Mutagenesi zuzendu

Mutagenesi zuzendua, gene baten DNA sekuentzian eta edozein produktu genikotan, nahita mutazio espezifikoak eragiteko erabiltzen den biologia molekularreko metodo bat da. Oligonukleotidoen bidezko mutagenesi zuzendua edota leku batera zuzendutako mutagenesi espezifiko bezala ere ezagutzen da. DNA, RNA eta proteinak bezalako molekulen estruktura eta jarduera biologikoa aztertzeko baliagarria da.

Laborategiko teknika garrantzitsuenetarikoen artean dago DNA sekuentzietan mutazioak sartu eta horrela DNA liburutegiak sortzerako orduan. Mutagenesi zuzendua lortzeko zenbait metodo existitzen diren arren, oligonukleotidoen sintesiaren kostua gutxitzearekin batera gene artifizialen sintesia erabiltzen hasi da mutagenesi zuzenduaren alternatiba gisa. 2013. urtetik aurrera, birusekiko defentsa prokariotoan oinarritzen den CRISPR/Cas9 teknologiaren garapenak genoma editatzea ahalbidetu du eta horrela mutagenesia erraztasun erlatiboarekin garatu daiteke in vivo.

Historia 
Erradiazio bidezko edo mutageno kimikoen bidezko mutagenesia burutzeko lehenengo saiakerak ez ziren leku jakin baterako espezifikoak, ondorioz, zorizko mutazioak sortzen zituzten. Beranduago, nukleotidoen analogoak eta beste produktu kimiko batzuk erabiltzen hasi ziren mutazio puntual  lokalizatuak sortzeko asmotan. Aipatutako produktu kimiko hauen adibide batzuk ondorengoak izan daitezke: aminopurina , nitrosoguanidina  eta bisulfitoa .

Mutagenesi zuzendua 1974. urtean lortu zen Charles Weissmann-en laborategian, N4-hidroxizitidina nukleotidoaren analogo bat erabiliz, zeinak GC-tik AT-rako trantsizioa induzitzen duen . Hala ere, mutagenesi metodo hauek sor dezaketen mutazio motaren arabera mugatuta daude eta ez dira beranduago aurkitutako metodoak bezain espezifikoak.

1971an Clyde Hutchison eta Marshall Edgell ikerlariek frogatu zuten,  ϕX174 fagoaren zati txikiak eta errestrikzio nukleasak erabiliz mutanteak ekoiztea posible zela . 1978an  Hutchison eta Michael Smith mutagenesi gidatura gehiago gerturatu ziren, oligonukleotidoak erabilz DNA polimerasaren bidez hasleak luzatzeko metodo batean. Poriektu honetan parte hartzeari esker, 1993. urtean Michael Smith ikerlariak Kimikako Nobel Saria lortu zuen Kary B. Mullis-ekin batera, azken hau polimerasaren kate-erreakzioa asmatu zuena izan zelarik.

Oinarrizko mekanismoa 
Oinarrizko prozedura burutzeko, DNA hasle labur bat sintetizatu behar da. Hasle sintetiko horrek intereseko mutazioa izango du eta mutazio gunearen inguruan dagoen DNA moldearen osagarria da, beraz, intereseko genearen DNArekin hibridatu daiteke. Mutazioa nukleotido bakarraren aldaketa bat izan daiteke (mutazio puntual bat), hainbat nukleotidoren aldaketa, delezioa edo insertzioa. Ondoren, DNA katearen sintesia ematen da DNA polimerasa entzima erabiliz harizpi bakarreko hasletik abiatuta. Horretarako, DNA kate moldea oinarritzat hartzen da, sintesian horren osagarriak diren nukleotidoak gehituz. Horrela kopiatutako geneak mutazioa izango du, eta zelula ostalari edo bektore batean sartuz, hau klonatu egiten da. Azkenik, mutanteak DNAren sekuentziazioaren bidez hautatzen dira, intereseko mutazioa dutela egiaztatzeko.

