Amiloid -peptid által indukált komplement aktiváció gátlása kis molekulatömegű szintetikus vegyületekkel in vitro

A TÉZISEK ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK Sárvári M, Vágó I, Wéber C, Nagy J, Gál P, Mák M, Kósa JP, Závodszky P, Pázmány TUrbányi Z, Forrai E, Sárvári M, Likó I, Illés J, Pázmány TGál P, Sárvári M, Szilágyi K, Závodszky P and Schumaker VLuo C, Thielens N, Gagnon P, Gál P, Sárvári M, Tseng Y, Tosi M, Závodszky P, Arlaud G and Schumaker VCseh S, Gál P, Sárvári M, Dobó J, Lőrincz Z, Schumaker V and Závodszky PSárvári M, Vágó I, Wéber C, Nagy J, Gál P, Mák M, Kósa J, Závodszky P, Pázmány TKurkó D, Boros A, Dezső P, Urbányi Z, Sárvári M, Nagy J, Szombathelyi Z, Szendrei GZávodszky P, Vonderviszt F, Lakatos S, Kilár F, Simon I, Török J, Sziva D and Sárvári M |
Amiloid -peptid által indukált komplement aktiváció gátlása kis molekulatömegű szintetikus vegyületekkel in vitro
|
Sana | 31.12.2019 | Hajmi | 73,5 Kb. | | #7092 |
Bu sahifa navigatsiya:
- A TÉZISEK ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK Sárvári M, Vágó I, Wéber C, Nagy J, Gál P, Mák M, Kósa JP, Závodszky P, Pázmány T
- Urbányi Z, Forrai E, Sárvári M, Likó I, Illés J, Pázmány T
- Gál P, Sárvári M, Szilágyi K, Závodszky P and Schumaker V
- Luo C, Thielens N, Gagnon P, Gál P, Sárvári M, Tseng Y, Tosi M, Závodszky P, Arlaud G and Schumaker V
- Cseh S, Gál P, Sárvári M, Dobó J, Lőrincz Z, Schumaker V and Závodszky P
- Sárvári M, Vágó I, Wéber C, Nagy J, Gál P, Mák M, Kósa J, Závodszky P, Pázmány T
- Kurkó D, Boros A, Dezső P, Urbányi Z, Sárvári M, Nagy J, Szombathelyi Z, Szendrei G
- Závodszky P, Vonderviszt F, Lakatos S, Kilár F, Simon I, Török J, Sziva D and Sárvári M
Amiloid -peptid által indukált komplement aktiváció gátlása
kis molekulatömegű szintetikus vegyületekkel in vitro
DOKTORI ÉRTEKEZÉS TÉZISEI
Készítette: Dr. Sárvári Miklós
Richter Gedeon Vegyészeti Gyár Nyrt
Farmakológiai és Gyógyszerbiztonsági
Kutatási Főosztály
Témavezető: Dr. Sass Miklós egyetemi tanár
Eötvös Lóránd Tudományegyetem
Természettudományi Kar
Anatómiai, Sejt- és Fejlődésbiológiai Tanszék
BIOLÓGIAI DOKTORI ISKOLA
Vezető: Dr. Erdei Anna, akadémikus
MOLEKULÁRIS SEJT- ÉS NEUROBIOLÓGIAI DOKTORI PROGRAM
Vezető: Dr. Sass Miklós, tanszékvezető egyetemi tanár
2007.
BEVEZETÉS
Az utóbbi évek preklinikai és klinikai kutatási eredményei szerint az agy neuroimmunológiai folyamatai fontos szerepet játszanak a neurodegeneratív betegségek kialakulásában. Ezekben a folyamatokban a komplementrendszer, az asztroglia és mikroglia sejtek központi szerepet játszanak. A krónikus komplement aktiváció jelenléte az agyban az időskori demenciák egyik közös jellemzője. Több, az egyes betegségekre jellemző, fehérje természetű komplement aktivátort azonosítottak. A komplement első komponensének q alegysége (C1q) köt az amiloid -peptidhez, amely oki kapcsolatba hozható az Alzheimer kór kialakulásával. A kölcsönhatás a komplement klasszikus útjának aktivációját eredményezi. Az aktiváció során felszabaduló komplement fragmentumok a plakkképződés helyére toborozzák a mikroglia és asztroglia sejteket. A glia sejtek gyulladásserkentő molekulákat, köztük komplement fehérjé-ket termelnek, amelyek az aggregátum eltávolítását célozzák. A mikroglia sejtek azonban nem tudják bekebelezni a képződött amiloid plakkokat, amelyek így állandó komplement aktivációs forrásokká válnak.
