Rekombinant DNK - 1-Ma’ruza: Gen muhandisligi faniga kirish

Rekombinant DNK avtonom replikasiya bo‘lishi uchun javob beradigan DNK bo‘lagi vektor molekulalari deyiladi. Vektor molekulalar o‘z vazifasiga ko‘ra ikki tipga bo‘linadi. Birinchisi avtopom replikasiya bo‘luvchi vektorlar. Ikkinchisi xromosomaga integrasiya bo‘luvchi vektorlar. Vektor molekulalar gen muxandisligi biotexnologiyasida genlarni klonlashda va transformasiya qilishda asosiy ish quroli bo‘lib xizmat qiladi.
Vektor molskulalari vazifasini fag DNK lari, plazmidalar va o‘simliklarni xloroplast hamda mitoxondriya DNK lari o‘tashi mumkin. Xo‘jalik ahamiyati qimmatli bo‘lgan genlarni ajratish uchun gen bibliotekasi tuziladi. Xromosomal DNK asosida gen bibliotekasini tuzish quyidagicha amalga oshiriladi: DNK va vektor molekulalar restriktaza fermenti yordamida qirqiladi va ma’lum sharoitda reassosiasiya qilinadi. Nukleotidlar orasida ulanmayqolgan bo‘shliq DNK-ligaza fermenti yordamida o‘zaro biriktiriladi. Olingan rekombinant DNK bakteriya hujayrasiga trangformasiya qilinadi. Xromosomal DNQda mavjud genlarni to‘la klonlash uchun DNK o‘lchamiga va olingan klonlarni soniga e’tibor berish kerak. Bu ko‘rsatgich quyidagi formula yordamida xisoblapadi,
1p (1-)
1p (1-x/u)
bunda:
x-klonlanayotgan DNK o‘lchami), u-gaploid genomning o‘lchzmi va r=0,99 ga teng bo‘lsa 99 ga teng xromosomal DNKning unikal qismi klonlanadi.
Genlarni klonlashda ko‘pincha kDNK bibliotekasini tuzish maqsadga muvofiqdir. Bu holda maxsus poli (Y) va oligo (dT) kolonkalari yordamida uchlarida poli (A) nukleotidlar ketma-ketligini saqlovchi iRNK tRNK va rRNK dan ajratib olinadi. Olingan iRNK molekulasi oligo (dT) nukleotidlari bilan aralashtirilib reassosiasiya qilinadi. Bunda iRNK molekulasiningpoli (A)uchida dA va dT qo‘sh zanjirli segment hosil bo‘ladi. Ushbu ikki zanjirli segmentning oligo (dT) uchi kDNK sintezini amalga oshiruvchi revertaza fermenti uchun praymer (kDNK sintezining boshlanish nuqtasi) vazifasini o‘taydi.
Sintez qilingan kDNK molekulasi qisqa uchli ikki zanjirli struktura bilan tugallanadi. kDNK sintezida matrisa vazifasini o‘taganiRNKmolekulasi NaON bilan parchalanadi natajada qisqa ikkizanjirli va to‘liq iRNK molekulasiga komplementar bo‘lgan birzanjirli kDNK molekulasi hosil bo‘ladi. Hosil bo‘lganqisqa ikki zanjirli struktura kDNK ning ikkinchi zanjirini sintez qilishda praymer vazifasini o‘taydi. DNK-polimeraza I !fermenti yordamida kDNKning ikkinchi zanjiri sintez qilinadi. Hosil bo‘lgan kDNKning bir zanjirli qismi SI-nukleaza fermenti yordamida parchalanadi va ikki zanjirli kDNK molekulasi hosil bo‘ladi. Shu yo‘sinda hosil bo‘lgan kDNK molekulasi vektor molskualariga ulangan holda klonlanadi.
Har ikki usul bilan yaratilgan genom bibliotekasidan individual genlarni ajratib olish quyidagicha amalga oshiriladi rekombimant plazmida denaturasiya qilinadi (100 °C haroratda 5min.,0,2n NaON eritmasida 15 min), bir zanjirli DNK molekulasi stabil qo‘zg‘almaydigan holatda turishi uchun nitrosellyuloza filtriga biriktiriladi. Olingan filtr ATF nukleotidi bilannishonlangan iRNK molekulasi bilan gibridizasiya qilinadi. Molekulyar gibridizasiya jarayonida filtrga birikkan rekombinantDNK molekulasiga komplementarlik qonuniyati asosida nishonlangan iRNK molekulalari birikadi.
Hosil bo‘lgan gibrid DNK molekulasi denaturasiya qilinibnishonlangan iRNK molekulasi (elyusiya yordamida) ajratib olinadi. Olingan iRNK molekulasi hujayrasiz oqsil sintez qilish tizimida tekshirib ko‘riladi. Hosil bo‘lgan oqsil molekulasining identifikasiya qilish yo‘li bilan individual genlarni ajratib olishga omalgaoshiriladi.
Eco.R1 yopishqoq uchli fragmentlar hosil kilishi ma’lum bo‘lgandan keyin har xil DNK fragmentlarini sistematik klonlash usuli topildi. Uning asosiga Eco.R1 -fragmentli DNK molekulasini xalkali plazmida DNK kiritish yotadi.
Bu gibrid plazmida hosil bo‘lishiga olib keladi, uni bakteriya hujayrasiga kiritish mumkin. Bunda har bir hujayra uzida yot DNK fragmentini biriktirgan plazmidagi kiritishi mumkin. Birinchi shunday ekperimentlarda E.colining rSC101 plazmidalidan foydalanildi, chunki u Eco.R1 parchalanishini bitta saytiga ega va demak u restriktaza ta’sirida chizikli molekulaga aylanadi. Bunday DNK xudda shunday yopishkok uchli yot DNK bilan aralashtirilganda yangi gibrid plazmida hosil bo‘ladi. Ularning har birida xech bo‘lmasa yot DNK fragmenti bo‘lib, plazmidaning Eco.R1 saytiga birikib olgan bo‘ladi.
Izlanuvchi vektor xususiyatini hujayra xususiyatlariga moslashtirishi zarur. Vektorda genetik marker bo‘lib, shunga karab seleksiya utkazish mumkin. Prokariot sistemalarda kupincha bu har xil antibiotiklar - ampisilin, tetrasiklin v.h ga chidamlilik markeri mavjud. Hujayin-hujayrasi rekombinant DNK molekulasi funksiyalashning uchun eng birinchi muxitdir. Xozirgi vaqtda kupincha E.coli, B.subtilis, achitqi va boshqa mikroorganizmlar qo‘llaniladi.
Rekombinant DNK hujayraga kiritilgandan keyin (transformasiya) molekulyar klonlashtirish, ya’ni hosil qilini rekombinant DNK avlodini olish boshlanadi. Buning uchun transformasiyalangan hujayralar o‘sishi uchun sharoit yaratiladi. Masalan: muxitga u yoki bu antibiotik qo‘shiladi. Oxirida absolyut gomogen shtamm olinadi, undan quyilgan maqsadi karib klonlangan gen yoki uning mahsuloti ajratib olinadi.
