Immunokromatografiset sivuvirtaustestit

Immunokromatografiset sivuvirtaustestit (LFT), jotka tunnetaan myös nimellä lateraalivirtauksen immunokromatografiset määritykset tai pikatestit, ovat yksinkertaisia laitteita, joiden tarkoituksena on havaita kohdeaineen esiintyminen nestemäisessä näytteessä ilman kalliita erikoislaitteita. Näitä testejä käytetään laajalti lääketieteellisessä diagnostiikassa kotitesteissä, hoitopaikkatesteissä tai laboratoriokäytössä. Esimerkiksi kotiraskaustesti on LFT, joka havaitsee tietyn hormonin. Nämä testit ovat yksinkertaisia ja taloudellisia, ja ne antavat tuloksen yleensä noin viidessä-30 minuutissa. Monet laboratoriosovellukset lisäävät yksinkertaisten LFT-testien herkkyyttä käyttämällä erityisiä lisälaitteita.

LFT-testit toimivat samoilla periaatteilla kuin entsyymisidonnaiset immunosorbenttimääritykset (ELISA). Pohjimmiltaan näissä testeissä nestemäinen näyte ajetaan pitkin tyynyn pintaa, jossa on reaktiivisia molekyylejä, jotka näyttävät positiivisen tai negatiivisen tuloksen. Tyynyt perustuvat kapillaarivuoteisiin, kuten huokoiseen paperiin, mikrorakenteiseen polymeeriin tai sintrattuun polymeeriin. Jokainen näistä tyynyistä pystyy kuljettamaan nestettä (esim. virtsaa, verta, sylkeä) spontaanisti.

Näytetyyny toimii sienenä ja pidättää ylimääräisen näytteen nesteen. Kun neste on imeytynyt, se virtaa toiseen konjugaattityynyyn, johon valmistaja on varastoinut suola-sokerimatriisiin pakastekuivattuja bioaktiivisia hiukkasia, joita kutsutaan konjugaateiksi (ks. jäljempänä). Konjugaattityyny sisältää kaikki reagenssit, joita tarvitaan optimoituun kemialliseen reaktioon kohdemolekyylin (esim. antigeenin) ja sen kemiallisen kumppanin (esim. vasta-aineen) välillä, joka on immobilisoitu hiukkasen pinnalle. Tämä merkitsee kohdehiukkaset, kun ne kulkevat tyynyn läpi ja jatkavat matkaansa testi- ja kontrollilinjoille. Testiviivalla näkyy signaali, usein väri kuten raskaustestissä. Kontrolliviiva sisältää affiniteettiligandeja, jotka osoittavat, onko näyte virrannut läpi ja ovatko konjugaattityynyssä olevat biomolekyylit aktiivisia. Kun neste on läpäissyt nämä reaktiovyöhykkeet, se pääsee viimeiseen huokoiseen materiaaliin, sydänlankaan, joka toimii yksinkertaisesti jätesäiliönä.

LFT:t voivat toimia joko kilpailu- tai sandwich-määrityksinä.

Yhteenveto

Värilliset hiukkaset 

Periaatteessa voidaan käyttää mitä tahansa värillistä hiukkasta, mutta yleisimmin käytetään kuitenkin lateksia (sininen väri) tai nanometrin kokoisia kultahiukkasia (punainen väri). Kultahiukkaset ovat punaisia paikallisen pintaplasmoniresonanssin vuoksi. Myös fluoresoivia tai magneettisesti leimattuja hiukkasia voidaan käyttää, mutta nämä vaativat kuitenkin elektronisen lukulaitteen käyttöä testituloksen arvioimiseksi.

Sandwich-määritykset 

Sivuvirtaustestien sandwich-assay- ja competitive assay -muotojen välinen ero

Sandwich-testejä käytetään yleensä suurille analyytteille, koska niillä on yleensä useita sitoutumiskohtia. Kun näyte siirtyy määrityksen läpi, se kohtaa ensin konjugaatin, joka on kohdeanalyytille spesifinen vasta-aine, joka on merkitty visuaalisella tunnisteella, yleensä kolloidisella kullalla. Vasta-aineet sitoutuvat näytteessä olevaan kohdeanalyyttiin ja siirtyvät yhdessä, kunnes ne saavuttavat testilinjan. Testilinja sisältää myös kohdeanalyytille spesifisiä immobilisoituja vasta-aineita, jotka sitoutuvat siirtyneisiin analyyttiin sitoutuneisiin konjugaattimolekyyleihin. Testilinjalla näkyy tällöin visuaalinen muutos, joka johtuu konsentroituneesta visuaalisesta tunnisteesta, mikä vahvistaa kohdemolekyylien läsnäolon. Useimmissa sandwich-määrityksissä on myös kontrolliviiva, joka näkyy riippumatta siitä, onko kohdeanalyytti läsnä vai ei, jotta voidaan varmistaa lateraalivirtaustyynyn moitteeton toiminta.