A komplement aktiváció toxikus hatásai ellen szolubilis és membránkötött fehérjék védik a szervezet saját sejtjeit. A krónikus komplement aktiváció az agyban azért különösen veszé-lyes, mert egyes agyterületeken a komplement regulátor fehérjék alacsony szintje védtelenné teszi az idegsejteket a membránkárosító komplex kialakulásával szemben. Kutatásaim az aktiváció útvonalának felderítésére, és szelektív komplement gátlók kifejlesztésére irányultak.
CÉLKITŰZÉSEK
Munkám során az alábbi feladatokat és kérdések vizsgálatát tűztük ki:
Ismert, hogy az amiloid -peptid aktiválja a komplement rendszert in vitro. Az aktiváció funkcionális hatásainak vizsgálatára egy in vitro sejtalapú rendszer kidolgozását tűztük ki.
Az amiloid -peptid által kiváltott komplement aktivációhoz irodalmi adatok alapján mind a klasszikus, mind az alternatív út hozzájárul. Nem jelent meg azonban összefoglaló vizsgálat arról, hogy melyik útvonal játssza a főszerepet az aktiváció során. Ezt a kérdést egy endogén komplement szabályozó fehérje, a C1 inhibítor (C1-Inh) hatásának vizsgálatával kívántuk tanulmányozni.
A központi idegrendszerben található komplement komponensek nagyrészét az agy szöveti makrofágja, a mikroglia termeli. Különböző komplement gének kifejeződését vizsgáltuk kezeletlen és lipopoliszacharid kezelt mikroglia sejtekben in vitro.
Mára egyetértés alakult ki abban, hogy az amiloid -peptid oki szerepet játszik az Alzheimer kór kialakulásában. Vizsgálni kívántuk, hogy a peptid befolyásolja-e korai komplement gének átíródását mikroglia sejtekben in vitro.
Az aktivációért felelős útvonal és a mikrogliális expresszió ismeretében egy farmakológiai beavatkozásra alkalmas támadáspont kiválasztása, amelynek révén szelektíven gátolható legyen a komplement aktiváció.
A szakirodalomban kevés komplement inhibítort írtak le, klinikán pedig nincs szelektív, kis molekulatömegű komplementgátló. Ezért célul tűztük ki ismert vegyületek tanulmányozását a kiválasztott célfehérje (target) funkciójára.
A Társaság tulajdonában levő vegyülettár mérete és szerkezeti diverzitása révén alkalmas lehet új kémiai szerkezetek azonosítására. Egy nagy áteresztőképességű módszer beállítása és validálása után szűrjük a vegyülettárat. Optimalizálás után vezérmolekulát választunk ki.
A kiválasztott vegyületet hatékonysági és szelektivitási vizsgálatokkal jellemezzük.
A vezérmolekula egy molekula részlethez kötődve fejti ki a hatását. Tanulmányozni kívánjuk, hogy a vegyület melyik fehérje molekulához köt.
A vezérmolekula szelektíven gátolja a komplement aktiváció valamelyik lépését. In vitro sejtalapú tesztben vizsgálni kívánjuk, hogy a molekula felfüggeszti-e a komple-ment toxikus hatását az idegsejtekre.
ALKALMAZOTT MÓDSZEREK
Sejttenyészetek és jellemzésük
Primer egér mikroglia tenyészeteket újszülött NMRI egerek agyából készítettünk egy általánosan használt módszert követve. CD18 festés alapján a sejtek több, mint 95%-át találtuk mikrogliának. Primer patkány hippokampális sejttenyészeteket újszülött Wistar patkányok agyából készítettünk egy korábban kidolgozott eljárás alapján.
