Ανάλυση διαφορικής γονιδιακής έκφρασης

Η Ανάλυση Διαφορικής Γονιδιακής Έκφρασης (ΔΓΕ) (Αγγ. Differential gene expression (DGE) analysis), η οποία λέγεται και αλλιώς ανάλυση DG ή DGE, εκτός από το γεγονός ότι είναι ένα τμήμα της ανάλυσης βιολογικών δεδομένων αφορά επίσης και στην ανάλυση-ερμηνεία των διαφορών στην ποσότητα, στο πόσο δηλαδή άφθονα είναι τα μεταγραφήματα των γονιδίων.  Αυτή επίσης, λαμβάνει κανονικοποιημένα δεδομένα μέτρησης μετά από ανάγνωση και διεξάγει στατιστικές ανάλυσεις ώστε να αποκαλύψει τυχόν ποσοτικές αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης μεταξύ των πειραματικών ομάδων γονιδίων. Μια πολύ συχνή τακτική είναι η δημιουργία για παράδειγμα στατιστικών δοκιμών με σκοπό δούμε εάν, για ένα συγκεκριμένο γονίδιο ενδιαφέροντος, η διαφορά στο πλήθος των αριθμών ανάγνωσης είναι σημαντική. Αυτή λοιπόν μπορεί να είναι είτε μεγαλύτερη από ό,τι θα περίμενε κανείς, είτε μικρότερη, για διαφορετικά σετ γονιδίων ως αποτέλεσμα, για παράδειγμα, της φυσικής τυχαίας διακύμανσης. Στις πιο πολλές περιπτώσεις η ανάλυση διαφορικά εκφραζόμεων γονιδίων ακολουθείται από την ανάλυση-λειτουργικό χαρακτηρισμό αυτών.

Κύριες μέθοδοι πρόσκτησης δεδομένων 
Η ανάλυση διαφορικής έκφρασης  γονιδίων είναι μια από τις πιο κοινές εφαρμογές ανάλυσης δεδομένων αλληλούχισης RNA (RNA-seq) και μικροσυστοιχιών.

Μικροσυστοιχίες 
Οι Μικροσυστοιχίες χρησιμοποιούνται κυρίως για την ανίχνευση γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά σε δύο ή περισσότερα διακριτά σύνολα δειγμάτων. Τα διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια μπορεί να είναι υπεύθυνα για τις διαφορετικές ιδιότητες των συνόλων των δειγμάτων.

Η ανάλυση αλληλουχίας  ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης ή Chip Seq χρησιμοποιείται για την ανάλυση αλληλεπιδράσεων πρωτεϊνών με DNA. Πιο συγκεκριμένα, χρησιμοποιείται για τη χαρτογράφηση των θέσεων των πρωτεϊνών που είναι δεσμευμένες στη χρωματίνη σε όλο το γονιδίωμα. Τα θραύσματα χρωματίνης με την πρωτεΐνη ενδιαφέροντος επιλέγονται με τη βοήθεια ενός αντισώματος και το δεσμευμένο DNA αναλύεται για να αποκαλυφθούν οι θέσεις δέσμευσης.

