Vedelikkromatograafia-massispektromeetria

Vedelikkromatograafia-massispektromeetria (lühendatult LC/MS) on analüütilises keemias kasutatav meetod, mis hõlmab vedelikkromatograafia (LC või HPLC) võimekust aineid üksteisest füüsiliselt eraldada ning massispektromeetria (MS) võimet tuvastada aineid massi ja laengu suhte (m/z) järgi.

Seadmed

Vedelikkromatograaf

Vedelikkromatograafia on ainete eraldamise meetod. Erinevalt gaasikromatograafiast, mis ei sobi mittelenduvate ega termolabiilsete (kuuma käes lagunevate) molekulidega, suudab LC eraldada vägagi erinevaid orgaanilisi molekule.

Massispektromeeter
Massispektromeeter on universaalne detektor LC jaoks. MS-i tööpõhimõte seisneb selles, et molekulid ioniseeritakse ning tekkinud ioonid sorteeritakse massi ja laengu suhte (m/z) alusel. Sellele järgneb ioonide kvantitatiivne tuvastamine. Kaks põhilist komponenti selles protsessis on ioonallikad, mis ioniseerivad molekule, ja massianalüsaator, mis sorteerib ioone. MS võimaldab madalaid avastuspiire (vähim analüüdi sisaldus proovis, mida saab usaldusväärselt detekteerida ja identifitseerida), lisaks saab analüüte identifitseerida ja hinnata kromatograafiliste piikide (kromatogrammile tekkivad kohalikud maksimumid) puhtust (kas piik sisaldab peale analüüdi ka teisi aineid).

Ioonallikad
Ioonallikas on liides LC ja MS-i vahel. Selle ülesandeks on ioniseerida analüüdi molekulid ning eraldada need ülejäänud ioonidest mobiilsest faasist.

Varasemad LC/MS seadmed kasutasid liideseid, mis ei eraldanud mobiilse faasi molekule analüütidest või tegid seda enne ioniseerimist. Nendega ioniseeriti analüüdi ioonid massispektromeetris, kus oli vaakum (tihti elektronioonisatsiooniga). Sellised lähenemised olid edukad ainult väga väheste koostisosadega.

Tänapäeval kasutatakse enamasti LC/MS-i liidestamiseks atmosfäärirõhulist ionisatsiooni (API). Selle kasutuselevõtt suurendas oluliselt LC/MS-i analüütide hulka. API tehnikatega analüüdid esmalt ioniseeritakse ning seejärel toimub ioonide eemaldamine neutraalsetest molekulidest elektrostaatiliselt ja mehaaniliselt. Levinuimad API seadmed on: elektropihustus-ionisatsioon (ESI), atmosfäärirõhuline keemiline ionisatsioon (APCI) ja atmosfäärirõhuline fotoionisatsioon (APPI).
Enamik LC/MS analüüse, mis on tänapäeval kasutusel, korraldatakse ESI või APCI-ga.

Massianalüsaatorid
Tekkinud ioonid juhitakse massianalüsaatorisse, mis asub vaakumis. Teoreetiliselt saab LC/MS korral kasutada kõiki massianalüsaatorite tüüpe. Kasutatakse kvadrupool-, lennuaja-, ioonlõks- ning Fourier’ teisendusega ioontsüklotronresonantsmassianalüsaatoreid.

Rakendused
LC/MS-iga saab analüüsida termolabiilseid analüüte, mis ei sobi gaasikromatoraafia-massispektromeetria jaoks. See võimaldab analüüsida mitteaurustuvaid analüüte ning analüüdid ei vaja derivatiseerimist. LC/MS sobib paljudeks rakendusteks, mida kasutatakse alates farmaatsiast kuni keskkonnaanalüüsideni. LC/MS-i võime tuvastada paljusid komponente suure tundlikkuse ja spetsiifilisusega on muutnud selle populaarseks paljudel aladel. Näiteks võimaldab see tuvastada molekulmasse ning annab infot struktuuri kohta. LC/MS leiab kasutust farmaatsias, biokeemias, kliinikumis, toiduainetööstuses, keskkonnaanalüüsides jne. MS on hea ravimite metabolismi ning produkti stabiilsuse uurimiseks, looduslike produktide tuvastamisel ja kohtuekspertiisi analüüsides – kõikjal, kus struktuuriline selgus ja tuvastamine on vajalik. Analüüsid hõlmavad nii kvalitatiivseid kui ka kvantitatiivseid määramisi. Analüütideks võivad olla nii suure kui ka väikese molekulmassiga ained, sealhulgas sünteetilised polümeerid, biopolümeerid, keskkonna saasteained, farmatseutilised ühendid (ravimid ja nende metaboliidid) ning looduslikud ühendid. Üldiselt on see kasutusel kõikide analüütide jaoks, mis võivad esineda keerulistes maatriksites. Erinevate rakenduste jaoks on vajalikud erinevad LC/MS liidesed, millest kahtlemata kõige levinumad on ESI ja APCI.
Põhiliselt jagunevad rakendused kahte rühma:
analüüdi identifitseerimine
analüüdi kvantifitseerimine.
Need omakorda jagunevad rakendusteks, kus analüütideks on kas suure molekulmassiga komponendid (biopolümeerid) või väikse molekulmassiga komponendid (ravimid).

