ábra - Amiloid -peptid által indukált komplement aktiváció gátlása kis molekulatömegű szintetikus vegyületekkel in vitro

20. ábra A vezérmolekula jellemzése szelektivitási vizsgálatokban. A C1q kötést vizs-gáltuk A (fekete kör) és IgG (fehér háromszög) molekulákhoz. SAP kötését is vizsgáltuk A peptidhez (fehér négyzet) a vegyület jelenlétében. A vizsgálatok eredményei azt mutatták, hogy a vegyület mikromólos koncentrációban csak az A peptidhez történő C1q kötést gátol-ta, ugyanakkor nincs hatása más fehérje-fehérje kölcsönhatásra, beleértve az antitestekhez történő C1q kötést is (Sárvári és mtsai, 2003). A pontok hat független mérés átlagai.
Mivel a vegyület gátolta a C1q kötést A peptidhez, de nem volt hatása a C1q kötésre IgG Fc régiójához és a SAP kötésre A peptidhez sem, valószínűnek látszott, hogy a vezérmolekula szelektíven gátolja a C1q kötést A peptidhez és több más nem-immunglobulin aktivátorhoz.
A vegyület hatásmechanizmusa szempontjából döntő kérdés, hogy melyik kölcsönható partner kötőhelyéhez kapcsolódva gátolja a C1q kötését A peptidhez. A kérdést tömeg-spektrometriás kísérletben vizsgáltuk. A módszert elterjedten használják kis molekulák és fehérjék nem kovalens komplexeinek mennyiségi meghatározására. Az általunk használt elektrospray technikában a tömegspektrométer közvetlenül mérte a kondenzált fázisban jelenlévő komplexeket. A kísérletben natív körülmények között inkubáltuk az A peptidet és a vezérmolekulát, majd a kialakult komplexeket tanulmányoztuk (Sárvári és mtsai, 2003).
A B
21. ábra A vezérmolekula és A peptid kölcsönhatásának vizsgálata ESI tömegspektro-metriával. Először az A (M1) és melatonin (M2) közötti jól jellemzett kölcsönhatást vizsgál-tuk (A). 3 óra inkubáció után az A közel 30%-a a melatoninnal kialakult komplexben talál-ható. Ezzel szemben a vezérmolekulával az A 3%-a képzett komplexet ugyanennyi idő alatt (B). A komplex csúcsának intenzitása 24 órás inkubáció alatt sem emelkedett számottevően.
A kísérlet eredménye bizonyította, hogy a vezérmolekula nem köt az A peptidhez. A C1q kötést így valószínűleg a C1q A kötőhelyéhez kötve gátolja a vegyület.
A lead molekula hatékonyságát funkcionális vizsgálatban is ellenőriztük. Hippokampális sejteket kezeltünk szérum jelenlétében A peptiddel, és a vegyület koncentrációfüggő védő hatását vizsgáltuk in vitro.
22. ábra A lead vegyülettel történő C1q kötés gátlása A peptidhez a komplement-függő citotoxicitás felfüggesztését eredményezte (Sárvári és mtsai, 2003).
A kísérlet eredménye azt mutatta, hogy a C1 aktiváció nemcsak a C1r és C1s proteázok szintjén (7. ábra), hanem a C1q A kötőhelyén is gátolható (22. ábra).
7. Eredmények megbeszélése
7.1 A komplement aktiváció biológiai jelentősége
A keringésben az antitestek antigénekhez kapcsolódva immunkomplexeket hoznak létre. Ha ezeket a fagociták nem takarítják el, akkor az érfalon vagy a szövetekben lerakódva tartós gyulladást okozhatnak. Komplement hiányos állapotok bizonyítják, hogy a komplement fontos szerepet játszik az immunkomplexek eltávolításában. C5 vagy terminális komplement komponensek hiánya nem okoz változást, de a korai komponensek (C1q, C1r, C1s, C4, C2, C3) hiánya gyakran immunkomplex betegséget okoz. Ez összhangban van azzal a megfigye-léssel, hogy a klasszikus reakcióút fontos szerepet játszik a nagyméretű immunkomplexek kialakulásának és lerakódásának megakadályozásában, míg az alternatív út működése teszi oldhatóvá ezeket, ha mégis kialakulnának (Schifferli és mtsai, 1986).
