START
 
Po zarejestrowaniu woltamperogramu należy zapisać uzyskane wyniki. W tym celu należy przejść do menu: Curve -> Save curve

START
-
Po zarejestrowaniu woltamperogramu należy zapisać uzyskane wyniki. W tym celu należy przejść do menu: Curve -> Save curve.., co powoduje pojawienie się okna dialogowego z komunikatem (Rys.4, krok 1,2,3).
Rys.4.
Okno to pozwala zachować dane z wykonania pomiaru. Najpierw w oknie dialogowym należy odszukać znajdujący się na pulpicie (ikona z lewej strony) - katalog STUDENCI, następnie utworzyć nowy folder. W polu nazwa pliku wpisać swoje nazwisko (np. Kowalski), otworzyć utworzony folder, a następnie w miejscu Nazwa pliku (Rys.4.) należy wpisywać swoje nazwisko oraz numer porządkowy woltamperogramu, np. Kowalski1.
UWAGA! PAMIĘTAJ, ABY KOLEJNYM WOLTAMPEROGRAMOM NADAWAĆ NASTĘPUJĄCE PO SOBIE NUMERY PORZĄDKOWE: 1 (DLA PRÓBKI Z SOKIEM),
2 (DLA PRÓBKI Z SOKIEMI Z I DODATKIEM), 3 (DLA PRÓBKI Z SOKIEMI Z
II DODATKIEM), 4 (DLA PRÓBKI Z SOKIEMI Z III DODATKIEM).
-
Następnie należy zmierzyć wartość natężenia prądu otrzymanego piku soku jabłkowego oraz odczytać ich potencjały. W tym celu należy wejść do menu Plot oraz włączyć ikonę, jak pokazano na Rys.5. Opcja ta umożliwia odczytanie potencjałów pików i wartości natężeń prądów pików. Po wybraniu tej opcji na ekranie pojawia się następujące okno dialogowe z danymi (Rys.5, krok 1,2,3). W przypadku, gdy sygnały nie zostaną automatycznie odmierzone przez program, należy odmierzyć je ręcznie.
Rys.5.
-
Odczytane wartości potencjałów pików (zapisać w tabeli w miliwoltach!) oraz wartości natężeń prądów pików (w mikroamperach) należy umieścić w tabeli:
|
Ep (mV)
|
Ip (µA)
|
Próbka soku jabłkowego
|
|
|
Próbka soku jabłkowego I dodatek
|
|
|
Próbka soku jabłkowego II dodatek
|
|
|
Próbka soku jabłkowego III dodatek
|
|
|
Kolejnym etapem jest zarejestrowanie trzech woltamperogramów po trzykrotnym dodatku wzorca kwasu askorbinowego do analizowanej próbki. W tym celu do naczynka woltamperometrycznego należy wprowadzić pipetami automatycznymi przez otwór w teflonowej pokrywie kolejno po: 30.00; 45.00; 75.00 µl roztworu wzorcowego kwasu askorbinowego o stężeniu 0.01 mol L-1.
UWAGA! NALEŻY PAMIĘTAĆ, ŻE TAK MAŁE OBJĘTOŚCI POWINNY BYĆ
DODAWANE DO ROZTWORU MIESZANEGO, DLATEGO W TRAKCIE
DODAWANIA NALEŻY WŁĄCZYĆ MIESZADŁO MAGNETYCZNE!
-
Po dodatku roztworu wzorcowego kwasu askorbinowego do analizowanej próbki należy odczekać 3 minuty, po czym wyłączyć mieszanie, a następnie zarejestrować kolejne woltamperogramy – w tym celu przejdź do punktu i.
-
Po zarejestrowaniu kolejnego woltamperogramu należy zapisać wyniki (patrz punkt k.) oraz zmierzyć potencjały pików, wartości natężeń prądu (patrz punkt l.), a następnie wyniki zapisać w Tabelce (patrz punkt m.).
-
Po wykonaniu analizy próbek należy dokładnie umyć wodą destylowaną układ elektrod. Nasyconą elektrodę kalomelową należy umieścić w nasyconym roztworze KCl. Wyłączyć program (przejść do menu Method -> Exit), sterownik elektrod, komputer. Wyłączyć listwę zasilającą.
-
Opracowanie wyników
-
Wykonać wykres właściwy dla metody wielokrotnego dodatku wzorca.
-
Obliczyć zawartość kwasu askorbinowego w mg/l (witaminy C) w soku jabłkowyn „Cappy”. Zinterpretować uzyskane wyniki.
-
Środki ostrożności
-
W trakcie wykonywania ćwiczenia student powinien nosić odzież ochronną.
