Tekshirilayotgan materialni seriyali suyultirish usuli bilan ekish

4. Tekshirilayotgan materialni seriyali suyultirish usuli bilan ekish. Bu usulda sof kultura ajratib olishdan tashqari tekshirilayotgan materialda mikroorganizimlarning miqdoriy ko’rsatkichlari ham aniqlanadi (23-rasm ). Dastlab steril probirkalar olinadi va har biriga 9,0 ml steril fiziologik eritma yoki steril suv olinadi va asosiy materialdan 1.0 ml olinib 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000 ( tekshirilayotgan materialga qarab yanada ko’proq suyultirish ham mumkin) nisbatda suyultiriladi. Tayyorlangan probirkalardan belgilangan pipetka yordamida 0,1 ml material olinib oziqli agar yuzasiga tomiziladi va shpatel bilan surkab gazon usulida ekiladi va termostatga (37 Sº) qo’yiladi.Tekshirilayotgan materaldan umumiy mikroblar soni (UMS) quyidagi formula orqali aniqlash mumkin UMS= AxVxS.
A- probirkadagi suyultirish darajasi;
V- 0,1 ekilgan ekma
S- oziqli agar yuzasida o’sgan mikroblar soni
Mikroorganizmlarni biologik xususiyatlariga asoslangan ajratish usular.
Shukevich usuli. Amaliyotda Proteya bakteriyasining sof kulturasini (Proteus vulgparis) ajratib olishda, uning oziqli muhitda «yoyilib» o’sish xususiyatidan foydalaniladi.Buning uchun tekshirilayotgan materialdan qovuzloq bilan yangi tayyorlangan qiyshiq agarni kondensasion suviga ekiladi va termostatga (37 Sº) qo’yiladi.Proteya bakteriyalari oziqli muhitda o’rmalab o’sish xususiyatiga ega va kiyingi kunda qiyshiq agarni yuqori qismiga o’rmalab o’sib chiqadi, uning yuqori qismidagi kulturasidan olinib, toza kultura ajratib olish mumkin.
Qizdirish usuli bilan toza kultura ajratib olish. Spora hosil qiluvchi bakteriyalarni ajratib olishda qo’laniladi. Bu usulda spora hosil qilmaydigan, ammo qo’shilib qolgan mikroorganizmlarni vegitativ formasini yo’q qilish uchun, tekshiriladigan material 80°S da qizdiriladi yoki qisqa vaqt davomida qaynatiladi. Bu holatda mikroorganizmning sporasi saqlanib qoladi va qizdirilgan materialni oziqa muhitiga ekilganda, agar u shu turga mansub bo’lsa, bakteriyaning sof kulturasini tashkil qilgan holda o’sib chiqadi.
Bakteriostatik usul (Ingibisiya usuli). Mikroorganizmlarni o’sishiga turli kimyoviy moddalar va antibiotiklar va turli omillarni ta’sir qilishiga asoslangan. Tekshirilayotgan materialni oziqli muhitga ekishda, asosiy mikrobning ko’payishiga ta’sir ko’rsatmaydigan ammo tashqi mikrofloraning ko’payishini, o’sishini to’xtatadigan temperaturada o’stiriladi. Masalan, aktinomisitlar, iersiniya bakteriyasining sof kulturasini ajratib olish uchun, ekilgan material 22°S temperaturada o’stiriladi. Ko’pchilik boshqa bakteriyalar bu haroratda ularni o’sishi sustlashadi. Ikkinchi holatda oziqli muhitga, begona bakteriyalarning ko’payishini to’xtatadigan, ammo tekshirilayotgan mikrobga ta’sir qilmaydigan aniq konsentrasiyada ma’lum antibiotiklar qo’shish mumkin. Ko’k yo’tal qo’zg’atuvchisini ajratib olishda Kozeinli ko’mirli agarga (KKA) penisillin antibiotigi qo’shiladi. Penisilin Gram manfiy ko’k yo’tal qo’zg’atuvchisiga ta’sir ko’rsatmaydi, lekin gram musbat qo’shimcha gram musbat bakteriyalarni o’sishini to’xtatib qo’yadi.
Kislotaga chidamli bakteriyalarni toza kulturasini ajratib olishda, tekshirilayotgan material 5 % sulfat kislota bilan ishlov beriladi, kislotaga chidamsiz qo’shimcha floralar hammasi o’lib ketadi, kislotaga chidamli bakteriyalar saqlanib qoladi, kiyin oziqli muhitlarga ekilganda ular yaxshi o’sadi. Bu usuldan sil tayoqchasini sof kulturasini ajratib olishda keng qo’llaniladi.
Boyituvchi usul (metod obogasheniya). Tekshiriluvchi material bakteriyalar uchun elektiv muhitlarga ekiladi bu muhitlarda ma’lum bir bakteriyalar yaxshi o’sa oladi. Masalan stafilokokklar natriy xlor tuzining yuqori konsentrasiyasi bo’lgan (10-15%) muhitda, vabo vibrionlari esa ishqoriy muhitda yaxshi o’sadi, qo’shimcha florani o’sishi to’xtab qoladi yoki suslashadi.
Bakteriyalarni sof kulturasini biologik usullar bilan ajratib olish. Ko’pgina patogen bakteriyalarni saprofitlardan ajratib olishda qo’laniladi. Amaliyotda ba’zi bakteriyalarni ajratib olishda qiyinchiliklar tug’iladi, ya’ni tekshirilayotgan materialda izlanilayotgan bakteriyani miqdori juda kam bo’lishi, yoki hayvonlarni o’ligini tekshirilgangda (o’latda), chirituvchi bakteiyalarni ko’payib ketganligi, materialni laboratoriyaga yetkazib berish vaqtini cho’zilib ketishi, bakteriyalarni sof kulturasini ajratib olish extimolini kamaytirib yuboradi. Bunday xollarda biologik usul muhim ahamiyat kasb etadi. Materialni yuqtirish uchun, izlanilayotgan bakteriyaga sezgir bo’lgan laboratoriya hayvonlari tanlanadi. Masalan pnevmakokk va o’lat qo’zg’atuvchisi uchun eng sezgir hayvon oq sichqonlar xisoblanadi. Rikketsiyalar uchun esa kalamush, zahim qo’zg’atuvchisi quyon organizmida yaxshi ko’payadi. Material yuqtirilgan hayvonda kasallik belgilari ko’rina boshlansa, patologik anatomik tekshiriladi va ularning organ va to’qimalaridan yuqoridagi usullar yordamida toza kulturasi ajratib olinadi.
Laboratoriya ishini bajarish:
Plastinkali GPA oziq muxitini tayyorlash.
Toza sterillangan shisha kolba tayyorlanadi.
Kolbaga 1 litr distillangan suvga 40 gr GPA kukuni solinadi eritiladi.
rN tekshirib ko’rilib, og’zi paxta-dokali probka bilan berkitiladi.
Avtoklavga qo’yib 10-15 minut davomida 120 ºS da, 0.5 atmosfera bosimida sterilizasiya qilinadi.
Tayyor bo’lgan oziq muxit sterillangan petri kosachalariga 15-20 ml quyiladi.
Qiyalatilgan oziqli agar tayyorlash uchun, ichiga agar quyilgan probirkalar stol ustida 45 º qiyshaytirilgan holatda qotiriladi.
Havoni sedimentasion usul bilan ekish.
Tayyorlangan plastinkali GPA xonaning ma’lum tanlab olingan joyiga qopqog’i ochib 15-20 minut qoldiriladi.
Belgilangan vaqtdan kiyin kosachani qopqog’i yopilib, ustiga material olingan sana, soati, gurux nomeri yozib qo’yiladi.
Havo ekilgan GPA termostatga 37ºS ga qo’yiladi.
Bakteriyalarni toza kulturasini ajratib olish maqsadida bemor yiringi va najasini TSTA, Endo muhitlariga ekish.
Tekshirilayotgan bemor yiringi va najasi yuqorida keltirilgan bakteriyalarni ekish texnikasi va aerob bakteriyalarni sof kulturasini ajratib olishdagi usullarga amal qilingan xolda TSTA va Endo muhitlariga ekiladi.
Ekma ekilgan Petri kosachasini qopqog’i yopilib, ustiga material ekilgan sana, soati, gurux nomeri yozib qo’yiladi.
Ekilgan GPA termostatga 37ºS ga qo’yiladi.
Bajarilgan ishlar bo’yicha protokol tuziladi va xulosa yoziladi.
Labaratoriya mashg’uloti 4
Mavzu: Umumiy virusologiya: tuzilishi, klassifikasiyasi, reproduksiyasi. Bakterofaglar
Mashgulot rejasi
1. Turli viruslar va faglarning morfologiyasi, ultra tuzilishini o’rganish.
2. Viruslarni hujayra kulturasida, tovuq embrionida va laboratoriya hayvonlari organizmida o’stirish.
3. Viruslarni hujayra kulturasi va tovuq embrionida aniqlash (indikasiya) usullari.
4. Viruslarni identifikasiya qilish usullari
5. Tashqiy muhit ob’ektlaridan faglarni ajratib olish usullari.
6. Faglarni aniqlash (indikasiya) usullari
7. Grasiya usuli bo’yicha fagni titirlash
Namoyish qilish
1. Virusologik amaliyotda ishlatiladigan idishlar, asboblar (hujayra kulturasini o’stirish uchun shisha idishlar, matras, ovoskop, avtomatik titrlashda qo’llaniladigon pipetkalar, planshetkalar).
2. Chechak vaksinasi virusi morfologiyasini Morozov usuli bilan bo’yalgan preparatlari.
3. Viruslarni saqlanishini taminlaydigan va ko’paytirshda qo’llaniladigan oziq ( 199, Igla, Xenks, Gidrolizat va bosh.) muhitlar.
4. Oddiy va murakkab virionlar tuzilishini sxema va elektron-mikroskopik fotosuratlari, rangli surrat, slaydalar.
5. Birlamchi hujayra kulturasi va ularning tayyorlash etaplarining sxemasi.
6. 10-12 kunlik tovuq embrioni va unga patologik materiallarni yuqtirish usullari.
7. Viruslarni indikasiya va identifikasiya qilish usullari.
8. Tashqi muhit ob’ektlaridan faglarni ajratib olish usullari.
Laboratoriya ishini bajarish uchun topshiriq
1. Hujayra kulturasida va tovuq embrionida viruslarni reproduksiyasini aniqlash (indikasiya).
a) viruslarning hujayraga sitopatik ta’siri bo’yicha.
b) gemagglyutinasiya reaksiyasi yordamida.
2. Rinositoskopik usulda bosma surtma tayyorlab bo’yab ko’rish.
3. Stafilakokk kulturasini fagotipini aniqlash.
Viruslar marfologiyasi va ultura struktura tuzilishi.
Mikroblar olamiga hujayra tuzilishiga ega bo’lgan prokariot va eukariotlardan tashqari hujayra tuzilish formasiga ega bo’lmagan patogen agentlar ham kiritilgan. Bularga kiradi:
1. Prionlar
2. Virioidlar
3. Viruslar
Prionlar ( ing.so’z proeinaceous infectious partict – oqsilsimon yuqumli bo’lakcha). Hujayrada normal prion oqsil strukturasi bo’lib (PrPc –celluar prion protein) tarkibida nuklin kislota tutmaydi. Normal prion oqsili nukleazlarga rezistent bo’ladi, lekin proteaz fermentlar ta’sirida inaktivasiyaga uchraydi. Ularni issiq qonli organizimlardagi (odamda) 20 xromosoma tarkibidagi prion genomi tamonidan kodlashtirilib, boshqarilib turadi. Uzoq davom etuvchi mutasiya ta’sirida PrR c gen va Pr RSc ishtirokida transformasiyalanib (PrR c ) normal prion oqsilidan proteaz fermentlarga chidamli PrR Sc (screpie prion protein) patogent agentga aylanadi. Prion oqsillari boshlang’ich yuqumli agent sifatida (skrepi) tovuqlardan (Kroytsfeldt-Yakoba kasalligi), katta shoxli qoramollardan (spongiko’rinishdagi ensefalopatiya- sigir qutirishi kasalligi) ajratib olingan.
Viruslar esa hozirgi kundagi klassifikasiyasiga asosan vira (Vira) podisholigiga kiritilgan. Viruslar o’ta mayda organizimlar bo’lib, ularda hujayra tuzilishi va oqsil sintez qiluvchi sistemasi shakillanmagan. Tarkibida bitta tipdagi nuklein kislatasi tutadi (RNK yoki DNK). Qa’tiy obligat hujayra ichida ko’payuvchi parazitlar hisoblanib, parazitligini genetik darajada amalga oshiradi. Shuning uchun viruslarni genetik parazitlar ham deb atashadi.
Viruslar avtonom genetik strukturalar bo’lib, faqat viruslarga xos bo’lgan bir-biridan ajralgan (disyunktiv) usul bilan ko’payadi, ya’ni virusni nuklein kislotasi hujayrada alohida sintez bo’lsa, uning oqsillari boshqa joyda sintez bo’ladi, kiyin ular har bir virus tiplariga xos bo’lgan joyda (yadroda, yadro membranasida, sitoplazma strukturalarida yoki sitoplazmatik membranada) yig’iladi.Ularning yig’ilishida nuklein kislota oqsilni tanishi, oqsil-oqsilni tanishi prinsiplari yotadi.Viruslarning hujayradan tashqarisidagi formasini v i r i o n deb, hujayra ichidagi formasini esa v i r u s deb yuritiladi.
Viruslarning morfologik va ulturastrukturasini elektron mikroskop yordamida o’rganiladi. Virionlar o’lchami jihatdan mayda (22-30 nm poliomielit), o’rta (80-120 nm gripp), katta o’lchamda (00-350 nm chin chechak)
bo’lishi mumkin.Virionlarning shakli ham (rasm 30) turli ko’rinishlarda uchraydi. Shakli tayoqchasimon ( tamaki bargi virusi), o’qsimon (qutirish virusi), sharsimon (gripp, paragripp, gepatit V viruslari), ipsimon (flaviviruslar), kuboidal (chin chechak, ospa vaksina) spermatozoidsimon
(bakteriofaglar) bo’lishi mumkin.
Viruslar genomi gaploid ko’rinishda bo’lib bir tipdagi nuklein kislotadan DNK yoki RNK iborat, lekin retroviruslarda diploidli genom uchraydi. Virus genomi oltitadan birnecha yuz genlar tutishi mumkin va ularning nuklein kislotalari – ikki ipli, bir ipli, chiziqli (lineyni), xalqasimon va fragmentlangan bo’lishi mumkin.
RNK saqlovchi viruslarda faqat musbat ipli (+RNK) genom tutuvchi viruslar uchrab, infeksion virus deb ham ataladi. Bu viruslarda transkripsiya kuzatilmaydi, virusning RNK si bir vaqtni o’zida informasion (iRNK) vazifasini ham bajaradi.
Manfiy ipli RNK tutuvchi viruslarda esa RNK genomi faqat nasliy funksiyani bajaradi.
Virionlar tuzilishi jihatdan oddiy (yalang’oya) va murakkab (kiyingan) viruslarga bo’linadi. Oddiy viruslarga ( shol, gepatit A), murakkab viruslarga (qizamiq, OITV, gepatit V,) kiradi.
Oddiy virionlar nuklein kislota va uni zich o’rab turgan oqsil qobig’i — kapsiddan iborat (capsa- lotincha bo’lib g’ilof demakdir). Virionlarning kapsidlari o’z navbatida ketma ket keluvchi subbirliklardan iborat bo’lib ularni kapsomerlar deb ataladi (rasm-31). Kapsomerlarni elektron mikroskopda ko’rish mumkin, har bir virionlar oilasi uchun kapsomerlarni soni ularga xos xisoblanadi. Masalan, adenoviruslar 252 ta , pikornoviruslar 60 ta kapsomerlar tutadi. Nuklein kislotasi va kapsomer o’zaro birikib virusni nukleokapsidni hosil qiladi.
Murakkab virionlarni nukleokapsidi tashqi tomondan lipoproteinli qobiq bilan o’ralgan bo’lib –superkapsid yoki peplos deb nomlanadi (rasm-31). Superkapsid tarkibida oqsillardan tashqari, yog’ va uglevodlar lipo -, glikoproteinlar ko’rinishida uchraydi. Ba’zi viruslarda glikoproteinlar supekapsid tarkibida tikanak ko’rinishida (gripp, pargripp viruslarda) bo’lishi mumkin superkapsid ostida M, F oqsillar bo’lib, viruslar bilan zararlangan hujayralarning bir-biri bilan qo’shilib ketishini taminlaydi, bu esa gigant ko’p yadroli simplast hujayralari hosil bo’lishiga olib keladi va hujayralarning destruksiyasi bilan tugaydi. Bundan tashqari ba’zi viruslar o’ta murakkab tuzilishlarga ega bo’lib virusning nuklein kislotasi oqsil qobiq bilan o’ralgan, uning ustidan kapsid o’rab turadi (virus mag’izi), kapsid ustida esa virusni yana bir ichkiy matriks oqsil qavati (M-qavat) bo’lib u super kapsidga birikib ketadi (OITV), chin chechak virusi tuzilishi esa prokariot hujayralariga yaqin turadi.
Virionning kapsid kapsomerlari nuklein kislotani tashqi tomondan o’rab turganda ma’lum simmetriya tiplarini shakllantiradi. Virionlarda uch hil simmetriya tiplari uchraydi: spiralsimon, kubsimon va aralash.
