Dlouhé a krátké geny - MolekuláRNĚ genetická diagnostika deficitu c4 složky komplementu

Dlouhé a krátké geny C4
Při sestavování genomové mapy MHC III byla odhalena rozdílná délka sekvencí kódujících geny C4A a C4B. Gen C4A byl o 6-7 kb delší než gen C4B (Carroll et al., 1984). Tato rozdílnost je způsobena začleněním 6,4 kb dlouhé sekvence do intronu 9, čímž se původní délka krátkého genu (short) z 14,6 kb prodlouží na délku 21 kb charakteristickou pro dlouhý gen (long). Tato začleňující se sekvence byla v r. 1994 charakterizována jako nová endogenní retrovirová struktura HERV-K s opačnou transkripční orientací (Tassabehji et al., 1994).
Z různých studií vyplývá, že zatímco gen C4A je vždy dlouhý gen, tedy gen se začleněným retrovirem HERV-K, pouze dvě třetiny genů C4B jej obsahují také (Blanchong et al., 2000; Lee et al., 2006).
2. 2. Jednotka RCCX
Gen C4 spolu se sousedními třemi geny tvoří na chromozomu 6 tzv. RCCX jednotku. Na telomerovém konci (5´ konci) se nachází gen pro serin/threonin kinázu (RP), následuje gen C4, gen pro steroidní 21-hydroxylázu (CYP21) a na centromerovém konci (3´ konci) je lokalizován gen pro extracelulární matrixový protein tenascin X (TNX). Ve většině případů se jednotka RCCX na chromozomu opakuje dvakrát, může tam být ovšem zastoupena jednou až čtyřikrát (Obr. 4) (Chung et al., 2002). Při zdvojení nebo i ztrojení jednotky dochází u duplikovaných genů CYP21 a TNX nacházejících se na první jednotce RCCX a genů RP lokalizovaných na dalších jednotkách RCCX k mutacím, které způsobují buď vytváření nefunkčních produktů nebo v jejich důsledku k syntéze proteinů vůbec nedochází (Yang et al., 1999).
Obr. 4. Složení dvoujednotkové RCCX. První jednotka obsahuje dlouhý gen C4A, druhá jednotka zahrnuje krátký gen C4B (Chung et al., 2002, upraveno).
2. 2. 1. Gen RP
Gen RP je lokalizován na telomerové části jednotky RCCX. Má délku 12,1 kb a obsahuje 9 exonů o délce 1,6 nebo 1,8 kb (kódujících 258 nebo 364 aminokyselin). Gen RP první jednotky RCCX (na 5´ konci) je označovaný jako RP1 a zachovává si svou funkci. Tato varianta genu kóduje 364 aminokyselin. Geny dalších RCCX jednotek jsou označované jako RP2 a právě u nich dochází k delecím přibližně 200 bp, kódují tedy 258 aminokyselin. Tím ztrácí svou funkci, ale jsou stále přítomné v genomu (Shen et al., 1994).
2. 2. 2. Gen CYP21
Gen CYP21 je dlouhý přibližně 3,4 kb a obsahuje 10 exonů (Rowen et al., 1997). Oproti genu RP se nefunkční variantou stává gen na první jednotce RCCX. Tato varianta je označovaná jako pseudogen CYP21A a je charakterizována především inzercí 1 bp, delecí 8 bp a transiční mutací, což vede k předčasnému ukončení translace (Higashi et al., 1986). Tento pseudogen navíc obsahuje množství bodových mutací v kódujících i nekódujících oblastech. Funkční varianta genu je označována jako CYP21B a je lokalizovaná na centromerovém konci (3´ konci) poslední jednotky RCCX (Carroll et al., 1985a).
2. 2. 3. Gen TNX
Tento gen je dlouhý 68,2 kb a obsahuje celkem 45 exonů (Rowen et al., 1997). Funkční gen je stejně jako gen CYP21 označována písmenem B, nefunkční písmenem A. TNXA zahrnuje částečně duplikovaný úsek, který odpovídá oblasti od intronu 32 až po exon 45 genu TNXB. Na ztrátě funkce se podílí i delece 121 bp v exonu a intronu 36 (91 bp z 3´ konce exonu 36 a 30 bp z intronu 36) (Gitelman et al., 1992).
2. 2. 4. Varianty RCCX jednotek
Různé varianty RCCX jednotek jsou dány jejich počtem na chromozomu, kombinací přítomných genů C4A a C4B a v neposlední řadě také jejich délkou.
Podle počtu přítomných jednotek RCCX můžeme rozlišit 4 různé haplotypy, které jsou tvořené jednou, dvěma, třemi nebo čtyřmi jednotkami. Nejrozšířenější je haplotyp se dvěma jednotkami představující přibližně 73 % všech haplotypů, následuje haplotyp s jednou jednotkou (15 %) a se třemi jednotkami (10 %) (Blanchong et al., 2000; Yang et al., 2003). Poslední haplotyp se čtyřmi jednotkami je velmi vzácný, vyskytuje se pouze u jedinců s imunitní chorobou (Chung et al., 2002).
Při určování diploidní sady chromozomů byla nejzastoupenější variantou dvoujednotková sestava RCCX nacházející se na obou chromozomech (48 %) následovaná kombinací jedné a dvou jednotek (25 %) a dvou a tří jednotek na chromozomech (17 %) (Obr. 5). Zbývajících 10 % tvořily varianty jedné a tří jednotek nebo dvou tříjednotkových sestav (Blanchong et al., 2000).
1. 1 jednotka / 1 jednotka
2. 1 jednotka / 2 jednotky
3. 2 jednotky / 2 jednotky
4. 2 jednotky / 3 jednotky
5. 3 jednotky / 3 jednotky
6. 1 jednotka / 3 jednotky
Obr. 5. Procentuální zastoupení variant počtu jednotek RCCX v diploidní sadě chromozomů (Blanchong et al., 2000, upraveno).
Detailním složením jednotek RCCX z hlediska genů C4 v genomu se zabývaly dvě populační studie. V roce 2000 byla publikována studie maďarské populace (Blanchong et al., 2000) a v r. 2003 studie bělošské americké populace pocházející z Ohia (Yang et al., 2003). V obou případech bylo dosaženo obdobných výsledků (Tab. 4 a 5).
Při porovnávání počtu genů C4 na obou chromozomech je patrné, že nejrozšířenější jsou čtyři kopie (52 – 65 %), následované třemi (23 %) a pěti (12 – 17 %). V diploidní sadě chromozomů je gen C4A zastoupen až pětkrát, gen C4B až čtyřikrát. Obě alely jsou v diploidní sestavě chromozomů nejčastěji zastoupené dvakrát (46 – 57 % u C4A, 53 – 70 % u C4B) (Tab. 4) (Blanchong et al., 2000; Yang et al., 2003). Počet genů C4A a C4B v populaci je téměř vyrovnaný, gen C4A se vyskytuje přibližně o 5 % častěji (Blanchong et al., 2000).
Tab. 4. Srovnání dvou populačních studií – maďarské (150 zdravých lidí) a americké bělošské (128 zdravých lidí) populace (Blanchong et al., 2000; Yang et al., 2003, upraveno).
-
Maďarsko Ohio
počet frekvence počet frekvence
|
Počet genů C4 v diploidním genomu
2 2 0,016 3 0,020
3 27 0,211 38 0,253
4 84 0,656 78 0,520
5 15 0,117 26 0,173
6 0 0 5 0,033
celkem 128 1,0 150 1,0
počet genů C4 na diploidní genom 3,88 3,95
Počet genů C4A v diploidním genomu
0 2 0,016 1 0,007
1 26 0,203 30 0,200
2 73 0,570 69 0,460
3 24 0,188 44 0,293
4 3 0,023 5 0,033
5 0 0 1 0,007
celkem 128 1,0 150 1,0
počet genů C4A na diploidní genom 2,05 2,17
Počet genů C4B v diploidním genomu
0 1 0,008 3 0,020
1 26 0,203 48 0,320
2 90 0,703 80 0,533
3 10 0,078 18 0,120
4 1 0,008 1 0,007
celkem 128 1,0 150 1,0
počet genů C4B na diploidní genom 1,88 1,77
|
Z hlediska kombinace alel C4A a C4B je nejzastoupenější haplotyp C4A/C4B pokrývající přibližně 86 % dvoujednotkových RCCX (tj. přibližně 63 % všech variant RCCX). Zbývající isotypy vzniklé konverzí genů C4B v C4A a naopak tvoří přibližně 13 % (C4A/C4A) a necelé 1 % (C4B/C4B) (Blanchong et al., 2000). Princip konverze genu C4B v C4A byl objasněn v roce 1990 analýzou nulových alel. V publikované studii byla prokázána přítomnost specifické sekvence nedeletované alely C4A i u nedeletovaných nulových alel C4B. To je důkazem vzniku nulové alely C4B konverzí genu C4B v C4A. U genu C4A přítomnost mutace v této sekvenci demonstruje přeměnu genu v pseudogen. Objev mechanismu konverze C4B v C4A může být vysvětlením toho, proč bývá nalézán gen C4A i v druhém lokusu jednotek RCCX, který je většinou obsazována genem C4B (Braun et al., 1990).
