Etidio bromuro

Etidio bromuroa (EtBr) agente tartekatzaile bat da, biologia molekularreko laborategietan erabiltzen dena agarosa gel elektroforesia bezalako tekniketan markatzaile fluoresente (azido nukleiko tartekatzaile) moduan. EtBr bezala laburbildu daiteke, zein aldi berean bromoetanoaren laburdura den, baina laborategi batzuetan EthBr bezala erabili ohi da nahasteak ekiditeko. Argi ultramorearen eraginpean laranja koloreko fluorespena eragiten du, fluoreszentzia hori ia 20 aldiz areagotzen da DNAri lotu ondoren. Etidio bromuroa DNAn tartekatzen denez, efektu mutagenoa eta kartzinogenoa edo teratogenoa eduki dezakeen ideia dago, baina nahiko segurua dela frogatu da. Gaur egun, badaude beste konposatu batzuk etidio bromuroaren funtzioa betetzen dutenak eta seguruago bezala saltzen direnak, efektu mutagenorik ez dutelako; adibidez, Sybr Safe (Invitrogen), Gel Red (Biotium) edo MIDORI green (Nippon Genetics).

Etidio bromuroak CAS1239-45-8 erreferentzia du eta formula kimikoa C21H20BrN3 da. Konposatu fluoreszente gehienak bezala, substantzia aromatikoa da. Molekularen zati handiena egitura trizikliko bat da, piridina molekula baten alde bakoitzean amino-bentzeno taldeak dituena (sei atomo, nitrogenoa eta eraztun aromatikoa). Dibenzopiridina egitura hori fenantridina izenarekin ezagutzen da.

Egitura, kimika eta fluoreszentzia 
Konposatu fluoreszente gehienak bezala, etidio bromuroa aromatikoa da. Bere oinarrizko zati heteroziklikoa fenantridina moduan ezagutzen da, eta horren isomero bat akridina koloratzaile fluoreszentea da. EtBr molekularen xurgapen maximoak ur-disoluzioan 210 nm eta 285 nm artekoak dira, argi ultramoreari dagozkienak. Kitzikapen horren ondorioz, EtBr-ak 605 nm-ko uhin-luzera duen argi laranja igortzen du.

Etidio bromuroaren fluoreszentzia DNArekin lotu ondoren ziurrenik ez dagokio fenil zatiaren egonkortze zurrunari, fenilo-eraztunak tartekatutako baseetatik kanpo proiektatzen direla frogatu baita. Horren ordez, arrazoia base pareen artean aurkitutako ingurune hidrofoboa dela uste da. Ingurune hidrofobo horretara mugitzean eta disolbatzailetik urruntzean, etidio katioiak lotuta dituen ur-molekulak askatzen ditu. Ura fluoreszentziaren itzaltzaile eraginkorra denez, ur molekula horiek kentzean etidioak fluoreszentzia igortzen du.

Aplikazioak 

Biologia molekularreko laborategietan azido nukleikoak detektatzeko erabiltzen da etidio bromuroa. DNAren kasuan, helize bikoitzekoa izan ohi da. Bestalde, RNA ere detektatu daiteke, izan ere, bere buruarekin tolesten da eta base parekaketak sortzen diren guneetan molekula tartekatzen da. Detekzioetan normalean azido nukleikoak dituzten gelak erabiltzen dira lanpara ultramore batekin argiztatuta. Argi ultramorea begietarako eta azalerako kaltegarria denez, etidio bromuroa daukaten gelak zeharka ikusten dira, itxitako ganbara baten bidez. Zuzenean ikusi behar den kasuan, ikuslearen begiak eta agerian dagoen azala babestu behar dira.

Etidio bromuroa agarosa gel elektroforesiaren bidez DNA zatiak bereizteko ere erabiltzen da. Tanpoi migratzaileari gehitzen zaio eta DNA base-bikoteen artean tartekatzen da. Agarosa gela argi ultramorearekin argiztatzen denean, DNA-bandak ikusten dira. EtBr-aren arteko tartekatzeak DNA molekulen propietateak alda ditzake, hala nola, karga, pisua, konformazioa eta malgutasuna. Agarosa gelaren zehar DNA molekularen mugikortasuna pisu molekularraren araberakoa denez, EtBr-aren efektuak erabakigarriak izan daitezke molekulen tamainak zehazterako orduan.

Etidio bromuroa ere asko erabili da ugaltzen ari diren zeluletan DNA mitokondrialaren kopia kopurua murrizteko. EtBr-ek DNA mitokondrialean duen eragina albaitaritzan behien tripanosomiasia tratatzeko erabiltzen da, EtBr-ak kinetoplastidoen DNA molekulak lotzen eta horien konformazioa Z-DNA formara aldatzen baitu. Forma horren ondorioz, kinetoplastido DNAren erreplikazioa oztopatzen da, tripanosomentzat hilgarria dena.

