Proteina berde fluoreszente

Proteina berde fluoreszentea (edo GFP, ingelesezko siglen arabera, green fluorescent protein) Aequorea victoria marmokak sortutako proteina da, eta fluoreszentzia igortzen du espektro ikusgaiaren berdegunean, zeina biolumineszentzia terminoaren ezberdina den. Proteina hau kodetzen duen genea aspaldian isolatu egin da, eta biologia molekularrean erabili ohi da markatzaile gisa.

A. victoriaren GFP proteinak 395 nm-ko uhin-luzera baino eszitazio-gailur handiagoa eta 475 nm baino txikiagoa du. Haren emisio-gailurra 509 nm da, espektro ikusgaiaren behealdean. GFPren fluoreszentzia-etekin kuantikoa (QY) 0,79 da. Renilla reniformisren GFP proteinak 498 nm-tik gorako kitzikapen-gailur bakarra du. GFPa tresna bikaina da biologia-arlo askotan, kofaktore osagarririk, produktu genetikorik edo oxigeno molekularra ez den entzima edo substraturik behar izan gabe barne-kromoforo bat osatzeko gaitasuna duelako.

Historia 
Osamu Shimomura GFPa isolatzen lehena izan zen. 60ko hamarkadaren hasieran Aequorea Victoriatik GFPa bakantzeaz gain, fluoreszentziaren eragilea zein zati zen identifikatu zuen. Washingtongo Unibertsitateko Frank Johnsonekin batera, kaltzioaren menpeko proteina fluoreszente bat isolatu zuen, eta aequorina izena jarri zion, lan egiteko erabiltzen zuten marmokari erreferentzia eginez. Proteina honek fluoreszentzia igortzen du espektroaren gune urdinean. Aldi berean, fluoreszentzia berdexka igortzen zuen beste proteina bat identifikatu zen argi ultramorearen presentzian eta, beraz, "proteina berde fluoreszente" izena eman zitzaion.

Hurrengo urteetan egiaztatu zen fluoreszentzia igortzeko medusak kaltzio-ioiak askatzen dituela, eta horiek aequorinak argi urdina igortzea aktibatzen dutela. GFPak, berriz, kaltzio-ioiak askatutako argia xurgatzen du, eta bere argi berde bereizgarria sortzen du. Hala ere, Douglas Prasherrek ez zuen 1987ra arte onartu GFPak markagailu gisa zuen potentziala.

1992an, cDNA tekniken bidez sekuentziatu zen lehen aldiz GFP proteina (Prasher et al., 1992); baina 1994ra arte ez zen lortu fluoreszentzia mantentzea. Chalfie-k (Chalfie et al., 1994), Inouy-k eta Tsuji-k (Bilesek aipatua, 1998) lortu zuten fluoreszentzia mantentzea beste organismo prokariotiko eta eukariotiko batzuekin egindako labore batean. Horrekin frogatu zuten GFParen geneak bere kabuz biltzen duela kromoforoa sintetizatzeko behar den informazio guztia, eta ez duela eskatzen Aequorea victoria medusaren entzima espezifikoen ekintza.

Duela gutxi beste proteina fluoreszente batzuk identifikatu dira: proteina hori fluoreszentea (ingelesezko YFP laburduragatik ezaguna) eta gorria (RFP), besteak beste. Gainera, jatorrizko proteina horiek aldatu egin dira funtzionamendua hobetzeko. Hobekuntza horien emaitzetako bat da proteina berde fluoreszente hobetua (edo EGFP, ingelesezko siglengatik, "enhanced green florescent protein").

Tsienen taldeak proteina txikiagoak garatu zituen GFPtik abiatuta, eta, baita, fruten izenak jarri zizkien beste batzuk ere, hala nola mPlum, mCherry, mStrawberry, mOrange eta mCitrine distiren kolorearen arabera.

Ezaugarriak 
Proteina berde fluoreszenteak bi eszitazio-gailur ditu: lehena, 395 nm-tik gertu eta, bigarrena, 475 nm-tik gertu. Bestalde, bi igorpen-tontor ere baditu: 395 nm-ra kitzikatua bada, haren igorpen-tontorra 508 nm-koa izaten da eta, 475 nm-ra kitzikatzen bada, aldiz, 503 nm-ko igorpena gertatuko da, hau argi-ikusgaitik kanpo proteinak argi gehiago xurgatzen du eta argi ikusgai berdexka bihurtu. GFP proteina 238 aminoazidok osatzen dute, eta horien sekuentzia Prasher-ek eta haren laguntzaileek deszifratzen dute (Prasher et al., 1992). Serina, tirosina eta glizina aminoazidoek GFP proteinaren kromoforoa osatzen dute.