Αλληλούχιση RNA 
Η αλληλούχιση RNA ή RNA-Seq είναι μία τεχνική προσδιορισμού αλληλουχάς. Χρησιμοποιεί τις δυνατότητες των μεθόδων προσδιορισμού αλληλουχίας υψηλής απόδοσης για να παρέχει πληροφορίες σχετικά με το μεταγράφωμα ενός κυττάρου. Παρέχει πολύ μεγαλύτερη κάλυψη και μεγαλύτερη ανάλυση της δυναμικής φύσης του μεταγραφώματος. Η ενσωμάτωση και η οπτικοποίηση των αποτελεσμάτων ΔΓΕ μπορεί να διευκολύνει μεταγενέστερες μελέτες, ειδικά για ερευνητές που έχουν περιορισμένο υπολογιστικό υπόβαθρο. Ειδικότερα, το RNA-Seq βοηθά στην εξέταση εναλλακτικών γονιδιακών μεταγραφών, μετα-μεταγραφικών τροποποιήσεων, σύντηξης γονιδίων, μεταλλάξεων/SNPs και μεταβολών στη γονιδιακή έκφραση. Πριν από το RNA-Seq, έγιναν μελέτες γονιδιακής έκφρασης με μικροσυστοιχίες που βασίζονται σε υβριδισμό. Τα προβλήματα με τις μικροσυστοιχίες περιλαμβάνουν διασταυρούμενη υβριδοποίηση, κακή ποσοτικοποίηση γονιδίων χαμηλής και υψηλής έκφρασης και ανάγκη γνώσης της αλληλουχίας a priori. Εξαιτίας αυτών των τεχνικών ζητημάτων, η μεταγραφική μεταπήδησε σε μεθόδους που βασίζονται στην αλληλουχία του RNA.

Προσδιορισμός διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων 
Ο υπολογισμός του βαθμού της μεταβολής της έκφρασης του ίδιου γονιδίου μεταξύ δύο διαφορετικών συνθηκών γίνεται με τη χρήση του λογαρίθμου του λόγου των τιμών έκφρασης στη συνθήκη μελέτης (test) προς τη συνθήκη ελέγχου (control). Η απόδοση των συνθηκών γίνεται από τον πειραματιστή και βασίζεται στο βιολογικό ερώτημα. Έτσι π.χ. αν αναζητούμε τις μεταβολές της έκφρασης σε μια παθολογική κατάσταση είναι λογικό οι τιμές των παθολογικών δειγμάτων να είναι η συνθήκη μελέτης και αυτές των φυσιολογικών να είναι η συνθήκη ελέγχου. Υπολογίζουμε το λογάριθμο του λόγου τους ως εξής:

Όπου FC αντιστοιχει στο fold change, Ε στην έκφραση,  g στα προς μελέτη γονίδια.

Η χρήση του λόγου των τιμών έκφρασης είναι προφανής. Τιμές του λόγου >1 θα είναι ενδεικτικές μεγαλύτερης έκφρασης στη συνθήκη μελέτης και συνεπώς ενεργοποίησης του γονιδίου ενώ τιμές <1 θα είναι ενδεικτικές καταστολής του. Η εφαρμογή του λογαρίθμου γίνεται για δύο λόγους. Αρχικά, για να μειώσει τη διασπορά των τιμών λόγων έκφρασης, με τον ίδιο τρόπο που είδαμε παραπάνω για τις καθαρές τιμές έκφρασης. Κατά δεύτερο λόγο, για να μετατρέψει το “ουδέτερο” σημείο της ποσότητας από το 1 στο 0. Οι τιμές log2FC είναι θετικές στην περίπτωση της ενεργοποίησης του γονιδίου g, της αύξησης δηλαδή των επιπέδων έκφρασής του στη συνθήκη μελέτης σε σχέση με τη συνθήκη ελέγχου και αρνητικές στην περίπτωση καταστολής. Μηδενικές μεταβολές αντιστοιχίζονται στην τιμή 0. Επιπλέον, η χρήση του δυαδικού λογάριθμου επιτρέπει μια απευθείας ανάγνωση του βαθμού της διαφορικής έκφρασης. Μια τιμή log2FC=1 σημαίνει διπλάσια έκφραση σε σχέση με τη συνθήκη ελέγχου, ενώ μια τιμή log2FC=-1 υποδηλώνει μείωση στο μισό. Η χρήση της λογαριθμικής κλίμακας επιτρέπει γενικότερα ευκολότερη ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Στην περίπτωση που η έκφραση του κάθε γονιδίου έχει μετρηθεί περισσότερες από μία φορές σε επαναλήψεις του ίδιου πειράματος, η εξίσωση  δεν αλλάζει αλλά στη θέση των Ε(g)μελέτης και Ε(g)ελέγχου χρησιμοποιούνται οι αντίστοιχες μέσες τιμές των επαναλήψεων. Η σημασία της πραγματοποίησης επαναλήψεων του ίδιου πειράματος είναι πολύ μεγάλη για λόγους στατιστικής αξιολόγησης που θα συζητηθούν στη συνέχεια. Σημειώνεται εδώ ότι η ζευγαρωτή σχέση συνθήκης μελέτης/ελέγχου δε σημαίνει ότι σε κάθε πείραμα υπάρχει μόνο μια συνθήκη μελέτης. Κρατώντας σταθερή τη συνθήκη ελέγχου κανείς μπορεί να υπολογίσει τη σχετική έκφραση σε μια σειρά από καταστάσεις. Έτσι π.χ. μπορεί κανείς να συγκρίνει παθολογικά δείγματα με δείγματα στα οποία οι ασθενείς υποβάλλονται σε διαφορετικές θεραπείες ή να μελετήσει τη διαφορική έκφραση σε διαφορετικά στάδια μιας διαδικασίας εφόσον όλα συγκρίνονται με ένα αρχικό χρονικό σημείο t=0 κλπ.

