BacMam-süsteem

BacMam-süsteemiks nimetatakse bakuloviiruse (Baculovirus) geeni ülekannet imetajarakkudesse . Termin "BacMam" tuleneb ingliskeelse fraasi kahe sõna esitähtedest: "Baculovirus gene transfer into Mammalian cells" ja seda terminit kasutatakse teemakohastes teadusartiklites.

Bakuloviirused on putukarakkudes paljunevad DNA-viirused, mis modifitseerituna on võimelised ekspresseerima imetajarakkudes valke. BacMam-süsteem kasutab modifitseeritud putukaraku viirust (bakuloviirust) transpordivahendina, et viia geene imetajarakkudesse minimaalse lisaainete koguse ja toksilisusega. Tehnoloogia põhineb sellel, et bakuloviiruse genoomi viiakse kassett imetajarakkudes ekspresseeritavate valkude geenidega. Kuna putukaviirused imetajaterakkudes ei paljune, puudub ka igasugune nakkusoht inimestele ja keskkonnale.

BacMam-süsteem on bakuloviiruse-vahendatud geeni toimetamise meetod, mille avastas ning töötas välja Dr. Frederick M. Boyce. Oma paljude eeliste tõttu teiste transfektsiooni meetodite ees, on BacMam-tehnoloogia tänaseks juba laialdast kasutust leidnud . Peale selle esineb BacMam-süsteemil sisemine paindlikkus stabiilsete rakuliinide üle, mistõttu võib seda meetodit nimetada ka standardseks geeni toimetamise tehnoloogiaks.

Üldised omadused

BacMam-süsteemi geeni kättetoimetamise tehnoloogia on transientne ekspressiooni süsteem, mis hõlbustab toksiliste geeniproduktide ekspressiooni. See hõlmab laia transduktsiooni ulatuse, sealhulgas ka erinevaid algraku tüüpe ja tüvirakke. Bakuloviiruslikul genoomil on suur võime võõraste geenide sisseviimiseks, mis on edukalt saavutatud alates geenidest suurusega 38 kiloaluspaari. Teostatav on ka samaaegne mitmekordne geeni ülekanne samasse rakku. Mikroskoopiliselt vaadeldavaid tsütopatoloogilisi BacMam-süsteemi osakeste efekte imetajarakkudes on väga vähe. Geeniekspressiooni tase võib olla kohandatud viirusliku annuse või keemiliste lisandite poolt, kasutades histooni deatsetülaasi inhibiitorit. Rakkude transduktsiooni teostatakse ainult lahuse lisamise teel ja seetõttu on BacMam-süsteem ka järeleandlik automatiseeritud meetod. Viirusosakesed jäävad lõpuks stabiilseks, kui neid hoida pimedas pika ajavahemiku jooksul 4 °C juures.

Tehnoloogia ülevaade
BacMam-tehnoloogia baseerub putukaviiruse kaksikhelikaalsel DNA-l kui transpordivahendil efektiivseks geeniülekandeks ning geenide ekspresseerumiseks imetajarakkudes. BacMam-reagente (valik reagente:) kasutatakse rakupõhistel analüüsidel, elusrakkude uurimisel, tüvirakkude bioloogias ja paljudes teistes rakendustes.

Geenide ülekandmiseks imetajarakkudesse kasutatakse standardset transduktsiooni protsessi. BacMam-süsteemi osakesed viiakse endotsütoosi ja vabastatakse transkriptsiooni ja geeniekspressiooni ajal. Transduktsiooni puhul kannavad geene edasi viirused. Paljud viirused liidavad rakku sisenedes oma DNA peremeesraku genoomi ning genoomist lahkudes ja rakust väljudes võtavad koos oma genoomiga kaasa ka peremehe geene. Uude peremeesrakku sisenedes on neil niiviisi kaasas eelmise peremehe geenid ja need võivad uues peremehes alles jääda ning toimima hakata. Geeniekspressioon algab 4–6 tunni jooksul transduktsiooni ajal ning paljude rakutüüpide puhul lõpeb täielikult alles pärast üleööd. Sõltudes transduktsiooni efektiivsusest, rakutüübist ja rakujagunemise määrast, jääb transgeen märgatavaks 5–14 päevaks.

Eelised
 Tõhus imetaja rakuliinide transduktioon.
 BacMam reagente saab kasutada väga laias imetaja rakutüüpide vahemikus. Rakutüübid, mis on edukalt transdukteeritud BacMam-reagentidega, hõlmavad arvukaid transformeeritud rakuliine (näiteks U2-OS, HEK 293 ning HeLa). Paljude algrakkude (näiteks fibroblastid, hepatotsüüdid, kardiovaskulaarsed rakud ja epiteelrakud) ja tüvirakkude (näiteks närvirakud ja mesenkemaalid) transformeeritud rakuliinide BacMam transduktsioon on näidanud kõrget tõhusust ning üldiselt pole täheldatud ka vastumõjusid. See teeb selle platvormi väga paljutõotavaks geeni toimetamise tehnoloogiaks.
 Ohutu – ei replitseeru imetajarakkudes, ja märgatava tsütopaatse efekti puudumine.
 Eeltransdukteeritud rakkude hoiustamine külmutatult genereerib analüüsiks valmisrakke.
 Analüüsi arengu kiirus – puudub vajadus tekitada stabiilseid rakuliine.

