سنجش پروتئین برادفورد

آزمون سنجش پروتئین برادفورد (همچنین به عنوان آزمون سنجش پروتئین کوماسی شناخته می شود) توسط ماریون ام. برادفورد در سال 1976 ایجاد شد  این یک روش آنالیزی طیف‌سنجی سریع و دقیق  است که برای اندازه‌گیری غلظت پروتئین در محلول استفاده می‌شود. این واکنش به ترکیب اسید آمینه های پروتئین  اندازه گیری شده بستگی دارد..

Coomassie Brilliant Blue G-250.svg

اساس آزمون 
آزمون  برادفورد، یک آزمون رنگ سنجی پروتئین، مبتنی بر تغییر جذب رنگ Coomassie brilliant blue G-250   می باشد. رنگ Coomassie brilliant blue G-250 به سه شکل آنیونی (آبی)، خنثی (سبز) و کاتیونی (قرمز) وجود دارد.  در شرایط اسیدی، رنگ قرمز  به رنگ آبی  تبدیل می‌شود و به پروتئین  متصل می‌شود. اگر هیچ پروتئینی برای اتصال وجود نداشته باشد، محلول قهوه ای باقی خواهد ماند  این رنگ  توسط نیروی واندروالس و ازطریق برهمکنش های الکترواستاتیکی، یک کمپلکس قوی و غیرکووالانسی با گروه کربوکسیل پروتئین و گروه آمینه تشکیل می دهد.  در طی تشکیل این کمپلکس، شکل قرمز رنگ کوماسی ابتدا الکترون آزاد خود را به گروه‌های یونی روی پروتئین اهدا می‌کند که باعث تغییر ساختار پروتئین و در نتیجه باز شدن قسمت آبگریز آن می‌شود. این قسمت های آبگریز در ساختار سوم پروتئین از طریق اولین برهمکنش پیوند ( نیروهای واندروالس ) که گروه‌های آمین مثبت را در مجاورت بار منفی رنگ قرار می‌دهد، به‌صورت غیرکووالانسی به ناحیه غیر قطبی رنگ متصل می‌شوند. این پیوند با برهمکنش پیوند دوم بین این دو، برهمکنش یونی، بیشتر تقویت می شود. هنگامی که رنگ به پروتئین متصل می شود، باعث تغییر حداکثر جذب از 465 نانومتر به 595 نانومتر  می شود به همین دلیل است که قرائت جذب در 595 نانومتر  گرفته می شود 

شکل کاتیونی (متصل نشده) سبز/قرمز است و حداکثر طیف جذبی آن در 465 نانومتر است. شکل آنیونی (متصل شده)  رنگ که توسط فعل و انفعالات آبگریز و یونی در کنار هم نگه داشته می شود، دارای حداکثر طیف جذبی است که 595 نانومتر است.  افزایش جذب در 595 نانومتر با مقدار رنگ متصل شده و در نتیجه با مقدار (غلظت) پروتئین موجود در نمونه متناسب است و هر چه رنگ اتصال بیشتری با پروتئین داشته باشد جذب بیشتری به دست می آید. 

بر خلاف سایر تست های سنجش پروتئین،آزمایش برادفورد کمتر در معرض تداخل ترکیبات شیمیایی مختلف مانند سدیم، پتاسیم یا حتی کربوهیدرات‌هایی مانند ساکارز است که ممکن است در نمونه‌های پروتئینی وجود داشته باشد.  ، غلظت بالای دترجنت ها  تنها استثناء برای احتمال تداخل در این آزمون  است. سدیم دودسیل سولفات (SDS)، یک شوینده متداول است که ممکن است در پروتئین استخراج شده  یافت شود، زیرا از آن برای لیز سلولی از طریق تخریب لایه لیپیدی غشایی و دناتوره کردن پروتئین ها برای SDS-PAGE استفاده می شود. در حالی که سایر مواد شوینده در غلظت بالا با این آزمایش تداخل می کنند، تداخل ناشی از SDS در دو حالت مختلف است و هر کدام در غلظت متفاوتی رخ می دهد. هنگامی که غلظت SDS کمتر از غلظت بحرانی میسل (معروف به CMC، 0.00333% W/V تا 0.0667%) در محلول رنگ کوماسی  است ، ماده شوینده تمایل دارد به شدت با پروتئین متصل شود و مکان های اتصال پروتئین را برای معرف رنگ مهار کند. این می تواند باعث  کم تخمین زدن غلظت پروتئین در محلول شود. هنگامی که غلظت SDS بالاتر از CMC باشد، مواد شوینده به شدت با شکل سبز رنگ کوماسی مرتبط می‌شود و باعث می‌شود تعادل تغییر کند و در نتیجه شکل آبی بیشتری تولید شود. این باعث افزایش جذب در 595نانومتر  مستقل از حضور پروتئین می شود . 