Naponta 109 sejt pusztul el programozottan a szervezet számára nem megfelelő, hibás, rossz helyen lévő, nem funkcióképes, potenciálisan veszélyes sejtek eliminálására. Apoptózissal elpusztult sejtek eltávolításában fontos szerepet játszik a komplementrendszer. A pusztuló sejtek fagocitózist elősegítő molekulákat, például foszfokolint jelenítenek meg membránjuk extraculluláris oldalán, amihez Ca++ jelenlétében CRP kötődik (Szalai, 2004). Más membrán struktúrákhoz IgM köt. A C1q mindkét fehérjét felismeri, ami a klasszikus út aktivációját eredményezi. A keletkező C3b és C4b fragmentumok opszonizálják az elpusztult sejteket, ezáltal a CRP-vel és IgM-mel jelölt apoptotikus sejteket a szöveti makrofágok sikeresen eltakarítják. Az aktiváció azonban a C3 hasítását követően megáll, mert a CRP H-faktort köt, és az I-faktor a C3b hasításán keresztül lefékezi az aktivációt (lásd bővebben: 12. oldal). Részben tehát az I-faktor felelős azért, hogy az apoptózissal elpusztult sejtek nem okoznak gyulladást, mivel a C3b hasítása révén megakadályozza a C5-konvertáz kialakulását, ezáltal az apoptotikus sejtek környezetében nem következik be a C5 hasítása és a C5a felszabadulása.
A komplementrendszer elemei az összes testfolyadékban megtalálhatóak, és fajlagos immunitás hiányában is biztosítani tudják a fertőző ágensek elleni hatékony védelmet. A fertőző kórokozók elleni harcban a komplement opszonizáló, gyulladásserkentő és litikus aktivitása egyaránt kiemelkedően fontos szerepet játszik.
A fagociták, amelyek feladata a sejttörmelékek, immunaggregátumok, baktériumok és más mikroorganizmusok bekebelezése és feldolgozása, csak akkor tudják ellátni feladatukat, ha az eltávolítandó sejteket meg tudják különböztetni a szervezet saját sejtjeitől. A védekező reakci-ónak ezért az egyik feladata, hogy antitestekkel és komplement fragmentumokkal megjelölje az eltávolítandó célsejteket a komplement receptorokkal rendelkező fagociták számára. A fagociták közé tartoznak a vér monocitái és a polimorfonukleáris leukociták, valamint a különböző szöveti makrofágok. A fagocitózisban résztvevő receptorok az antitestek Fc régió-ját felismerő FcR, és a C3b, illetve iC3b (I-faktor által hasított C3b) fragmentumokat felisme-rő CR1 és CR3. Elegendő számú antitest a célsejt membránján elégséges az FcR-val rendelke-ző fagociták számára a bekebelezési folyamat beindításához. Kevesebb antitest elegendő a klasszikus út aktivációjához, és a C4b és C3b jelölések felerősítik az opszonizációt. Azonban a CR1 és CR3 önmagában nem mindig elégséges a bekebelezés beindításához. Bekebelezés után a fagoszómák lizoszómákkal olvadnak össze, és a lizoszómális enzimek lebontják a bekebelezett sejtet.
A klasszikus út aktivációja során három kisméretű fragmentum, C4a, C3a és C5a szabadul fel (Ember és mtsai, 1998). A három molekula rokon szerkezetű, hasonló aktivitási mintázattal, de különböző hatékonysággal rendelkeznek (C4a<
A vörösvértest membránon kialakuló membránkárosító komplex vizsgálatából kiderült, hogy a C5b-8(C9)n összetételű komplex esetében a pórus mérete 3 és 10nm között van. Fontos, hogy a 3nm pórusátmérőjű komplex (n=2) is rendelkezik litikus aktivitással. De a sejtmaggal rendelkező sejtek többféle módon képesek kivédeni a membránkárosító komplex litikus hatását. A komplex kialakulása után, de még a lízis előtt hirtelen megemelkedik az intracelluláris Ca++ koncentráció, ami a komplex leválását vagy internalizációját és a javító mechanizmusok aktivációját eredményezi. Szemben a vörösvértestekkel, amelyek kizárólag a CD59 molekulát használják a C9 beépülésének megakadályozására, a magvas sejtek ellenálló-ak a komplement lízissel szemben. Azonban nagyfokú komplement aktiváció esetén (105 membránkárosító komplex /sejt) még a magvas sejtek sem képesek a túlélésre, mivel a komplex kialakulásával párhuzamosan depolarizálódik a sejtmembrán. Az ezt követő kom-penzációs mechanizmusok és a Ca++ indukálta sejt aktivációs folyamatai elhasználják az energia tartalékokat, és ez a bekövetkezett membránszerkezet sérülésekkel együtt a sejt halálát okozza.