Plazmidli vektor pBR322 2 xil genetik markerni uz ichiga oladi ampisillin (AR) va tetrasiklin(Ts) antibiotiklariga rezistentlik. Restriksiyalovchi endonukleazalar Bam HI yordamida polinukleotid xalka Te geni qismida uziladi-kesiladi. Natijasida 5’-GATSli yopishkok uchlar paydo bo‘ladi va Te gen inaktivlanadi.5’-GATS uchli sintetik gen olinadi. Bu gen va uzilgan vektor pBR322 ligaza T4 fermenti yordamida uzilgan bog‘lar tiklanadi va aksariyat xollarda sintetik gen vektorga birikladi va rekombinant DNK hosil qiladi.
Aralashmada endi ikki xil navli siklik molekulalar - pBR 322 vektorlari va rekombinant gen tashuvchi plazmidalar bo‘ladi.
Ular ampisillinga rezistent (chidamli) , lekin vektor tetrasiklinga ham rezistent bo‘ladi, rekombinant plazmidalar esa aksincha chidamsizdir.
Bu esa selektiv muxitda kerakli geni bo‘lgan rekombinantlarni ajratish imkonini beradi. Gen injeneriyasi o‘zining birinchi qadami bilan yangi kutilmagan xodisalarni ochdi.
Bunday yangiliklarga birinchi navbatda eukariot genlarning mozaik strukturasi kiradi,ya’ni ular oqsilni kodlovchi qism (ekzonlar) va oralik (intron) , oqsilga aloqasi bo‘lmagan qismlardan iboratligi aniqlandi.
Genlarning mozaik strukturasining aniqlanishi muxim ahamiyatga ega bo‘ladi, u avval ma’lum bo‘lmagan iRNKning hosil bo‘lish etapini ochishga olib keldi, ya’ni birlamchi nusxadan intronning kesib olinishi va ekzonning biriktirib iRNKning oxirgi shakllanganini olishga olib keldi.
kDNKni plazmida tarkibida klonlab xromosoma genlarining strukturasini to‘g‘ridan- to‘g‘ri o‘rganish mumkin, lekin ulardan transkripsiyalanadigan mRNKni emas. Lekin kodlanadigan gendan tashqarida bo‘lgan regulyasiyalaydigan tartiblarni o‘rganish uchun xromosoma DNKsining ancha uzun fragmentlari bilan manipulyasiya qilishga to‘g‘ri keladi. Amalda minglab ximera plazmida olish mumkin, ularning har biri DNK (odam, sichqon, tovuq)ning spesifik fragmentlariga ega bo‘ladi. Ko‘p sondagi bunday plazmidalarini skrininglab bu organizmlarning to‘liq genomini o‘rganish mumkin. Lekin katta DNK bo‘lagiga ega bo‘lgan plazmida barqaror bo‘lmaydi, replikasiyada sekin asta kichrayib boradi, ya’ni delesiya natijasida yot DNK nukleotidlari soni kamayib boradi. Buning sababi shundaki, plazmida qancha kichik bo‘lsa shuncha tez replikasiyalanadi. Shu sababli plazmida ko‘payishi uchun kerak bo‘lmagan genetik material tez yuqoladi. Delesiya chastotasi kDNK klonida bir necha mingdan ko‘p nukleotidlar bo‘lsa ancha ortadi.
Xromosoma DNKsining katta bo‘laklari (15 kv) plazmida tarkibida juda ham barqaror emas, lekin ularni biz maxsus konstruksiyalangan L fagi shtammlariga biriktirsak ancha barqaror bo‘lib qoladi.
Faglar eukariotlarining spesifik genlariga ega bo‘lgan, "bibliotekasi" olinandan keyin uni plazmidaga klonlangan kDNK yordamida oson skrininglash mumkin. Bunda ham radioaktiv nishonlanganlangan zondlar yordamida kDNKga komplementar tartibga ega bo‘lgan fag koloniyalari identifikasiyalanadi. Sut emizuvchilar gaploid nabor xromosomalari 3*10 juft asoslarga ega. DNK L fagga klonlanganda har bir fragment o‘rtacha 1,5*10 juft nukleotiddan iborat bo‘ladi. Shunday qilib faqat 1mln fagning skrining sut emizuvchilarning butun genomini o‘rganish imkonini beradi. Agar spesifik kDNK bo‘lsa, kerakli genni L fagi bibliotekasidan topish ko‘pi bilan bir necha xafta vaqtni oladi.
Fagda klonlangandi eukariotik genom segmentining o‘lchovi 15 kv bilan chegaralanadi. Ko‘p xollarda bu butun gen va u bilan bog‘lik tartiblar olish uchun yetarlidir. Lekin izlanishlar shuni ko‘rsatadiki ko‘p genlar ancha uzun bo‘lib ular 35-40 kv nukleotidlarga ega bo‘ladi. Undan tashqari L fagida klonlab odatda 2ta yaqin turgan genlardan rekombinant DNK ajratish mumkin emas. Juda uzun eukariotip DNK fragmentlarini E.colida klonlash kosmidalarda olib boriladi. Bu usul shuncha asoslangaki L fag DNKsi 2ta uchida komplementar bir zanjirli qism bo‘lib unga sos-sayt deb ataladi. Fag-ning normal xayotiy siklida fagning yuzlab DNK molekulalari uzun zajirga birikadi, ya’ni konkotamerga birikadi, bunda L fagi har biri boshqasi bilan cos-sayt bilan birikkan bo‘ladi.
Fag DNKsini joylashishini (ulolovka) katalizlovchi fermentlar bu konkatemerda 2ta bir biridan 35-45 kv mosofada to‘rgan cos-saytlarni toniydi va ular oraligida to‘rgan fag genomini kesib ajratadi va uni fag boshchasiga joylashtiradi. Shunday kilib sos-sayt bu DNKni fag boshchasiga joylashishida muximdir.
Lfagi cos-sayti pBR322 plazmidaning ampisillinga chidamliligiga kloninib, tetrasiklinga chidamlilik gen faol saklanib qoladi. Eukariotik DNK-restriktaza yordamida qisman gidrolizlanadi. Bunda nisbatan uzun DNK fragmentlari hosil bo‘ladi. Keyin bu fragmentlar aralashmasi plazmidaning cos-sayti bilan biriktiriladi. Sos-sayt ham shu ferment yordamida gidrolizlanadi. Bunda intakt TetR genni intakt DNK ximera aralashmasi hosil bo‘ladi. Bu aralashmada eukariotik DNK fragmenti cos-sayt bilan tugagan.
Bu aralashmaga L fagi DNKsini joylashishini katalizlovchi ekstrakt qushilganda, 35-45 kv eukariotik DNK fragmentlarini taniydi va ajralish sodir bo‘ladi va ular fag boshchasiga joylashadi. Eukariotik DNKning qisqa fragmentlari ularda cos-sayt bo‘lsa ham fag boshida joylashmaydi. Bunday DNKli fag boshchasi aniqki ko‘paya olmaydi . Sungra ular bilan ishlov berilgan Ye.coli tetrasiklinga chidamliligi buyicha tanlanadi. E.coli ichiga tushgandan keyin gibrid molekula plazmida kabi ko‘payadi.
Kosmidalarda klonlash effektivligi fagga qaraganda past va kosmida bibliotekasini kam mikdorda DNK bo‘lgan organizmlar bilan ishlaganda olish qulay (masalan: drozofila).
