Proteiinkinaas B

Proteiinkinaas B (PKB, tuntud ka kui Akt ja proteiinkinaas B-d (PKBα/β/γ) (geenid: Akt1, Akt2, Akt3) on kinaassete ensüümide perekond, mis modifitseerivad valke fosfaatrühma lisamise teel (fosforüleerides) ja liigitatakse eukarüootsete organismide valkude superperekonna proteiinkinaaside hulka.

Akt on seriin/treoniinkinaas, mis reguleerib rakus mitmeid olulisi protsesse. näiteks transkriptsiooni, glükoosi metabolismi ning rakkude apoptoosi, jagunemist ja migreerumist.

Hiljuti on avastatud, et laborihiirte PKB-l on tähtis roll postnataalses aju arengus.

Nimetus Akt ei ole seotud valgu funktsiooniga. Jacob Furth nimetas Ak-ks hiirteliini, kellel areneb spontaanselt tüümuse lümfoom. Nimele lisatud t tähistab tümoomi. Liinist isoleeriti transformeeruv retroviirus, millele anti nimi Akt8 ning viiruse kodeeritud onkogeeni nimeks v-Akt. Hiljem hakati inimese analoogseid geene nimetama sama süsteemi järgi.

Akt ülevaade ja isovormid
Akt ehk proteiinkinaas B on seriini- ja treoniinispetsiifiline kinaas, millel on oluline roll mitmetes rakuprotsessides. Substraate fosforüleerides osaleb Akt glükoosi metabolismi, apoptoosi, translatsiooni, rakkude jagunemise ja migratsiooni regulatsioonis. Rakkude jagunemist reguleerib Akt rakutuuma lamiine fosforüleerides, mis võimaldab mitootilisel rakul läbida rakutsükli G2/M kontrollpunkti. Pärast kontrollpunkti toimub tuumamembraani lagunemine, mis on eelduseks tütarrakkude moodustumisele. Akt on fosfoinositiid-3-kinaasi signaaliraja üks komponente ning arvatakse, et on seeläbi seotud vähirakkude vohamise ning teistesse kudedesse tungimisega.

Akt-d leidub rakus kolme isovormina: Akt1 ehk PKBα, Akt2 ehk PKBβ ning Akt3 ehk PKBγ. Akt isovorme kodeerivad erinevad geenid, mis paiknevad erinevates kromosoomides, kuid olenemata sellest on kõigil isovormidel sarnane struktuur. Erinevate isovormide vaheline homoloogia on 80%.

Akt1 inhibeerib apoptoosi ning indutseerib valgusünteesi, mis avaldub Akt1-defektsete hiirte väiksemas kasvus. Valkude sünteesi reguleerimise kaudu mõjutab Akt1 ka kudede moodustumist ja arengut. Apoptoosi inhibeerimise tõttu mängib see isovorm olulist rolli erinevate kasvajate tekkes. 

Akt2 on oluline komponent insuliini signaalirajas ja seega vajalik glükoosi homöostaasi säilitamiseks. Akt2-defektsed hiired on diabeedile iseloomuliku fenotüübiga. 

Akt3 roll on ebaselge, kuid peamiselt on selle ekspressiooni tuvastatud ajus. Akt isovormid on üleekspresseeritud mitmetes kasvajates.

Akt struktuur
Akt kuulub cAMP-ist sõltuvate proteiinkinaaside perekonda. Kõikidel selle perekonna kinaasidel on homoloogiline struktuur ja sarnane aktivatsioonimehhanism. Akt isovormid on sarnase ülesehitusega, sisaldades PH-domeeni, kinaasi domeeni ja C-terminaalset regulatoorset domeeni, mis sisaldab hüdrofoobset motiivi.