A komplement fontos szerepet játszik a B-sejt válasz kialakulásában. Ennek molekuláris alapja, hogy a B-sejteken található antigénreceptor és CR2 keresztkötése alakul ki, ha a komplement aktiváció során az antigénhez C3d kapcsolódik. A keresztkötött receptorok sokkal erősebb B-sejt aktivációt eredményeznek, mint az antigén egyedül. Ez magasabb antitest titer és erősebb B-sejt memória kialakulásához vezet.
7.2 A peptid által kiváltott komplement aktiváció
A komplement aktiváció jelentőségére az Alzheimer kór patomechanizmusában két kulcsfontosságú megfigyelés világított rá. Az egyik megfigyelés szerint Alzheimer kórban a komplement aktiváció antitestektől független folyamat. A C1q köt a plakkok fő alkotójához, az A peptidhez (Rogers és mtsai, 1992). Modellezési kísérletek szerint az A 4-11 szakaszá-ban található Asp7, Glu11 oldalláncok elektrosztatikus kölcsönhatást létesíthetnek a C1q A láncban található Arg16, Arg19, Arg20 bázikus oldalláncokkal (Velazquez és mtsai, 1997).
Az eredmények azt sugallják, hogy Alzheimer kór esetében elsősorban a klasszikus útnak van jelentősége, de in vitro az A C3 kötésen keresztül aktiválja a komplement alternatív útját is (Bradt és mtsai, 1998). Ez a megfigyelés magyarázattal szolgál arra, hogyan alakul ki a gyulladás már a betegség preklinikai szakaszában (Zanjani és mtsai, 2005), és marad fenn a betegség során több évtizedig. Fontos megjegyezni, hogy az NFT is aktiválja a komplement klasszikus útját (Shen és mtsai, 2001).
A másik megfigyelés szerint a komplement fehérjéknek jelentős gyulladást kiváltó hatásuk van az agyszövetben is. Az aktiváció során felszabaduló anafilatoxinok, köztük a C5a keletkezése aktiválja a glia sejteket, és növeli a gyulladásserkentő citokinek termelését. Alzheimer kórban emelkedik a komplement fehérjék szintézise. A komplement aktiváció során keletkező fragmentumok megjelölik (opszonizálják) a célsejtek membránját a fagociták számára. Ezeket az opszoninokat (például C1q, C4b, C3b) kimutatták Alzheimer kóros betegek agyában. Az idegsejtek membránján keletkező membránkárosító komplexek azok pusztulását eredményezhetik (Webster és mtsai, 1997; Yang és mtsai, 2000). Kísérleteink szerint A szérum jelenlétében a klasszikus út aktivációján keresztül hippokampális sejtek pusztulását okozta in vitro (6. ábra).
7.3 A peptid által kiváltott komplement aktiváció a klasszikus úton történik
Jóllehet a klasszikus és az alternatív útvonal aktivációját is leírták A hatására in vitro, farmakológiai szempontból fontos kérdés, hogy melyik útvonal hatása a domináns. A kérdés megválaszolásához C1-Inh hatását vizsgáltuk az A által indukált komplement aktiváció toxikus hatására hippokampális sejteken in vitro. Kísérleteink azt mutatták, hogy a klasszikus reakcióút endogén szabályozó molekulája felfüggesztette a komplement aktiváció által kiváltott sejtpusztulást (7. ábra). Ez az eredmény azt az elképzelést támasztotta alá, hogy az A elsősorban a klasszikus útvonalon keresztül aktiválja a komplementrendszert, ami idegsejtek pusztulását eredményezi.
