Ti plasmidoa

Tumore induzitzaile (Ti) plasmidoa Agrobacterium generoko espezie patogenoetan aurkitzen den plasmidoa da; A. tumefaciens, A. rhizogenes, A. rubi eta A. vitis bakterioetan, besteak beste. Plasmido horiek, aipatutako bakterioek infektatzen dituzten landareen zelulei plasmido beraren informazio genetikoaren zati bat transferitzeko gaitasuna dute.

Eboluzioari dagokionez, Ti plasmidoak Alphaproteobacteria klaseko espezieek garraiatzen dituzten plasmido familia baten parte dira. Plasmido familia horren ezaugarri nagusiena repABC izenez ezagutzen den DNA eskualde kontserbatu bat da, non bere funtzioa plasmidoaren erreplikazioa eta zatiketa gidatzea eta zelula ostalarian dagoen plasmido kopia kopurua egonkor mantentzea den.

Bakterioek, landareetan gaixotzeko eragiten dituzten zezidio egiturak sortzeko, Ti plasmidoa eta horietan agertzen diren eskualde batzuk behar dituzte. Alde batetik, birulentzia geneak kodetzen dituzten vir sekuentziak eta, bestetik, konjugazio bidez landareen zelula ostalarietara transferituko diren DNA zatiak (T-DNA). Eskualde horien bitartez, zauritutako landare zeluletara T-DNA transferituko da zuzenean eta, horrek, horietan aldaketak eraginez, landare hormonen (auxina, zitokininak…) eta zezidio tumoreen sintesia eragingo du.

Ti plasmidoaren T-DNA eskualdea bakterioetatik landareetara zuzenean transferitu daitekeenez, horren inguruko ikerketa oso zabaldua da eta erreinuen arteko DNA transferentzia garatzeko aurreikuspenak itxaropentsuak dira.

Egitura 
Ti plasmidoak harizpi bikoitzeko DNA zirkularrez osaturiko eta tamaina nahiko handiko (200-800 Kb) plasmidoak dira. Mota honetako plasmidoan zenbait osagai bereiz ditzakegu:

 Erreplikazio jatorria (ORI), bakterioetan plasmidoaren erreplikazioa gertatzeko proteinek ezagutu behar duten sekuentzia.
 Birulentzia edo vir eskualdea, birulentzia gene ezberdinek osatzen dutena (25eraino daude deskribatuta); horietako bi (virA eta virG) adierazpen konstitutibokoak dira, beharrezkoak virB, virC, virD eta virE geneen adierazpenerako.
 Transferentzia eskualdea (T-DNA), 24-25 base-pareko bi ertzek mugaturikoa, eskumako ertza (“Right Border”) eta ezkerreko ertza (“Left Border”) bezala ezagunak. Ertz hauek Ti plasmido ezberdinen artean oso kontserbatuta daude. Eskualde honetan auxina eta zitokininen sintesirako entzimak kodetzen dituzten gene talde bat dago, eta baita opinen sintesirako zenbait gene ere.
 Opinen katabolismorako entzimak kodetzen dituzten geneak.

Birulentzia mekanismoa 
Landare baten genomarainoko T-DNAren transferentzia prozesu konplexua da, eta hau gertatzeko beharrezkoak dira T-DNAren alboetako ertzak, vir gene aktibatuak, eta kromosoma bakterianoak kodetutako bestelako gene batzuk (ros, ivr, esaterako), landare zelula eta bakterioaren arteko elkarketa burutzeko ezinbestekoak direnak.

Orokorrean, zauritutako landareak jariatzen dituen zenbait konposatu kimikoren bitartez Agrobacterium bakterioa beregana erakartzen du. Bakterioa landareak duen zauriaren bitartez landare-zelulara barneratu eta Ti plasmidoaren zati bat transferitzen du (T-DNA), konjugazio antzeko mekanismo baten bitartez. T-DNA landare zelulan barneratu eta zelularen zatiketa estimulatuko duten bi hormona kodetzen dituzten geneen adierazpena sustatuko da. Horretaz gain, bakterioaren biziraupenerako opinak ere sintetizatuko dira. Prozesu honen bitartez, landare zelulan tumorea sortuko da, bakterioa bertan haziz.

Birulentzia operona 
Ti plasmidoaren vir eskualdearen adierazpena egoera normaletan erreprimituta egoten da, eta bakterioak landare zaurituak askaturiko seinaleak detektatzen dituenean soilik aktibatzen da. Aktibazio hau beharrezkoa da vir proteinen ekoizpenerako eta landare zelulara T-DNA transferitzeko.

