Plazmidalar, restriktazalar

|
Plazmidalar, restriktazalar
|
bet | 9/14 | Sana | 27.05.2024 | Hajmi | 15,56 Mb. | | #255427 |
Bog'liq Gen muhandisligi mavzular to\'plamiPlazmidalar, restriktazalar. Bakteriya va tuban eukariot organizmlar hujayralarida asosiy xromosomadan tashqari, kichik ulchamga ega bo‘lgan xalkasimon yoki chiziksimon strukturaga ega bo‘lgan Qo‘shimcha xromosomalar mavjuddir, bu mini – xromosomalar plazmidalar deb ataladi. Plazmid DNKasi kupi bilan 3 – 10 tagacha genlarni uzida saklaydi. Bu genlar, asosan antibiotik yoki zaharli tosinlarni parchalovchi fermentlarni sinteziga javobgardir. Shu tufayli plazmidalar bakteriya, achitqi va zamburuglarning antibiotik va zaharli tokisnlarga chidamliligini ta’minlaydi. Plazmidning antibiotik parchalovchi genlari bir plazmiddan ikkinchisiga transpozonlar bilan birikkan xolatda ham ko‘chib uta oladi. Bu molekulyar jarayon kasal chakiruvchi mikroblarning antibiotiklarga chidamliligini nixoyatda oshiradi. Plazmidalar uz xususiyatiga kura ikkiga bo‘linali. Birinchisi transpozon yoki bakteriofag irsiy molekulasi kabi hujayra asosiy xromosomasining maxsus DNK izchilligini kesib, rekombinasiya bula oladigan plazmidlar. Bunday rekombinasiyalanuvchi plazmidalar transmissibl, ya’ni nasldan – naslga utuvchi plazmidalar deb ataladi. Transmissibl plazmid asosiy xromosomaga birikkandan keyin o‘z mustakilligini yukotadi.
Asosiy xromosomadan mustaqil ravishda o‘z – o‘zini replikasiya qila olmaydi. Ayni paytda bunday plazmidalarda joylashgan genlar asosiy xromosomada o‘z faoliyatini bajaradi. Hujayra bo‘linganda rekombinasiyalanuvchi plazmid genlar asosiy xromosoma genlari birikkan holda nasldan – naslga beriladi. Ikkinchi toifa plazmidlar avtonom holda replikasiyalanuvchi plazmidlar deb ataladi. Bunday plazmidlar asosiy xromosomaga birika olmaydi, asosiy xromosomalardan mustakil ravishda uz – uzini replikasiya yuli bilan unlab va xatto yuzlab marta ko‘paytira oladi. Avtonom plazmidlar orasida tasodifiy ravishda taksimlanadi. Shu bilan birga avtonom plazmid bir hujayradan ikkinchisiga hujayra qobig‘i va membranasining teshiklaridan uta oladi.
Tabiatda biror mikroorganizm hujayrasiga tashqaridan yot genetik material kirsa, u darxol hujayra nukleaza fermentlari orkali parchalab tashlanadi.
DNK molekulasini mayda bo‘laklarga buluvchi fermetlar endonukleazalar yoki restriktazalar deb ataladi. Har bir restriktaza turt yoki kuprok maxsus nukleotid juftlarni tanib olib bog‘lanadi va dNK molekulasini kesadi. Ayrim restriktazlar DNK kush zanjirini kaychi singari shartta ikki bo‘lakka bo‘ladi. Bunday retriktazalar Alu I, Dra I, Haye III, Hpa I, YecoR V, Hinc II, Pvu II, Rsa I, Sca I, Sma I va boshqalarini misol kilib keltirish mumkin.
Shu bilan birga kush zanjir DNK molekulasini «yopishkok» uchlar hosil kilib kesuvchi restiktazalar ham mavjud (Aat II, Acc III, Apa I, Bam HI, YecoRI, Hind III va boshqalar). Bu restriktazalar funksiyasi jixatdan transpozazaga uxshashligi kurinib turibdi. Shuning uchun ham bu restriktazalar hosil kilgan «yopishkok» uchlardan foydalanib, har xil DNK bo‘laklarini bir – biriga boglash osonlashadi. Ana shu xususiyati tufayli bu xil restriktazalar gen muxandisligida keng qo‘llaniladi. Xozirgi kungacha 500 dan ortik xilma xil restriktazalar tozalanib olingan va o‘rganilgan.
Odatda mikroorganizm irsiy moddasining xromosomasi bir nechta million nukleotid juftlari izchilligidan iborat. O‘simlik yoki hayvon genomi bir necha yuz milliondan to 1 milliardgacha nukleotid juftlari izchilligidan tuzilgan.
