Морфологічна характеристика впливу магнітного поля та лазерного опромінення на регенерацію периферійного нерва

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені О.О. БОГОМОЛЬЦЯ





Раскалєй Дмитро Володимирович

УДК:616.833-089.85-003.93-018:[615.847.8+615.849.19



МОРФОЛОГІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ВПЛИВУ МАГНІТНОГО ПОЛЯ ТА ЛАЗЕРНОГО ОПРОМІНЕННЯ НА РЕГЕНЕРАЦІЮ ПЕРИФЕРІЙНОГО НЕРВА



14.03.09 – гістологія, цитологія, ембріологія



АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

























Київ 2008


Дисертацією є рукопис.



Робота виконана в Національному медичному університеті імені 

О.О. Богомольця МОЗ України.

Науковий керівник

член-кореспондент АМН України,

доктор медичних наук, професор

Чайковський Юрій Богданович,

Національний медичний університет

імені О.О. Богомольця, завідувач 

кафедри гістології та ембріології

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Квітницька-Рижова Тетяна Юріївна, Інститут геронтології АМН України, завідувач лабораторії морфології і цитології; 

доктор медичних наук, професор Геращенко Сергій Борисович, Івано-Франківський державний медичний університет, завідувач кафедри гістології, цитології та ембріології. 

Захист відбудеться 03.04.2008 р. о _13-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.06 у Національному медичному університеті імені О.О. Богомольця (03057, м. Київ, пр-т Перемоги,34 ).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету імені О.О. Богомольця МОЗ України (03057, м. Київ, вул. Зоологічна,1 ).

Автореферат розісланий 03.03.2008 р.

Вчений секретар 

спеціалізованої вченої ради Д 26.003.06

доктор медичних наук, професор			Грабовий О.М.


ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ



Актуальність теми. Пошуки засобів та методів лікувального впливу на процеси, які відбуваються у травмованих нервах, з метою стимуляції їх відновлення, залишаються однією з актуальних задач неврології та нейрохірургії. У структурі патології периферійної нервової системи значну частину (70 – 75%) становить пошкодження нервових стовбурів кінцівок [Корлетяну М. А.,1973]. Це призводить до тяжких порушень рухової функції, часто зі стійкою втратою працездатності та інвалідністю [Лаврентьев Б. И., 1944]. На жаль, серед пацієнтів переважають люди до 45 років (85,9%), а середній вік становить 31,2 року [Лаврентьев Б. И., 1961]. У зв’язку з багатогранністю клінічних проявів, наявністю ряду ускладнень (больових синдромів, рухових та трофічних порушень, контрактур і т.д.) лікування пошкоджень периферійних нервів не завжди ефективне і залишається складною задачею [Акимов Г.А., 1983; Гейниц А.В., 2001; Лисайчук Ю.С., 1998]. 

Відомо, що за тривалої відсутності зв’язків нервових закінчень з відповідними мотонейронами виникає атрофія м’язів з наступним їх заміщенням жировою тканиною. Це потребує відповідної корекції, тобто, реінервації м’язових волокон [Мульдияров Т.Т., 1983; Ромоданов А.П., 1978; Ansselin A.D., 1997; Cajal R.G., 1928; Pleasure D., 1974]. На результатах відновлення нервових стовбурів позначаються також розміри дефектів периферійних нервів.

Актуальною проблемою сучасної медицини залишаються нейротканинні взаємовідношення, оскільки їх вивчення має як теоретичне значення, зумовлене участю нервової системи в підтримці морфофункціональної організації тканини, так і клінічне, обумовлене тим, що результат відновлювальних операцій багато в чому залежить від характеру невротизації пошкоджених тканин [Морозов В. В., 1976; Ромоданов А.П., 1978, Barker A.T., 1985, Chelyshev Yu.A., 1995; Day B.L., 1987].

На сьогодні для лікування травм периферійних нервів використовуються оперативні втручання та консервативна терапія, до якої входить лікувальна фізкультура, масаж, електролікування, вібро- та магнітотерапія, різні фармакотерапевтичні засоби [Александровская А.В., 1980; Грабовий О. М., 1994; Старченко И. И., 1999; Чайковський Ю.Б., 2000, Челышев Ю. А., 1995]. При цьому лікування, як правило, проводиться комплексами, а ефективність залежить від їх складу [Грабовий О.М., 2000, Корлетяну М. А., 1973]. Однак, індивідуальні особливості розвитку патологічних реакцій, підвищена у цілому ряді випадків чутливість хворих до фізичних факторів суттєво обмежують використання існуючих методів [Антронова М. И., 1970, Зайцев Р. З., 1976, Самохвалов В.И., 1985, Стрелис Л.П., 1989].

Для стимуляції регенераторних процесів у пошкодженому периферійному нерві після його зшивання використовуються фармакологічні засоби та фізіотерапевтичні методи, які мають переважно протизапальну дію [Цымбалюк В.И., 1998]. І, практично, не застосовуються препарати та методи, які б впливали на стан регенеруючих нервових волокон у периферійному відрізку нерва, зокрема специфічно на процес мієлінізації, який є важливою складовою відновлювального процесу, оскільки довжина периферійного відрізка нерідко сягає десятків сантиметрів.

Спроби впливати на відновлення пошкоджених нервів були спрямовані на нервові центри та ділянку пошкодження [Челышев Ю. А., 1995], на зміни у сполучній тканині [Чайковский Ю.Б., 1999], а вивчення дії фізіотерапевтичних методів на дистальні відрізки пошкодженого нерва, зокрема, на процес мієлінізації новоутворених нервових волокон практично не проводилось.

Відомо також, що лазерне випромінення та магнітне поле досить ефективно впливають на відновлення пошкодженого нерва. Але ми не знайшли в літературних джерелах даних про поєднану дію низькоінтенсивного лазерного випромінення (НІЛВ) та магнітного поля (МП) на процеси регенерації пошкодженого нерва.