N-terminaalne PH-domeen koosneb keskmiselt 120 aminohappest ja seondub PIP3-ga (fosfatidüülinositool-3,4,5-trisfosfaat, ingl phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate), mis asub membraanil. PH-domeenist C-terminuse poole jäävad katalüütiline domeen ning regulatoorne domeen. Katalüütilise domeeni koosseisus on säilinud treoniinijääk, mille fosforüleerimine on vajalik Akt aktivatsiooniks. Kinaasi domeenile järgneb C-terminaalne regioon, mis sisaldab hüdrofoobset motiivi: F-X-X-F/Y-S/T-Y/F (F - fenüülalaniin, Y - türosiin, S - seriin, T - treoniin, X - varieeruv aminohape). Hüdrofoobse domeeni seriini- ja treoniinijäägid peavad olema fosforüleeritud, et tagada Akt täielik aktiivsus. Esimesena toimub aga Akt kotranslatsiooniline fosforüleerimine proteiinkompleks mTORC2-ga (ingl mammalian target of rapamycin complex 2) positsioonis T450. mTORC2 on seotud endoplasmaatilise retiikulumi ehk tsütoplasmavõrgustikuga ning fosforüülimine stabiliseerib Akt ja kaitseb valku lagundamise eest. PH-domeeni ja katalüütilise regiooni kinaasi vahele jääb lühike α-helikaalne regioon, mille funktsioon on ebaselge, kuid mis oletatavasti tingib Akt signaalide spetsiifilisuse.

Akt aktiivsuse regulatsioon
Akt funktsioneerimist kontrollitakse aktiveerimise ja inhibeerimise teel. Aktiveerimiseks on olulised signaalirajad, mille tulemusena Akt fosforüleeritakse. Akt inhibeerimiseks on vajalik aga fosfataaside stimuleerimine.

PI3K/Akt/mTOR signaalirada
Akt erinevad isovormidel on ühine mitmeetapiline aktiveerimisrada, mis on võimalik nende sarnase struktuuri tõttu. Kõik Akt isovormid asuvad inaktiivsena tsütoplasmas. Akt aktiveeritakse plasmamembraani tsütoplasmapoolsel küljel, kuhu Akt on seondunud PIP3 abil.

PI3K signaalirada on keeruline võrgustik, mis algab ligandi (nt kasvufaktori) seondumisega retseptor türosiinkinaasiga (RTK). RTK on rakumembraanil asuv retseptor, mille tsütoplasmaatilisel poolel on türosiinkinaas. Kasvufaktori seondumine toob kaasa türosiinkinaasi dimeriseerumise ja vastastikuse fosforüleerimise ehk trans-autofosforüleerimise. Tekkinud fosfotürosiiniga seondub heterodimeerne fosfoinositiid-3-kinaas (PI3K), mis koosneb katalüütilisest (p110) ja regulatoorsest (p85) alaühikust. Fosfotürosiiniga seondumise tulemusel muutub PI3K konformatsioon ning aktiveeritakse katalüütiline alaühik, mis fosforüleerib fosfatidüülinositool-4,5-bisfosfaadi (PIP2) fosfatidüülinostiool-3,4,5-trisfosfaadiks (PIP3). PIP3-ga seondub PH-domeeni kaudu Akt, mis tähendab, et Akt liigub tsütoplasmast plasmamembraanile. Plasmamembraanile kinnitunud Akt aktiveeritakse mitme järjestikuse etapi tulemusel. Lisaks Akt-ile seondub PIP3 abil plasmamembraanile fosfoinositiidsõltuv kinaas 1 (PDK-1). Membraanile kinnitumine kutsub esile PDK-1 konformatsiooni muutuse, mille tagajärjel muutub aktiivseks kinaasne domeen. Aktiveeritud kinaas fosforüleerib Akt treoniinijäägi (T308). Akt täielikuks aktiveerimiseks on vajalik veel seriinijäägi (S473) fosforüülimine, mis kuulub C-terminaalse hüdrofoobse motiivi koosseisu. Seriini fosforüleerimise mehhanism ei ole täielikult selge. On pakutud küll mitmeid kinaaside kandidaate, mis on rakutüüpidele spetsiifilised, kuid universaalset kinaasi ei ole leitud. Seriinijäägi fosforüülimine on üks aktivatsiooni olulisemaid sündmusi, sest see tagab Akt aktiivse vormi stabiilsuse.

