Transformatsiya uchun vektorlar - Amaliy mashg’ulot materiallari mashg‘ulot№1 Mavzu: Farmatsevtik biotexnologiya...

|
Amaliy mashg’ulot materiallari mashg‘ulot№1 Mavzu: Farmatsevtik biotexnologiya va uning zamonaviy yo’nalishlari Mashg'ulot shakli
|
bet | 42/107 | Sana | 01.07.2021 | Hajmi | 4,64 Mb. | | #15319 |
3. Transformatsiya uchun vektorlar. Retsipient genomiga begona DNK fragmentlarini kiritish uchun foydalaniladi. Bunday vektorlar odatda genomga integratsiyalanishiga yordam beruvchi maxsus izchilliklar tutadi. Zamonaviy vektor tizimlar polifunksional bo‘lib, bir nechta funksiyani bitta vektorga jamlaydi. Birinchi tabiiy vektorlar bakteriyalardan ajratilgan bo‘lib, ko‘pchiligi tajriba maqsadidan kelib chiqqan xolda (ekspression vektorlar, klonlash uchun vektorlar, transformatsiya uchun vektorlar) gen muxandisligi usullari yordamida qayta yaratilgan.
Vektor molekulalarning tarkibida marker gen bo‘lishi, bu gen hujayrada vektor ishtirok etayotgani xaqida ma’lum qiluvchi fenotip berishi ya’ni vektor selektiv irsiy belgiga ega bo‘lishi kerak. Ko‘pincha selektiv belgi sifatida tabiatda keng tarqalgan antibiotikka chidamlilik genidan foydalaniladi.
E.coli hujayralariga vektor konstruksiyalar transformatsiyasi Tarkibida begona DNK fragmentlari tutuvchi vektor konstruksiyalar E.colining maxsus shtammlari hujayralariga transformatsiya qilish uchun foydalaniladi. Vektor plazmidalarning bakteriyalarga transformatsiyasi hujayralarning DNK molekulalarini qabul qilish qobiliyatiga asoslangan (kompitentligiga). E.coli hujayralariga transformatsiyalash asosan kalsiy shoki yoki elektroporatsiya usullaridan birini qo‘llash orqali amalga oshiriladi. Ikkala xolatda ham bakteriya membranasining DNK molekulalari uchun o‘tkazuvchanligi oshadi.
Vektor molekulasi uchun quyidagi asosiy talablar qo‘yiladi:
1) vektor begona DNK fragmentlarini o‘ziga biriktirishi uchun bir nechta restriktazalar uchun yagona restriksiya saytlari tutishi zarur.
2) vektor replikatsiya boshlanish nuqtasi izchilligini tutishi hisobiga muayyan hujayralarda replikatsiyalanishi shart.
3) vektor marker gen izchilligini tutishi zarur. Bu genlar vektor konstruksiyani tutuvchi hujayralar seleksiyasini engillashtiradi.
Bakteriya plazmidalaridan klonlashda foydalanish. Bakteriya hujayrasida xromosoma DNKsidan tashqari, ko‘p nusxada xalqasimon DNK molekulalari ham mavjud. (1-25 m.n.j.). Bunday xalqasimon molekulalar plazmidalar deb ataladi. Ba’zi plazmidalar tarkibida antibiotikga chidamlilik genlarini tutadi.
Plazmidalardan vektor sifatida birinchi marta 1973 yilda P.Berg laboratoriyasida foydalanilgan. Tajribalar uncha katta bo‘lmagan (~9 m.n.j.), tetratsiklinga chidamlilik geni tutuvchi E.coli plazmidasi pSC 101 da olib borilgan. Plazmida tarkibida faqat bir dona EcoRI restriktaza fermenti tanib kesadigan sayt (maxsus nukleotidlar izchilligi) bo‘lganligi sababli, ferment plazmidaning xalqasimon qo‘sh zanjirini faqat bir joyidan kesib «yopishqoq» uchli ochiq xalqa xolatiga o‘tkazadi.
DNK fragment-larini plazmidalar yordamida klonlash bo‘yicha tajriba sxemasi.
1-Biriktirilayotgan getero-logik DNK; 2-antibiotikka chidamlilik bo‘yicha marker; 3-DNKning rekombinant molekulasi; 4-Rekombinant DNKni bakteriya hujayrasiga kiritish.
Plazmida pSC 101ning DNKsi ichak tayoqchasi uchun begona DNKning EcoRI–fragmentlari bilan aralashtiriladi. DNK-ligaza fermentlari yordamida begona DNK fragmentlari va pSC 101 plazmida yagona rekombinant molekulaga birlashtiriladi. So‘ngra bu rekombinant plazmidani E.colining kompitent hujayralariga qo‘shilganda u bakteriya hujayrasiga kiradi. Rekombinant plazmidani tutuvchi hujayralar tetratsiklinli selektiv muhitda ajratiladi.
|
|
Bosh sahifa
Aloqalar
Bosh sahifa
Amaliy mashg’ulot materiallari mashg‘ulot№1 Mavzu: Farmatsevtik biotexnologiya va uning zamonaviy yo’nalishlari Mashg'ulot shakli
|