Több irodalmi adat utal arra, hogy az in vitro kísérletekkel vizsgált A kiváltotta komplement aktiváció valószínűleg in vivo is lejátszódik. Alzheimer kórban elhunyt betegek agyában, kü-lönösen a hippokampuszban magasabb C1q szintet figyeltek meg (Yasojima és mtsai, 1999). Emellett a betegek agyában kimutathatóak az aktiváció folyamatát bizonyító komplement aktivációs fragmentumok, és a membránkárosító komplex (Webster és mtsai, 1997). Vizsgálataink során RNS (8. ábra) és fehérje szinten (10. ábra) igazoltuk, hogy az agy szöveti makrofágja, a mikroglia folyamatosan termel C1q fehérjét in vitro. RNS szintű kísérletekkel igazoltuk, hogy a mikroglia rendelkezik komplement receptorokkal, többek között a cC1qR, CR3 és a C5aR gén kifejeződését (8. ábra) bizonyítottuk in vitro. Valószínűsíthető, hogy komplement aktiváció esetén a mikroglia sejtek a felszabaduló C5a hatására az aktiváció helyére sereglenek, majd ott az aktivációt kiváltó, már opszonizált anyagot megpróbálják eltávolítani. A felszabaduló C5a IL-1 és IL-6 szintézist indukál A stimulálta mikroglia sejtekben. A keletkező citokinek növelik a korai komplement fehérjék szintézisét, de a C1-Inh szintézise nem változik (Veerhuis és mtsai, 1999). Vizsgálataink azt mutatták, hogy glia sejtekben A kezelés hatására enyhén emelkedett a C1q gének transzkripciója (12. ábra), de a C1-Inh gén átíródása (13. ábra) változatlan maradt. Mivel a C1-Inh a klasszikus reakcióút fő szabályozó molekulája, az aktiváció és a gátlás egyensúlya A jelenlétében felborulhat, ezáltal a komplementrendszer aktivációja szabályozatlanná válhat.
7.4 C1q, a szelektív komplement gátlás lehetséges molekuláris célpontja
A komplement aktiváció szelektív gátlása bizonyos kórképekben, így Alzheimer kór esetében is vonzó terápiás célpontnak látszik. Alzheimer kór esetében az irodalomban közölt adatok és saját kísérleteink eredményei is azt mutatták, hogy az aktiváció túlnyomórészt a klasszikus úton keresztül történik. Ezért molekuláris célpontként a klasszikus reakcióút fehér-jéit vettük számba. A proteázok gátlását a szelektivitás hiánya miatt elvetettük. Ezzel szemben a C1q több ok miatt is vonzó célpontnak látszott. Irodalmi adatok azt mutatták, hogy a C1q molekulán az Fc és az A kötőhelyek különbözőek. Régóta ismert, hogy az immunglobulinok Fc régiójának kötéséért a C1q globuláris doménje felelős (Duncan & Winter, 1988). Az A kötőhelyre vonatkozóan az irodalomban ellentmondó adatok találhatóak. A C1q A lánc 14-26 szekvenciájának megfelelő peptid gátolta a C1q kötését A peptidhez. Ebből azt a következte-tést vonták le, hogy a C1q A láncának ez a környezete felelős az A kötésért (Jiang és mtsai, 1994). Egy másik közlemény azonban a globuláris doménen lokalizálta az A kötőhelyet (Tacnet-Delorme és mtsai, 2001). Számunkra döntő kérdés volt, hogy az Ig és A kötőhely különböző legyen. A kérdés eldöntésére beállítottunk két szilárd fázisú kötési tesztet, az egyikben a C1q-A, a másikban C1q-IgG kölcsönhatást vizsgáltuk. Az első, tehát a C1q-A kötési teszttel vizsgáltuk az RBI vegyület gyűjteményét, amely 640 farmakológiailag aktív vegyületet tartalmazott. Hét olyan vegyületet találtunk, amely hatékonyan (IC50<5M) gátolta a C1q kötést A peptidhez (3. táblázat). A hét anyag egyike sem gátolta a C1q kötését immobilizált antitestekhez. Eredményünk azt az elképzelést támasztotta alá, hogy a C1q molekula eltérő kötőhellyel rendelkezik az A és az Ig kötésére. Ezek szerint az C1q molekulán szelektíven gátolható az A kiváltotta komplement aktiváció. Két nem-immunglo-bulin C1q aktivátor, CRP és SAP kötését is vizsgáltuk A és Ig mellett. A gátlási görbék lefutása (17. ábra) a három nem-immunglobulin aktivátor esetében nagyon hasonlónak bizonyult.
