Taq polimerasa

Taq polimerasa I DNA polimerasa egonkorra da, Thermus aquaticus mikroorganismo termofiliko eubakterioaren ondorioz izendatua, izan ere, izaki hartatik isolatu zuten 1976an Chien et al.-ek. Bere izena sarritan laburtu ohi da Taq edota Taq pol deituz. Polimerasa hau maiz erabili ohi da polimerasaren kate-erreakzioan (PCR), DNAren segmentu laburren kopurua nabarmenki anplifikatzeko metodo bat.

T. aquaticus ur termaletan eta iturri hidrotermaletan bizi den bakterioa da eta haren polimerasa, Taq polimerasa, PCR prozesuan behar ziren desnaturalizazio-baldintzak (tenperatura handiak) jasateko gai den entzima gisa identifikatu zen. Termoegonkortasun horri esker, Taq polimerasa erabiltzen hasi zen, jatorriz PCRan erabiltzen zen E. coli-ren DNA polimerasaren ordez.

Propietate entzimatikoak 
Taq polimerasa-ren aktibitaterako tenperatura optimoa 75-80ºC artean dago, tenperatura horretan polimerizazio-tasa optimoa lortzen du eta tenperatura-tarte optimoaren edozein desbideraziok entzimaren luzapen-tasa inhibitzen du. 90ºC baino altuagoko tenperaturetan, Taq oso aktibitate baxua dauka edo ez du inolako aktibitaterik, entzimak desnaturalizatzen  ez den eta osorik mantentzen den arren. Erreakzio-hodian zenbait ioiren presentzia egoteak ere entzimaren jarduera espezifikoari eragiten dio, adibidez, potasio kloruro (KCl) eta magnesio ioien (Mg2+)  kantitate txikiek aktibitate entzimatikoa sustatzen dute eta hauen kontzentrazio altuek, aldiz, aktibitatea inhibitzen dute.

PCRan 
1980ko hamarkadaren hasieran, Kary Mullis Cetus Corporation enpresan DNA sintetikoen aplikazio bioteknologikoak ikertzen zebilen. Maiz erabili ohi zituen DNA oligonukleotidoak itu DNA sekuentziekin lotzeko probetan, baita oligonukleotido hauek hasle gisa bezala erabili DNA sekuentziazio eta cDNA (DNA osagarria) sintesirako. 1983. urtean, bi hasle erabiliz hasi zen, bakoitzak itu DNAko harizpietako batekin hibridatzeko  eta erreakziora DNA polimerasa gehitu zuen. Honen ondorioz, DNA erreplikazio esponentziala burutu izan zen, hasleen arteko DNA segmentua nabarmenki anplifikatzea lortuz.

Hala ere, erreplikazio ziklo bakoitzaren ostean, nahastea 90ºC baino gehiagoko tenperaturara berotu behar da, DNA sortu berria desnaturalizatzeko, harizpiak banatzea ahalbidetuz, harizpiek hurrengo zikloetako molde gisa joka dezaten. Berotze urrats honek jatorriz erabilitako DNA polimerasa, Klenow fragmentua (E. coli-tik isolatua) inaktibatzen zuen, ez ordea Taq polimerasa. Honi esker, Taq polimerasa oso erabilgarria da PCRa burutzeko, DNA harizpiak banatzeko ezarri beharreko 95ºC tenperatura jasan baitezake oraindik aktibitate katalitikoa mantenduz, hau da, desnaturalizatu gabe.

Taq termoegonkorraren erabilerak ahalbidetzen du PCR erreakzioa tenperatura altuetan burutzea (~60 °C eta altuagoak), hasleen espezifikotasuna altuagoa eta produktu inespezifikoen (hasleen dimeroak, esaterako) kopurua urriagoa izango direlarik. Horrez gain, polimerasa termoegonkorra erabiltzeari esker uneoro entzima berak burutuko du anplifikazioa, ziklo guztietan, termozikladoreko ziklo berri bakoitzaren aurretik entzima berria gehitu behar izatea saihestuz. Tutu itxia makina erlatiboki sinple batean sartuta prozesu guztia burutu daiteke eta beraz, Taq polimerasaren erabilera gakoa izan zen PCR teknika DNA analisiarekin erlazionatuta zeuden biologia molekularreko zenbait arlo ezberdinetan aplikatu ahal izateko.

