Φασματοφωτόμετρο

Το φασματοφωτόμετρο (αγγλ. spectrophotometer) είναι όργανο το οποίο μετρά την ένταση μιας επιλεγμένης συχνότητας ακτινοβολίας. Χρησιμοποιείται κυρίως στην Αναλυτική χημεία, αλλά και σε άλλες θετικές επιστήμες (αστρονομία, φυσική κλπ)

Αρχή λειτουργίας φασματοφωτομέτρου χημικού εργαστηρίου 

Σε ό,τι αφορά την αναλυτική χημεία το φασματοφωτόμετρο είναι εξέλιξη του χρωματοφωτομέτρου. Το πρώτο τμήμα του φασματοφωτομέτρου, αποτελείται από την πηγή παραγωγής ακτινοβολίας. Το δεύτερο τμήμα είναι αυτό που διαχωρίζει το επιθυμητό μήκος κύματος (συχνότητα) από τα υπόλοιπα που παράγει η πηγή, παρέχοντας έτσι στο τρίτο μέρος μονοχρωματική ακτινοβολία. Το τρίτο είναι αυτό που τοποθετείται το προς μέτρηση δείγμα και το τελευταίο είναι ο μετρητής της ακτινοβολίας που τελικά "περνά" (δεν απορροφάται) από το δείγμα.

Φασματοφωτόμετρο ορατού 

Η πιο απλή μορφή φασματοφωτόμετρου είναι το φασματοφωτόμετρο ορατού φάσματος (VIS από το Visible). Σε αυτό η πηγή είναι μια κοινή λάμπα πυράκτωσης. Το σύστημα διαχωρισμού είναι ένα κοινό πρίσμα ή συνηθέστερα ένα παραθλαστικό φράγμα το οποίο απομονώνει την επιθυμητή μονοχρωματική ακτινοβολία (μια συχνότητα ορατή σαν κόκκινο, πράσινο, κίτρινο κλπ φως). Η ακτινοβολία αυτή περνάει μέσα από μια κυψελίδα δηλ. διαφανές άχρωμο δοχείο που περιέχει το προς εξέταση δείγμα και όσο φως δεν απορροφά το διάλυμα μετρείται από ένα κοινό φωτόμετρο που βρίσκεται από την απέναντι πλευρά της κυψελίδας.

Φασματοφωτόμετρο υπεριώδους (UV) 

Η οργανολογία του είναι παρόμοια με αυτήν του ορατού. Οι διαφορές είναι δύο: Η πηγή είναι λυχνία Δευτερίου ή Ξένου (για να παράγει υπεριώδη ακτινοβολία) και όλα τα εξαρτήματα (πρίσμα, κυψελίδα κλπ) δεν είναι από γυαλί (το οποίο απορροφά την υπεριώδη ακτινοβολία) αλλά από χαλαζία. Ως όργανο συνήθως εμπεριέχει και λυχνία πυράκτωσης ώστε να μπορεί να γίνουν μετρήσεις και στο ορατό φάσμα. Τότε αναφέρεται ως UV-VIS.

Φασματοφωτόμετρο υπερύθρου (IR) 

Η οργανολογία του είναι παρόμοια με του ορατού. Οι διαφορές είναι στην κυψελίδα (επειδή δεν πρέπει να απορροφά υπέρυθρη ακτινοβολία) είναι συνήθως από ανόργανα άλατα αλκαλίων και στον τρόπο μέτρησης, συνήθως λαμβάνεται φάσμα απορρόφησης και όχι απορρόφηση σε μια συγκεκριμένη συχνότητα. Χρησιμοποιείται πολύ στον προσδιορισμό της δομής των χημικών ενώσεων.

Φασματοφωτόμετρο ατομικής απορρόφησης (ΑΑS) 

Σε αυτό η μονοχρωματική ακτινοβολία παράγεται από ειδικές λυχνίες για κάθε μετρούμενο μέταλλο (είναι εξειδικευμένη αναλυτική τεχνική για προσδιορισμό μετάλλων).Μέσα σε αυτές τις λυχνίες δημιουργείται ατμός του μετάλλου ο οποίος φωτοβολεί συγκεκριμένη συχνότητα. Το δείγμα αεριοποιείται με κάποιο τρόπο (είτε σε φούρνο γραφίτη,είτε με ψεκασμό σε φλόγα) και οι ατμοί του δείγματος μπαίνουν στην πορεία του παραγόμενου από την λυχνία μονοχρωματικού φωτός.Από εκεί απορροφούν μια ποσότητα φωτός ανάλογη της περιεκτικότητας του δείγματος προς το εξεταζόμενο μέταλλο, η οποία μετράται από τον μετρητή - φωτόμετρο.

Αρχή λειτουργίας φασματοφωτομετρίας ορατού-υπεριώδους (UV-VIS) 