RNS izolálás, fordított (reverz) transzkripció
A sejtekből totál RNS-t izoláltunk a Stratagene RNS izoláló kitjével a gyártó által javasolt recept alapján. A minták integritását agaróz gélben vizsgáltuk etidium-bromid festést követően. Az RNS koncentrációkat 260nm-en mért abszorpcióval határoztuk meg. Azonos mennyiségű RNS mintákat fordítottunk át cDNS-sé RNáz inhibítor jelenlétében MuLV reverz transzkriptáz (Stratagene) enzimmel.
Polimeráz láncreakció
A polimeráz láncreakciót 50l térfogatban, 1 egység Tag DNS polimeráz (Stratagene) jelenlétében végeztük Hybaid Thermocycler készülékben. A reakciót általánosan használt paraméterekkel (94oC 30 másodperc, 60oC 30 másodperc, 72oC 1 perc), 25 ciklussal futtatva egy 10 perces extenziós idő után fejeztük be.
Szilárd fázisú kötési vizsgálat
A mikrotiter lemezek borítását és a C1q kötést egy közölt leírás módosítása alapján végeztük. A C1q kötést szobahőmérsékleten végeztük 60 percig a jelzett koncentrációban, majd a kötött C1q mennyiségét standard ELISA módszerrel határoztuk meg. A C1q-t anti-humán C1q anti-testtel reagáltattuk, majd biotin-jelzett második antitestet, és Extravidin-HRPO-t használtunk. Az enzim mennyiségét TMB szubsztrát hasítása alapján határoztuk meg. A mérést Tecan Spectra fotométeren végeztük 450 nm-en. Az antitest-C1q kötési vizsgálatban a lemezt 10 mg/ml ovalbuminnal borítottuk 4 oC-on. Az antigén fölösleg eltávolítása után immunkomp-lexet képeztünk anti-ovalbumin 1:400 hígítású oldatával. A C1q kötést és a mennyiségi meghatározást a fent leírtak szerint végeztük.
Komplement toxicitási teszt
A komplement-függő A toxicitás mérést egy közölt módszert módosítva végeztük. Egy hét-tel lemezelés után a hippokampális sejtek morfológiáját ellenőriztük. Komplement aktivátor-ként A1-40 peptidet, kontrollként a fordított A40-1 peptidet használtuk. A peptideket használat előtt DMSO-ban oldottuk, majd tápfolyadékban hígítottuk a kívánt koncentrációra. Friss, normál humán szérumot használtunk komplement forrásként. 25l A törzsoldat és 15l normál humán szérum került minden kamrába, ami 40M A és 3% szérum koncentrá-ciót eredményezett. A toxicitást a tápfolyadékban mérhető LDH aktivitás alapján határoztuk meg Cytotoxicity Detection kittel (Roche Diagnostics).
Tömegspektrometria
A tömeg spektrumokat Finnigan MAT 95SQ tandem spektrométeren elektrospray ionizációs forrást használva vettük fel (Skribanek és mtsai, 2001). A vizsgálatban N2 védő-gázt használtunk, 3kV spray feszültség és 70V feszültség mellett. Az anyagok oldására 2mM CH3CO2NH4 – 0,5% ecetsav (v/v) 1:1 elegyét használtuk. 20 l mintát injektáltunk az eluens áramba, áramlási sebesség 50 l.
TÉZISEK
Kutatásaim a komplement központi idegrendszerben bekövetkező aktivációjának és következ-ményeinek felderítésére irányultak.
Ismert, hogy az amiloid -peptid (A) aktiválja a komplement rendszert in vitro. Az aktiváció funkcionális hatásainak vizsgálatára egy in vitro sejtalapú rendszer kidolgo-zását tűztük ki. Megállapítottuk, hogy hippokampális sejtek érzékenyek az A által kiváltott komplement aktiváció litikus hatásaira. Ezt a megfigyelést felhasználva és egy közölt módszer alapján kidolgoztunk egy sejtalapú tesztet, ami alkalmasnak bizo-nyult arra, hogy az A által indukált komplement aktiváció citotoxikus hatásait kimutassuk in vitro (Sárvári és mtsai, 2003).