-
Roztworów nie należy wdychać i pipetować ustami.
-
Identyfikacja zagrożeń:
- roztwory wykorzystywane w ćwiczeniu nie zostały sklasyfikowane jako niebezpieczne
-
Pierwsza pomoc:
- w razie kontaktu ze skórą: spłukać dużą ilością wody.\- w razie kontaktu z oczami: przepłukać dużą ilością wody, przy szeroko otwartej powiece, usunąć soczewki kontaktowe jeśli są.
- w przypadku wystąpienia podrażnień skontaktować się z lekarzem.
- w razie spożycia: przepłukać usta wodą, podać do wypicia niewielką ilość wody
i skontaktować się z lekarzem
S1 - WYZNACZANIE AKTYWNOŚCI AMYLAZY W ŚLINIE
Amylaza jest enzymem występującym w ślinie i soku trzustkowym, który katalizuje hydrolityczny rozkład wiązań -glikozydowych w polisacharydach takich jak skrobia, glikogen oraz produkty ich rozpadu. Początkowo skrobia jest rozbijana na amylodekstryny, a w miarę postępu reakcji enzymatycznej hydrolizy powstają dekstryny. Końcowymi produktami są maltoza i glukoza. Optymalne pH działania enzymu wynosi 6.9-7.0. Inhibitorami hydrolizy skrobi są jony jodkowe, fluorkowe, cytrynianowe i szczawianowe. Aktywatorami natomiast są jony chlorkowe.
Skrobia oraz amylodekstryny zawierające powyżej 30 reszt glukozowych w łańcuchu tworzą z jodem addycyjne połączenie o charakterystycznym niebieskim zabarwieniu. Zmiana stężenia substratów jest proporcjonalna do aktywności amylazy. Badanie aktywności amylazy w materiałach biologicznych pobranych od pacjentów (mocz, krew, ślina) ma znaczenie diagnostyczne w niektórych chorobach.
Aktywność enzymu może być wyrażona w katalach (kat), jednostkach Somogyi (JS) lub w jednostkach enzymatycznych (U). Katal jest to aktywność, która przekształca 1 mol substratu (w ćwiczeniu skrobi) w czasie 1 s - mianem katala jest zatem mol·s-1. Katal jest jednostką bardzo dużą i z reguły aktywność enzymu wyraża się w mikrokatalach (kat) lub nanokatalach (nkat). JS jest to aktywność amylazy zawartej w 100 ml badanego materiału, która katalizuje hydrolizę 10 mg skrobi w czasie 30 min., do związków niebarwiących skrobi. Jednostka enzymatyczna odpowiada ilości enzymu przekształcającemu 1 mikromol substratu w czasie 1 minuty. Obecnie zalecaną jednostką aktywności enzymatycznej w układzie SI jest katal.
Celem ćwiczenia jest zbadanie aktywności amylazy zawartej w ślinie oraz wpływu na nią temperatury, jonów chlorkowych, cytrynianowych oraz alkoholu.
Odczynniki
roztwór skrobi - 0.05%, pH 6.9-7.0,
roztwór jodu – 1% w 2% KI,
roztwór chlorku sodu o stężeniu c(NaCl) = 0.01 mol/l,
roztwór cytrynianu sodu c(Na3C6H5O7) = 0.01 mol/l,
alkohol etylowy.
Aparatura i sprzęt laboratoryjny
kolby miarowe pojemności 10 ml
|
8 szt.
|
pipeta wielomiarowa pojemności 1 ml z podziałką co 0.1 ml
|
5 szt.
|
mikropipeta nastawna 100-1000 µl
|
1 szt.
|
mikropipeta jednomiarowa 10 µl
|
1 szt.
|
kubki jednorazowe
|
|
zlewka o pojemności 25 lub 50 ml
|
1 szt.
|
pipetka z tworzywa
|
1 szt.
|
stoper
|
1 szt.
|
spektrofotometr z kuwetami o szerokości 1 cm
UWAGA! WSZYSTKIE ROZTWORY PRZYGOTOWUJEMY WYKORZYSTUJĄC
WODĘ POZBAWIONĄ ZWIĄZKÓW REDUKUJĄCYCH.
