تعیین کمی پروتئین

تعیین کمی پروتئین ها
به طور کلی یک روش رضایت بخش و کامل برای تعیین غلظت هیچ نمونه پروتئینی وجود ندارد .
انتخاب یک روش ، وابسته به نوع و ماهیت پروتئین ، ماهیت سایر ترکیبات نمونه پروتئینی ، سرعت مورد لزوم ، دقت و حساسیت آزمایش است .

روش‌های مورد استفاده برای تعیین پروتئین‌ها:

بیوره 
 آزمایش بیوره : مکانیسم اندازه گیری پروتئین به روش بیوره تشکیل کمپلکس بین یونهای مس دو ظرفیتی(Cu 2+) و پیوندهای پپتیدی است و برای تشکیل کمپلکس نیاز به حداقل دو پیوند پپتیدی است تا کمپلکس تشکیل گردد که کمپلکس تشکیل شده رنگ بنفش دارد . جذب رنگ آبی تولید شده را در طول موج 540 نانومتر خوانش می کنند و از آنجایی که جذب با غلظت ارتباط مستقیم دارد طبق قانون بییر – لامبرت با رسم یک منحنی استاندارد مقادیر پروتئین مجهول در نمونه قابل اندازه گیری است .
هر چه تعداد پیوند پپتیدی بیشتر باشد شدت و غلظت رنگ بنفش زیادتر خواهد بودعلت تولید رنگ قرار گرفتن مس در بین دو پیوند پپتیدی است .
 آزمایش اثر حلال های آلی : حلال های آلی با تغییر نیروهای آب‌گریز و هیدروژنی، منجر به اختلال در ساختمان های دوم و سوم پروتئین می شود.
 آزمایش اثر فلزات سنگین : در PH حدود 7، بیشتر پروتئین ها دارای بار منفی هستند.بنابراین با یون های فلزات سنگین که دارای بار مثبت هستند، ترکیب شده و نمک های نامحلول این فلزات را تشکیل می دهند که منجر به رسوب پروتئین می گردد.
 آزمایش اثر اسیدها بر پروتئین ها : اسیدهابا تغییر PH و تغییر بار در گروه های آمین و کربوکسیل منجر به شکستن پیوندهای یونی و هیدروژنی در پروتئین ها شده و رسوب میدهند.

تست بیسین چونینیک (BCA) 
ویژگی های تست بیسین چونینیک (BCA) 
 حساسیت زیاد و سریع ، اگر در دماهای بالا مورد استفاده قرار گیرد .
 سازگار با بسیاری از دترجنت ها
 واکنشگر پایدار
 اختلاف بسیار کم در واکنش با پروتئین های متفاوت
 رنج کاری خطی عریض
 واکنشگر وقتی در دمای اتاق به کار برده می شود ، تمام نمی‌شود .

تست برادفورد (Bradford) 
 CBBG اولیه با آرژنین باقی‌مانده واکنش می دهد .
 اگر پروتئین آرژنین زیادی دارد، به استانداردی نیاز است که آرژنین زیادی داشته باشد .
 CBBG با این باقی‌مانده ها در فرم آنیونیک باند شده و جذب آن در 595nm خواهد بود .
 رنگ تنها با فرم کاتیونی می باشد و جذب آن در 470nm می باشد .
 ویژگیهای تست برادفورد (Bradford)
 ارزان و سریع
 بسیار ویژه برای پروتئین ها
 بسیار حساس [1-20 µg (micro assay) 20-200 µg (macro assay)] 
 سازگار با طیف وسیعی از مواد
 واکنشگر کمپلکسی است که تقریباً یک ساعت پایدار می ماند .
 کرو استاندارد ، غیر خطی است .
 جوابگو برای پروتئین های گوناگون ، انتخاب استاندارد بسیار مهم است .
 طیف جذبی فرمهای آنیونی و کاتیونی بر روی هم می افتد .
 لذا کرو استاندارد خطی نیست ، اگر چه که تهیه کنندگان این کیت ها اصرار بر خطی بودن آن دارند .
 خطی بودن آن در پهنای غلظتی کوچکی است .
 اگر نمونه بیشتر از 20 µg باشد ، بهتر است از یک منحنی درجه دوم به جای یک خط راست استفاده شود .

منابع 

Gornall, AG, CS Bardawill, and MM David. J. Biol. Chem. 177: 751. 1949.#
 Layne, E. Spectrophotometric and Turbidimetric Methods for Measuring Proteins. Methods in Enzymology 10: 447-455. 1957. 
 Robinson, HW and CG Hogden. J. Biol. Chem. 135: 707. 1940. 
 Slater, RJ (ed.). Experiments in Molecular Biology. Clifton, New Jersey: Humana Press, 1986. P. 269. 
 Weichselbaum, TE. Am. J. Clin. Pathol. Suppl. 10: 40. 1946.

==

محلول‌ها
مقاله‌های ایجاد شده توسط ایجادگر