Click-keemia

Click-keemia ehk klikk-keemia on rühm keemilise sünteesi bioloogilisi reaktsioone, mille peamine eesmärk on valitud substraatide ühendamine kindlate biomolekulidega. Click-keemia ei ole üks konkreetne reaktsioon, vaid see kirjeldab viisi, mille abil saab luua looduslike ainetega sarnaseid aineid ja luua aineid, ühendades väikseid modulaarseid ühikuid. Üldiselt ühendavad click-reaktsioonid biomolekuli ja reportermolekuli. Click-keemial ei ole bioloogilisi piiranguid, mõistet click-reaktsioon kasutatakse ka farmakoloogilistes ja erinevates bio-imiteerivates rakendustes ning see on muutunud ka väga kasulikuks biomolekulide kvalifitseerimises, lokaliseerimises ja detekteerimises.

Click-reaktsioonid toimuvad ühenõusünteesis, ei sõltu vee juuresolekust, tekitavad minimaalseid kahjutuid kõrvalprodukte ja on "vedruga" – seda iseloomustab kõrge termodünaamiline tõukejõud, mis viib kiiresti ja pöördumatult reaktsiooni produkti kõrge saagiseni, mis on kõrge spetsiifilisusega (mõnel juhul nii regio- kui ka stereoselektiivsusega). Need omadused muudavad click-reaktsioonid eriti sobivaks lahenduseks molekulide isoleerimise ja sihtimise probleemidele keerulistes bioloogilistes keskkondades. Sellistes keskkondades peavad produktid olema füsioloogiliselt stabiilsed ja mistahes kõrvalproduktid peavad olema mittetoksilised (in vivo süsteemides).

Mõiste click-keemia võttis esimest korda kasutusele 1998. aastal Karl Barry Sharpless ning seda kirjeldasid esmalt täielikult 2001. aastal Sharpless, Hartmuth Kolb ja M. G. Finn Scrippsi uurimisinstituudis. Ameeriklased Carolyn Bertozzi ja Barry Sharpless ning taanlane Morten Meldal pälvisid klikk-keemia arendamise eest 2022. aastal Nobeli keemiaauhinna.

Taust
Click-keemia on meetod kinnitamaks valitud sonde või substraate kindla biomolekuli külge ning seda protsessi kutsutakse biokonjugatsiooniks. Võimalus kinnitada fluorofoore ja teisi reportermolekule on muutnud click-keemia väga võimsaks tööriistaks uute ja vanade biomolekulide asukoha määramiseks, kirjeldamiseks ning identifitseerimiseks.

Üks kõige varasematest ning kõige tähtsamatest biokonjugatsioonimeetodidest on reporteri väljutamine samast transkribeeritavast järjestusest nagu uuritav biomolekul. Paljude valkude korral ongi GFP (green fluorescent protein) väljutatud N- või C-otspunktist, mis on näide esimest meetodist ning seda kasutatakse siiamaani. Siiski, sellise lähenemisega kaasnevad mitmed probleemid. GFP on väga suur molekul ning võib sageli mõjutada valitud valgu voltumist, veel enam, olles kinnitatud emba-kumba otspunkti, võib GFP-ga produkt omakorda mõjutada soovitud valgu "sihtimist" ning välimust. Lisaks saab selle meetodi kasutamisel GFP olla kinnitatud ainult proteiinide külge ja jätta mitte post-translatoorselt teised olulised biomolekulide liigid (nukleiinhapped, lipiidid ja sahhariidid jt) kättesaamatuks.

Tehes kindlaks bioortogonaalsetest reaktsioonidest osavõtjate paarid ning kasutades biomolekulaarsete sondidena väikseid eksogeenseid molekule, püüavad keemikud elimineerida neid takistavaid tegureid. Fluorofoori saab kinnitada ühe sellise sondi külge, et sidumise ajal edastada fluorestsentsi signaali reportermolekulist märklauale, täpselt nagu GFP, mis fluorestseerub suunatuna märklaua poole.

Seetõttu tulevad aga uued keemilised piirangud sondi suunamisest märklaua poole. Selleks, et seda tehnikat saaks kasutada bioloogilistes süsteemides, peab click-keemia toimuma bioloogilistes või sellele lähedastes tingimustes, tootma vähesel määral ja (täiuslikul juhul) mittetoksilisi kõrvalprodukte, mis peavad olema (eelistatult) stabiilsed ja ainsad produktid samades tingimustes ning nad peavad andma ühenõusünteesi korral suure saagise. Senini on teadustöö keskendunud uute reaktsioonide mõistmisele ja arendamisele ning tuntud reaktsioonidele uute eesmärkide seadmisele ja uuesti mõistmisele, kuid lisaks proovitakse ka kasutusel olevaid meetodeid laiendada, et ühendada reaktsioonipartnerid elussüsteemidega, luua uusi reaktsioonipartnereid ja arendada biokonjugatsiooni rakendusi.