V případě tříjednotkových variant RCCX se v genomu objevují s přibližně stejným zastoupením sedmi procent haplotypy C4A/C4A/C4B a C4A/C4B/C4B (Blanchong et al., 2000).
Při porovnávání frekvence dlouhých a krátkých C4 genů bylo prokázáno, že přibližně 77 % genů je dlouhých (Tab. 5), přičemž v první jednotce RCCX je vždy gen dlouhý (Blanchong et al., 2000; Chung et al., 2002; Lee et al., 2006) s výjimkou velmi vzácné kombinace dvou krátkých genů ve dvoujednotkové RCCX, která se častěji vyskytuje u některých jihoamerických kmenů (Weg-Remers et al., 1997) nebo čtyřjednotkové SLSL. Posledně zmiňovaná varianta spolu s haplotypem LLLL se vyskytuje pouze u jedinců s imunitní chorobou (Chung et al., 2002).
Kromě popsaných variant byly prokázány mnohem častější kombinace dlouhých a krátkých genů vyskytující se u zdravé populace i nemocných osob. Nejzastoupenějšími variantami jsou LL (téměř 50 %) a LS (25%) (Tab. 5) (Blanchong et al., 2000; Yang et al., 2003).
Tab. 5. Srovnání dvou populačních studií – maďarské (150 zdravých lidí) a americké bělošské (128 zdravých lidí) populace (Blanchong et al., 2000; Yang et al., 2003, upraveno).
-
Maďarsko Ohioa
počet frekvence počet frekvence
|
Dlouhé a krátké geny C4
L geny 384 0,774 450 0,762
S geny 112 0,226 140 0,237
Celkem 496 1,0 590 1,0
Varianty dlouhých (L) a krátkých (S) genů C4
S 22 0,086 32 0,107
L 12 0,047 18 0,060
LL 128 0,500 138 0,460
LS 74 0,289 70 0,233
LLL 10 0,039 22 0,073
LSL 1 0,004 1 0,003
LSS 7 0,027 19 0,063
Lx* 2 0,008 0 0,000
Celkem 256 1,0 300 1,0
|
* nezjištěno kvůli TaqI RFLP na 5´ konci druhého genu C4
Při porovnávání diploidních sad chromozomů byly prokázány jako nejčastější varianty LL/LS (20,7 %) a LL/LL (19,3 %). Třetí nejrozšířenější kombinací je LL/S (12,0 %). Zbylé diploidní kombinace haplotypů se vyskytují s frekvencí přibližně od 0,5 % do 8,5 % (Obr. 6). Navíc bylo při studiu diploidních sad chromozomů prokázáno, že 90,4 % zdravé populace má ve svém genomu alespoň jeden chromozom s dvoujednotkovou strukturou, 31,3 % mělo alespoň jeden chromozom s jednojednotkovou strukturou a 24,6 % s tříjednotkovou strukturou. Ve stejné studii byla také prokázána heterozygotní kombinace u téměř 70 % diploidních genomů (z hlediska počtu modulů RCCX a/nebo velikosti genů C4) (Blanchong et al., 2000).
1. LL/LS
2. LL/LL
3. LL/S
4. LL/L
5. LS/LS
6. LSS/LL
7. LLL/LS
8. LLL/LL
9. LSS/S
10. LS/S
11. LLL/LLL
12. LS/L
13. L/S
14. S/S
15. LSS/LSS
16. LLL/LLS
17. LLL/S
Obr. 6. Procentuální zastoupení variant jednotek RCCX z hlediska počtu jednotek a velikosti genu C4 v diploidní sadě chromozomů (Blanchong et al., 2000, upraveno).
2. 3. Deficience C4 složky komplementu
V populaci se vyskytují dva genotypy způsobující nedostatek proteinu C4. Genotyp C4AQ0 vede k deficienci proteinu C4A a genotyp C4BQ0 způsobuje deficienci proteinu C4B. V obecné populaci se deficientní fenotyp objevuje s frekvencí 31,6 %. Fenotyp C4AQ0 je u zdravé populace nejčastěji podmíněn delecí celého genu C4A (12 %), konverzí (0,67 %) anebo inzercí 2 bp (0,67 %). Fenotyp C4BQ0 je většinou způsoben konverzí (13,3 %), ale také delecí celého genu C4B (5%) (Blanchong et al., 2000).
Nedostatek C4 složky komplementu může být částečný anebo úplný. Může se týkat pouze alely C4A nebo C4B, ale i obou společně. Úplná deficience zpravidla vykazuje silnou asociaci se vznikem závažných autoimunitních onemocnění (např. systémový lupus erythematodes – SLE), u částečných deficiencí je popisována zvýšená vnímavost ke vzniku některých, zejména imunitních chorob.
V následujících kapitolách týkajících se deficience C4 složky komplementu jsou popisovány mutace odhalené u pacientů s imunitním onemocněním.
2. 3. 1. Deficience C4A
Mezi nejčastější mutace vyskytující se u pacientů s imunitní chorobou a způsobující nedostatek proteinu C4A se řadí inzerce. V roce 1993 byly studovány genomy 12 lidí s homozygotní C4A deficiencí (deficiencí C4A na obou chromozomech). V 10 případech byla objevena inzerce 2 bp (TC) v řetězci alfa mezi nukleotidy na pozicích 5880 a 5881 v exonu 29 způsobující vytvoření předčasného terminálního kodónu v exonu 30. Tento typ mutace se vyskytoval u 7 jedinců s haplotypem HLA-B60-DR6 (Barba et al., 1993). Stejná mutace byla v r. 1999 prokázána u finské pacientky trpící SLE, kde byla doprovázena stejnou mutací v genu C4B (Lokki et al., 1999), nebo v r. 2002, kdy byla tato mutace spojená s haplotypem HLA-A2-B12-DR6 (Rupert et al., 2002).
Druhým typem mutací způsobující vznik nulové alely C4A jsou delece. Ty mohou postihnout několik bp, část genu nebo i celý gen (spolu s genem CYP21A). V roce 1985 byla prokázána rozsáhlá delece 28 – 30 kb postihující právě část genu C4A a pseudogen CYP21A (Carroll et al., 1985b). U pacientů trpících SLE je tato delece často spojená s haplotypem HLA-B8-C4AQ0-C4B1-DR3 (Kemp et al., 1987; Grant et al., 2000). Později byla popsána úplná deficience proteinu C4, kdy na maternálním chromozomu pacienta trpícího SLE byla objevena dosud neznámá delece 1 bp (C3318) v exonu 20 genu C4A, způsobující předčasné vytvoření stop kodonu na konci exonu 20, a na paternálním chromozomu tohoto pacienta byla prokázána již známá inzerce 2 bp v exonu 29. Tento pacient tedy trpěl úplnou deficiencí C4A (Fredrikson et al., 1998). V r. 2004 byla publikována studie, ve které byla popsána opět nová delece u pacientů trpících úplnou deficiencí C4A – delece 2 bp (GT) v exonu 13 genu C4A. Byla spojená s haplotypem HLA-A24-B38-DR13 (Yang et al., 2004).
2. 3. 2. Deficience C4B
Jako příčiny nedostatku C4B proteinu byly zatím objeveny pouze delece a pravděpodobně i konverze genu C4B v gen C4A.
V r. 2002 byl publikován objev delece cytosinu v kodonu 522 exonu 13 molekuly C4B (Rupert et al., 2002). O dva roky později byly u 4 pacientů se SLE s homozygotním haplotypem HLA-A30-B18-DR7 prokázány bodové intronové mutace způsobující právě úplnou deficienci proteinu C4B. Tito pacienti měli neobvyklou RCCX strukturu, která byla tvořena dvěma krátkými geny C4B, za kterými následovaly geny CYP21B. V obou genech C4B bylo objeveno 9 stejných intronových mutací, z nichž nejzávažnější byla substituce guaninu za adenin (na pozici 8127) v intronu 28. Tato substituce pravděpodobně způsobila chybu při sestřihu RNA (Yang et al., 2004).
Jako příčina úplné deficience C4B složky komplementu byla prokázána u finského pacienta delece genu C4B na maternálním chromozomu a konverze genu C4B v C4A na paternálním chromozomu. Pacient měl v tomto případě plně funkční první gen C4A paternálního chromozomu, ale druhý gen C4A se zde vyskytoval jako pseudogen (Jaatinen et al., 2003).
2. 3. 3. Úplná deficience C4A a C4B
Tento typ deficience se vyskytuje především u pacientů trpících SLE. V r. 2002 byla publikována studie, ve které byla zjišťována molekulární podstata úplné deficience C4A a C4B složky komplementu u pacienta trpícího právě tímto onemocněním. Daný pacient měl homozygotní C4A (dlouhý) a C4B (krátký) mutantní gen. V případě genu C4A byla prokázána již dříve objevená inzerce 2 bp v exonu 29. V genu C4B byla detekována delece cytosinu (v kodonu 522) v exonu 13 (Rupert et al., 2002).
Jiná příčina úplné deficience C4A a C4B byla u finské pacientky. Deficience proteinu C4A i C4B byla způsobena inzercí 2 bp v exonu 29. To, že se v obou genech vyskytovala stejná mutace, je vysvětlováno tím, že gen C4B poměrně snadno podléhá konverzi, tzn. dochází u něj k přejímání specifických sekvencí z genu C4A (Lokki et al., 1999).