Враховуючи вищесказане, розробка нових підходів лікування даного контингенту хворих, основаних на оптимізації режимів і методів, які можуть використовуватись, є актуальною задачею. В останні роки з’явились роботи, автори яких використовують поєднану дію лазерного випромінення та магнітного поля в експерименті та клініці для лікування нейропатій лицевого нерва, дистрофії сітківки, хронічних гастродуоденітів, кардіальної патології, туберкульозу легень, ішемічного інсульту [Будкарь Л.Н., 1996, Верещагина В.В., 2005, Гнатюк М.С., 2005, Лапшин В.Ф., 2005, Самосюк Н.І., 2004].

Показано, що магнітолазеротерапія (МЛТ) викликає знеболюючу, трофічну, протизапальну дію [Бриль Г.Е., 2005, Денисенко О.И., 2005], покращує крово- та лімфообіг [Бриль Г.Е., 2005], позитивно діє на центральну і периферійну нервову систему [Дубенко Е.Г., 2005].

Разом з тим, у зазначених роботах не проводилось вивчення впливу різних спектрів лазерного випромінення та різних частот модуляції, що викликає значний інтерес у зв’язку з необхідністю визначення максимального терапевтичного ефекту.

Таким чином, усі вище наведені факти дають підстави сподіватись, що отримані результати експериментального дослідження можуть стати передумовою для використання МЛТ у комплексному лікуванні пошкоджених нервів; мають важливе теоретичне та практичне значення і є актуальними в даний час.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є індивідуальним фрагментом планової науково-дослідної роботи кафедри гістології та ембріології Національного медичного університету імені О.О. Богомольця МОЗ України “Вивчити морфологічні зміни нервової системи за умов дії фізичних та хімічних чинників та можливості їх корекції ” 2004– 2009 рр., № державної реєстрації 0106U002345.

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи було встановлення особливостей відновлення та підвищення ефективності регенерації нервового стовбура за умов впливу на нього спільної дії магнітного поля та лазерного опромінення у різні терміни після пошкодження. Для досягнення поставленої мети було визначено вирішення наступних задач:

Вивчити в експерименті вплив частотно-модульованого магнітного поля та оптичного потоку в червоному діапазоні спектра при частоті модуляції 9,4 Гц на регенерацію периферійного нерва.

Вивчити в експерименті вплив частотно-модульованого магнітного поля та оптичного потоку в червоному діапазоні спектра при частоті модуляції 37,5 Гц на регенерацію периферійного нерва.

Вивчити в експерименті вплив частотно-модульованого магнітного поля та оптичного потоку в інфрачервоному діапазоні спектра при частоті модуляції 9,4 Гц на регенерацію периферійного нерва. 

Вивчити в експерименті вплив частотно-модульованого магнітного поля та оптичного потоку в інфрачервоному діапазоні спектра при частоті модуляції 37,5 Гц на регенерацію периферійного нерва. 

На основі отриманих результатів розробити рекомендації для використання впливу магнітного поля та лазерного опромінення на регенерацію периферійного нерва.

	Об’єкт дослідження. Об’єктом даного дослідження були морфологічні зміни у сідничому нерві після його травматичного пошкодження, наступного зшивання та частотно-модульованої магнітолазеротерапії (ЧМ МЛТ).

Предмет дослідження. Предметом дослідження був сідничий нерв після невротомії з наступним зшиванням через 3, 6 та 12 тижнів після операції без використання та з використанням магнітолазеротерапії.

Методи дослідження. Для об’єктивного вивчення показників було використано комплекс методів, які дозволили вивчити реактивні властивості сідничого нерва у процесі його регенерації: загальногістологічні, нейрогістологічні, електронномікроскопічне та морфометричні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Дістало подальшого розвитку комплексне вивчення основних змін у пошкодженому нерві у процесі його регенерації.

Уперше проведено детальний аналіз стану нервових волокон, що проростають у периферійний відрізок нервового стовбуру та їх мієлінізацію під впливом частотно-модульованої мангітолазеротерапії у червоному та інфрачервоному спектрі. Отримані дані дозволили з’ясувати закономірності процесів регенерації та мієлінізації нервових волокон залежно від терміну оперативного втручання і впливу частотно-модульованої магнітолазеротерапії та провести кореляцію між змінами в проксимальному та дистальному відрізках пошкодженого нерва.

Встановлено, що дія магнітолазеротерапії в інфрачервоному спектрі з частотою модуляції 37,5 Гц є найбільш ефективною.

Отримані результати дають змогу створити умови удосконалення методики лікування травм нервових стовбурів у людей, а також надати теоретичне обґрунтування для розробки рекомендацій щодо вибору реабілітаційних засобів.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані є передумовою для розробки в клінічній практиці способів покращення процесів відновлення периферійних нервів після їх пошкодження.

Матеріали представленого експериментального дослідження можуть бути впроваджені у педагогічний процес з метою розширення уявлень студентів про властивості нервової системи, реактивні та репаративні процеси в ній. Результати можна використовувати на кафедрах нормальної та патологічної анатомії, гістології та ембріології, нейрохірургії, травматології та ортопедії, нервових хвороб та нейрореабілітації.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є закінченою науково-дослідною роботою. Автором самостійно виконано аналіз наукової літератури за темою дисертації, проведено патентно-інформаційний пошук, у тому числі, за допомогою електронних баз даних. Розроблено теоретичні та практичні положення роботи, методологію експерименту згідно поставлених задач. Автором особисто проводились виконання експерименту, макро-, мікроскопічні та морфометричні дослідження. Здобувачем самостійно проведена первинна статистична обробка отриманих даних, виконана фотодокументація. Усі розділи дисертаційної роботи написані автором особисто.