Miután a szelektív komplement gátlás a C1q A kötőhelyének gátlásával megvalósíthatónak tűnt, a Társaság tulajdonában lévő vegyülettárat szűrtük a beállított kötési teszttel. A találatok azonosítása és újramérése után szelektivitási vizsgálatokban jellemeztük őket. A 308 találat közül 56 gátolta a C1q kötését CRP-hez, míg 35 vegyület a C1q kötését MBP-hez (18. ábra). A leghatékonyabb szerkezeti csoport optimalizálásával vezérmolekulát állítottunk elő, ami hatékonyan (IC50=0,7M) gátolta a C1q kötését A peptidhez (19. ábra), de nem gátolt több fehérje-fehérje kölcsönhatást (20. ábra), köztük a C1q immunkomplexekhez történő kötését sem. Tömegspektrometriás kísérletekkel igazoltuk (21. ábra), hogy a vegyület nem az A C1q kötőhelyéhez, hanem a C1q molekulán található A kötőhelyhez köt.
A vezérmolekula funkcionális hatását egy sejtalapú modellben ellenőriztük in vitro. Hippo-kampális sejteket kezeltünk szérum jelenlétében A peptiddel. A kezelés után öt nappal a sejtek 30%-a elpusztult (6. ábra). A vezérmolekula a C1-Inh-hoz hasonlóan (7. ábra) felfüg-gesztette az A komplement-függő citotoxikus hatását (22. ábra). A kölcsönhatás in vivo relevanciáját bizonyítja az a megfigyelés, hogy az Alzheimer kór egyik állatmodelljében, APP transzgenikus egerekben C1q hiányában, amikor a komplement-függő citotxikus hatás nem érvényesül, alacsonyabb sejtpusztulást tapasztaltak (Fonseca és mtsai, 2004).
7.5 Valószínűleg nem az A14-26 régió a C1q molekula A kötőhelye
A vezérmolekula hatékonyan gátolta a C1q kötését direkt aktivátorokhoz, és több nagyságrenddel alacsonyabb mértékben gátolta a C1q kötését antitestekhez. Ezek az eredmé-nyek megerősítették azt az elképzelésünket, hogy a kétféle aktivátorra, antitestekre és direkt C1q aktivátorokra különböző kötőhelyek találhatók a C1q molekulán. A C1q A láncában a 14-26 régióról bizonyították, hogy részt vesz a CRP kötésben (Jiang és mtsai, 1992). Az
A14-26 peptid hatékonyan (IC50=0,7M) gátolta a C1q kötését CRP-hez. Mivel az általunk kifejlesztett vezérmolekula és az A14-26 peptid azonos hatékonysággal gátolta a C1q kötést, valószínűnek látszik, hogy a CRP kötőhely az A14-26 szekvencia környezetében található.
A vezérmolekula hatékonyan gátolta a C1q kötését egy másik akut fázis fehérjéhez, a szérum amiloid P-hez (Ying és mtsai, 1993). Az A14-26 peptid ugyancsak gátolta a C1q kötését SAP-hoz, de a gátlás hatékonysága közel egy nagyságrenddel (IC50=5M) alacsonyabb, mint a CRP esetében. A gátlási hatékonyságok különbözősége arra utalhat, hogy a SAP kötőhely nem pontosan az A14-26 régióban lokalizálható a C1q molekulán.
A vezérmolekula ugyancsak hatékonyan gátolta a C1q kötését A peptidhez. A 14-26 peptid hatását vizsgálva megállapították, hogy gyengén (IC50=70M) gátolta a C1q kötését A peptidhez (Jiang és mtsai, 1994). Az általunk kifejlesztett lead molekula és az A14-26 peptid gátlási állandója közötti két nagyságrend különbség arra utal, hogy az A kötőhely nem az A lánc 14-26 régiójában található. A következtetést alátámasztja egy friss publikáció, amely a C1q globuláris régiójában lokalizálta az A kötőhelyet (Tacnet-Delorme és mtsai, 2001).