Κάποια μόρια όταν ακτινοβοληθούν, απορροφούν μέρος της ακτινοβολίας (στο εξής φως, αν και δεν είναι πάντα έτσι)και μάλιστα κάποια συγκεκριμένα μήκη κύματος (π.χ. η ροδαμίνη απορροφά γύρω στα 550nm με μέγιστο τα 555nm). Όσο περισσότερα μόρια υπάρχουν στην δέσμη του φωτός, τόσο περισσότερο φως απορροφάται. Άρα μετρώντας την διαφορά της ποσότητας του φωτός, με και χωρίς τα προς μέτρηση μόρια μπορούμε να εκτιμήσουμε την ποσότητα τους. Αυτό είναι που κάνουμε χωρίς όργανο (στην ουσία αντί για φασματοφωτόμετρο χρησιμοποιούμε τα μάτια μας) παρατηρώντας πόσο σκούρο είναι ένα διάλυμα χρωστικής. Σκούρο διάλυμα = πυκνό, ανοικτόχρωμο = αραιό. Χρησιμοποιώντας μια σειρά πρότυπα διαλύματα π.χ. 1, 3, 5, 10 ppm μπορούμε να συγκρίνουμε ένα άγνωστο διάλυμα και να πούμε ότι αυτό είναι μεταξύ 3 και 5 ppm εφόσον η χρωματική του ένταση είναι μεταξύ του 2ου και 3ου προτύπου. Δεν μπορούμε όμως να πούμε ότι είναι 3,2 ή 4,0 ή 4,5 ppm γιατί απλά δεν μπορούμε να το εκτιμήσουμε. Αυτό γίνεται με το φασματοφωτόμετρο, το οποίο για κάθε πρότυπο δίνει ως αποτέλεσμα έναν αριθμό (το ποσοστό του φωτός που πέρασε (διαπερατότητα % (Τ% από το transmission) ή το λογάριθμο της ποσότητας του φωτός που απορροφήθηκε (ABS ή απλώς Α από το absorbance))οπότε με απλούς μαθηματικούς υπολογισμούς μπορεί να εξαχθεί ακριβές αποτέλεσμα. Π.χ. έστω ότι τα πρότυπα διαλύματα παρουσίασαν απορροφήσεις 1ppm=0,08 3ppm=0,24 5ppm=0,40 10ppm=0,80 και του δείγματος=0,30. Τότε η περιεκτικότητα του δείγματος είναι 3,75ppm. Οι μετρήσεις γίνονται στο μήκος κύματος που παρουσιάζει την μέγιστη απορρόφηση η εξεταζόμενη ουσία, ώστε να περιοριστούν οι επιδράσεις από άλλες ουσίες που υπάρχουν στο ίδιο διάλυμα (και απορροφούν σε άλλα μήκη κύματος). 
Η φασματοφωτομετρία χρησιμοποιείται ευρέως και για ουσίες που απορροφούν στο υπεριώδες (π.χ. σορβικό οξύ), αλλά και για ουσίες που δεν έχουν χρωμοφόρες ομάδες στο μόριο τους (αόρατες), αλλά γίνονται ορατές μετά από σχετικές αντιδράσεις (π.χ. η προλίνη σχηματίζει πορτοκαλέρυθρο σύμπλοκο με την νινυδρίνη και έτσι μπορεί να μετρηθεί φασματοφωτομετρικά).

Νόμος Lambert-Beer 
Ο νόμος αυτός σχετίζεται με την ποσότητα (ένταση) του φωτός που προσπίπτει σε ένα διάλυμα, και την ποσότητα του φωτός που απορροφάται από αυτό, σε σχέση με την περιεκτικότητα σε διαλυμένη ουσία. Συγκεκριμένα εκφράζεται από τον τύπο:

A = ε.l.c

όπου ε είναι η μοριακή απορρόφηση (δηλ. Η απορρόφηση που θα είχε διάλυμα 1Μ της ουσίας) , l το μήκος του δείγματος (πάχος κυψελίδας σε cm), και c η συγκέντρωση της διαλυμένης ουσίας (σε mole/l).  To A  είναι ο λογάριθμος του λόγου εντάσεως προσπιπτομένου φωτός προς το  φως που τελικά περνάει από το διάλυμα:

Α = -log(Ι/Ιo) όπου Ιο η ένταση του προσπίπτοντος φωτός και Ι το φως που εξέρχεται από την κυψελίδα (Η ποσότητα Ιο-Ι απορροφήθηκε από το δείγμα) . Ο λόγος Ι/Ιο εκφράζει την διαπερατότητα Τ(αγγλ. transmitance) η οποία λαμβάνει τιμές 0-1. Αν η διαπερατότητα εκφραστεί επί τοις 100 (Τ%=100*Ι/Ιο)  τότε Α = 2-log (T%)

Βλ. και τη σχετική απεικόνιση του φασματοφωτομέτρου

Έτσι γνωρίζοντας το ε (βιβλιογραφικά) μπορούμε να υπολογίσουμε και τη συγκέντρωση του διαλύματος με μια απλή φασματοφωτομέτρηση. π.χ δίδεται ότι το ε της υδροξυμεθυλοφουρφουράλης στα 284nm είναι 16830. Αν πάρουμε μια μέτρηση απορρόφησης Α= 0,350 στη συνήθη κυψελίδα 1 cm αυτό σημαίνει ότι η συγκέντρωση της ουσίας είναι c=A/ε.l = 0,350/16830.1= 0,0000208 Μ. Δηλαδή 0,0000208 mole/l. Και επειδή το mole της συγκεκριμένης ουσίας είναι 126,1 <=>0,0262g/l =26,2mg/l

Πολλές φορές αντί του ε δίδεται το Ε1%. Αυτό είναι η απορρόφηση που έχει το διάλυμα σε συγκέντρωση ουσίας 1%. Με αντίστοιχους υπολογισμούς βρίσκεται η συγκέντρωση του διαλύματος.

Βέβαια, όπως όλοι οι νόμοι, έτσι και ο Lambert-Beer  δεν ισχύει πάντα, αλλά έχει αποκλίσεις αρνητικές ή θετικές.Οπότε καλό είναι, εφόσον είναι δυνατόν, να παρασκευάζεται καμπύλη απορροφήσεων/συγκέντρωσης από γνωστά διαλύματα. Έπειτα η μέτρηση του αγνώστου να ανάγεται σ' αυτήν, ώστε να ελαχιστοποιούνται τα σφάλματα. Ένας τέτοιος, αλγεβρικός όμως, τρόπος περιγράφεται στην παράγραφο "αρχή λειτουργίας φασματοφωτομετρίας"

Συσκευές εργαστηρίου
Φασματοσκοπία