Arendades kindlaid kontrollitavaid bioortogonaalseid reaktsioone, on teadlased avastanud võimaluse tabada konkreetseid märklaudu keerulistes rakulüsaatides. Hiljuti on teadlased avastanud ka click-keemia rakenduse elusrakkudes, näiteks kasutades väikeseid sondimolekule, mis leiavad märklaua ja kinnitavad end neile click-reaktsiooniga. Vaatamata takistustele raku läbilaskvuses, bioortogonaalsuses, asukoha märgistamises ja reaktsiooni efektiivsuses, on click-reaktsioonid oma kasulikkust tõestanud uue generatsiooni immunosadestuskatsetes (mille korral saab kindlaid märklaudasid isoleerida, näiteks reportermolekulidega, mis seonduvad teatud kolonni) ja fluorestsentsspektroskoopias (mille korral fluorofoor on kinnitatud valitud märklaua külge ja märklaud on koguseliselt või asukohaliselt kindlaks määratud). Viimasel ajal on leitud uudseid meetodeid click-reaktsiooni partnerite ühendamiseks biomolekulide pinnale ning sisse, reageerivaid rühmi sisaldavate mittestandardsete aminohapete ühendamiseks valguga ja nukleotiidide modifitseerimiseks. Need reaktsioonitehnikad esindavad osa keemilisest bioloogiast, milles click-keemia mängib põhirolli sidudes modulaarseid ühikuid tahtlikult just aine erinevatesse otstesse.

Click-reaktsioonid 
Soovitud click-keemia reaktsioon peab olema:
modulaarne
laia käsitlusalaga
väga suure saagisega
moodustanud ainult kahjutuid kõrvalsaaduseid
stereospetsiifiline
füsioloogiliselt stabiilne
suure termodünaamilise tõukejõuga (> 84 kJ/mol), et reaktsioon omaks ühte produkti

Vask(I)-katalüüsitud asiid-alküün tsükloliitumisreaktsioon (CuAAC)

Klassikaline click-reaktsioon on vask-katalüüsitud reaktsioon asiidi ja alküüniga, et moodustada 5-lülilist heteroaatomitest ringi – vask(I)-katalüüsitud asiid-alküün tsükloliitumisreaktsioon (inglise k Cu(I)-Catalysed Azide-Alkyne Cycloaddition (CuAAC)). Esimese triasooli sünteesi dietüülatsetüleenkarboksülaadi ja fenüülasiidiga viis läbi Arthur Michael 1893. aastal. Hiljem, 20. sajandi keskel, peale Rolf Huisgeni reaktsioonide tingimuste ja kineetika uurimist, sai rühm 1,3-dipolaarseid tsükloreaktsioone Huisgeni nime. Vask(I)-katalüüs Huisgeni 1,3-dipolaarsed tsükloreaktsioonid avastasid samaaegselt V. Fokini ja K. Barry Sharplessi uurimisrühmad Scrippsi uurimisinstituudis ja Morten Medal Carlsberg Laboratory’s. Vask-katalüüsitud versioon sellest reaktsioonist annab ainult 1,4-isomeeri, samal ajal kui Huisgeni mitte-katalüüsitud 1,3-dipolaarne tsükloreaktsioon annab nii 1,4- kui ka 1,5-isomeeri, mis on aga omakorda aeglane reaktsioon ja vajab toimumiseks temperatuuri 100° C.

Asiid-alküün pingestatud tsükloliitumisreaktsioon (SPAAC)

Carolyn R. Bertozzi uurimisrühm arendas hiljem Huisgeni vasevaba click-reaktsiooni, et vabaneda CuAAC-reaktsiooni tsütotoksilisusest. Selle asemel, et kasutada Cu(I) alküüni aktiveerimiseks, on alküün aktiveeritud pingestatud difluorooktüünis (DIFO), mille korral elektrofiilsed ja propagüülsed pärl-fluoriinid tegutsevad koos pingestatud ringja tsükliga, et alküüni destabiliseerida. See destabiliseerimine tõstab reaktsiooni tõukejõudu ja tsükloalküüni soovi leevendada oma ringjat pingesolekut. 
See reaktsioon jätkub nagu [3+2] tsükloreaktsioon Huisgeni 1,3-dipolaarse tsükloreaktsiooni mehhanismi järgi. Fluoriini asendajaks võivad olla ka näiteks benseenituumad, mis on samuti tsüklooktüüni korral lubatud.

Alküün-nitron pingestatud tsükloliitumisreaktsioon (SPANC)

Pingestatud diarüültsüklooktüünid, sisaldades dibensüültsüklooktüüne (DIBO), on samuti kasutatud reageerimiseks 1,3-nitronitega pingestatud alküün-nitron tsükloliitumisreaktsioonides, et toota N-alküleeritud isoksasüliine.

Kuna see reaktsioon on metallivaba ja talle on omane kiire kineetika (k2=60 Ms−1, kiirem kui mõlemal CuAAC-l või SPAAC-l), saab SPANC-i kasutada elusrakkude märgistamiseks. Enamgi veel, süsiniku ja lämmastiku asendamine nitroni dipoolil ning atsüülsed ja endotsüülsed nitronid on kõik sobivad. Selline lai sobivusala tagab suure paindlikkuse nitroni käsitlemisel ja sondiga ühinemisel.

Rakendused

Click-keemia rakendused on laialdased, nende abil saab suurt hulka sonde kinnitada suure hulga biomolekulidest märklaudade külge. Märkimisväärsete click-keemia rakenduste hulka kuulub ka fluorestseerivate sondide kinnitamine spektromeetiliseks määramiseks ja kvalifikatsiooniks, ning molekulide käsitlemine, mis võimaldavad sihtbiomolekuli puhastamist. Näiteks fluorofoor rodamiin on kinnitatud norboneeni külge ja pandud reageerima tetrasiiniga elussüsteemides ning SPAAC tsüklooktüüni-modifitseeritud fluorofoor ja valgud, mille külge on asiid kinnitatud, võimaldavad nende valkude sisenemise rakulüsaatidesse.

Viited 

Keemia