  بافری که جهت تهیه نمونه پروتئین استفاده می شود می تواند  یکی دیگر از عوامل تداخل  باشد. غلظت بالای بافر به دلیل تخلیه پروتون های آزاد از محلول توسط باز مزدوج از بافر،باعث می شود غلظت پروتئین بیش از حد تخمین زده شود. در صورت استفاده از غلظت کم پروتئین (بعد از آن بافر) مشکلی ایجاد نخواهد شد. 

برای اندازه گیری جذب یک ترکیب بی رنگ، می توان از تست برادفورد استفاده کرد. برخی از ترکیبات بی رنگ مانند پروتئین ها را به دلیل وجود حلقه آروماتیک مانند تریپتوفان، تیروزین و فنیل آلانین می توان با چگالی نوری 280 نانومتر اندازه گیری کرد  است، اما اگر هیچ یک از این اسیدهای آمینه وجود نداشته باشد، جذب در 280 نانومتر  قابل اندازه گیری نیست.

مزایا 
بسیاری از محلول های پروتئینی، بالاترین جذب را در 280 نانومتر دارند. برای اینکار نیاز به اسپکتروفتومترهایی که قادر به اندازه گیری در محدوده UV می باشد. علاوه بر این، حداکثر جذب در 280 نانومتر مستلزم آن است که پروتئین ها حاوی اسیدهای آمینه آروماتیک مانند تیروزین (Y)، فنیل آلانین (F) و/یا تریپتوفان (W) باشند. همه پروتئین ها حاوی این اسیدهای آمینه نیستند، و به همین دلیل یکی از معایب این روش است . اگر اسیدهای نوکلئیک در نمونه وجود داشته باشد، نور را در280  نانومتر نیز جذب می کنند، که باعث می شود نتایج را بیشترمنحرف کنند. با استفاده از سنجش پروتئین برادفورد، می‌توان با مخلوط کردن نمونه‌های پروتئینی با رنگ Coomassie brilliant blue G-250 (معرف برادفورد) و اندازه‌گیری میزان جذب آنها در 595 نانومتر،که در محدوده قابل مشاهده  قرار دارد و ممکن است با استفاده از دوربین تلفن همراه هوشمند به دقت اندازه گیری شود ازبروز این مشکلات جلوگیری کرد.. 

روش  برادفورد بسیار آسان و ساده است. این آزمون در یک مرحله انجام می شود که در آن معرف برادفورد به همراه نمونه به یک لوله آزمایش اضافه می شود. پس از آنکه به طور کامل مخلوط شدند،رنگ این مخلوط  به رنگ آبی تغییر می کند. رنگ از طریق فرآیندی که حدود 2 دقیقه طول می کشد به پروتئین ها متصل می شود، در محلول های اسیدی حداکثر جذب رنگ از 465 نانومتر به  595 نانومتر تغییر می کند.  رخ می دهد.  این رنگ از طریق برهمکنش های الکترواستاتیکی با گروه های آمینو و کربوکسیل و همچنین برهمکنش های وان دروالس، پیوندهای غیرکووالانسی قوی با پروتئین ها ایجاد می کند. فقط مولکول‌هایی که به پروتئین‌های موجود در محلول متصل می‌شوند، این تغییر را در جذب نشان می‌دهند، که نگرانی تغییر جذب توسط مولکول های متصل نشده رنگ  را از بین می‌برد . این فرآیند سودمندتر است زیرا نسبت به روش‌های دیگر کم هزینه تر ، استفاده از آن آسان و حساسیت رنگ به پروتئین بالایی دارد. 

پس از آنکه 5 دقیقه انکوباسیون انجام شد، مقدار جذب را  در 595 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر یا دوربین تلفن هوشمند تلفن همراه خوانده شود..(روش RGBradford ). 

این آزمون یکی از سریع ترین روش های سنجش  است که روی پروتئین ها انجام می شود. کل زمان لازم برای آماده سازی و تکمیل آزمون کمتر از 30 دقیقه است. کل آزمایش در دمای اتاق انجام می شود.

سنجش پروتئین برادفورد  یک تکنیک فوق العاده حساس است و به کمک این متد می توان مقادیر 1 تا 20 میکروگرم  پروتئین رااندازه گیری کند. 