Wykonanie ćwiczenia
Przygotowanie roztworu śliny
1. Usta dobrze przepłukać wodą destylowaną odczekać ok. 1 minutę i do zlewki o poj. 25 ml zebrać ok. 2 ml śliny.
2. Do kolbki o poj. 10 ml odmierzyć 250 l próbki śliny i uzupełnic kolbkę wodą do kreski.
Określanie wpływu temperatury na aktywność amylazy
1. Do 4 kolbek o poj. 10 ml wprowadzić po dokładnie odmierzonym 1 ml roztworu skrobi. Dwie kolbki będą próbkami kontrolnymi (K1 i K2), a dwie próbkami badanymi (B1 i B2). Dla próbki badanej B1 próbką kontrolna jest K1, zaś dla próbki badanej B2 próbką kontrolną jest K2.
2. Kolbki K1 i B1 wstawić na 10 min. do termostatowania w temp. 37oC.
3. W czasie gdy próbki K1 i B1 termostatują się, do kolbki B2 wprowadzić 10 µl roztworu śliny. Zawartość delikatnie wymieszać i pozostawić w temperaturze pokojowej na 10 min.
4. W czasie termostatowania próbek K1 i B1, do kolbki K2 wprowadzić 1 ml roztworu jodu, uzupełnić ją wodą destylowaną do kreski, dobrze wymieszać i przeprowadzić pomiar absorbancji.
UWAGA: WE WSZYSTKICH POMIARACH ODNOŚNIKIEM JEST WODA DESTYLOWANA
PRZED KAŻDYM POMIAREM ABSORBANCJI ROZTWORU BADANEGO SPEKTROFOTOMETR NALEŻY WYZEROWAĆ WZGLĘDEM ODNOŚNIKA.
5. Po upływie 10 min. od wprowadzenia roztworu śliny do kolbki B2 wprowadzić do niej 1 ml roztworu jodu. Kolbkę uzupełnić wodą destylowaną do kreski, dobrze wymieszać i przeprowadzić pomiar absorbancji.
6. Po 10 min. termostatowania do kolbki B1 wprowadzić 10 l roztworu śliny. Zawartość kolbki delikatnie wymieszać i wstawić ją na 10 min. do termostatowania w temp. 37oC.
Do kolbki K1 wprowadzić 1 ml roztworu jodu i uzupełnić ją wodą do kreski. Zawartość kolbki dobrze wymieszać i zmierzyć absorbancję roztworu.
7. Po kolejnych 10 min. termostatowania do kolbki B1 wprowadzić 1 ml roztworu jodu i uzupełnić ją wodą do kreski. Zawartość kolbki dobrze wymieszać i zmierzyć absorbancję roztworu.
PRZYGOTOWANIE SPEKTROFOTOMETRU DO POMIARÓW SPEKTROFOTOMETRYCZNYCH
1. Włączyć spektrofotometr przyciskiem 0/I umieszczonym n a prawym boku obudowy. Na ekranie wyświetla się ekran startowy:
2. Na panelu sterowania nacisnąć przycisk w celu uruchomienia autodiagnostyki.
Po zakończeniu autodiagnostyki na ekranie wyświetli się menu główne (Main Menu).
3. Na panelu sterowania nacisnąć przycisk aby przejść do pomiarów spektrofotometrycznych. Na ekranie wyświetla się menu pomiarów spektrofotometrycznych.
Na panelu sterowania nacisnąć przycisk . W prawym górnym rogu ekranu wyświetla się Ref. in?.
Jedną z kuwet uzupełnić w ok. ¾ objętości odnośnikiem (wodą destylowaną), ścianki dobrze wytrzeć ligniną w celu usunięcia kropli roztworu i zanieczyszczeń, a następnie umieścić ją w celce numer 1 spektrofotometru. Sprawdzić czy gałka przesuwająca wózek z kuwetami jest dosunięta do końca (pozycja 1).
UWAGA! PO ZAKOŃCZENIU POMIARU DLA ODNOŚNIKA NIE WYJMOWAĆ KUWETY
ZE SPEKTROFOTOMETRU.
Nacisnąć przycisk aby rozpocząć pomiar. W prawym górnym rogu ekranu wyświetla się Measuring.
Po zakończeniu pomiaru dla odnośnika w prawym górnym rogu ekranu wyświetla się Sample in?.
Gałkę przesuwającą wózek z kuwetami wysunąć do pozycji 2 odpowiadającej celce numer 2, w której zostanie umieszczona kuweta z roztworem badanym. Kuwetę tę przepłukać porcją roztworu badanego, uzupełnić ją tym roztworem w ok. ¾ objętości, ścianki dobrze wytrzeć ligniną w celu usunięcia kropli roztworu i zanieczyszczeń, a następnie umieścić ją w celce numer 2 spektrofotometru.
Rozpocząć pomiar absorbancji próbki naciskając przycisk . Na ekranie wyświetla się Measuring oraz wartość absorbancji.