Bioohutusalased kaalutlused

Bakuloviirused on esimese riskigrupi esindajad, mida on laialdaselt kasutatud juba üle 25 aasta putukarakkude valgu ekspressiooni rakendamiseks. Bakuloviirused on loodud putukarakkudes ja on võimetud paljunema imetajarakkudes ning ei ole teada ka ühtegi haigust, mille põhjustajaks tervetele täiskasvanud inimestele võiksid nad olla. Lisaks on BacMam viirusosakesed inaktiveeritud inimese poolt, mis vähendab riski teaduritele. Peale selle ei saa viirused paljuneda ka putukates, mistõttu puudub igasugune oht keskkonnale.

Viiruslik sisenemine

Uuringud bakuloviiruse sisenemisel inimese hepatotsellulaarsetesse vähkkasvaja rakkudesse vihjavad sellele, et BacMam siseneb imetajarakkudesse läbi klatriin-vahendatud endotsütoosi ning võimalikult läbi makropinotsütoosi . Hilisemad uuringud on vihjanud ka spetsialiseerunud lipiidiparve – caveolae, mis omab mitmeid signaaliülekande funktsioone, kaasamisest bakuloviiruse sisenemisse imetajarakkudesse.

Peremeesraku vastus

Et tehnoloogia toimiks efektiivselt, siis geeni toimetamise meetod ei tohi normaalseid rakulisi funktsioone segama hakata.Tsütotoksilisuse hinnangud ning transkriptsiooni analüüsid inimese HEK rakuliinidel (HEK293) on näidanud, et bakuloviiruse transduktsioon ei ole tsütotoksiline ega põhjusta muutusi transkriptsioonilistes vastustes. Samamoodi nakatunud Schwanni rakud säilitavad omale iseloomuliku morfoloogilise ja molekulaarse fenotüübi ja on võimelised diferentseeruma katseklaasis ja ekspresseerima P0 müeliinisatsiooni markerit. Kasutades komplementaarse DNA (cDNA) mikrorivi tehnoloogiat, et kontrollida in vitro (katseklaasis) ja in vivo (elusas rakus/organismis) üldist rakulist geeni väljenduse profiile roti ajus, aretatud inimese astrosaite ning inimese närvirakke pärast viiruslikku transduktsiooni, on täheldatud peremehe antiviiruslik vastus. Suguluses olevad geenid on peamiselt need, mis on seotud kaasasündinud immuunsusega, kaasa arvatud erinevad geenid, olles kaasatud Tolli-sarnaste retseptorite signaaliülekandesse ja tsütokiin-tsütokiin retseptori interaktsiooni.

Rakendused

 Bioproduktsioon BacMam-süsteemi on kasutatud tootmaks valke suurtes kogustes, kasutades HEK293 rakke õõneskiud-bioreaktori süsteemis.
 Kõrgläbilaske linastus G-valguga seotud retseptori farmakoloogia on võimaldanud tänu BacMam-süsteemi tehnoloogiale avastatud ravimite rakendust.
 Fluorestsentsmikroskoopia Organellide märgistamise reagentidena on kaubanduses saadaval BacMam organellide ja teiste rakusiseste struktuuride märgistuspartiklid.
 Üksik-mitokonder-märgistatud mitokondriaalselt suunatud roheline fluorestseeruv valk.
 Retseptor aktivatsiooni/ käiguraja analüüs''
 Serotoniini retseptori aktivatsiooni iseloomustus läbi BacMam-süsteemi poolt kohale toimetatud fusiooni kinaasi substraati.

BacMam-viiruste kasutamine südamehaiguste raviks
Geneetiliselt muundatud kardiomüoblastide ehk südamelihasrakkude võime ravida kahjustatud südamelihast on hästi teada. Siiski on ravimisel suureks probleemiks selliste rakkude efektiivne ülekanne. Piiravaks faktoriks on massiivsed rakkude surmad pärast nende lihasrakkudevälist siirdamist verd pumpavasse südamesse. Selle probleemi adresseerimiseks on loodud rekombinantsed bakuloviirused (BacMam-viirused), mis transdukteerivad efektiivselt südamelihasrakke optimeeritud tingimustes. Need geneetiliselt modifitseeritud rakud jäävad kaitstuks uue polümeerse mikrokapsli tekke tõttu, mistõttu rakud säilitavad elujõulisuse. See toetab rakkude kiiret levikut vähemalt 30 päevaks. Need kapslid omavad tugevat immuunkaitset ning rohkem kui 70%-l tervetel kapslitel on kõrge mehaaniline ja osmootne stabiilsus. Siiski on vaja teha kliinilisi uuringuid, et teada selle pikaajalisi mõjusid.
Uuringutes loodi rekombinantsed viirused BacMam-süsteemi kasutades. See on tõhus tööriist mitmesugustegeeniteraapiate rakendamiseks, kuna see kombineerib laialdase rakkude kasvamise ning kõrge efektiivsusega transientse transgeeni avaldumise. Kuigi rekombinantset bakuloviirust võib pidada teatud mõttes süsteemi võlaks, on see siiski soovitum tunnus, arvestades selle bioohutust. Transientne ekspressioon on tunnuseks loodusliku mehhanismi puudumisel bakuloviiruse integreerumisel peremeesraku genoomiga. Kui alade tõttu, kus teiste imetaja viiruste nagu adenoviiruste ja lentiviiruste (nt HIV1, HIV2, SIV jt) vektoritel on suur tõenäosus juhuslikuks liitumiseks peremehe spetsiifilisse genoomi regiooni, võib esineda tahtmatute kasvajate teket, siis bakuloviirusega on selline oht võimalikult madal. Seetõttu kasutatakse just bakuloviirusi geenide ülekandmiseks, kuna tagatud on bioloogiline ohutus.

Viited 

Molekulaarbioloogia