2. 3. 4. Kombinovaná deficience C4
Deficience C4 složky komplementu může být i v kombinaci s deficiencí jiných složek komplementu – nejčastěji se složkou C2. Předpokládá se, že u bělošské populace je frekvence této kombinované heterozygotní deficience přibližně 0,001, čímž se stává jednou z nejčastějších genetických abnormalit v lidském komplementovém systému (Hartmann et al., 1997).
Deficience C2 složky komplementu je dvojího typu – typu I a typu II. Pro typ I je charakteristická absence proteinu C2 způsobená nulovou alelou C2Q0 vzniklé v důsledku delece 28 bp (9 bp z exonu 6 a 19 bp z následujícího intronu 6). Vlivem mutace dochází k vytvoření předčasného terminálního kodonu, v syntetizovaném proteinu C2 chybí exon 6 a celá molekula se tak stává nefunkční (Johnson et al., 1992a). Tento typ mutace je převážně spojený s haplotypem HLA-C4-A4-B2 (Awdeh et al., 1981).
Naproti tomu, typ II se vyznačuje selektivní poruchou v sekreci proteinu C2 (Johnson et al., 1992b). Vyskytuje se spolu s 2 rozdílnými haplotypy MHC. U haplotypu HLA-A2-B5-DRw4 dochází k nukleotidové substituci na pozici 1930 (adenin za guanin) měnící smysl čtení, kdy je zaměněna aminokyselina na pozici 444 (arginin za glycin). Druhý haplotyp HLA-A11-B35- -DRw1 je spojen se stejnou mutací na pozici 566 (thymin za cytozin) měnící aminokyselinový zbytek na pozici 189 (serin na fenylalanin). Především druhá mutace způsobuje inhibici sekrece proteinu C2 (Wetsel et al., 1996).
Typ I je u kombinovaných deficiencí C2 s C4 prokázán u obou nulových alel genu C4 – C4AQ0 i C4BQ0. Nebylo prokázáno, že by kombinovaná deficience C2 a C4 přímo způsobovala nějaké onemocnění, nicméně 5 z 15 studovaných lidí bylo postiženo autoimunitním onemocněním (Hartmann et al., 1997).
2. 3. 5. Nemoci spojené s deficiencí C4 složky komplementu
Mezi nemoci, u kterých je popisována deficience proteinu C4, se především řadí systémové choroby, při kterých dochází k ukládání neodbouraných imunokomplexů do tkání, čímž způsobují záněty a jejich poškození nebo i nekrózy (Fučíková, 1997). Deficience C4 byla referována také jako rizikový faktor vzniku infekčních onemocnění.
Kromě imunologických chorob byly zjištěny deficience proteinu C4 i u některých psychických onemocnění a poruch.
Deficience C4 může také ovlivňovat průběh nemoci, jak je tomu např. u syndromu získaného imunodeficitu (AIDS) (Just et al., 1995).
U jednotlivých poruch se mohou vyskytovat samotné deficience C4A nebo C4B proteinů, ale může zde být zastoupena i deficience obou isoforem, popř. může být deficience kombinovaná s jinou složkou komplementu (např. C2 nebo C3).
Deficience C4 nemusí být zastoupena u všech pacientů trpících daným onemocněním, přesto jsou u pacientů nalézány nulové alely genů C4A nebo C4B ve zvýšeném množství a pravděpodobně napomáhají vzniku nebo urychlují rozvoj dané choroby. U žádného z onemocnění není deficience proteinu C4 jeho hlavní ani jedinou příčinou.
Systémová onemocnění
Systémový lupus erythematodes
SLE je chronické zánětlivé systémové onemocnění postihující z 90 % ženy. Je podmíněno nadměrnou tvorbou a ukládáním imunokomplexů do tkání (z 80 % do kůže). Mezi nejčastější počáteční projevy této nemoci patří artralgie, horečka, Raynodův fenomén a přecitlivělost kůže na sluneční světlo. V pozdějším stádiu se v obličeji vytváří typický motýlovitý erytém (Fučíková, 1997).
Díky genetickým studiím bylo doposud odhaleno 8 lokusů zodpovídajících za tvorbu proteinů nebo receptorů účastnících se imunitní odpovědi a mající přímou souvislost s rozvojem SLE. Jedním z těchto lokusů je i oblast MHC III na chromozomu 6p21, kde se nachází geny pro komplementové proteiny C2, C4 a faktor B. Bylo prokázáno, že 40 – 60% pacientů se SLE má homozygotní nebo heterozygotní deficienci genu C4A, a to nezávisle na etnickém původu. Asociace s nulovými alelami C4B je výrazně slabší. Zdá se, že deficience C4A znamená genetickou predispozici ke vzniku SLE (Wong and Tsao, 2006). V některých případech se jednalo i o kombinovanou deficienci komplementových proteinů C4 s proteiny C2 (Hartmann et al., 1997).
Feltyho syndrom
Feltyho syndrom je aktivní forma revmatoidní artritidy, která je doprovázena zvětšením sleziny, lymfatických uzlin, anémií, nedostatkem krevních destiček a neutrofilních granulocytů. Postihuje především mladé osoby (Fučíková, 1997).
V roce 1988 bylo prokázáno zvýšené riziko onemocnění Feltyho syndromem u lidí trpících revmatoidními obtížemi a majících v genomu nulovou alelu C4B (Thomson et al., 1988). Tato náchylnost byla potvrzena i o dva roky později, kdy u více než poloviny lidí s Feltyho syndromem byla prokázána přítomnost C4BQ0 v genomu (Hillarby et al., 1990).
Henochova-Schönleinova purpura
Henochova-Schönleinova purpura (HSP) je zánět cév způsobený pravděpodobně cirkulací imunokomplexů IgA (Levinsky and Barratt, 1979) a jejich ukládáním do cévního endotelu kožních cév a ledvinného mesangia (Faille-Kuyber et al., 1973). Vyskytuje se především u dětí a mladistvých, u kterých se projevuje kožní purpurou (jasnými červenými lézemi) obvykle na dolních končetinách, bolestmi kloubů a břicha, případně krvácením z trávicího ústrojí a nefritidou (Fučíková, 1997).
U pacientů trpících HSP byla prokázána zvýšená frekvence C4BQ0 (25 %) ve srovnání s kontrolní populací (11 %, p = 0,002) (Stefansson Thors et al., 2005).
Systémová sklerodermie
Systémová sklerodermie je chronické onemocnění charakterizované zvýšenou produkcí vaziva a změnami cév postihující především kůži, zažívací trakt, plíce, srdce a ledviny (Štork, 1996). Nemoc se projevuje postupným tuhnutím a atrofií kůže (Fučíková, 1997).
U této nemoci byla prokázána spojitost s nulovými alelami C4A (Briggs et al., 1993).
Infekční onemocnění
V r. 1989 byla prokázána asociace úplné deficience C4B s bakteriálními meningitidami u dětí. U 5 ze 46 (10,9 %) nemocných dětí se vyskytovala homozygotní deficience C4B, zatímco u kontrolního vzorku 223 zdravých dětí bylo objeveno pouze 7 úplných deficiencí C4B (3,1 %; p = 0,038) (Rowe et al., 1989).
Souvislost úplné deficience C4B s infekčními onemocněními byla prokázána i u finské pacientky, která trpěla opakujícími se meningitidami, fistulami a abscesy. Na maternálním chromozomu byla odhalena rozsáhlá delece postihující mj. gen C4B, na paternálním chromozomu byla prokázána konverze genu C4B v gen C4A (Jaatinen et al., 2003).
Imunodeficience
Syndrom získaného imunodeficitu
Syndrom získaného imunodeficitu (AIDS; acquired immunodeficiency syndrome) je nejzávažnější forma získaného imunodeficitu. Je způsobena retrovirem HIV (human immunodeficiency virus), který se váže především na receptory T-buněk a makrofágů a způsobuje snižování počtu těchto buněk v organismu (Fučíková, 1997).
Přítomnost nulové alely C4A snižuje délku přežití lidí s virem HIV. Dětští mositelé nulové alely C4A nebo haplotypu HLA-DR3 (DRB1*0301-DQB1*0201-DQA1*0501) mají vyšší riziko vzniku encefalitid a úmrtí do 2 let věku než děti, které uvedený haplotyp nemají (Just et al., 1995).
Psychická onemocnění
U psychických onemocnění byly prokázány pouze nulové alely genu C4B. U autistických pacientů se alela C4BQ0 vyskytovala v haplotypu více než dvakrát častěji ve srovnání se zdravou populací (Odell et al., 2005). U dětí s poruchou koncentrace a hyperaktivitou se prokazatelně vyskytovaly snížené hladiny proteinu C4B v séru. Zajímavé bylo, že matky těchto dětí měly ve srovnání s matkami zdravých dětí také sníženou hladinu tohoto proteinu (Warren et al., 1995).
U pacientů trpících schizofrenií byla nejdříve prokázána zvýšená frekvence nulových alel C4BQ0 (Rudduck et al., 1985), nicméně pozdější práce tuto souvislost nepotvrdila (Schroers et al., 1997).