Az A által kiváltott komplement aktivációhoz irodalmi adatok alapján mind a klasz-szikus, mind az alternatív út hozzájárul. Nem jelent meg azonban összehasonlító vizs-gálat arról, hogy melyik útvonal játssza a főszerepet az aktiváció során. Ezt a kérdést a C1r és C1s proteázokat gátló C1-Inh hatásának vizsgálatával tanulmányoztuk. Megállapítottuk, hogy a klasszikus aktivációs út endogén szabályozó molekulája, a C1-Inh védelmet biztosított hippokampális sejtek számára az A-indukálta komple-ment citotoxikus hatásaival szemben in vitro (Sárvári és mtsai, 2003). Eszerint az aktiváció döntően a klasszikus útvonalon keresztül történik.
A központi idegrendszerben több sejttípusról is kimutatták, hogy komplement fehérjé-ket termelnek. A komplement komponensek jelentős részét az agy szöveti makrofágja, a mikroglia termeli. Irodalmi adatokkal összhangban kimutattuk, hogy mikroglia sejtekben konstitutívan kifejeződnek a komplement első komponensének láncait kódoló gének in vitro. Megállapítottuk, hogy a mikroglia felszínén több komplement receptor, C1qR, CR3 és C5aR található. Ezek az eredmények arra utaltak, hogy a mikroglia komplement receptorai révén érzékeli az aktiváció során felszabaduló aktivációs fragmentumokat, és a sejtek az aktivációt kiváltó anyag köré sereglenek. Ebből következik, hogy a komplement aktiváció és a mikroglia sejtek központi szerepet játszanak a központi idegrendszer gyulladásos folyamataiban.
Mára egyetértés alakult ki abban, hogy az A oki szerepet játszik az Alzheimer kór kialakulásában. Tanulmányoztuk, hogy a peptid befolyásolja-e a C1q és a C1-Inh génjeinek átíródását mikroglia sejtekben in vitro. Megállapítottuk, hogy az A koncentráció-függő módon növeli a C1q génjeinek átíródását, míg csökkenti a C1-Inh transzkripcióját (Sárvári és Pázmány, nem közölt eredmény). Ez az eredmény megerősítette azt az elképzelésünket, hogy az amiloid felszabadulás és lerakódás környezetében aktiválódik a komplementrendszer, ám az aktiváció és szabályozó mechanizmusok egyensúlya felborul és az aktiváció krónikussá válik.
Az aktivációért felelős útvonal és a mikrogliális expresszió ismeretében a komplement első komponensének q alegységét farmakológiai beavatkozásra alkalmas célpontnak választottuk (Sárvári és Pázmány, nem közölt eredmény). Irodalmi és saját eredmé-nyeink alapján valószínűsítettük, hogy a C1q A kötőhelyének gátlása révén a komplement aktiváció szelektíven gátolható.
A szakirodalomban kevés komplement inhibítort írtak le, klinikán pedig nincs szelek-tív, kis molekulatömegű komplementgátló. Ezért először egy glikózaminoglikán, majd egy kereskedelmi úton beszerezhető gyűjtemény vegyületeinek hatását tanulmányoz-tuk a kiválasztott célfehérje, a C1q funkciójára. Megállapítottuk, hogy a kiválasztott glikózaminoglikán és a gyűjtemény néhány (7) vegyülete gátolta a C1q kötést A peptidhez (Urbányi és mtsai, 2005).
A Társaság tulajdonában levő vegyülettár mérete és szerkezeti diverzitása révén alkalmas új kémiai szerkezetek azonosítására. Egy nagy áteresztőképességű módszer beállítása és validálása után szűrtük a vegyülettárat. Kémiai optimalizálás után vezér-molekulát választunk ki (Sárvári és mtsai, 2003).
A kiválasztott vezérmolekulát hatékonysági és szelektivitási vizsgálatokkal jellemez-tük. Megállapítottuk, hogy a vegyület gátolta a C1q kötést A peptidhez és más nem-immunglobulin aktivátorokhoz, de nem gátolta a kötést immunglobulinokhoz (Sárvári és mtsai, 2003). Ezek az eredmények bizonyították, hogy a C1q A kötőhelye szelektíven gátolható.