Aby przeprowadzić kolejny pomiar należy nacisnąć przycisk . W prawym górnym rogu ekranu wyświetla się Ref. again?. Naciśnięcie przycisku powoduje wyświetlenie Ref. in?. Wózek z kuwetami ustawić w pozycji odnośnika i nacisnąć przycisk aby wyzerować spektrofotometr. Następnie zmierzyć absorbancje kolejnego roztworu badanego (celka nr 2) w sposób analogiczny do opisanego powyżej.
Określanie wpływu jonów chlorkowych, cytrynianowych i alkoholu na aktywność amylazy
1. Do 3 kolbek (B3, B4 i B5) o poj. 10 ml odmierzyć po 1 ml roztworu skrobi.
2. Kolbki B3, B4 i B5 wstawić na 10 min. do termostatowania w temp. 37oC.
3. Po upływie 10 min. do kolbki B3 wprowadzić 1 ml roztworu chlorku sodu, do kolbki B4 1 ml roztworu cytrynianu sodu, a do kolbki B5 1 ml alkoholu. Do każdej kolbki wprowadzić 10 l roztworu śliny Zawartość kolbek delikatnie wymieszać i wstawić je na 10 min. do termostatowania w temp. 37oC.
4. Po upływie 10 min. do kolbek dodać 1 ml roztworu jodu i uzupełnić je wodą destylowaną do kreski. Zawartość kolbek dobrze wymieszać i zmierzyć absorbancję roztworów.
UWAGA! PRÓBKĄ KONTROLNĄ DLA TEJ CZĘŚCI ĆWICZENIA JEST PRÓBKA K1,
ODNOŚNIKIEM JEST NADAL WODA DESTYLOWANA
Opracowanie wyników
1. Obliczyć aktywność amylazy w:
katalach/l wg wzoru:
- jednostkach Somogyi wg wzoru:
- jednostkach enzymatycznych U korzystając z zależności:
1 kat = 60·106 U
2. Określ wpływ temperatury, jonów chlorkowych, cytrynianowych oraz alkoholu na aktywność amylazy.
S1 - KINETYCZNE OZNACZANIE MOLIBDENU METODĄ TANGENSÓW
Metody analizy oparte na pomiarze szybkości reakcji i wykorzystaniu jej wartości do oznaczenia stężenia substancji nazywane są kinetycznymi metodami analizy.
Metody kinetyczne stosowane są bardzo często w oznaczeniach śladowych ilości substancji, gdy wykazują one zdolności pełnienia roli katalizatora odpowiedniej reakcji wskaźnikowej. Można oznaczać w ten sposób np. jony metali przejściowych czy enzymy.
Szybkość takiej katalizowanej reakcji opisanej równaniem:
(1)
pierwszego rzędu względem substratu A można wyrazić równaniem:
(2)
gdzie: k1 - stała szybkość reakcji,
a - początkowe stężenie substratu A,
x - stężenie produktu X po upływie czasu t,
(a - x) - stężenie substratu A po upływie czasu t,
ck - stężenie katalizatora,
Ic - iloczyn lub bardziej złożona funkcja stężeń wszystkich pozostałych substancji biorących udział w reakcji.
Wartość Ic na ogół nie zmienia się podczas przebiegu reakcji i oznaczając jako k = k1 · Ic otrzymujemy:
(3)
Oznaczenia kinetyczne można prowadzić w dwóch wariantach, różniczkowym i całkowym. W wariancie różniczkowym ograniczamy pomiary stężenia produktu X tylko do początkowego okresu reakcji, gdy x « a. Wzór (2) przybiera wtedy postać:
(4)
Całkując równanie (4) otrzymujemy liniową zależność stężenia produktu, które zwykle stanowi wielkość mierzoną od czasu:
x = k · a · ck · t (5)
Należy pamiętać, że zależność (5) jest słuszna tylko dla początkowego przebiegu reakcji.
Jeżeli podczas pomiaru następują znaczne zmiany stężenia substancji A, wówczas stosujemy całkowy wariant metod kinetycznych całkując równanie (1). Otrzymujemy wówczas zależność:
(6)
która jest spełniona dla całego czasu przebiegu reakcji.
Oznaczenie stężenia katalizatora można przeprowadzić jedną z trzech metod stosując w każdej wariant różniczkowy lub całkowy.
