MolekuláRNĚ genetická diagnostika deficitu c4 složky komplementu

MASARYKOVA UNIVERZITA
Přírodovědecká fakulta
Ústav experimentální biologie
Oddělení genetiky a molekulární biologie
MOLEKULÁRNĚ GENETICKÁ DIAGNOSTIKA DEFICITU C4 SLOŽKY KOMPLEMENTU
Brno 2007 Eva Matoulková
Poděkování
Ráda bych poděkovala MUDr. Tomáši Freibergerovi, PhD. za odborné vedení a cenné připomínky při zpracování této práce.
Obsah
Úvod .............................................................................................................................................. 4
1. Komplement .............................................................................................................................. 5
1.1. Aktivace komplementu ...................................................................................................... 5
2. Genetika komplementu ............................................................................................................. 9
2.1. Gen C4 ............................................................................................................................... 10
2.1.1. Polymorfismus genů C4A a C4B ................................................................................ 11
2.2. Jednotka RCCX ................................................................................................................. 15
2.2.1. Gen RP ........................................................................................................................ 15
2.2.2. Gen CYP21 ................................................................................................................. 15
2.2.3. Gen TNX ..................................................................................................................... 16
2.2.4. Varianty jednotek RCCX ........................................................................................... 16
2.3. Deficience C4 složky komplementu ................................................................................. 19
2.3.1. Deficience C4A .......................................................................................................... 20
2.3.2. Deficience C4B .......................................................................................................... 20
2.3.3. Úplná deficience C4A a C4B ..................................................................................... 21
2.3.4. Kombinovaná deficience C4 ...................................................................................... 21
2.3.5. Nemoci spojené s deficiencí C4 složky komplementu .............................................. 22
3. Metody detekce deficitu C4 složky komplementu ................................................................... 25
3.1. Stanovení deficitu C4 složky komplementu na úrovni proteinů ....................................... 25
3.1.1. Gelová elektroforéza .................................................................................................. 25
3.1.2. SDS-PAGE ................................................................................................................. 26
3.1.3. Westernový přenos ..................................................................................................... 26
3.2. Stanovení deficitu C4 složky komplementu na úrovni DNA ............................................ 27
3.2.1. Gelová elektroforéza doplněná Southernovým přenosem ......................................... 27
3.2.2. Metody PCR ............................................................................................................... 28
3.2.2.1. PCR-SSP ............................................................................................................. 28
3.2.2.2. PCR-SSP v kombinaci s kapilární gelovou elektroforézou ................................. 29
3.2.2.3. Kvantitativní PCR ............................................................................................... 30
3.2.2.4. Long-PCR ........................................................................................................... 31
Závěr ............................................................................................................................................. 33
Literatura ...................................................................................................................................... 34
Úvod
Komplement spolu s fagocytózou tvoří hlavní složku vrozeného imunitního systému a významně se podílí na mechanismu protilátkami zprostředkované imunity. Zajišťuje obranu proti patogenním mikroorganismům jejich lýzou nebo opsonizací, která usnadňuje jejich fagocytózu.
Komplement je tvořen proteiny, které mezi sebou kaskádovitě interagují. V případě nedostatku nebo úplné absence některého z těchto proteinů dochází k narušení procesu aktivace komplementu a ke vzniku patologických situací.
Jednou ze základních složek komplementové kaskády je složka C4. Detekce její snížené hladiny nebo úplné deficience v krevním séru může napomoci při stanovování diagnóz u pacientů s poruchou imunity, protože u některých imunitních onemocnění jsou odhalovány významně snížené hladiny tohoto proteinu v krevním séru.
Pro přesné objasnění úlohy této složky v imunitním systému se nejdříve budu zabývat obecnou aktivací komplementu a vzájemnou interakcí jednotlivých složek. Dále se zaměřím na genetickou lokalizaci jednotlivých komplementových komponent, přičemž se budu podrobně věnovat C4 složce komplementu. Odhalím její polymorfní strukturu a genetický podklad jejího deficitu. Také se zmíním o nemocech, jež jsou asociovány s deficiencí C4 složky komplementu. Nakonec se budu zabývat vlastními molekulárně genetickými metodami její detekce, a to jak na úrovni proteinů, tak i na úrovni DNA.
