CRISPRa

CRISPR aktibatzailea (CRISPRa) endonukleasa-jarduerarik gabeko CRISPR efektoreen bertsio eraldatuak erabiltzen dituen CRISPR tresna mota bat da. Tresna honek, dCas9 edo RNA gidarietan (gRNAk) gehitutako transkripzioaren aktibatzaileak erabiltzen ditu.

Osagarria den RNA gida batek CRISPR efektoreak itura gidatzen ditu. CRISPR aktibazio-sistemak transkripzioaren aktibatzaileekin fusionatzen dira intereseko geneen adierazpena areagotzeko. Sistema horiek hainbat helburutarako erabil daitezke, besteak beste, analisi genetikoak egiteko eta intereseko proteinen gainadierazpenerako. Gehien erabiltzen den efektorea Cas9-n oinarritzen da (II motako sistema), baina Cas12a (V mota) bezalako beste efektore batzuk ere erabili dira.

Osagaiak

dCas9 
Cas9 Endonuclease Dead, dead Cas9 edo dCas9 bezala ere ezaguna, Cas9aren forma mutante bat da. Forma mutante honek, endonukleasa domeinuetan gertatutako mutazio puntualen ondorioz, ez dauka endonukleasa jarduerarik. 

Mutatu gabeko formaren antzera, dCas9 CRISPR sistemetan erabiltzen da gRNAekin batera, Cas9 lotzea ahalbidetzen duten PAM sekuentziak dituzten gRNArekiko osagarriak diren gene edo nukleotido espezifikoak markatzeko. Cas9k normalean 2 endonukleasa domeinu ditu, RuvC eta HNH domeinuak. D10A eta H840A mutazio puntualek endonukleasaren jarduerarako garrantzitsuak diren 2 hondakin aldatzen dituzte, desaktibazioa eraginez. Nahiz eta dCas9k endonukleasa-jarduerarik ez izan, bere RNA gidariarekin eta markatutako DNA-harizpiarekin bat egiteko gai da, beste domeinu batzuk lotura horretaz arduratzen baitira. Askotan, hori bakarrik nahikoa izaten da, erabat blokeatu ezean, itu genearen transkripzioa arintzeko, baldin eta gRNAek dCas9 posizionatzen badu transkripzio faktoreak eta RNA polimerasa DNAn sartzea saihesten duen modu batean. Hala ere, DNAri batzeko gaitasun hori aktibaziorako ere balia daiteke, dCas9k eskualde aldagarriak baititu. Eskualde hauek normalean proteinaren N eta C muturretan kokatzen dira eta transkripzioaren aktibatzaileak lotzeko erabil daitezke.

RNA gida 
RNA gida txikia (sgRNA), edo gRNA, 20 nukleotido inguru dituen RNA molekula da. RNA molekula horiek Cas9 edo dCas9 bere itu genera bideratzeko erabiltzen dira. gRNAk CRISPR sistementzat garrantzitsuak diren bi eskualde nagusi ditu: euskarria eta eskualde banatzailea. Eskualde banatzaileak, itu-geneekiko osagarriak diren nukelotidoak ditu, askotan eskualde sustatzailean egoten direnak. Euskarria, aldiz, (d)Cas9rekin konplexu bat eratzearen arduraduna da. Elkarrekin, (d)Cas9era lotzen dira eta intereseko geneetara bideratzen dute. gRNA baten eskualde banatzailea edozein sekuentzia potentziala lortzeko alda daitekeenez, CRISPR sistemei askoz malgutasun handiagoa ematen diete. Izan ere, eskualde banatzailearen sekuentziarekiko osagarria den edozein sekuentziarantz bideratu daiteke.

Transkripzioaren aktibatzaileak 
Transkripzioaren aktibatzaileak dCas9 edo sgRNAri lotutako proteina domeinuak edo proteina osoak dira, kofaktore garrantzitsuak errekrutatzen laguntzeaz gain, sistemak xede gisa dituen geneak transkribatzeko beharrezkoa den RNA polimerasa ere errekrutatzen laguntzen dutenak. Proteina jakin bat kodetzeko, RNA polimerasak genearen DNA txantiloitik abiatuta RNA sortu behar du transkripzio izeneko prozesu batean. Transkripzioaren aktibatzaileek DNAri lotzeko domeinu bat eta transkripzioa aktibatzeko domeinu bat dute.