3. Metody detekce deficitu C4 složky komplementu
Pro kvalitativní nebo kvantitativní stanovení proteinů v krevním séru se využívají různé imunochemické metody založené na reakci protilátky s antigeny za vzniku imunokomplexu. Aglutinační reakce využívá reakce solubilních protilátek s antigenem. Precipitační reakci podléhají solubilní antigeny se specifickými protilátkami. Stanovení přítomnosti nebo množství proteinu C4 se nejčastěji provádí radiální imunodifúzí (RID) nebo měřením zákalu, a to nefelometricky (měřením intenzity difúzně rozptýleného světla) nebo turbidimetricky (sledováním poklesu intenzity záření procházejícího roztokem v přímém směru) (Krejsek and Kopecký, 2004).
Stanovit deficit C4 složky komplementu lze na úrovni proteinů nebo na úrovni nukleové kyseliny. Nízká hladina proteinu C4 v séru může znamenat primární (vrozený) nebo sekundární (získaný) deficit, zatímco stanovení přítomnosti nulových alel pomocí analýzy DNA odhalíme právě jen vrozenou poruchu. Sekundární deficit může být způsoben sníženou tvorbou proteinu např. při autoimunitních chorobách nebo při onemocněních jater nebo může být zapříčiněn zvýšenou konsumpcí např. při imunokomplexových chorobách (Yang et al., 2003).
3. 1. Stanovení deficitu C4 složky komplementu na úrovni proteinů
Stanovení deficitu C4 složky komplementu na úrovni proteinu se v praxi nejčastěji provádí sérologickými metodami, tzn. RID, turbidimetricky nebo nefelometricky. Pro přesnější stanovení deficitu C4 je možné využít některou z následujících molekulárně biologických metod, díky kterým lze kromě přítomnosti nulových alel určit i jednotlivé alotypy proteinu C4.
3. 1. 1. Gelová elektroforéza
Gelová elektroforéza se využívá pro stanovení alotypů C4 složky komplementu na úrovni proteinů a lze s její pomocí stanovit i přítomnost skrytých nulových alel.
Při této metodě jsou jednotlivé alotypy proteinu C4 v agarózovém nebo polyakrylamidovém gelu rozděleny na základě jejich výsledného elektrického náboje, isoelektrického bodu a molekulové hmotnosti (Krejsek and Kopecký, 2004). Při použití polyakrylamidového gelu se ke zviditelnění proteinů využívají specifická barviva (např. stříbro nebo coomassie briliantová modř).
Protein C4 na gelu vytváří tři proužky, které mohou často splývat a překrývat se. Jsou způsobené C-koncovými basickými aminokyselinami (lysin, arginin) na řetězcích alfa a beta molekuly C4. Pro odstranění tohoto nežádoucího efektu se ke vzorkům přidávají specifické enzymy neuraminidáza (Awdeh and Alper, 1980) nebo karboxypeptidáza (Sim and Cross, 1986), které odstraní tyto C-koncové aminokyseliny a na gelu je následně vidět dobře rozlišitelný proužek charakterizující příslušny alotyp.
Přítomnost skryté nulové alely se projevuje přinejmenším o polovinu slabší intenzitou proužku reprezentující isotyp (C4A nebo C4B) s nulovou alelou (Sim and Cross, 1986).
3. 1. 2. SDS-PAGE
Pro přesnější rozlišení isotypů C4A a C4B je možné použít variantu gelové elektroforézy v polyakrylamidovém gelu s dodecyl sulfátem sodným (SDS-PAGE).
K roztoku proteinu je před nanesením na gel přidán detergent SDS, který se naváže na proteiny a denaturuje je. Počet navázaných SDS je úměrný molekulové hmotnosti proteinu, což zajišťuje po spuštění elektroforézy v elektrickém poli ekvivalentní hustotu náboje vzhledem ke hmotnosti daného proteinu. Jednotlivé proteiny jsou tedy rozděleny na základě jejich molekulové hmotnosti. K jejich obarvení se využívá přímé barvení v gelu nebo specifické protilátky.
Isotypy C4A a C4B se liší molekulovou hmotností řetězců alfa, což zajišťuje vizuální rozlišení těchto proteinů na gelu. Řetězec alfa molekuly C4A má molekulovou hmotnost (Mr) 96 000, řetězec alfa isotypu C4B má Mr 94 000 (Roos et al., 1982).
3. 1. 3. Westernový přenos
Westernový přenos umožňuje rozlišení jak isotypů C4A a C4B, tak i jednoznačnější stanovení získaných alotypů proteinu C4 pomocí elektroforézy v polyakrylamidovém gelu s dodecyl sulfátem sodným.
Jeho principem je přenos elektroforézou rozdělených proteinů na nylonovou nebo nitrocelulózovou membránu, kde jsou označeny příslušnými protilátkami a po promytí zviditelněny.
Používané protilátky jsou nejčastěji monoklonální nebo polyklonální a zajišťují rozlišení příslušných alotypů proteinů C4A a C4B (tab. 6) (Doxiadis and Grosse-Wilde, 1990). K rozlišení isotypů C4A a C4B se využívají anti-Rg a anti-Ch séra. Na molekulách C4A se vyskytují ve většině případů antigenní determinanty Rodgers, proto se na ně sonda s protilátkou anti-Rg naváže a zviditelní tak tento řetězec na membráně. Naproti tomu molekuly C4B jsou zviditelňovány anti-Ch séry, jelikož mají na svém povrchu přítomné především antigenní determinanty Chido (Roos et al., 1982).
Tab. 6. Reaktivita některých monoklonálních protilátek s alotypy C4 (Doxiadis and Grosse-Wilde, 1990)
2B12 99H7
|
91 2, 3, 4, 45, (5),
alotypy C4A 55, 58, 6, 7, (8),
1*, 12* 1*, 12*
|
92, 94, 95, 96, 11, 12, 13, 45
alotypy C4B 1, 2, 22, 35,
3*, 4*, 5*, 6(*–) 3*, 4*, 5*, (6*)
|
* některé alotypy
(–) slabá reaktivita
(–) pravděpodobně, ale netestováno
|
3. 2. Stanovení deficitu C4 složky komplementu na úrovni DNA
3. 2. 1. Gelová elektroforéza doplněná Southernovým přenosem
Ke stanovení deficitu C4 složky komplementu na úrovni DNA je možné využít gelovou elektroforézu následovanou Southernovým přenosem.
Gelová elektroforéza separuje nukleové kyseliny (NK) na základě jejich rozdílného náboje. Hlavním nábojem NK jsou negativně nabité fosfátové skupiny, jejichž množství je přímo úměrné velikosti NK, a lze je tak rozlišit. Southernův přenos zajišťuje difúzní přenos denaturované DNA na nitrocelulózovou membránu, na které je DNA zviditelněna jednořetězcovou DNA značenou sondou.
Ve spojení s analýzou délky restrikčních fragmentů (RFLP; restriction fragment length polymorphism) se tato metoda využívá pro stanovení isotypů, alotypů i antigenních determinant Rodgers a Chido. RFLP je způsoben mutacemi (repeticemi, delecemi, inzercemi, přestavbami sekvence ve specifických oblastech), které vytvářejí nebo naopak odstraňují rozpoznávací místa pro restrikční endonukleázy. Tato místa jsou specifická pro jednotlivé genové varianty. Působením příslušných restriktáz dochází ke vzniku restrikčních fragmentů o různé délce, které jsou oddělitelné gelovou elektroforézou a charakterizovatelné při Southernově přenosu sondami specifickými pro dané oblasti sekvence DNA (Yu and Campbell, 1987).
Pro detekci polymorfismu C4 složky komplementu se nejčastěji využívá pět restrikčních endonukleáz. Geny C4A a C4B se rozlišují pomocí restrikční endonukleázy N1aIV (Yu and Campbell, 1987), rozdílné délky přítomných genů C4 (varianty L a S) jsou odhalovány restrikčními endonukleázami TaqI (Schneider et al., 1986), BamHI nebo KpnI (Carroll et al., 1985b) a exprese antigenních determinant Rg1 a Ch1 se stanovuje restrikční endonukleázou EcoO 109 (Yu and Campbell, 1987).
Pro rozlišení L a S variant se k hybridizaci při Southernově přenosu využívají sondy specifické pro 5´ oblast DNA (Schneider et al., 1986). Při stanovování genů C4A a C4B nebo antigenních determinant Rg1 a Ch1 se využívá jejich rozdílných sekvencí v řetězci C4d, proto se jako hybridizační sondy využívají právě C4d-specifické sondy (Yu and Campbell, 1987).
Stejně jako u elektroforézy proteinů, i u této metody lze detekovat nulovou alelu na základě intenzity proužků.
3. 2. 2. Metody PCR
Metody založené na polymerázové řetězové reakci (PCR) se používají pro stanovení isotypů, alotypů, antigenních determinant nebo mutací v genu C4. Jejich modifikace je možné využít při kvantitativním vyšetření.
PCR je metoda zajišťující enzymovou syntézu nových řetězců vybraných úseků DNA. Amplifikované úseky DNA jsou vymezeny dvěma primery vázajícími se na oba matricové řetězce DNA a směřujícími 3´ konci proti sobě. Vlastní syntéza je zajištěna DNA-polymerázou (nejčastěji Taq DNA-polymerázou izolovanou z Thermus aquaticus) odolnou proti vysokým teplotám, při kterých DNA denaturuje, čímž je umožněna opakovaná syntéza DNA.