7.6 A komplementgátlás lehetséges terápiás előnyei és hátrányai
A komplementrendszer egyik biológiai funkciója, hogy az idegen sejteket felismerje és megsemmisítse, vagy közreműködjön azok megsemmisítésében opszonizációjuk révén. A fibrilláris amiloidot a C1q idegennek ismeri fel, és a kötés hatására aktiválódik a komplement klasszikus reakcióútja (Rogers és mtsai, 1992; Jiang és mtsai, 1994). Az aktiváció során felszabaduló kisméretű C3a és C5a fragmentumok az aktiváció helyére toborozzák az agy szöveti makrofágját, a mikrogliát. Az aktivált mikroglia sejtek hatékony fagociták, és megpró-bálják bekebelezni az opszonizált amiloid lerakódásokat. A lerakódásokat a mikroglia nem tudja eltávolítani, ezért aktivált állapotuk elhúzódik. A fenti folyamatok kétféle úton befolyá-solhatóak. Az egyik lehetőség a fagocitózis elősegítése, pl. anti-A antitestek segítségével (Schenk és mtsai, 1999). A másik stratégia a komplement aktiváció gátlása révén megakadá-lyozni a komplement és a mikroglia aktiváció citotoxikus hatásainak megjelenését. A vakcina stratégia klinikai eredményei óvatosságra intenek, ezért ésszerűnek tűnt a második lehetőség vizsgálata.
A komplement az immunrendszer alapvető eleme, tehát gátlása esetén kiemelkedő szempont a szelektivitás kérdése. A kaszkád aktivációs fázisban történő gátlása kívánatos, hogy a C3 hasítása már ne történjen meg. Irodalmi és saját eredményeink alapján a C1q előnyös molekuláris célpontak látszott az A peptid által kiváltott aktiváció gátlására.A C1q kötés szelektív gátlása esetén az A által kiváltott komplement aktiváció első lépése gátolt. Ebben az esetben valószínűleg nem borul fel az aktiváció-gátlás egyensúlya, tehát nem alakul ki krónikus komplement aktiváció. Ennek következtében nem keletkezik véletlenszerűen membránkárosító komplex az amiloid plakkok környezetében található idegsejteken. Másrészt nem szabadulnak fel C3a és C5a anafilatoxinok, és nem toborzódik mikroglia az amiloid lerakódásokhoz. Mivel a vezérmolekula nem gátolta a C1q kötést antitestekhez, a periférián az IgG és IgM képes aktiválni a komplementrendszert a klasszikus reakcióúton keresztül. A szelektivitási adatok arra is utalnak, hogy a pentraxinok által kiváltott komplement aktiváció sérül. Ez káros lehet az apoptotikus sejtek hatékony és gyors eltávolítására, de kifejezetten előnyös, hogy a szenilis plakkokban megtalálható SAP sem aktiválja a komplement klasszikus útját. A legfontosabb kérdés, hogy hosszútávon a szervezet miként tolerálja a csökkent komplement funkciót.
7.7 Komplement aktiváció gátlása sclerosis multiplex kezelésére
A vezérmolekula szelektivitási adatai megerősítették, hogy a komplement aktiváció a C1q molekulán keresztül szelektíven gátolható. A vegyület hatékonyan gátolta a C1q kötést több nem-immunglobulin aktivátorhoz, többek között MBP-hez is. A találatok csoportosítá-sakor kapott eredményünk (18. ábra) arra utalt, hogy a C1q molekulán az MBP kötőhely valószínűleg átfed a CRP kötőhellyel, tehát az MBP kötőhely is az A14-26 régióban található. Természetesen az eredmények alapján nem zárható ki, hogy a kötésben egy másik, bázikus oldalláncokban gazdag kötőhely vesz részt. Ez felveti annak a lehetőségét, hogy az általunk kifejlesztett C1q inhibítor nemcsak Alzheimer kórban, hanem demielinizációs betegségekben, például sclerosis multiplexben (SM) is alkalmas lehet a gyulladás kialakulásában és a neuron-pusztuláshoz hozzájáruló komplement aktiváció szabályozására. A betegségben az axonok mielin hüvelye sérül, ezáltal nem-immunglobulin C1q aktivátorként ismert molekulák, MBP, mielin oligodendrocita glikoprotein (MOG) kerülhetnek felszínre, amelyek a folyamatosan termelődő C1q révén aktiválják a klasszikus reakcióutat (Vanguri & Shin, 1986; Johns & Bernard, 1997). Az oligodendrociták, a mielinizációért felelős glia sejtek különösen érzéke-nyek a komplement litikus hatásaira (Scolding és mtsai, 1989; Piddlesden & Morgan,1993; Agoropoulou és mtsai, 1998). SM betegek agyában komplement aktivációs fragmentumokat azonosítottak (Spiegel és mtsai, 1998). Fertőzések esetén a komplement terminális szakaszá-nak aktivációja általában előnyös a szervezet számára, de bizonyos betegségekben, különösen autoimmun betegségekben szöveti sérülést okozhat. A membránszerkezet megbontásán túl a szublitikus dózisú membránkárosító komplex toxikus oxigén metabolit és arachidonsav felszabadulást okoz, ami hozzájárulhat a szöveti sérüléshez.
