In situ PCRa

In situ PCRa ehun zati edo hedapen zitologikoaren gainean PCR bat egitean datza, dNTPak (nukleotidoak) edo kolorimetrikoki edo fluoreszenteki markatutako zundak erabilita,  beraz teknika hau in situ-hibridazioa (ISH) konbinatzen dituen teknika molekularra da. 

Teknika honetan zelula osoen barruan anplifikatzen da gure intereseko genaren sekuentzia, modu honetan ISH edo immunokimikak detektatu ditzakeen kopia kopurua lortuz. Lehenengo anplifikazioa egiten da eta ondoren, detekziorako in situ-hibridazioa erabiltzen da, DNA/RNA zundak erabiliz. Honek ahalbidetzen du genoma kantitate oso txikiak detektatzea. 

Termozikladoreen]erabilera beharrezkoa da, eta hauek tenperatura aldetik kontrol zehatza eduki behar dute ondo dakigun bezala eta intereseko gunean DNAren pilaketak ekiditeko UV erradiazioa erabiltzen da (PCR konbentzionalean bezala), edo in situ-hibridazio PCRarekin konbinatzen da.

Teknika honek hainbat erabilera izan ditzake: birusen DNA detektatzea, DNA berrantolatua, kromosomen translokazioak eta suspentzioan dauden zeluletan birusen RNA aztertzea, zitozentrifugen prestaketa edo artxiboko ehunen ebaketa. 

Bi motatakoa izan daiteke: zuzena eta ez zuzena. Leheneangoan nukleotidoak markatzen dira eta bigarrenean ordea produktua da markatzen dena. ''In situ PCR zuzenean ez zuzenean baino espezifitate gutxiagoko emaitzak lortzen dira, eta gainera lehenengoan, artefaktoak detektatzeko, erreakzioaren nahasketan hasleen omisioa bezalako kontrol adizionalak beharrezkoak dira.In situ PCRak lagin guztietan aplikagarriak ez diren hainbat teknika desberdin erabiltzen ditu. Teknika hau fixaketa kontrolatuko eta aurretik tratatutako zelula isolatuen prestaketetako DNA detektatzeko da eraginkorragoa, baina kasu hauetan emaitzen kuantifikazioa zaila izan ohi da. Difusio eta alde extrazelularrean PCR produktuen eraketaren ondorioz positibo faltsuak lortzen dira batzuetan. Azido nukleikoen egoera txarraren eta PCR produktuen erretentzioaren ondorioz in situ PCRa  artxiboko ehunen ebaketetan ez da oso eraginkorra. 

 Historia In situ PCRa 1990. urtean erabili zen lehenengo aldiz, lentibirus batekin infektatuta zeuden zelulekin. Denborarekin, teknika honen garapena burutu da giza papilomaren genoma detektatzeko asmoarekin.

1992. urtean Komminoth-ek in situ PCR teknika erabili zuen DNA birala, geneen kopia sinpleak eta eraldaketa genikoak detektatzeko eta urte berean, Bagasra-k GIB-aren birusa detektatu zuen odol laginetan.

1993. urtean Gosden eta Hanratty zientzialariek, nahiz eta kopia kopuru txikian egon, sekuentzia jakinak detektatu zituzten. Honek guztiak adierazten du teknika hau oso baliagarria dela sekuentzia geniko eta biralen detekziorako, nahiz eta horren kopia gutxi egon edo soilik zelula gutxi batzuek duten. 

 Erabilerak In situ PCRak hainbat erabilera desberdin ditu. Hasteko zitoplasmako edo nukleoko mRNA edo DNA zati bat anplifikatzeko erabili daiteke, eta modu honetan birus zehatz batengatik infektatutako edo, DNA eta mRNA hasle espezifikoak erabiliz, birusaren geneen espresio aktiboa edo latente duten zelula kopurua ezagutu daiteke. Honez gain teknika honek terapia bat baino lehen eta ondoren dauden tumore zelulen ehunekoa determinatzeko ere balio du edo zelula mota zehatzetan erabiltzen diten hasle espezifikoak erabiliz tomore metastasikoen jatorria ezagutzeko. In situ PCR bidez ere posiblea da zitoplasmako edo nukleoko konpartimenduen barruan gene edo birus baten kokapen subzelularra determinatzea. Ingurune natural batean bakterio espezieen identifikazio azkarra egiteko ere erabili daiteke in situ'' PCRa.

Erreferentziak

Kanpo estekak 

Laborategi biologikoaren teknikak
Biologia molekularra