Апробація результатів дисертації. Основні положення наукових досліджень за темою дисертації були представлені на: 13-му Щорічному міжнародному конгресі студентів та молодих вчених медичного університету Ain Shams (Каїр, 2005); Міжнародній конференції викладачів, лікарів, молодих вчених та студентів “Актуальні питання експериментальної медицини” (Суми, 2006); Науково-практичній конференції з міжнародною участю “Морфологічний стан тканин і органів у нормі та при моделюванні патологічних процесів” (Тернопіль, 2006); Всеукраїнській науково-практичній конференції “Сучасні проблеми морфології”, присвяченої 70-річчю з дня народження Заслуженого діяча науки і техніки України д.мед.н. професора Миколи Сергійовича Скрипнікова” (Полтава, 2006); IV Національному конгресі АГЕТ України (Сімферополь-Алушта, 2006); на кафедрі гістології та ембріології Національного медичного університету імені О.О. Богомольця (19.06.07, протокол №23) та на засіданні апробаційної Вченої ради “Морфологія” НМУ імені О.О. Богомольця (21.09.07, протокол №2).

Публікації. За результатами дисертації опубліковані 8 наукових робіт (1 - одноосібна), в тому числі 4 статті у наукових фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, отримано Патент України та рішення про видачу Патенту України.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 134 сторінках (основного тексту – 103 сторінки) і складається зі вступу, огляду літератури, методів дослідження, розділу власних досліджень, аналізу одержаних результатів, висновків, списку використаних джерел. Роботу проілюстровано 51 рисунком та 2 таблицями. Список літератури містить 277 джерел, з них 207 вітчизняних та 70 зарубіжних авторів. 


ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ



Матеріали та методи дослідження. Експериментальні спостереження були проведені на 87 білих щурах вагою 150 – 200 г віком 4 – 5 місяців. Згідно поставлених завдань, тварини були розподілені на 5 груп.

Перша група – тварини, яким було проведено операцію з моделювання стандартної травми периферійного нерва (15 щурів).

Друга група – 18 щурів, яким виконували операцію з моделювання стандартної травми периферійного нерва та проводили частотно модульовану магнітолазеротерапію у червоному спектрі з частотою модуляції 9,4 Гц.

Третя група включала 18 щурів, яким виконували операцію з моделювання стандартної травми периферійного нерва та проводили частотно модульовану магнітолазеротерапію у червоному спектрі з частотою модуляції 37,5 Гц.

Четверта група – 18 щурів, яким виконували операцію з моделювання стандартної травми периферійного нерва та проводили частотно модульовану магнітолазеротерапію в інфрачервоному спектрі з частотою модуляції 9,4 Гц.

П’ята група включала 18 щурів, яким виконували операцію з моделювання стандартної травми периферійного нерва та проводили частотно модульовану магнітолазеротерапію у інфрачервоному спектрі з частотою модуляції 37,5 Гц.

Операція з моделювання стандартної травми периферійного нерва полягала у наступному: втручання проводили під тіопенталовим наркозом, який вводили інтраперитонеально в дозі 5 мг сухої речовини на 100г маси тварини (препарат розводили в ізотонічному розчині хлориду натрію). Оперативне втручання проводили в асептичних умовах за допомогою мікрохірургічного інструментарію під оптичним збільшенням 8Х. Доступ до сідничого нерва виконувався на межі середньої та верхньої третини стегна за його проекційною лінією. Після обробки операційного поля розтинались м’які тканини, а потім за допомогою затискача виділяли сідничий нерв. Останній пересікався лезом безпечної бритви у вищезгаданій ділянці на межі верхньої та середньої третини стегна. Відрізки нерва співставляли на відстані 2-3 мм, а потім накладали епіневральні шви у кількості 2-3 атравматичною голкою з монофіламентною поліамідною ниткою 10/0 фірми Ethicon. Після проведення гемостазу рану ретельно зашивали, і дослідні тварини отримували однакове харчування згідно норм віварію та знаходились в однакових умовах.

Друга, третя, четверта і п’ята групи тварин підлягали аналогічній операції, після чого на наступний день їм проводилась черезшкірна частотно модульована магнітолазеротерапія на ділянку пошкодженого нерва в різних світлових спектрах та з різною частотою модуляції протягом 10 діб. З цією метою використовувався серійний прилад „МІТ-11” вітчизняного виробництва фірми НМЦ „Медінтех”. Цей апарат має свідоцтво про державну реєстрацію Державного департаменту з контролю за якістю, безпекою та виробництвом лікарських засобів і виробів медичного призначення МОЗ України за № UA 1.003.0098031-05, виданий Державним комітетом України з питань технічного регулювання та споживчої політики. Особливістю цього приладу є те, що його магнітні індуктори поєднані з лазерним випромінювачем в одному терміналі. Це дозволяє одночасно впливати магнітним полем (МП) і лазерним випроміненням (ЛВ) на необхідну ділянку. 

Параметри, що передбачені в конструкції приладу:

напруга МП – до 100 мТл;

потужність ЛВ – до 100 мВт;

довжина хвилі ЛВ :

		- 0,67 мкм (червоний діапазон);

		- 0,78 мкм (інфрачервоний діапазон);

	- частота модуляції МП і ЛВ – від 1 до 100 Гц.

Необхідна доза для проведення 1 сеансу МЛТ розраховувалась з відомою формулою : t = (ES / P) K,

де t- час впливу, с; E- необхідна енергія для опромінення зони, Дж/см2; S- площа зони впливу, см2; Р- потужність лазерного випромінення, Вт; К- коефіцієнт віддзеркалення. Відповідно для ЛВ у червоному діапазоні спектра вона становила 4 хв., у інфрачервоному- 2хв. МЛТ проводилась на ділянку пошкодження нерва та проксимальний і дистальний його відрізки. Тваринам контрольної групи після пересічення і зшивання нерва МЛТ не проводилось.