Spiralsimon simmetriya ( tamaki mazaika, gripp, koronaviruslarda) vintsimon ko’rinishdagi nuklein kislotasini tashqaridan mustahkam oqsil subbirliklari (protomer) o’rab (rasm 31) turadi. Shakillangan nukleokapsid tayoqchasimon yoki ipsimon ko’rinishda bo’ladi. Spiral tayoqchasimon simmeriya tipiga ega bo’lgan oddiy viruslarga tamaki bargi virusi, ipsimonlariga esa ba’zi bir bakteriofaglar misol bo’la oladi. Bu tipdagi simmetriya tutovchi oddiy viruslar odam va umirtqali hayvonlarda kasallik keltirib chiqarmaydi.
Kubik yoki ikosaedrik simmetriya da kapsid virionni nuklein kislotasi joylashgan ma’lum ko’rinishdagi izometrik tana, mag’izni hosil qiladi. Kubsimon simmetriyada kapsid sharsimon, ba’zida prizmasimon shakilli kapsomerlardan tuzilgan. Har bir kapsomer besh (pentomer) yoki olti (seksomer) subbirliklardan tashkil (rasm 31b) topadi. Kubsimon simmetriya asosida, kapsomerlar hosil qiladigan teng tamonli burchakli kombinasiyalar yotadi.
Kubsimon simmetriyali odiy viruslar (yalang’och) ko’p qirrali shakilda (gepatit A, koksaki va boshqa enteroviruslar), superkapsid bilan o’ralgan murakkab viruslar esa, asosan sferik shakilga ega (orta-, paramiksoviruslar) bo’ladi. Lekin murakkab viruslarning o’qsimon (qutirish virusi), parallelepiped (chin chechak virusi) shakllariga ega tiplari ham bor.
Aralash simmetriya tiplari bakteriofaglarda kuzatiladi, ularning bosh qismida kubsimon, tanasida esa spiralimon simmetriyalar uchraydi (rasm 30).
Murakkab tuzilishga ega bo’lgan virionlarni ichkiy strukturasi, ularning mag’izi (serdsevina) deb ataladi. Adenoviruslarda mag’iz qismida DNK bilan bog’langan gistonlarga o’xshash oqsillar uchrasa, reoviruslarda bu ichkiy kapsid oqsillidan iborat.
Viruslarning taksonomik toifalari. Virusologiyada quyidagi taksonomik toifalar (kategoriyalar) qabul qilingan Viruslar tasnifi va taksonomiyasi yangi olingan ma’lumotlar asosida doimo to’ldirilib boriladi.
Viruslar Taksonomiyasi bo’yicha Xalqaro Tashkilot-VTXT (International Committee on Taxonomy of Viruses-ICTV) shug’illanadi. Bu tashkilot Butun Dunyo Sog’liqni Saqlash Tashkiloti bilan yaqin aloqada bo’ladi. Hozirgi kunda VTXT da 1550 xildan ortiq viruslar xususiyatlari yozilgan reestr tuzilgan va ma’lumotlar bazasi ICTV dB yaratilgan. Viruslar taksonomiyasining zamonaviy tizimi Linney tasnifining prinsiplariga asoslanadi va quyidagi taksonomik mezonlardan iborat: tartib, oila, oilacha, avlod, tur.
Tartib – genomning tipiga bog’liq ravishda virus oilalarini birlashtiradi va ularning lotincha nomlanishiga “ –viralis” qo’shimchasi qo’shiladi, masalan Mononega viralis (bir ipli manfiy RNK ipli).
Oila – umumiy evolyusion kelib chiqishiga ega bo’lgan viruslar guruhlaridan (avlodlardan) tashkil topadi. Oila nomning ohiriga viridae so’zi qo’yiladi, masalan Poxviridae.
Oilacha- bir oilaga kiruvchi viruslarni o’rganishda ularning umumiy evolyusion kelib chiqishiga qarshi yangi ma’lumotlar olingan tag’dirda bu tokson qo’llaniladi. Oilacha “-virinae” qo’shimchasiga ega. Masalan, chin chechak virusi oilasi 2 ta oilachaga Chordopoxvirinae (umurtqalilarda chin chechak ketirib chiqaruvchi) va Entomopoxvirinae (hashoratlarda chin chechak ketirib chiqaruvchi) bo’linadi.
Avlod - umumiy evolyusion kelib chiqishiga ega va umumiy ko’plab xususiyatlari o’xshash bo’lgan viruslarni jamlashtiradi. Avlod so’zi (virus) so’zi bilan tugaydi. Masalan Chordopoxvirinae oilachasiga 6 avlod kiritilgan, bulardan Orthopoxvirs va Parapoxvirs avlod vakillari tibbiy amaliyotda axamiyatliroq.
Tur – viruslarning avlod ichidagi bo’limidir. Tur bu nukleotid tarkibi o’xshash va ma’lum bir ekologik muhitni egallovchi bir avlodga mansub viruslar yig’indisidir. Turni nomlashda-“ virus” qo’shimchasi ishlatiladi. Masalan: chin chechak virusi, gripp virusi, Poliovirus, lekin hamma viruslarda oila osti kategoriyasi berilmagan va bakteriyalarga o’xshash binomenal (qo’sholoq) nomlash ham virusologiyada qo’llanilmaydi.
Virusologik amaliyotda viruslar turlari kenja tur, serovariantlar, genetik variantlar, shtamlar kabi rasmiy qabul qilinmagan ko’rsatkichlar ham keng qo’llaniladi.
Viruslarning tartib, oila, oilacha, avlod, turlarini aniqlashda asosiy mezonlar quyidagilarxisoblanadi:
1.Virus genomini tashkiliy tuzilishi va turi.
2.Virus replikasiyasining strategiyasi.
3.Virionning tuzilishi.
Avlod ichida turni saralash maqsadida quyidagi mezonlardan foydalaniladi:
- genom tarkibidagi o’xshashlik;
- tabiiy ho’jayini (ekologik manba);
- to’qima va hujayralarga trapizmi;
- patogenlik va sitopatologiya;
- infeksiyaning yuqish yo’li;
- virioning fizik-kimyoviy xususiyati;
- simmetriya tiplari;
- virusning antigenlik xususiyatlari.
Zamonaviy tasnif bo’yicha odam uchun patogen bo’lgan viruslar 20 ta oilaga kiritilgan. Bulardan 13 tasi RNK genomli viruslar va 7tasi esa DNK genomli viruslar xisoblanadi (rasm 32).
Virusologiyada qo’llaniladigan tekshiruv usullari.
D.I. Ivanovskiy chinni sham filtrlarni qo’llab viruslar olamini kashf qildi. Elektron mikroskopni kashf qilinishi, viruslarni ko’rish, ularning ultra strukturalarini o’rganishni ochib berdi. Gradient zichliklarda o’ta tez ultra sentrifugalarni qo’llash orqali viruslarning tozalangan preparatlarini olish imkoniyatini va ularning kimyoviy tarkibini o’rganishga olib keldi. Virusologiya fanini rivojlanishidagi asosiy omillardan biri, viruslarning o’stirib olish usullarini ishlab
chiqilganligi hisoblanadi. Viruslar obligat parazitlar bo’lib, faqat tirik hujayralardagina ko’paya olishi mumkin.
Viruslar keltirib chiqaruvchi yuqumli kasalliklar diognostikasida zamonoviy usullar bilan bir qatorda sinalgan turli xil viruslogik tekshirish usullari qo’llaniladi:
- elektron mikroskapiya usuli;
- sitoskapik, immunoflyuorissent usullar;
- hujayra kulturalarida viruslarni o’stirish va ajratib olish;
- rivojlanayotgan tovuq embirionida viruslarni o’stirish va ajratib olish;
- gemagglyutinasiya reaksiyasi yordamida viruslarni aniqlash;
- serologik reaksiyalar, an’anaviy serologik reaksiyalar (KBR,PR, NR) bilan bir qatorda zamonoviy (IFA, RIU, immunbloting) usullar;
- molekulyar-genetik tekshirish usullari- molekulyar gibridizasiya (MG) va polimeraza zanjirli reaksiya (PZR).
Asosan viruslarni laboratoriya sharoitida ajratib olishda quyidagi usullardan foydalaniladi: sezgir laboratoriya hayvonlarga yuqtirish, rivojlanuvchi tovuq embrionida va hujayra kulturasida o’stirish.
Viruslarni undirib olishda hujayra kulturalari muhim ahamiyatga egadir.
Hujayra kulturasi- sun’iy sharoitda o’sish va ko’payish qobiliyatiga ega bo’lgan, odam va hayvonlarning to’qima hujayralaridir.
Hujayra kulturalarini olish, qo’llashda 4 ta muhim bo’lgan muommalarni hal qilishga to’g’ri keladi, bularga kiradi:
1. Bir-biridan chegaralanib yotgan, miqdoriy jihatdan yetarili hujayralarni olish.
2. Bu hujayralarni saqlash va ko’payishini taminlovchi oziq muhitlarni qo’llash.
3. Hujayra kulturalarida bakteriyalarning ko’payib ketmasligi uchun chora tadbirlar qo’llash.
4. Viruslarni hujayra kulturalarida ko’pyayotganligini (indikasiya) aniqlash va ularni bir-birdan (identifikasiya) saralash.
Virusologik amaliyotda qo’llaniladiga oziqli muhitlar. Hujayra kulturasini saqlash va ko’paytirishda murakkab tarkibga ega bo’lgan muhitlar qo’llaniladi. Bu muhitlar tarkibiga aminokislotalar, vitaminlar, odam yoki hayvon qon zardobi, mineral tuzlar kiradi va ularning rN buferli eritmalar stabil saqlaydi.
Hujayra kulturalari uchun tayyorlangan ko’pgina oziqli muhitlar tarkibi tuzli eritmalardan iborat. Virusologik amaliyotda turli eritmalar hujayra kulturalarni organizimdan tashqarida yashashini taminlaydi va ularni tayyorlash jarayonida to’qima va hujayralarni yuvishda qo’llaniladi va virusologik oziq muhitlarni tayyorlashda asosiy manba bo’lib hisoblanadi. Amaliyotda eng ko’p Xenks va Erl tuzli eritmalari ishladiladi (jadval 8).
Virusologik amaliyotda qo’llaniladiga oziqli muhitlar kelib chiqishiga qarab farqlanadi:
1. Tabiiy oziq muhitlar (kam qo’llaniladi);
2. Oqsil moddalarning fermentativ gidrolizatlari;
3. Sun’iy oziq muhitlar.
Tabiiy oziq muhitlar asosan tuzli eritmalar asosida tayyorlaniladi va ularga odam va hayvonlar zardobi, amniotik suyuqlik va embrional ekstrakt qo’shiladi.
Zardoblar sog’lom odam, ot, sigir, buzoq, tovuq, quyon va boshqalarning qon zardoblari ishladiladi. Zardoblar olingandan kiyin ularni hujayra kulturalariga toksik ta’sirga ega emasligi aniqlanadi va uzoq mutdat sovutkichlarda saqlanishi mumkin.
Amnion suyuqligi homilador hayvonlardan, ayollardan aseptika qoidalariga rioya qilgan holda olinadi. Amnion suyuqligi rezina tiqinli flokonlarda sovutkichlarda saqlanadi.
Embrional ekstraktlar asosan 10-12 kunlik tovuq yoki hayvonlar embrionidan tayyorlanadi. Embrion tanasi qondan tozalanib, maydalaniladi va teng hajmda biror tuzli eritma (ko’pincha Xenks) qo’shiladi 30 minut sentrifuga (3000 aylanma/min.) qilinadi. Olingan cho’kma usti suyuqligi pipetkalar yordamida ajratib olinib muzlatkichlarda saqlanadi.
Fermentativ gidrolizat saqlovchi oziq muhitlar. Ko’proq sut laktoalbuminining gidrolizati va kozein va shoxli hayvonlarni oqsil gidrolizatlari ishlatiladi. Bu gidrolizatlardan oziq muhit tayyorlashda ularga tuzli eritmalar va 2, 4 va 10% gacha zardoblar qo’shiladi.
Sun’iy muhitlar. Bular ma’lum kimyoviy moddalardan tayyorlaniladi, shuning uchun ular doimiy va aniq tarkibga ega bo’ladi. Ular tabiiy moddalarga o’xshab ballast (begona oqsillar) tutmaydi. Bu muhitlar ancha murakkab tarkibga (aminokislotalar, vitaminlar, pirimidin, uglevodlar, mineral tuzlar va bosh. moddalar) ega bo’ladi. Bularga 199, Igla muhitlari kiradi.
Hujayra kulturalari. Hujayra kulturasi odam, hayvonlar, yoki parandalar va boshqa biologik ob’ektlar to’qimasidan tayyorlanadi. Hujayra kulturasini tayyorlash quyidagi bir necha ketma-ket bosqichdan iborat:
to’qimani olish, qondan, keraksiz to’qimalardan tozalash va maydalash.
tripsin ta’sir ettirib, hujayralarni bir-biridan ajratish.
hosil bo’lgan bir jinsli hujayralar suspenziyasini yuvib, tripsindan tozalash.
tayyorlangan hujayra kulturalarini sanash va hujayrani ma’lum miqdordagi suspenziyasini tayyorlash.
hujayra kulturalarini viruslarni undirishda qo’llaniladigan mahsus shisha probirka, flokon (matraslar) larda, hujayralarning o’sishini ta’minlab beradigan oziqli muhitlar qo’shib saqlash.
Hujayra kulturalarini olishda va saqlashda yuqorida keltirilgan oziqli muhitlardan foydalaniladi.
Hujayra kulturalarini bakteriyalar bilan ifloslanib qolmasligi uchun, hujayra kulturalari bilan ishlashda qa’tiy aseptik qoidalarga rioya qilgan holda maxsus steril bokslarda ish olib boriladi va tekshirilayotgan materiallardagi qo’shimcha mikroflorani ko’payib ketishini oldini olish maqsadida oziqli muhitlarga antibiotiklar qo’shiladi.
Hujayra kulturalarini tayyorlash usullari bo’yicha fiksasiyalangan to’qima bo’lakchalari kulturasi, bir qavatli, suspenziyalangan va organ kulturasi tafovut qilinadi.
1) Bir qavatli hujayra kulturasi- kimyoviy neytral shisha, plastika laboratoriya idishlari yuzasiga bir qavat bo’lib ( monosloy) birikib oluvchi va ko’payuvchi hujayra kulturalaridir. Virusologiya amaliyotida eng ko’p qo’llaniladi.
2) Suspenziyali hujayra kulturasi- oziqli muhitning hamma hajmida ko’payuvchi hujayralar yig’indisi bo’lib, ular har doim aylantiruvchi magnit yordamida aralashtirib turiladi. Bunday hujayra kulturalari virusologik amaliyotda vaksina preparatlari olishda qo’llaniladi.
3) Fiksasiyalangan to’qima bo’lakchalari kulturasi- maydalangan to’qima bo’lakchalari tovuq plazmasiga solinadi. Plazmada hosil bo’lgan cho’kmaga to’qima bo’lakchalari fiksasiyalanadi. Uning ustiga antibiotiklar va Xenks eritmasi, embrion ekstraktidan tayyorlangan suyuq suspenziya qo’shiladi.1-2 kundan kiyin to’qima bo’lakchalari atrofida plazma fibrinlaridan hosil bo’lgan to’rda yangi hujayralar o’sa boshlaydi.
Fiksasiyalangan to’qima bo’lakchalari kulturasini olish va saqlash ancha murakkab jarayon bo’lganligi sababli bu usulda olingan hujayra kulturalarini bir qavatli hujayra kulturasi amaliyotda siqib chiqarmoqda.
3) Organ kulturasi – Birlamchi strukturasi o’zgarmagan ma’lum organ bo’lakchalari yoki to’qima. Chegaralangan xolda qo’llaniladi.
Hujayra kulturasi va ularni undirib olish jarayonida bir qancha o’nlab generasiyalar (bir ko’payish sikli) kuzatiladi. Hujayra kulturalarining hayot faoliyati saqlanib qoluvchi generasiya sonlariga qarab bo’linadi: birlamchi hujayra kulturalari, undiriladigan va yarim undiriladigan.
Birlamchi hujayra kulturalari – to’qimalardan ajratib olingandan kiyin ko’payish generasiyasi 5-10 marotiba qayta undirib olishga yaraydi. Bunday hujayra kulturalari laboratoriya sharoitida embrional, normal to’qimalarini bo’lakchalaridan maxsus proteolitik fermentlar ( tripsin) ta’sir etirilib hujayra kulturalari olinadi.Birlamchi tripsinlangan hujayra kulturalarni kamchiligi asosan ularni bir necha generasiyadan kiyin ko’payishini to’xtab qolishi hisoblanadi.
Undiriladigan yoki stabil hujayra kulturalari – bunday hujayra kulturalari laboratoriya sharoitida bir necha 10 yillar ko’payish xususiyatini yo’qotmaydi va ko’plab qayta undirishlarga chidaydi. Bu hujayra kulturalari yuqori ko’payish potensialiga ega bo’lgan o’sma yoki embrional to’qimalardan olinadi Bularga xavfli o’sma hujayralari HeLa (birinchi marta bachadon bo’ynidagi karsinomadan), Ner-3 (limfoid karsinomasidan), hamda odam amnionining normal hujayralari, maymun buyragi va boshqalardan tayyorlapgan hujayralar kiradi va ular birlamchi hujayra kulturalariga nisbatan qator avfzalliklarga ega. Bularga kiradi: uzoq yillar undirilishi va yuqori ko’payish potensialiga ega bo’lishi, kam mexnat talabi, uzoq yillar muzlatib qo’yilganda ham o’zining xususiyatini yo’qotmasligi, xalqaro hujayra kultura liniyasi bo’ylab ko’plab dunyodagi laboratoriyalarda qo’llanilishi. Lekin, bu hujayralarning ko’plab generasiyalari natijasida havfli ko’payish xarakteri va somatik mutasiyalarga uchrash extimolligi bu hujayralarni virus vaksinalari olish jarayonlarida qo’llashni chegaralab qo’yishga olib kelgan.