Εργαλεία Ανάλυσης Διαφορικής Έκφρασης 
Η ανάλυση διαφορικής γονιδιακής έκφρασης (DGE) είναι μια από τις πιο κοινές εφαρμογές των δεδομένων προσδιορισμού αλληλουχίας RNA (RNA-seq). Αυτή η διαδικασία επιτρέπει την αποσαφήνιση διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων σε δύο ή περισσότερες συνθήκες και χρησιμοποιείται ευρέως σε πολλές εφαρμογές ανάλυσης δεδομένων RNA-seq. Η ερμηνεία των αποτελεσμάτων της DGE μπορεί να είναι  χρονοβόρα λόγω της ποικιλίας των μορφών που βασίζονται στο εργαλείο επιλογής και των πολυάριθμων πληροφοριών που παρέχονται σε αυτά τα αρχεία αποτελεσμάτων.

Τα εργαλεία διαφορικής έκφρασης γονιδίων (DGE) εκτελούν στατιστικές δοκιμές βασισμένες σε ποσοτικοποιήσεις εκφρασμένων γονιδίων που προέρχονται από υπολογιστικές αναλύσεις μη επεξεργασμένων RNA-seq αποτελεσμάτων με σκοπό να προσδιοριστούν τα γονίδια που έχουν στατιστικά σημαντική διαφορά, ενώ παρέχουν επίσης πληροφορίες σχετικά με το επίπεδο έκφρασης και το μέγεθος της διαφοράς ανά ζεύγη για κάθε γονίδιο. Οι αναλύσεις DGE μπορούν να παρέχουν σημαντική εικόνα για τους γενετικούς μηχανισμούς σε οργανισμούς που συμβάλλουν σε φαινοτυπικές διαφορές, συμπεριλαμβανομένων των προτύπων ανάπτυξης των φυτών, της ανίχνευσης προέλευσης όγκου και της μελέτης μικροβιωμάτων.

Τα εργαλεία που συνήθως χρησιμοποιούνται ειναι:

 edgeR 
 Cuffdiff/Cuffdiff2 2
 DESeq/DESeq2
 NOISeq
 SAMSeq
 sleuth
 Limma
 NBPSeq
 TSPM
 limma
 baySeq
 EBSeq
 ShrinkSeq
 voom/vst
Τα εργαλεία με την καλύτερη απόδοση τείνουν να είναι τα edgeR, DESeq/DESeq2 και limma-voom. Το DESeq και το limma-voom τείνουν να είναι πιο συντηρητικά από το edgeR, αλλά το edgeR συνιστάται για πειράματα με λιγότερες από 12 επαναλήψεις. Όλα αυτά τα εργαλεία βασίζονται στη γλώσσα R και κάνουν μεγάλη χρήση πολυάριθμων στατιστικών μεθόδων που έχουν αναπτυχθεί και εφαρμοστεί τις τελευταίες δύο δεκαετίες για να βελτιώσουν την ισχύ ανίχνευσης ισχυρών αλλαγών που βασίζονται σε εξαιρετικά μικρό αριθμό επαναλήψεων και να βοηθήσουν στην αντιμετώπιση των ιδιορρυθμιών ακέραιων δεδομένων. Αυτά τα εργαλεία βασικά ακολουθούν την ίδια προσέγγιση, εκτιμούν τη διαφορά γονιδιακής έκφρασης για ένα δεδομένο γονίδιο χρησιμοποιώντας μοντέλα που βασίζονται σε παλινδρόμηση, ακολουθούμενο από μια στατιστική δοκιμή με βάση τη μηδενική υπόθεση ότι η διαφορά είναι κοντά στο μηδέν, πράγμα που θα σήμαινε ότι δεν υπάρχει διαφορά στις τιμές έκφρασης των γονιδίων που θα μπορούσαν να εξηγηθούν από τις συνθήκες. Ο παρακάτω πίνακας έχει μια περίληψη των βασικών ιδιοτήτων των δημοφιλών εργαλείων DGE. Οι πληροφορίες βασίζονται στους οδηγούς χρήσης των DESeq2, edgeR και limma και Rapaport et al. (2013), Seyednasrollah et al. (2015) και Schurch et al. (2015).

Μέθοδοι ανάλυσης διαφορικής έκφρασης 
Η λειτουργική ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης αποτελεί βασικό στάδιο για την αξιοποίηση ενός ολοένα αυξανόμενου αριθμού πειραμάτων. Τρεις είναι οι βασικότερες κατηγορίες μεθόδων.

1. Απλή Ανάλυση Εμπλουτισμού (SEA) 
H Aπλή Ανάλυση Εμπλουτισμού (Single Enrichment Analysis, SEA) εκτυλίσσεται σε δύο στάδια, τον υπολογισμό των σχετικών εμπλουτισμών και το στατιστικό έλεγχο των τιμών τους μέσω της υπεργεωμετρικής κατανομής. Ο συγκεκριμένος τύπος ανάλυσης είναι ο απλούστερος αλλά αποτελεί τη βάση για όλες τις πιο σύνθετες μεθοδολογίες.

2. Ανάλυση Εμπλουτισμού σε Σύνολα Γονιδίων (GSEA) 
Η Ανάλυση Εμπλουτισμού σε Σύνολα Γονιδίων (Gene Set Enrichment Analysis, GSEA) είναι μια μέθοδος με δύο βασικά πλεονεκτήματα σε σχέση με την απλούστερη SEA..

Πρώτον, δεν απαιτεί την εφαρμογή αυθαίρετων κριτηρίων για τον ορισμό ενός υποσυνόλου διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων. Δεύτερον, ακριβώς εξαιτίας αυτής της απουσίας τιμών-κατωφλίων, χρησιμοποιεί το σύνολο των δεδομένων αντί για ένα περιορισμένο μέρος τους. Τα δεδομένα εισόδου στην GSEA είναι οι τιμές έκφρασης από ολόκληρο το πείραμα. Το τελικό αποτέλεσμα είναι κι εδώ μια σειρά από τιμές p-value που αξιολογούν το βαθμό εμπλουτισμού μιας δεδομένης λειτουργίας, όμως ο τρόπος που υπολογίζεται τόσο η κάθε τιμή p-value αλλά και ο εμπλουτισμός διαφέρουν από την SEA.