Agar biz odam tuqimasidanmi yoki boshqa tuqimadan summar DNK ajratib , uni kerakli restriktaza bilan fragmentlarga parchalasak va bu fragmentlarni plazmidali vektorga kiritsak sungra hosil bo‘lgan rekombinant DNKni bakteriyalar populyasiyasiga kiritisak, unda biz odam genlari bibliotekasiga ega bo‘lamiz. Bu katalogsiz biblioteka bo‘lib, biz bunda kerakli genga ega bo‘lgan bakteriyani ajratish muammosiga duch kelamiz. Bu ish juda qiyin bo‘lib xozirgi vaqtda zondlar qo‘llaniladi. Ularning qo‘llanilishi nuklein kislotalarining komplementarligiga asoslangan.
Bunday zond radioaktiv nishanlangan mRNK bo‘lishi mumkin va ajratish kerak bo‘lgan genga mos keladi. Bunday mRNKga ega bo‘lib genlar bibliotekasini skrininglash mumkin va bu zondga komplementar DNKga ega bo‘lgan bakteriyani topish mumkin. Bu ishda odatda bitta tusiq bor: u ham bo‘lsa juda toza mRNK olishining juda qiyinligidir. Masalan: shakllangan eritrositlarda globinli mRNK umumiy RNKning faqat yarimini tashkil etadi. Shakllangan eritrositlarda esa gemoglobinga hujayra oqsillining 90%ga yaqini to‘g‘ri keladi. Agar zond sifatida to‘liq tozalanmagan mRNKdan foydalanib klonlangan genni izlasak xotoga yo‘l quyishi mumkin. Shu sababli boshqa usullardan foydalanib toza zondlar olish mumkin.
Odatda hamma mRNK (eukariotlarda) 3’ uchida pol (A) tartiblar bo‘ladi. Roly (A) DNKning mRNKga komplementar zanjirini sintezlash imkonini beradi. Agar mRNK bilan qisqa oligo (dT)aralashtirilga ular poly (A) bilan gibridizasiyalanadi va teskari transkriptaza ferment uchun zatravka rolini bajaradi. Bu ferment ba’zi RNKli onkogen viruslardan ajratilib RNKni matrisa sifatida foydalanib DNKning komplementar zanjirini sintezlashi mumkin. Reaksiya mahsuloti bo‘lib RNK- DNK gibridi hosil bo‘ladi. Yangi sintezlangan DNK zanjiri oxirida ilgan bo‘lib, sungra u o‘z nusxasini ola boshlaydi. Hosil bo‘lgan qo‘sh spiralli kDNK bunday ilgakni intakt holda bo‘lib, uni S1-nukleaza parchalashi mumkin.
Shu tariqa hosil bo‘lgan qush spiralli DNK pBR322 plazmidasiga birikadi. Birikish DNK -ligaza yordamida ro‘y beradi sungra rekombinant plazmida E.colining kerakli shtammiga kirgiziladi. U yerda plazmida ko‘payadi.
Oligonukleotidlarning ximiyaviy sintezi.
Yuqorida ko‘rsatilgan operasiyalar tartibini mRNKning aralash pulyasiyasi bilan olib borsak (odatda amalda xuddi shunday bo‘ladi, chunki gomogen mRNK olish qiyin) reaksiya mahsuloti ham kDNK aralashmasi bo‘ladi. Lekin tajribani shunday tashkil etish mumkinki har bir bakteriya hujayrasi bitta rekombinant kDNKli plazmidani olishi mumkin. Natijada bu hujayra va uning avlodi faqat bir tur kDNKni ega bo‘ladi. Keyingi muammo bu endi hujayra kanday kDNKni olganining aniqlashdan iborat.
Buning uchun bakteriyaning aloxida koloniyasi olinadi va undan juda toza gomogen kultura olinadi. Sungra bu genetik bir jinsli hujayralarning klonial populyasiyasidan kDNKli plazmida bori ajratiladi va ular denaturasiyalanadi. Bunda DNK zonjiri ajraladi. Denaturasiyalangan DNKni nitroselyulozali filtrlarda immobilizasiyalash mumkin.
Bu filtlar orkali mRNK aralashmasi o‘tkazilganda filtrda faqat shu kDNKga komplementar molekulalar ushlanib qoladi. Sungra birikkan mRNKni filtrdan ajratib hujayrasiz sistemaga qo‘shib translyasiyalash mumkin. Bunda sintezlanadigan oqsil kDNKga spesifik bo‘lib uni identifikasiyalash mumkin. Bu ishlar qilinganndan keyin izlanuvchi qo‘lida toza kDNK bo‘lib individual genni aniqlash imkonini beradi.
Aniqki preparatning qanchalik kup qismini bu mRNK tashkil etsa kDNK-zond olish shuncha oson bo‘ladi.. Shu sababli rekombinant DNK texnologiyasi birinchi navbatda ko‘p miqdorda sintezlanadigan oqsillar geni zondini olishda qo‘llanildi. Masalan: miyelomalar produksiyasi gemoglobin va antitelolar.
Ma’lum oqsil uchun kDNK zond olingandan keyin uni kup sondagi bakterial koloniyalarini tez skrininglash uchun nitrosellyulozali filtrlarda gibridizasiyalash usuli uchun qullash mumkin. Bundan maqsad boshqa rekombinant shunday yoki shuni uxshash genli plazmidalarni aniqlash imkonini beradi.
Bu usullar yordamida ko‘p har xil oqsillar uchun kDNK –zondlar olinib ularning har birini izlanayotgan genning to‘liq yoki qisman nusxasi ekanligi aniqlandi.
Bu savolini aniqlash usullaridan biri bu RNK-DNK geteroduplekslarning o‘lchamini aniqlashdir. mRNK bilan geterodupleks hosil qiladigan kDNK klonlari keyin analiz qilinib, ularning nukleotidlar tartibi shu oqsilning aminokislotalar tartibiga mos kelishi
tekshirildi . Kutilgan kabi bunday mos kelish juda anik bo‘lib yana shu narsa aniklandiki. kupchilik mRNKning 5’ uchlarida Qo‘shimcha nukleotidlar qatori mavjud ekan. Ular oqsilning liderli segmentlarini kodlab, bu segmentlar sintez tugagandan keyin parchalanib ketadi va kupincha aniqlab bo‘lmayd.
5-ma’ruza: Mikroorganizmlarda gen muhandisligi
Reja
1.Mikroorganizmlarda gen muhandisligi
2. Begona genlarni mikroorganizmlarga kiritish usullari.
3. Transgen mikroorganizmlar olish
Bakteriyalar o'rtasida genetik materialning (qisqa yoki uzun qismi yoki barcha DNK segmenti) bir donordan ikkinchisiga (retsipient) o'tishi oddiy sharoitlarda, in vivo yoki in vitroda osonlik bilan sodir bo'lishi mumkin. O'tkazilgan genlar, agar bakteriyalar genetik jihatdan bir-biriga juda yaqin bo'lsa yoki ularning DNK ketma-ketligi o'rtasida katta gomologiya bo'lsa, qabul qiluvchining xromosomasi bilan osongina birlashishi mumkin. Agar gomologiya juda oz bo'lsa yoki alohida avlodlarga tegishli turlar bo'lsa, bu birlashma ancha kam bo'lishi mumkin.