Yarim undiriladigan (diploid) hujayra kulturalari – ko’paytirilib undirilishi chegaralangan 40 va 50 generasiyaga chidaydi. Bu hujayralar asosan odam embrioni diploid hujayralaridan olinadi. Undirilish jarayonida bu hujayralar o’zlarini birlamchi avlodlari singari tarkibida diploid xromosoma to’plami saqlashodi va havfli hujayra formasiga transformasiyalanmaydi. Shuning uchun bu hujayra kulturalaridan virusologik amaliyotda diognostik va vaksinalar olish maqsadlarida keng qo’llaniladi.
Viruslarni indikasiya qilish usullari. Virusologik amaliyotga hujayra kulturalarining kirib kelishi , oldin noma’lum bo’lgan ko’plab kasallik qo’zg’atuvchi viruslarni ajratib olish va ularni identifikasiya qilish imkoniyatlarini ochib berdi. Hozirgi kunda har bir viruslar uchun sezgir hujayra kulturalarini tanlash imkoniyatlari movjud.
Hujayra kulturalariga virus saqluvchi materialni yuqtirilganda, virusning ko’payishi (reproduksiyasi) natijasida hujayralarda turli o’zgarishlar ( destruksiya) kiritmalar hosil bo’lishi kuzatiladi. Viruslarning bunday xususiyati SPT (sito patologik ta’siri) ya’ni hujayrani morfologiyasini o’zgarishi, hatto uning o’limiga sabab bo’luvchi faktor deb qaraladi. Ularni quyidagi fenomenlar asosida aniqlash (indikasiya) mumkin:
1. Virusni hujayraga sitopatologik ta’siri (effekti)
2. Virusni hujayrada kiritmalar hosil qilishi
3. Pilakchalar (blyashek) hujayra kulturasida hosil qilishi
4. Gemadsorbsiya reaksiyasi
5. Gemagglyutinasiya reaksiyasi
6. Rangli reaksiya
7. Interferensiya fenomeni
Virusni hujayraga sitopatologik ta’siri (effekti). Viruslarning hujayra kulturasida ko’payayotganligi (reproduksiyasi), ularning hujayraga SPT asosida mikroskop ostida ko’rish bilan aniqlanadi va morfologik o’zgarishlarning sodir bo’lganligiga qarab baholanadi. Bunda ularning bir qismi halok bo’lib, probirka devoridan ko’chadi. Ayrim hujayralarning yemirilishi oqibatida ajralib chiqqan viruslar boshqa hujayralarga yuqadi. Ma’lum vaqtdan so’ng bu hujayralar ham o’ladi. Natijada bir qavatli yaxlit hujayra qatlami o’rnida alohida-alohida xujayrasiz zonada hujayra orolchalari hosil bo’ladi. Turli viruslar hosil qilgan (SPT) ning xarakteri bir xil emas. Bir xil viruslar (poliviruslar, Koksaki va bosh.) mayda donodor bir xil tipdagi hujayra destruksiyasini keltirib chiqaradi (rasm 33), o’choqli mayda donodor destruksiyani (gripp, kana ensefaliti) viruslari, katta donador bir xil ko’rinishdagi destruksiyani (gerpes) viruslar, simplast ko’p yadroli hujayralarni ( retroviruslar, morbiloviruslar, respirator-sinsitial) viruslar keltirib chiqaradi. Viruslarning SPT amaliyotda viruslarning birlamchi indikasiya qilishda va oldindan taxminiy tashxis qo’yishda qo’llaniladi.
Virusni hujayrada kiritmalar hosil qilishi. Ko’pchilik viruslar hujayralarda ko’payganda hujayrada ilgari kuzatilmagan kiritmalar hosil qilishlari mumkin. Masalan qutirish virusi nerv hujayralarning sitoplazmasida eozinofilli kiritmalar xosil qiladi (Babesh-Negre tanachasi), virus nukleokapsidlarini sitoplazmada (yadro oldida) yig’ilib qolishi natijasida kuzatiladi. Chin chechak virusi xujayin hujayrasining sitoplazmasida ko’payadi va sitoplazmada katta hujayralar va ularning sitoplazmasida Gvarnieri tanachalarini hosil qiladi. Yorug’lik mikroskopida ham aniqlash mumkin (rasm-34).
Pilakchalar (blyashek) hujayra kulturasida hosil qilishi.
Viruslarning miqdori jihatdan aniq sonini hisobga olish usuli hisoblanadi (34-rasm). Viruslarni ajratib olishda bir qavatli hujayra kulturasidagi oziqli muhit olib tashlanib virus saqlovchi material saqlovchi material bilan hujayra kulturasiga virus yuqtiriladi, so’ngra neytral qizil indikator qo’shilgan yupqa agar qatlami bilan qoplanadi..
Termostatda bir necha kun saqlab turilgandan so’ng, agar qoplamasida ma’lum shakldagi oq-oq dog’lar monoqatlam fonida (pilakcha) paydo bo’ladi. Bu esa, bir tekisda o’sgan hujayra kulturasi tarkibida virus ko’payishi natijasida hosil bo’lgan jonsizlangan hujayralar to’plamidir. Har bir pilakcha birgina virus zarrachasining ko’payishi natijasida hosil bo’lib, neytral qizil bilan bo’yalgan hujayralar fonida yumaloq oq dog’lar shaklida ko’rinadi.
Shu usul bilan aniqlangan virusning titri 1 ml tekshirilayotgan materialda pilakcha hosil qiluvchi birlik (PXB) bilan belgilanadi. Pilakchaning katta-kichikligi, morfologiyasi va uning paydo bo’lish vaqti, virusning har xil turida turlicha bo’ladi, xatto shu turning ichidagi ayrim shtammlarida ham farqlanadi. Viruslarning bu xususiyati shtammlarni seleksiya qilishda va ularning sof liniyasini ajratib olishda qo’llaniladi.
Gemadsorbsiya reaksiyasi. Viruslarni indikasiya qilish usullaridan biri, ular kirib ko’payayotgan (reproduksiya) hujayraning yuzasi eritrositlarni adsorbsiya qilish qobiliyatiga asoslangan, bu esa gemadsorbsiya reaksiyasi deyiladi (34 -rasm). Gemadsorbsiya ham gemagglyutinasiya reaksiyasiga o’xshash mexanizimga ega. Gemadsorbsiyalash xossasiga ega bo’lishi virus yuqtirgan hujayra membranasida virusga xos maxsus oqsillarning –gemagglyutininlarning joylashganiga bog’liq bo’lib, eritrositlarda bu oqsillarga komplementar reseptorlar bo’ladi va shuning uchun ham ular virus bilan zararlangan hujayralar yuzasiga adsorbsiyalanadi. Bu reaksiyani qo’yish uchun viruslar bilan zararlangan hujayra kulturasira eritrositlar (ko’proq tovuq, dengiz cho’chqachasi, maymun va odamning O (I) eritrositlari ishlatiladi) suspenziyasi qo’shiladi. Ma’lum vaqtdan so’ng hujayralar natriy xloridning izotonik eritmasi bilan yuviladi. Tarkibpda viruslar bo’lgan hujayralar yuzasida eritrositlar yopishganicha qoladi. Yorug’lik mikroskopida ko’rish mumkin. Virus yuqtirilgan hujayra kulturasiga tip maxsusligini na’mayon qilovchi zardob qo’shilib saqlansa, hujayralar gemadsorbsiya qilish qobilyatini yo’qotadi, ya’ni gemadsorbsiya tormozlanib qoladi. Bu fenomen viruslarning identifikasiyasida qo’llaniladi.
Gemagglyutinasiya reaksiyasi. Bu reaksiya suyuqlikdagi hujayra kulturasi yoki tovuq embrionining xorion-allantois yoki amniotik suyuqlikdagi viruslarni indikasiya qilish uchun ko’llaniladi.
Gemagglyutinasiya reaksiyasida virus superkapsidi tarkibida gemagglyutinin fermenti bo’lgan viruslar (gripp, paragripp) keltirib chiqaradi, ya’niy virus ko’paygan hujayra kulturasiga tovuq, g’oz, dengiz cho’chqachalari eritrositlari qo’shilsa, viruslar eritrositlarni bir-biriga yopishtirib (rasm 35) qo’yadi. Bu usulda viruslarning suyuqlikdagi titrini suyultirish darajasiga qarab aniqlash mumkin. Virusologik amaliyotda viruslarning indikasiya qilishda keng qo’llaniladi.
Rangli reaksiya. Hujayra kulturalarida viruslarni ko’payishini rangli reaksiya orqali ham indikasiya qilish mumkin. Buning aniqlash, normal ko’payuuvchi hujayra kulturasi uchun qo’llanilgan oziqli muhitdagi indikatordan foydalaniladi. Agar hujayrada virus ko’paymasa tirik hujayra kulturalarda normal metobalitik jarayon kuzatiladi va bu jarayon natijasida nordon maxsulotlari yg’ilib qoladi, indikator rangi o’zgaradi. Hujayra kulturasida virus ko’paysa, hujayraning metobalizimi buziladi (nobud bo’lishiga olib keladi) indikator rangi o’zgarmaydi.
Interferensiya fenomeni. Bu usul asosan hujayra kulturalarida ko’payib, lekin aniqlab bo’lmaydigan HPT xususiyatga ega bo’lgan viruslarni indikasiya qilishda qo’llaniladi. Hujayra kulturasiga virus saqlovchi material yuqtiriladi keyin esa indikator virus (vezikulyar stomatit virusi VSV) yuqtiriladi. Agar tekshirilayotgan materialda izlanilayotgan virus bo’lsa indikator virusni HPT kuzatilmaydi (hujayra izlanilayotgan virus tomonidan egallangan) . Yorug’lik mikroskopida vizual ko’rish mumkin. Tekshirilayotgan materialda virus bo’lmasa VSV hujayraga patologik ta’sir ko’rsatadi.
Viruslarni undirib olishda tovuq embrionidan foydalanish (rasm 36). Virusologik amaliyotda tovuq embrioni hujayra kulturasi va tajriba qilinayotgan hayvonlarga nisbatan bakteriyalar bilan ifloslanish darajasi kam va qo’shimcha mikroorganizmlar bilan kamdan-kam hollardagina zararlangan bo’ladi. Bundan tashqari, turli ta’sirotlarga ham juda
chidamlidir. Rikketsiya, xlamidiya va bir qator viruslarning diagnostik maqsadlarda, sof kulturasini olish va turli preparatlar (vaksina, diagnostikumlarni) tayyorlash uchun 8—12 kunlik tovuq embrionlaridan foydalaniladi. Yuqorida ko’rsatilgan mikroorganizmlarning ko’payganligi embrion qobiqlarining ochilganidan so’ng pardalarida hosil bo’lgan morfologik o’zgarishlar orqali o’rganiladi.Masalan chin chechak yuqtirigan embrion tanasida, qobig’ida qon quyilishlar kuzatiladi, embrion nobud bo’ladi. Bundan tashqari virus ko’payishi natijasida allantois, amnion suyuqligida viruslar yig’ilib qoladi va gemagglyutinin fermenti bor viruslarni GAR orqali indikasiya qilish mumkin.
Rivojlanayotgan tovuq embrionida viruslarni ko’paytirish sanoat miqiyosida qo’llaniladi, ammo ko’pchilik viruslar tovuq embrionida ko’paymaydi, bundan tashqari tekshirilayotgan viruslarni embrionini ochmay turib aniqlab bo’lmaydi, shuningdek unda ko’p miqdordagi oqsil va boshqa yod birikmalarning borligi, tayyorlangan preparatlarni allergik xususiyatini oshiradi, ularni tozalanishini qiyinlashtiradi.
Viruslarni ko’paytirishda laboratoriya hayvonlaridan foydalanish. Amalda ko’pincha turli xil zotsiz laboratoriya hayvonlaridan (voyaga yetgan, emadigon sichqon bolalari, quyon, maymun, dengiz cho’chqachalari va bosh) foydalaniladi. Hayvonlarning ma’lum turdagi viruslarga beriluvchanligi va ularning yoshi viruslarning ko’payish qobiliyati tajribada xisobga olinadi. Ko’pincha yangi tug’ilgan hayvonlargina u yoki bu virusga (masalan, emadigan sichqon bolalari — Koksaki virusiga, sichqon, quyon- qutirish virusiga, oqsim (yashur) virusi- dengiz cho’chqachasi va gripp virusi–sichqon va og’maxon) sezgir bo’ladi.
Bu usulning afzalliklari va kamchiliklari mavjud. Afzalligi shuki, bunda kultura yoki tovuq embrionida yaxshi reproduksiya qilinmaydigan viruslarni ajratib olish mumkin bo’ladi. Bu usulning kamchiligi esa, tajriba qilinayotgan hayvon organizmidagi mikroorganizmlarning begona virus va mikoplazmalar bilan aralashib ketishidadir.Bundan tashqari ekonomik etikaviy jihatlari, shuningdek, virusning “sof” liniyasini olish uchun keyinchalik hujayra kulturasiga hayvondan olingan material yuqtiriladi, bu esa tekshirish muddatini cho’zib yuboradi.
Virus saqlovchi materiallarni laboratoriya hayvonlarga yuqtirishni turli (teri ostiga, teri ichiga. muskul ichiga, qorin pardasiga, subdural va bosh.) usullari qo’llaniladi.
Viruslarning laboratoriya hayvonlar organizimida reproduksiya bo’lganligini kasallikni ko’zga tashlanadigon klinik rivojlanishi, organ va to’qimalarning patomorfologik o’zgarishi, organlardan olingan suspenziyalarda virus borligini gemagglyutinasiya (GAR), neytralizasiya (NR) reaksiyalari orqali (agar virus o’z tarkibida gemagglyutinin fermenti tutsa) aniqlash mumkin.
Metodik ko’rsatmalar
Viruslarni morozov usulida bo’yash.
Viruslarni Morozov usuli bilan bo’yash uchun uchta reaktiv tayyorlanadi:
1) 1 ml muzli sirka kislotasiga 40% li 2 ml formalin eritmasi qo’shiladi va distirlangan suv bilan uning hajmi 100 ml ga yetkaziladi;
2) 1 ml karbol kislotasiga 5 g tanin qo’shiladi va distirlangan suv bilan uning hajmi 100 ml ga yetkaziladi;
3) 5 ml kumush nitrati eritmasiga ammiak eritmasi biroz quyqa hosil bo’lgunga qadar tomchilab tomiziladi.
Bo’yash usuli: 1) tayyorlangan surtma — 1-eritma bilan 1 min davomida fiksasiyalanadi, so’ng reaktiv to’kiladi va surtma suv bilan yuviladi;
2) u 2-eritma bilan 1—2 min davomida to bug’ paydo bo’lguncha qizdiriladi, so’ngra suv bilan yuviladi;
3) 3-eritma .bilan surtma to’q jigar rang hosil bo’lgunga qadar qizdiriladi, so’ng suv bilan yuvib, quritiladi va mikroskop ostida ko’riladi. Bunda virus elementar tanachalari qora rangga bo’yaladi.Morozov usulida bo’yalganda ospa vaksina virusni o’lchami 0.2 mkm bo’lib kokksimon ko’rinishda bo’ladi. Viruslarning SPT ni o’rganish. Probirkadagi hujayra kulturasini tekshirish uchun mikroskopning buyum stolchasiga probirka shunday qo’yiladiki, undagi bir qavatli hujayra qatlami yuqoriga qaragan holda bo’lishi kerak. Bir qavatli hujayra yopishgan joyi probirkaning qarama-qarshi tomonidan qalam bilan belgilab qo’yiladi.
Materialni yuqtirishdan oldin tuxumning havoli kamera ustidagi po’stlog’i 70º li spirt bilan tozalanadi, alangada qizdiriladi, 2% li yod eritmasi surtiladi, ikkinchi marta spirt bilan artiladi va qizdiriladi.
Allantois bo’shlig’iga yuqtirish uchun havoli kamera ( ovoskopda tuxumga yorug’lik tushirilganda uning chegarasi oldindan kalam bilan chizib qo’yiladi) ustidagi tuxum po’chog’i qaychi, skalpel yoki maxsus asbob yordamida extiyotlik bilan teshiladi. Shpris bilan 0,1—0,2 ml virusli material ( antibiotik qo’shilib ishlov berilgan) havo kamerasi chegarasidan 2 — 3 mm chuqurlikka yuboriladi. Tuxum po’chog’idagi teshikka eritilgan parafin quyiladi.
Zararlangan embrion virus juda ko’paygan vaqtda, ya’ni 48—72 soat 37 ºC da termostatda saqlangandan so’ng ochiladi. Tuxum spirt bilan artiladi va unga 2% li yod eritmasi surtiladi. So’ngra qaychi bilan havo kamera atrofi bo’ylab chizilgan belgidan biroz yuqoriroqdan tuxum po’chog’i kesiladi. Bunda tuxum po’chog’i bo’shliqqa tushmasligi uchun, qiyshaytirilgan holda ushlanadi (37-rasm). Po’choq olinib, asta-sekin uning pardasi ham olinadi va xorion-allantois pardasining virus yuqtirilgan joyida gemorragik, oqimtir shikastlanish o’choqlarining bor-yo’qligi qayd qilinadi. So’ngra paster pipetkasi bilan xorion-allantois pardasining qon tomiri kam bo’lgan joyidan teshiladi va allantois suyuqligi so’rib olinadi. Keyin xorion-allantois pardasi ajratib olinib, ikki marta natriy xloridning izotonik eritmasi bilan yuviladi, Petri kosachasiga o’rnatiladi va qora fonda, maxsus (spesifik) zararlanish borligi aniqlanadi.
