ábra - Amiloid -peptid által indukált komplement aktiváció gátlása kis molekulatömegű szintetikus vegyületekkel in vitro

7. ábra A C1-Inh, a klasszikus út C1r és C1s proteázainak endogén inhibítora védelmet nyújtott az A peptid indukálta komplement aktiváció által kiváltott neurotoxicitással szemben hippokampális sejteken in vitro. A sejteket 3% normál humán szérum jelenlétében 40M A1-40 peptiddel kezeltük, és a C1-Inh védő hatását LDH felszabadulás méréssel követtük az 5. napon. A pontok három független mérés átlagai.
Alzheimer kórban nem tapasztalták a vér monocita/makrofág sejtjeinek infiltrációját, ezért mikroglia sejtekben, az agy szöveti makrofágjaiban vizsgáltuk komplement komponensek, köztük a C1q expresszióját.
6.3 Komplement gének expressziója mikroglia sejtekben
6.3.1 Komplement gének transzkripciója mikroglia sejtekben
A központi idegrendszer immunológiája, a neuroimmunológia az utóbbi évtizedben önálló tudományággá vált. A kutatások rávilágítottak, hogy az agyban a mikroglia monitoroz-za a szövet állapotát, és távolítja el az elpusztult sejteket, a szöveti törmeléket vagy fehérje aggregátumokat. A mikroglia, mint szöveti makrofág vélhetően termel komplement fehérjéket és rendelkezik komplement receptorokkal, amelyek érzékelik a komplement aktiváció során keletkező komplement fragmentumokat. Munkám során először komplement gének kifejező-dését tanulmányoztam mikroglia sejteken in vitro.
8. ábra Komplement gének expressziója kezeletlen mikroglia sejtekben. A vizsgálat-ban a következő komplement gének átíródását vizsgáltuk: C1q A lánc (1), C1q B lánc (2), cC1qR (3), C3 (4), CR3 lánc (5), CR3 lánc (6), C5 (7), C5aR (8). A primerek szekvenci-ája alapján a várt fragmentum méretek a következők: C1q A lánc 419 bp, C1q B lánc 608 bp, C1qR 377 bp, C3 425 bp, CR3 lánc 84 bp, CR3 lánc 662 bp, C5 638 bp, C5aR 453 bp. A kép bal szélén látható a 100 bp létra (marker), a belső kontrollként használt aktint (500 bp) nyíllal jelöltem.
A kísérlet eredményéből kiderült, hogy mikroglia sejtekben több komplement receptor, többek között a cC1qR, CR3 és C5aR génje átíródott (Sárvári és Pázmány, nem közölt eredmény). Ez azt jelenti, hogy az aktiváció hatására bekövetkező opszonizáció segíti az eltávolítandó anyag mikroglia általi fagocitózisát, és a felszabaduló C5a fragmentum az aktiváció helyére toborozza a C5aR- pozitív mikroglia sejteket. Említésre méltó, hogy a klasszikus reakcióút felismerő fehérjéje, a C1q (és alacsonyabb mértékben a rendszer központi molekulája, a C3) mikroglia sejtekben folyamatosan termelődött.
6.3.2 Mikroglia sejtekben történő komplement génkifejeződés változása gyulladásos
stimulus hatására
A központi idegrendszerben lejátszódó gyulladási folyamatokban jelentős szerepet játszanak a mikroglia sejtek. Láttuk, hogy nyugvó mikroglia sejtekben folyamatosan átíród-nak a komplement fehérjéket és receptoraikat kódoló gének (8. ábra). Bakteriális lipopoli-szacharid (LPS), egy erős gyulladásos stimulus hatását vizsgáltuk komplement gének átíródására mikroglia sejtekben.
A
B
9. ábra Komplement gének és receptoraik transzkripciójának változása primer mikroglia sejtekben LPS indukció hatására. Primer egér mikroglia sejteket raktunk ki 6 kamrás szövettenyésztő lemezre, majd LPS kezelés után 0, 2, 4 és 24 órával a sejtekből RNS-t izoláltunk, amit fordított (reverz) transzkripcióval cDNS-re írtunk át. Az izolált cDNS szolgált templátul a PCR reakciókban. (A) C5 (1), C5aR (2), cC1qR (3), C1q A lánc (4) és B lánc (5) gének átíródásának vizsgáltuk LPS indukciót követően. A keletkező fragmentumok mérete sorrendben: C5 638 bp, C5aR 453 bp, cC1qR 377 bp, C1qA 419 bp, C1qB 608 bp. A belső kontrollként használt aktint (500 bp) nyíllal jelöltük. (B) C3 (1), CR3 lánc (2) és lánc (3), clusterin (4), C9 (5) és perforin (6) expresszióját vizsgáltuk mikroglia sejtekben 0, 2, 4 és 24 órával LPS kezelés után. A reakció során keletkező fragmentumok hossza sorrendben: C3 425 bp, CR3 84 bp, CR3 662 bp, clusterin 243 bp, C9 596 bp, perforin 703 bp. Az aktin belső kontrollt (500bp) nyíllal jelöltük.
A két kísérlet eredménye azt mutatta, hogy a komplement receptor gének (C1qR, CR3, C5aR) kifejeződése LPS kezelés után 2 órával jelentősen emelkedett. Ugyancsak jelentősen emelke-dett a komplement központi komponensének, a C3 génjének kifejeződése kezelés után 2 órával. A receptorok és a C3 esetében is bekövetkező gyors transzkripciónövekedés a kezelés után 24 óráig megfigyelhető volt. Egy szabályozó fehérje, a clusterin génjének transzkripció-ját is vizsgáltuk (9B. ábrán a 4. sáv). Megállapítottuk, hogy nyugvó mikroglia sejtekben nem termelődött clusterin, de LPS kezelés hatására 2 óra múlva a gén transzkripciója jelentősen emelkedett (Sárvári és Pázmány, nem közölt eredmény). Ezek az eredmények irodalmi adatokkal összhangban arra utalnak, hogy a mikroglia sejteken megtalálható az LPS kötésért felelős TLR4 (Olson & Miller, 2004). Említésre méltó, hogy a C1q láncait kódoló gének expressziója nem emelkedett számottevően. Összefoglalva, gyulladásos stimulus hatására a mikroglia sejtekben a génexpressziós változások a jellegzetes makrofág funkciók, a migráció és a fagocitózis támogatását szolgálják. Emellett a mikroglia komplement fehérjék növekvő szintézisével hozzájárul a komplement aktiváció fenntartásához is.
A C1q alegység expresszióját mikroglia sejtekben fehérje szinten immunhisztokémia módszerrel vizsgáltuk (10. ábra). Egér mikroglia sejteket fixálás után C1q antitesttel inkubáltuk, és fluoreszcensen jelzett második antitesttel jelölve megállapítottuk, hogy mikroglia sejtekben konstitutív C1q szintézis folyt. Tehát RNS és fehérje szinten is kimutat-tuk, hogy az agy szöveti makrofágjai nyugvó állapotban is jelentős mennyiségű C1q fehérjét termeltek (Sárvári és Pázmány, nem közölt eredmény).
|