Transgen o’simliklar yaratish texnologiyasi. Kallus to’qimasi

Biotexnologiya asoslaridan Transgen o’simliklar yaratish texnologiyasi. Kallus to’qimasi.
o’quv-uslubiy majmua
Transgen o’simliklar yaratish texnologiyasi. Kallus to’qimasi
|
Ma’ruza rejasi
O’simliklarning agrobakterial transformatsiyasi
O’simliklarni mikroklonal ko’paytirish
Ti-plazmidasi
Tayanch atama va iboralar: Ti-plazmida, meristema, agrobakterial transformatsiya, t DNK, fitogarmon
Agrobacteria guruhiga kiruvchi tuproq bakteriyalari orasida o'simliklarda shish hosil qiluvchi turlari bor. O'simlik shikastlangan yoki kesilgan eridan bakteriya kirib oladi. So'ngra kirgan eridan shish hosil qiladi. Bu shish tojsimon gall deyiladi. Tojsimon gall hujayralari ko'p jihatdan hayvonlardagi saraton kasalligi hujayralariga o'hshab ketadi. Tojsimon gall hujayralari to'htovsiz o'sib borish hususiyatiga ega.
Normal o'simlik hujayralarining o'sishi uchun mahsus gormonlar zarur. Biroq tojsimon gall hujayralari in vitro sharoitda mahsus gormonlarsiz ham o'saveradi. Bakteriyalar antibiotiklar yordamida nobud qilinsa ham bu hujayralar o'sish qobiliyatini yo'qotmaydi.
O'simlikda shish chaqiruvchi bakteriyalardan biri - Agrobacterium tumefaciens. Bu bakteriyani o'rganish natijasida shu narsa ma'lum bo'ldiki, o'simlikdagi shishni bakteriyaning Ti-plazmidasi chaqirar ekan. Bunda plazmida o'simlik hromosomasiga qisman qo'shilib ketadi.
13-rasm. Agrobacterium tumefaciens bakteriyasi ta'sirida tojsimon gallni (shish) hosil bo'lishi. O'simlikdagi shishni bakteriyaning Ti-plazmidasi chaqiradi. Bakteriya o'simlik tanasiga kirganida Ti-plazmidaning T-qismi (T-DNK ya'ni transformatsiyalovchi DNK) o'simlik genomiga qo'shiladi. T-DNKdan tashqari plazmidaning yana 3 ta zonasi bor; vir- T-DNKni kesuvchi va o'simlik hujayrasiga kirituvchi genlar zonasi, tra-bakteriyaning kon'yugatsiyasini nazorat qiluvchi genlar zonasi, ori-Ti-plazmida replikatsiyasini boshqaruvchi genlar zonasi.
O'simliklarning agrobakterial transformatsiyasi: Ti-plazmidalar
A. Tumefaciens bakteriyasi hujayrasida hromosomadan tashqari Ti-plazmida ham bor. Plazmida tarkibida T-DNK mavjud. T-DNK 12-22 ming nukleotidlar juftidan iborat. U o'simlik hromosomasiga qo'shilish hususiyatiga ega.
T-DNKda fitogormonlar va opinlar (bakteriya uchun uglerod, azot va energiya manbai bo'lgan aminokislotalar hosilalari) sinteziga javob beruvchi genlar bor. T-DNKdan tashqari plazmidada vir-zonasi ham bor. Vir-zona T-DNKni o'simlik hujayrasiga kiritish vazifasini bajaradi. Yana vir-zonada opinlar utilizatsiyasi, bakteriya kon'yugatsiyasini nazorat qiluvchi genlar bor.
O'simlikdagi shishni bakteriya hromosomasidagi genlar emas, aynan Ti-plazmida genlari chaqirishi tajriba yo'li bilan isbotlangan. Bunda mutant Ti-plazmidalar saqlagan bakteriyalar o'rganilgan. Ti-plazmidasi yo'q bakteriyalar o'simlikda shish ham, opinlar sintezini ham chaqirmagan. Tajriba uchun 3 hil mutant Ti-plazmidalar olingan:
opinlar sintezlamaydi, lekin tojsimon gall hosil qiladi;
umuman hech qanday shish hosil qilmaydi;
normal hujayralarning anomaliyasiga sabab bo'ladi (masalan, o'simlik novdalari va ildizining haddan ortiq o'sib ketishi).