Gemagglyutinasiya reaksiyasini qo’yish (GAR). Tovuq embrioni ochilgandan so’ng allantois suyuqligi so’rib olinadi va probirkalarga yoki pleksiglasdan tayyorlangan plastinkalar chuqurchasiga 0,5 ml hajmda (kontrol uchun 0,5 ml yuqtirilmagan embrionning shunday suyuqligidan) quyiladi. So’ngra uning ustiga 0,2 ml 1 % li yuvilgan tovuq eritrositidan qo’shiladi va uy temperaturasida saqlanadi. Reaksiya natijasi 40 min. dan so’ng, ya’ni eritrositlar cho’kma hosil qilgandan keyin tekshiriladi. Reaksiya musbat bo’lsa probirkaning ostida bir –biri bilan yopishgan eritrositlardan tashkil topgan yupqa parda zontik xosil bo’ladi. Reaksiya natijalari 4 tagacha musbat belgi bilan aniqlanadi. Yaxshi gemagglyutnasiya + + + + — bu holatda probirkaning ostida parda zontik yaqol ko’rinishida bo’ladi; + + + pardaning oralarida ochiq joylar koladi; + + eritrositlarning birlashishida viruslar kamayganligi sababli parda chetlari tekislashadi; + kam agglyutinasiyalangan eritrositlar birikmalari bilan o’ralgan eritrositlarniig cho’kmasi; — eritrositlar cho’kmasining atrof chegarasi yaqqol ko’rinib turadi, ammo kontroldan (eritrositlar tugmacha formasini oladi) farq qilmaydi- Agar tajribadagi probirkalarda gemagglyutinasiya bo’lib, kontrol probirkalarda bo’lmasa, bu — tekshirilayotgan suyuqlikda virus borligini ko’rsatadi.
Viruslarni indikasiya qilishda tekshirilayotgan suyuqliklarda viruslarning titrini ( miqdoriy ko’rsatkichini) aniqlash muhim amaliy ahamiyatga ega. Virus saqlovchi materialni maksimal suyultirilganda virus o’zining (SPT. GAR, xayvonlarni nobud qilish va bosh.) infeksion aktivligini na’moyon qila oladigan miqdoriga virus titri deb ataladi. Titr 1 birlik qilib olingan, ya’niy shu titrda viruslar 50% yuqtirilgan kulturalarda SPT keltirib chiqaradi. GAR virus tirtri deb ++ ( I AE – bitta agglyutinasiya beruvchi birlik) dan kam bo’lmagan eritrasitlarni agglyutinasiyasini beruvchi eng ko’p suyultirilgan eritmasiga aytiladi. Viruslarni titrlarini aniqlash , viruslarning ishchi, yuqish dozalari ishlab chiqishda va keyinchalik viruslarni
Bakteriofaglar ( “bakteriya va yunoncha so’z phagos yeb yuboruvchi) –bakteriya hujayralariga maxsus kirishi va ularda parazitlik qilib, lizisga, o’limga olib keluvchi bakteriya viruslari xisoblanadi.
Bakteriofaglar atrof-muhitda, suv havzalarida, tuproqda keng tarqalgan.Shu bilan birgalikda ularni ko’pchiligi bakteriyalardan va boshqa mikroorganizmlardan va zamburug’lardan topilgan.Shuning uchun bakteriofaglar keng ma’noda umumiy so’z bilan fag deb nomlanadi. Faglarni nomlashda lotin, yunon va rus alfaviti hariflaridan, sifrlardan foydalaniladi va ularning oldida bakteriya avlodi va turi yoziladi ( E. coli T2 ). Qarindosh avlod va tur vakillarini nomlashda, ularning ajratib olingan manbasi nomi beriladi: kolifaglar, stafilofaglar, aktinofaglar va bosh.
Faglarni asosan elektron mikroskopda ularning ultrastrukturasi o’rganiladi (rasm 38). Faglar shakli va struktura tuzilishi jihatdan bir nechta morfologik tiplarga bo’linadi: ipsimon; mayda kubsimon
(ba’zilarida o’simtalar analogi bo’lishi mumkin); spermatozoidsimon faglar, ya’niy kubsimon boshi va dum qismidan iborat bo’lib, ustida qisqaruvchi va qisqarmaydigan yopqichlar mavjud bo’ladi. Faglarni o’lcham 20 dan 800 nm gacha bo’ladi.
Faglar o’zlarini tarkibida DNK yoki RNK tutadi. Faglarni nuklein kislotalari ikki ipli, bir ipli, chiziqli halqasimon bo’lishi mumkin. Ko’pchilik faglar ikki ipli halqasimon DNK tutadi. Struktura tuzilishlari viruslarga o’xshash kapsid va kapsomerlar faglar shakillanishida qatnashadi, lekin faglarda simmetriya tiplari aralash bo’ladi. Bosh qismi kubsimon simmetriyaga ega bo’lsa dum qismida spirallsimon simmetriya tiplari uchraydi.
Faglarni antigen xususiyati. Bakteriofaglar gruppospesifik va tipospesifik antigenlar tutadi va ular immunogen xususiyatga ega, organizmda maxsus antitelalar hosil qiladi.Bu antitelalar faglar bilan birikib ularni bakteriyaga qarshi litik xususiyatini neytrallashi mumkin.Tipospesifik xususiyati bo’yicha faglar serotiplarga bo’linadi.
Rezistentligi (chidamliligi). Viruslarga qaraganda tashqiy muhit faktorlariga ancha chidamli. Temperatura tasirida 65-70ºS o’ladi,bundan tashqari UF nurlari va radiasiyaning yuqori dozalari, kislota, farmolinlarga chidamli.Uzoq vaqt past temperaturada, quritganda saqlanib qoladi.
Faglarning yuqumliligi o’ta maxsus bo’lib, ma’lum bakteriyalarda ko’payadi. Ularni maxsus strukturasiga nisbatan sezgir bakteriyalarda reseptorlar mavjud.Faglarni sezgir bakteriyalar bilan maxsus o’zaro munosabatiga asosan faglar quyidagi ko’rinishlarda bo’ladi: polivalent – qarindosh bakteriyalarda ko’payya oladi; monovalent- ma’lum tur bakteriyalarda ko’payadi; tipovoy – bakteriya turlarining aloxida tiplarida ko’paya oladi.
Faglarni bakteriya bilan o’zaro munosabati viruslarga o’xshab produktiv, abortiv va integrativ ko’rinishda kuzatiladi. Produktiv formada fag bakteriyani to’liq lizisga uchratadi va fagning avlodlari hosil bo’ladi. Abortiv formada, bakteriya lizisga uchramaydi va fagning avlodlari ham hosil bo’lmaydi. Integrativ tipda esa fag bakteriyaning xromosomasiga kirib oladi va u bilan birga (profag) turadi. Shuning uchun faglarni bakteriyalar bilan o’zaro munosabati natijasida ular ikki xil ko’rinishda, virulent va avirulent (mo’’tadil) bo’ladi.
Virulent faglarni bakteriyalar bilan o’zaro munosabati produktiv tipda kuzatiladi. Ularning reproduksiyasida 200-300 ta yangi faglar xosil bo’ladi.
Mo’’tadil faglar virulent faglardan farqlanib ularning bakteriyalar bilan munosabati produktiv yoki integrativ bo’lishi mumkin (rasm -39). Produktiv ko’rinishda virulent fagdan reproduksiyasida farq kuzatilmaydi va bakteriyaning lizisi bilan tugaydi. Integrativ tipda fag genomi bakteriyaxromosomasiga kirib oladi va sinxron ko’rinishda ko’payayotgan bakteriya genomi bilan birga replikasiya bo’ladi, bakteriyani lizisga uchratmaydi. Shunday DNK saqlovchi faglar p r o f a g deb ataladi, bakteriya esa “l i z o g ye n” li kultura deb nomlanadi, chunki bunday lizogenli bakteriyalarda har doim profag aktivlansa lizisga uchrash ehtimoli yuqori bo’ladi.. Bunday bakteriyalar profagni o’z avlodlariga o’tkazadi. Lekin, fag replikasiyaga uchramaydi va o’z naslini qoldirmaydi. Buning sababi bakteriya hujayrasida fagni transkripsiyasini to’xtatib turuvchi past molekulyar oqsil repressor ishlab chiqiladi. Repressorlar biosentizini fag genlari boshqaradi. Shuning uchun bunday lizogenli bakteriyalarda boshqa faglarga nisbatan immunitet xosil bo’ladi, ya’niy boshqa yaqin qarindosh faglar bakteriyaga kira olmaydi.Ammo, lizogen termini shu bakteriyalarni har doim lizisga uchrashi mumkinligini bildiradi. Buning isboti sifatida, bakteriyalar tarkibidagi fag o’z-o’zidan spantan ravishda, yoki fizik, kimyoviy faktorlar ta’sirida vegitativ formaga o’tishi va bakteriya hujayrasini lizisga uchratishi mumkin. Bakteriya xromosomasidan ajrab chiqgan fag, bakteriyadan ma’lum ma’lum informasiya saqluvchi genlarni o’ziga biriktirib olishi va bu ma’lumotlarni boshqa bakteriyalarga (transduksiya xodisasi) o’tkazishi mumkin. Bakteriyalar oldin o’zlarida kuzatilmagan belgi va xususiyatlarni na’moyon qilishi mumkin. Profag ta’sirida bakteriyalarni xususiyatlarini o’zgarishi “ fagli konversiya” deb nomlangan ( lot. sonver-sio- o’zgartirmoq).
Bakteriofaglar amaliyotda quyidagi maqsadlarda qo’llaniladi; fagoterapiyada, fagoprofilaktikada, fagoidentifikasiyada va fagotiplashda.Bundan tashqari ichak tayoqchasini kolifagi tashqi muhit ob’ektlarini ifloslanishini aniqlashda sanitar ko’rsatkich (indikator) mikroorganizm sifatida qo’llaniladi:
1) fagoterapiya — ayrim yuqumli kasalliklarni keltirib chiqaradigan (shigella, protey, stafilokokk, ko’k yiring tayoqchasi) bakteriyalarga qarshi davolashda ishlatiladi.
2) fagoprofilaktikada — epidemik o’chokda bo’lgan kishilar orasida ayrim kasalliklarning oldini olishda (masalan, dizenteriya, vabo);
3) fagoidentifikasiyada — fag yordamida bakteriya kulturasini qaysi turga mansubligini aniqlash;
4) fagodiagnostika kasal organizmidan (masalan, najasdan) fagni ajratib olishdan iborat bo’lib, organizmda shu fagning mikrobi borligini ko’rsatadi, ya’ni fag bilan diagnoz qo’yish;
5) fagotiplash - bakteriyalarni fagotipini aniqlashda, ya’ni fagotipning, bir turdagi bakteriya shtammini shu tipga xos faglar bilan lizis qilish orqali aniqlanadi; bu esa tekshirilayotgan kulturalarni belgilaganda, kasallikni epidemiologik tekshirishda ayniqsa muhimdir.
Amaliyotda bulonda o’stirilgan bakteriyalar hujayralaridagi virulent faglar reproduksiyasi bu hujayralarning lizisga uchrashi va muhitning tiniq, yaltiroq tusga aylanishi bilan tugaydi. Petri kosachasidagi agarli muhitda sezuvchan bakteriyani gazon usuli bilan o’stirilganda faglar lizis o’choqli yoki yaxlit zonalarini hosil qiladi. Bu esa, fagning kopsentrasiyasiga bog’liqdir. Lizisning o’choqli zonalari fagning negativ koloniyalari yoki steril dog’lar — pilakchalar deb nomlanadi. Ular ma’lum faglarga xos morfologiyaga ega bo’lib, birgina fag zarrachasidan hosil bo’ladi va boshqa hujayralarga kirishi va keyinchalik ko’payishi natijasida hosil bo’ladi.
Fagning «sof liniyasini» (boshqa faglar aralashmasidan holi) olish uchun morfologik jihatdan bir xil bo’lgan negativ koloniyalarning qator passajlari bir xil bakterial shtamm gazonining aynan o’zida olib boriladi.
Metodik ko’rsatmalar
Fagni atrof-muhitdan ajratib olish. Virulentli fag olish uchun dastlabki material (suv, najas suspenziyasi va boshkalar) bakteriya filtridan o’tkaziladi. So’ng filtrat tayyorlanadi. Olingan filtrat ma’lum bakteriya kulturasi bilan birgalikda bulonga ekiladi va termostatda 37°S da 18—24 soat davomida saqlanadi. Kultura lizisga uchragandan so’ng, qolgan bakteriya hujayralaridan fag sentrafuga yordamida yoki filtrdan o’tkazib tozalanadi. Filtratda fagning borligini sifat va son jihatidan aniklaydigan usullar bilan tekshiriladi.
S.aureus fagini sifatini aniqlash usuli Oziqli agarli Petri kosachasiga S.aureus sutkali, bulonli kulturasi gazon bilan ekiladi va 37°S da 10—15 min davomida quritiladi. So’ng gazon yuzasiga bir tomchi fag tomiziladi va ikkinchi chetiga tomchi yetib borguncha Petri kosachasi qiyshaytiriladi. Termostatda bir sutka davomida inkubasiya qilinganidan so’ng, kosacha ko’zdan kechiriladi, bunda fag tomchisi tekkan yerda lizis zonasining borligi belgilanadi.
Miqdoriy usul — Grasia usuli bilan fagning titrini aniqlash.
Usulning moxiyati. Probirkadagi suyultirilgan GPA ga indikator mikrobidan va suyultirilgan ma’lum fag saqlovchi materialdan 1.0 ml quyiladi va yaxshilab aralashtiriladi so’ng Petri kasachasiga quyib inkubasiya qilingandan kiyin kosachadagi negativ koloniyalar sanaladi va 1.0 ml tekshirilayotgan materialdagi virus miqdori xisoblab topiladi. Tajriba o’tkazish uchun oldindan quyidalarni tayyorlash dozim:
a) oziqli agar Petri kosachasiga quyiladi, termostatda kuritiladi;
b) 3—4 ml dan probirkaga quyilgan, 0,7% li yarim suyuq oziqli agar suv hammomida eritiladi.
Tekshirilayotgan fag o’n martadan (10-2-10-7 va yana ham fagning taxminiy titriga ko’ra ko’proq suyultirshi mumkin) natriy xloridning izotonik eritmasida suyultiriladi. So’ng eng oxirgi suyultirilgan (10-7) fagdan 0,5 ml olib, shy hajmdagi fagga sezuvchan bakteriyaning sutkali bulonli kulturasi bilan aralashtiriladi va 45 S gacha sovutilgan, yarim suyuq agarli probirkaga quyiladi. Bu aralashma tezlikda agarli Petri kosachasiga quyiladi, nadijada yupqa qavat hosil qilib qotadi. Bakteriyalar va yarim cyyuq agar bilan keyingi (10 6) suyultirishdagi fag aralashmasi ham xuddi shunday tayyorlanib, boshqa kosachadagi agar yuziga quyiladi, keyin — 10 5 suyultirilgan joydan aralashma tayyorlanadi.
Agarning ikkinchi quyilgan qavati qotganidan so’ng kosacha 37°S da inkubasiya kilinadi. Fag bilan zararlanmagan bakteriyalar ko’payib, oziqli agar yuzasida bir tekis o’sib, gazon hosil qiladi.
Fag bilan zararlangan har bir bakteriya lizisga uchraydi va natijada bir necha yuz yangi fag zarrachalarn ajralib chiqadi. Ular butun hujayralarga yana kiradilar va sikl qaytadan boshlanadi. Hujayralar lizisi natijasida yaxlit bakterial gazon ichida «steril» dog’lar yoki fagning negativ koloniyalari hosil bo’ladi. Shu dog’larning soni aralashmadagi ekilgan fag zarrachalarining soniga teng. Ya’ni 1 ml tekshirilayotgan suspenziyadagi miqdorini ko’rsatadi, bu esa uning titri deb ataladi. Masalan 10 - 7 suyultirilgan namunadan ekilganda hosil bo’lgan fagning “steril” dog’lar soni 5 ta ekan, bunda 1 ml tekshirilayotgan suspenziyadagi fag miqdori 7,5 x 107 teng bo’ladi.
Labaratoriya mashg’uloti 5
Mavzu: Dorilarning va dorivor xom ashyolarni sanitar mikrobiologik usullarda tekshirish. Dorivor preparatlarning sterilligini aniqlash usullari.
Dars soati : 2 soat
1. Darsning maqsadi: Talabalarda dori-darmonlar va dori vositalarining mikrob bilan zararlanish manbalari , zararlanishnung oldini olish choralari, zararlanishning mikrobiologik nazorat qilish usullari haqida bilim hosil qilish.
2. Darsning vazifasi: Talabalarda dori preparatlardagi umumiy va patogen mikroblar sonini aniqlash usullarini , dorivor moddalarning sterilligini aniqlash usullarini o’rgatish.
Mavzuga mustaqil tayyorlanish uchun savollar.