Післяопераційні рани усіх тварин загоїлись первинним натягом. Летальних випадків тварин не було.

Тварин виводили з експерименту через 3, 6 та 12 тижнів за допомогою передозування препарату Тіопентал (25мг/100г) при інтраперитонеальному введенні та давали летальну дозу ефіру. Евтаназію експериментальних та контрольних тварин виконували згідно міжнародних нормативів гуманного ставлення до тварин [Добровольский Г.А., 1984; Западнюк И.П., 1983; Методические рекомендации по представлению документации на лекарственные средства ФК Минздрава Украины, 1993].

Розроблена методика ЧМ МЛТ передбачала:

		черезшкірний вплив на відрізки пошкодженого нерва та на місце їх зшивання МП та ЛВ у червоному спектрі з частотою модуляції 9,4 Гц та 37,5 Гц (МП до 30 мТЛ, ЛВ – до 50 мВт, л=0,67 мкм – частота блокування кальцієвих каналів); 

-	черезшкірний вплив на відрізки пошкодженого нерва та на місце їх зшивання МП та ЛВ в інфрачервоному спектрі з частотою модуляції 9,4 Гц та 37,5 Гц (МП – до 30 мТл, ЛВ – до 50 мВт, л – 0,78 мкм).

	Матеріалом для дослідження були невроми, центральні (проксимальні) та периферійні (дистальні) відрізки пошкодженого нерва. Для світлової мікроскопії матеріал фіксували у 10% розчині формаліну, промивали та отримували зрізи на заморожувальному мікротомі, які імпрегнували азотнокислим сріблом за Рассказовою. Для вивчення сполучної тканини препарати забарвлювали азур II - еозином. Для морфометричного аналізу використовували напівтонкі поперечні зрізи нервів, виготовлені на ультратомі LKB і забарвлені толуїдиновим синім.

У даному дослідженні визначали такі величини: об’єм волокон в об’ємі нерва (%), кількість нервових волокон в одиниці об’єму нерва, (мкм3), площу поперечного зрізу нервового волокна (мкм2), площу поперечного зрізу осьового циліндру (мкм2), товщину мієлінової оболонки (мкм2).

При статистичному аналізі морфометричних даних обчислювали середні значення величин, середнє квадратичне відхилення, похибку середньої, коефіцієнт варіації, коефіцієнт точності визначення середньої і відповідності до рекомендацій, які містяться у підручниках з математичної статистики [Лакин Г.Ф., 1973; Урбах В.Ю., 1964]. З метою оцінки співвідношення трьох типів мієлінових нервових волокон (за розміром), використовували непараметричний критерій Колмогорова-Смірнова. Для виявлення зв’язків у змінах площ поперечних зрізів мієлінового нервового волокна, осьового циліндру та мієлінової оболонки використовували кореляційний аналіз. Препарати тонких і напівтонких зрізів фотографували за допомогою цифрової фотокамери “Олімпус”.

Для електронномікроскопічного дослідження невеликі фрагменти дистальних відрізків нерва фіксували в 1%-му розчині чотирьохокису осмію за Колфілдом протягом 2-х годин при температурі +4°С. Об’єкти зневоднювали в етанолі зростаючих концентрацій, в ацетоні і заливали в суміш епону з аралдитом за загальноприйнятою методикою [Бирюзова В.И.,1963; Карупу В.Я., 1984]. Ультратонкі зрізи одержували на ультратомі LKB-8800 (Швеція) у поздовжній та поперечній проекціях нерва. Контрастували їх у 2%-му розчині уранілацетату в 70%-му етанолі протягом 15 хвилин і азотнокислим свинцем стільки ж часу, а потім зрізи вивчали та фотографували в електронному мікроскопі ЭМВ 125К.

Результати досліджень та їх обговорення. Передумовою цього дисертаційного дослідження були пошуки нових засобів та методів лікувального впливу на процеси, які відбуваються у пошкоджених нервах, з метою стимуляції їх відновлення, що наразі є однією з актуальних задач неврології та нейрохірургії. Інше, що спонукало нас на проведення даного дослідження, була відсутність інформації про вплив МЛТ на регенерацію пошкоджених нервів та наявність нових теоретичних розробок щодо дії МП і НІЛВ на біологічні об’єкти.

З’явились фундаментальні наукові праці, які пояснюють взаємодію слабких МП з біологічними системами і доводять можливість впливу МП на структурні елементи атому (електрони, нуклони), мембрани живих клітин зі зміною їх проникності для найважливіших іонів (Na+, Ca2+, K+). В основі цієї взаємодії лежить принцип резонансу, тобто, при відповідній частоті зовнішнього МП можливий активний вплив на атоми, іони тощо. Прикладом “резонансної взаємодії” фізичних факторів і деяких структур біологічного об’єкту є магніторезонансна томографія (МРТ) – одна з найбільш інформативних діагностичних систем.

Таким чином, вище наведені дані стали підставою для проведення експериментальних досліджень застосування ЧМ МЛТ при пошкодженні периферійних нервів з метою визначення параметрів МЛТ, які б давали найкращі результати.

Використовуючи МЛТ з метою стимуляції регенерації пошкодженого нерва, ми звертали увагу на процеси, які відбуваються у центральному відрізку, регенераційній невромі та дистальному відрізку. Особливо цікавим було те, як впливає МЛТ на процеси дегенерації, оскільки вчення про дегенерацію нервового волокна, відокремленого від свого трофічного центру – тіла нейрона, сформувалось ще у 1850р. завдяки класичним роботам A. Waller, який описав патологоморфологічну картину дегенерації периферійного відрізка нерва.

