DNA sekuentziazio



Oinarri teorikoa 
Azido nukleikoak izaki bizidun baten informazio genetikoa gordetzen duten biomolekulak dira. Nagusiki, zelula batean aurkitu daitekeen material genetikoa Azido desoxirribonukleikoa (ADN) da, baina Azido erribonukleiko (ARN) ere aurkitu daiteke. ADNak izaki bizidunen garapenerako beharrezkoa den informazio guztia kodetzen du eta belaunaldiz belaunaldi transmititzen da, herentzia moduan ezagututako prozesuaren bidez .

Informazio genetikoa kodetzeko prozesu berezia jarraitzen da. ADN molekula osatzen duten azpiunitateak (Nukleotidoak) base nitrogenatuak (edo Base nukleikoak) dituzte haien konposizioan. Base hauek lau letra erabilita ezagutzen dira: adenina (A), timina (T), zitosina (C) eta guanina (G). ARNan timina ordezkatzen duen uraziloa (U) aurkitzen da . ADNan baseak hirunaka irakurtzen dira (hirukote, kodoi, triplete) eta horietan oinarrituz ARNa sintetizatzen da. ARNan hirukoteak "irakurtzen" dira, itzulpen izeneko prozesu baten bidez, eta horietako talde bakoitzak aminoazido (proteinen azpiunitateak) baterako kodetzen dute, Kode genetikoa erabiliz.

Beraz, sekuentziazio genetikoa, material genetikoa osatzen duten baseen ordena ezagutzeari esten zaio. Hau da, izaki bizidunetan aurkitzen den material genetikoaren sekuentzia ezagutzeari deritzo, teknika biokimiko desberdinak erabiliz. Sekuentzia ezagutzea ezinbestekoa da biologia molekularreko hainbat teknika aurrera atera ahal izateko. Gainera, gaur egun oso ezagunak dira gaixotasun genetikoak, eta hauen atzean sekuentzia genetiko oker bat aurkitzen da. Horregatik, diagnostiko eta tratamendurako beharrezkoa da sekuentzia ezagutzea. Are gehiago, kontseilu genetikorako ere nahitaezkoa da sekuentziazioa egitea .

Sekuentziazio genetikorako metodoak 
Historian zehar asko izan dira sekuentzia genetikoa ezagutzeko garatu diren metodoak. Nahiz eta teknika berritzaile batzuk ARNa sekuentziatzeko helburua duten, orokorrean ADNa da sekuentziatzen den molekula. Hona hemen teknika horietako batzuk.

Lehenengo belaunaldiko sekuentziazio metodoak

Maxam-Gilbert sekuentziazioa 

Allan Maxam eta Walter Gilbertek garatu zuten metodoa (1976-1977) ADNaren aldaketa kimikoan eta base espezifikoen bereizketan oinarritzen da . Era zabal batean ADNa sekuentziatzeko lehenengo metodoa izan zen, eta Sanger sekuentziazioarekin batera, lehenengo belaunaldiko metodoa da.

Allan Maxam eta Walter Gilbertek garatu zuten metodoa (1976-1977) ADNaren aldaketa kimikoan eta base espezifikoen bereizketan oinarritzen da . Era zabal batean ADNa sekuentziatzeko lehenengo metodoa izan zen, eta Sanger sekuentziazioarekin batera, lehenengo belaunaldiko metodoa da.

Laburki, ADN molekula lau erreakzio kimiko zehatz desberdinen bidez zatitzen da eta muturrak erradioaktiboki markatzen dira. Ondoren, sekuentziatu nahi diren zatien purifikazioa egiten da. Azkenik, gel elektroforesi baten bidez tamainaren arabera banatzen dira ADN zatiak. Erreakzio bakoitzean lortutako zatiak ikusteko, autorradiografia bidez egiten da. Autoerradiografia horren bidez banda batzuk agertuko dira poliakrilamidazko gelean eta banda horietatik, ADN sekuentzia inferitu daiteke.

Dagoeneko gaur egun metodo zahar bat da eta ez da erabiltzen.

