ábra - Amiloid -peptid által indukált komplement aktiváció gátlása kis molekulatömegű szintetikus vegyületekkel in vitro

16. ábra GAG1 gátló hatása a C1q nem-immunglobulin aktivátorokhoz való kötésére.
A kísérletek eredménye azt mutatta, hogy a vizsgált állati eredetű glikózaminoglikán gátolta a C1q és SAP kötését az A peptidhez, és csökkentette a SAP-indukálta sejtpusztulást is (Urbányi és mtsai, 2005).
6.5.2 RBI vegyületkönyvtár tesztelése a kötőhelyek különbözőségének igazolására
A vizsgált RBI könyvtár 640 farmakológiailag aktív vegyületet tartalmazott, és ezeket vizsgáltuk szilárd fázisú C1q kötési tesztekben.
3. táblázat A C1q A kötést leghatékonyabban gátló hét vegyület gátlási állandója
vegyület
|
IC50 [M]
|
célpont és hatás
|
benextramine
|
3
|
1/2 antagonista
|
calmidazolium
|
3
|
Ca-ATPáz inhibítor
|
methoctramine
|
2
|
M2 antagonista
|
milrinone
|
3
|
PDEIII inhibítor
|
NPC-15437
|
1
|
PKC inhibítor
|
tamoxifen
|
2
|
SERM
|
thioridazine
|
4
|
D1/D2 antagonista
|
A hét vegyület esetében közel megegyező gátlási állandókat kaptunk A, CRP és SAP esetében is (18. ábra). Továbbá a hét vegyület közül egy sem gátolta a C1q kötést ovalbumin-hoz kötött anti-ovalbumin IgG-hez. Az eredmény azt támasztotta alá, hogy a C1q molekulán két különböző kötőhely van a direkt aktivátorok, mint ACRP és SAP, valamint az IgG számára.
A B
17. ábra Három C1q kötési tesztben mért methoctramine (A) és NPC-15437 (B) gátlási görbék: A (kék), CRP (piros), SAP (világoskék). Az IC50 értékek a három kötési vizsgálatban nagyon hasonlóak, A esetében 2 M, illetve 1M.
6.6 C1q kötést gátló új szintetikus vegyületek
Új kémiai szerkezetek azonosítására a Társaság vegyülettárát vizsgáltuk a beállított C1q-A kötési teszttel. Háromszáznyolc olyan anyagot azonosítottunk, amelyek 1M koncentrációban 50%-nál nagyobb mértékben gátolták a C1q kötését A peptidhez. Ezek közül a vegyületek közül 56 gátolta a C1q kötését C-reaktív proteinhez (CRP), és 35 mielin bázikus fehérjéhez (MBP). Tökéletes átfedés volt a 35 és az 56 vegyület között (19. ábra). A háromszáznyolc vegyület között hét olyan vegyületet találtunk, amelyek jelentős (25%-nál nagyobb) mértékben gátolták a C1q kötését ovalbuminhoz kapcsolódott anti-ovalbumin IgG antitestekhez. A szelektivitási vizsgálatok eredményei megerősítették azt az elképzelésünket, hogy a C1q molekulán található IgG és direkt aktivátor (A, CRP, MBP) kötőhelyek különbözőek.
18. ábra A kötési vizsgálattal azonosított és szelektivitási esszékkel jellemzett találatok csoportosítása. A vegyülettár szkrínelésekor azonosított vegyületeket újramértük, majd a megerősített találatokat szelektivitási vizsgálatokkal jellemeztük. Háromszáznyolc vegyületet azonosítottunk, amelyek 1M koncentrációban 50%-nál nagyobb mértékben gátolták a C1q kötését A peptidhez. Ezek közül 56 gátolta a C1q kötését CRP-hez, és 35 MBP-hez. A 308 vegyület közül 7 vegyület gátolta 25%-nál nagyobb mértékben a C1q kötését ovalbuminhoz kapcsolódott anti-ovalbumin antitestekhez, de ezek közül egyik sem gátolta a C1q kötését más direkt aktivátorokhoz (Sárvári, Kósa és Pázmány, nem közölt eredmény).
A leghatékonyabb szerkezeti csoport kémiai optimalizálásával egy hatékony vezérmolekulát (lead) állítottunk elő. Először a vegyület hatékonyságát vizsgáltuk kötési tesztekben, és megállapítottuk, hogy a vezérmolekula hatékonyan gátolta a C1q kötést A peptidhez (19. ábra). Több nem-immunglobulin C1q aktivátor esetében is vizsgáltuk a vegyület hatását, és megállapítottuk, hogy gátolta a C1q kötést CRP-hez és MBP-hez is (19. ábra).
19. ábra A vezérmolekula jellemzése kötési vizsgálatokban. A vegyület mikromoláris koncentrációban csökkentette a C1q kötését különböző nem-immunglobulin C1q aktivátorok-hoz, mint A (fekete kör), CRP (fehér háromszög) és MBP (fehér kör). Nem tudtunk C1q kötést kimutatni a fordított A40-1 peptidhez (Sárvári és mtsai, 2003). A pontok hat független mérés átlagai, a mérést az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint végeztük.
A vegyület speciális kémiai szerkezete (apoláros jellege) miatt kiemelkedő fontosságú volt a szelektivitás kérdése. A kérdést a vegyület fehérje-fehérje kölcsönhatásokra gyakorolt hatásá-val vizsgáltuk.
|