Через 3 тижні після операції та проведення МЛТ у проксимальних відділах пошкоджених нервів в усіх експериментальних групах спостерігаються ретроградні дегенеративні зміни та помірні прояви подразнення нервових волокон. Епіневрій потовщений, щільність капілярів у ньому збільшена, венули дещо розширені та переповнені кров’ю. Нервові волокна мають деякі нерівності контурів, зустрічаються місця, де вони гіпо- чи гіперімпрегновані. Ступінь вираженості цих змін у 5 групі тварин значно менший, ніж у тварин інших експериментальних груп. Крім того, звертає на себе увагу поява у проксимальному відрізку нерва тварин 5 групи більшої кількості тоненьких регенеруючих волокон і зменшення загальної інфільтрації.

Регенераційна неврома у цей термін дослідження містить малодиференційовану сполучну тканину з великою кількістю фібробластів, макрофагів та тучних клітин. Колагенові волокна сполучної тканини помірно потовщені, а сама сполучна тканина виглядає більш однорідною. Рідше зустрічаються мало- та безсудинні зони. Звертає на себе увагу збільшення кількості регенеруючих нервових волокон. Затримані колби росту та спіралі Перрончіто спостерігаються відносно рідко. Визначається рівномірність кровопостачання невроми і більш упорядковане розташування нервових волокон, переважна більшість яких розміщується вздовж осі нерва. 

У периферійному відрізку нерва через 3 тижні відмічається наявність овоїдів менших розмірів, що, на нашу думку, свідчить про більш швидкий перебіг процесів дегенерації. Виявляється проліферація нейрофіламентів і формування бюнгнерівських стрічок. Дані процеси співпадають з описаними в літературі. Нечисленні регенеруючі нервові волокна, кількість яких у тварин 5 групи є значно більшою, ідуть з центрального відрізку нерва у периферійний переважно прямолінійно. За рахунок збільшення кількості та гіпертрофії нейролемоцитів збільшується діаметр бюнгнерівських стрічок.

Через 6 тижнів після операції та проведення МЛТ у проксимальному відрізку нерва відмічається більше клітинних елементів у сполучнотканинних структурах, що, на нашу думку, пов’язане зі стимуляцією їх проліферації МЛТ. Значно менша кількість аргірофільних включень у цитоплазмі нейролемоцитів свідчить про зменшення кількості продуктів деструкції передіснуючих нервових волокон. Безпосередньо біля місця травми можна спостерігати слабко виражені явища подразнення нервових волокон та поодинокі розширені інтраневральні судини.

У ділянці регенераційної невроми, у цей час, сполучна тканина більш зріла, і в ній міститься велика кількість колагенових волокон і небагато фібробластів макрофагів та тучних клітин. Через ділянку рубця проходять численні новоутворені нервові волокна, кількість яких у 5 експериментальній групі найбільша. Переважна більшість волокон направлена вздовж осі нерва і тільки деякі з них втрачають поздовжню орієнтацію і прямують до периферійних відділів невроми. Кількість спіралей Перрончіто тут значно зменшується, але збільшується кількість аксонів з колбами росту. Відмічається збільшення діаметру регенеруючих нервових волокон.

У периферійному відрізку нерва виявляється збільшення діаметру бюнгнерівських стрічок. Продуктів деструкції передіснуючих нервових волокон практично не відмічається. Регенеруючі нервові волокна, кількість яких значно збільшується, особливо у тварин 5 групи, розміщується за ходом тяжів нейролемоцитів, які сформувались у периферійному відрізку нерва.

Через 12 тижнів після початку експерименту у проксимальному відрізку нерва тварин 2, 3, 4 та 5 груп спостерігаються морфологічні особливості будови, близькі до таких, які описані іншими дослідниками у сідничому нерві інтактних тварин. Звертає на себе увагу дещо більша кількість фібробластів та тканинних базофілів у ендоневрії та деяке потовщення останнього. За рахунок збільшення діаметру осьових циліндрів нервові волокна потовщуються, а кількість нейролемоцитів у них збільшується.

При аналізі даних, отриманих при дослідженні експериментального матеріалу у 2, 3, 4 та 5 групах тварин, з’ясувалось, що під впливом МЛТ у різних діапазонах та з різною частотою модуляції у процесах відновлення пошкодженого нерва відбуваються майже однакові позитивні зрушення, у порівнянні з 1 групою тварин. Але, слід зазначити, що дія МЛТ в інфрачервоному спектрі з частотою модуляції 37,5 Гц є найкращою.

Таким чином, у тварин усіх експериментальних груп темпи дегенерації передіснуючих нервових волокон на ранніх стадіях відновлення пошкодженого нерва практично однакові. Але на більш пізніх термінах вони значно прискорюються, і особливо це проявляється у тварин 5 групи.

Кількісний аналіз структурної перебудови тканинних елементів, їх композиції та зв’язків, що відображено на рисунках 1, 2, 3, 4, 5, дає переконливий матеріал для побудови системи доказів характеру морфологічних змін і пов’язаного з ними характеру функціональних процесів. 

Морфометричні підходи обумовлюють стандартизацію методів відбору типів їх обробки, математичного аналізу вимірювань. Крім того, отримані кількісні показники дають змогу порівнювати їх з даними літератури та екстраполювати результати на інші моделі дослідів та на людину, а також суттєво доповнюють морфологічну та електронномікроскопічну картини.

		Невротизація периферійного відрізку пошкодженого нерва та мієлінізація новоутворених нервових волокон не завжди відбуваються задовільно і не завжди приводять до відновлення втраченої функції, що залежить від багатьох причин.















Рис. 1. Графік змін стереологічних показників дистального відрізку сідничого нерва контрольної групи тварин. По осі абсцис – терміни досліджень, по осі ординат – середні величини показників.












Рис. 2. Графік змін стереологічних показників дистального відрізку сідничого нерва за умови спільної дії магнітного поля та лазерного випромінення у червоному спектрі з частотою модуляції 9,4 Гц. По осі абсцис – терміни досліджень, по осі ординат – середні величини показників.