Patente arazoak 
Hoffmann-La Roche enpresak PCR eta Taq patenteak erosi zizkion Cetus enpresari 330 milioi dolarren truke, geroago haiei esker 2000 milioi dolar baino gehiago irabaziz.1989. urtean, Science aldizkariak Taq polimerasa lehendabiziko “Urteko Molekula” gisa izendatu zuen. Kary Mullis-ek Kimikako Nobel Saria jaso zuen 1993an, konpainia bioteknologiko batean ikerketa egitearen ondorioz saritutako pertsona bakarra izanik. 1990eko hamarkadaren hasieran, Taq polimerasa erabiliz PCR teknika hainbat arlotan erabiltzen ari zen, hala nola, oinarrizko biologia molekularreko ikerketan, testaketa klinikoan eta arlo forensean. Horrez gain, HIES kasuetako GIB birusa era zuzenean detektatzeko erabiltzen hasi zen.

1999ko abenduan, Vaughn Walker AEBko distritu epaileak erabaki zuen Taq polimerasaren inguruko 1990eko patentea kaltetuta zegoela, neurri batean Cetus Corporation-eko zientzialariek egindako baieztapen eta informazio okerrak zirela eta. Epaileak Promega Corporation-ek Hoffman-La Roche-ren aurka egindako lehiaketa babestu zuen, Hoffman-La Roche-k Taq patentea 1991ean bereganatu zuelarik. Walker epaileak aurretik beste laborategi batzuetan burututako aurkikuntzak iruzkindu zituen, haien artean, Cincinnati-ko unibertsitateko John Trela-k burututakoa, epaileak hartutako erabakiaren oinarri gisa.

Domeinuen egitura

Exonukleasa domeinua 
Taq PolA entzimak E. coli-ren PolA entzimaren egitura orokor antzekoa du. Erdiko 3’-5’ exonukleasa domeinua proba-irakurketa aktibitateaz arduratzen dena, hau nabarmenki aldatua dagoenez, ez da funtzionala. Hala ere, entzimak badauka 5’-3’ exonukleasa domeinua amino muturrean, zeinak, E. coli-ren domeinua ez bezala, ez duen hasleen degradazioa burutzen. Gainera, zundekin ere oso erabilgarria da, izan ere, harizpi berriak sintetizatu ahala Taq polimerasak 5’ -3’ zundetako fluoroforoak ebaki eta aske uzten ditu.

Mutanteak 
Zuzenduriko mutagenesi bidezko esperimentu baten bidez 3’-5’ exonukleasa aktibitatea hobetzea lortu izan da, baina ez da ezaguna horrek entzimaren errore-tasa murrizten duen ala ez. Mutante hauen adibide kimera proteinak izan daitezke, zeinetan proba-irakurketadun entzima sortzea lortu izan den, baina, zoritxarrez, tenperatura optimo eta termoegonkortasun baxuagoa duen. Bestalde, 5’-3’ exonukleasa domeinurik gabeko polimerasaren aldaerak sortu izan dira (Klentaq eta Stoffel fragmentuak), hauek bigarren mailako egiturak dituzten hasleekin erabiltzeko egokiak dira, baita molekula zirkularren erreplikaziorako ere.

Garrantzia gaixotasunen detekzioan 
Taq polimerasak PCR-ko DNA erreplikazioan zenbait hobekuntza eragin zituen, hala nola, espezifizitate altuagoa, produktu inespezifiko gutxiago eta ekipamendu zein prozesu errazagoak. Entzimak rol gakoa izan du munduko gaixotasun txarrenen detekzioan, bizitza ugari salbatzen lagunduz, haien artean, tuberkulosia, pneumonia atipikoa, HIESa, paperak eta hepatitisa, besteak beste.

PCR probak Taq polimerasarekiko duen beharra bereziki nabarmendu izan da 2020. urteko COVID-19 pandemian zehar, hainbat herrialdetan entzimaren eskasia egon baita eta ondorioz, Taq polimerasarik gabe gaixotasunaren detekziorako prozesua askoz motelagoa eta zailagoa baita.

Taq polimerasaren erabilerak baditu bere mugak ere, izan ere, gaixotasun batzuetan, erretrobirusek mutazioak izaten dituzte haien genoman, eta Taq polimerasaren fideltasun erlatiboki baxuaren ondorioz mutazio berdinak gerta daitezke erreplikazioan zehar. Arrazoi hau dela medio, nahiko posiblea da testaren emaitza positibo faltsua izatea.

Erreferentziak

Kanpo estekak 

Genetika molekularra
Transferasak