ESI-MS vizsgálatokkal kizártuk, hogy a vezérmolekula köt az A peptidhez. A kísérlet eredménye megerősítette, hogy a vegyület a C1q A kötőhelyén keresztül fejti ki hatását (Sárvári és mtsai, 2003).
A vezérmolekula szelektíven gátolta a komplement aktiváció első lépését. In vitro sejtalapú tesztben vizsgáltuk, hogy a molekula felfüggeszti-e a komplement toxikus hatását az idegsejtekre. Megállapítottuk, hogy a vezérmolekula az aktiváció első lépését gátolva megvédte a hippokampális sejteket az A-indukálta komplement aktiváció citotoxikus hatásaival szemben (Sárvári és mtsai, 2003).
KÖVETKEZTETÉSEK
In vitro vizsgálatok arra utaltak, hogy a komplementrendszer klasszikus és alternatív útja is aktiválódik amiloid -peptid (A) hatására. A klasszikus útvonal aktivációjában a C1 szerepe kulcsfontosságú, amit bizonyít, hogy az A aktiválja a tisztított C1q, C1r és C1s alegységekből képzett C1 komplexet. Igazoltuk, hogy a C1r és C1s proteázok endogén szabályozója, a C1-Inh, megvédte a hippokampális sejteket a komplement-függő A toxicitás ellen in vitro. Ez az eredmény bizonyította, hogy az A döntően C1q-n keresztül aktiválja a komplementrendszert (Sárvári és mtsai, 2003).
Ennek a megfigyelésnek az alapján választottuk farmakológiai beavatkozás molekulá-ris célpontjának a C1q molekulát. Először olyan ismert vegyületeket azonosítottunk, amelyek gátolták a C1q kötést A peptidhez. Ilyen molekulák voltak egy állati eredetű glikózaminoglikán (Urbányi és mtsai, 2005) és az RBI vegyület gyűjtemény hét farmakológiailag aktív vegyülete, köztük a tamoxifen. Ezek a vegyületek nem befo-lyásolták a C1q kötést immunglobulinok Fc régiójához. Az eredmény azt mutatta, hogy a C1q molekulán található A kötőhely szelektíven gátolható kis molekula-tömegű szintetikus vegyületekkel..
A Társaság vegyülettárából 308 olyan vegyületet azonosítottunk, amelyek gátolták a C1q kötést A peptidhez (Sárvári, Kósa, Pázmány, nem közölt eredmény). A 308 vegyület közül 301 nem befolyásolta a C1q kötést immunkomplexben lévő antitestek Fc régiójához. A 308 vegyület közül 56 gátolta a C1q kötést C-reaktív proteinhez és 35 mielin bázikus fehérjéhez (Sárvári és Pázmány, nem közölt eredmény). Az eredmény megerősítette, hogy a C1q molekulán található A kötőhely szelektíven gátolható.
Kémiai optimalizálással vezérmolekulát állítottunk elő. A vegyület mikromoláris koncentráció alatt gátolta a C1q kötést A peptidhez, C-reaktív proteinhez (CRP) és mielin bázikus fehérjéhez (Sárvári és mtsai, 2003). Tehát a vezérmolekula gátolta a C1q kötést több nem-immunglobulin C1q aktivátorhoz is.
Az irodalomban ellentmondó adatok találhatóak a nem-immunglobulin C1q aktivátorok kötőhelyeire vonatkozóan. Ezért összehasonlítottuk a vezérmolekula és a más laboratóriumok által vizsgált A14-26 peptid gátlási állandóit (IC50). A két IC50 egyezősége arra utalt, hogy a CRP kötőhelye a C1q molekulán az A lánc 14-26 szakaszán található. A két IC50 érték A esetén két nagyságrend eltérést mutatott. Ez alapján valószínű, hogy az A kötőhely a C1q molekulán nem az A14-26 régióban található.