3. Σπονδυλωτή (modular) Ανάλυση Εμπλουτισμού (MEA) 
Κληρονομώντας το βασικό υπολογισμό εμπλουτισμών από την SEA, η Σπονδυλωτή Ανάλυση Εμπλουτισμού (Modular Enrichment Analysis, ΜΕΑ) ενσωματώνει επιπλέον αλγορίθμους που αποσκοπούν στην ανάδειξη ιδιοτήτων δικτύων που λαμβάνουν υπόψη τις σχέσεις μεταξύ λειτουργικών όρων. Έτσι αν δύο όροι π.χ. γονιδιακής οντολογίας βρεθούν να είναι σημαντικά εμπλουτισμένοι αλλά ταυτόχρονα βρίσκονται και σε γειτονικές θέσεις στο γράφο της ιεραρχίας των όρων, θα θεωρηθούν ακόμα μεγαλύτερης σημασίας. Το βασικό πλεονέκτημα αυτών των μεθόδων είναι ότι επιτρέπουν την εξόρυξη πληροφορίας που σχετίζεται με βαθύτερες βιολογικές σχέσεις όπως η ιεραρχική οργάνωση κυτταρικών διεργασιών ή οι αλληλεπιδράσεις 36 μεταξύ μονοπατιών. Στον αντίποδα, ένας βασικός περιορισμός είναι ότι η ΜΕΑ απαιτεί την ύπαρξη ιεραρχίας στην οργάνωση των λειτουργικών κατηγοριών (όρων) και έτσι μπορεί να χρησιμοποιηθεί κυρίως στην περίπτωση των γονιδιακών οντολογιών. Οι προσπάθειες για την ιεραρχική οργάνωση και άλλων λειτουργικών κατηγοριοποιήσεων έχουν ενταθεί καθώς είναι προφανές πως θα συμβάλλουν σημαντικά στην καλύτερη και πληρέστερη βιολογική ερμηνεία των πειραμάτων έκφρασης με μικρότερη εξάρτηση από ακραίες τιμές έκφρασης που δημιουργούν μια χαρακτηριστική τάση υπερεκπροσώπησης συγκεκριμένων λειτουργικών κατηγοριών (π.χ. ρύθμισης της μεταγραφής).

Υπάρχουν διαφορετικές μέθοδοι για ανάλυση διαφορικής έκφρασης, όπως το edgeR και το DESeq που βασίζονται σε αρνητικές διωνυμικές κατανομές (NB) ή baySeq και EBSeq που είναι προσεγγίσεις Bayes βασισμένες σε αρνητικό διωνυμικό μοντέλο. Είναι σημαντικό να λαμβάνεται υπόψη ο πειραματικός σχεδιασμός κατά την επιλογή μιας μεθόδου ανάλυσης. Ενώ ορισμένα από τα εργαλεία διαφορικής έκφρασης μπορούν να πραγματοποιήσουν σύγκριση μόνο κατά ζεύγη, άλλα όπως το edgeR, το limma-voom, το DESeq και το maSigPro μπορούν να εκτελέσουν πολλαπλές συγκρίσεις.
Η γραμμή επεξεργασίας RNA-seq που χρησιμοποιείται για τη δημιουργία δεδομένων για τον Άτλαντα έκφρασης είναι ένας "αγωγός". Σε αυτόν τον “αγωγό” οι ακατέργαστες αναγνώσεις (αρχεία FASTQ) υποβάλλονται σε αξιολόγηση ποιότητας και φιλτράρισμα. Οι ποιοτικά φιλτραρισμένες αναγνώσεις ευθυγραμμίζονται με το γονιδίωμα αναφοράς μέσω του HISAT2. Οι χαρτογραφημένες αναγνώσεις συνοψίζονται και συγκεντρώνονται σε γονίδια μέσω HTSeq. Για τη βασική έκφραση, τα FPKM υπολογίζονται από τις πρωτογενείς μετρήσεις από το iRAP. Αυτές υπολογίζονται κατά μέσο όρο για κάθε σύνολο τεχνικών αντιγράφων και, στη συνέχεια, κανονικοποιούνται τα ποσοστά εντός κάθε συνόλου βιολογικών αντιγράφων χρησιμοποιώντας λίμα.