Aktibazio-domeinuak transkripzio faktore orokorrak edo RNA polimerasa errekrutatu ditzake genearen sekuentziarako. Aktibatzeko domeinuek ere gelditutako RNA polimerasen transkripzioa erraztuz funtziona dezakete. Honez gain, eukariotoetan DNAn zehar nukleosomak mugitzeko edo adierazpen genikoa areagotzeko asmoz histonak aldatzeko jardun dezakete.  Aktibatzaile horiek dCas9 edo sgRNAtara lotuz sisteman sar daitezke. Zenbait ikertzailek erregulazio-maila transkripzionala modulatu daitekeela ikusi dute.

Adierazpen-sistema 
Intereseko zeluletan (d)Cas9 proteinak eta gRNAk sartzeko adierazpen-sistema bat behar da. Erabili ohi diren aukeren artean, plasmidoak eta birus-bektoreak daude, hala nola adenobirusekin erlazionatutako birusen (AAV) bektorea edo lentibirusen bektorea.

Aktibazio-sistema espezifikoak

VP64-p65-Rta 

VP64-p65-Rta, edo VPR, dCas9 aktibatzailea lehendik existitzen zen dCas9 aktibatzaile bat aldatuz sortu zen. Aktibatzaile berri honetan, transkripzioaren aktibatzaile bat (Vp64) dCas9ren C muturrari lotuta dago. dCas9-VPR proteinan, p65 eta Rta transkripzio faktoreak dCas9-Vp64ren C muturrera gehitzen dira. Beraz, hiru transkripzio faktoreak gene berera bideratuko dira. Transkripziorako hiru faktore erabiltzeak, Vp64 bakarrik erabili beharrean, itu geneen adierazpena handiagoa izatea eragiten du. dCas9 gene desberdinetara bideratu zenean, guztiek adierazpen nabarmen handiagoa erakutsi zuten dCas9-VPRrekin dCas9-VP64rekin baino. Era berean, zelula berean sgRNA anizkoitzak jarriz dCas9-VPR gene anitzen adierazpena handitzeko erabil daitekeela frogatu da. dCas9-VPR 2 neurogeninaren geneak eta 1 bereizketa neurogenikoaren geneak aktibatzeko erabili da, eta horren ondorioz, induzitutako zelula ama pluripotenteak neurona induzituetan bereiztea lortu da.  

dCas9 aktibatzaileak alderatu zituen ikerketa batek, VPR, SAM eta SunTag aktibatzaileek giza, sagu eta frutaren euliaren zelula mota desberdinetan geneen espresioa areagotzeko dCas9rekin hobeto funtzionatzen zutela aurkitu zuen.

Aktibazio sinergikoaren bitartekaria 
dCas9-VP64 sistemaren muga gainditzeko, transkripzio faktore ugari sartzeko ahalmena ematen duen dCas9-SAM sistema garatu zen. MS2, p65 eta HSF1 proteinak erabiliz, dCas9-SAM sistemak itu genea aktibatzeko modu sinergikoan funtzionatzen duten hainbat transkripzio faktore biltzen ditu.Transkripzioaren aktibatzaile desberdinak mihiztatzeko, dCas9-SAM sistemak eraldatutako RNA gida bakarra erabiltzen du (sgRNA), MS2 proteinarako lotuneak dituena. Urkilaren aptameroak sgRNAren tetra loop eta stem loop 2-ra lotzen dira, bakteriofagoaren estalkiko dimerizatutako proteinentzako lotura-gune bihurtzeko. Urkilak dCas9-sgRNA konplexutik kanpo ikusgai daudenez, beste transkripzio faktore batzuk MS2 proteinarekin batu daitezke, dCas9-sgRNA konplexua aldatu gabe. Beraz, MS2 proteina p65 eta HSF1 proteinak barneratzeko diseinatuta dago. MS2-p65-HSF1 fusio-proteinak dCas9-VP64rekin elkarreragiten du, itu geneen sustatzailean transkripzio faktore gehiago errekrutatzeko.
dCas-SAM sistema erabiliz, Zhang-k et al. (2015) GIBaren gene latentea arrakastaz berpiztu zuten GIBaren zelula ostalarien proteina biralak gainadierazteko. Birus-proteinak gehiegi adieraztea lortu zuten, funtsean, birus-proteinen toxikotasunaren ondorioz GIB-1eko zelula latenteen apoptosia eragiteko. dCas-SAM sistemaren beste esperimentu batean, Konermann-k et al. (2015) melanoma-zeluletan dCas sistemaren bidez gene hautagaiak aktibatuz BRAF inhibitzaile bati erresistentzia ematen dioten geneak aurkitu zituzten. Hortaz, dCas9-SAM sistema gene latenteak aktibatzeko, terapia genikoak garatzeko eta gene berriak aurkitzeko ere erabil daiteke.