نمونه های پروتئینی معمولاً حاوی نمک ها، حلال ها، بافرها، نگهدارنده ها، عوامل کاهنده و عوامل کلات کننده فلزی هستند. این مولکول ها اغلب برای قابل حل نمودن و تثبیت پروتئین ها استفاده می شوند. سایر آزمایش‌های پروتئین مانند BCA وLowry به دلیل مولکول‌هایی مانند ،عوامل کاهنده که در آزمایش تداخل می‌کنند غیر موثر هستند .  استفاده از برادفورد می تواند در برابر این مولکول ها سودمند باشد زیرا آنها با یکدیگر سازگار هستند و تداخلی ندارند. 

با استفاده از شیب خط  نمودار  به دست آمده (جذب در برابر غلظت پروتئین در میکروگرم بر میلی لیتر) می توان به راحتی بن غلظت پروتئین ها را محاسبه نمود.

معایب 

تست برادفورد در یک محدوده  0 میکروگرم در میلی لیتر تا 2000 میکروگرم بر میلی لیترخطی است، به همین جهت ضروری است که رقت های نمونه  قبل ازآنالیزتهیه شوند. در ساخت این رقت ها، خطا در یک رقت در رقت های بعدی ترکیب می شود که منجر به یک رابطه خطی می شود که ممکن است همیشه دقیق نباشد.

در شرایط قلیایی ودر حضور دترجنت هایی، مانند SDS، می توانند در توانایی رنگ برای اتصال به پروتئین از طریق زنجیره های جانبی آن اختلال ایجاد کنند.  با این حال، برخی از پروتئین ها که توسط سد هسته ای بازدارنده شده اند، ممکن است سبب خطا در اندازه گیری غلظت گردند.

معرف هایی که  در این متد استفاده می شود تمایل به ایجاد رنگ بر روی لوله های آزمایش دارند. به همین دلیل از همان لوله های آزمایشی نمی توان استفاده کرد زیرا لکه ایجاد شده بر میزان جذب تأثیر می گذارد. این روش به زمان نیز حساس است. هنگامی که بیش از یک محلول آزمایش می شود، مهم است که مطمئن شوید هر نمونه برای مدت زمان یکسانی برای مقایسه دقیق انکوبه می شود.

همچنین پروتئین ها  با وجود دترجنت ها مهار می شود، اگرچه این مشکل را می توان با افزودن سیکلودکسترین به مخلوط سنجش کاهش داد. 

سنجش برادفورد با اندازه گیری نسبت جذب، 595 بر 450 خطی می شود.نانومتر این روش اصلاح شده برادفورد تقریباً 10 برابر حساس تر از روش معمولی است. 

رنگ Coomassie Blue G250  در روش برادفورد  بااتصال به آرژنین و لیزین به پروتئین متصل می شود. این یک نقطه ضعف است زیرا ترجیح رنگ برای اتصال به این اسیدهای آمینه می تواند منجر به پاسخ متفاوت سنجش بین پروتئین های مختلف شود. می توان با ایجاد تغییراتی  در روش اصلی، مانند افزایش pH با افزودن NaOH یا افزودن رنگ بیشتر این روش را  به مواد شوینده ای که می توانند با نمونه تداخل داشته باشند حساس نمود.

نمونه روش برادفورد 
مواد مورد نیاز:

 گاما گلوبولین پلاسمای گاوی لیوفیلیزه
 Coomassie brilliant blue
 0.15  NaCl
 اسپکتروفتومتر و کووت
 میکروپیپت ها

روش (آزمون استاندارد، 20-150 میکروگرم پروتئین؛ 200-1500 میکروگرم در میلی لیتر) 

 تهیه یک سری استاندارد رقیق شده با 0.15 مولار نمک طعام تا غلظت نهایی 0 (خالی = بدون پروتئین)، 250، 500، 750 و 1500 میکروگرم بر میلی لیتر همچنین رقت های سریالی نمونه ناشناخته را برای اندازه گیری آماده کنید.
 100 میکرولیتر از هر یک از موارد فوق را به یک لوله آزمایش جداگانه (یا لوله اسپکتروفتومتر در صورت استفاده از اسپکترونیک 20 ) اضافه کنید.
 به هر لوله 5.0 میلی لیتر کوماسی بلو اضافه کنید و با گرداب یا وارونگی مخلوط کنید.
 اسپکتروفتومتر را روی طول موج 595 تنظیم کنید نانومتر، با استفاده از لوله ای که حاوی پروتئین نیست (خالی).
 5 دقیقه صبر کنید و هر یک از استانداردها و هر یک از نمونه ها را در 595 بخوانید طول موج نانومتر
 جذب استانداردها در مقابل غلظت آنها را ترسیم کنید. ضریب خاموشی را محاسبه کرده و غلظت نمونه های ناشناخته را محاسبه کنید.