1. Dori-darmonlar va dori vositalarining mikrob bilan zararlanish manbalari.
2. Dori-darmonlarning mikrob bilan zararlanishining oldini olish choralari.
3. Dori-darmonlarning zararlanishini mikrobiologik nazorat qilish usullari.
4. Sterillangan dorivor moddalarni ishlab chiqarishdagi asosiy talablar.
5. Pirogenlar, ularning dorivor moddalarga tushib qolish xavfi.
6. Dorivor moddalarning sterilligini aniqlashning metodlari.
3. Darsning mazmuni:
1. O’simliklarda uchraydigan mikroorganizmlarning asosiy turlari va ular to’grisida ma'lumot.
2. O’simliklarda uchraydigan kasalliklar va ularga qarshi kurash choralari.
3. Dori-darmonlar va dori vositalarining mikrob bilan zararlanish manbalari.
4. Dori-darmonlarning mikrob bilan zararlanishining oldini olish choralari.
5. Dori-darmonlarning zararlanishini mikrobiologik nazorat qilish usullari.
4. O’quv jarayonini amalga oshirish texnologiyasi (metod, forma, (shakl) vosita, usul, nazorat, baholash).
a) Darsning turi-suhbat
b) Metod:- 1.Davra suhbati”, 2. “Qor bo’ron”, 3.”interaktiv usul”.
v) Forma(shakl)-guruh
g) Vosita-doska, tarqatma material, tablitsa, tayyor preparat, mikroskop,
kompyuter, labarator idish, uskunalar.
d) Usul-nutqli
ye) Nazorat-kuzatish ( ko’rish)
j) Baholash – o'z-o'zini va umumiy baholash.
5.Metodlar –1.Davra suhbati”, 2. “Qor bo’ron”, 3.”interaktiv usul”.
“Davra suhbatsh” ish o'yinini o'tkazish metodikasi.
Ish uchun zarur:
Vaziyatli masala va savollar tuplami alohida oq qog’ozlarga pechatlangan.
Guruhdagi talabalar soniga qarab qur'a tashlash (jerebevka) uchun savollar.
Toza qog’oz varaqlari.
Ish bajarish tartibi:
1. Qur'a tashlash yo'li bilan guruh 3-4 ta talabadan iborat bo'lgan kichik guruhlarga bo'linadi.
2. Har bir kichik guruh alohida stol atrofiga o'tiradi, toza qogoz varoq va ruchka tayorlanadi.
3. Varaqda sana, guruh soni,fakultet ish uyinini nomi, shu kichik guruhda ishtirok etadigan talabalar familiyasi, ismi, sharifi yoziladi.
4. Har bir kichik guruhlarni bitta qatnashchisi o’qituvchisini oldiga kelib konvertdan topshiriq variantini oladi.
5. Talabalar varaqga o'zlarining topshirqlarini ko’chiradilar.
6. Bu varaq stol aylana yuboriladi.
7. har bir student o'zuni javob variantini yozadi va boshqaga uzatadi.
8. Har bir student javobiga 3 min ajratiladi.
9. Vaqt tugagach javob varog’i o'qituvchiga topshiriladi.
10.Hamma qatnashchilar natijalarni muhokama qilishadi, to'g’riroq
javoblarni tanlashadi va ularga maksimal ball qo’yiladi.
11. Muhokamaga 15 min ajratiladi.
12. Talabalar javoblari uchun reyting ballarini olishadi.
13. Talabalar olgan ballari shu mavzu bo'yicha joriy ballashda
qo’llaniladi.
14. Jurnalning pastki bo'sh qismida ish uyini o'tkazilganligi haqida
yozib qo’ yiladi va guruh sardori qo'l qo'yadi.
Talabalar ishlari o'qituvchida saqlanib qoladi.
Ish uyini o'tkazish uchun savollar to'plami.
1. Dori-darmonlar va dori vositalarining mikrob bilan zararlanish manbalari.
2. Dori-darmonlarning mikrob bilan zararlanishining oldini olish choralari.
3. Dori-darmonlarning zararlanishini mikrobiologik nazorat qilish usullari.
4. Sterillangan dorivor moddalarni ishlab chiqarishdagi asosiy talablar.
5. Pirogenlar, ularning dorivor moddalarga tushib qolish xavfi.
6. Dorivor moddalarning sterilligini aniqlashning metodlari.
2.“Qor bo’ron ” usulida ish o’yinini o’tkazish.
Maqsad: Guruh talabalarining qammasini bir vaqtning o’zida bilimini nazorat qilish.
Ishni o’tkazish tartibi:
Guruh 2-3 talabadan iborat kichik guruhchalarga bo’linadi. Guruh talabalarining hammasi bitta savol yoki vaziyatli masalani o’zaro taqlil qilishadi. Har bir to’g’ri javob bergan guruhchaga ball sifatida qor bo’ron yozib qo’yiladi. Natijada eng ko’p bo’ronlar to’plangan guruhcha qolib bo’ladi.
Ish o’yini uchun savollar:
. O’simliklarda uchraydigan mikroorganizmlarning asosiy turlari va ular to’grisida ma'lumot.
O’simliklarda uchraydigan kasalliklar va ularga qarshi kurash choralari.
Dori-darmonlar va dori vositalarining mikrob bilan zararlanish manbalari.
Dori-darmonlarning mikrob bilan zararlanishining oldini olish choralari.
Dori-darmonlarning zararlanishini mikrobiologik nazorat qilish usullari.
3.“Interaktiv usul.” Talabalar mavzu bo’yicha kompyuter yordamida audio, video materiallar bilan tanishadilar.
6.O’quv jarayonida talabalar bajaradigan mustaqil ishi:
1. Dorivor o’simliklar xom-ashyosini mikrob bilan ifloslanishini aniqlash.
2. Antimikrob ta’siriga ega bo’lmagan dorivor vositalarning mikrob bilan ifloslanishini aniqlash.
3. Fil’trat yo’li bilan dorivor vositalarning mikrob bilan ifloslanishini aniqlash.
4.Antigen hususiyatga ega bo’lmagan va in’eksiya uchun ishlatiladigan dorivor moddalarnig sterilligini aniqlash.
5. Dorivor moddani mikrob bilan zararlanganini aniqlash uchun qiyshiq agarga ekilgan ekmani kuzatish.
6. Surtma tayyorlash. Gram bo’yicha bo’yash. Rasmini chizib olish.
7. Talabalar mustaqil ishlashi uchun vazifalar (nazariy qism).
Dorilarni tayyorlashda har xil o’simliklardan foydalaniladi yoki ko’pgina o’simliklardan qaynatma, damlamalar tayyorlanadi. Dorivor modda va tayyor dori-darmonlar tarkibida turli xil mikroorganizmlar bo’lishi mumkin. O’simliklardan olinadigan dorivor moddalarning mikroblar bilan zararlanishi o’sha o’simlik turi va uning o’sib chiqishi uchun zarur bo’lgan shart - sharoitiga bogliq bo’ladi. Chunki o’simliklar atrof muqitdagi ayniqsa, tuproq tarkibidagi mikroorganizmlar bilan zararlangan bo’lishi ham mumkin. Lekin shuni hisobga olish kerakki, dorivor o’simliklar xom ashyosida o’z mikroflorasi ya'ni normal mikroflora va fitopatogen mikroorganizmlar ya'ni o’simlik kasalliklari qo’zgatuvchilari bilan zararlangan bo’lishi mumkin.
O’simliklar normal mikroflorasi barg yuzida, urug’larida, ildiz oldi sistemasida har
xil bo’ladi.
Jonli (tirik) o’simliklarda yashovchi va ularga zarar keltirmaydigan mikroblar, "epifit mikroflora" tushunchasiga birlashgan. Yangi kesilgan yaproq yuza qismida ko’pincha 2 xil bakteriya aniqlandi:
1) Bact herbicola aureum va
2) Psevdomonos fluorescens
Kam hollarda sporali bakteriyalar: Bac mesentericum
Bac vulgatus
Sporasiz – Bac putiodam, E coli va zamburug’lar
Bu mikroflora o’simliklarda qaysi geografik zonadaligidan qat'iy nazar bo’ladi.
Bact herbicola aureum - qisqa Gr(-) tayoqchalar bo’lib, 2 ta polyar xivchinlari bo’ladi.
Go’sht peptonli agarda yuzida shilimshiq bo’lgan, tilla sariq rangli yumaloq koloniyalar hosil qiladi.
Psevdomonos fluorescens - polimorf, polyar xivchinli tayoqchalar bo’lib, Gr(-). Zich ozuqa muhitida chetlari notekis bo’lgan tiniq koloniyalar qosil qiladi.
Tuproqda o’simlik ildizi atrofida intensiv o’sish zonasi bo’ladi va mikroblar yuqori aktivlikka ega bo’lib, bu qism rizosfera deyiladi.
Rizosferaning sifat va miqdor tarkibi har bir o’simlik turi uchun spetsifik bo’ladi.
Ko’pincha sporasiz bakteriyalar va mikobakteriyalar uchraydi. Kam xollarda sporali bakteriyalar, aktinomitsetlar va zamburug’lar uchraydi. Tuproq mikroorganizmlari o’simliklarga ijobiy ta'sir qilib, ular o’simliklar uchun zarur bo’ladi, ular bilan simbioz holda bo’lishi mumkin yoki zararli ta'sir qilib, ularning nobud bo’lishiga olib kelishi mumkin.
Tuproqdagi bakteriyalardan Ps fluorescens, rizosfera zonasida joylashgan bo’lib, o’simliklarni infektsiyadan ximoya qilishda katta rol o’ynaydi, ya'ni ular o’simliklarni fitopotogen bakteriyalardan ximoya qiladi. Lekin aynan shu bakteriyalar o’simliklarda jarohatlangan to’qimalari orqali kirib, ularning chirishiga sabab bo’ladi.
O’simliklarning mikroblar bilan ifloslanishi o’stirish sharoitlariga ularning bandligiga bog’liq bo’ladi.Kulturali tuproq o’simliklarida mikroblar, o’rmon va gulzorlardagiga qaraganda ko’p bo’ladi. Kuzda yaproqlarda bakteriyalar, bahordagidan ko’p bo’ladi. O’simliklarning yuqori qismida joylashgan yaproqlarda mikroblar kam, pastki qismidagi yaproqlarda ko’p bo’lib, bunga sabab, pastki qismiga mikroblar tuproqdan yomgir yog’ganda sachrab o’tishi xisobiga.
Ayniqsa o’simlik mikroblar bilan ko’p ifloslangan bo’ladi sugorish maydonlarida, axlatxonali joylarda, yoki avvaldan axlatlar to’kilgan joylarda, mol boqiladigan yaylovlarda. Shu yerda o’sgan o’simliklar tarkibida inson salomatligi uchun xavfli bo’lgan patogen mikroorganizmlar bo’lishi mumkin.
Kesilgan yoki yulingan o’simliklarni darrov qayta ishlash, ishlov berilishi lozim, chunki ular mikroblarning rivojlanishi uchun qulay muhit hisoblanadi. Quritilgan o’simliklarda mikroblar hayot faoliyati susayadi, ko’pgina bakteriyalar nobud bo’ladi.
Fitopotogen mikroblar qo’zgatuvchi o’simliklardagi infektsion kasallanish ya'ni bakterial kelib chiqishiga ega bo’lsa bakterioz deyiladi. Bakteriozlarga har xil chirishlar, bakterial dog’lar, kuyish, nekroz, so’lish va boshqalar kiradi. Chirishlar quruq va nam bo’ladi, bunda o’simlik hujayralarining yumshaganligi, hujayralarning parchalanishi yoki ma'lum bir qismining yoki butun o’simlikning nobud bo’lishi kuzatiladi.
Doglar paydo bo’lganda, ularning formasi, rangi va razmeri har xil bo’ladi.
Kuyishda asosan mevali daraxtlarda (yaproqlari, shohlari, mevalarida) suvli dog’lar xosil bo’lib,qorayishi yoki jigar rang tusga kirishi kuzatiladi. Zararlangan barg nobud bo’ladi, mevalarda esa dog’lar qoladi.
O’simliklarda o’sishdan orqada qolish (karlikovost), ularning bargi och sariq rangda bo’ladi, ildizlari chirishi va o’simliklarning o’lishi kuzatiladi.O’simlik barg,stvol va ildizlarida o’simtalar,shish paydo bo’lib ,ularning razmeri kattalashishi mumkin.Bunday jaroxatlar o’simliklardagi tuberkulez va o’sma rivojlanishida kuzatiladi.
O’simliklarning virusli kasalliklariga mozaika kasalligi, sarg’ayishi, o’sishdan orqada qolish (karlikovost) va boshqalar kiradi.
O’simliklarda yana zamburug’li kasalliklar kuzatiladi, bularni mikofitozlar deyiladi. Masalan: fuzarioz, septarioz, chirishlar va boshqalar.
Aktinomitsetlar keltirib chiqaradigan o’simliklardagi infektsion kasalliklar aktinomikozlar deyiladi.
Fitopatogen bakteriya quyidagi avlodlarga kiradi. Erwinia, Pectobacterium, Pseudomonas, Xanthomonas, Rhizobium, Corynebacterium, Agrobacterium va boshqalar.
Erwinia avlodi o’z ichiga bir qancha tur bakteriyalarni kiritadi, ular kuyish tipidagi kasalliklarni keltirib chiqaradi. Masalan: Yerwamylovora- mevali daraxtlardagi kuyishlarning qo’zgatuvchisi.
Pectobacterium avlodiga - o’simliklarda chirishlarni keltiradigan ro’pgina turlari bilan bu bakteriyalar Erwinia avlodiga yaqin; farqi ular keskin pektolitik aktivlikga ega. Ko’p tarqalgan turlari – Pectobact, phytophthorum, Pectobact corotovorum, Pectobact aroidae-o’simliklardagi yumshoq chirishlarning qo’zqatuvchilari.
Pseudomonas avlodiga ko’pgina bakteriya turlari kiritilgan bo’lib, ular bo’yalmaydigan koloniyalar beradi, masalan: Ps.syringae, o’simliklar yaproq barglarini zararlaydi - bakterial dog’lar deyiladi. Barglarda yorqin rangli, xar xil kattalikdagi yumaloq dog’lar hosil bo’ladi, o’simliklar turiga qarab. Barglar katta qismi zararlangan bo’lsa, nobud bo’ladi.
Ps. Fluorescent turi o’z ichiga saprofit hayot kechiruvchi va kasallik chaqiruvchi bakteriya variantlarini oladi.
Xanthomonas avlodiga kiradigan bakteriyalar zich muxitda sariq pigmentli koloniyalar xosil qilish xususiyatiga ega. Bakteriyalar barglarni zararlab, dog’lar xosil qiladi yoki o’simlikning tomirli sistemaga o’tib ularning nobud bo’lishiga olib keladi. Bu avlodga mansub ba'zi bakteriyalar ma'lum bir o’simliklarni zararlashi mumkin. Masalan: xanth. Heterocea, ko’p zaxarli bakteriya bo’lib, 25 turdan ortiq o’simliklarni zararlanishi mumkin. Bunda xar xil formadagi, rangdagi va razmerdagi dog’lar keltirib chiqaradi.
Rhizobium avlodiga kiruvchi bakteriyalar - (klubenkoviy bakteriya) kirib, ular dukkakli o’simliklarda va lyupin ildizlarida parazitlik qiladi.
Corynebacterium avlodi - tomirli kasalliklarni keltirib chiqaradigan (trexobakterioz) va kam xollarda parenximatoz kasalliklarni keltirib chiqaradi.
Boshqa fitopatogen bakteriyalardan farqli ravishda, bu bakteriyalar G (+) hisoblanadi. Bakteriyalarning toksik ta'siri ulardagi glikopeptid bilan bog’liq, ular tashqi muxitga chiqarilganda, tomirlarning xujayra membranalari zararlanishi oqibatida tomirlar berkilib qolishi va o’simliklar nobud bo’lishiga olib keladi. Masalan: Corynebact insidoliosum, dukkakli oilasiga mansub o’simliklarni so’lishiga olib keladi. Corynebact fasians rozo rangli dukkakli oilasiga mansub o’simliklarni zararlaydi.
Agrobacterium avlodiga mansub bakteriyalar o’simliklarda xar xil o’smalar rivojlanishiga olib keladi. Oxirgi yillarda shu narsa aniqlanganki, o’smalarning xosil bo’lishi plazmidalar bilan indutsiyalanib, ular o’smali nomini olgan va bakteriyalar orqali o’simlik xujayralariga beriladi.
O’simliklarning zararlanishi va bakteriozlarning tarqalishi zararlangan urug’lar, tuproq, gruntli suvlar, yomg’ir tomchi suvlari, hashoratlar orqali va ba'zi hollarda xavo orqali amalga oshiriladi qachonki zararlanish manbai ko’p bo’lganda (massoviy)
Lekin bakterioz beriloshida xavoning ro’li chegaralangan. O’simliklarning zamburug’ va bakterial kasallik qo’zg’atuvchilari, inson va hayvondagi kasallik qo’zg’atuvchilariga nisbatan, tuproq bilan ko’proq bog’langan, bu o’simlik hayotining o’ziga xos xususiyati bilan ifodalanadi.
Kasalliklarning berilishi va tarqalishida nobud bo’lgan o’simliklarning o’rni muxim, ayniqsa bakterial kasalliklarda, bunda tuproq to’liq chirib, bo’lmagan kasal o’simlik qoldiglarini saqlab, asosiy, asosiy bosh infektsiya manbai xisoblanadi. Ammo shuni esda saqlash lozimki, fitopatogen bakteriyalar tuproqda uzoq vaqt yashab qololmaydi, sabab tuproqdagi boshqa bakteriyalar, aktinomistet, zamburuglarning antogonist ta'siri tufayli.
Bakteriyalar o’simliklarga kichkina arzimagan shikastlanish orqali kirishi mumkin.
Bakteriyalarning o’simliklar to’qimasiga kirishi, ma'lum darajada bakteriyalarning xayvonlar to’qimasiga kirishiga o’xshash bo’ladi, ayniqsa mikroblar xujayralararo moddalarni eritish uchun fermentlar va xujayralarni o’ldirish yoki ularning qarshiligini kamaytirish uchun zaxar moddalar chiqarganda. Bundan xujayralar matseryatsiya qilinadi va bir biridan ajralib, bakteriyalarning yoki zamburuqlarning o’simlik to’qimasi ichiga kirishini yengillashtiradi.