A betegség egyik állatmodelljében, kísérleti úton létrehozott autoimmun encephalomyelitis-ben (EAE) komplement gátlókkal történt kezelés csökkentette az agyban zajló gyulladásos folyamatokat, és megszűntette a mielinvesztést (Piddlesden és mtsai, 1994). Transzgenikus egérben, amelyben asztrociták szolubilis komplement inhibítort termeltek, nem alakult ki EAE, vagy csak enyhe tünetek jelentkeztek (Davoust és mtsai, 1999). Mindezek az eredmé-nyek arra utalnak, hogy a komplementrendszer aktivációja jelentős mértékben hozzájárul az SM-ben történő neuronpusztuláshoz.
Az aktivációt kiváltó anyag valószínűleg a sérült mielin hüvely egyik komponense. Az a tény, hogy B-sejt hiányos transzgenikus egérben is létrehozható EAE (Hjelmström és mtsai, 1998), megerősíti elképzelésünket, hogy nem-immunglobulin C1q aktivátorok felelősek a komple-mentrendszer antitest-független aktivációjáért.
Az SM klinikailag heterogén, a gyulladásos reakció ugyan hasonló, de a mielinvesztés alapján négy jól meghatározott csoport különböztethető meg (Lassman és mtsai, 2001). Az egyik csoport a makrofág közvetített mielinvesztés, amelyben az aktivált makrofág és mikroglia okoz sejtpusztulást. A betegség e típusának in vivo modellezésére általánosan elfogadott az EAE, tehát a fejlesztett vegyületek ebben a modellben vizsgálhatók.
8 A célkitűzések megvalósulása
Kutatásaim a komplement központi idegrendszerben bekövetkező aktivációjának és következményeinek felderítésére irányultak. A célkitűzésekben (4. fejezet, 23. oldal) megfogalmazott kutatási célok az alábbiak szerint valósultak meg:
Ismert, hogy az amiloid -peptid (A) aktiválja a komplement rendszert in vitro. Az aktiváció funkcionális hatásainak vizsgálatára egy in vitro sejtalapú rendszer kidol-gozását tűztük ki. Megállapítottuk, hogy hippokampális sejtek érzékenyek az A által kiváltott komplement aktiváció lítikus hatásaira. Ezt a megfigyelést felhasználva és egy közölt módszer alapján kidolgoztunk egy sejtalapú tesztet, ami alkalmasnak bizonyult arra, hogy az A által indukált komplement aktiváció citotoxikus hatásait kimutassuk (Sárvári és mtsai, 2003).
Az A által kiváltott komplement aktivációhoz irodalmi adatok alapján mind a klasszikus, mind az alternatív út hozzájárul. Nem jelent meg azonban összefoglaló vizsgálat arról, hogy melyik útvonal játsza a főszerepet az aktiváció során. Ezt a kérdést a C1r és C1s proteázokat gátló C1-Inh hatásának vizsgálatával tanulmányoz-tuk. Megállapítottuk, hogy a klasszikus aktivációs út endogén szabályozó molekulája, a C1-Inh védelmet biztosított hippokampális sejtek számára az A-indukálta komplement citotoxikus hatásaival szemben (Sárvári és mtsai, 2003). Eszerint az aktiváció döntően a klasszikus útvonalon keresztül zajlik.