روش ( سنجش میکرو، 1-10 میکروگرم پروتئین در میلی لیتر) 

 غلظت های استاندارد پروتئین 1، 5، 7.5 و 10 میکروگرم بر میلی لیتر را تهیه کنید  فقط یک نمونه بلانک  از NaCl آماده کنید. یک سری رقت از نمونه آماده کنید.
 100 میکرولیتر از هر یک از موارد فوق را به لوله های جدا اضافه کنید (از لوله های میکرو سانتریفیوژ استفاده کنید) و 1.0 میلی لیتر Coomassie Blue به هر لوله اضافه کنید.
 یک اسپکتروفتومتر را روشن کرده و روی طول موج 595 نانومتر تنظیم کنید و اسپکتروفتومتر را با استفاده از کووت های 1.5 میلی لیتری بلانک کنید یا از دوربین تلفن همراه هوشمند (روش RGBradford ) استفاده کنید. 
 2 دقیقه صبر کنید و میزان جذب هر استاندارد و نمونه را در 595 نانومتر بخوانید 
 جذب استانداردها در مقابل غلظت آنها را ترسیم کنید. ضریب خاموشی را محاسبه کرده و غلظت نمونه های ناشناخته را محاسبه کنید.

استفاده از داده های به دست آمده برای یافتن غلظت نمونه مجهول 
برای بدست آوردن یک منحنی استاندارد، باید از غلظت های مختلف BSA ( آلبومین سرم گاوی )  استفاده نمود و منحنی استاندارد  را با غلظت رسم شده در محور x و جذب رسم شده در محور y ایجاد کرد . به منظور ایجاد یک منحنی استاندارد دقیق از دامنه غلظتی محدودی از BSA استفاده می شود (2-10 ug/mL) .  استفاده از دامنه وسیعی از غلظت پروتئین، تعیین غلظت پروتئین مجهول را دشوارتر می کند.  از این منحنی استاندارد برای تعیین غلظت پروتئین مجهول استفاده می شود. در ادامه نحوه استفاده از منحنی استاندارد جهت محاسبه  غلظت  پروتئین مجهول توضیح داده شده است.

ابتدا یک خط  با بهترین تناسب یا رگرسیون خطی اضافه کنید و معادله را روی نمودار نمایش دهید. در حالت ایده آل، مقدار R 2 تا حد امکان به 1 نزدیک است. R نشان دهنده مجموع مقادیر مربع خط است که از هر نقطه داده کم می شود. بنابراین، اگر R 2 بسیار کمتر از یک شد، بیهتر است که آزمایش را مجدداً تکرار شود  تا  داده های قابل اعتمادتر بدست آورید. 

BSA Standard Curve.png

جهت محاسبه غلظت نمونه های مجهول می توان از معادله نمایش داده شده در نمودار استفاده نمود.وجذب بدست آمده را در این معادله قرار داد . در نمودار 1، x غلظت و y جذب است، بنابراین باید معادله را تغییر داد تا x بدست آید  و جذب نمونه مجهول اندازه گیری شده را وارد کرد.  این احتمال وجود دارد که مجهول  جذب خارج از محدوده استاندارد داشته باشد. این نمونه ها را نمی توان به کمک این معادله محاسبه نمود زیرا معادله داده شده نمی تواند برای اعداد خارج از محدودیت های آن اعمال شود. در مقیاس بزرگ، باید ضریب خاموشی را با استفاده از قانون بیر-لامبرت A=εLC محاسبه کرد که در آن A جذب اندازه‌گیری شده، ε شیب منحنی استاندارد، L طول کووت و C غلظت است. در حال تعیین شدن  در مقیاس میکرو، ممکن است از یک کووت استفاده نشود و بنابراین فقط باید برای حل x دوباره مرتب شود.

Normalization of concentration.png

برای رسیدن به غلظتی که با داده ها همخوانی داشته باشد، رقت ها، غلظت ها و واحدهای مجهول باید نرمالیزه شوند  (جدول 1). برای انجام این کار،ابتدا باید غلظت پروتئین را بر حجم تقسیم کرد تا غلظت را نرمال کرد و سپس در مقدار رقیق شده ضرب کرد تا رقت ایجاد شده در پروتئین قبل از انجام آزمایش تصحیح شود.

روشهای جایگزین 
روشهای پروتئین جایگزین عبارتند از:
 طیف‌سنجی مرئی-فرابنفش
 آزمایش پروتئین بیورت
 سنجش پروتئین Lowry
 سنجش پروتئین BCA
 سنجش پروتئین سیاه آمیدو

منابع

پیوند به بیرون 
 شیمی آزمایش برادفورد
 طیف‌سنجی طول مسیر متغیر
 OpenWetWare

آزمون‌های شیمیایی
روش‌های پروتئینی
شیمی تجزیه