Bunday bakteriozlar parenximatozlar deb nomlanadi, bakteriyalarning tarqalish yo’llari esa intratsellyulyar va xujayra aro bo’ladi.
Ko’pgina bakteriyalar tomirli tugunlar yoki asosan ksilemma qismida tarqaladi va ko’payadi. Tomirlar bakteriyalar bilan tiqilganday bo’ladi va natijada o’simlik so’ladi. Bunday kasalliklar - tomirli deb nomlanadi. O’simliklarning so’lishi, mikroorganizmlar chiqaradigan zaxarning ta'siri bilan tushuntiriladi. 3 gruppa bakteriyalari o’simliklarni
zararlaganda o’smalar paydo qiladi.
Zararlanish boshlangandan, to o’simliklarda kasallikning tashqi simptomlalari paydo bo’lgunga qadar, inkubatsion davr o’tadi. Inkubatsion davrning davomiyligi ko’pgina faktorlarga bog’liq bo’ladi: temperatura, xavoning namligi, yorug’lik oziqlanish, o’simliklarning chidamliligi, sezgirligi yoki qabul qilishiga bog’liq bo’ladi.
Bakteriozlarning rivojlanishi, zararlanish intensiv o’sib borishi bilan xarakterlanadi va qo’zqatuvchining xujayra bo’yicha ko’payishi, aktivligi va tarqalishi bilan bog’liq bo’ladi. Zararlanish xarakteri chegaralangan, maxalliy bo’lishi mumkin, agar o’simlikning ximoya reaktsiyalari faollashgan bo’lsa himoya reaktsiyalar (oksidlanish fermentlarining ta'siri, fitontsidlar, zararlangan hujayra nobud bo’lishi va to’kilishilari.)
O’simlik bakteriozlariga qarshi kurash chora-tadbirlari quyidagilarga qaratilgan tuproqni zararsizlantirish, zararlangan o’simliklardan sog’lom o’simliklarga kasallik o’tishi, tarqalishining oldini olish, kasallangan o’simliklarni yo’q qilish, mikroblarni tarqatadigan hashoratlarni yo’q qilish.
Asosiy profilaktik chora tadbirlar urug’larning zararlanishni oldini olishga qaratilgan bo’lib, buning uchun urug’lar ximik, fizik va biologik usullar bilan ishlov beriladi: o’sayotgan o’simliklarga fungitsid bilan purkaladi, yoki sepiladi. Ammo shuni nazarda tutish kerakki, o’simlik kasalliklarini qo’zg’atuvchilardan tashqari, tuproqda doimiy yashovchi - katta guruh bakteriyalari mavjud bo’lib, ular xam kasalliklar keltirib chiqarishi mumkin. Shuning uchun qarshi kurash chora tadbirlarini to’g’ri tashkil qilish uchun bakterioz qo’zqatuvchilarining tabiiy sharoitlarda yashashdagi o’ziga xos tomonlarini bilishi kerak bo’ladi.
O’simliklar kasalliklarini o’rganuvchi fan, ilm - fitopotologiya nomini olgan va o’simliklar bilan shug’ullanuvchi mutaxasislarni tayyorlashda katta axamiyat kasb etadi.
Dorivor o’simlik xom ashyosi, uni tayyorlash va saqlashning hamma bosqichlarida mikroblar bilan ifloslanishi mumkin: yig’ish, birlamchi qayta ishlov, quritish, maydalash,
qadoqlashda. Ifloslanish bo’lishi mumkin yana xom ashyoni standart holatga keltirishda -kesilgan xom ashyoni olishda, o’simliklar poroshoklarini olish, briket, granula, tabletkalarni tayyorlashda. Xom ashyoni buzulishi birinchi navbatda yuqori namlikdan kelib chiqadi, yuqori namlik chirituvchi mikroblarning ko’payishiga sharoit to’g’diradi va bu o’simliklar farmakalogik xossalarining o’zgarishiga olib keladi.
Aptekalarga xomashyolar maydalangan ko’rinishda keladi va ifloslanish yuzasi ko’payadi, shuning uchun saqlash sharoitlariga qat'iy rioya qilish talab etiladi va bakteriologik nazorat olib borish - maxsus instruktsiyada ko’rsatilgan aptekadagi dorivor xom ashyolarni saqlash qoidalari bo’yicha va sanitar rejimga rioya qilishga asosan.
Mikroorganizmlar farmetsevtik zavod va aptekalarda tayyorlanadigan dorivor preparatlar tarkibiga xam tushishi mumkin. Zavodlarda sanitar rejimga rioya qilishdan tashqari preparatni ishlab chiqarishda, chiqarilayotgan formalarning xar bir seriyasidan bakteriologik nazorat o’tkaziladi. Parenteral yo’l bilan yuboriladigan preparatlar absalyut sterial bo’lishi kerak. Poroshoklar, ba'zi tabletkalarda mikroorganizmlar soni normada belgilangan sondan oshmasligi kerak.
Mikroorganizmlar tabiatda keng tarqalgan bo’lib, o’simliklar bandan mustasno emas, shuning uchun dorixona xodimlari, dori tayyorlovchi korxona ishchilari galen zavod va
fabrikasida ishlovchilar, o’simlik xom ashyosini tayyorlovchilar, o’simliklarni va ulardan tayyorlangan dorilarni, mikroorganizmlar bilan ifloslanmasligini ta'minlash choralarini bilishi lozim. Buning uchun ular o’simliklar mikroflorasini, o’simliklarda kasallik qo’zqatuvchi mikrorganizmlarni va ularni tushishi yo’llarini hamda dorivor o’simliklarni saqlash tartibini bilishi shart.
O’simliklarning o’sish jarayonida ularning mikroflorasi turlicha bo’ladi va o’sish harakteriga ta'sir ko’rsatadi, ba'zan kasallik chaqirishi xossasiga ega.
O’simliklarning kasalligini o’rganuvchi fan - fitopatologiya fanidair.
O’simliklarning kasalliklari chaqiruvchi mikroorganizm katta ziyon keltiradilar, chunki ularning ta'sirida hosildorchilik pasayadi, ildiz, barg va o’simlik tanasini zararlab, noyob
o’simliklarning yo’q bo’lib ketishiga olib boradi. Dorivor o’simliklarning bu holda uchrashi, bu o’simlikning dori tayyorlash uchun ishlatib bo’lmaslikka olib boradi. Yer kurrasida bakteriya va zamburug’lar o’simliklarda kasallik chaqiruvchi sifatida keng tarqalgan bo’lib, tarqalishi o’simlikning o’sish zonasiga bag’liq bo’ladi.
Mikroorganizmlar havo orqali tarqalib, atmosferaning turli qatlamlarida turli mikroorganizmlar bo’ladi, suv orqali va o’simlik urug’lari orqali tarqalishi mumkin.
Barcha mikroblar orqali tarqalayotgan kasalliklarni tarqalganliklariga qarab, shartli ravishda endemik va pandemik tarqalishiga ajratish mumkin. Endemik ma'lum bir geografik zonada tarqalish holatiga aytiladi.
O’simliklarda kasallik qo’zqatuvchi mikroorganizmlarning turi 310 dan ortiq bo’lib,
ular tayoqchasimon, kokklar, spiralsimon bo’lib, grammlar kupchilik turlarini tashkil etadi.
Fitopatogen mikrorganizmlarning ko’pchiligi flurostsentsiya holatini chaqiruvchi bo’lib, turli rangdagi (sariq, jigar rang) pigment hosil qilish xossasiga ega. Fitopatogen mikrorganizmlarning asosiy ozuqa manbai bo’lib o’simlik oqsiliva uglevodlar hisoblanadi, ular kraxmalni gidroliz qiladi, spirt va shakarni parchalash, sutni chiritmi, jelatinani eritishi, ammiak, indol qosil qilish xossasiga ega. Fitopatogen bakteriyalarning yashash faoliyatlari turlicha bo’lib, ba'zi turlari tuproqda uzoq yashab, sovuqni, quyosh nurlarining ta'sirini va qurishga chidamli qisoblanadi. Umuman fitopatogen bakteriyalarni bir necha avlodga taaluqli hisoblab, ularga quyidagi turlar kiradi:
1. Ervini-ervini
2. Psevdomanus-psevdomanus
3. Corinobacteria-korinobakteriya
4. Actobacteria-akvobakteriya
Dorivor o’sialiklardan tayyorlangan dorilar mikroflorasl o’ziga xos xossalarga ega bo’lib, quyidagi faktorlarga boqliq bo’ladi:
1. Xom ashyoning turiga, ozuqa tarkibiga.
2. Dorivor mikroorganizmlar kimyoviy tarkibiga.
3. Dorining tayyorlanish usuliga (qaynatma temperatura, bosim, ta'sir vaqtiga).
4. Saqlanish usuliga.
5. Dorixonalarning sanitar-gigienik qolatiga.
Dorivor o’simliklarning kasalligini asosan 2 turga ajratish mumkin:
1. O’simlik tomirining jarohatlanishi natijada, butun tanasi jarohatlanishi, bunda o’simlik halok bo’ladi.
2. O’simlik tanasining ma'lum bir qismini chegarali jaroqatlanish (yaproq, ildiz, shoh).
O’simlik- kasalliklarini o’ziga qaysi tarzda o’tishi bilan bir nechaxil turlarni bilishi mumkin:
1. Qatron (o’mola) yoki shilimshiq oqishi bilan o’tuvchi kasalliklar. Buni zamburug’lar, bakterIyalar chiqaradi, ba'zan bu holat yuqumli bo’lmagan bakteriyalar chaqirishi mumkin. Bunga ignabargliklar va yaproq bargiga ta'sirchan bo’ladi.
2. Chirish protsess bilan boruvchi kasalliklar.
Chirish ho’l va quruq bo’lishi mumkin. Chirish protsessida o’simlikning ba'zi to’qimalari
bakteriyalar va zamburug’lar yashash faoliyati natijasida bu protsessga uchraydi.
3.Unli shudring - bu o’simlikning bargida, shohlarida ipsimon zamburug’lar ko’payishi natijasida kelib chiqadi.
4. Xiralashishi va qurishi. Bunda barglar, shoh va butalar sarg’ayadi va quriydi.
Kuydirish. Bunda o’simliklarning guli, yangi shoh-butalari, bargi, mevalari bakteriya ta'sirida qorayadi va kuyadi. Bu kasallik asosan mevali daraxtlarda ko’p uchraydi.
5. Dog’ hosil bo’lishi. Buni asosan zamburug’lar hosil qiladi.
6.Shish qosil bo’lishi. Bular qo’zqatuvchilari fitobakteriyalar bo’lib, o’simliklarda shish hosil qiladi.
Bundan tashqari o’simliklarning kasalliklari yara, deformatsiya, barglarning moxlanishi rabi holatlarini chaqirishi mumkin.
O’simliklarning jaroxatlanishi, faqat kasallik bakteriyalar ta'sirida bo’lmay, balki simbioz natijasida bo’lishi mumkin. Masalan: zamburug’lar bilan bakteriyalar simbiozda, bunday holatdagi kasallik o’limga olib keladi.
Fitopatogen mikroorganizmlarga yaqin hisoblangan zamburug’larga mikorida hosil qiluvchi zamburug’lar kiradi. Ular o’zlaridan mikoriaza ajratadilar. Buni birinchi bo’lib 1883 y. Kamenskiy F.F. aniqlagan. Bu turkumiga kiruvchi zamburug’larga bazidomitsetlar, fikomitsetlar va tugallanmagan zamburug’larga misol bo’la oladi.
Mikoriazani turli tuproqlarda uchratish mukin. Uning bo’lishi turning miqdoriga bog’liq bo’lib, sifatiga bog’liq bo’lmaydi. Mikoriazalar ko’p miqdorga yozda kamlar miqdorida bahor va kuz oylarida kamroq bo’ladi.
O’simliklarning fitopatogen mikroorganizmlarga chidamlikligini qanday saqlaydi degan savolga quyidagicha javob berish mumkin:
Bu chidamlilik o’simliklarning nasldan-naslga o’tuvchi irsiy xossalariga, yashash faoliyati davomida hosil qilgan moslanishlarga, hujayra suyuqligining reaktsiyasiga bog’liq bo’ladi. Irsiy chidamlikda o’simliklarni tanlashda gibrytizatsiya qilinayotgan davrida ahamiyat berish lozim.
Rivojlanayotgan o’simlik kasalliklariga qarshi kurash bir nechta tosfaga
(kategoriya) bo’lib o’rganish mumkin:
1. Karantin olib borish ishlari.
Bunda har bir davlat o’z chegarasiga kasallik chaqiruvchilarini kirgizmaslik. Bular har bir davlatda maxsus "O’simliklarni davlat muxofazasida" karantin bo’lishi mavjud.
2. Muhofazaning fizik-ximiyaviy turi.
Bunga zararlangan o’simliklardan, sog’larini ajratish, zararlangan qismlarni ajratib olish, oraliq kasallik manbalarini yo’qotish kabi ishlar olib boriladi. Bunda tuproqni zararsizlantirish, urug’larni zararsizlantirish ishlari muhim rol o’ynaydi. Bu maqsadda fungitsidlardan keng foydalaniladi.
O’simliklarning dorivor xomashyosini turli xil tayyorlanish davrida (terli, quritish, standartizatsiya qilish, maydalash va saqlash) mikrob bilan ifloslanish mumkin.
Dorivor o’simliklarni saqlashda namlikka, yoruqlikka, chang va xashoratlarga ahamiyat berish lozim. Ortiqcha namlikni o’simlik o’ziga tortib olish xossasiga ega, bular natijada ular rangi o’zgaradi, o’zidan qo’lansa hid ajratadi va chirish protsessini keltirib chiqaradi. Bu protsesslar dorivor moddalarga ta'sir qilishi o’zgaradi va aktiv moddalar yo’q bo’lib ketadi (masalan glikozid).
Chirish protsessi o’simliklarda mikrofloraning almashinuvchi (zamburug’larni bakteriyalar bilan) bo’lib o’tadi.
Dori moddalar va tayyor dori-darmonlar tarkibida turli xil mikroorganizmlar bo’lishi mumkin. O’simliklardan olinadigan dorivor moddalarning mikroblar bilan zararlanishi o’sha o’simlik turi va uning o’sib chiqishi uchun zarur bo’lgan shart-sharoitga bog’liq bo’ladi. Chunki o’simliklar atrof muhitdagi ayniqsa, tuproq tarkibidagi mikroorganizmlar bilan zararlangan bo’lishi ham mumkin. Bundan tashqari o’simliklarning o’z mikroflorasi xam katta ahamiyatga ega: masalan, epifit (Erwinia herbicola, P. fluorescens va fitopatogen (Erwinia, Pseudomonos, Coryhebacterium, Agrobacterium, aktinomitsetlar, ayrim zamburug’lar). Axlatxona yoki avvaldan axlatlar tashlangan joylarda, shuningdek, sug’oriladigan maydonlarda, mol boqiladigan yaylovlarda o’simliklar tarkibida inson salomatligi uchun xavfli bo’lgan patogen mikroorganizmlar ham bo’lishi mumkin.
O’simliklardan olinadigan dorivor xom-ashyolar bu mahsulotlarni yig’ishtirib olish va tayyorlashning turli bosqichlarida - o’simliklarni yig’ish, dastlabki ishlov berish, quritish, yanchish-maydalash, maxsus idishlarga joylashtirish, shuningdek, standart holatda saqlanish chog’ida xom ashyoni maydalash, dorivor kukunlarga aylantirish, briket, granul va tabletka holiga keltirish jarayonida ham urug’lanishi mumkin.
O’simliklardan olingan dorivor xomashyolar avvalo saqlanishjoyida namlikning belgilangan normadan oshib ketishi natijasida buziladi: namlik oshib ketsa, xomashyo tarkibida har xil zamburug’lar, chirituvchi, sellyuzalarni parchalovchi bakteriyalar va boshqa mikroorganizmlar paydo bo’ladi. Mikroblar degradatsiyasi o’simlik farmakologik xususiyatlarining o’zgarishiga olib keladi va zaharli moddalarning hosil bo’lishiga sabab bo’lishi mumkin.
Mikroorganizmlar dorivor xomashyolarni zararlash orqali doridarmonlarning xususiyatlarini o’zgartirib yuboradi. Chunki dorivormoddalardan ferment chiqishi, mikrobli og’ular yoki pirogenlarning hosil bo’lishi natijasida ular o’ta zaharli holatga kelib qolishi ham mumkin.
Agar odamlar Staphylococcus, Pseudomonas, Salmonella va boshqa mikroorganizmlar bilan zararlangan tibbiy preparatlarni iste'mol qilsa, ularning tarkibidagi patogen mikroblar turli xil yuqumli kasalliklarni keltirib chiqarishi mumkin. O’simliklardan olinadigan dorivor moddalar va homashyolarning mikrob bilan zararlanishini tekshirib ko’rishda quyidagi usuldan foydalaniladi.
Dori vositalarining mikroblar bilan zararlanishini aniqlash
Dorixonalarda tayyorlanadigan dori-darmonlar va tibbiy moddalarning mikroflorasi qanday bo’lishi quyidagi sabablarga bog’liq bo’ladi:
1) Xomashyo turi, uning tarkibidagi mikroorganizmlar uchun ozuqabop moddalarning miqdori yoki aksincha ulariing antimikrob faolligi, ilk zararlanish darajasi.
2). Dorivor xomashyo tarkibiga kiradigan moddalarning kimyoviytabiati.