Τέλος, υπολογίζεται ο μέσος όρος για όλα τα βιολογικά αντίγραφα (εάν υπάρχουν). Για τη διαφορική έκφραση, τα γονίδια που εκφράζονται διαφορετικά μεταξύ του τεστ και των ομάδων αναφοράς κάθε ζεύγους αντίθεσης ταυτοποιούνται χρησιμοποιώντας το DESeq2.

Χάρτες θερμότητας και ομαδοποίηση 

Μια κοινή μέθοδος οπτικοποίησης δεδομένων γονιδιακής έκφρασης είναι η εμφάνισή τους ως θερμικός χάρτης. Ο θερμικός χάρτης μπορεί επίσης να συνδυαστεί με μεθόδους ομαδοποίησης που ομαδοποιούν γονίδια ή/και δείγματα με βάση την ομοιότητα του προτύπου γονιδιακής έκφρασης τους. Αυτό μπορεί να είναι χρήσιμο για τον εντοπισμό γονιδίων που ρυθμίζονται συνήθως ή βιολογικών υπογραφών που σχετίζονται με μια συγκεκριμένη πάθηση (π.χ. μια ασθένεια ή μια περιβαλλοντική κατάσταση).

Στους χάρτες θερμότητας τα δεδομένα εμφανίζονται σε ένα πλέγμα όπου κάθε σειρά αντιπροσωπεύει ένα γονίδιο και κάθε στήλη αντιπροσωπεύει ένα δείγμα. Το χρώμα και η ένταση των πλαισίων χρησιμοποιούνται για να αναπαραστήσουν αλλαγές (όχι απόλυτες τιμές) της γονιδιακής έκφρασης. Στο παρακάτω παράδειγμα, το κόκκινο αντιπροσωπεύει γονίδια που ρυθμίζονται προς τα πάνω και το πράσινο αντιπροσωπεύει γονίδια που ρυθμίζονται προς τα κάτω.

Μια κοινή προσέγγιση για την ερμηνεία των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης είναι η ανάλυση εμπλουτισμού συνόλου γονιδίων που βασίζεται στον λειτουργικό σχολιασμό των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων. Αυτό είναι χρήσιμο για να διαπιστωθεί εάν τα διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια σχετίζονται με μια συγκεκριμένη βιολογική διαδικασία ή μοριακή λειτουργία.

Η Γονιδιακή Οντολογία, που περιέχει τυποποιημένο σχολιασμό γονιδιακών προϊόντων, χρησιμοποιείται συνήθως για το σκοπό αυτό. Λειτουργεί συγκρίνοντας τη συχνότητα μεμονωμένων σχολιασμών στη λίστα γονιδίων (π.χ. γονίδια που εκφράζονται διαφορικά) με μια λίστα αναφοράς (συνήθως όλα τα γονίδια στη μικροσυστοιχία ή στο γονιδίωμα). Ο εμπλουτισμός των βιολογικών οδών που παρέχονται από τα KEGG, Ingenuity, Reactome ή WikiPathways μπορεί να πραγματοποιηθεί με παρόμοιο τρόπο.

Επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων της ΔΓΕ 
Η μελέτη της διαφορικής γονιδιακής έκφρασης με τους τρόπους που προαναφέρθηκαν, δίνει μια αρκετά αξιόπιστη εικόνα όσον αφορά τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων. Για να επαληθευούν όμως τα αποτελέσματα των μεθόδων αυτών και να εξαχθεί αδιαμφισβήτητο συμπέρασμα απαιτούνται περαιτέρω πειραματικές διεργασίες, στοχευμένες στα προς μελέτη διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια. Όπως για παράδειγμα στοχευμένες αλυσιδωτές αντιδράσεις πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (Real-Time PCR).

Παραπομπές