Bu yerda ikki masalani farqlash foydali bo'ladi. Begona DNKning donordan retsipientga o'tish mexanizmi va hujayra ichiga kiradigan segmentlarning retsipient xromosomasi bilan birlashishi turli xil hodisalardir. Ular bir-biridan alohida ko'rib chiqilishi kerak.
Donor DNK segmentlarini retsipient bakteriyaga o'tkazish tabiiy ravishda sodir bo'lishi mumkin, lekin juda kamdan-kam hollarda amalga oshiriladi. Bu tezlikni sun'iy ravishda maxsus texnikalar (elektroporatsiya, CaPO4 tuzlari, mikroinektsiya, mikroprojectile, vektorlar va boshqalar) yordamida oshirish mumkin.
Bakteriyalar o'rtasida bu tabiiy gen almashinuvidan tashqari, biotexnologik usullar (rekombinant DNK texnologiyasi) bilan gen o'tkazishni muvaffaqiyatli amalga oshirish mumkin. Ushbu texnikada rekombinant vektor (plazmid, fag, kosmid, shuttle vektorlar) donorda (prokariotik va eukariotik) genni (genlarni) parchalash va juda muhim protein sintezini cheklash endonukleaza fermentlari bilan kodlash orqali yaratilgan. Oraliq molekulalar (vektor, virus, bakteriyalar) retsipient organizmga (prokariotik yoki eukariotik) va u yerda genning ifodalanishini ta'minlaydi (gen klonlash, molekulyar klonlash). Ko‘p foyda keltiradigan bu texnologiya kasalliklarni tashxislash, nazorat qilish va davolashda hamda tadqiqotlarda katta hissa qo‘shadi.
Bakteriyalar o'rtasida tabiiy gen almashinuvi uchta asosiy mexanizm bilan sodir bo'ladi.
1) Transformatsiya
2) Konyugatsiya
3) Transduksiya
Transformatsiya
Agar mikroorganizm DNK tarkibi bo'yicha o'ziga juda yaqin bo'lgan va boshqa mikroorganizmning genetik materiali (DNK segmentlari) bo'lgan muhitda o'stirilgan bo'lsa, ma'lum vaqtdan so'ng, bu suyuq muhitdan qattiq muhitga ekish amalga oshirilsa; ba'zi koloniyalar morfologiyasi va genetik materiali har xil bo'ladi.
DNK segmenti boshqa bakterial xromosoma bilan bog'lanishi uchun ikkalasi ham asosiy ketma-ketlikda gomologiyaga ega bo'lishi kerak. Shu sababli, bir-birini birlashtira oladigan va bir-birini to'ldiruvchi bu hudud va DNK fragmentlaridagi A+ T/G + C nisbati bir xil yoki bir-biriga juda yaqin bo'lishi ham zarur. Bunday holda, donor hujayra DNK segmenti o'ziga gomolog bo'lgan va u yerdan integratsiyalasha oladigan qabul qiluvchi hujayra DNKsining ma'lum bir hududi bilan bog'lanadi. Ba'zi hollarda, donor hujayra DNKsi qabul qiluvchi hujayraga kirsa ham, maxsus qabul qiluvchi joylar (gomolog yon tomonlar) bo'lmasa, sintez sodir bo'lmaydi. Gomologik rekombinatsiya sodir bo'lganda, donor hujayra DNK fragmenti qabul qiluvchi xromosomasining bir qismi yoki davomi bo'ladi. Biroq, u ko'payadi va hujayra bo'linishi paytida uning nusxasi boshqa qiz hujayraga o'tkaziladi.
Transformatsiyada qabul qiluvchi va donor hujayralarining DNKsining homologatsiyasi bilan bir qatorda ba'zi muhim omillar mavjud. Tegishli muhit va maqbul sharoitlarda ko'payadigan hujayralarning faqat 107108 tasi DNK segmentlarini qabul qilish qobiliyatiga ega. Shuning uchun ham ba'zi hujayralar ko'payish jarayonida ma'lum bir fiziologik holatga kelishi va DNK bo'lagini olish qobiliyatini (o'tkazuvchanligini) egallashi juda muhimdir. Boshqacha qilib aytganda, qabul qiluvchi hujayra boshqalardan farqli va malakali bo'lishi kerak. Yana bir muhim jihat shundaki, DNK segmentlari 105 dalton molekulyar og'irligidan kam bo'lmasligi kerak. Ikki qatorli bo'lmagan va yuqorida ko'rsatilgan o'lchamlardan kichikroq bo'lganlar qabul qiluvchi hujayralarga osongina kira olmaydi.
Qabul qiluvchi hujayraning yuzasi donor hujayraning DNK bo'lagining adsorbsiyasi uchun muhim ahamiyatga ega. Retseptor hujayra yuzasida maxsus va ma'lum retseptor joylari (retseptorlari) mavjud. Kapsüllangan bakteriyalarda adsorbsiya va penetratsiya hodisasi juda qiyin. Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, ba'zi bakteriyalarda 75 tagacha o'ziga xos retseptorlarning adsorbsion joylari mavjud. Agar kapsula mavjud bo'lmasa va boshqa sharoitlar mos bo'lsa, adsorbsiya sodir bo'lishi mumkin. Hujayra yuzasiga adsorbsiyalangan DNK segmenti, agar u kirish imkoniyati bo'lmasa yoki kirishda kechiksa, tuz, pH va dezoksiribonukleaza (endonukleaza) ta'sirida inaktivlanadi yoki lizislanadi.
DNK segmenti adsorbsiyalangan va retsipient hujayra yuzasida ma'lum joylarga kirib borganidan so'ng, u bakterial turlar orasida o'zgarib turadigan 10 daqiqadan bir necha soatgacha bo'lgan vakolatli hujayra DNKsi bilan bog'lanadi. Bu o'tgan vaqt tutilish (yashirin) davr deb ataladi. Hujayra ichiga kirgan DNK segmenti ikki zanjirli shaklda qolishi va aylana shakliga aylangandan keyin retsipientning DNKsi bilan birlashishi ham mumkin. Ekzogenot qabul qiluvchi hujayra DNK idagi o'ziga xos komplementar mintaqa bilan yonma-yon bo'lishi kerak. Bunga erishilgandan so'ng, ekzogenot va endogen o'rtasida gomologik rekombinatsiya amalga oshiriladi. Rekombinatsiya ligaza fermenti tomonidan hosil qilingan gibrid DNKning uchlarini birlashtirish orqali yakunlanadi. Shunday qilib, birlashtirilgan ekzogenot xost hujayra DNKsining bir qismi va davomi bo'lib, birgalikda replikatsiyalanadi. Biroq, yangi avlodlarda orttirilgan belgilar ko'rinishi uchun 2-3 avlod kerak.
Bakteriyalarda ekliptika davri har xil. H. influenzae da bu davr juda qisqa. Ba'zi bakteriyalarda bu bir necha soat davom etishi mumkin.
D. pneumoniae dan tashqari H. influenzae, stafilokokklar, oʻsimlik qoʻzgʻatuvchilari, tayoqchalar, azot saqlovchi mikroorganizmlar orasida ham transformatsiya aniqlangan. Enterobakteriyalar o'rtasida transformatsiya unchalik muvaffaqiyatli bo'lmasa-da, so'nggi yillarda E. coli da yuqori kaltsiy ionlari konsentratsiyasida transformatsiya ham aniqlangan.