1. Komplement
Komplement je tvořen 30 proteiny nacházejícími se především v krevním séru, ale také na povrchu buněk. Jednotlivé proteiny mezi sebou kaskádovitě reagují a v konečné fázi tak zajišťují lýzu bakteriální buňky nebo zničení a odstranění cizorodé částice z organismu.
Komplement zahrnuje proteiny C1 až C9, které jsou číslované podle pozice v komplementové kaskádě (výjimku tvoří protein C4, který byl dříve pojmenován než zařazen do sledu komplementové kaskády), faktory B, D, H, I, properdin (P), C1-inhibitor (Walport, 2001), manózu vázající lektin (MBL; mannose binding lectin) a serinové proteázy asociované s MBL (MASP-1 a MASP-2; MBL-associated serine proteases) (Turner, 1996).
V iniciační fázi komplementové kaskády dochází u většiny protienů k jejich rozštěpení na 2 jednotky – na menší jednotku a uvolňovanou do prostředí a zajišťující např. chemotaxi dalších komplementových proteinů, a na větší jednotku b, která nasedá na povrch patogenního mikroorganismu nebo na jinou složku komplementu. Jednotka b spolu s dalšími aktivovanými jednotkami komplementu způsobuje proteolytické štěpení neaktivovaných složek komplementu a tím přenos signálu. Výjimku zde představuje protein C2, u kterého se z historických důvodů označuje větší jednotka a a menší jednotka b (Walport, 2001).
1. 1. Aktivace komplementu
Důležitým signálem pro spuštění komplementové kaskády jsou protilátky (imunoglobuliny), v menší míře i protein A. Imunoglobuliny se váží na povrchu patogena na příslušné antigeny, vytváří s nimi komplex antigen-protilátka (Ag-Ab; antigen-antibody) a spouští tak tzv. klasickou cestu aktivace komplementu. Tato cesta může být zahájena i prostřednictvím C-reaktivního proteinu rozpoznávajícího a vázajícího se na určité polysacharidy přítomné v buněčné stěně některých bakterií. Spuštění komplementové kaskády je zajišťováno i částicemi neimunoglobulinové povahy – polyanionty nebo některými bakteriemi a viry působícími jako aktivátory a urychlujícími tak spontánní aktivaci komplementu. V tomto případě hovoříme o tzv. alternativní cestě. Existuje ještě třetí typ aktivace komplementu, který je velmi podobný klasické cestě – tzv. lektinová cesta založená na rozpoznávání cukerných složek na povrchu bakterií, virů, hub nebo parazitických buněk (Petersen et al., 2001). Takto aktivované proteiny působí jako receptory pro další komplementové proteiny a vstupují pak do společné fáze kaskády – tzv. lytické cesty, která zajišťuje neutralizaci patogena jeho opsonizací nebo jeho lýzu.
Klasická cesta aktivace
Tato cesta je tvořená čtyřmi proteiny – C1, inhibitorem C1, C4 a C2 (Obr. 1). Protein C1 sestává z pěti molekul – jedné molekuly C1q, dvou molekul C1r a dvou molekul C1s (Lepow et al., 1963). Na protein C1 je nekovalentní vazbou navázán inhibitor C1. Při zvýšené hladině spouštěcího signálu (protilátky) v krevním séru dochází k vytvoření komplexu Ag-Ab na povrchu bakterie a k aktivaci prvního proteinu klasické cesty aktivace, a to disociací komplexu proteinů C1 a inhibitoru C1 na aktivní protein C1 a neaktivní inhibitor C1. Takto aktivovaný protein C1 se naváže přes C1q molekulu na komplex Ag-Ab a díky konformační změně dojde k odhalení tetrameru molekul C1r a C1s. C1s nejdříve navodí rozštěpení proteinu C4 na menší jednotku C4a uvolňovanou do prostředí a větší jednotku C4b, která se kovalentně váže na povrch rozpoznaného patogena. Následně umožní rozštěpení i proteinu C2 na menší jednotku C2b uvolňovanou do prostředí a větší jednotku C2a vázající se na protein C4b, s nímž vytváří komplex C4bC2a (C4b2a). Tento komplex vykazuje konvertázovou aktivitu k proteinu C3 – proto se nazývá C3 konvertáza, umožňuje rozštěpení proteinu C3 a tím navození lytické cesty aktivace (Walport, 2001).