VirA eta VirG proteinek Agrobacterium barneko erregulazio-sistema osatzen dute, bakterioetan ohikoa den detekzio eta seinaleztapen sistema. Kasu honetan, landareak askaturiko seinaleak jaso eta vir eskualdearen adierazpenaren sustapenean jarduten du erregulazio-sistema honek.

Landare zaurituak jariaturiko azetosiringona bezalako konposatu kimikoak VirA proteinak ezagutu eta histidina hondar espezifiko batean autofosforilatuko da, ondoren fosforilo taldea VirG proteinara pasarazi eta azken hau ere aktibatuz. VirG proteinaren aktibazioak vir eskualdearen adierazpena abian jarriko du, horien artean VirD eta VirE geneak. VirD genearen aktibaziotik lorturiko VirD1 (topoisomerasa) eta VirD2 (endonukleasa) produktuek T-DNA katearen bi ertzetan mozketa bana egingo dute. VirD2 DNA harizpiaren 5’ muturrean kobalenteki lotuta mantenduko da, mutur horren delezioa ekidinez. Askaturiko harizpi bakarreko DNA katea VirE2 proteinek estaliko dute, DNA nukleasen aurrean babestuz eta landare zelularen genomara zuzenduz. Behin landare zelularen barnean, VIP1 proteina VirE2 proteinara lotu eta T-DNAren babespenean jardungo du.

T-DNAren txertaketa landare zelularen genoman 
T-DNA kate bakarrak, landare zelularainoko garraio prozesuaren momenturen batean kate bikoitzeko forma hartuko du, eta Ti plasmidoan geratzen den hutsune monokatenarioa zenbait sistema zelularrek konponduko dute. Bakterioak pilus (hodi proteikoa) sortu eta T-DNA zitoplasma zelularrera garraiatuko da. 

Dirudienez, T-DNA landarearen genoman ausaz barneratzen da eta behin txertatuta, T-DNA-n kokatutako geneak piztu egingo dira. T-DNA-k zenbait gene ditu, auxina eta zitokinina hormonen zein opinen sintesia kodetzen dutenak. Alde batetik, auxina eta zitokinina hormonen sintesia emango da. Auxinek landare zelulak azkarrago haztea eragiten duten bitartean, zitokininek zelulen zatiketa estimulatzen dute. Hori dela eta, zelulen gehiegizko zatiketa eta hazkuntza eman eta zezidio tumorea sortuko da.

Bestetik, landare zelulek opina izeneko mantenugai ez-ohikoak sintetizatu eta kantitate handitan ingurura jariatuko dituzte. Opina hauek bakterioek soilik erabil ditzakete, opinen katabolismorako geneak Ti plasmidoaren bestelako eskualde batzuetan kodetuta baitaude. Beraz, Agrobacterium-ek opina hauek aprobetxatuko ditu bere hazkuntzarako, baina landareak ezin izango ditu erabili.

Erabilerak bioingeniaritzan 
Ti plasmido eraldatuen erabilera oso zabaldua dago landareen ingeniaritza genetikoaren alorrean. Izan ere, Agrobacterium-ek landare zeluletan DNA txertatzeko duen gaitasunak landareen ingeniaritzan ate berriak ireki zituen, genetikoki eraldatutako landareen ekoizpena ahalbidetuz (landare transgenikoak).

Genetikoki eraldatutako Ti plasmidoak daramatzaten Agrobacterium bakterioak intereseko geneak landareetara transferitzeko erabiliak dira. Prozesua orokorki azalduz, T-DNAren transferentzian inplikaturiko proteinek T-DNAren ertzetako sekuentziak ezagutuko dituzte, eta horiek erabilgarriak  izango dira intereseko edozein sekuentzia txertatzeko. Modu horretan, gure sekuentzia Ti plasmidoan barneratuta dagoela bakterioan integratuko da. Bakterio zelulek euren makineria erabiliz, T-DNAren ertzetako sekuentziak identifikatu eta gure intereseko sekuentzia landare zelulara barneratuko dute. T DNAn aldez aurretik auxina, zitokinina zein opinen sintesirako geneak ezabatu direnez, txertaturiko sekuentziak landarearen genoma eraldatuko du inolako tumorerik sortarazi gabe.

Erreferentziak

Kanpo estekak 

Bioteknologia