Transformatsiya yordamida bakteriyalarning xromosoma xaritalari tuzilishi mumkin. Ushbu texnika yordamida olingan xaritalar yordamida genlar ketma-ketligi, genlar orasidagi masofalar va ularning bir-biriga munosabatini o'rganish mumkin. Biroq, eng yaxshi xaritalar konyugatsiya va transduktsiya orqali amalga oshiriladi.
Transfeksiya: Virus, plazmid, fag, bakteriyalar va DNK segmentlarini maxsus usullar bilan retsipient hujayralarga o'tkazish transfeksiya deyiladi. Masalan, bakteriyalarda sintezlangan faglarning bir qismi kapsid olib yurmasligi yoki fag DNKsi sintez qilingandan keyin kapsid bilan birikmasligi mumkin. Bakteriyalar parchalanganidan keyin chiqariladigan bu faglar atrof-muhitda mavjud bo'lgan vakolatli hujayralar tomonidan qabul qilinishi mumkin. Biroq, bu hodisa juda cheklangan va kam uchraydi. E. coli K12 va sferoplastlarda transfeksiya qayd etilgan.
DNK segmentining hujayralarga haddan tashqari kirib borishini osonlashtirish uchun CaPO4 tuzlari bilan cho'ktirish, mikroin'ektsiya, elektroporatsiya va boshqalar kabi maxsus usullar qo'llaniladi.
Konyugatsiya - donor hujayra DNKsining barcha yoki bir qismini ushbu ikki hujayraning to'g'ridan-to'g'ri aloqasi yoki jinsiy pili orqali qabul qiluvchiga o'tkazishga aytiladi. Bakteriyalardagi konyugatsiya hodisasini yoritish bo'yicha birinchi tadqiqotlar J. Lederberg va E.L. Tatum (1946) tadqiqotidan olingan.
Tadqiqotchilar ikkita aminokislota ekzotrofik belgilarga ega bo'lgan 2 ta E. coli K-12 mutantlari ustida olib borilgan tadqiqotlari bilan konyugatsiyani aniqladilar. Ushbu tajribada ikkita mutant shtamm, biri A- va B- aminokislotalar uchun auksotrofik, lekin C+ va D+ aminokislotalarini (A-B-C+D+) sintez qilishga qodir, ikkinchisi esa aksincha (A+B+C-D-), muhitda aralashtiriladi. Inkubatsiya davridan keyin (6-7 soat) u minimal muhitga (tarkibida ushbu aminokislotalar bo'lmagan) ekilgan. Bu ikki shtamm bu muhitlarda alohida koʻpaymagan boʻlsa-da, birga boʻlgandan keyin oʻstirilganda baʼzi koloniyalar hosil boʻlgani va bu koloniyalardagi E. coli tekshirilganda ularning barcha 4 ta aminokislotalar (A+) uchun ijobiy ekanligi kuzatildi. B+C+D+). Biroq, bu hodisa taxminan 6-10 soatni tashkil qiladi.
Transduktsiya
Genetik materialning donor bakteriyadan qabul qiluvchi bakteriyaga faglar orqali o‘tishi transduksiya deyiladi. Transduksiya yoʻli bilan genlar koʻchishi Gram-manfiy (Salmonella, E. coli, Shigella, Proteus, Vibrio, P. aeruginosa va boshqalar) va Gram-musbat mikroorganizmlarda (Stafilokokklar va tayoqchalar) kuzatilgan.
Transduktsiya uchta asosiy usulda amalga oshirilishi mumkin.
1- Umumiy transduktsiya,
2- Maxsus transduktsiya,
3- abortiv transduksiya.
Umumiy transduksiyada fag bakteriya hujayrasi ichida yetuk bo'lganda, ajralgan xost DNK ning bir qismi tasodifan o'sha joyda sintezlanadigan fag kapsidiga kirishi mumkin. Shunday qilib, bu kapsid (fag boshi ichida) fag DNK sidan alohida, turli uzunlikdagi (50-100 genni o'z ichiga olishi mumkin) bakterial DNKni o'z ichiga oladi. Bunday fag tarqalib, boshqa bakteriyani yuqtirganda, u o'z DNKsini xost hujayrasiga o'tkazadi. Agar fag mezbon hujayraning xromosomasi bilan o'zi olib yuradigan ushbu bakterial DNK bilan birlashsa, u qabul qiluvchi hujayrani o'zi olib yuradigan belgilar nuqtai nazaridan ijobiy qiladi. Bir necha krossengoverdan so‘ng bakterial DNK bilan birlasha oladigan bu fag + bakterial DNK segmenti retsipient hujayra xromosomasining davomiga aylanadi, birga replikatsiyalanadi va transkripsiyalanadi va u olib yurgan genlardagi ma’lumotlar mRNK ga o‘tadi va translatsiyada ishtirok etadi.
Umumiy transduksiyada fag bakteriya hujayrasi ichida yetuk bo'lganda, ajralgan xost DNK ning bir qismi tasodifan o'sha joyda sintezlanadigan fag kapsidiga kirishi mumkin. Shunday qilib, bu kapsid (fag boshi ichida) fag DNK sidan alohida, turli uzunlikdagi (50-100 genni o'z ichiga olishi mumkin) bakterial DNKni o'z ichiga oladi. Bunday fag tarqalib, boshqa bakteriyani yuqtirganda, u o'z DNKsini xost hujayrasiga o'tkazadi. Agar fag mezbon hujayraning xromosomasi bilan o'zi olib yuradigan ushbu bakterial DNK bilan birlashsa, u qabul qiluvchi hujayrani o'zi olib yuradigan belgilar nuqtai nazaridan ijobiy qiladi. Bir necha krossengoverdan so‘ng bakterial DNK bilan birlasha oladigan bu fag + bakterial DNK segmenti retsipient hujayra xromosomasining davomiga aylanadi, birga replikatsiyalanadi va transkripsiyalanadi va u olib yurgan genlardagi ma’lumotlar mRNK ga o‘tadi va translatsiyada ishtirok etadi.
Maxsus transduktsiyali faglar xost DNKsida ma'lum genlar yonida joylashgan bo'lib, hujayra DNKsi bilan birlashib, profaglarga aylanadi. Shu jihatdan ular epizoma-belgi F-omiliga (Hfr) o'xshaydi. Xost hujayraning xromosomasi bilan bog'langan fag faollashadi, agar mezbon hujayra ultrabinafsha nurlari ta'sirida bo'lsa va DNKdan yoki o'zi joylashgan joydan ajralib, xostini lizingga uchrasa. DNK dan ajratilganda, ular o'zlari bilan birga yoki biriktirilgan bakteriyalarga tegishli genni olish orqali ajratiladi. Agar shunday fag boshqa bakteriya kulturasiga inokulatsiya qilinsa, u yerdagi hujayralarni yuqtirganda, o'zi olib yurgan genni o'sha bakteriyaga o'tkazadi va genda topilgan maxsus belgilar nuqtai nazaridan bakteriyani ijobiy qiladi.