1. Metoda tangensów.
a) wariant różniczkowy - bada się zmiany stężenia produktu (x) w czasie dla różnych stężeń katalizatora. Prowadząc pomiary w początkowym okresie przebiegu reakcji otrzymuje się zgodnie z zależnością (5) proste o różnych nachyleniach do osi czasu. Zmierzone tangensy kątów nachylenia (tg ) są liniową funkcją stężenia katalizatora, która stanowi prostą kalibracyjną.
b) wariant całkowy - nie ograniczający pomiarów stężenia produktu (x) do okresu początkowego przebiegu reakcji. Dla każdego badanego stężenia katalizatora sporządza się wykres zależności . Zgodnie z zależnością (6) otrzymuje się także proste, których tangensy kąta nachylenia (tg ) są liniową funkcją stężenia katalizatora.
2. Metoda ustalonego czasu.
W metodzie tej mierzy się stężenie produktu (x) lub substratu po określonym czasie przebiegu reakcji dla różnych stężeń katalizatora.
a) wariant różniczkowy - prostą kalibracyjną stanowi zależność zmierzonego stężenia produktu od stężenia katalizatora.
b) wariant całkowy - prostą kalibracyjną stanowi zależność od stężenia katalizatora.
3. Metoda ustalonego stężenia.
W metodzie tej mierzy się czas reakcji (t) potrzebny do osiągnięcia założonego stężenia jednego z produktów lub substratów dla różnych stężeń katalizatora. Zarówno w wariancie różniczkowym jak i całkowym prostą kalibracyjną stanowi zależność odwrotności czasu reakcji od stężenia katalizatora
Celem ćwiczenia jest oznaczenie zawartości molibdenu(VI) kinetyczną metodą tangensów w oparciu o reakcję utleniania jonów jodkowych nadtlenkiem wodoru.
Utlenianie jonów jodkowych nadtlenkiem wodoru do wolnego jodu przebiega w środowisku kwaśnym zgodnie z równaniem reakcji:
2I- H2O2 2H I2 2H2O (7)
Wzrost stężenia jodu wydzielającego się w czasie trwania reakcji można śledzić spektrofotometrycznie. Mierzy się zmiany absorbancji barwnego kompleksu jod-skrobia, który wykazuje maksimum pochłaniania przy długości fali 560 nm.
Reakcja opisana równaniem (7) przy niskim stężeniu reagentów bardzo powoli. Śladowe ilości molibdenu(VI) wprowadzone do reagującej mieszaniny zwiększają, w sposób katalityczny jej szybkość. Wzrost szybkości reakcji jest proporcjonalny do stężenia molibdenu(VI), co pozwala na jego ilościowe oznaczenie.
Odczynniki
roztwór wzorcowy molibdenu (VI) o stężeniu c = 10 µg Mo/ml
roztwór nadtlenku wodoru o stężeniu c(NaOH) = 1 mol/l
roztwór jodku potasu o stężeniu c(KI) = 0.005 mol/l
roztwór kwasu siarkowego o stężeniu c(H2SO4) = 0.8 mol/l
roztwór skrobi o stężeniu c = 0.2%
aparatura i sprzęt laboratoryjny
kolby miarowe pojemności 10 ml
|
5 szt.
|
kolby miarowe o pojemnosci 25 ml
|
2 szt.
|
pipety wielomiarowe o pojemności 1 ml
|
3 szt.
|
pipety wielomiarowe o pojemności 5 ml
|
2 szt.
|
mikropipeta 20-200 µl
|
1 szt.
|
mikropipeta 200-1000 µl
|
1 szt.
|
spektrofotometr UV/VIS z kuwetami o szerokości 1cm.
UWAGA: WSZYSTKIE ROZTWORY PRZYGOTOWUJEMY WYKORZYSTUJĄC
WODĘ POZBAWIONĄ ZWIĄZKÓW REDUKUJĄCYCH.
Wykonanie ćwiczenia
Przygotowanie roztworu molibdenu(VI) o stężeniu 1 µg Mo/ml
Do kolbki miarowej o pojemności 25 ml wlać ok. 10 ml wody destylowanej, a następnie wprowadzić odmierzone dokładnie 2.5 ml roztworu wzorcowego molibdenu(VI) o stężeniu 10 µg Mo/ml. Uzupełnić kolbkę wodą destylowaną do kreski i dokładnie wymieszać.
Przygotowanie roztworu nadtlenku wodoru o stężeniu 0.1 mol/l
Do kolbki miarowej o pojemności 25 ml wlać ok. 10 ml wody destylowanej, a następnie wprowadzić odmierzone dokładnie 2.5 ml roztworu nadtlenku wodoru o stężeniu 1 mol/l. Uzupełnić kolbkę wodą destylowaną do kreski i dokładnie wymieszać.
Przygotowanie spektrofotometru do pomiarów kinetycznych
|