Emisio-egitura eta -espektroa 
Proteina berde fluoreszentearen egitura 1996an determinatu zen. GFPa 230 aminoazido inguruko proteina monomerikoa da, eta ß upela bezala ezagutzen den egitura tertziarioa osatzen du, gerora karakterizatutako beste proteina fluoreszente askotan ohikoa dena. Proteina honetan, ß upela 11 katez osatuta dago eta erdiko ⍺ helize bat dauka, upela luzera osoan zeharkatzen duena. Helize horretan, kromoforo natural bat osatzen duten ondoz ondoko hiru aminoazido daude eta, beraz, GFPa argi ultramoreaz argiztatzen denean, fluoreszentzia berde distiratsua sortzen du.

GFP proteinak kromoforo berezi bat du (65, 66 eta 67 aminoazidoek osatua), argia xurgatu eta igortzen duen talde kimikoa dena. UV argiak edo argi urdinak kromoforoari eragiten dionean, horrek argi-energia hartu eta kitzikatu egiten da. Hurrengo urratsean, kromoforoak energia askatzen du, argia kolore berdearen uhin-luzeran igorriz. Ezaugarri garrantzitsu bat da GFPak ez duela gehigarririk behar distira egiteko, aequorina eta beste proteina biolumineszente batzuek ez bezala. Gehigarririk beharko balu, molekula energetikoak zeluletan etengabe injektatu beharko lirateke, baina nahikoa da GFPa UV argiarekin edo urdinarekin erradiatzea fluoreszentzia igortzeko. Marmokaren jatorrizko GFPak bi eszitazio-gailur ditu: txikiena, 475 nm-an eta bestea, 395 nm-an. Haren igorpen-gailurra 509 nm-an dago, espektroaren berdegunean.

Egitura kuaternarioa aztertu zenean, agerian geratu zen GFParen kontzentrazio altuak proteina beraren azpiunitateak eta mintzeko beste proteina batzuk batzearen ondorio direla. Fenomeno horri dimerizazioa deritzo, eta fluoreszentzia inhibitzen du. Behar bezala tolestutako 1 µL GFP proteina behar da proteinak argia igor dezan.

Proteina berde fluoreszentea naturan 
Ezezaguna da zer funtzio duten biolumineszentziak (aequoforinak luziferinaren gainean egiten duena) eta GFP proteinak marmoketan duen fluoreszentziak. Marmokaren kanpaiaren ertzaren inguruan, GFP proteina aequorinarekin batera pikor txikietan sortzen da. GFParen bigarren mailako kitzikapen-gailurrak (480 nm) aequorinaren igorpen urdinaren zati bat xurgatzen du, eta biolumineszentziari tonu berdeagoa ematen dio. Marmokak biolumineszentziaren kolorea sakoneraren arabera alda dezake.

Friday Harbor-eko marmoka-populazioa murriztu egin da, non hasiera batean GFP proteina aurkitu zen. Beherakada horrek oztopatu egin du GFP proteinak marmoken ingurune naturalean duen zereginaren ikerketa. GFParen antzeko proteinak aurkitu dira hainbat itsas kopepodotan, bereziki Pontellidae eta Aetideidae familiakoetan.

Aplikazioak

Erreportari laguntzailea 
Proteina berde fluoreszentea gene-erreportari gisa erabil daiteke. GFPren abantailarik handiena da, egiaztagarria izan daitekeela, eta zelulak eta ehunak etengabe aztertzeko aukera ematen duela. GFPa ikustea ez da kaltegarria eta argi urdinaren presentzia nahikoa da GFP ikus dadin. GFPak berez ez du prozesu biologikoetan esku hartzen, baina proteina interesgarriekin fusionatzen denean, linkerrak kontu handiz diseinatu behar dira intereseko proteinaren funtzioa mantentzeko. Gainera, monomero batekin erabiltzen bada, gai da zelula guztietara erraz barreiatzeko.