Metodoak 
Hasle bakar baten luzapena erabiltzen zuen jatorrizko metodoa ez zen eraginkorra, mutanteen errendimendu baxuaren ondorioz. Nahasketak jatorrizko harizpi ez-mutatua eta mutatua ditu, progenie mutanteen eta ez-mutanteen populazio mistoa sortuz. Gainera, eredutzat erabilitako jatorrizko harizpia metilatuta dago, kate mutantea metilatu gabe dagoen bitartean, eta mutanteak kontra-hautatuak izan daitezke, harizpi metilatuaren DNA foboratzen duen konponketa mekanismo bat dagoelako. Ondorioz, mutante gutxiago izatea eragingo du. Orduz geroztik, mutagenesiaren eraginkortasuna hobetzeko ikuspegi asko garatu dira.

Leku batera zuzendutako mutagenesia burutzeko hainbat metodo dauden arren , gehienak ez dira laborategian erabiltzen. Izan ere, gaur egun dauden teknika berriek modu sinpleago eta errazago batean sortzen dituzte lekuarekiko espezifikoak diren mutazioak geneetan.

Kunkel-en metodoa 
1985ean, Thomas Kunkelek teknika berri bat aurkeztu zuen zeinak mutanteak hautatzeko beharra murrizten duen . Mutatu nahi den DNA sekuentzia M13mp18/19 bezalako fasmido (bioteknologian erabiltzen de klonazio bektore bat) batean txertatzen da eta gero dUTPasa (dut) eta urazilo deglukosidasa (udg) entzimarik gabeko  E. coli andui batean transformatzen da. Bi entzima horiek DNA konponketa mekanismoetako bide batean parte hartzen dute, zeinak mutazioen kromosoma bakterioanoak babesten dituen dCTP eta dUTP nukleotidoen desaminazio espontaneoaren bitartez. dUTPasaren urritasunak dUTP-aren deskonposizioa ekiditen du eta horrek zelulan dUTP maila altuetan egotea eragiten du. Urazilo deglukosidasaren urritasunak aldiz, sintetizatu berri den DNA-tik uraziloa ezabatzea ekiditen du. Mutazio bikoitzdun E.coli bakterioak fagoaren DNA erreplikatzen du eta beraz, bere makineria entzimatikoak akats gisa dUTP gehitu dezake dTTP gehitu beharrean, horrek urazilo batzuk (ssUDNA) dituen kate bakarreko DNA sortzea eragingo duelarik. ssUDNA hori medioan askatutako bakteriofagotik isolatu eta gero mutagenesirako eredu bezala erabiltzen da. Haslearen luzapenerako intereseko mutaziodun oligonukleotido bat erabiliko da. Eratzen den DNA heteroduplexaren harizpi bat parentala izango da, mutatu gabea eta dUTP duena, beste harizpia aldiz mutatua izango da eta dTTP edukiko du. Jarraian, DNA dut eta udg geneak dituen E. coli andui basati batean transformatzen da. Kasu honetan, urazilodun DNA harizpi parentala degradatu egiten da eta modu horretan geratzen den DNA gehiena harizpi mutatuak osatzen du.

Cassette bidezko mutagenesia 
Beste metodoetan ez bezala, cassete bidezko mutagenesian ez da DNA polimerasaren bidezko haslearen luzapena gertatzen. Metodo honen bidez, DNA zati bat sintetizatzen da, ondoren plasmido batean txertatzen dena . Murrizketa entzima baten bidez, plasmidoaren gune espezifiko batean ebaketa egiten da, ondoren, mutazioa duten eta osagarriak diren oligonukleotidoak plasmido horretara lotzen dira ligazio bidez. Plasmidoa eta oligonukleotidoak mozten dituzten murrizketa entzimak berdinak izan ohi dira, horrela, plasmidoak dituen mutur itsaskorren eta txertatutako oligonukleotidoen arteko lotura ematen da. Metodo honek, %100eko eraginkortasuna duten mutanteak sortzeko aukera ematen du, baina mutatu nahi den eskualdearen inguruko murrizketa guneen erabilgarritasunagatik mugatua dago.