SunTag 
SunTag sistema aktibatzaileak SunTag-ekin lotzeko eraldatuta dagoen dCas9 proteina erabiltzen du. SunTag-a matrize polipeptidiko errepikakorra da, antigorputzen kopia ugari bil ditzakeena. Transkripzio faktoreak antigorputzei lotuz, SunTag dCas9 konplexu aktibatzaileak bere transkripzio faktoreen errekrutatzea anplifikatzen du. dCas9 proteina bere itu genera bideratzeko, dCas9 SunTag sistemak sgRNA erabiltzen du.

Tanenbaum-ri et al. (2014) dCas9 SunTag sistema sortzea egozten zaie. Antigorputzetarako, GCN4 antigorputzak erabili zituzten, VP64 transkripzio faktorearekin lotu zutenak. Antigorputzak zelulen nukleoetara garraiatzeko, NLS etiketa bat jarri zieten. Antigorputzen kokapen nuklearra baieztatzeko, sfGFP erabili zen bistaratzeko. Beraz, GCN4-sfGFP-NLS-VP64 proteina dCas SunTag sistemarekin elkarreragiteko garatu zen. Antigorputzak arrakastaz batu ziren SunTag polipeptidoekin, eta CXCR4 itu genea aktibatu zuten K562 zelula-lerroetan. dCas9-VP64 aktibazio-konplexuarekin alderatuta, CXCR4 genearen adierazpena 5 eta 25 aldiz gehiago areagotu zuten K562 zelula-lerroetan. CXCR4 proteinaren gainespresio handiagoa ez ezik, CXCR4 proteinak ere transwell migrazio saiakuntzan bidaiatzen jarraitzeko aktibo zeuden. Hortaz, dCas9-SunTag sistema ezkutuan dauden geneak aktibatzeko erabil daiteke, hala nola birusen geneak.

Aplikazioak 
dCas9 aktibazio-sistemak zelula berean intereseko gene bat edo gene ugari adierazteko aukera ematen du. Prozesu jakin batean parte hartzen duten geneak "genome-wide screen" teknikaren bidez azter daitezke, geneen adierazpena aktibatzea dakarrena. sgRNA desberdinek zer fenotipo sortzen duten aztertzean, bidezidor zehatz batean zer gene inplikatuta dagoen aztertu daiteke. dCas9 aktibazio-sistema zehazki zein zelulak aktibatzen diren eta aktibazioa zein unetan gertatzen den kontrolatzeko erabil daiteke. dCas9 konstruktoak egin dira, argiaren edo produktu kimikoen aurrean dCas9-aktibatzaile fusio-proteina aktibatzen dutenak. Zelulak birprogramatu edo zelula-mota batetik bestera ere bereizi egin daitezke, zelula-mota bat sortzeko edo mantentzeko garrantzitsuak diren gene jakin batzuen adierazpena areagotuz.

Adierazpen genikoaren gaineko kontrol handiagoa 
Ikerketa-talde batek sistema bat erabili zuen non dCas9 domeinu partikular batekin elkartu zen, C1B1 alegia. Argi urdina zelularen gainean irradiatzen denean, Cry2 domeinua C1B1 domeinuari lotzen da. Cry2 domeinua transkripzioaren aktibatzaile batekin fusionatzen da eta, hortaz, argi urdinak aktibatzailea dCas9 lotzen den lekura bideratzen du. Argiaren erabilerak kontrol handia izatea ahalbidetzen du intereseko genearen aktibazioa ematen denean. Zelularen argia kentzeak intereseko genean dCas9 bakarrik geratzea dakar; beraz, adierazpena ez da areagotzen. Horrela, sistema itzulgarria da. 