Fluoreszentziako mikroskopia 
GFParen eta haren eratorrien eskuragarritasunak sakonki birdefinitu ditu fluoreszentzia-mikroskopia eta biologia zelularrean eta beste diziplina biologiko batzuetan erabiltzeko modua. Nahiz eta molekula fluoreszente txiki gehienak fototoxiko handiak izan zelula bizietan erabiltzen direnean, GFP bezalako proteina fluoreszenteak ez dira hain kaltegarriak zelula bizietan argiztatzen direnean. Horren ondorioz, oso automatizatuta dauden zelula bizien fluoreszentziako mikroskopia-sistemak garatu dira, proteina fluoreszentez markatutako proteina bat edo gehiago adierazten duten zelulei denboran zehar behatzeko erabil daitezkeenak.

Zelula bizien irudien esperimentu batean GFP proteina erabiltzeko teknika asko daude. GFPa erabiltzeko modurik zuzenena intereseko proteina bati zuzenean eranstea da. Adibidez, GFPa beste gene batzuk adierazten dituen plasmido batean sar daiteke, intereseko gene baten transferentzia arrakastatsua adierazteko.

Bereizketa morfologikoa ahalbidetzen duten egituretan ere adieraz daiteke GFP proteina. Kasu horietan, GFPa ekoizten duen genea organismoaren genomari gehitzen zaio xede-proteinak kodetzen duen eta erregulazio-sekuentzia berak kontrolatzen duen DNA-eskualdean; hau da, genearen erregulazio-sekuentziak markatutako proteinak kontrolatzeaz gain, GFParen ekoizpena ere kontrolatzen du. Genea adierazten den zeluletan eta markatutako proteinak sortzen diren zeluletan, GFPa aldi berean sortzen da. Beraz, markatutako genea edo itu-proteinak adierazten dituzten zeluletan bakarrik gertatuko da fluoreszentzia fluoreszentziako mikroskopioaren bidez behatzen zaienean. Metodo hori erabilgarria da eskala makromolekularrean edo molekula bakarraren eskalan, markatutako proteinaren ezaugarri estrukturalak eta funtzionalak aztertzeko fluoreszentzia-mikroskopia erabiliz.

Halaber, GFP proteinadun arratoi transgenikoen lerro berriak garrantzitsuak izan daitezke bai terapia genikorako bai medikuntza birsortzailerako. GFP "oso adierazkorra" erabiliz, arratoi transgenikoek adierazpen handia dute ehun gehienetan, eta karakterizatu ez diren edo GFPdun beste arratoi transgenikoetan soilik ezaugarritu diren zelula asko agertzen dira.

GFP proteina oso erabilia da minbiziaren ikerketan, minbizi-zelulak etiketatzeko eta jarraitzeko. GPFarekin markatutako minbizi-zelulak metastasia modelizatzeko erabili dira; metastasia minbizi-zelulak urruneko organoetara barreiatzeko prozesua da.

Maskota transgenikoak 
Alba untxi berde fluoreszentea Eduardo Kac-ek zuzenduriko laborategi frantses batek sortu zuen, GFP proteina erabiliz artearen eta gizartearen helburuetarako. AEBtako Yorktown Technologies enpresak akuario-dendetan merkaturatu zituen zebra-arrain fluoreszente berdeak (GloFish). Hasieran, ur-ibilbideetan kutsadura detektatzeko helburuarekin sortu ziren. NeonPets, Estatu Batuetan oinarritutako enpresa batek sagu fluoreszente berdeak merkaturatu zituen maskoten industriarako NeonMice gisa. Txerri berde fluoreszenteak, Noels izenekoak, Wu Shinn-Chih buru zuen ikertzaile talde batek hazi zituen Taiwango Unibertsitate Nazionaleko Animalien Zientzia eta Teknologia Sailean. Japoniar-amerikar talde batek katu berde fluoreszenteak sortu zituen gaixotasunak (batez ere GIB birusa) detektatzeko proba gisa. 2009an, Seulgo Unibertsitate Nazionaleko Hego Koreako talde batek itsasoko anemonen fibroblasto-zelulekin hazi zituen lehen txakur transgenikoak. Txakurrek argi fluoreszente gorria igortzen dute, eta zientzialariek gizakien gaixotasunak eragiten dituzten geneak aztertzeko erabiltzen dira, hala nola narkolepsia eta itsutasuna.

Erreferentziak

Kanpo estekak 

Proteinak
Optika
Zelulen irudigintza
Proteina fluoreszenteak