Alternativní cesta aktivace
Oproti klasické cestě, která je vyvolána pouze přímou aktivací pomocí protilátek, alternativní cesta aktivace komplementu probíhá v organismu díky spontánní aktivaci proteinů C3 neustále (na nízké úrovni) a zajišťuje tak rychlou imunitní odpověď (Obr. 1).
Spontánní aktivace proteinů C3 v krevní plazmě je zajišťována spontánním začleněním molekuly vody do proteinu C3. Na tento komplex se za pomoci Mg2+ iontů naváže faktor B, který je následně štěpen faktorem D (přítomným v aktivní formě v krvi) na menší jednotku Ba uvolňovanou do prostředí a větší jednotku Bb zůstávající navázanou na komplex C3(H2O). Takto vytvořený komplex C3(H2O)Bb nemá hemolytickou aktivitu, ale působí jako konvertáza pro ostatní proteiny C3, které štěpí (stejně jako komplex C4b2a u klasické cesty aktivace) na jednotky C3a a C3b. Na jednotku C3b se opět váže faktor B, který je stejně jako v předchozím případě, rozštěpen faktorem D na Ba a Bb. Takto vzniklý komplex C3bBb umožňuje rychlé štěpení C3 proteinů na jednotky C3b a C3a a tím dochází k amplifikaci imunitní odpovědi. Tento komplex si musí zachovat konvertázovou aktivitu k proteinu C3, která je nezbytná k zahájení lytické cesty aktivace. To zabezpečuje properdin, který zabraňuje degradaci komplexu C3Bb faktorem I (Walport, 2001).
Lektinová cesta aktivace
Lektinová cesta aktivace se velmi podobá klasické cestě aktivace (Obr. 1). Je zajišťována tzv. MBL-MASP komplexem. Ten je svou strukturou velmi podobný proteinu C1, který se uplatňuje při klasické cestě aktivace. Molekula MBL je stejně jako molekula C1 tvořena šesti rameny, na kterých je navázán dimer MASP zodpovídající za enzymatickou aktivitu tohoto komplexu. MBL má stejnou funkci jako C1q – váže se na povrch patogena, kde za přítomnosti Ca2+ iontů rozeznává cukerné složky, MASP-1 plní stejnou funkci jako C1r a MASP-2, stejně jako C1s, štěpí protein C4 a C2 za vzniku komplexu C4b2a – konvertázy C3 (Wallis and Dodd, 2000).
C3 konvertáza, ať už tvořená komplexem C4b2a nebo C3bBbP, zajišťuje štěpení C3 proteinu na jednotky C3a a C3b. C3a je uvolňována do prostředí, kde působí jako anafylatoxin a C3b jednotka se váže na povrch patogena, kde působí buď jako opsonin (váže se na C3 receptory fagocytů a usnadňuje tak fagocytózu), nebo vytváří komplex s C4b2a (C4b2a3b) nebo C3bBb ((C3b)2Bb) a vykazuje tak konvertázovou aktivitu k proteinu C5, který štěpí na menší jednotku C5a (mající chemotaktické a anafylaktické účinky) a větší jednotku C5b, která vstupuje do lytické cesty aktivace komplementu vedoucí k lýze patogenního mikroorganismu (Walport, 2001).
Lytická cesta aktivace komplementu – vytvoření MAC
Při této cestě aktivace komplementu již nedochází k proteolytické aktivitě jednotlivých složek komplementu, ale je vytvořen tzv. membránu atakující komplex (MAC; membrane-attack complex), který způsobí lýzu patogenní buňky (Obr. 1). Tento komplex je tvořený proteiny C5b, C6, C7, C8 a C9.