A vezérmolekula szelektivitását vizsgálva megállapítottuk, hogy az nem gátolta a C1q kötést immunglobulin G molekulákhoz, és nem gátolta a szérum amiloid P kötést A peptidhez (Sárvári és mtsai, 2003).
ESI-MS kísérletekkel igazoltuk, hogy a vezérmolekula nem kötődött A peptidhez. Ezért a vegyület valószínűleg a C1q A kötőhelyére köt (Sárvári és mtsai, 2003).
A vezérmolekula a beállított sejtalapú vizsgálatban C1q-n keresztül gátolta a komple-mentrendszer aktivációját és megvédte a hippokampális sejteket a komplement-függő A toxicitás ellen in vitro (Sárvári és mtsai, 2003).
A TÉZISEK ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK
Sárvári M, Vágó I, Wéber C, Nagy J, Gál P, Mák M, Kósa JP, Závodszky P, Pázmány T (2003) Inhibition of C1q--amyloid binding protects hippocampal cells against complement mediated toxicity.
Journal of Neuroimmunology 137: 12-18
Urbányi Z, Forrai E, Sárvári M, Likó I, Illés J, Pázmány T (2005) Glycosaminoglycans inhibit neurodegenerative effects of serum amyloid P component in vitro.
Neurochemistry International 46: 471-477
PUBLIKÁCIÓS JEGYZÉK
Referált tudományos folyóiratban megjelent dolgozatok
Vonderviszt F, Lakatos S, Gál P, Sárvári M, Závodszky P (1987) A molten globule-like unfolding intermediate of a four domains protein, the Fc fragment of the IgG molecule
Biochemical and Biophysical Research Communications 148: 92-98
Gál P, Sárvári M, Szilágyi K, Závodszky P and Schumaker V (1989) Expression of a hemolytically active human complement component C1r proenzyme in insect cells using a baculovirus vector
Complement and Inflammation 6: 433-441
Sárvári M, Csikós G, Sass M, Gál P, Schumaker V, Závodszky P (1990) Ecdysteroids increase the yield of recombinant protein produced in baculovirus insect cell expression system
Biochemical and Biophysical Research Communications 167: 1154-1161
Luo C, Thielens N, Gagnon P, Gál P, Sárvári M, Tseng Y, Tosi M, Závodszky P, Arlaud G and Schumaker V (1992) Recombinant human complement subcomponent C1s lacking beta-hydroxy-asparagine, sialic acid, and one of its two carbohydrate chains still reassembles with C1q and C1r to form a functional C1 complex
Biochemistry 31: 4254-4261
Cseh S, Gál P, Sárvári M, Dobó J, Lőrincz Z, Schumaker V and Závodszky P (1996)
Functional effects of domain deletions in a multidomain serine protease, C1r
Molecular Immunology 33: 351-359
Sárvári M, Závodszky P, Molnár K, Lőw P and Sass M (1996) Baculovirus-mediated trans-epithelial transport of proteins in infected caterpillars
Journal of General Virology 78: 953-963
Sárvári M, Vágó I, Wéber C, Nagy J, Gál P, Mák M, Kósa J, Závodszky P, Pázmány T (2003) Inhibition of C1q-beta-amyloid binding protects hippocampal cells against complement mediated toxicity
Journal of Neuroimmunology 137: 12-18
Urbányi Z, Forrai E, Sárvári M, Likó I, Illés J, Pázmány T (2005) Glycosaminoglycans inhibit
neurodegenerative effects of serum amyloid P component in vitro
Neurochemistry International 46: 471-477
Kurkó D, Boros A, Dezső P, Urbányi Z, Sárvári M, Nagy J, Szombathelyi Z, Szendrei G (2006) Flow cytometry-based method to analyse the change in tau phosphorylation in a hGSK-3beta and htau over-expressing EcR-293 cell line
Neurochemistry International 48: 374-382
Önálló tudományos könyv részlete
Závodszky P, Vonderviszt F, Lakatos S, Kilár F, Simon I, Török J, Sziva D and Sárvári M (1985) Domain structure and signal transduction within antibody molecules.
In: Multidomain proteins (Eds: Patthy L and Friedrich P), pp. 157-174. Akadémiai Kiadó, Budapest
|
| |