Maxsus transduktsiyali faglarga misollar qatoriga lyamda fagi va E. coli K 12 ning 80 faglari kiradi. E. coli da lyamda fag odatda biotin va galaktoza genlari orasida joylashadi, u yerda profag sifatida mavjud. Hujayradan chiqayotganda galaktoza genini (gal+) ham birga oladi. Agar bu fag gal-mikroorganizmni yuqtirsa, uni gal+ holatga aylantiradi. Ushbu turdagi transduktsiya 10-6-10-7 tezligida sodir bo'ladi. 80 fag triptofan geni yonida joylashgan, xuddi lyamda fagi kabi harakat qiladi.
Abortiv transduktsiya Fag tomonidan o'z xo'jayinidan olingan va ba'zi belgilar (genlar) ga ega bo'lgan DNK segmenti fag boshqa hujayrani yuqtirganda ushbu hujayraga o'tadi. Biroq, bu DNK fragmenti hujayra ichida qoladi va bakterial DNK bilan birlashmaydi. U hujayrada mustaqil ravishda mavjud bo'lsa-da, hujayra DNKsi bilan bir vaqtda ko'payish qobiliyatiga ega emas. Biroq, u tashuvchi belgilar nuqtai nazaridan hujayrani ijobiy holga keltirishi mumkin. Bakteriyaning har bir bo'linishi bilan bu ekzogenot qardosh hujayrada qoladi va uni ijobiy qiladi. Shunday qilib, bakteriyaning har bir bo'linmasida DNK segmenti replikatsiya qilinmasdan bitta hujayra qoladi.
Genetik rekombinatsiyalar
Donor bakteriyadan turli yo‘llar bilan ko‘chirilgan genetik materiallar (ekzogenot) samarali bo‘lishi uchun ular sitoplazmada emas, balki retsipient xromosomasi bilan birlashishiga (integratsiyalashishiga) rekombinatsiya deyiladi. Ba'zi hollarda, qabul qiluvchining sitoplazmasiga kiradigan begona DNK ketma-ketligi o'sha erda qolishi va xromosoma bilan birlashmasligi mumkin. Bunday holatlar, aksincha, qabul qiluvchi va donor hujayralarining DNK tarkibi har xil bo'lganda paydo bo'lishi mumkin. Bunday hodisalar gomologik hududlarning kam yoki umuman yo'qligi yoki ketma-ketliklar orasidagi maxsus birikmalar natijasida yuzaga keladi.
1) Gomologik (umumiy) rekombinatsiya
2) Saytga xos rekombinatsiya
3) Gomologik bo'lmagan rekombinatsiya
Ushbu turdagi rekombinatsiyada hujayra devoridan va qabul qiluvchining ma'lum qismlaridan kirib boradigan chiziqli DNK segmentlari darhol dumaloq shaklga aylanadi. Bunday molekulada retsipient xromosomasiga komplementar (gomolog) bo'lgan hududlar duch keladi. Gomologik hududlarda o'zaro uzilishlar natijasida donorning ketma-ketligi qabul qiluvchining DNK ketma-ketligi bilan birlashadi.
6-mavzu: O‘simliklarda gen muhandisligi
Reja
1.Qimmatli xo‘jalik ahamiyatiga ega transgen o‘simliklar olish.
2. O‘simlik hujayralari transformasiyasi usullari. Agrobakteriyalar yordamida kokultivasiyalash usuli.
3. Bioballistik transformasiyalar usuli. DNK mikroinyeksiyasi.
4. Elektroporasiya. Liposomalarga joylashtirish.
O'simliklarning bitta hujayrasidan yaxlit o'simlik olish mumkinligi, ya’ni totipotentlik xususiyati hayvonlar hujayralariga nisbatan ularning eng muhim afzalligi hisoblanadi. O'simliklar gen muhandisligidagi natijalar o'simlik to'qimalari kulturasi usullari, ayniqsa, turli xil o'simliklarni regeneratsiya qilish uslublarini ishlab chiqishga bog'liq bo'ladi.
Gen muhandisligi texnologiyasi transgen o'simlik olishning quyidagi bosqichlarini o'z ichiga oladi:
1) genni tanlash va uni klonlash;
2) retsipient - o'simlik genotipini tanlash;
3) genni kiritish va uning retsipient - o'simlik genomiga ekspressiyasi;
4) transformant hujayralar regeneratsiyasi va transgen o'simliklarni tanlab olish.
Genni tanlash va uni klonlash.
Genni tanlash, o‘simlikka xo'jalik ahamiyati qimmatii ma’lum bir belgini o'tkazish zaruriyatidan kelib chiqadi. Hozirgi vaqtda, asosan, o‘simliklar transformatsiyasi uchun monogen belgilar, ya’ni, pestitsidlarga chidamlilik, yoki boshqa xil stress omillarga chidamlilikni belgilovchi genlar keng qo'llaniladi. Bu belgilarga javobgar genlarning ko‘pchiligi bakteriya genomlaridan ajratib olingan. Keyingi vaqtlarda chidamlilik belgilariga javobgar donor sifatida yovvoyi o‘simlik turlari genomlari tanlanmoqda. Turli xil tur, avlod va hatto oilalarga mansub o'simliklarning biologik jihatdan bir biriga mos kelmasligi sababli bunday genlarni retsipient o‘simliklar genomiga jinsiy gibridlash usuli orqaligina kiritish mumkin emas. Hal etilishi yanada murakkab muammo bir guruh sifat belgilari: urug‘ sifati, qurg‘oqchilik, yuqori va past haroratga chidamlilik belgilarini ajratib olish hisoblanadi.
Retsipient o‘simlik genotipini tanlash.
Retsipient sifatida ishlab chiqarish amaliyoti talablariga hosildorligi, urug‘ - mevasi sifati, biotik va abiotik stresslarga chidamliligi bilan javob bera oladigan, lekin faqat birgina salbiy belgi, masalan, zararkunanda hasharotlarga chidamsiz nav yoki liniyalar tanlab olinadi. Bunday o‘simliklar genomiga hasharotlami nobud qiluvchi prototoksin oqsili ekspressiyasini ta’minlovchi bt2 bakteriya genini kiritish tanlab olingan navda hosildorlikni sezilarli oshishiga sabab bo‘ladi. Shuningdek, retsipient o‘simlik genotipini tanlashda hujayralarning yaxlit (fertil) yetuk o‘simlikka qadar regeneratsiya qilish xususiyati ham inobatga olinadi, chunki bu belgi genotipga ham bir qadar bog‘liqdir
Genni kiritish va uning retsipient o‘simlik genomidagi ekspressiyasi.
O‘simliklar genomiga begona genlarni ko'chirib o‘tkazish muammosi begona genlarni ikki pallali va ba’zi bir pallali o‘simliklar genomiga ko'chirib o‘tkazish imkonini beruvchi tuproq agrobakteriyalari Agrobacterium tumefaciens tarkibidagi Ti-plazmidlarining aniqlanishi bilan birmuncha yengillashdi. So‘nggi vaqtlarda o‘simlik hujayralari transformatsiyasida bioballistik transformatsiya usuli, ayniqsa, bir pallali o‘simliklar uchun keng qo‘llanilmoqda. Begona genni retsipient o‘simlik genomiga ekspressiyasini amalga oshirish va avlodlarda belgining nasldan - naslga turg'un o'tishini ta’minlash muhim masala bo‘lib hisoblanadi. Kiritilgan genni ekspressiya bo‘lishi bir qator sabablar: genni o‘simlik genomiga integratsiya bo‘lgan joyi, promotor qismining metillanish izchilligi, kiritilgan genning xususiyatlari va h.k. larga bog‘liq
Transformant hujayralar regeneratsiyasi va transgen o‘simliklarni tanlash.