Pärast T308 ja S473 fosforüülimist vabaneb Akt tsütoplasmasse või translokeerub tuuma. Seega on seondumine membraaniga lühiajaline. Tsütoplasmas säilitab Akt katalüütiliselt aktiivse konformatsiooni ning võib rakusiseselt liikuda oma substraatide juurde. Tsütoplasmas aktiveerib Akt näiteks mTORC1.

Fosfataasid ja PIP3
Fosfataasid kontrollivad PI3K-st sõltuvat Akt aktivatsiooni. PTEN on fosfataas, mis kuulub tuumorsupressorvalkude hulka. Tuumorsupressorite ülesanne on inhibeerida rakkude jagunemist ja kasvajate ehk tuumorite teket. PTEN on PI3K antagonist ehk defosforüleerib PIP3 PIP2-ks. PIP3 puudumine ei võimalda Akt-il raku plasmamembraanile kinnituda ning ühtlasi välistab Akt fosforüleerimise. PTEN-i aktiivsuse suurenedes Akt ja tema substraatide aktiivsus väheneb märkimisväärselt.

PIP3 võivad 5’-positsioonis defosforüleerida ka SHIP perekonda kuuluvad inositoolfosfataasid SHIP1 ja SHIP2. Vastavad ensüümid defosforüleerivad samuti PIP3 PIP2 tekkega.

Akt degradeerimine
Normaalsetes rakkudes fosforüleeritakse Akt kotranslatsiooniliselt T450-positsioonis (türosiinijääk 450). Kui sellele aminohappejäägile fosfaatrühma ei lisata, ei voltu valk õigesti. Defektse konformatsiooniga Akt-ile lisatakse ubikvitiinijääk, mis suunab valgu proteasoomi. Proteasoomis lagundatakse valgud proteaaside ehk proteolüütiliste ensüümide poolt.

Lisaks võib toimuda Akt fosforüleerimine positsioonides T308 ja S473 vastusena IGF-1-le (insuliini sarnane kasvufaktor 1, ingl insulin-like growth factor 1). Tulemuseks on polüfosforüleeritud Akt, millele lisatakse ubikvitiinijääk. Suurem osa polüfosforüleeritud ja ubikvitinüleeritud Akt-ist lagundatakse samuti proteasoomis. Osa modifitseeritud Akt-ist translokeerub tuuma, kus fosforüleerib oma substraadid. Kasvajatest leitud mutantne Akt1 (E17K, 17. aminohape PH-domeenis on asendunud) on sagedamini fosforüleeritud ja ubikvitinüleeritud kui looduslik (ingl wild type) Akt. Lisaks translokeerub Akt1-E17K efektiivsemalt tuuma ja võib seeläbi olla seotud kasvajate kujunemisega. Akt-E17K mutantset varianti on leitud näiteks inimese rinna- ning kopsuvähi rakkudest.

Funktsioon
Aktiveeritud Akt translokeerub tsütoplasmasse ja tuuma, kus paiknevad ensüümi substraadid. Akt mõjutab substraate neid fosforüleerides. Fosforüleerimine võib olla stimuleeriv või inhibeeriv ehk substraate aktiveeriv või inaktiveeriv.

Rakkude ellujäämine ja apoptoos
Aktiveeritud Akt mõjutab mitmeid faktoreid, mis osalevad apoptoosis, kas transkriptsiooni reguleerides või neid otseselt fosforüleerides. Tuumas inhibeerib Akt transkriptsioonifaktoreid, mis on vajalikud apoptoosiks, ja stimuleerib antiapoptootiliste geenide avaldumist. Lisaks aktiveerib Akt transkriptsioonifaktoreid, mis on olulised raku ellujäämist tagavate geenide ekspressiooniks. Näiteks fosforüleerib Akt IκB kinaasi ja võimaldab seeläbi transkriptsioonifaktor NFκB aktiivse vormi tekkimise. See transkriptsioonifaktor on samuti oluline apoptoosi regulatsioonis, lisaks mõjutab see rakkude kasvu, kudede arengut ja immuunvastust.