PCR bidez zuzendutako mutagenesia 

Aurreko teknikan aipatutako mutagesi guneek dituzten mugak gainditzeko, PCR teknika erabilgarria da, oligonukleotidoz osatuta dauden hasleak dituena. Horrela, bi murrizketa lekuak barne hartzen dituen sekuentzia luzeagoa sintetizatuko da. PCRaren bidezko anplifikazio esponentzialaren ondorioz, gure intereseko mutazioa duen zatia lortzen da, gel elektroforesia erabiliz mutatu gabeko jatorrizko plasmidotik banatu ahal izateko kantitate nahikoa izango duena. Banatutako edo isolatutako zati hau biologia molekular birkonbinatuaren teknikak erabiliz jatorrizko gunean txertatzeko aukera dago. Dena den, teknika honen zenbait aldaera desberdin egon daitezke. Alde batetik, PCR sinpleenak mutazio gunea DNA sekuentziaren mutur batean kokatzen du, beraz, zatia lortzeko erabili diren bi oligonukleotidoen artean, bakarrak mutazioa adieraziko du. Hau PCRan pausu bakarra izango da, baina hasle oso luze bat ez erabiltzekotan, oraindik mutazioaren alboko murrizketa gune egoki baten presentzia eskatzen du. Hori dela eta, PCRaren beste aldaerek bi edo hiru oligonukleotido erabiltzen dituzte. Horietariko bi komenigarriak diren murrizketa guneetan dauden oligonukleotido ez mutagenikoak izan daitezke eta digerituta edota plasmido bati lotuta egoten dira. Mutagenikoa den oligonukleotidoa, aldiz, isolatutako DNA sekuentziako edozein gunerekiko osagarria izan daiteke, komenigarria den murrizketa gunetik urrun egon arren. Metodo hauek, hainbat PCR pausu behar dituzte, amaieran lotuko den sekuentziak gure intereseko mutazioarekin izan dezan. Gure intereseko mutazioa duen eta errestrikzio gune egokiak dituen sekuentzia ekoizteko diseinua garatzeko zenbait software erabil daitezke, horien artean, SDM-Assist .

Plasmido osoaren mutagenesia 
Plasmidoa manipulatzeko, mutagenesi zuzenduko zenbait teknika sinpleagoak eta eraginkorragoak diren beste teknika batzuengatik ordezkatuak izan dira, azken hauek erabilerrazak eta kit erakoak izaten direlarik. Teknika hauen adibide bat Quikchange metodoa da , bertan osagarriak diren bi hasle mutageniko erabiltzen dira plasmido guztia anplifikatzeko. Anplifikazio hau termoziklazio erreakzio baten bitartez lortzen da, fideltasun altuko DNA polimerasa bat erabiliz, zeinak ez duen harizpia desplazatzen pfu polimerasak egiten duen bezala. Erreakzioak DNA zirukular akastu bat sortzen du. DNA moldea ezabatua izan behar da digestio entzimatikoaren bitartez, DNA metilatuarekiko espezifikoa den Dpnl bezalako errestrikzio entzima bat erabiliz. E. coli bakterioaren andui gehienetatik abiatuz ekoiztutako DNA guztia metilatuta egongo da; E. coli bakterioan biosintetizatzen den plasmido moldea, beraz, digeritua izango da eta plasmido mutatua aldiz, in vitro sortzen dena eta ondorioz metilatuta ez dagoena, digeritu gabe geratuko da. Harizpi bikoitzeko plasmidoen mutagenesi metodo hauetan, termoziklazio erreakzioa erabili daitekeen arren, ez da DNA esponentzialki anplifikatzea behar, PCRan gertatzen den bezala. Bestalde, anplifikazioa lineala da eta ondorioz ez da guztiz zuzena PCR gisa definitzea, ez baitago kate erreakziorik.

