Oligonukleotido

Oligonukleotidoak DNA edo RNAren sekuentzia laburrak dira, berrogeita hamar base pare edo gutxiagoz osatuak. 

Funtzio desberdinak dituzte: anplifikazio erreakzioetan abiarazle gisa erabiltzen dira, hibridazio-zunda gisa eta RNA mezulariaren blokeo espezifikorako.

Olionukleotidoen sintesia 
Oligonukleotidoa hainbat nukleotidoz osatutako molekula konplexua da, eta horietako bakoitza base nitrogenatu batek, karbohidrato batek eta fosfato talde batek osatzen dute. 

Oligonukleotidoen sintesia hainbat erreakziotan oinarritzen da, hauetan, molekularen zentro erreaktibo desberdinak ziklikoki babestu eta babesgabetzen dira:

 2' Hidroxilo babeslea: Tert-butil dimetilsililoa (TBDMS).
 Fosfato askearen babeslea: B-zianoetil. 
 Oinarrien heterozikloen babeslea: amida talde desberdinak.

Terapia genikoan erabilera 
Oligonukleotidoak terapia genikoan erabiltzen dira geneak isilarazteko estrategia gisa. Horretarako, isilarazi nahi diren geneen ARN mezulariaren osagarri diren 12 eta 20 base pareko oligonukleotidoak erabiltzen dira.

Zelula barruan, oligonukleotidoa bere xedeko mRNArekin lotzen da eta haren itzulpena blokeatzen du, hau da, erribosomak mRNA itzuliko du oligonukleotidoa aurkitu eta prozesua gelditu arte. Gainera, teknika honen beste abantaila bat, RNasaHk oligo-RNA hibridoa ezagutzen eta degradatzen duela da. Garrantzitsua da oligonukleotidoa itzulpenaren hasieratik hurbil diseinatzea edo sor daitekeen produktuak funtzio biologikorik ez duela ziurtatzea, isiltzea eraginkorra izan dadin.

Terapia genikorako oligonukleotido idealek ezaugarri hauek izan behar dituzte: 

 Material genetikoarekin konplexu egonkorrak osatu behar dituzte. 
 Helburuarekiko espezifikoak izan behar dute. 
 Egonkortasun handia eta ohikoa baino erdi-bizitza luzeagoa izan behar dute nukleasei aurre egiteko. 
 Zelularen mintzetatik leunki pasatzeko gai izan behar dute. 
 Ez dira organoetan edo zelula organuluetan metatu behar. 
 Bere tamaina 18 eta 20 oinarri-pare artekoa izan behar du. 

Oligonukleotidoak in vivo erabil daitezke, baina oso erdi-bizitza laburra eta kontzentrazio baxua dute. 

Hain zuzen ere, iraupen luzeko efekturik ez dutenez, oligonukleotidoeta oinarritzen den terapia genetikoaren arazo nagusiena ondoz ondoko dosien beharra da. Kimikoki eraldatu egiten dira erdi-bizitza luzeagoa izateko, bai fosfato-zubietako oxigenoan, bai oinarrietan, bai lotura-zubietan aurkitzen ez den fosfatoan. Beraz, droga/sendagaitzat hartzen dira, ez baitute DNA aldatzen eta degradatzen amaitzen baitute. 

Oligonukleotidoen erabilera posibleak terapia antibiraletan, bakterioen terapian, terapia antiparasitarioan, minbiziaren aurkako ex vivo terapian, azaleko gaixotasunen tratamenduan, hanturaren inhibizioan, onkogenen kentzean edo gene nagusien kentzean izan daitezke.

Aldaketa kimikoak 
Kimikoki egonkorrak diren oligonukleotido laburrak sortzea izan zen oligonuklotido terapiak garatzeko lehen erronka. Naturan dauden oligonukleotidoak erraz degradatzen dituzte nukleasek, nukleotidoak zatitzen dituzten zelula mota guztietan dauden entzimak. Oligonukleotidoen sekuentzia laburrek ere lotura-afinitate ahulak dituzte, eta horrek in vivo degradatzen laguntzen du.