3. 2. 2. 1. PCR-SSP
Jednou z variant PCR využívaných při stanovování proteinů C4 je PCR se sekvenčně specifickými primery (PCR-SSP). Jednotlivé primery jsou navrhovány přesně podle sekvence amplifikované DNA. Výhodou této metody je vysoce specifické navázání primeru na templát, které není narušeno nespecifickými nukleotidy (především na 3´ konci) snižujícími stringenci reakce.
Tato metoda umožňuje stanovení alotypů C4A a C4B, antigenních determinant Rodgers a Chido i nulových alel pomocí sekvenčně specifických primerů navhovaných přesně do oblastí, kde jsou sekvence příslušných variant jedinečné.
PCR-SSP pro antigenní determinanty Rg a Ch zajišťuje rozlišení i takových variant, které nemohly být určeny sérologickými metodami. Tak byly např. stanoveny dva různé alotypy C4B1, které jsou tvořené antigenními determinantami Ch3 a Ch6 nebo Ch-3 a Rg3. Druhou výhodou této metody při určování antigenních determinant je detekce tzv. překrývajících se determinant, které jsou při běžných sérologických metodách nezjistitelné. To je příklad alotypu C4B2, u kterého je determinanta Ch-5 překryta determinantou Ch5 alotypu C4B1. Poslední výhodou při určování antigenních determinant je možnost zjištění determinanty konvertovaného haplotypu a detekovat tak vzácný alotyp – tímto způsobem byla určena např. determinanta Ch5 konvertovaného haplotypu HLA-C4-A2-A3-BQ0, či detekován vzácný alotyp C4B5 (Ch-5) (Barba et al., 1994).
Při sérologických metodách je nulová alela lehce zjistitelná díky absenci daného proteinu, u PCR-SSP (využívající sekvenčně specifické primery pro C4A a C4B nebo pro Rodgers a Chido) je amplifikována část genu C4 bez ohledu na jeho expresi (Barba et al., 1994). Při stanovování nulových alel je tedy nutné navrhnout specifický primer zahrnující danou kauzální mutaci (nejčastěji inzerci nebo deleci několika nukleotidů). Jedním z takto navrhnutých primerů byl primer 13INS potvrzující přítomnost C4AQ0 způsobené inzercí 2 bp v exonu 29 (Barba et al., 1993).
3. 2. 2. 2. PCR-SSP v kombinaci s kapilární gelovou elektroforézou
Pomocí PCR-SSP v kombinaci s kapilární gelovou elektroforézou je možné provést kvantitativní stanovení isotypů C4A a C4B.
Kapilární gelová elektroforéza je jedním z typů gelových elektroforéz, při kterých se agarózový nebo polyakrylamidový gel plní do kapiláry (o průměru 10 až 200 mm), ve které pak dochází k elektroforetické separaci molekul (nukleových kyselin i proteinů) na základě jejich rozdílné velikosti. Po jejich rozdělení jsou tyto molekuly detekované měřením fluorescence. Předpokladem je, aby pro PCR byly použity primery označené příslušnými fluorofory (Blessum et al., 1999).
Při navrhování sekvenčně specifických primerů genů C4A a C4B se využívá jejich rozdílné sekvence, která se liší pěti nukleotidy (v oblasti 17 nukleotidů) v řetězci alfa. 3´ konce primerů specifických pro C4A a C4B jsou komplementární ke 3 z 5 odlišných nukleotidů genů C4A a C4B, což zajišťuje amplifikaci fragmentu genu C4A nebo C4B. Na 5´ konci jsou primery označené rozdílnými fluorofory, díky kterým jsou pak produkty odlišitelné při kapilární gelové elektroforéze (u C4A specifického primeru se využívá Alexa Fluor 488, u C4B specifického primeru Cy5).
Pro standardizaci kvantitativního stanovení genu C4 se k těmto C4A a C4B specifickým primerům přidávají dvě sady kontrolních primerů. První sada primerů amplifikuje sekvenci shodnou pro oba isotypy C4 (je označena fluoroforem Alexa Fluor 488), druhá sada se váže na specifickou sekvenci v genu RP1, která chybí v pseudogenu RP2, a dochází tak k amplifikaci jediného produktu nezávisle na počtu RCCX jednotek na chromozomu (je označená fluoroforem Cy5).
Amplikony získané pomocí PCR se tedy liší svou délkou (C4A a C4B specifické produkty PCR mají délku 169 bp, referenční vzorky mají délku 207, resp. 206 bp) a jsou označené různými fluorofory. Následně jsou rozděleny kapilární gelovou elektroforézou a detekované pomocí speciálního přístroje.
Pro vyhodnocování měření je důležité, že PCR je zastavena v lineární fázi, ve které je hodnota detekované fluorescence přímo úměrná množství templátu (počtu genů) vstupujícího do reakce. Počet genů C4A a C4B se pak stanovuje na základě poměrů ploch pod křivkami elektroferogramu, které odpovídají specifickým a kontrolním produktům (Szilagyi et al., 2006a).
Výhodou této metody je rychlá kvantifikaci genů C4A a C4B v jediném kroku. Tímto přístupem ovšem nelze při ní zjistit přítomnost nulových alel.
3. 2. 2. 3. Kvantitativní PCR
Kvantitativní PCR nebo-li PCR v reálném čase (real-time PCR) je nejnovější kvantifikační metoda stanovení C4 složky komplementu. Je založena na průběžném sledování množství produktu PCR během cyklů reakce na základě detekce fluorescence.
Nejjednodušší metodou PCR v reálném čase je vazba interkalačního barviva v průběhu reakce (např. SYBR Green) na dvouřetězcovou DNA, které je následně fluorescenčně detekovatelné.
Dalšími používanými metodami jsou fluorescenčně značené primery nebo fluorescenční sondy vázající se do střední části amplikonu. Nejpoužívanější jsou právě fluorescenční sondy, které jsou tvořené jednořetězcovou DNA (o délce 25 až 30 nukleotidů) specifickou pro ampfikovanou část DNA a nesoucí na svých koncích obvykle dva fluorofory. Na 5´ konci je navázán fluorofor vyzařující světlo o vlnové délce detekovatelné přístrojem (R; reported dye), na 3´ konci se nachází tzv. zhášeč (Q; quencher), který toto světlo zháší převáděním energie na teplo nebo světlo o vlnové délce nezachytitelné přístrojem. Při PCR je tato sonda degradovaná 5´ exonukleázovou aktivitou DNA-polymerázy, zhášeč se dostane do větší vzdálenosti od fluoroforu a je mu znemožněno účinně působit. Emitované světlo fluoroforu je tedy detekovatelné přístrojem (Tse and Capeau, 2003).
Nejčastější fluorescenční sondou je sonda TaqManTM (Obr. 7), která má na 5´ konci fluorofor tvořený derivátem fluoresceinu a na 3´ konci má zhášeč tvořený nejčastěji derivátem rhodaminu (TAMRA). V roce 2000 byl navžen nový typ TaqManTM sondy vázající se do malého žlábku, tzv. TaqManTM – MGB (minor groove binder), která zvyšuje teplotu tání sondy a stabilizuje její interakci s matricí DNA, což mj. umožňuje navrhovat menší sondy (o velikosti 13 až 20 nukleotidů) (Kutyavin et al., 2000).
Méně používanými fluorescenčními sondami jsou tzv. LightCyclerTM sondy tvořené dvěma krátkými oligonukleotidy, na kterých jsou rozdílné fluorofory, nebo se navrhují tzv. majáky – BeaconTM uspořádané z jednořetězcové DNA tvořící vlásenku se smyčkou, na jejímž konci je opět fluorofor a zhášeč (Tse and Capeau, 2003).
Kvantifikace PCR v reálném čase se provádí výpočtem hodnot získaných z lineární fáze reakce (ve které je množství cyklů přímo úměrné měřené fluorescenci). Stejně jako při použití kapilární gelové elektroforézy, i při této metodě nelze odhalit nulové alely.
Pro kvantitativní stanovení genu C4 byla použita sonda TaqManTM – MGB (Szilagyi et al., 2006b).
Obr. 7. Sonda TaqManTM. 1) hybridizace sondy TaqManTM mezi dva primery: reportérský fluorofor (R) je excitovaný světlem, všechnu energii nevyzařuje pomocí fluorescence, ale část energie je absorbovaná zhášečem (Q; quencher). 2) prodlužování primerů DNA-polymerázou: sonda je odstraněna 5´ → 3´ exonukleázovou aktivitou DNA- -polymerázy; R vyzařuje fluorescenční signál, protože je osvobozen od zhášecího vlivu Q. 3) konec syntézy nového komplementárního řetězce (Tse and Capeau, 2003, upraveno).
3. 2. 2. 4. Long-PCR
PCR pro amplifikaci dlouhých úseků DNA (long-PCR) se využívá pro detekci delece 30 kb genu C4A spojené s delecí pseudogenu CYP21A a částí genu C4B.
Long-PCR je určená právě pro amplifikaci DNA delší než 5 kb, u kterých dochází k chybnému začleňování nukleotidů a tím i ke snížení efektivity amplifikace dlouhých produktů. Běžně používaná Taq DNA-polymeráza nemá 3´ exonukleázovou aktivitu, která by zajišťovala opravu produktu, a proto se při long-PCR do reakční směsi přidává Tth DNA-polymeráza (izolovaná z Thermus thermophillus) s 3´ exonukleázovou aktivitou opravující chybně začleněné báze (Cheng et al., 1994).