Amaitzeko, etidio bromuroa YEPD meditoetara gehitu daiteke zelulen hazkuntzaren inhibitzaile gisa erabiltzeko.

Gelaren alternatibak 
Badira etidio bromuroaren alternatibak arrisku gutxiago eta errendimendu hobea daukatela iragartzen dutenak. Esaterako, ikertzaile batzuek SYBRn oinarritutako hainbat koloratzaile erabiltzen dituzte eta beste koloratzaile batzuk sortzen ari dira, hala nola "Novel Juice". SYBR koloratzaileak ez dira EtBr bezain mutagenikoak, gibel-erauzkinarekin egindako Ames probaren arabera. Hala ere, UV azpian ikusgai (koloratzaile biak ikusteko erabiltzen da) zeuden bakterio-zelulentzako SYBR Green I EtBr baino mutagenikoagoa zela ikusi zen.

SYBR Safe-ren MSDSak arratoientzako LD50 5 g/kg baino gehiagoko balio baten berri ematen du, zein EtBr-arena baino handiagoa (1,5 g/kg) den. Tindaketa helburuetarako EtBr-ren ordez SYBR koloratzaileak erabiltzeak etekinean abantaila duen arren, ikertzaile askok oraindik EtBr nahiago dute, askoz merkeagoa baita.

Arriskuak 
Etidio bromuroak osasun-arrisku larriak eragiten ditu, mutageno gisa jokatzen du kate bikoitzeko DNAn tartekatzen delako, hau da, kateen artean txertatu eta DNA deformatuz. Ugaztunetan zein bakterioen zeluletan mutagenikotasuna erakusten duten proba ugari izan arren, animalia bizietan epe luzerako probarik ez izatea arriskutsua ez dela argudiatzeko arrazoi bezala erabili da. Hala ere, ikerketa laborategi modernoek normalean produktu kimiko arriskutsu gisa tratatzen dute. 1975ean, etidio bromuroa bakterioentzako mutagenoa zela aurkitu zen (Ames probaren bidez), eta DNAn toxikotasuna ere eragin zuen gibel-homogeneizatuaren tratamenduaren ondoren. 1994an, Toxikologia Programa Nazionalak in vivo (biziak) arratoi, sagu eta hamster zeluletan EtBr konposatuak mutagenikotasun handia erakusten zituen ikerketak ere aurkitu zituen. Azterketek ondorioztatu zuten EtBr genotoxikoa zela. Kartzinogenizitateari dagokionez, saguetan egindako ikerketa batek etidio bromuroa erabili zuen p53 genean alterazioak detektatzeko eta minbizia hautemateko. Etidio bromuroaren bidez p53 genean mutazioak induzitzen saiatu ziren, baina zelulak oso mutatuta egon arren, p53 genean ez zen mutaziorik aurkitu.

Etidio Bromuroaren mutagenikotasun handia dela eta, azterketa bat egin zen saguetan EtBr-a agente kimioterapeutiko antitumoral gisa ebaluatzeko. Bertan, etidio bromuroa gizakien eta saguen mitokondrioentzako oso mutagenoa zela ikusi zen. Ikerketa berriago batek erakusten du EtBr-ek  topoisomerasa I-entzat pozoi gisa jokatzen duela eta giza DNA mutatzen duela. Ezaugarri hori dela eta, minbiziaren aurkako botiken ikerketarako oinarri gisa erabiltzea proposatu da, baina oraindik ez da etidio bromuroa erabiltzen duten botikarik garatu. Horrela, badira konposatuaren toxikotasuna zalantzan jarri duten iruzkintzaileak.

Etidio bromuroaren erabilera gehiena laborategian (0,25-1 µg/ml) LD50 dosiaren azpitik dago. Gizakietan probak egitea eta edozein ugaztun-sistematan azterketa luzeagoak egin beharko lirateke epe luzerako etidio bromuroak laborategiko langileentzat duen arriskua guztiz ulertzeko, baina argi dago etidio bromuroak ugaztun zein bakterio zelulak erabat mutatzen eta hiltzen dituela.

Isurketak 
Etidio bromuroa kontzentrazio baxuetan ez dago hondakin arriskutsu gisa erregulatuta, baina erakunde askok hondakin arriskutsu gisa tratatzen dute. Materiala materialen segurtasun-datuen fitxaren (MSDS) arabera maneiatu behar da.

Laborategiko etidio bromuroa botatzea gai polemiko bat da oraindik. Etidio bromuroa kimikoki degradatu daiteke, edo bildu eta erraustu. Ohikoa da agindutako kontzentraziotik beherako etidio bromuroaren hondakinak modu normalean botatzea (esate baterako, hustubide batera botatzea). Beste ohiko praktika bat etidio bromuroa sodio hipokloritoarekin (lixibarekin) tratatzea da, eta ondoren botatzea.

Erreferentziak

Kanpo estekak 

Amina aromatikoak