Do lytické cesty tedy vstupuje jednotka C5b, na kterou se naváže protein C6. Díky konformační změně je umožněno navázání proteinu C7 a proteinu C8. Ten zajišťuje penetraci buněčné membrány a nakonec dochází k navázání 10 až 16 proteinů C9, které vytváří pór v buněčné membráně patogena a navozují tak jeho lýzu (Esser, 1994).
Obr. 1: Aktivace komplementové kaskády pomocí klasické (A), lektinové (B) nebo alternativní (C) cesty vyúsťující v lytickou fázi komplementové cesty (D) vedoucí k vytvoření membránu atakujícího komplexu (Favoreel et al., 2003, upraveno).
2. Genetika komplementu
Jednotlivé složky komplementu jsou kódované jedním nebo i více lokusy, které mohou ležet na jednom nebo více chromozomech (Tab. 1). Jejich geny jsou lokalizované na 11 chromozomech – 1, 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 19 a X (Lawson and Reid, 2000).
Jedním lokusem jsou kódované např. proteiny C2 (Carroll et al., 1984), C6, C7 (Hobart et al., 1993), dvěma lokusy ležícími na jednom chromozomu je kódován protein C4 (Francke and Pellegrino, 1977). Dvěma lokusy ležícími na různých chromozomech je kódován protein C8 (Alper et al., 1983), pěti lokusy lokalizovanými na dvou chromozomech je kódovaný protein C1 (Kusumoto et al., 1988, Sellar et al., 1991).
Jednotlivé geny složek komplementu se vyznačují různým stupněm polymorfismu. Nejvíce polymorfní je gen C4, u kterého bylo do současnosti objeveno 41 alel (Mauff et al., 1998). Vysoce polymorfní je i gen pro faktor B (Bf), který se v populaci vyskytuje v 10 variantách (Horiuchi et al., 2002). Čtyři polymorfní alely byly prokázány u genu C2 (Raum et al., 1979a) a 2 alely u genu C8 (Raum et al., 1979b). U některých genů (C2, C4 a Bf) byly popsány nulové alely, které způsobují nedostatečnou tvorbu příslušného proteinu (Hartmann et al., 1997).
Některé geny ve své nukleotidové sekvenci navzájem vykazují částečnou homologii. Geny C1r a C1s vykazují 40% homologii s geny MASP-1 a MASP-2 (Gal and Ambrus, 2001), nižší homologii navzájem vykazují i geny komplexu MAC. Gen C7 je z 28 % až 30 % homologní s genem C8 a z 23 % homologní s genem C9 (DiScipio et al., 1988).
Tab. 1. Seznam lokusů složek komplementu (Lawson and Reid, 2000, upraveno).
složka komplementu
|
lokalizace
|
inhibitor C1
C1q
C1r
C1s
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
C9
faktor B
faktor D
faktor H
faktor I
MASP-1
MASP-2
MBL
properdin
|
11q11-q13.1
1p36.3-p34.1
12p13
12p13
6p21.3
19
6p21.3
9q34.1
5p13
5p13
1p32, 9q34
5p13
6p21.3
19pTel
1q32
4q25
3q27-q28
neznámá
10q11.2-q21
Xp11.4-p11.23
|
2. 1. Gen C4
Gen C4 kódující komplementový protein C4 se v sekvenci DNA nachází nejčastěji v podobě dvou za sebou umístěných lokusů C4A a C4B, které kódují dva isotypy proteinu C4 – isotyp C4A a C4B. Oba lokusy jsou lokalizované na krátkém rameni chromozomu 6 (6p21.3) v oblasti hlavního histokompatibilního komplexu III (MHC III – major histocompatibility complex) (Francke and Pellegrino, 1977) mezi lokusy HLA-B a HLA-DR. Spolu s těmito geny se v této oblasti ještě nachází gen pro faktor B a C2 (Carroll et al., 1984).
|