Právě tato metoda umožňuje detekci zmiňované rozsáhlé delece 30 kb. Delece zahrnuje mj. intron 9 genu C4A, tedy intron obsahující sekvenci endogenního retroviru HERV(K). Primery pro PCR jsou navrhnuty tak, aby pokrývaly celý gen C4 až po intron 9 (včetně) – levý primer je specifický ke genu RP1, pravý primer nasedá na exon 10 genu C4. Pokud se v genomu vyskytuje delece, je výsledný produkt dlouhý 5,4 kb (Obr. 8a), ale v případě, kdy se zde nenachází rozsáhlá delece (je tedy přítomný 6,4 kb dlouhý retrovirus), délka produktu PCR je 11,8 kb (Obr. 8b). Ta je ovšem výrazně delší než produkt vzniklý na základě deletovaného genu a dochází tak k nerovnoměrné amplifikaci produktů. Proto byl navrhnut jiný pravý primer zajišťující produkt nedeletovaného genu o přibližně stejné délce jako byl produkt deletovaného genu. Tento druhý primer nasedá na oblast sekvence spojující intron 9 a retrotranspozon a vytváří tak produkt dlouhý 5,2 kb, který je již amplifikován ve stejném množství jako produkt deletovaného genu (Obr. 9). Pro tuto metodu se tedy používají dvě sady primerů zajišťující rozlišení deletovaných a nedeltovaných genů C4 (Grant et al., 2000).
Obr. 8. Znázornění délky produktů PCR při použití pravého primeru nasedajícího na exon 10 genu C4A a C4B u deletovaného (a) a nedeletovaného (b) genu (Grant et al., 2000, upraveno).
Obr. 9. Znázornění PCR s použitím primeru specifického pro nedeletovaný gen C4 (Grant et al., 2000, upraveno).
Závěr
C4 složka komplementu je jenou ze základních složek komplementu. Účastní se klasické, popř. i lektinové cesty aktivace. Protein C4 je ze všech komplementových složek nejvíce polymorfní, což se projevuje na genové i proteinové úrovni. V populaci se vyskytuje různý počet genů C4, které se liší svou primární strukturou a vytváří celkem 41 variantu. Na proteinové úrovni se polymorfismus projevuje preferenční vazbou isotypů C4A a C4B k rozdílným antigenům a různou kombinací antigenních determinant pro krevní skupiny Rodgers a Chido na povrchu molekuly C4.
Deficit proteinu C4 v krevním séru je u vrozených deficiencí způsoben mutacemi v kódující sekvenci nukleotidů genu C4, kde dochází nejčastěji k delecím nebo inzercím jednoho až dvou nukleotidů nebo k rozsáhlým delecím. Deficience C4 je asociována s řadou onemocnění, především imunitního systému.
Kvůli vysokému stupni polymorfismu genu C4 je detekce C4 složky komplementu složitá a ani molekulárně genetický přístup neumožňuje pomocí jedné metody stanovit kvalitativní i kvantitativní polymorfismus alel C4. U proteinových metod je možné odhalit deficienci proteinu C4 na základě přítomnosti nulových alel, ale není možné popsat její molekulárně genetickou podstatu. Při studiu proteinů lze stanovit i jednotlivé alotypy C4, ale nevýhodou je, že se alotypy mohou navzájem překrývat, což může vést k nepřesnému vyhodnocení vzorku. U metod založených na studiu DNA lze velmi přesně zjistit genetickou variabilitu přítomných alel C4, jejich množství v genomu, jednotlivé varianty, nukleotidy zodpovědné za antigenní determinanty i charakterizovat mutace způsobující deficit proteinu C4. Taková komplexní analýza je ovšem poměrně rozsáhlá a finančně náročná, navíc nevypovídá o funkčním dopadu detekovaných změn. Proto je nezbytné pro přesné stanovení polymorfismu C4 složky komplementu kombinovat více metodických přístupů.
Literatura
Alper, C. A., Marcus, D., Raum, D., Petersen, B. H. and Spira, T. J. 1983. Genetic polymorphism in C8 beta-chains. Evidence for two unlinked genetic loci for the eighth component of human complement (C8). J Clin Invest. 72 (5): 1526-31.
Anderson, M. J., Milner, C. M., Cotton, R. G. and Campbell, R.D. 1992. The coding sequence of the hemolytically inactive C4A6 allotype of human complement component C4 reveals that a single arginine to tryptophan substitution at beta-chain residue 458 is the likely cause of the defect. J Immunol. 148 (9): 2795-802.
Awdeh, Z. L. and Alper, C. A. 1980. Inherited structural polymorphism of the fourth component of human complement. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (6): 3576-80.
Awdeh, Z. L., Raum, D. D., Glass, D., Agnello, V., Schur, P. H., Johnston, R. B. Jr, Gelfand, E. W., Ballow, M., Yunis, E. and Alper, C. A. 1981. Complement-human histocompatibility antigen haplotypes in C2 deficiency. J Clin Invest. 67 (2): 581-3.
Barba, G. M., Braun-Heimer, L., Rittner, C. and Schneider, P. M. 1994. A new PCR-based typing of the Rodgers and Chido antigenic determinants of the fourth component of human complement. Eur J Immunogenet. 21 (5): 325-39.
Barba, G., Rittner, C. and Schneider, P. M. 1993. Genetic basis of human complement C4A deficiency. Detection of a point mutation leading to nonexpression. J Clin Invest. 91 (4): 1681-6.
Blanchong, C. A., Chung, E. K., Rupert, K. L., Yang, Y., Yang, Z., Zhou, B., Moulds, J. M. and Yu, C. Y. 2001. Genetic, structural and functional diversities of human complement components C4A and C4B and their mouse homologues, Slp and C4. Int Immunopharmacol. 1 (3): 365-92.
Blanchong, C. A., Zhou, B., Rupert, K. L., Chung, E. K., Jones, K. N., Sotos, J. F., Zipf, W. B., Rennebohm, R. M. and Yu, C. Y. 2000. Deficiencies of human complement component C4A and C4B and heterozygosity in length variants of RP-C4-CYP21-TNX (RCCX) modules in caucasians. The load of RCCX genetic diversity on major histocompatibility complex-associated disease. J Exp Med. 191 (12): 2183-96.
Blessum, C., Jeppsson, J. O., Aguzzi, F., Bernon, H. and Bienvenu, J. 1999. L’électrophorèse capillaire: principe et applications au laboratoire de biologie clinique. Ann Biol Clin (Paris). 57 (6): 643-57. [online], [cit. 17. května 2007].
http://www.john-libbey-eurotext.fr/fr/revues/bio_rech/abc/e-docs/00/00/C4/1F/article.md?type=text.html
Braun, L., Schneider, P. M., Giles, C. M., Bertrams, J. and Rittner, C. 1990. Null alleles of human complement C4. Evidence for pseudogenes at the C4A locus and for gene conversion at the C4B locus. J Exp Med. 171 (1): 129-40.
Briggs, D., Stephens, C., Vaughan, R., Welsh K. and Black, C. 1993. A molecular and serologic analysis of the major histocompatibility complex and complement component C4 in systemic sclerosis. Arthritis Rheum. 36 (7): 943-54. In Arason, G. J., Geirsson, A. J., Kolka, R., Vikingsdottir, T. and Valdimarsson, H. 2002. Deficiency of complement-dependent prevention of immune precipitation in systemic sclerosis. Ann Rheum Dis. 61 (3): 257-60.
Carroll, M. C., Campbell, R. D. and Porter, R. R. 1985a. Mapping of steroid 21-hydroxylase genes adjacent to complement component C4 genes in HLA, the major histocompatibility complex in man. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (2): 521-5.
Carroll, M. C., Campbell, R. D., Bentley, D. R. and Porter, R. R. 1984. A molecular map of the human major histocompatibility complex class III region linking complement genes C4, C2 and factor B. Nature. 307 (5948): 237-41.
Carroll, M. C., Palsdottir, A., Belt, K. T. and Porter, R. R. 1985b. Deletion of complement C4 and steroid 21-hydroxylase genes in the HLA class III region. EMBO J. 4 (10): 2547-52.
DiScipio, R. G., Chakravarti, D. N., Muller-Eberhard, H. J. and Fey, G. H. 1988. The structure of human complement component C7 and the C5b-7 complex. J Biol Chem. 263 (1): 549-60.
Doxiadis, G. and Grosse-Wilde, H. 1990. C4 allotyping by prolonged gel electrophoresis and immunoblotting using monoclonal and polyclonal antibodies. Complement Inflamm. 7 (4-6): 269-76.
Esser, A. F. 1994. The membrane attack complex of complement. Assembly, structure and cytotoxic activity. Toxicology. 87 (1-3): 229-47.
Faille-Kuyber, E. H., Kater, L., Kooiker, C. J. and Dorhout Mees, E. J. 1973. IgA-deposits in cutaneous blood-vessel walls and mesangium in Henoch-Schonlein syndrome. Lancet. 1 (7808): 892-3. In Stefansson Thors, V., Kolka, R., Sigurdardottir, S. L., Edvardsson, V. O., Arason, G. and Haraldsson A. 2005. Increased frequency of C4B*Q0 alleles in patients with Henoch-Schonlein purpura. Scand J Immunol. 61 (3): 274-8.
