Методика: использован метод гибридизации на олигонуклеотидном биочипе

Реферат

Отчет 51 с., 15 рис., 10 табл, 31 источник

Ключевые слова: генетический полиморфизм, биочипы, фармакогенетика, артериальная гипертензия, мутация, медицинская генетика.

Цель работы: разработка и апробация тест-систем на основе биочипов для изучения генетической предрасположенности к развитию наиболее частых мультифакториальных заболеваний (онкологических и сердечно-сосудистых). 

Объект исследования: образцы ДНК базы данных Лаборатории пренатальной диагностики ГУ НИИ АГ им.Д.О.Отта РАМН.

Методика: использован метод гибридизации на олигонуклеотидном биочипе

Результаты работы: в настоящее время созданы биочипы для диагностики генетической предрасположенности к онкологическим и сердечно-сосудистым заболеваниям. Биочипы для диагностики генетической предрасположенности к онкологическим заболеваниям является диагностической тест-системой, позволяющей выявлять как генетическую предрасположенность к мультифакториальным заболеваниям (в подавляющем большинстве, онкологическим), так и определять индивидуальную чувствительность к фармацевтическим препаратам. Во многом такая особенность биочипа обусловлена особенностями его конструирования и выбором определенных локусов для анализа. Мы руководствовались следующими принципами при выборе полиморфных локусов: в исследование вошли  гены, преимущественно участвующие, как в регулировании метаболизма лекарств, так и в определении генетической предрасположенности к различным мультифакториальным заболеваниям. В этих генах выбирали  функционально значимые аллели, встречающиеся с наибольшей частотой. Включали только те гены, полиморфизм которых характерен и уже предварительно изучен в российской популяции. Микрочип устроен по блочному принципу. Каждый блок предназначен для детекции мутаций в группе генов, предрасполагающих к тому или иному заболеванию или имеющих близкие функции. Поэтому, в зависимости от задачи, исследователь может комбинировать блоками при конструировании диагностического биочипа для анализа конкретного заболевания, а также менять число блоков и состав генов внутри блока. Такая особенность осуществима, благодаря универсальности подхода при подборе праймеров и выборе условий проведения мультиплексных ПЦР. В блок №1 входят гены CYP1A1 и CYP2D6. В гене  CYP1A1 с помощью чипа можно анализировать мутации С4887А, A4889G и T6235C. Детекция данных мутаций позволяет выявить 4-аллеля этого гена: “дикий тип”, “2A”, “2B” и “4”. В гене  CYP2D6 можно выявлять мутации G1934A и DelA2637. Их определение позволяет сделать вывод о наличии у индивидуума аллелей “*4” и “*3”. В блок №2 входят гены GSTT1 и GSTM1. Внутри этих генов  с помощью чипа можно анализировать протяженные делеции. Детекция данных мутаций позволяет выявлять так называемые “нулевые” аллели этого гена (гомозигот по делеции), а также определять образцы, в которых есть хотя бы одна копия гена (гетерозиготы по делеции и гомозиготы “дикиго типа. В блок №3 входят гены NAT2 и MTHFR. В гене NAT2 с помощью чипа можно анализировать мутации 481C>T, 590G>A и 857G>A. Детекция данных мутаций позволяет выявить 4-аллеля этого гена: “дикий тип”, “ S1”, “ S2” и “ S3”. В гене  MTHFR можно анализировать мутацию С677Т. В блок №4 входят гены CYP2C9 и CYP2C19. В гене  CYP2C9 с помощью чипа можно анализировать мутации С430T и C61075T. Детекция данных мутаций позволяет выявить 3-аллеля этого гена: “дикий тип”, “*2” и “ *3”. В гене  CYP2C19 можно анализировать мутацию G681A, что позволяет определять “дикий тип” и “*2” аллель этого гена. Таким образом, “Фармаген-биочип” позволяет анализировать 14 мутаций в 8 генах. Кроме того, используя гибридизацию на гелевом микрочипе, мы можем с одинаковой эффективностью определять как однонуклеотидные замены, так и микро и макро делеции (в данном случае используется один раунд мультиплексной ПЦР), а также выявлять близкорасположенные мутации. Микрочип был протестирован на 30 контрольных и более 100 клинических образцах. Результаты тестирования контрольных образцов (идентификация мутаций в них была подтверждена другими методами – ПДРФ, секвенирование и другие) показали полное совпадение. Анализ клинических образцов выявил 2 расхождения из 715 проанализированных мутаций. Таким образом, точность метода составила 99,7%. 

Биочип, для анализа генетической предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям, устроен аналогично. В блок №1 входят гены REN, AGT, AGTR1, AGTR2. В гене REN с помощью чипа можно анализировать мутацию I9-83G/A, в гене AGT - M235T, в гене  AGTR1 - A1166C, в гене AGTR2 - C3123A. В блок №2 входят гены BKR2, ADRB2 и MTHFR. В гене BKR2 с помощью чипа можно анализировать мутацию -T58C, в гене ADRB2 - A48G и C81G, в гене MTHFR - С677Т. Таким образом, “Кардио-биочип” позволяет анализировать 8 мутаций в 7 генах. Микрочип был протестирован на 20 контрольных и более 50 клинических образцах. Результаты тестирования контрольных образцов (идентификация мутаций в них была подтверждена другими методами – ПДРФ, секвенирование и другие) показали полное совпадение. Анализ клинических образцов выявил 1 расхождения из 400 проанализированных мутаций. Таким образом, точность метода составила 99,8%.



Основные конструктивные, технологические и технико-эксплуатационные характеристики: биочип обладает определенной специфичностью и чувствительностью: 1. Специфичность. Биочип должен специфично определять генетические изменения (полиморфизм) в исследуемом образце крови или слюны. В качестве основных параметров выступают характеристики сравнения интенсивности флуоресценции дискриминирующих олигонуклеотидов. 2. Чувствительность. Биочип должен выявлять указанные генетические изменения при наличии не менее 10 000 геном-эквивалентов (молекул ДНК) в 1 мл крови или в 1 мл слюны.

Экономическая эффективность или значимость работы: результатом проекта является создание принципиально новой продукции (материалов, образцов, технологий и др.). Рыночная привлекательность продукта проекта заключается в том, что появляется возможность в кратчайшие, приемлемые для практической медицины, сроки выявлять текущее состояние исследуемых в ходе диагностики образцов и принимать оперативные меры в интересах нейтрализации потенциального негативного воздействия. Наиболее важными достоинствами продукта проекта, в первую очередь интересующих потребителей, является высокая чувствительность диагностики, малые сроки ее проведения, относительная дешевизна, как процесса диагностики, так и используемых оборудования и материалов, простота освоения технологии средним медперсоналом.