Bunday buyuk molekulani yuqorida kayd qilingan xilma – xil restriksion endonukleazalardan foydalanib kuplab bo‘laklarga bo‘lish mumkin. Endonukleaza ishtirokida parchalangan DNK bo‘laklari elektroforez moslamasida maxsus molekulyar «elak» teshiklaridan yuqori kuchlanishli elektr maydoni ta’sirida molekulaning zaryadi va ulchamiga binoan ajratiladi. DNK bulagi maxsus buyok bilan buyash natijasida ultrabinafsha nurlari yordamida oddiy kuz bilan kuriladi. DNK ning mayda bo‘laklari elektr maydonida gel kovaklaridan yirik bo‘laklarga nisbatan tez harakat kilgani uchun ularning startdan bosib utgan masofasini ulchab DNK bulagining katta – kichikligi aniklanadi. Elektroforez moslamasida bir – biridan faqat bir nukleotid kam yoki kupligi bilan farklanuvchi DNK bulagini ajratish mumkin. Restriksion endonukleaza fermentlarining ochilishi va elektroforez moslamasida DNK bo‘laklarini uta aniklik bilan bir – biridan ajratishning takomillashuvi gigant DNK molekulasidan istalgan DNK bulagini ajratib olish imkonini beradi.
Rekombinat DNK hujayraga utkazishda vektorlardan foydalaniladi. Kuchirilgan genlar doimo ham ishlab ketavermaydi. U hujayra DNK siga kushilib, replikasiya bo‘lish yoki mustakil ravishda replikasiyalanishi kerak.
Vektorlar- bu DNK molekulalari bo‘lib begona genlarni uzlarida biriktirib replikasiya kilish va transformasiya (kuchirish) xususiyatiga ega bo‘lishi kerak. Vektor sifatida plazmidalar, bakteriofaglar, mobil elementlar, hayvon viruslari bo‘lishi mumkin.
Xozirgi kunda vektorlar foydalanishiga karab bir necha guruxga bo‘linadi:
klonlashtirishda foydalaniladigan vektorlar. Bu bakteriya plazmidalari, faglaridan foydalaniladi, ular DNK replikasiyasini ko‘paytiradi. Masalan, sun’iy bakteriya (VAS), va achitqi (UAS) xromosomalari genom fragmentlarini klonlashda foydalaniladi.
ekspressiya vektorlar – Bular genlar ketma-ketligi va oqsil tarkibini aniqlashda ishlatiladi.
Transformasiya vektorlar - Begona genli DNK fragmentlarini resipiyent genomiga kuchirishda ishlatiladi.
Birinchi vektor bakteriyalardan olingan Ye coli hujayralariga begona DNK fragmentlarini kuchirishda plazmidalardan foydalanib, hujayraga kuyishda elektroporasiya yoki «kalsiyevogo shok» usulda utkaziladi. Ikki usulda ham bakteriya membranasi utkazuvchanligi oshadi.
Klonlashda bakteriya plazmasida foydalaniladi. Bakteriya hujayrasi xromosoma DNK ni saklaydi. Ular katta bo‘lmagan (1-25 t.n.p) xalkali DNK molekulasiga ega. Bunda xalkali DNK molekulalari plazmidalar deb yuritiladi. Plazmidalar vektor sifatida 1973 yilda P.Berg laboratoriyasida birinchi ishlatilgan. E.coli p SC 101 plazmida (-9.m.n.p) tetrosiklin antibiotikka bardoshli genni uzida saklaydi. U E. coli I fragment bilan kushilib, DNK ligaza fermenti yordamida begona gen pSC 101klon ulanib rekombinat molekula olinadi. Sungra rekombinat plazmidaga Ye coli hujayrasi kushilib bakteriya hujayrasiga kiritiladi. Rekombinat plazmida tetrosiklin muxitida selektiv tanlab olinadi. Bu gen injeneriyasida ilk tajribalardan bo‘lgan.
Genlarni kuchirishning ikki usuli mavjud bo‘lib ular bevosita va bilvosita xisoblanadi.Genlarni bevosita kuchirishda DNK malekulalaridan eritmalar tayyorlanib maxsus mikroigna orkali organizmlarning uruglangan tuxum hujayralariga va o‘simliklarda esa murtak xaltasiga kuyiladi. Organizlarda uruglangan tuxum hujayralar ikki xaftalik davrida yani RNK sintezi boshlanmasdan genlar utkazilishi kerak. Shunda kuchirilgan genlar DNK sinteziga kushilib ketishi mumkin ekan.
Genlarni bilvosita usulda kuchirishda genlar oldin maxsus plazmidalar (vektorlarga)ga ulanib sun’iy muxitda klanlanib tekshiriladi va bir necha yullar bilan utkaziladi.Odamlar va hayvonlarda genlar to‘g‘ridan to‘g‘ri vektorlar yordamida mikroine’ksiya kilish yuli bilan tuxum hujayraga kuchiriladi.O‘simliklarda esa lizosamaga yigish, elektroporasiya, mikroine’ksiya, minihujayralar yordamida, biolistika protoplastlarni kushish usullaridan foydalanib utkaziladi.Ushbu usullardan keng tarkalgani vektorlar yordamida mikroine’ksiya va protoplastlarni qo‘shish, minihujayralar yordamida o‘tkazish hisoblanadi.
|
| |