Favoreel, H. W., Van de Walle, G. R., Nauwynck, H. J. and Pensaert, M. B. 2003. Virus complement evasion strategies. J Gen Virol. 84 (Pt 1): 1-15. Francke, U. and Pellegrino, M. A. 1977. Assignment of the major histocompatibility complex to a region of the short arm of human chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (3): 1147-51.
Fredrikson, G. N., Gullstrand, B., Schneider, P. M., Witzel-Schlomp, K., Sjoholm, A. G., Alper, C. A., Awdeh, Z. and Truedsson, L. 1998. Characterization of non-expressed C4 genes in a case of complete C4 deficiency: identification of a novel point mutation leading to a premature stop codon. Hum Immunol. 59 (11): 713-9.
Fučíková, T. 1997. Klinická imunologie v praxi. 2. přeprac. vyd. Galén. Praha.
Gal, P. and Ambrus, G. 2001. Structure and function of complement activating enzyme complexes: C1 and MBL-MASPs. Curr Protein Pept Sci. 2 (1): 43-59.
Gitelman, S. E., Bristow, J. and Miller, W. L. 1992. Mechanism and consequences of the duplication of the human C4/P450c21/gene X locus. Mol Cell Biol. 12 (5): 2124-34.
Grant, S. F., Kristjansdottir, H., Steinsson, K., Blondal, T., Yuryev, A., Stefansson, K. and Gulcher, J. R. 2000. Long PCR detection of the C4A null allele in B8-C4AQ0-C4B1-DR3. J Immunol Methods. 244 (1-2): 41-7. Hall, R. E. and Colten, H. R. 1977. Cell-free synthesis of the fourth component of guinea pig complement (C4): identification of a precursor of serum C4 (pro-C4). Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (4): 1707-10.
Hartmann, D., Fremeaux-Bacchi, V., Weiss, L., Meyer, A., Blouin, J., Hauptmann, G., Kazatchkine, M. and Uring-Lambert, B. 1997. Combined heterozygous deficiency of the classical complement pathway proteins C2 and C4. J Clin Immunol. 17 (2): 176-84.
Higashi, Y., Yoshioka, H., Yamane, M., Gotoh, O. and Fujii-Kuriyama, Y. 1986. Complete nucleotide sequence of two steroid 21-hydroxylase genes tandemly arranged in human chromosome: a pseudogene and a genuine gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (9): 2841-5.
Hillarby, M. C., Strachan, T. and Grennan, D. M. 1990. Molecular characterisation of C4 null alleles found in Felty's syndrome. Ann Rheum Dis. 49 (10): 763-7.
Hobart M. J., Fernie, B. A., DiScipio, R. G. and Lachmann, P. J. 1993. A physical map of the C6 and C7 complement component gene region on chromosome 5p13. Hum Mol Genet. 2 (7): 1035-6.
Horiuchi, T., Nishimukai, H., Okiura, T., Nishimura, K., Nishizaka, H., Kojima, T., Tsukamoto, H., Hayashi, K. and Harada, M. 2002. Molecular bases for human complement C7 polymorphisms, C7*3 and C7*4. Biochem Biophys Res Commun. 298 (3): 450-5.
Cheng, S., Fockler, C., Barnes, W. M. and Higuchi, R. 1994. Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (12): 5695-9.
Chung, E. K., Yang, Y., Rennebohm, R. M., Lokki, M. L., Higgins, G. C., Jones, K. N., Zhou, B., Blanchong, C. A. and Yu, C. Y. 2002. Genetic sophistication of human complement components C4A and C4B and RP-C4-CYP21-TNX (RCCX) modules in the major histocompatibility complex. Am J Hum Genet. 71 (4): 823-37.
Jaatinen, T., Lahti, M., Ruuskanen, O., Kinos, R., Truedsson, L., Lahesmaa, R. and Lokki, M. L. 2003. Total C4B deficiency due to gene deletion and gene conversion in a patient with severe infections. Clin Diagn Lab Immunol. 10 (2): 195-201.
Johnson, C. A., Densen, P., Hurford, R. K., Jr., Colten, H. R. and Wetsel, R. A. 1992a. Type I human complement C2 deficiency. A 28-base pair gene deletion causes skipping of exon 6 during RNA splicing. J Biol Chem. 267 (13): 9347-53.
Johnson, C. A., Densen, P., Wetsel, R. A., Cole, F. S., Goeken, N. E. and Colten, H. R. 1992b. Molecular heterogeneity of C2 deficiency. N Engl J Med. 326 (13): 871-4.
Just, J. J., Abrams, E., Louie, L. G., Urbano, R., Wara, D., Nicholas, S. W., Stein, Z. and King, M. C. 1995. Influence of host genotype on progression to acquired immunodeficiency syndrome among children infected with human immunodeficiency virus type 1. J Pediatr. 127 (4): 544-9.
Kemp, M. E., Atkinson, J. P., Skanes, V. M., Levine, R. P. and Chaplin, D. D. 1987. Deletion of C4A genes in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 30 (9): 1015-22.
Krejsek, J. and Kopecký, O. 2004. Laboratorní vyšetřovací metody v klinické imunologii, p. 869-898. Klinická imunologie. 1. vyd. Nucleus HK. Hradec Králové.
Kusumoto, H., Hirosawa, S., Salier, J. P., Hagen, F. S. and Kurachi, K. 1988. Human genes for complement components C1r and C1s in a close tail-to-tail arrangement. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (19): 7307-11.
Kutyavin, I. V., Afonina, I. A., Mills, A., Gorn, V. V., Lukhtanov, E. A., Belousov, E. S., Singer, M. J., Walburger, D. K., Lokhov, S. G., Gall, A. A., Dempcy, R., Reed, M. W., Meyer, R. B. and Hedgpeth, J. 2000. 3'-minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Res. 28 (2): 655-61.
Law, S. K. A., Dodds, A. W. and Porter, R. R. 1984. A comparison of the properties of two classes, C4A and C4B, of the human complement component C4. EMBO J. 3 (8): 1819–23.
Lawson, P. R. and Reid, K. B. 2000. A novel PCR-based technique using expressed sequence tags and gene homology for murine genetic mapping: localization of the complement genes. Int Immunol. 12 (3): 231-40.
Lee, H. H., Chang, S. F., Tseng, Y. T. and Lee, Y. J. 2006. Identification of the size and antigenic determinants of the human C4 gene by a polymerase chain-reaction-based amplification method. Anal Biochem. 357 (1): 122-7.
Lepow, I. H., Naff, G. B., Todd, E. W., Pensky, J. and Hinz, C. F. 1963. Chromatographic resolution of the first component of human complement into three activities. J Exp Med. 117: 983-1008.
Levinsky, R. J. and Barratt, T. M. 1979. IgA immune complexes in Henoch-Schonlein purpura. Lancet. 2 (8152): 1100-3. In Stefansson Thors, V., Kolka, R., Sigurdardottir, S. L., Edvardsson, V. O., Arason, G. and Haraldsson A. 2005. Increased frequency of C4B*Q0 alleles in patients with Henoch-Schonlein purpura. Scand J Immunol. 61 (3): 274-8.
Lokki, M. L., Circolo, A., Ahokas, P., Rupert, K. L., Yu, C. Y. and Colten, H. R. 1999. Deficiency of human complement protein C4 due to identical frameshift mutations in the C4A and C4B genes. J Immunol. 162 (6): 3687-93.
Mauff, G., Luther, B., Schneider, P. M., Rittner, C., Stradmann-Bellinghausen, B., Dawkins, R. and Moulds, J. M. 1998. Reference typing report for complement component C4. Exp Clin Immunogenet. 15 (4): 249-60. In Blanchong, C. A., Zhou, B., Rupert, K. L., Chung, E. K., Jones, K. N., Sotos, J. F., Zipf, W. B., Rennebohm, R. M. and Yu, C. Y. 2000. Deficiencies of human complement component C4A and C4B and heterozygosity in length variants of RP-C4-CYP21-TNX (RCCX) modules in caucasians. The load of RCCX genetic diversity on major histocompatibility complex-associated disease. J Exp Med. 191 (12): 2183-96.
McLean, R. H., Niblack, G., Julian, B., Wang, T., Wyatt, R., Phillips, J. A., 3rd, Collins, T. S., Winkelstein, J. and Valle, D. 1994. Hemolytically inactive C4B complement allotype caused by a proline to leucine mutation in the C5-binding site. J Biol Chem. 269 (44): 27727-31.
Odell, D., Maciulis, A., Cutler, A., Warren, L., McMahon, W. M., Coon, H., Stubbs, G., Henley, K. and Torres, A. 2005. Confirmation of the association of the C4B null allelle in autism. Hum Immunol. 66 (2): 140-5.
Petersen, S. V., Thiel, S. and Jensenius, J. C. 2001. The mannan-binding lectin pathway of complement activation: biology and disease association. Mol Immunol. 38 (2-3): 133-49.
Raum, D., Glass, D., Carpenter, C. B., Schur, P. H. and Alper, C. A. 1979a. Mapping of the structural gene for the second component of complement with respect to the human major histocompatibility complex. Am J Hum Genet. 31 (1): 35-41.