Sanger sekuentziazioa 

1977. urtean Frederick Sangerek ADNa sekuentziatzeko metodo berri bat garatu zuen: Sanger metodoa . Metodo honen berrikuntzarik nagusia dideoxinukleotidoen (ddNTP) erabilera da. Hauen berezitasuna da 3' muturrean -OH taldea falta zaiela (desoxinukleotidoekin (dNTP) konparatuz). Hori dela eta, sekuentziazio prozesuan zehar molekula sintetizatzen doan heinean, ddNTP bat sartzen denean, sintesia eteten da.  

Era labur batean, hau izango litzateke Sanger metodoaren funtzionamendua:  

 Lehenik eta behin, sekuentziatu nahi den ADNa isolatu behar da eta Polimerasaren kate-erreakzioaren (PCR) bidez kopiak egiten dira (anplifikazio moduan ezagututa).
 ADNa desnaturalizatu behar da, sekuentziazio erreakziorako harizpi bakarreko molekula erabiltzen delako.
 Sekuentziazio erreakziorako primer edo hasle moduan ezagututako ADN zati txikiak (oligonukleotidoak) behar dira. Gainera, lau erreakzio desberdin prestatzen dira. Erreakzio bakoitzean erradiaktiboki markatutako ddNTP bat gehitzen da. Sintesi prozesuan zehar, dNTPak gehitzen joango dira eta noizean behin, zoriz, ddNTP bat gehituko da. Behin ddNTPa gehituta, sintesia geldituko da eta beraz luzera desberdineko zatiak lortuko dira.
 Behin erreakzioak  amaituta, akrilamidazko gel batean kargatzen dira, bakoitza kale batean. Elektroforesia burutzen da eta zatiak tamainaren arabera banatzen dira, base bateko erresoluzioarekin.
 Autoerradiografia erabiliz gela errebelatzen da eta ADN zati bakoitzari dagokion banda ikusgarri egiten da. Era honetan, sekuentzia "irakurri daiteke".

Sekuentziazio automatikoa 
Oinarri moduan Sanger metodoa erabiltzen du . Kimikoki, aurreko atalean azaldutakoa jarraitzen du, baina kasu honetan ez da erreadioaktibitatea erabiltzen. Aldiz, ddNTP bakoitzak fluoroforo desberdin bat du lotututa. Prozesua erraztu eta azkartzearren, automatizatu egin zen. Kasu honetan, elektroforesi gelak erabili beharrean, sekuentziadore moduan ezagututako aparatuak erabiltzen dira. Sekuentziadorean elektroforesi kapilar bat egiten da eta laser batekin didesoxinukleotidoen fluoroforoak kitzikatzen dira. Kitzikatutakoan, fluoroforoek fluoreszentzia igortzen dute eta sekuentziadoreak seinale hori irakurtzen du. Seinalea irakurri ahala, sekuentzia ebazten doa. Emaitza moduan, sekuentzia elektroferograma eran ematen da (beheko irudia).

Gaur egun sekuentziazio metodoen hartean urrezko estandarra da. Hau da, sekuentzia bat analizatzerako orduan, ontzat ematen diren emaitzak teknika honetatik lortutakoak dira.

Bigarren belaunaldiko sekuentziazio metodoak 
Lehenengo belaunaldiko sekuentziazio metodoekin sekuentzia gutxi batzuk azertu daitezke aldi berean eta gainera denbora aldetik asko eskatzen dute. Hori dela eta, bigarren belaunaldiko metodoak garatu dira . 

Next Generation Sequencing (NGS) moduan ezagutzen diren metodoen ezaugarriak honako hauek dira:

Milioika irakurketa sortzen dituzte paraleloan.
 Lehenengo belaunaldiko metodoak baino azkarragoak dira.
 Koste ekonomikoa baxuagoa da.
 Erabiltzen den makinariak analisiaren parte handia egiten du, ez dira beharrezkoak elektroforesi gelak.