A központi idegrendszerben több sejttípusról is kimutatták, hogy komplement fehérjéket termelnek. A komplement komponensek jelentős részét az agy szöveti makrofágja, a mikroglia termeli. Irodalmi adatokkal összhangban kimutattuk, hogy mikroglia sejtekben konstitutívan kifejeződnek a komplement első komponensének láncait kódoló gének in vitro. Megállapítottuk, hogy a mikroglia felszínén több komplement receptor, C1qR, CR3 és C5aR található. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a mikroglia komplement receptorai révén érzékeli az aktiváció során felszabaduló aktivációs fragmentumokat, és a sejtek az aktivációt kiváltó anyag köré sereglenek. Ebből következik, hogy a komplement aktiváció és a mikroglia sejtek központi szerepet játszanak a központi idegrendszer gyulladásos folyamataiban.
Mára egyetértés alakult ki abban, hogy az A oki szerepet játszik az Alzheimer kór kialakulásában. Tanulmányoztuk, hogy a peptid befolyásolja-e a C1q és a C1-Inh génjeinek átíródását mikroglia sejtekben in vitro. Megállapítottuk, hogy az A koncentráció-függő módon növeli a C1q génjeinek átíródását, míg csökkenti a C1-Inh transzkripcióját (Sárvári és Pázmány, nem közölt eredmény). Ez az eredmény megerősíti azt az elképzelést, hogy az amiloid felszabadulás és lerakódás környezetében aktiválódik a komplementrendszer, ám az aktiváció és szabályozó mechanizmusok egyensúlya felborul és az aktiváció krónikussá válik.
Az aktivációért felelős útvonal és a mikrogliális expresszió ismeretében a komplement első komponensének q alegységét farmakológiai beavatkozásra alkalmas támadáspont-nak választottuk (Sárvári és Pázmány, nem közölt eredmény). Irodalmi és saját eredményeink alapján azt gondoltuk, hogy a C1q A kötőhelyének gátlása révén a komplement aktiváció szelektíven gátolható.
A szakirodalomban kevés komplement inhibítort írtak le, klinikán pedig nincs szelek-tív, kis molekulatömegű komplementgátló. Ezért először egy glikózaminoglikánt, majd egy kereskedelmi úton beszerezhető gyűjtemény vegyületeit tanulmányoztuk a kiválasztott támadáspontú C1q fehérje funkciójára. Megállapítottuk, hogy a kiválasztott glikózaminoglikán és a gyűjtemény néhány (7) vegyülete gátolta a C1q kötést A peptidhez (Urbányi és mtsai, 2005).
A Társaság tulajdonában levő vegyülettár mérete és szerkezeti diverzitása révén alkalmas új kémiai szerkezetek azonosítására. Egy nagy áteresztőképességű módszer beállítása és validálása után szűrtük a vegyülettárat. Optimalizálás után vezérmole-kulát választunk ki (Sárvári és mtsai, 2003)).
A kiválasztott vezérmolekulát hatékonysági és szelektivitási vizsgálatokkal jellemez-tük. Megállapítottuk, hogy a vegyület gátolta a C1q kötést Ab peptidhez és más nem-immunglobulin aktivátorokhoz, de nem gátolta a kötést immunglobulinokhoz (Sárvári és mtsai, 2003). Ezek az eredmények arra utaltak, hogy a C1q amiloid kötőhelyének gátlása révén a komplement klasszikus útjának aktivációja szelektíven befolyásolható.
ESI-MS vizsgálatokkal kizártuk, hogy a vezérmolekula köt az A peptidhez. A kísérlet eredménye megerősítette, hogy a vegyület a C1q amiloid kötőhelyéhez kötve fejti ki hatását (Sárvári és mtsai, 2003).
A vezérmolekula szelektíven gátolta a komplement aktiváció első lépését. In vitro sejtalapú tesztben vizsgáltuk, hogy a molekula felfüggeszti-e a komplement toxikus hatását az idegsejtekre. Megállapítottuk, hogy a vezérmolekula az aktiváció első lépését gátolva megvédte a hippokampális sejteket az A-indukálta komplement aktiváció citotoxikus hatásaival szemben (Sárvári és mtsai, 2003).
9 Saját közlemények
|