Raum, D., Spence, M. A., Balavitch, D., Tideman, S., Merritt, A. D., Taggart, R. T., Petersen, B. H., Day, N. K. and Alper, C. A. 1979b. Genetic control of the eighth component of complement. J Clin Invest. 64 (3): 858-65.
Roos, M. H., Mollenhauer, E., Demant, P. and Rittner, C. 1982. A molecular basis for the two locus model of human complement component C4. Nature. 298 (5877): 854-6.
Rowe, P. C., McLean, R. H., Wood, R. A., Leggiadro, R. J. and Winkelstein, J. A. 1989. Association of homozygous C4B deficiency with bacterial meningitis. J Infect Dis. 160 (3): 448-51.
Rowen, L., Dankers, C., Baskin, D., Faust, J., Loretz, C., Ahearn, M. E., Banta, A., Swartzell, S., Smith,T. M., Spies, T. and Hood, L. 1997. Homo sapiens HLA class III region containing tenascin X (tenascin-X) gene, partial cds; cytochrome P450 21-hydroxylase (CYP21B), complement component C4 (C4B) G11, helicase (SKI2W), RD, complement factor B (Bf), and complement component C2 (C2) genes, complete cds. GenBank AF019413.
Rudduck, C., Beckman, L., Franzen, G., Jacobsson, L. and Lindstrom, L. 1985. Complement factor C4 in schizophrenia. Hum Hered. 35 (4): 223-6.
Rupert, K. L., Moulds, J. M., Yang, Y., Arnett, F. C., Warren, R. W., Reveille, J. D., Myones, B. L., Blanchong, C. A. and Yu, C. Y. 2002. The molecular basis of complete complement C4A and C4B deficiencies in a systemic lupus erythematosus patient with homozygous C4A and C4B mutant genes. J Immunol. 169 (3): 1570-8.
Sellar G. C., Blake, D. J., Reid and K. B. 1991. Characterization and organization of the genes encoding the A-, B- and C-chains of human complement subcomponent C1q. The complete derived amino acid sequence of human C1q. Biochem J. 274 ( Pt 2): 481-90.
Shen, L., Wu, L. C., Sanlioglu, S., Chen, R., Mendoza, A. R., Dangel, A. W., Carroll, M. C., Zipf, W. B. and Yu, C. Y. 1994. Structure and genetics of the partially duplicated gene RP located immediately upstream of the complement C4A and the C4B genes in the HLA class III region. Molecular cloning, exon-intron structure, composite retroposon, and breakpoint of gene duplication. 269 (11): 8466-76.
Schneider, P. M., Carroll, M. C., Alper, C. A., Rittner, C., Whitehead, A. S., Yunis, E. J. and Colten, H. R. 1986. Polymorphism of the human complement C4 and steroid 21-hydroxylase genes. Restriction fragment length polymorphisms revealing structural deletions, homoduplications, and size variants. J Clin Invest. 78 (3): 650-7.
Schneider, P. M., Stradmann-Bellinghausen, B. and Rittner, C. 1996. Genetic polymorphism of the fourth component of human complement: population study and proposal for a revised nomenclature based on genomic PCR typing of Rodgers and Chido determinants. Eur J Immunogenet. 23 (5): 335-44.
Schroers, R., Nothen, M. M., Rietschel, M., Albus, M., Maier, W., Schwab, S., Wildenauer, D., Fimmers, R., Propping, P. and Dewald, G. 1997. Investigation of complement C4B deficiency in schizophrenia. Hum Hered. 47 (5): 279-82. In Samano, E. S., Ribeiro, L. de M., Gorescu, R. G., Rocha, K. C. and Grumach, A. S. 2004. Involvement of C4 allotypes in the pathogenesis of human diseases. Rev Hosp Clin Fac Med Sao Paulo. 59 (3): 138-44.
Sim, E. and Cross, S. J. 1986. Phenotyping of human complement component C4, a class-III HLA antigen. Biochem J. 239 (3): 763-7.
Stefansson Thors, V., Kolka, R., Sigurdardottir, S. L., Edvardsson, V. O., Arason, G. and Haraldsson A. 2005. Increased frequency of C4B*Q0 alleles in patients with Henoch-Schonlein purpura. Scand J Immunol. 61 (3): 274-8.
Szilagyi, A., Blasko, B., Ronai, Z., Fust, G., Sasvari-Szekely, M. and Guttman, A. 2006a. Rapid quantification of human complement component C4A and C4B genes by capillary gel electrophoresis. Electrophoresis. 27 (8): 1437-43.
Szilagyi, A., Blasko, B., Szilassy, D., Fust, G., Sasvari-Szekely, M. and Ronai, Z. 2006b. Real-time PCR quantification of human complement C4A and C4B genes. BMC Genet. 7:1.
Štork, J. 1996. Sklerodermie. 1. vyd. Galén. Praha.
Tassabehji, M., Strachan, T., Anderson, M., Campbell, R. D., Collier, S. and Lako, M. 1994. Identification of a novel family of human endogenous retroviruses and characterization of one family member, HERV-K(C4), located in the complement C4 gene cluster. Nucleic Acids Res. 22 (24): 5211-7.
Thomson, W., Sanders, P. A., Davis, M., Davidson, J., Dyer, P. A. and Grennan, D. M. 1988. Complement C4B-null alleles in Felty's syndrome. Arthritis Rheum. 31 (8): 984-9.
Tse, C. and Capeau, J. 2003. [Real time PCR methodology for quantification of nucleic acids]. Ann Biol Clin (Paris). 61 (3): 279-93.
Turner, M. V. 1996. Mannose-binding lectin: the pluripotent molecule of the innate immune system. Immunol Today. 17 (11): 532-40.
Wallis, R. and Dodd, R. B. 2000. Interaction of mannose-binding protein with associated serine proteases: effects of naturally occurring mutations. J Biol Chem. 275 (40): 30962-9.
Walport, M. J. 2001. Complement. First of two parts. N Engl J Med. 344 (14): 1058-66.
Warren, R. P., Odell, J. D., Warren, W. L., Burger, R. A., Maciulis, A. and Torres, A. R. 1995. Is decreased blood plasma concentration of the complement C4B protein associated with attention-deficit hyperactivity disorder? J Am Acad Child Adolesc Psychiatry. 34 (8): 1009-14.
Weg-Remers, S., Brenden, M., Schwarz, E., Witzel, K., Schneider, P. M., Guerra, L. K., Rehfeldt, I. R., Lima, M. T., Hartmann, D., Petzl-Erler, M. L., de Messias, I. J. T. and Mauff, G. 1997. Major histocompatibility complex (MHC) class III genetics in two Amerindian tribes from southern Brazil: the Kaingang and the Guarani. Hum Genet. 100 (5-6): 548-56.
Wetsel, R. A., Kulics, J., Lokki, M. L., Kiepiela, P., Akama, H., Johnson, C. A. C., Densen, P. and Colten, H. R. 1996. Type II human complement C2 deficiency. Allele-specific amino acid substitutions (Ser189 → Phe; Gly444 → Arg) cause impaired C2 secretion. J Biol Chem. 271 (10): 5824-31.
Wong, M. and Tsao, B. P. 2006. Current topics in human SLE genetics. Springer Semin Immunopathol. 28 (2): 97-107.
Yang, Y., Chung, E. K., Zhou, B., Blanchong, C. A., Yu, C. Y., Fust, G., Kovacs, M., Vatay, A., Szalai, C., Karadi, I. and Varga, L. 2003. Diversity in intrinsic strengths of the human complement system: serum C4 protein concentrations correlate with C4 gene size and polygenic variations, hemolytic activities, and body mass index. J Immunol. 171 (5): 2734-45.
Yang, Y., Lhotta, K., Chung, E. K., Eder, P., Neumair, F. and Yu, C. Y. 2004. Complete complement components C4A and C4B deficiencies in human kidney diseases and systemic lupus erythematosus. J Immunol. 173 (4): 2803-14.
Yang, Z., Mendoza, A. R., Welch, T. R., Zipf, W. B. and Yu, C. Y. 1999. Modular variations of the human major histocompatibility complex class III genes for serine/threonine kinase RP, complement component C4, steroid 21-hydroxylase CYP21, and tenascin TNX (the RCCX module). A mechanism for gene deletions and disease associations. J Biol Chem. 274 (17): 12147-56.
Yu, C. Y, Belt, K. T., Giles, C. M., Campbell, R. D. and Porter, R. R. 1986. Structural basis of the polymorphism of human complement components C4A and C4B: gene size, reactivity and antigenicity. EMBO J. 5 (11): 2873-81.
Yu, C. Y, Campbell, R. D. and Porter, R. R. 1988. A structural model for the location of the Rodgers and the Chido antigenic determinants and their correlation with the human complement component C4A/C4B isotypes. Immunogenetics. 27 (6): 399-405.
Yu, C. Y. 1991. The complete exon-intron structure of a human complement component C4A gene. DNA sequences, polymorphism, and linkage to the 21-hydroxylase gene. J Immunol. 146 (3): 1057-66. Yu, C. Y. and Campbell, R. D. 1987. Definitive RFLPs to distinguish between the human complement C4A/C4B isotypes and the major Rodgers/Chido determinants: application to the study of C4 null alleles. Immunogenetics. 25 (6): 383-90.
- -
|