Рис. 3. Графік змін стереологічних показників дистального відрізку сідничого нерва за умови спільної дії магнітного поля та лазерного випромінення у червоному спектрі з частотою модуляції 37,5 Гц. По осі абсцис – терміни досліджень, по осі ординат – середні величини показників.













Рис.4. Графік змін стереологічних показників дистального відрізку сідничого нерва за умови спільної дії магнітного поля та лазерного випромінення в інфрачервоному спектрі з частотою модуляції 9,4 Гц. По осі абсцис – терміни досліджень, по осі ординат – середні величини показників.













Рис.5. Графік змін стереологічних показників дистального відрізку сідничого нерва за умови спільної дії магнітного поля та лазерного випромінення в інфрачервоному спектрі з частотою модуляції 37,5 Гц. По осі абсцис – терміни досліджень, по осі ординат – середні величини показників.



Деякі автори вважають, що регенерація ушкодженого нерва значно поліпшується при відкладеному шві. На думку інших, при цьому важко очікувати на хороші результати. Є також різні думки з приводу використання з метою стимуляції відновлення травмованого нерва як фармакологічних препаратів, так і фізіотерапевтичних засобів. Постійно з’являються нові методи, які пропонуються для лікування пошкоджених нервів. У зв’язку з цим ми вирішили дослідити дію нового апарату “МІТ-11”, який забезпечує частотно модульоване лазерне випромінення у магнітному полі (ЧМ МЛТ).

При оцінці ефекту застосування методу ЧМ МЛТ, у першу чергу слід зазначити значний нормалізуючий його вплив на реологічні та коагуляційні показники крові, а також на структурні елементи мембрани живих клітин зі зміною їх проникності для найважливіших іонів (Ca2+, K+, Na+ та ін.).

За даними Н.І. Самосюк (2004р.), застосування ЧМ МЛТ разом з медикаментозною терапією вже на 5-7 добу призводило до достовірного покращення індексу агрегації тромбоцитів з 58,7±1,4 до 39,7±1,8, індексу агрегації еритроцитів з 13,4±0,25 до 9,9±0,3 та спонтанного фібринолізу з 12,7±0,7 до 15,7±0,68.

Дані, отримані нами при імпрегнації регенеруючого нерва нітратом срібла, свідчать, що у тварин, яким проводили ЧМ МЛТ в інфрачервоному діапазоні спектра з частотою модуляції 37,5 Гц у ділянці проксимального відрізка невротизація відбувається швидше і більш рівномірно, а новоутворені аксони проникають у дистальний відрізок у значно коротший термін. 

При проведенні ультрамікроскопічного дослідження периферійного відрізку нерва було виявлено, що у тварин 5 групи поряд з нервовими волокнами, які формуються, з’являються мієлінові волокна з повністю сформованою мієліновою оболонкою та наявністю чисельних мітохондрій, нейротрубочок та нейрофібрил у аксоплазмі. Виникнення великої кількості новоутворених мієлінових волокон, на нашу думку, є результатом активності метаболічного апарату клітин Шванна. Досить значна кількість мітохондрій, що виявляється при цьому, має добре розвинуті кристи, між якими знаходиться електроннощільний матрикс. Слід відзначити також аутолітичну функцію нейролемоцитів, на що вказує наявність в їх цитоплазмі численних лізосом та фаголізосом, які накопичують ліпідні включення.

Проведений морфометричний аналіз свідчить, що в групах тварин, яким проводилась ЧМ МЛТ, кількість нервових волокон перевищує аналогічні показники у контрольній групі тварин. При чому, проявляється це найбільше у тварин 5 групи, яким проводилась МЛТ у інфрачервоному спектрі з частотою модуляції 37,5 Гц. Збільшення об’єму відбувається, в основному, за рахунок підвищення їх кількості, тоді як розміри не проявляють такої вираженої різниці. Водночас аналіз розподілу типів волокон за площею свідчить про суттєву різницю у співвідношенні волокон за розмірами, а саме: у контрольній групі переважну більшість становлять дрібні волокна, в той час, як у групах 2, 3, 4, 5 поступово з’являються волокна середнього та крупного діаметру, кількість яких у тварин 5 групи переважає (рис.6,7,8). Разом з тим, кількість товстих мієлінових волокон і збільшення кількості середніх у групах тварин, яким проводилась МЛТ, свідчить про їх більш швидке відновлення, а саме: співвідношення дрібних, середніх та великих за розмірами волокон в групах з МЛТ перевищує такі ж показники у тварин контрольної групи. Ці результати вказують на те, що у тварин, яким після невротомії проводилась МЛТ, процеси регенерації пошкодженого нерва відбувались значно краще, особливо у тварин 5 групи.

















Рис.6. Розподіл мієлінових волокон залежно від значень площ їх поперечних зрізів у контрольній групі. По осі абсцис – терміни досліджень, по осі ординат – кількість волокон у %

















Рис.7. Розподіл мієлінових волокон залежно від значень площ їх поперечних зрізів у динаміці експерименту за умови спільної дії магнітного поля та лазерного випромінення у червоному спектрі з частотою модуляції 37,5 Гц.














Рис.8. Розподіл мієлінових волокон залежно від значень площ їх поперечних зрізів у динаміці експерименту за умови спільної дії магнітного поля та лазерного випромінення в інфрачервоному спектрі з частотою модуляції 37,5 Гц.



Таким чином, ми прийшли до висновку, що використання ЧМ МЛТ позитивно впливає на процеси регенерації у пошкодженому нерві, причому в усіх його відділах (проксимальному, регенераційній невромі, дистальному). У зв’язку з цим, цей метод можна рекомендувати для комплексного лікування пошкоджених нервів. Крім цього, у подальших дослідженнях можна вивчити вплив МЛТ на біологічні точки, пов’язані з пошкодженим нервом та на сегменти спинного мозку, які зв’язані з цим нервом.