Plataforma eta metodo ugari daude , baina erabilienetakoak hauek dira:

Pirosekuentziazioa 
Luminiszentzian oinarrituz ebazten da ADNaren sekuentzia .  Entseguan entzima desberdinak erabiltzen dira: luziferasa, ATP sulfurilasa, ADN polimerasa eta apirasa. Gainera, bi sustrato ere beharrezkoak dira: luziferina eta adenosin-5-fosfosulfatoa (APS). Sekuentziazio prozesuan zehar, banan-banan gehitzen dira nukleotidoak. Nukleotidoa gehitzerakoan, pirofosfato bat askatzen da eta erreakzio desberdinen bidez luziferina oxiluziferinan bihurtzen da eta honek luminiszentzia ematen du.

Gaur egun ez da asko erabiltzen, bestelako NGS metodoek abantaila gehiago erakusten dituztelako. Hala ere, aplikazio batzuetarako (adibidez metilazio maila ezagutzeko) oso erabilgarria da.

Illumina 
Illumina, Inc. enpresak garatutako metodoan , sintesian oinarritutako sekuentziazioa egiten da.

Lehenik eta behin ADNa zatitzen da eta adaptadore batzuk gehitzen zaizkio. Ondoren, "libreria" izeneko ADN multzoak lortzeko, "zubi PCR" bat egiten da. Era honetan, sekuentziatu nahi diren ADN zatien kopia asko lortuko dira. Azkenik, sekuentziazio erreakzioan fluoreszenteki markatutako nukleotidoak erabiltzen dira. Molekulara gehitzen direnean, fluoreszentzia igortzen dute, argazki bat ateratzen da eta era honetan jakin daiteke ze base sartu den. Ondoren, beste nukleotido bat gehitzen da, gero beste bat, ... eta horrela ADN zatiaren sekuentzia osoa irakurri arte.

Roche 454 
Roche taldeak garatutako metodoa , komertzializatu zen lehenengo NGS plataforma izan zen. ADNa zatitzeko spray metodoa erabiltzen du eta adaptadoreak jartzen ditu ADNaren bi muturretan. Material genetikoaren kopiak egiteko, "emultsio PCR" izaneko erreakzioa erabiltzen da. Amaitzeko, pirosekuentziazioan oinarritutako sekuentziazioa egiten da .

Ion torrent 
Metodologia honen berezitasuna honako hau da: sekuentziazioaren prozesuan zehar, sintetizatzen ari den molekulan gehitzen diren nukleotidoek askatzen dituzten protoiei esker inferitzen da sekuentzia .

Hirugarren belaunaldiko sekuentziazio metodoak 
Sekuentziazio metodologia berrienak dira eta oraindik garapen fasean daude horietako asko. Multzo honen barruan sartzen diren teknologiak long-read sequencing moduan ere ezagutzen dira . Aurreko sekuentziazio metodoekin alderatuz, hiru abantaila nagusi dituzte:

 Sekuentzia luzeagoak irakur daitezke, 5.000 eta 15.000 bp artean.
 Epigenetika mailan gertatzen diren aldaketak ikusi daitezke.
 Askoz azkarragoak dira eta aparatuak errazago mugitu daitezke.

Haien aurrerapenei esker, aplikazio ugari dituzte arlo askotan: epigenetika, trasnkriptomika, metagenomika, ...

Hirugarren mailako sekuentziazioan hiru plataforma komertzial aritzen dira: Pacific Biosciences molekula bakarreko denbora errealeko (SMRT, Single Molecule Real Time) sekuentziazioa , Illumina Tru-seq Synthetic Long-Read teknologia  eta Oxford Nanopore . Hauen berezitasuna honako hau da: molekula bakar batetik abiatuta anplifikazioa egin dezakete.

Erreferentziak

Kanpo estekak 
Maxam-Gilbert sekuentziazio bideoa: https://www.youtube.com/watch?v=_B5Dj8PL4E0
Sanger metodoaren bideoa: https://www.youtube.com/watch?v=KTstRrDTmWI
Illumina plataformaren NGS sekuentziazioa: https://emea.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing.html
NGS sekuentziazio desberdinen konparaketa: https://www.youtube.com/watch?v=JNqXgLKOzKU&ab_channel=ImGenTechWPI

DNA
Ingeniaritza genetikoa
1970 zientzian
Biologia molekularra
Bioteknologia