Bizkarrezurreko aldaketak 

Nukleotidoen organotiofosfato nukleosidoen (PS) analogoek propietate onuragarri batzuk ematen dizkiete oligonukleotidei. PS bizkarrezurrek nukleotidoei ematen dizkieten propietate onuragarri nagusiak nukleotido bakoitzaren diastereomeroen identifikazioa eta fosforotioato nukleotidoen inguruko erreakzioak erraz jarraitzeko gaitasuna dira, hau da, oligonukleotidoen sintesian erabilgarria. Oligonukleotidoen PS bizkarrezurreko aldaketek entzimek nahi ez duten degradaziotik babesten dituzte. Nukleotidoen bizkarrezurra aldatzea oso erabilia da, nukleotido gehienetan erraztasun eta zehaztasun erlatiboz lor daitekeelako. Oligonukleotidoen 5' eta 3' muturreko aldaketa fluoreszenteak jakinarazi ziren oligonukleotidoen egiturak, dinamikak eta elkarrekintzak ingurunearekiko ebaluatzeko.

Azukre eraztun aldaketak 

Oligonukleotidoen aplikazio medikoetarako erabilgarria den beste aldaketa bat 2' azukre aldaketak dira. 2’ posizioko azukrea aldatzeak oligonukleotidoen eraginkortasuna areagotzen du, oligonukleotidoen xede-lotura gaitasunak hobetuz, bereziki zentzuaren aurkako oligonukleotidoen terapietan. Proteinen lotura ez-espezifikoa ere murrizten dute, proteina zehatzak bideratzeko zehaztasuna areagotuz. Gehien erabiltzen diren aldaketetako bi 2'-O-metiloa eta 2'-O-metoxietiloa dira. Nukleobasean aldaketa fluoreszenteak ere jakinarazi ziren.

Zentzuaren aurkako oligonukleotidoak 
Zentzuaren aurkako oligonukleotidoak (ASO, -inglesez-) aukeratutako sekuentzia baten osagarri diren DNA edo ARN kate bakarrekoak dira. Zentzuaren aurkako RNAren kasuan, RNA mezulari batzuen kate batzuen proteina-itzulpena ekiditen dute haiekin lotuz, hibridazio izeneko prozesu batean. Zentzuaren aurkako oligonukleotidoak ARN espezifiko eta osagarri (kodetzailea edo ez-kodetzailea) bideratzeko erabil daitezke. Lotura gertatzen bada hibrido hau RNasa H entzimak degradatu dezake. RNase H RNA hidrolizatzen duen entzima bat da, eta zentzuaren aurkako oligonukleotidoen aplikazio batean erabiltzen denean, mRNAren adierazpenaren % 80-95 beheranzko erregulazioa eragiten du. 

Morpholino zentzuaren aurkako oligonukleotidoen erabilera ornodunen gene-eraizketarako, gaur egun garapenaren biologian teknika estandarra dena eta geneen adierazpen aldatua eta geneen funtzioa aztertzeko erabiltzen dena, Janet Heasman-ek garatu zuen Xenopus erabiliz. FDAk onartutako Morpholino sendagaien artean eteplirsen eta golodirsen daude. Zentzuaren aurkako oligonukleotidoak ere erabili izan dira gripearen birusaren erreplikazioa zelula-lerroetan inhibitzeko.

Zentzuaren aurkako oligonukleotidoen terapiak proteina mutante bakar baten ondorio diren gaixotasun neuroendekapenezkoak aproposak dira, terapia hauek selektibitate handiko RNAren sekuentzia oso zehatzak bideratzeko eta aldatzeko duten gaitasunak baitituzte. Gaixotasun genetiko asko, besteak beste, Huntingtonen gaixotasuna, Alzheimer gaixotasuna, Parkinsonen gaixotasuna eta alboko esklerosi amiotrofikoa (ALS) DNAren alterazioekin lotuta daude, RNA sekuentzia okerrak eragiten dituztenak eta efektu fisiologiko toxikoa duten proteina gaizki itzuliak sortzen dituzte.