Transformant hujayralardan yetuk o‘simlikni regeneratsiya bo'lishi hujayralar totipotentligiga bog‘liq, ammo bu har doim ham amalga oshavermaydi. Totipotentlik belgisi ikki pallali o'simliklar: tamaki, kartoshka, lavlagi, soya, raps, beda, pomidor, sabzi, karam va ba’zi mevali daraxtlarda yaqqol ifodalangan. Bir pallalilar, ayniqsa, boshoqdoshlarda bu belgi kuchsiz ifodalangan bo‘lib, ularda hujayradan yetuk o‘simlikni regeneratsiyasi jarayoni juda qiyinchiliklar bilan kechadi. Hozirgi vaqtda g'alla ekinlariga mansub ba’zi o'simliklar makkajo'xori, sholi, bug'doy, suli kabilarni regeneratsiya qilish usullari ishlab chiqilgan. Shuni qayd etish lozimki, ko'plab o'simliklami regeneratsiya qilish bo'yicha yildan yilga bir qator takomillashtirilgan usullar ishlab chiqilmoqda va rivojlantirilmoqda.
Agrobakteriyalar asosida o‘simliklar transformatsiyasi
Shish hosil qiluvchi kuchli induktorlardan biri Agrobacterium tumefaciens misolida shish chaqiruvchi vosita Ti - plazmida deb nomlangan (ingliz tilidan Tumor inducing - shish chaqiruvchi) maxsus plazmida bo'lib, uning bir qismi o'simlik hujayrasi xromosomasiga o’rnashib olishi aniqlangan. Ti-plazmida uzunligi 200 m.n.j (ming nukleotid juft) dan iborat halqasimon DNK dan tashkil topgan. U bakteriya hujayralarida avtonom replikatsiya bo'la olish xususiyatiga ega. Ti - plazmidalarni ular sintezlaydigan opinlar tipiga ko'ra 4 ta guruhga bo'lishi mumkin. Ko'pincha nopalin yoki oktopin aminokislotalarini kodirlaydigan Ti - plazmidalar uchraydi. Agrobakteriya hujayrasi plazmidalarning faqat biri oktopin yoki nopalin kodirlaydigan tipini saqlashi mumkin.
Genetik tadqiqotlarning ko'rsatishicha, barcha Ti-plazmidalarni o'xshash tuzilishga va ikki xil:
1) agrobakteriyaning o'zini metabolizmi uchun zarur (opinlar katabolizmi genlari, plazmidalar replikatsiyasi boshlang'ich nuqtasi va h.k.);
2) o'simlik hujayralari transformatsiyasi uchun zarur bo'lgan guruhga mansub ketma-ketliklarga ega guruhlarga bo'lish mumkin. Shuni alohida qayd etish lozimki, birinchi guruh genlari promotorining prokariot tipiga ega va faqat bakteriya hujayrasidagina faoliyat yurita oladi, ikkinchi guruh genlari esa o‘simiik hujayrasida ham ishlay oladi. Ikkinchi guruhga shish hosil bo‘lishi va opinlar sintezi uchun javobgar genlar kiradi.
O‘simlikni agrobakteriyalar bilan zararlanishi natijasidagi transformatsiyasi quyidagicha kechadi. Aniqlanishicha, agrobakteriya ham, Ti - plazmida ham o‘simlik hujayrasi ichiga kirmaydi, lekin Ti - plazmidaning bir qismi o‘simlik hujayrasi yadrosiga o‘tib, o‘simlik genomiga joylashib olishi mumkin Ti - plazmidaning bu fragmenti T-DNK (ingliz tilidan transforming DNA - transformatsiyalanuvchi DNK) deb nomlanadi. T-DNK ning uzunligi 25 m.n.j. T-DNK oxirlarida uni plazmida tarkibidan qirqish va o'simlik genomiga integratsiyasi uchun zarur to‘g‘ri ketma-ketliklar (25 m.n.j) joylashgan. T-DNK yettita gen: opinlardan birini kodirlaydigan nos geni (nopalinsintetaza) yoki ocs (oktopinsintetaza), shuningdek, shish hosil bo‘lish belgilarini kodirlaydigan oltita gen, ulardan ikkitasi auksin sintezi, bittasi sitokinin sintezini kodirlaydigan genlarni tutadi. Bu genlar ekspressiyasi natijasida hujayralarning gormonal statusi o‘zgaradi, bu esa ularning dedifferensiallashuvi va shish hosil bo'lishiga olib keladi.
O‘simlikni agrobakteriyalar bilan zararlanishi natijasidagi transformatsiyasi quyidagicha kechadi. Aniqlanishicha, agrobakteriya ham, Ti - plazmida ham o‘simlik hujayrasi ichiga kirmaydi, lekin Ti - plazmidaning bir qismi o‘simlik hujayrasi yadrosiga o‘tib, o‘simlik genomiga joylashib olishi mumkin Ti - plazmidaning bu fragmenti T-DNK (ingliz tilidan transforming DNA - transformatsiyalanuvchi DNK) deb nomlanadi. T-DNK ning uzunligi 25 m.n.j. T-DNK oxirlarida uni plazmida tarkibidan qirqish va o'simlik genomiga integratsiyasi uchun zarur to‘g‘ri ketma-ketliklar (25 m.n.j) joylashgan. T-DNK yettita gen: opinlardan birini kodirlaydigan nos geni (nopalinsintetaza) yoki ocs (oktopinsintetaza), shuningdek, shish hosil bo‘lish belgilarini kodirlaydigan oltita gen, ulardan ikkitasi auksin sintezi, bittasi sitokinin sintezini kodirlaydigan genlarni tutadi. Bu genlar ekspressiyasi natijasida hujayralarning gormonal statusi o‘zgaradi, bu esa ularning dedifferensiallashuvi va shish hosil bo'lishiga olib keladi.
Agrobakteriyalar yordamida o'simliklar transformatsiyasi amalga oshirilishi uchun uchta shart bajarilishi lozim: - bakteriya hujayrasi yuzasida bakteriyaning o'simlik hujayrasi bilan birikishi uchun zarur maxsus polisaxaridlar sintezini amalga oshiruvchi to‘rtta genni agrobakteriyalar xromosomasidagi faollashuvi; - Ti - plazmidaning vir -hududi, ya’ni DNK ning o‘simlik hujayrasi yadrosiga ko‘chirib o‘tkazilishi initsiatsiyasi uchun zarur qismining faollashuvi; - T-DNK ning mavjud bo‘lishi.
O'simlik hujayralari transformatsiyasi usullari
Ikki pallali transgen o'simliklar olishda eng keng tarqalgan usullardan biri agrobakteriyalar bilan kokultivatsiya qilish usuli hisoblanadi. U o'simlik eksplantlarini T-DNK hududiga begona gen joylashtirilgan vektor konstruksiyaga ega agrobakteriyalar bilan transformatsiya qilishga asoslangan. Uning keng tarqalganligining sababi, transformatsiyani amalga oshirishning birmuncha soddaligi transgen o‘simliklarni ajratib olishda yuqori (o‘simlik turiga qarab, 10- 60 %) samaradorligi bilan izohlanadi.
