיתכלה כל הסובסטרט, שכן כך לא ניתן יהיה לכמת את הבדלי הצבע בין הדוגמאות. התגובה מסתיימת עם הוספת חומצה חזקה כמו חומצה גופרתית בריכוז גבוה.
 קריאה בספקטרופוטומטר באורך גל מתאים.

וריאציות של ELISA בסיסית 

אלייזת סנדוויץ'- כדי להגדיל את רגישות המבחן ניתן להשתמש באלייזת סנדוויץ': לפני הוספת האנטיגן מוסף לפלטה נוגדן הסנדוויץ', נוגדן זה ספציפי לאנטיגן הנבדק אך בניגוד לנוגדן הראשוני הוא אינו מוכר לנוגדן השניוני, לעיתים נוגדן הסנדוויץ' קושר אפיטופ (אזור) שונה באנטיגן לעומת הנוגדן הראשוני. המשך השיטה זהה לשיטה הבסיסית.

אלייזת סנדוויץ'- ביוטינילציה שיטה דומה לשיטת הסנדוויץ' אך ללא נוגדן שניוני. בשיטה זו נוגדן הסנדוויץ' יכול להיות זהה לנוגדן הראשוני, אך הנוגדן הראשוני מכיל ביוטין – מולקולה קטנה היוצרת קשרים חזקים מאוד לחלבון אבידין. חלבון האבידין מצומד לנוגדן השניוני וכך נוצרת תגובת הצבע. שימוש בשיטה זאת חוסך את השימוש בנוגדן סנדוויץ' שונה מן הנוגדן הראשוני.

ELISA עקיפה – בדיקה מכמתת חלבונים כגון בדיקת נוגדנים בסרום, בדיקות מסוג זה משמשות בין השאר לאבחון חשיפה לפתוגן (כמו בבדיקת HIV – איידס):
 הבסיס המוצק נחשף לחלבונים אופייניים לפתוגן (במקרה של איידס לחלבוני המעטפת של הנגיף HIV-1)
 מוסף סרום מאדם החשוד כנגוע בווירוס. אם בדמו של האדם נוגדנים לחלבון הפתוגני הם נקשרים לפלטה.
 מוסף נוגדן שניוני נגד נוגדנים אנושיים, לנוגדן זה מצומד האנזים HRP. אם נוצרת תגובת צבע לאחר חשיפה לסובסטרט סביר להניח שמערכת החיסון האנושית מכירה את הפתוגן והאדם נגוע המחלה.

קישורים חיצוניים

 

שיטות חלבונים
בדיקות רפואיות
ביולוגיה: שיטות ומכשור