Rakutsükkel
Akt võimaldab rakutsüklis G1-S-faaside vahelist üleminekut, fosforüleerides ja inaktiveerides glükogeeni süntaas-kinaasi 3 (GSK-3). See takistab tsükliin D1 ja β-kateniini degradatsiooni. Tsükliini ja β-kateniini kuhjumine omakorda suurendab tsükliin D1 ekspressiooni ehk toimub positiivne tagasiside. Akt suurendab ka tsükliin D1 translatsiooni mTOR-i fosforüleerimise kaudu. mTOR on seriin/treoniin-proteiinkinaas, mille üheks eesmärgiks on valkude sünteesi regulatsioon. Tsükliinide kuhjumine võimaldab ülemineku rakutsükli järgmisse faasi. S-faasis toimub DNA replikatsioon, mis on vajalik rakkude jagunemiseks.

Rakkude migratsioon
Akt fosforüleerib mitmeid valke, mis osalevad tsütoskeleti komponendi aktiini polümeriseerimisel ja stabiliseerimisel. Näiteks fosforüleerib Akt valku girdinit, mis mõjutab filamentide paiknemist ja on hädavajalik raku migratsiooniks. Normaalsetes rakkudes aktiini polümeriseerumine stabiliseerib teisi tsütoskeleti komponente või kutsub tsütoskeleti ümberkujundamise tulemusena esile rakkude migratsiooni. Lisaks interakteerub Akt teiste tsütoskeleti komponentidega. Näiteks fosforüleerib Akt vimentiini ja seeläbi takistab selle filamendi degradatsiooni. Vimentiin on vajalik kudede stabiliseerimiseks.

Seos kasvajatega
Akt reguleerib rakkude vohamist, kasvu (suurust), liikuvust, glükoosi metabolismi ja angiogeneesi ehk veresoonte moodustumist. Nende protsesside regulatsioonihäired viivad kasvaja tekkeni. Mitmed uuringud on näidanud, et paljudes kasvajatüüpides on Akt üleaktiveeritud ning see tõik on muutnud Akt signaaliraja oluliseks kasvajavastase võitluse märklauaks. Akt üleaktiveerimiseni võivad viia näiteks Akt geeni amplifikatsioon või liiga suur transkriptsioonimäär ning PTEN-i inaktivatsioon.

Angiogenees
Angiogenees ehk uute veresoonte moodustumine on hädavajalik kasvajarakkude elus püsimiseks ning toitainetega varustamiseks. Akt aktiveerib endoteliaalse lämmastikoksiidi süntaasi (eNOS), mis suurendab lämmastikoksiidi (NO) tootmist. Lämmastikoksiid osaleb veresoonte ümberkujundamises.

Glükoosi metabolism
Kasvajarakkudes on Akt seotud glükoosi metabolismi aktiveerimisega. Kasvajarakud eelistavad energiat saada glükolüüsi kaudu, mitte oksüdatiivse fosforüleerimise teel, isegi kui hapnikuallikas on olemas. Sellist nähtust nimetatakse Warburgi efektiks ehk aeroobseks glükolüüsiks. Akt suurendab glükoosi transporterite GLUT1 ja GLUT4 arvu plasmamembraanil, aktiveerib heksokinaasi ekspressiooni ning fosforüleerib GSK3 (glükogeen süntaas-kinaas 3). Need muutused mõjutavad glükoosi metabolismi ning stimuleerivad glükogeeni sünteesi. Lisaks mõjutab Akt glükolüüsi kaudselt transkriptsioonifaktorite ning fosfofruktokinaas-2 (PFK2) fosforüleerimise kaudu. PFK2 omakorda aktiveerib fosfofruktokinaas-1 (PFK1).

Viited

Ensüümid