Nopeaa ja edullista sandwich-pohjaista määritystä käytetään yleisesti kotiraskaustesteissä, joilla osoitetaan ihmisen koriongonadotropiinia (hCG) raskaana olevien naisten virtsasta.

Kilpailukykyiset määritykset 

Kompetitiivisia määrityksiä käytetään yleensä pienille analyytteille, koska pienillä analyytteillä on vähemmän sitoutumiskohtia. Näyte kohtaa ensin kohdeanalyytin vasta-aineet, jotka on merkitty visuaalisella tunnisteella (värilliset hiukkaset). Testirivi sisältää kohdeanalyytin, joka on kiinnitetty pintaan. Kun kohdeanalyytti puuttuu näytteestä, sitoutumattomat vasta-aineet sitoutuvat näihin kiinnittyneisiin analyyttimolekyyleihin, jolloin näytteessä näkyy visuaalinen merkintä. Sitä vastoin kun kohdeanalyytti on näytteessä, se sitoutuu vasta-aineisiin ja estää niitä sitoutumasta testilinjan kiinteään analyyttiin, jolloin visuaalista merkkiainetta ei näy. Tämä eroaa sandwich-määrityksistä siinä, että kaistaleen puuttuminen tarkoittaa, että analyytti on läsnä.

Kvantitatiiviset testit 

Useimmat LFT-testit on tarkoitettu toimimaan puhtaasti laadullisesti. On kuitenkin mahdollista mitata testiviivan voimakkuutta näytteessä olevan analyytin määrän määrittämiseksi. Useat yritykset käyttävät kannettavia diagnostisia laitteita, joita kutsutaan sivuvirtauslukulaitteiksi, joiden avulla saadaan täysin kvantitatiivinen määritystulos. Käyttämällä valaistuksessa ainutlaatuisia valon aallonpituuksia yhdessä joko CMOS- tai CCD-detektointitekniikan kanssa voidaan tuottaa signaalirikas kuva todellisista testiviivoista. Käyttämällä kuvankäsittelyalgoritmeja, jotka on suunniteltu erityisesti tiettyä testityyppiä ja väliaineita varten, viivojen voimakkuudet voidaan sitten suhteuttaa analyyttien pitoisuuksiin. Yhden tällaisen käsikäyttöisen lateraalivirtauslaitealustan on valmistanut Detekt Biomedical L.L.C.. Vaihtoehtoisilla ei-optisilla tekniikoilla voidaan myös raportoida kvantitatiivisia määritystuloksia. Yksi tällainen esimerkki on magneettinen immunomääritys (MIA) LFT-muodossa, joka mahdollistaa myös määrällisen tuloksen saamisen. Näytteen nesteen kapillaarisen pumppauksen vaihteluiden vähentäminen on toinen tapa siirtyä laadullisista tuloksista määrällisiin. Viimeaikaisessa työssä on esimerkiksi osoitettu kapillaarinen pumppaus, jossa virtausnopeus on vakio ja riippumaton nesteen viskositeetista ja pintaenergiasta.

Matkapuhelimet ovat osoittaneet, että niillä on suuri potentiaali kvantifioinnissa lateraalivirtausmäärityksissä, ei ainoastaan laitteen kameran, vaan myös valosensorin tai matkapuhelimen akun tuottaman energian avulla.

Kontrollilinja 

Vaikka se ei ole ehdottoman välttämätöntä, useimmissa testeissä on toinen linja, joka sisältää vasta-ainetta, joka poimii vapaan lateksin tai kullan, jotta voidaan varmistaa, että testi on toiminut oikein.

Veriplasman uuttaminen 

Koska hemoglobiinin voimakas punainen väri häiritsee kolorimetristen tai optiseen ilmaisuun perustuvien diagnostisten testien lukemista, veriplasman erottaminen on yleinen ensimmäinen vaihe diagnostisen testin tarkkuuden lisäämiseksi. Plasma voidaan erottaa kokoverestä integroitujen suodattimien tai agglutinaation avulla.

