Urkil txikiko RNA

Urkil txikiko RNA edo shRNA (ingelesez short hairping RNA) urkila forma duen RNA molekula txiki eta artifizial bat da. Bere funtzioari dagokionez, itu-genearen adierazpena RNA interferentzia bidez isilarazteko balio du. Horrela, gene horrek kodetzen duen proteinaren funtzioa azter daiteke, bide biologikoak karakterizatuz eta gene eta proteinen arteko elkarrekintzak identifikatuz.  

Zeluletan shRNAren adierazpena emateko, bertara garraiatu behar da eta hau plasmido edo bektore biriko edo bakterianoen bidez egin daiteke. shRNA RNA interferente (iRNA) mota abantailatsu bat da, degradazio- eta ordezkapen-tasa nahiko txikia duena.  Horregatik eta beste hainbat arrazoiengatik, shRNA etorkizunerako agente terapeutiko eraginkor bat izan daitekeela uste da. Hala ere, funtzionala izateko adierazpen-bektore baten beharra du eta honek aplikazio terapeutikoetan albo-ondorioak izan ditzake.

Garraioa 
Zeluletako shRNAren adierazpena plasmido edo bektore biriko edo bakterianoen garraio bidez lor daiteke. Plasmido bidezko shRNAren transferentziarako, merkatuan in vitro dauden erreaktiboak erabil daitezke. Hala ere, metodo hori ez da aplikagarria in vivo eta beraz, erabilera mugatua du.

Bektore bakterianoen erabilera nahiko ikuspegi berria da. Ikerketa batean saguak shRNA txertatuta duen plasmidoa garraiatzen duen Escherichia coli birkonbinatuz elikatu ziren. Horrela, heste-epitelioko itu-genearen adierazpen genikoa eteten zela ikusi zen.

Bektore biriko mota bat baino gehiago erabil daiteke zeluletako shRNA adierazpena lortzeko, adenobirusak, hauei lotutako birusak (ingelesez adeno-associated viruses edo AAVak) eta lentibirusak esaterako. Lehenengo biei dagokienez, genomak ez dira ostalariaren informazio genetikoan txertatuko. Infekzio egoera arrunt batean, birusak bere genoma ostalariarenean txertatu ohi du eta horrela ostalariaren makineria zelularra erabiliz bere burua hainbat aldiz kopiatuko du. Ez txertatze hori onuragarria izan daiteke, ostalariaren genomaren aldaketa ekiditen delako. Hala ere, badu bere desabantaila ere, zelularen progeniak berehala galduko baitu garraiatutako birusaren genoma zelula-zatiketaren bidez, zelula oso mantso zatitzen ez bada behintzat. AAVak, adenobirusekin alderatuz, gene birikoak ezabatu eta haien paketatze-ahalmena murrizten dute. Lentibirusetan transkripzio bidez aktibatzen den kromatinaren eskualdean integratzen da eta beraz, ondorengo zeluletara transmititzen dira.

Jarduera 

Bektorea ostalarian integratu ondoren, nukleoan II edo III RNA polimerasak shRNA  transkribatzen du, sustatzailearen arabera. Sustatzailearen aukeraketa egokia funtsezkoa da shRNAren adierazpen sendoa lortzeko. Hasiera batean, III polimerasaren sustatzaileak erabiltzen ziren baina hauek espazio- eta denbora-kontrolik ez dutela ikusi zen. [3] Beraz, azken urteetan II polimerasaren sustatzaileen erabilera sustatu da, hauek egokiagoak baitira shRNAren adierazpena erregulatzeko.

Transkripzio-produktua Drosha erribonukleasak prozesatzen du, RNA hidrolizatuz zati txikiagotan. Lortutako pre-shRNA, exportina batek nukleotik kanporatuko du. Ondoren, produktu hori Dicer erribonukleasak prozesatu eta RISC konplexuan (ingelesez RNA-induced silencing complex) kargatzen da. Itu-genearen harizpietako bat, kate atzeratua (5’-3’ noranzkoduna), degradatu egiten da eta besteak, kate gidariak (3’-5’ noranzkoduna), RISC konplexua mRNAra zuzentzen du, bere sekuentzia osagarria duena. Guztiz osagarriak badira, RISC konplexuak mRNA apurtuko du. Aldiz, osagarritasun partziala badago, RISC konplexuak mRNAren itzulpena erreprimituko du. Bi kasuetan, shRNAk itu-genea isilarazten du.

Erabilera terapia genikoan 
shRNAn oinarritutako terapiak erronka ugari ditu oraindik. Adierazgarriena, terapia genikoko beste metodo batzuekin gertatzen den bezala, garraio mekanismoa da. shRNA bektore baten bidez txertatzen da normalean, eta oro har metodo eraginkorra den arren, zalantza handiak sortzen ditu bere segurtasunari buruz. Zehazki, ikerketa klinikoetan frogatu da birusetan oinarritutako terapia genikoko metodoak arriskutsuak izan daitezkeela. Terapia geniko erretrobiralaren lehen belaunaldian, bektore biralekin tratatutako Wiskott-Aldrich sindromeko gaixo batzuek leuzemia akutua garatu zuten, bektore bat txertatzearen ondorioz. 

RISC konplexu molekularra gain asetzea ere arazo bat da. Izan ere, shRNA maila altuegietan adieraziz gero, posible da zelula RNA endogenoa (ostalariaren RNA) behar bezala prozesatzeko gai ez izatea eta horrek arazo larriak sor ditzake. Beste erronka bat pazienteak terapiaren aurkako erantzun immunea garatzeko aukera da, arrotza den RNA molekula bat baita administratzen dena.  Azkenik, zaila den arren, shRNAak beste gene batzuk isilaraz ditzake nahi gabe. Beraz, shRNAn oinarritutako terapia geniko berri bat arrakastaz garatzeko, erronka horiek guztiak hartu behar dira kontuan.

Hala ere, shRNAk errepresio geniko oso espezifiko eta iraunkorra emateko duen trebetasunaren ondorioz, interes handia garatu da terapia genikoan shRNA erabiltzeko.

Erreferentziak

Kanpo estekak 

RNA