ВИСНОВКИ



У дисертації наведено теоретичне узагальнення та нове рішення наукової задачі, яка полягає у з’ясуванні закономірностей невротизації та мієлінізації у травмованому нерві за умов проведення на ділянку пошкодження частотно-модульованої магнітолазеротерапії у червоному та інфрачервоному спектрі з частотою модуляції 9,4 Гц та 37,5 Гц.

		У тварин, яким після перетинання нерва проводилось зшивання його кінців без проведення МЛТ, відновлення сідничого нерва відбувається повільніше, ніж у групах тварин з використанням МЛТ. Це характеризується достовірно меншим об’ємом та кількістю мієлінових нервових волокон в одиниці об’єму нерва.

		Використання МЛТ у червоному спектрі з частотою модуляції 9,4 Гц з метою стимуляції регенерації пошкодженого нерва показало, що зміни, які при цьому відбуваються, практично не відрізняються від таких у контрольній групі тварин. Звертає лише увагу на себе деяке (хоча статистично недостовірне) збільшення морфометричних показників.

		Дослідження, проведені у групі тварин, яким після операції проводилась МЛТ у червоному спектрі з частотою модуляції 37,5 Гц, вказують на деякі позитивні зміни при регенерації у порівнянні з попередньою групою тварин. Однак, слід зазначити, що ступінь цих змін не є таким, який може забезпечити достатню компенсацію наслідків травми нерва.

		У тварин, яким після операції проводили МЛТ в інфрачервоному діапазоні спектра з частотою модуляції 9,4 Гц спостерігаються кращі результати щодо регенерації пошкодженого нерва, ніж у тварин, яким проводилась МЛТ в червоному діапазоні спектра. Це характеризується більшим об’ємом та кількістю мієлінових нервових волокон в одиниці об’єму нерва, більшою кількістю крупних за діаметром мієлінових нервових волокон.

		Найбільш позитивну дію МЛТ на регенерацію пошкодженого нерва було виявлено при використанні інфрачервоного спектру з частотою модуляції 37,5 Гц, що характеризується достовірно більшим об’ємом та кількістю мієлінових нервових волокон в одиниці об’єму нерва, достовірно більшою кількістю крупних за діаметром мієлінових нервових волокон.

		Отримані результати свідчать про те, що застосування МЛТ після травми нерва покращує результати відновлення останнього, що розширює уявлення про можливості використання фізичних методів для стимуляції регенерації пошкоджених нервів.

		Покращення показників, які характеризують регенерацію пошкодженого нерва під впливом МЛТ, дозволять застосовувати цей метод у клінічній практиці з метою прискорення мієлінізації ушкоджених нервів та розробляти нові підходи для використання цього методу. 


СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ



		Д.В. Раскалєй, Т.П. Куфтирєва. Морфологічна характеристика відновлення пошкодженого сідничого нерва під впливом магнітолазеротерапії//Вісник проблем біології і медицини. – 2006. – випуск 2. – С.282-285. (Пошукачем виконані експериментальні операції і проведена МЛТ. Здійснене забарвлення напівтонких зрізів, проведено аналіз отриманих морфометричних даних та їх статистичне опрацювання, підготовлена до друку стаття. )

		Раскалєй Д.В., Стеченко Л.О. Ультраструктурні зміни пошкодженого нерва в умовах дії магнітного поля та лазерного випромінення з різною частотою модуляції// Вісник наукових досліджень. – 2006. – №3. – С.21-24.(Пошукачем проведений аналіз електронограм, пошук літератури за темою та оформлення матеріалів.)

		 Д.В. Раскалєй, Г.І.Козак. Ультраструктурні особливості будови дистального відрізку пошкодженого нерва в умовах дії магнітного поля та лазерного випромінення у червоному спектрі з різною частотою модуляції//Таврический медико-биологический вестник. – 2006. – Т.9. - №3. – С. 149-153. (Пошукачем проведений аналіз електронограм, аналіз одержаних результатів, підготовлена стаття до друку.)

		Д.В. Раскалєй, О.М. Грабовий. Морфологічні особливості регенерації пошкодженого нерва, яка відбувається під впливом магнітолазерного опромінення//Вісник наукових досліджень. – 2007. - №1. – С.111-113. (Пошукачем здійснена імпрегнація зрізів пошкоджених нервів, проведено пошук літератури за темою та аналіз результатів, підготовлена стаття до друку.)

		 Пат. № 10757 UA 7 A61N5/067,G09B23/28. Спосіб лікування пошкоджень периферійних нервів в експерименті//Раскалєй Д.В., Чайковський Ю.Б.; НМУ ім. О.О.Богомольця. - №200505890; Заявл. 15.06.2005; Опубл. 15.11.2005.//Промислова власність. Бюлетень. – 2005. - №11. – С.3.28.1. (Пошукачем виконані експериментальні операції та розроблена методика лікування пошкоджених нервів.)

		Raskalyey D.V., Sokurenko L. М.Peripheral nerve regeneration after neurorhaphy and magnetolaser stimulation // 13th Annual International Ain Shams Medical Students’ Congress, Cairo, Egypt. – 2005. – С.67. (Пошукачем самостійно проаналізована література, проведений аналіз отриманих даних.)

	7. 	Раскалєй Д.В. Регенерація нервових волокон під дією магнітного поля та лазерного випромінення з різною частотою модуляції//Міжнародна науково-практична конференція студентів, молодих вчених, лікарів та викладачів “Актуальні питання експериментальної та клінічної медицини”, присвячена Дню науки в Україні. – С.53 – 54.

	8.	Раскалєй Д.В., Раскалєй В.Б., Чайковський Ю.Б. Вплив магнітолазеротерапії на мікроскопічні та ультрамікроскопічні процеси у периферійному нерві після його пошкодження//Збірник матеріалів науково-практичної конференції “Досвід і проблеми застосування сучасних морфологічних методів досліджень органів і тканин у нормі та при діагностиці патологічних процесів”. – Тернопіль, 2007. – С.73 – 75. (Пошукачем проведена імпрегнація досліджуваного матеріалу, проаналізовані електронограми, здійснено узагальнення усіх даних та оформлення результатів.).