Kontuan hartu behar da, pfu polimerasak harizpia despalazatu ahal duela, luzapen tenperatura altuago batean (≥70 °C), eta horrek esperimentuaren porrota ekar dezakela, hori dela eta, luzapen erreakzioa gomendatutako tenperaturan burutu behar da, 68 °C. Aplikazio batzuetan ikusi da, motodo honek hasleen kopia ugariren txertaketa bultzatzen duela . Metodoaren bariazio batek, SPRINP gisa ezagutzen dena, artefaktu hau ekiditen du eta horregatik lekuko mutagenesi zuzendu mota askotan erabili izan da .

Oligozuzendutako helburuen (SMOOT) ekorketa bidezko mutagenesia bezalako beste teknika batzuk, modu semialeatorio batean oligonukleotido mutagenikoak konbinatu ahal dituzte plasmidoen mutagenesian. Teknika honek plasmidoen mutagenesiaren liburutegiak sor ditzake, mutazio bakarretatik gene oso baten kodonen mutagenesira arte doazenak.

Mutagenesi zuzenduaren metodoak in vivo 

 Delitto perfetto 
 “pop-in-pop-ou” trasplantea
 Geneen ezabapen zuzena eta leku batera zuzendutako mutagenesi espezifikoa PCR eta markatzaile birziklagarri baten bidez
 Geneen ezabapen zuzena eta leku batera zuzendutako mutagenesi espezifikoa PCR eta markatzaile birziklagarri baten bidez, eskualde homologo luzeak erabiliz
 Leku batera zuzendutako mutagenesia in vivo oligonukleotido sintetikoekin

CRISPR 
2013. urtetik, CRISPR-Cas9 teknologiaren garapenak genomako mutazioen txertaketa eraginkorra ahalbidetu du organismo mota askotan. Metodo honek ez du transposonen tartekatze gune baten beharrik, ez du markatzeilerik uzten eta bere eraginkortasun zein sinpletasunak genomaren ediziorako metodo erabilienetariko batean bilakatu du.

Aplikazioak 
Leku batera zuzendutako mutagenesia, propietateetan hobekuntzak edo berezitasunak dituen arrazionalki diseinatutako proteina bat ekoizteko gai diren mutazioak sortzeko erabiltzen da (proteinen ingeniaritza).

Ikerkuntzako tresnak: DNAko mutazio espezifikoek DNA sekuentzia baten edota proteina baten funtzio eta propietateak ikertzea ahalbidetzen du ikuspegi arrazional batetik. Gainera, mutagenesi zuzenduaren bidez proteinetan emandako aminoazido bakar baten aldaketak itzulpenaren osteko aldaketen garrantzia ulertzen lagundu dezake. Adibidez, proteina substratu batean serina konkretu bat alanina batengatik aldatzeak, fosfato taldearen lotura blokeatzen du, zeinak fosforilazioa ikertzea ahalbidetzen duen. Ikuspegi hau kinasa HIPK2  bidezko CBP proteinaren fosforilazioa aurkitzeko erabili da. Beste ikuspegi global bat, lekuen asetze mutagenesia da, non kodon bakarra edo kodon taldeak ordezka daitezkeen aminoazido aukera posible guztiekin, posizio espezifikoetan. 

Aplikazio komertzialak: Proteinak eraldatuak izan daitezke aplikazio espezifiko batera egokituko diren forma mutatuak ekoizteko. Adibidez, detergeneteek subtilisina eduki dezakete, zeinaren forma basatia lejiagatik oxidatua izan daitekeen metionina bat duen, proteinaren aktibitatea prozesuan zehar nabarmenki txikituz . Metionina hau alanina edota beste hondar batzuez ordezkatua izan daiteke, oxidazioarekiko erresistente bilakaraziz eta lejiaren presentzian proteina aktibo mantentzea lortuz .

Genearen sintesia 
DNA oligonukleotidoen sintesiaren kostua txikitzen doan heinean, gene baten sintesi artifizial totala bideragarria bilakatzen ari da, geneetara mutazioak sartzeko orduan. Metodo honek, mutagenesi hedagarria ahalbidetzen du leku desberdinetan, genearen kodonen birdiseinua barne hartuz gene hori organismo konkretu batentzat optimizatzeko .

Erreferentziak

Kanpo estekak 

Genetika molekularra