3) Tayyorlash texnologiyasi (damlama, qaynatma, harorat, vaqt hajm va x.k.)saqlash shart-sharoitlari.
4) Dorixonaning sanitariya-gigienik sharoitlari.
Mikroorganizmlar turli yo’llar bilan dori moddalarga tushishi mumkin. Masalan, mahsulotga suv yoki havo orqali o’tishi, idishlar,dorixona xodimlarining qo’llari, shuningdek, analiz noto’g’riqilinganda, ayniqsa organoleptik tekshiruv choq’ida xam o’tib qolishimumkin.
Dori-darmonlar va dorivor mahsulotlarning mikroorganizmlar bilan zararlanishining oldini olish va ularni zararlanishdan saqlash uchun quyidagi qoidalarga qat'iy rioya qilish kerak:
1) Mikroorganizmlarga shikast yetkazmagan holda ashyodan foydalanish;
2) Dori moddalar va xom ashyolarni zarur namlik, harorat va tozalik qoidalariga rioya qilgan holda to’g’ri saqlash;
3) Tashqi muhitdan mikroorganizmlarning tushishini istisno qiladigan dori tayyorlash shart-sharoitlariga amal qilish (xonalarni dezinfektsiya qilish,sterillangan idishlardan foydalanish va x.k.);
4) Xonalari, asbob-uskunalari, idish, kiyimlarning to’la-to’kis tozaligiga, shuningdek, shaxsiy gigienaga rioya qilish;
5) Dori-darmonlar va dorivor xomashyolar qayta-qayta ishlatilganda ham zararlanmaydigan qilib, yaxshilab o’ralgan bo’lishi kerak;
6) Agar bir necha marta foydalanishga mo’ljallangan dori mahsulotlari tarkibida bakteriyalarga chidamsiz moddalar mavjud bo’lsa (qand, oqsil moddalar va x.k.),u holda bunday dorilarga konservant qo’shilishi lozim.
Suyuq dorivor moddalar mikroblar bilan zararlanganda dori solingan idish
tubida cho’kma hosil bo’ladi, cho’kma. miqdori ko’payadi, idishdagi dori xira tortib, yuzida yupqa parda hosil bo’ladi, dori solingan idishda o’sha doriga xos bo’lmagan hid paydo bo’ladi va x. k.
Ko’pincha dorivor xomashyolar va dori darmonlar tarkibida mikroorganizmlarning mavjudligi faqat mikrobiologik tekshirishlar natijasida aniqlanadi, xolos. Dorivor moddalar yoki tibbiy preparatlarning mikroorganizmlar bilan zararlanish darajasi 1 g quruq preparat yoki 1 ml eritma tarkibidagi mikroorganizmlar hujayrasi miqdori bilan ifodalanadi. Mahsulotlarning mikroorganizmlar bilan zararlanish darajasini aniqlashda ularning ayrimlari antimikrob ta'sir eta olish xususiyatiga ega bo’lishi mumkinligini ham nazarda tutish kerak. Odatda antimikrob ta'sirlar bakteriostatik (mikroorganizmlarning ko’payishini to’xtatuvchi yoki sekinlashtiruvchi) va bakterotsid (mikroorganizmlarga halokatli ta'sir ko’rsatuvchi) kabi turlarga bo’linadi. Mikro organizmlarning o’zi esa dorivor maxsulotlarga nisbatan sezuvchan yoki barqaror bo’lishi mumkin. Bularning barchasi dorilarning mikroorganizmlar bilan zararlanishini aniqlash
metodikasini murakkablashtiradi va har bir dori shakliga individual yondoshishni talab qiladi.
Noin'ektsion tibbiy preparatlarning mikrob bilan zararlanishini chegaralaydigan VOZ va farmokopeya talablari xam mavjud. Nosteril dorivor moddalar Regoz da qo’llaniladigan nosteril dori moddalar tarkibida patogen va shartli-patogen mikroflora namunalari uchramaydi. Mahalliy intravaginal holatda qo’llaniladigan, shuningdek, quloq, burun kabi organlarni, davolashda
ishlatiladigan dorivor moddalarning 1 g (ml) si da 100 mikrob hujayradan ko’p mikroorganizmlar bo’lmasligi kerak. Bundan boshqa turga mansub dori-darmonlar va dorivor xom-ashyolar tarkibidagi saprofit bakteriyalar soni 1000 hujayradan, patogen zamburug’lar esa 1 g preparatda 100 hujayradan oshmasligi lozim.
Dorivor moddalar va xom ashyolarning mikroorganizmlar bilan zararlanishini o’rganishga kirishishdan avval, o’sha moddalarning antimikrob ta'sirini aniqlash kerak.
Dorivor vositalarning antimikrob ta'sirini aniqlash
Antibiotiklar, sulfanilamidlar, xinoksalin, 8-oksixinolin, naftiridin, nitrofuran hosilalari va boshqalar kuchli antimikrob ta'siri quvvatiga ega bo’lgan dorilar hisoblanadi. Bundan tashqari mikroorganimzlarning ko’payishi va o’sishiga kuchli ta'sir eta oladigan bir qancha dorilar va konservantlar ham bor: kislotalar, ishqorlar, galoidlar, oksidlovchilar, og’ir metall tuzlari, bo’yoqlar, detergentlar, degtlar, mumlar, tarkibida oltingugurt, fitontsid va boshqa moddalar bo’lgan preparatlar shular jumlasiga kiradi.
Tekshirilayotgan yoki sinab ko’rilayotgan preparatning antimikroblik xususiyatini hisobga olmaslik oqibatida noto’g’ri xulosalar kelib chiqishining oldini olish maqsadida, o’sha preparatning mikroorganizmlar bilan zararlanishini o’rganishga kirishishdan avval uning mikroblarga aktiv ta'sir ko’rsata olish xususiyatini aniqlash lozim. Buning unun sinab ko’ri-layotgan preparatni tekshirish davomida qo’llaniladigan barcha muhitlarda ekib, har xil mikroblarga ta'sirini o’rganish kerak. Petri kosachalaridagi muhitlarga tekshirib ko’riladigan mikroorganizmlarni ekib, keyin unga sinab ko’rilayotgan preparat qo’shiladi. Kosachadagi test-kultura ekmasining o’sishi sekinlashsa preparat antimikrob ta'sir eta olish hususiyatiga ega deb hulosa chiqarish mumkin.
Dori vositalarining antimikrob ta'sirini bartaraf etish usullari
Dori vositalarining antimikrob ta'sirini bartaraf etish uchun xar xil usullardan foydalaniladi:
-Preparatlarning antimikrob ta'sirini neytrallashtiruvchi, lekin mikroorganizmlarning o’sishiga ziyon yetkazmaydigan maxsus inaktivatorlarni qo’shish;
-Suyultiruvchi moddani ko’proq qo’shib, preparatni imkoni boricha ko’proq suyultirish (bufer eritmasi yoki ozuqa muqiti).
- Ozuqa muhitiga nospetsifik inaktivatorlarni (tvin-80, letsitin va boshq.) qo’shish.
- Agar bu usullar samara bermasa, unda preparatlar membrana filtri orqali filtrlanadi
Ayrim antibiotiklarning inaktivatsiyasi
Penitsillinlar va sefalosporinlarni inaktivlash uchun o’rganilayotgan material namunasi suyultirish yoki suspenzirlash uchun ishlatiladigan bufer eritmasi yoki o’sha mahsulot ekiladigan ozuqa muhitdan foydalaniladi. Buning uchun aseptik sharoitda penitsillinga mo’ljallangan 1 ml ozuqa muhitida 1000 TB miqdorida, sefalosporinga mo’ljallangan ozuqa muhitining 1 ml eritmasiga esa 50000-100000 TB miqdorida penitsillinaza qo’shiladi. Penitsillinazani ozuqa muhitiga kiritishdan avval uni yaxshilab eritib, 50°C gacha sovutish kerak. Tetratsiklinni inaktivlash uchun o’rganilayotgan material namunasini ekishga mo’ljallangan ozuqa muhitiga uni tayyorlash chog’ida 10% li magniy sulfat MgS04 qo’shiladi. Sulfanilamid preparatlarni bufer eritmasi yoki ozuqa muhitida inaktivlash uchun ularni tayyorlash jarayonida 1 m muhitga 0,5 g miqdorda paraaminobenzoy kislotasidan qo’shish kerak. Yengil dori vositalar tarkibida mavjud bo’lgan konservantlarni bufer eritmasi yoki ozuqa muhitida inaktivlash uchun ularni hozirlash paytida nospetsifik inaktivatorlardan, ya'ni 3% li tvin-80, yoki 0,2% li letsitindan foydalanish zarur. Mobodo o’rganilayotgan preparat tarkibida kimyoviy tuzilishi har xil bo’lgan ikkidan ortiq konservayt mavjudligi aniqlansa, u holda 0,3% letsitin, 3% tvin-80, 0,1% gistidin va 0,5% tiosulfat natriydan iborat maxsus aralashmadan foydalaniladi.
8. Amaliy qism:
Amaliy qism 4ta qismdan iborat:
Labaratoriya ishining nomi
Ishning maqsadi va ahamiyati
Labaratoriya ishini amalga oshirish tehnikasi
Labaratoriya ishini daftarga qayd qilish
Dorivor xom-ashyo va tayyor dori formalari turli xil mikroorganizmlardan tashkil topishi mumkin.
Dorivor vositalarni mikrob bilan ifodalanishini aniqlash quyidagi tekshirish yo’llariga bo’linadi.
1. Dorivor vositalarni antimikrob ta'sirini aniqlash.
2. Antimikrob ta'sirga ega bo’lmagan dorivor vositalarni mikrob bilan ifloslanishini aniqlash.
3. Bakteregik ta'sirga ega bo’lgan antibiotiklarni ham kiritgan holda dorivor vositalarni mikrob bilan ifloslanishini aniqlash.
O’simlik dorivor vositalarni mikrob bilan ifloslanishin analiz qilish uchun quyidagi metodlardan foydalaniladi.Aseptik sharoitda otiril asboblardan foydalaniladi. 1 g xom-ashyoni tortib, 5 ml NaCl ning izotonik eritmasi bilan aralashtiriladi va shutel' apparatida 10 minut davomida silkitiladi, 1 ml smivni olib 1:10, 1:100 suyultiriladi. har bir suyultirilgandan petri chashkasidagi ozuqa muhitiga chuqur ekiladi. Zamburug’ va achitqilarni o’sishini Sabura yoki suslo-agar, MPA kuzatiladi.har bir suyultirilganni 2-3 chashkaga parallel ravishda ekiladi. Termostatdagi inkubatsiyadan keyin (24 S – zamburug’ va achitqilar uchun, 37 C bakteriyalar uchun) o’sib chiqqan kolloniyalarni soni sanaladi. Smivni suyultirilganligiga qarab xom-ashyoni (1g) mikrob bilan ifloslanganligi hisoblaniladi. Dorivor xom-ashyolarni antimikrob ta'sirini aniqlash quyidagi namunada bo’ladi:
Test-kul'turalar E coli, Psevdamanas, Staphylococcus 10 ml. Najepitatel'niy muhitni probirkaga solib, (har bir muhitga 4 tadan probirka) 1:1000 suyultirilgan 1 sutkali 0,1 li Test-kul'tura buyumini qo’yamiz.
Probirkaning 1-yarimiga 1 ml steril suv quyamiz, boshqa yarimiga esa tekshirilayotgan preparat. Keyin tekshirishni differensial-diagnostik vositani qo’llanilashi bilan davom ettiriladi.
Antimikrob ta'sirga ega bo’lmagan dorivor vositalarni mikrob bilan ifloslanishini aniqlash.
A. Bakteriyalarning umumiy sonini aniqlash 1:10 gacha suyultirilgan 1 ml preparatni 0.1 g glyukozali 4 ml eritilgan va 45-50 C gacha sovitilgan MPA har ikkala probirkaga solinadi. Oldindan qo’yilgan va sovutilgan shu muhitni 15-20 ml petri chashkasining har ikkisiga quyiladi va tez aralashtiriladi. Chashkani tez tebratgan holda yuqori qismini bir xil qilib taqsimlanadi va sovutiladi. Chashkalar 5 sutka davomida 37 C da inkubatsiya qilinadi. Keyin bakterial kolloriyalaning soni sanaladi, 2- chashkasi uchun o’rta arifmetikasi topiladi. 2 va 1 g namunaning bakteriya soni hisoblaniladi.
To’la ishonchli ko’rsatmalarni olish uchun faqat 300 kam kolloniyalar o’sgan chashkalar hisobga olinadi. Agar kolloniyalar soni ko’p bo’lsa suyultirilish tekshirishni bir qator davom ettiriladi (1:100, 1:1000). Ekish uchun anchagina qulay bo’lgan suyultirish olinadi.
B. Entenobakteriaecae- oilasiga mansub bakteriyani aniqlash uchun 10 g Entenobakteriaecae oilasiga mansub bakteriya bilan boyitilgan 90 ml muhit solinadi, aralashtiriladi va 24-48 soat 37 C da inkubatsiya qilinadi. O’sish boshlanganda petlya yordamida Endova vismut'-sul'fitli agar muhitiga qayta ekiladi. 24-48 soat 37 C da inkubatsiya qilinadi. Entenobakteriaecae- oilasiga mansub bakteriyalar, qizil rangli metaldek yaltiroq yoki yaltirog’I bo’lmagan yirik kolloniyalar hosil qiladi, pushti, rangsiz yaltiroq, bo’rtgan dm. 2-3mm. kolloniya. Vismut-sul'fitli agarida kolloniya metal sifat yaltiroq qora, kolloniya ostida esa muhit qora rangga yoki qo’ng’ir -ko’kimtir, och yashil, jigar rang va hakazo ragnda bo’ladi. Mikroskop ostida ular grammanfiy. Sporasiz keltakchalardir. Shubhalantiruvch kolloniyalarni o’rilgan 0.17 glyukozali MPA probirkasiga har birini alohida qayta ekiladi va 24 soat 37 C da o’stiriladi. Har bir toza qulturali probirkadan enterebakteriyalarni identifikatsiya qilish uchun qayta muhitga ekiladi.
a. Glyukozali va qizil fenolin muhitga
b. Kaliy nitratli muhitga. Enterebakteriyalar glyukozani fermentatsiya qiladi, bunda muhit qizil rangdan sariqga aylanadi. Ular nitritni nitratga qaytarishga qodir, va stitoxromoksidaza fermenti bo’lmaydi. Agar namunada grammanfiy, sporasiz qayton sezilsa, ular stitoxromoksidazaga manfiy reakstiya ta’sir etsa nitratni nitratga qaytaradi va glyukozani fermentlaydi. Tekshirilayotgan preparat Entenobakteriaecae oilasiga mansub bakteriyani o’zida saqlaydi.
Bakteriostit ta’sirga ega bo’lgan antibiotiklarni qo’shgan holda, dorivor vositalarni mikrob bilan ifloslanishini aniqlash.
Antibiotik eritmasini tayyorlangan zahotiyoq 4 ta membranali fil’trdan o’tkaziladi. Har bir fil’trdan 250 ml eritma fil’tratsiya qilib bo’lgandan keyin fil’trlarni 100 ml li 5 portsiya eritma bilan antibiotikdan tozalaniladi. Petri chashkasiga quyidagi muhitlarga joylashtiriladi.
Mikroorganizmlarni umumiy sonini hisoblash uchun MPA ga inaktivator qo’shiladi. Ekmani 3 sutka davomida 37 C da inkubatsiya qilinadi.
Saburo muhitida mog’or, achitqi zamburug’larni umumiy sonini hisoblash uchun
5 sutka davomida 24 C da inkubatsiya qilinadi.
v. Ichak gruppasining mikroorganizmini aniqlash uchun Endo muhitiga MPA ga o’xshash inaktivator qo’shiladi. 3 sutka davomida 37 C da inkubatsiya qilinadi.
d. Stofilokokklarni aniqlash uchun qon agariga inaktivator qo’shiladi. 3 sutka davomida 37 C da inkubatsiya qilinadi.
Qonli agarda stafilokokklari koloniya atrofida beradi. Antibiotik tabletkalaridan 0.2 ml suspenziya shpatel bilan agarizovanniy muhitning ustki qismiga, 3 ta petri chashkasini parallel ishlash bilan lesi ekiladi.
Inekstiya uchun ishlatiladigan, ko’z tomchilari va yangi tug’ilgan chaqaloqlar uchun ishlatiladigan dorivor preparatlar steril holatda bo’lishi kerak.
Dorivor moddalarni sterilligini- sanitariya sharoitlariga va sterilizatsiyaga rioya qilish bilan erishiladi.
Ba’zi bir steril preparatlar pirogen hususiyatga ega bo’lgan mikrob hujayralarining mahsulotlarini o’z tarkibida saqlashi mumkin. Pirogenlar- tarkibida protein, lipid, polisaharid saqlovchi, orgonizmda kompleks o’zgarishlar(tana temperaturasining ko’tarilishi) chaqiruvch bakterial endotaksinlar hisoblanadi.
Pirogen bakterialar fil’trdan o’tadi, tempiraturaga chidamlidir.
Sterillangan dorivor moddalarni tayyorlashdagi asosiy talablar.
In’ekstiya uchun tayyorlangan eritmalarda, sterilizatsiya qilishdan oldin 1 ml da mikrob hujayrasi 30 tadan ko’p bo’lishi kerak emas.
Ularni tayyorlashdan sterilizatsiya qilinguncha ketadigan vaqti 1.5 soatdan oshmasligi kerak.
Steril moddani tayyorlash uchun ishlatiladigan distillangan suvning tarkibida E.coli bo’lishi kerak emas. Mikroorganizmlarning umumiy soni 1 ml.da 10-15 ta hujayradan oshmasligi kerak.