Vedelikkromatograafia ühendatult massispektromeetriga
Paljudes analüüsides on meid huvitav(ad) koostisosa(d) keerulises segus. Kromatograafia roll on need koostisad sellest segust eraldada, et oleks võimalik nende tuvastamine ja kvantitatiivne määramine. Kvalitatiivsest vaatenurgast põhiliseks kromatograafia miinuseks on see, et komponente pole võimalik üheselt kindlaks määrata isegi siis, kui nad on täielikult eraldatud. Identifitseerimine põhineb komponentide retentsiooniaegade võrdlemisel referentsainete retentsiooniaegadega. Kuid sellisel juhul ei ole kindlalt võimalik öelda, kas tegu on just sama ainega. Samuti pole alati võimalik saavutada ainete kromatograafilist lahutust. MS-i võimsus seisneb selles, et massispektril on info komponentide kohta piisavalt iseloomulik. See info võimaldab komponente väga suure kindlusega identifitseerida.

Kui analüüs vajab analüüdile iseloomulikku informatsiooni, siis detektorite hulgas pole MS-ile vastast. Informatsioon, mis on saadud näiteks fotodioodrivi detektori abil, on suhteliselt piiratud, samal ajal kui massispektrid sisaldavad informatsiooni molekulaarioonide ja elementide kohta ning struktuurilist infot, et kromatograafiliselt lahutatud komponendid oleks üheselt mõistetavad. Massispektromeetrit kasutades suureneb märgatavalt võime segus leiduvat komponenti identifitseerida.

Klassispetsiifiliste detektoritega (näiteks UV-detektoriga) on raske täielikult tuvastada tundmatuid aineid. Selliste detektorite meetodid on tavaliselt arendatud selleks, et kinnitada kindla analüüdi olemasolu. Kui on tegemist lihtsate segudega, siis sellest täiesti piisab.

Koostisosaspetsiifiline detektor, nagu näiteks MS, annab piisavalt infot, et ära tunda proovi komponente. Massispektrid on rikkad keemilise info poolest, mis lubab tuvastada tundmatud komponendid proovides isegi siis, kui neid pole võimalik standardiga võrrelda. MS on kasulik kõikides analüüsialades, kus struktuuriline selgus ja tuvastamine on vajalik. MS-iga ei pea enne analüüsi teadma, mida otsitakse, kuid näiteks UV-detektoriga on see vajalik. MS-ga saab tuvastada komponente nii, nagu nad on (pole vaja derivatiseerida). See annab suure eelise juhul, kui on oluline analüüsi läbiviimise kiirus ning täpsus proovi kohta, mis on kriitiline mingi tähtsa otsuse tegemiseks või probleemi lahendamiseks.

Vedelikkromatograafia-massispektromeetria ajalugu
LC/MS-i tegi võimalikuks kolm põhilist aspekti:
võimalus ühendada kromatograafiline kolonn MS-ga
võimalus saavutada rikastumine analüüdiga, et võimaldada elektronionisatsiooni
võimalus ioniseerida analüüte otse mobiilsest faasist.

Vedelikkromatograafia-massispektromeetria algus
1970-ndatel, kui ilmusid esimesed teated kõrgsurve-vedelikkromatograafia tuleku kohta, said alguse uurimused LC ja MS-i liidestamiseks. 
Ilmselgelt on kõige lihtsam viis ühendada LC kolonni väljund otse MS-i ioonallikaga, mis asetseb vaakumis. Sellist lähenemist luua sisselaske liides katsetas teoreetiliselt ja eksperimentaalselt Tal’rose jt 1972. aastal.

Selleks, et vältida mittelenduvate ühendite sadenemist MS-i sisemistele seintele, uuriti LC väljundi vähendamise võimalusi. Probleem leidis lahenduse 1980. Aastal, mil loodi väike membraan solvendi eemalejuhtimiseks. See tegi võimalikuks otsese vedeliku sisestamise liidese.

1972. aastal kirjeldasid Lovins jt LC voolu peatamisega (stop-flow) LC/MS süsteemi, kus esmalt koguti teatud kogus efluenti ning pärast seda peatati vool läbi kolonni. Osa efluendist kuumutati, mille käigus see aurustus ning kontsentreerus mõõtepea otsa. Edasi juhiti see juba tavalisse MS-i ioonallikasse. Seejärel käivitati jälle läbivool kolonnist ning jätkus kromatograafiline eraldamine. Terve selline tsükkel võttis aega 3–5 minutit.

1974. aastal toimusid katsetused APCI suunas. APCI on solvendi vahendusel keemilise ionisatsiooni meetod. Keemiline ionisatsioon on initsieeritud elektronide poolt, mis on pärit 63Ni fooliumilt või koroonalahenduselektroodilt. Sellise lähenemise rajas Horningu grupp. Sel ajal oli see kõige parem lähenemine LC/MS-ile ning see kestis kuni 90-ndate alguseni, mil saavutati tõeline murrang LC/APCI/MS-is.

1968–1980 toimusid mitmeid uuringuid, mis olid suunatud lahuste elektropihustuseks MS-i proovide jaoks. Need ei olnud otseselt suunatud LC liidestamiseks MS-ga, kuid sellegipoolest mängisid suurt rolli hilisemas LC/MS-i arengus.

Esimene kaubanduslik LC/MS liides muutus kättesaadavaks 1970ndate lõpus. ESI liideste ilmumine 1980-ndate lõpus tõi kaasa suure muutuse LC/MS-is. See tegi võimalikuks tunduvalt suuremad voolukiirused ning tõstis ka meetodi tundlikkust. Samuti võimaldas ESI kasutuselevõtt laiendada LC/MS-i kasutusalasid.

Viited 

Massispektromeetria