АНОТАЦІЯ



Раскалєй Д.В. Морфологічна характеристика впливу магнітного поля та лазерного опромінення на регенерацію периферійного нерва. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.09 – гістологія, цитологія, ембріологія. – Національний медичний університет імені О.О. Богомольця МОЗ України, Київ, 2008.

Дисертація присвячена вивченню можливості стимуляції регенерації пошкоджених периферійних нервів в умовах спільної дії частотно-модульованого магнітного поля та лазерного опромінення у різні терміни після травми. Відновлення функції пошкоджених нервів залежить від швидкості регенерації нервових волокон, відновлення повноцінної інервації тканин, можливості розвитку в рані запального процесу.

Під час проведення дослідження було доведено перспективність і доцільність комплексного застосування магнітолазеротерапії (МЛТ) у лікуванні пошкоджених нервів. 

В експерименті було вивчено вплив на регенерацію периферійного нерва частотно-модульованого магнітного поля та оптичного потоку в різних діапазонах спектру (червоному та інфрачервоному) при частоті модуляції 9,4 та 37,5 Гц. У роботі було використані нейрогістологічні, загальногістологічні, електронномікроскопічні та морфометричні методи дослідження, які дозволили вивчити реактивні зміни під час регенерації сідничого нерва.

Дослідження проводились на базі кафедри гістології та ембріології НМУ імені О.О. Богомольця. Використовувались апарат для фізіотерапії комбінований “МІТ-11” вітчизняного виробництва, цифрова фотокамера та мікроскоп “Oлімпус”, ультратом LKB-8800 (Швеція), електронний мікроскоп ЕМВ 125К.

Об’єктом дослідження був сідничий нерв після невротомії з наступним зшиванням із застосуванням МЛТ та без її застосування. Матеріал забирався через 3, 6 та 12 тижнів після операції без використання та з використанням магнітолазеротерапії. Вперше було досліджено вплив частотно-модульованої магнітолазерної дії на регенерацію периферійного нерва і встановлено, що використання МЛТ в інфрачервоному діапазоні спектру з частотою модуляції 37,5 Гц дало найкращі результати.

Отримані дані можуть бути використані для оптимізації способів лікування пошкоджених нервів.

Ключові слова : магнітолазеротерапія, дегенерація, регенерація, нервові волокна, інфрачервоний діапазон спектру.


АННОТАЦИЯ



Раскалей Д.В. Морфологическая характеристика влияния магнитного поля и лазерного облучения на регенерацию периферического нерва. – Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.09 – гистология, цитология, эмбриология. – Национальный медицинский университет имени А.А. Богомольца МЗ Украины, Киев, 2008.

Диссертация посвящена изучению возможности стимуляции регенерации поврежденных периферийных нервов в условиях общего действия частотно модулируемого магнитного поля и лазерного облучения в разные сроки после травмы. Восстановление функции поврежденных нервов зависит от скорости регенерации нервных волокон, возобновления полноценной иннервации тканей, возможности развития в ране воспалительного процесса. Во время проведения исследования были доказаны перспективность и целесообразность комплексного применения магнитолазеротерапии (МЛТ) в лечении поврежденных нервов.

В эксперименте было изучено влияние на регенерацию периферического нерва частотномодулируемого магнитного поля и оптического потока в разных диапазонах спектра (красном и инфракрасном) при частоте модуляции 9,4 и 37,5 Гц. 

В работе были использованы нейрогистологические, общегистологические, электронномикроскопические и морфометрические методы исследования, которые позволили изучить реактивные изменения во время регенерации седалищного нерва. Исследования проводились на базе кафедры гистологии и эмбриологии НМУ имени А.А. Богомольца. Использовались аппарат для физиотерапии комбинированный “МИТ-11” отечественного производства, цифровая фотокамера и микроскоп “Oлимпус”, ультратом LKB-8800 (Швеция), электронный микроскоп ЕМВ 125К.

Объектом исследования был седалищный нерв после невротомии с последующим сшиванием с применением МЛТ и без таковой. Материал забирался через 3, 6 та 12 недель после операции. Впервые было исследовано влияние частотно-модулированного магнитолазерного действия на регенерацию периферического нерва. Показано, что МЛТ в инфракрасном диапазоне спектра с частотой модуляции 37,5 Гц дало наилучшие результаты.

Полученные данные могут быть использованы для оптимизации способов лечения поврежденных нервов.

Ключевые слова: магнитолазеротерапия, дегенерация, регенерация, нервные волокна, инфракрасный диапазон спектра.


SUMMARY



Raskalyey D.V. Morphological description of influencing of the magnetic field and laser irradiation on the regeneration of peripheral nerve. A Manuscript.

Thesis for a candidate’s degree of medical sciences in speciality 14.03.09 – histology, cytology, embryology. – National О.О. Bogomolets medical university, Kyiv, 2008. 

The thesis is devoted to the study of dynamics in repair processes of preliminarily cut and sutured sciatic nerves in experiments on white rats. A research purpose is based on the increasing efficiency of treatment of the damaged peripheral nerve by the action of the frequency-modulated magnetic field and laser radiation. It was shown that influence of magnetic field and laser radiation in the infrared diapason with the modulation frequency of 37.5 Hz tends to shorten the period of regeneration in the distal length of the nerve. Secondary regeneration of the nerve fibers proceeds more intensively. 

Thus, the results of the study can be applied in medicine to achieve better results in the treatment of damaged peripheral nerves.

Key words: magnetic-laser therapy, degeneration, regeneration, nerve fiber, infrared spectrum diapason.