Nopeus ja yksinkertaisuus 

Testituloksen saamiseen kuluva aika on näiden tuotteiden keskeinen tekijä. Testien kehittäminen voi kestää vain muutaman minuutin. Yleensä ajan ja herkkyyden välillä on kompromissi: herkempien testien kehittäminen voi kestää kauemmin. Tämän testimuodon toinen keskeinen etu muihin immunomäärityksiin verrattuna on testin yksinkertaisuus, sillä se vaatii yleensä vain vähän tai ei lainkaan näytteen tai reagenssin valmistelua.

Patentit 

Tämä on erittäin kilpaillut ala, ja useat tahot vaativat alan patentteja, erityisesti Alere (entinen Inverness Medical Innovations, nykyisin Abbottin omistuksessa), joka omistaa Unipathin alun perin hakemia patentteja. Ryhmä kilpailijoita kiistää patenttien pätevyyden. Myös useilla muilla yrityksillä on patentteja tällä alalla.

Sovellukset 

Sivuvirtausmäärityksillä on monenlaisia sovelluksia, ja niillä voidaan testata erilaisia näytteitä, kuten virtsaa, verta, sylkeä, hikeä, seerumia ja muita nesteitä. Tällä hetkellä kliiniset laboratoriot, sairaalat ja lääkärit käyttävät niitä nopeisiin ja tarkkoihin testeihin, joilla voidaan tutkia tiettyjä kohdemolekyylejä ja geeniekspressiota. Muita lateraalivirtausmääritysten käyttökohteita ovat elintarvike- ja ympäristöturvallisuus sekä eläinlääketiede kemikaalien sekä tautien ja toksiinien, löytämiseksi. LFT:tä käytetään yleisesti myös tautien, kuten ebolan, tunnistamiseen, mutta yleisin LFT on kotiraskaustesti.

COVID-19-testi 
Sivuvirtausmääritykset ovat olleet ratkaisevassa asemassa COVID-19-testauksessa, sillä niiden etuna on, että ne antavat tuloksen 15-30 minuutissa. Sivuvirtausmääritysten järjestelmällinen arviointi COVID-19-pandemian aikana aloitettiin Oxfordin yliopistossa osana Yhdistyneen kuningaskunnan yhteistyötä Public Health Englandin kanssa. Kesäkuussa 2020 Yhdistyneessä kuningaskunnassa alkanut tutkimus FALCON-C19 vahvisti joidenkin lateraalivirtauslaitteiden (LFD) herkkyyden tässä tilanteessa. Erityisesti Innova SARS-CoV-2 Antigen Rapid Qualitative Test -laitteelle tehtiin laajennettu kliininen arviointi kenttätutkimuksissa, ja sen todettiin olevan hyvä virusantigeenin havaitsemis-/herkkyysominaisuuksiltaan ja spesifisyydeltään erinomainen, vaikkakin testipakkauksen epäonnistumisprosentti ja koulutuksen vaikutus olivat mahdollisia ongelmia. Arvioinnin jälkeen Yhdistyneen kuningaskunnan hallitus päätti tammikuussa 2021 avata Englannissa yläkouluja, joissa oppilaat ja opettajat ottavat päivittäin LFT-testin, osana niin kutsuttua "Operation Moonshot" -operaatiota. Tammikuun 19. päivänä 2021 MHRA ei kuitenkaan hyväksynyt päivittäisiä pikatestejä vaihtoehdoksi itseruiskutukselle.

LFT-testejä on käytetty COVID-19:n joukkotestaukseen maailmanlaajuisesti, ja ne täydentävät muita COVID-19:n kansanterveystoimenpiteitä.

Jotkut hallituksen ulkopuoliset tutkijat ovat ilmaisseet vakavia epäilyjä Innova LFD:n käytöstä Covidin seulontaan. Birminghamin yliopiston biostatistiikan professorin Jon Deeksin mukaan Innova-testi on "täysin sopimaton" yhteisötestaukseen: "Koska testistä voi jäädä huomaamatta jopa puolet tapauksista, negatiivinen testitulos osoittaa pienentynyttä Covid-riskiä, mutta ei sulje pois Covidia". Asiantuntijoiden esittämän kritiikin ja sääntelyviranomaisen puuttuvan hyväksynnän vuoksi Yhdistyneen kuningaskunnan hallitus "keskeytti" päivittäiset LFT-testit Englannin kouluissa tammikuun 2021 puolivälissä.

Lähteet 

Immunologia
Biokemia