Dorivor moddalarni tekshirish aseptika qoidalariga qat’iy tayangan holda bokslarda olib boriladi.
Bokslarda ishlashda aseptikaning asosiy talablari.
Boks xonasini dizenfekstiyalovchi moddalar bilan qayta ishlash kerak.
Ish boshlashdan 2 soat oldin bakteriostid lampalarni yoqib qo’yish kerak.
Mikrob bilan zararlanganini tekshirib turish kerak. Go’sht-peptonli bul’onda 5 ta kolloniyadan ortiqcha bo’lishi kerak emas.
Mog’or va achitqi zamburug’lari bo’lishi kerak emas.
Boksda sterillangan holat va topochkalarda ishlash kerak. Ularni 120 C temperaturada 30 min davomida avtorlavda sterilizatsiya qilinadi.
Inekstion preparatlarning sterilligini aniqlash.
Antibiotiklarning har bir seriyasidan 10.000 ampuladan 3 ta ampula, qo’shimcha 1 tadan ampula 10.000 ampuladan olinadi. Poliglyutin va ferroglyulitinni sterilligini aniqlash uchun avtoklatga joylashgan preparatlardan 6 ta flakondan olinadi va
MPA- 0.5 gr glyukozali muhitga ekiladi 37 C da 5 sutka .
Kitta-Terotsi muhiti- 37 C da 5 sutka.
Saburo suyuq muhitda- 24 C da 5 sutka.
Antibiotiklarni sterilligini aniqlash.
Antibiotiklar sterillagan suvda eritiladi.
MPB- glyukozali 15 ta probirkaga ekiladi.
2 ml dan Saburo muhitli 5 ta probirkaga ekiladi.
Bunda antibiotiklarning konsentratsiyada 25.000 ga teng bo’lishi kerak.
MPB li 10 ta probirka 37 C da 5 sutka.
MPB li 5 ta probirka 24 C da 5 sutka.
Saburo muhitli 5 ta probirka 24 C da 5 sutka.
Antibiotiklarning inaktivligini tekshirish uchun MPG li probirkaga 18 soatli 1 ml da 250 ta mikrob hujayrasi to’g’ri keladigan Test- kulturaga ekiladi. 37 C da 5 sutka turadi. Bu prabirka hira bo’lishi kerak. Faqat bitta o’sma o’sib chiqsa ham preparat sterillangan hisoblanmaydi va qaytadan ekiladi.
Bakteriostatik ta’sirga ega bo’lgan dorivor priparatlarning sterilligini aniqlash.
Buning uchun priparat:
MPB- glyukozali 5 ta probirkaga 0.5 ml dan solinadi.
MPA li 3 ta probirkaga 0.2 ml dan
Kitta-Terotsi muhitli 3 probirkada 0.5 ml.
Saburo muhitli 3 probirkaga 0.5 ml dan solinadi.
Kitta-Terotsi muhiti 37 C da, MPB- glyukozali muhit 24 C, Saburo muhitini 24 C da 7 sutka turadi. Agar o’smalar o’sib chiqsa preparat sterillanmagan hisoblanadi.
9. Kutiladigan natijalar:
O’qituvchi Talaba
1. Mavzu bo’yicha maqsadni 1. Mavzu bo’yicha to’la ma’lumot
tushuntirish. olish
Talabalarda qiziqish uyg’otish 2. Talabalar bilimini shakllantirish
Yangi texnologik usullarni qo’llash 3. Talabalar qiziqish bilan qabul
qilishi.
10. Kelgusi rejalar:
1. O’qituvchi internetdan yangi 1. Talaba ushbu materiallarni o’z-
material olish uchun foydalanishi, lashtirishi, konspekt yozish,
mukammallashtirishi. mustaqil ishlashi.
2. Yangilash va joriy etish, yondashuv. 2. Adabiyotlar bilan ishlashi
3. Kasbiy tayyorgarlikni 3. Yangi texnologiyaga yondashuvi.
insonparvarlashtirish.
Nazorat savollari.
1. Dori-darmonlar va dori vositalarining mikrob bilan zararlanish manbalari.
2. Dori-darmonlarning mikrob bilan zararlanishining oldini olish choralari.
3. Dori-darmonlarning zararlanishini mikrobiologik nazorat qilish usullari.
4. Sterillangan dorivor moddalarni ishlab chiqarishdagi asosiy talablar.
5. Pirogenlar, ularning dorivor moddalarga tushib qolish xavfi.
6. Dorivor moddalarning sterilligini aniqlashning metodlari
Labaratoriya mashg’uloti 6
Mavzu: Mikroorganizmlar ekologiyasi. Inson tana normal mikroflorasi.
Mashg’ulot programmasi
1. Atrof-muhitdagi mikroflorani o’rganish usullari.
2. Cyv, havo va tuproqni saiitariya-baktoriologiya usullari bilan baholash.
3. Membran filtr usuli bo’yicha suvning koli-indeksini aniqlash.
4. Krotov apparati va sedimentasiya usuli bilan havodagi mikrob sonini aniqlash.
5. Tuprosning perfringois-titri ia koli-titrini aniqlash usullari.
Namoish qilinadi
1. Gemolitik streptokokkning qonli agarda o’sishi.
2. Staph. aureus ning tuxum sarig’i va sut qo’shilgan tuzli agarda o’sishi.
3 Clostridium perfringens Kitto torasi muhitiga ekilganda o’sishi.
4. Krotov apparati, membranali filtirlar
5. Tuproq, suv va havoning sanitariya-bakteriologik baho berishda qo’llaniladigon usullarnig sxemalari.
Laboratornya shshshi bajarish uchun topshiriq
1. Quyidagi tajribalar natijasiga asosan havo, suv, tuproqning sanitar bakteriodogik holatini baholash;
a) havodagi mikroblar sonini sedimentasiya usulida aniqlash;
b) vodrprovod suvi va ochiq suv havzalaridagi suvning umumiy mikroblar sonnni aniqlash;
v) suvning koli -titri va koli-indeksini xisoblab topish:
g) tuproqning koli-titri va perfringens-titri, mikrob sonini xisoblab topish.
Mikroorganizmlarning ekologiyasi – mikroorganizmlarning o’zaro va tashqiy muhit bilan aloqalarini, munosabatlarini o’rganuvchi fan xisoblanadi. Tibbiyot mikrobiologiyasini o’rganish o’bekti bo’lib mikroorganizm bilan inson organizimi o’rtasidagi kompleks munosabatlar xisoblanadi.
Mikroorganizmlarning tabiatda tarqalganligi. Mikroorganizimlar tabiatdagi hamma (suv, havo, tuproq) muhitlard uchraydi. Ularning bunchalik keng tarqalishiga asosiy sabab ularning oziqlanish mexanizimlarining turli ko’rinishda bo’lishidir.
Mikroorganizimlar tabiatdagi tashqiy muhit omillariga tez moslashadi, shuning uchun boshqa organizimlar yashashi mumkin bo’lmagan sharoitlarda va muhitlarda ham ular hayot kechirishadi. Mikroorganizimlarning bunchalik tabiatda keng tarqalishiga yana bir sabab, ularning o’lchamini o’ta kichikligi va havo oqimlari suv bilan uzoq masofalarga tez tarqalishidir.
Mikroorganizmlar ma’lum yashash mintaqalarda biosenozni ( yunon. bios- hayot, + koinos- birga yashash) shakillantiradi. Har bir mikroblar biosenozi o’zining aniq mikroorganizimlar tarkibiga ega bo’lib, shu muhitning autoxton ( yunon. autos- o’ziniki + chthon- joy, mamlakat) mikroorganizimlari deb yuritiladi, ya’ni bu mikroorganizimlar shu yashash muhitida doim uchraydi. Bu mikroblarni yashash muhitiga boshqa alloxton ( yunon. allos - begona, + chthon- joy, mamlakat) bakteriyalar, parazit mikroorganizimlar tushib qolishi mumkin. Tabbiyi biosenozlarda (tuproq, suv, havo) mikroorganizimlarning yashashi tashqiy muhit faktorlarini ta’siriga bog’liq bo’lib, agar tashqiy faktorlar ularning yashashiga ijobiy ta’sir qilishi yoki faktorlarning ta’sirisalbiy tamonga o’zgarsa, bu biosenozdagi mikroblarning yashashi, ko’payishi to’xtab qolishi mumkin.
Biosenozdagi mikroorganizimlarning o’zaro munosabatlarini tiplari. Mikroorganizimlar bir-birlari bilan o’ta kuchli raqobatda yashaydi. Mikroorganizimlarning biosenozda o’zaro yashash munosabatlari simbioz ko’rinishlarda bo’lishi mumkin.
Simbioz ( yunon. symbiosis- birga yashamoq) mikroorganizimlarning uzoq yillar ma’lum muhitlarda birga hayot kechirishi bo’lib, xo’jayin hujayrasidan tashqarida yashasa ektosimbioz: hujayra ichida hayot kechirsa endosimbioz deb ataladi. Ektosimbiozni tipik vakillariga ichak bakteriyalari ( E. Coli, Bacteroides va bosh.)misol bo’la oladi. Endosimbioz vakillariga esa plazmiidlar, proviruslar, profaglar kiradi. Tabiyi sharoitda simbiozni bir qancha formalari uchraydi.
Mutalizm – (lot. mutuus, o’zaro) simbiozda yashovchi mikroorganizimlar o’zaro foyda keltirib yashashlari mumkin. Masalan ichakni normal mikroflorasi, odam uchun foyda keltiradi (modalar almashuvinida, vitaminlar sintezlarida va bosh.), shu bilan bir qatorda bu mikroorganizimlarni doimo muhitning noqulay sharoitlaridan (qurib qolishdan, ekstremal temperaturadan) ximoyalanib va oziqli muhitlar yetarli bo’lishini organizim ta’minlab turadi.
Kommensalizim –simbioz formasi bo’lib, muhitda yashovchi mikroorganizmlardan biri foyda ko’radi, lekin ikkinchi gurux bakteriyalarga ziyon keltirmaydi.Tipik kommensal mikroblarga ichak tayoqchasi, laktobakteriyalarni kiritish mumkin. Lekin ko’pchilik kommensal bakteriyalar shartli patogenlar ham bo’lishi mumkin, ya’niy ma’lum xolatlarda kasallik keltirib chiqarishi mumkin.
Parazitizm- antagonistik simbioz formasi bo’lib, bir gurux bakteriyalar boshqa organizimlar hisobiga yashab (tekinho’r), unga ziyon yetkazishi (yunon. para, oldida,+ sitos,ovqat) tushiniladi. Parazit bakteriyalar ho’jayin organizimiga kirib kasallik keltirib chiqarishi mumkin, shuning uchun bularni patogen mikroorganizimlar ham deb ataladi. Parazitlarni hujayra ichida yashovchi (viruslar, xlomidiyalar, rikketsiyalar) va hujayradan tashqarida yashovchi ( kshpchilik bakteriya, zamburug’lar) formalari bo’lishi mumkin. Ba’zi bakteriyalar yashash sharoitiga qarab parazit tipida yoki saprofit bo’lib yashashi kuzatiladi. Bunday bakteriyalarni fakultativ parazitlar ham deb ataladi. Agar bakteriyalar o’zlari uchun kerakli metobalitlarni boshqa organizimlar xisogbiga to’liq o’zlashtirishsa bunday mikroorganizimlarni obligat parazitlar deb yuritiladi.
Satellizm- ba’zi bir mikroorganizimlar ishlab chiqargan metobalitlari boshqa bakteriyalarni ko’payishini stimullashi mumkin. Masalan sarsinlar va stafilokokklar o’sganda o’sish faktori ishlab chiqarishadi va Haemophilus avlodi bakteriyalarini o’sishini stimullaydi. Tipik satillitlarga gepatit V virusini ham kiritish mumkin, gepatit delta virusi gepatit V virusi ishtirokida ko’payyadi.
Tuproq mikroflorasi. Tuproq mikroorganizmlar uchun asosiy tabbiyi yashash muhiti xisoblanib, tabiatning shakillanishida, tozalanishida va moddalar almashinuvida (azot,uglerod, oltingugurt, temir) aktiv qatnashadi. Tuproq mikroflorasining tarkibi tuproqning turiga, ishlov berilishiga, geografik zonasiga, namlik, teperatura va organik moddalar bilan qanchalik ifloslanishlariga va boshqa. xususiyalarga bog’liq.. Tuproqning mikroflorasi juda ham ko’p va turli bakteriyalar vakillari bo’lishi mumkin.Tuproqning autoxton mikrobiosenoziga quyidagi bakteriyalar kiradi: mikobakteriyalar, psevdomonandlar, sporaxosilqilovchi, azotbiriktiruvchi, bakteriyalar, aktinomisetlar, zamburug’lar. Bu mikroorganizimlar har doim o’simliklar va bir –birlari bilan simbioz ko’rinishlarida yashaydi.
Tuproqning allohton mikroflorasiga asosan odam va xayvonlarning normal va patogen mikroflorasi kirishi mumkin, lekin bu mikroorganizimlar tuproqda ko’paymaydi va ma’lum davirgacha saqlanib turishi mumkink. Shuning uchun tuproqning yuqumli kasallikni manbasi bo’lishini e’tirof etgan holda, patogen bakteriyalarni tuproqda qancha vaqtgacha saqlanishini bilish va tuproqni epidemiologik nuqtai nazardan xafsiz ekanligini aniqlashda muhim praktik ahamiyatga ega.
Suv mikroflorasi. Suv ham mikroorganizimlaning tabbiyi yashash muhitlaidan biri xisoblanadi. Suvning mikroflorasining tarkibi sho’r dengiz, okian suvlari va chuchuk suv havzalariga bog’liq. Suvda mikroorganizimlarning toksonomik grppalarining qariyib hamma vakillari uchraydi. Suv mikrofloralari majmuasini mikroblar planktoni deb yuritiladi.
Suvning autoxton mikroflorasiga suvda doimo yashovchi mikroblar majmuasi kiradi va ko’roq turoq mikroflorasiga o’xshab ketadi, chunki suv va tuproq o’rtasida doimo tabiyi munosobatlar ro’y berib turadi (qor, yomg’ir). Suvning maxsus mikroflorasiga kiradi: Micrococcus candicanis, M. roseus, Sarcina lutea, Bacteriumaquatilis communis, Pseudomonas, Leptospira, Proteus anaeroblardan Clostridiumb Chromobacterium violaceum. Alloxton florasini esa asosan suvga tasodifan tashqiy muhitdan tushgan mikroorganizimlar yig’indisi tashkil qiladi va ular suvda nisbatan uzoq saqlanib turmaydi.
Ochiq suv havzalarining mikroflorasi miqdoriy ko’rsatkichlari doim o’zgarib turadi, uning o’zgarib turishi asosan suv havzasini tipiga, uning ifloslanish darajasiga, meterologik xolatga va yil fasllariga bog’liq bo’ladi.
Suvning bakteriyalar bilan ifloslanishi asosan unga ishlatilgan chiqindi suvlarni tozalanmasdan tushishi oqibatida ro’y beradi. Suvga bu iflos suvlar bilan odam va hayvonlarning normal mikroflorasidan tashqari shartli patogenlar va patogen mikroorganizimlar ham tushishi ( ichak yuqumli kasallik qo’zg’atuvchilari, tulyaremiya, iersiniozlar, leptospirozlar, viruslar poliomielit, gepatit A va bosh.) mumkin. Bundan tashqari odamlar va hayvonlarning cho’milishi oqibatida ham suvga alloxton mikroorganizimlar tushadi. Suv patogen bakteriyalarning ko’payishi uchun noqulay muhit xisoblanadi. Suv tabiyi sharoitda doimo tozalanib turadi, chunki suvning avtoxton mikroflorasi kuchli antogonistik xususiyatga ega, shu bilan birgalikda bu mikrofloralar suvga tushgan organik modalarni tez o’zlashtirib olishadi va bu o’z navbatida suvni odam va hayvonlar chiqindilaridan tozalanishiga olib keladi. Lekin suv biosenozida mikroorganizimlarning miqdoriy va sifat ko’rsatkichlari bir xil ko’rinishda bo’lmaydi va turli faktorlar ta’sirida doimo o’zgarib turadi, ya’niy saproblik xolatiga bog’liqdir. Saproblik (sapronost) termini suv havzasidagi umumiy xususiyatlar va shular bilan birga suvdagi mikroblar tarkibi, miqdori va suvdagi ma’lum organik, neorganik moddalarning konsentrasiyasini belgilaydi. Suvning doimo tozalanib turishi oqibatida suvning bioseozi
o’zgarib turadi. Ifloslanish darajasiga qarab suv havzalarida polisaprob, mezosaprob, oligosaprob zonalar qabul qilingan.
Polisaprob zonada (o’ta ifloslangan) katta miqdorda yengil parchalanuvchi organik moddalar saqlanadi, kislorod konsentrasiyasi minimal darajada va 1 ml suvda milliondan ko’p mikroblar uchraydi.
Mezosaprob zonada esa oksidlanish va nitrifikasiyalanish jarayonlari ustin turadi, suv tozalanib boradi 1 ml suvda 100 ming atrofida mikroblar bo’lishi mumkin.
Oligosaprob zonada suvning o’z-o’zidan tozalanishi nihoyasiga yetgan, organik moddalar suv tarkibida diyarli bo’lmaydi va 1 ml suvda 10 dan 1000 mikrob bo’lishi mumkin.
Patogen bakteriyalar polisaprob zonada juda ko’p uchraydi, sekin asta o’lib, tozalanib mezosaprob zonada kamroq va olgasaprob zonada esa diyarli uchramaydi.
|