O'tkazilgan genetik tadqiqotlarga qaraganda, o'simlik tanasidagi turli shishlarni paydo bo'lishi, opinlar sintezi aynan Ti-plazmida genlariga bog'liq ekan. 2- va 3-hil mutant plazmidalarni o'simlikka kiritib, fitogormonlar yordamida shish hosil qilsa bo'ladi.
Ti-plazmidalarning mutatsiyasi o'simlikning gormonal metabolizmiga ta'sir qiladi degan ilmiy tahminlar ham yo'q emas.
Agrobakterial transformatsiyaning molekulyar-genetik
mehanizmlari
Transformatsiya jarayonini 4 bosqichga ajratish mumkin:
bakteriyani o'simlik hujayrasi devoriga bog'lanib olishi;
o'simlik hujayrasiga T-DNKni kirishi;
T-DNKni o'simlik genomiga integratsiyasi (qo'shilishi);
T-DNK ekspressiyasi (rasm 13.).
14-rasm. Agrobakterial ransformatsiyaning asosiy bosqichlari: I-o'simlik hujayrasi devori gidrolizlanadi, gidroliz mahsulotlari VirA hemoretseptorlarini faollantiradi; II- VirG – vir-genlarning transkriptsiyasi va ekspressiyasi aktivatori; III- VirD1 va VirC1 yordamida VirD2 ni T-DNKga bog'lanishi va TDNKning o'ng (RB-right bound) va chap (LB-left bound) tomonidan uzilishi; IV- VirE2 ni T-zanjir bilan bog'lanishi va T-zanjir+ VirD2 + VirE2 kompleksini bakteriya hujayrasi g'ovagidan o'tishi; V- operon VirB agrobakteriya hujayrasi devorida g'ovak hosil qilgan; VI- T-DNKning o'simlik hromosomasiga integratsiyasi;
Transformatsiya jarayonining dastlabki bosqichlari o'simlikning jarohatlangan eridan boshlanadi. O'simlik jarohtlanganida quyi molekulyar fenol birikmalar (masalan, atsetosiringon), uglevodlar (masalan, glukoza va glyukuron kislota) ajraladi. pH muhit esa kislotali bo'ladi. Agrobakteriya plazmidasidagi T-DNKni kesilishidan tortib o'simlik hromosomasiga integratsiyasigacha bo'lgan jarayonlarni Ti-plazmidaning vir zonasidagi genlar bajaradi.
O'simlik jarohatidagi signallarni VirA va ChvE oqsillari qabul qiladi. ChvE oqsilini agrobakteriyaning hromosoma genlari sintezlaydi. U atsetosiringonga nisbatan sezgir bo'lib, VirA oqsiliga ta'sir qiladi. Natijada VirA oqsili fenol birikmalarini sezishni boshlaydi. VirA oqsili - proteinkinaza fermenti. U bakteriya hujayrasi ichki membranasini ikki marta teshadi. Shuningdek VirG oqsiliga fosfor donori bo'lib hizmat qiladi. O'z navbatida VirG boshqa vir-genlar transkriptsiyasini boshlanishiga sababchi bo'ladi.
Agar o'simlik kasallangan yoki boshqa sabablar bilan yahshi rivojlana olmaydigan bo'lsa, vir genlar faollanmaydi, T-DNK ham o'simlik hromosomasiga birikmaydi.
VirD operoni bir qancha metabolitlarni sintezlaydi. Bu metabolitlardan biri – ikki komponentli endonukleaza fermenti. Bu ferment T-DNKni kesadi. Kesilgan T-DNKni VirB va VirE oqsillari agrobakteriyadan o'simlikka o'tkazadi. T-DNKni bakteriyadan o'simlik hujayrasiga o'tishi uchun 30 minut vaqt talab etiladi. T-DNKning o'simlik genomiga qo'shilishi ko'p bosqichli jarayon hisoblanadi. Genomga T-DNKning bir necha nushalari joylashishi mumkin. Jarayon tugaganidan so'ng T-DNK o'simlik genomining bir qismiga aylanadi. T-DNK o'simlik hujayrasidagi RNK-polimeraza II fermenti yordamida transkriptsiyalanadi.
Agar yuqorida keltirilgan ma'lumotlarga e'tibor bergan bo'lsangiz, agrobakteriyaning o'zi o'simlik hujayrasiga kirmaydi. Bakteriya o'zining T-DNKsini o'simlik hujayrasiga kiritdi, hromosomaga joylashtirdi va o'simlikni opinlar sintez qiluvchi «fabrika»ga aylantirdi. Opinlar esa bakteriya uchun azot va uglerod manbaidir.
|