Kontrol kimikoa erabiliz antzeko sistema bat garatu zen. Sistema horretan, dCas9k FKBP domeinua duen MS2 fusio proteina bat errekrutatzen du. RAP izeneko konposatu kimikoa dagoenean, kromatina aldatzeko konplexu batekin fusionatutako FRB domeinu bat FKBPrekin elkartzen da. Zelulei RAP gehitzen zaien bakoitzean, genera kromatina aldatzeko konplexu espezifiko bat bidera daiteke. Horri esker, zientzialariek kromatinaren aldaketa espezifikoek gene baten adierazpenari nola eragiten dioten azter dezakete. 

dCas9-VPR sistema, aktibatzaile gisa erabiltzen da, eskualde kodetzailetik ur-gorako gene baten sustatzailera bideratuz. Ikerketa batean hainbat sgRNA erabili zituzten gene baten eskualde ezberdinetara bideratzeko eta dCas9-VPRk aktibatzaile edo errepresore gisa jardun dezakeela aurkitu zuten, batzen den kokapenaren arabera. Zelula batean, sustatzailera bideratzen diren sgRNAek aukera eman dezakete dCas9-VPR adierazpena handitzeko; genearen eskualde kodifikatzailera doazen sgRNA-ek, berriz, dCas9-VPR adierazpena gutxitzen dute.

Genoma osoaren aktibazioa 
sgRNAren moldakortasunari esker, dCas9 aktibatzaileek organismo baten genomaren edozein generen adierazpena handitu dezakete. Hori proteina bat kodetzen duen gene baten edo RNA transkribatu baten adierazpena handitzeko erabil daiteke. Artikulu batek genoma osoaren aktibazioa farmako espezifiko batekiko erresistentzia mediatuan zein proteina inplikatuta dauden zehazteko erabil zitekeela frogatu zuen. 

Beste artikulu batek RNA luze ez-kodetzaileen genoma osoaren aktibazioa erabili zuen, eta ohartu zen RNA luze ez-kodetzaile jakin batzuen adierazpenaren gorakadak vemurafenib farmakoaren kontrako erresistentzia ematen ziola. Bi kasuetan, botikak hiltzen ez dituen zelulak zer sgRNA duten jakiteko azter daitezke. Horri esker, ikertzaileek bizirik dagoen zelula bakoitzean zein gene aktibatu den zehaztu dezakete, eta horrek farmako horrekiko erresistentziarako garrantzitsuak diren geneak iradokitzen ditu.

Erabilera organismoetan 
dCas9, VP64, p65 eta HSF1 (shock termikoaren 1 faktorea) arteko fusio bati esker ikertzaileek Arabidopsis thalianaren geneak markatu eta genearen transkripzioa landarearen genoman txertatzen denean lortzen den antzeko mailara areagotu zuten. Frogatutako bi geneetako baten kasuan, dCas9 aktibatzaileak hostoen kopurua eta tamaina aldatzen ditu eta landareek lehortea maneiatzeko gaitasun handiagoa izatea eragiten du. Egileek ondorioztatu dute dCas9 aktibatzaileak gainadierazpenerako transgene bat txertatzen denean sortutako fenotipoen antzekoak diren fenotipoak sor ditzakeela landareetan. Ikertzaileek RNA gida anitz erabili dituzte dCas9 aktibazio sistema sagu-andui espezifikoetara bideratzeko, non dCas9 zelula-lerro espezifikoetan aktibatu daitekeen Cre birkonbinaketa-sistema erabiliz. Zientzialariek hainbat generen markaketa eta adierazpenaren areagotzea erabili zuten birsorkuntzan eta gibeleko kartzinometan inplikatutako prozesuak aztertzeko.

Erreferentziak

Kanpo estekak 

Ingeniaritza genetikoa