Genning kelib chiqishi (prokariot yoki eukariot) transformatsiya uchun ahamiyatsizdir, lekin u o‘simlik hujayrasiga ekspressiya bo‘la oladigan promotor nazorati ostida bo‘lishi lozim. Fuksional gendan tashqari, vektor, albatta, transformatsiyaning selektiv nishon belgisini saqlashi shart. Bunday nishon belgi sifatida antibiotiklar: kanamitsin (npt-geni), gigromitsin (npt-geni) va yoki gerbitsidlar xlorsulforon (ALS geni), fosfinotritsin (bar- geni) (BASTA) ga chidamlilik belgisini yuzaga chiqaradigan genlar ishlatiladi. Bundan tashqari, retsipient - o‘simlik navlarini tanlab olish lozim. Transformatsiya uchun eksplant sifatida steril o‘simlik barg plastinkalari olinadi. Biroq buning uchun yosh ildizlar (arabidopsisda), gipokotil (pomidorda), urug‘palla (pomidor, baqlajonda), bo‘g‘im oralig‘i (kartoshkada) ham ishlatilishi mumkin.
O'simliklarga genlarni to'g'ridan - to‘g‘ri ko'chirib o'tkazish
O'simlik hujayralariga genlari to'g'ridan-to'g'ri ko'chirib o'tkazishda o'simlik protoplastlarining transformatsiyasi keng qo'llaniladi. O'simlik hujayra devoriga fermentlar (sellulaza, pektinaza) bilan ishlov berilganda hujayra devori yemirilib, faqat protoplast qoladi. DNK ishtirokida protoplastlarni to'g'ridan-to'g'ri transformatsiyalash usuli ishlab chiqilgan. Transformatsiyaning birmuncha yuqori samaradorligiga elektroporatsiya va polietilengekol qo'shish usuli orqali erishish mumkin. Agrobakteriyalar bilan transformatsiya qilishga nisbatan, to'g'ridan-to'g'ri ko'chirib o'tkazish usulining chastotasi kam bo'lsa-da, birmuncha afzalliklarga ega.
Hozirgi vaqtda 140 dan ortiq o'simlik turlari vektor DNKsini protoplast hujayralariga turli usullar bilan ko‘chirib o'tkazish orqali transformatsiya qilingan.
DNK mikroineksiyasi. Bir qator tajribalarning ko‘rsatishicha, o‘simlik hujayralari transformatsiyasi uchun hayvon hujayralaridagi mikroin’eksiyalar singari mikroin’eksiyalari usulini qo'llash mumkin. Bunda in’eksiya uchun protoplastlar olishda ularni polilizinli shishalarga yopishtirish usullari ishlab chiqilganligi qator texnik qiyinchiliklarni bartaraf etish imkoniyatini berdi . Vektor tipiga bog‘liq bo'lmagan holda o'simlik protoplastlari transformatsiyasi samaradorligi 10-15 % dan oshmaydi, u ikki pallali o'simliklar uchun ham bir pallalilar uchun ham bir xilda muvofiq keladi.
Elektroporatsiya. Bu usul yuqori impulsli kuchlanishlarning biomembranalar o'tkazuvchanligini qaytar darajada oshirishga asoslangan. O'simlik protoplastlari uchun elektroporatsiya muolajalari juda samarali hisoblanadi. Usulning mohiyati quyidagicha: DNK- vektorini saqlovchi yuqori konsentrasiyali eritmadagi o'simlik protoplastlariga yuqori voltli impuls (kuchlanish 200-350 V, impuls davomiyligi 54 ms) bilan ta’sir etiladi. Natijada DNK molekulalari hujayra membranasidagi poralar (teshikchalar) orqali yutiladi. Eritma aralashtirilgandan so‘ng protoplastlarni regeneratsiya bo‘lishi uchun yetarli muhitga ekiladi. Ko‘chirib o'tkazishning samarasi elektr shokidan so‘ng 24-28 soat o‘tgach aniqlanadi.
Liposomalarga joylashtirish. O‘simlik protoplastlariga o‘tkaziladigan ekzogen genetik materialni nuklein kislotalarni parchalaydigan nukleazalar ta’siridan himoya qilishda qo‘llaniladigan usullardan biri liposomalarga joylashtirish usuli. Liposomalar qobig'i fosfolipidlardan tashkil topgan sferik shakllar hisoblanadi. Ularni fosfolipidlarning suvli emulsiyalariga ultratovushlar bilan ishlov berish yoki qattiq chayqatish natijasida olish mumkin. Liposomalar yordamida o'simlik protoplastlariga tamaki mozaikasi virusi RNK si, A.tumefaciens bakteriyasi Ti-plazmidasi DNK si, shuningdek, butun metafaza davri xromosomalari kiritilgan. Liposomalar yordamida ko‘chirib o‘tkazish tizimlarining afzalliklari sifatida ularning hujayralarga nisbatan zaharliligining kamligi, liposomalarni parchalash xususiyatiga ega hujayralari bo‘lgan ko'plab o‘simliklarda ishlatish mumkinligini ko‘rsatish mumkin. Hozirgi vaqtga kelib, mazkur usul texnik jihatdan qiyinligi va transformatsiyalash faolligining nisbatan kam (0,5-1%) ligi uchun tobora kam foydalanilmoqda.
Bioballistik transformatsiyalar usuli.
Bioballistika usuli bugungi kunga kelib, bir pallalilar uchun eng samarali usullardan hisoblanadi, shuningdek, uni ikki pallali o'simliklarda ham muvaffiqiyat bilan qo'llash mumkin. Transformatsiya uchun dastlabki material sifatida kulturalar suspenziyasi, kallus to'qimasi yoki bir pallalilarning yetilmagan murtak o'simtalari olinadi. Mazkur usulning mohiyati shundan iboratki, diametri 0,6-1,2 mkm bo'lgan volfram, oltin yoki platina bo'lakchalari transformatsiya uchun zarur gen konstruksiyalari saqlovchi DNK ustidan purkaladi. DNK tutuvchi volfram, platina yoki oltin bo'lakchalari sellofan qobiq bilan o'ralib, bioballistik zambarak ichiga joylashtiriladi. Kallus yoki hujayra suspenziyasi agarli oziqa muhiti solingan Petri likopchasiga o'tkaziladi va bioballistik zambarak ro'parasiga 10-15 sm masofada joylashtiriladi. Zambarakdagi bosim vakuum nasos bilan 1,0 atm gacha tushiriladi. Bosim tushiriladigan vaqtda zambarakdan volfram yoki oltin bo'lakchalari otilib chiqib, hujayra devorini yorib o'tadi va sitoplazmaga, hujayra yadrosiga o'tadi.
Bioballistik zambaraklar yordamida bir pallali makkajo'xori, sholi, bug'doy, arpa o'simliklari transformatsiya qilinib, turg'un transgen o'simliklar olingan. Bundan tashqari, bioballistik transformatsiya DNK ni embriogen changchiga to'g'ridan-to'g'ri ko'chirib o'tkazish, transgen digaploid o'simliklar olish uchun qo'llaniladi va u seleksiya ishlarida muhim bosqich hisoblanadi. Bu usul bilan tamaki o'simligining transformatsiyasi amalga oshirilib, gaploid o'simliklar regeneratsiyasidan so'ng turg'un transformantlar olingan.
|