Zeluletan barneratzea 
Zeluletan hartzea/barneratzea oligonukleotido terapeutiko arrakastatsurako oztoporik handiena da oraindik. Molekula txikiko sendagai gehienen antzera aprobetxamendu zuzena, bizkarrezur polianionikoak eta ONen tamaina molekularrak oztopatzen du. Ekintza-lekurantz iristeko eta zelula barneko trafikoan bidaiatzeko mekanismo zehatzak oraindik ez daude argi. Gainera, ON egitura/aldaketaren desberdintasun txikiek eta zelula-motaren desberdintasunak aprobetxamenduan desberdintasun handiak eragiten dituzte. Uste da zelulen harrapaketa bide ezberdinetan gertatzen dela ONak zelulen gainazalean xurgatu ondoren. Nabarmentzeko, ikerketek erakusten dute ehun-hazkuntzako zelula gehienek erraz hartzen dituztela ASOak modu ez-produktiboan, hau da, ez da zentzuaren aurkako efekturik ikusten. ASO-ren komunztadurak G-akoplatutako errezeptoreek ezagutzen dituzten ligandoekin konjugatzeak ekoizpen produktiboa areagotzen du. Sailkapen horren ondoan (ez produktiboa vs. produktiboa), zelulen barneratzea gehienetan energiaren menpeko era batean egiten da (hartzaileen bidezko endozitosia), baina baliteke energiatik independentea den difusio pasiboa (=gimnosia) ez baztertzea. Zelula-mintza igaro ondoren, ON terapeutikoak endosoma goiztiarretan kapsulatzen dira, eta azken finean pH baxuan entzima degradatzaileak dituzten lisosomekin fusionatzen diren endosoma berantiarretara garraiatzen dira. Bere funtzio terapeutikoa gauzatzeko, ONak endosomatik ihes egin behar du degradatu aurretik. Orain arte, ez dago metodo unibertsala emate, zelulen harrapaketa eta ihes endosomikoaren arazoak gainditzeko, baina badira zelula zehatzetara (haien errezeptoreak barne) egokitutako hainbat planteamendu. Oligonuckleotidoa eta zelulen ezagutze/hartzeaz arduratzen den entitate batekin konjugatzeak hartzailea areagotzeaz gain (ikus supra), zelulen aprobetxamenduaren konplexutasuna murrizten duela uste da. Hau molekula-ON konjugatu txikiekin lortu da, adibidez, hepatozitoen errezeptoreak zuzentzen dituen N-acetil galaktosamina bat dutenak. Konjokatu hauek adibide bikaina dira zelulen aprobetxamendu handitzea lortzeko bideratuarekin batera, dagozkien errezeptoreak xede-zeluletan gehiegi adierazita baitaude, xede-zeluletan zuzendutako terapeutiko bat lortzeko (konparatu minbizi-zeluletan gehiegi adierazitako errezeptoreak ustiatzen dituzten antigorputz-droga konjokatuak). Oligonukleotidoen zelulen bidalketa eta zelulen aprobetxamendu handitzeko oso erabilia eta asko ikertutako beste entitate bat antigorputzak dira.

Teknika analitikoak

Kromatografia 
Alkilamidak fase geldi kromatografiko gisa erabil daitezke. Fase horiek oligonukleotidoak bereizteko ikertu dira. Ioi-bikote alderantzizko faseko errendimendu handiko kromatografia likidoa, sintesi automatizatuaren ondoren oligonukleotidoak bereizteko eta aztertzeko erabiltzen da.

Masa-espektrometria 
Azido 5-metoxisalizilikoaren eta esperminaren nahasketa bat, oligonukleotidoen analisirako matrize gisa erabil daiteke MALDI masa-espektrometrian. ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry (ESI-MS) oligonukleotidoen masa ikertzeko tresna indartsua da ere.

DNA mikroarray-ak 
DNA mikroarray-ak oligonukleotidoen aplikazio analitiko erabilgarria dira. cDNA mkroarray-ak estandarrekin alderatuta, espezifikotasun kontrolatuagoa dute hibridazioan baino gehiago, eta splicing alternatiboa duten sekuentzien ​​edo poliadenilatutako sekuentzien presentzia eta prebalentzia neurtzeko gaitasuna dute. DNA mikroarry azpimota bat dentsitate handian oligonukleotidoa lotu zaizkien substratu gisa deskriba daiteke (nylona, ​​beira, etab.). Bizitza zientzien barruan DNA mikroarrayen aplikazio ugari daude.

Erreferentziak

Kanpo estekak 

Azido nukleikoak