Этапы определения АК последовательности в пептидах. Синтез белка

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИНФОРМАТИКИ И РАДИОЭЛЕКТРОНИКИ



Кафедра ЭТТ













РЕФЕРАТ

На тему:



«Этапы определения АК последовательности в пептидах.

Синтез белка»





























МИНСК, 2008


Предварительное освобождение каждого анализируемого пептида от примесей других.

1. Идентификация NH2- и СООН - концевых остатков.

2. Расщепление с помощью трипсина неповрежденной цепи на ряд более коротких пептидов (фрагментов).

3. Разделение фрагментов пептидов при помощи электрофореза или хроматографии.

4. Определяют NH2- и СООН- группы фрагментов.

5. Более длинные фрагменты анализируют, устанавливая первичную структуру.

6. Подвергают полипептид частичному гидролизу (химотрипсин, пепсин)

7. Сопоставляют аминокислотный состав в двух наборах пептидных компонентов.

Определена АК последовательность бычьего инсулина, молекула которого состоит из двух полипептидных цепей, содержащих А-21 и В-30 аминокислотных остатков, эти две цепи поперечно связаны -S-S- мостиками и имеют еще один такой мостик внутри цепи. также расшифрованы адренокортикотропин, рибонуклеаза, гемоглобин. 

Видовая специфичность АК - инсулин у животных и человека. Цитохром С - белок переносчик электронов у всех животных, растений и микроорганизмов.

В настоящее время для количественного определения АК применяется реакция их с нингидрином. В первой стадии реакции нингидрин восстанавливается. В результате образуется аммиак, который во второй стадии реагирует с нингидрином, образуя сине-фиолетовый продукт, интенсивность окраски которого (570 нм) пропорциональна количеству АК.

На основе нингидриновой реакции разработан метод хроматографии распределения на бумаге. Эта же реакция используется и в автоматическом анализаторе АК: после разделения на колонке, заполненной специальными ионообменными смолами, элюент из колонки поступает в смеситель, туда же поступает раствор нингидрина, интенсивность окраски измеряется на спектрофотометре и записывается в виде пиков. Смесь АК успешно разделяется и методом электрофореза на бумаге. При рН=6,0 хорошо разделяются кислые и основные АК с нейтральными. Отрицательно заряженные АК двигаются к аноду, а положительно - к катоду, нейтральные остаются на старте. После электрофореза АК выявляют с помощью химических реакций.

Наиболее богаты белковыми веществами ткани и органы животных. Источником белка являются также микроорганизмы и растения. В теле человека белки составляют 45% сухой массы. Помимо углерода (50-54%), кислорода (21,5-23,5%) и водорода (6,5-7,3%), входящих в состав почти всех органических полимерных молекул, обязательным компонентом белков являются азот (15-17%), сера (0,3-2,5%) , в небольших количествах содержатся железо, марганец, фосфор, магний, йод.

Для исследования свойств белков, также как и для изучения их химического состава и строения необходимо получение их в химически индивидуальном состоянии.

Белковые вещества чувствительны к повышению температуры и к действию большинства химических реагентов. Белки выделяют при низкой (+4о С) температуре. Органы и ткани животных измельчают, гомогенизируют. Большинство белков тканей хорошо растворимы в 8-10% растворах солей. Для экстракции белков применяются буферные смеси с определенными значениями рН среды. Разделение смеси белков - фракционирование. Для этого используют различные методы: высаливание, хроматографию, гель-фильтрацию, электрофорез, ультрацентрифугирование и т.д.

Таким образом, основная структурная единица белка - мономер- аминокислота. Белки - высокомолекулярные, N-содержащие биомолекулы, состоящие в основном из аминокислот. Молекулярная масса белков колеблется от 6000 до 1000000 и выше дальтон.

У огромного количества белков химическое строение не выяснено, поэтому основными методами для определения молекулярной массы являются методы седиментационного анализа (включая центрифугирование в градиенте плотности), хроматографии, гель-фильтрации и электрофореза.

Седиментационный анализ проводят в ультрацентрифугах и вычисляют молекулярную массу по скорости седиментации (чем больше масса исследуемого вещества, тем меньше скорость осаждения).

Тонкослойная гель-фильтрация. Длина пробега белка (в мм) через тонкий слой сефадекса находится в логарифмической зависимости от молекулярной массы белка.

Величину и форму белковых молекул определяют благодаря применению методов сканирующей электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа, что позволило в деталях расшифровать не только пространственную структуру, но и соответственно форму и степень асимметрии белковых молекул во всех трех измерениях.

В процессе жизнедеятельности организма белкам принадлежит особая роль, т.к. ни углеводы, ни липиды не могут их заменить в воспроизводстве основных структурных элементов клетки, а также в образовании таких важнейших веществ, как ферменты и гормоны. Однако синтез белка из неорганических веществ возможен только в растительных клетках. В животном организме белок синтезируется из аминокислот, часть которых образуется в самом организме, а другие АК в организмах не синтезируется и должны поступать с пищей. Поэтому биологическая ценность белков пищи определяется наличием в их составе всех АК.

Состояние белкового обмена организма зависит не только от количества принимаемого с пищей белка, но и от качественного его состава. Природные белки обладают неодинаковой пищевой ценностью. Поэтому для удовлетворения пластических потребностей организма требуются различные количества разных белков пищи. Чем ближе аминокислотный состав принимаемого пищевого белка к аминокислотному составу белков тела, тем выше его биологическая ценность. Степень усвоения пищевого белка зависит также от степени гидролиза, распада его под влиянием ферментов желудочно-кишечного тракта. Ряд белковых веществ (шерсть, волосы, перья) несмотря на их близкий состав к белкам тела, почти не используются в качестве пищевого белка, поскольку они не гидролизуются протеиназами кишечника человека и большинства животных.

С понятием биологической ценности белков тесно связан вопрос о незаменимых АК. Живые организмы существенно различаются по способности синтезировать АК. Высшие позвоночные животные не синтезируют всех необходимых для синтетических целей АК.

В организме человека синтезируется только 10 из 20 АК белковой молекулы. Это - заменимые АК. Они могут быть синтезированы из продуктов обмена углеводов и липидов. Остальные 10 аминокислот не синтезируются в организме, они называются незаменимые аминокислоты.

Установлено, что незаменимость аминокислот для роста и развития организма животных и человека связана с отсутствием способность тканей синтезировать углеродные скелеты незаменимых АК, поскольку процесс аминирования кетопроизводных осуществляется легко с помощью реакций трансаминирования. для обеспечения нормальной жизнедеятельности все эти 10 АК должны поступать с пищей. Для взрослого человека аргинин и гистидин оказались частично заменимыми. Исключение незаменимых АК из пищевой смеси сопровождается развитием отрицательного азотистого баланса, слабости, нарушений со стороны нервной системы и т.д. Для человека белки мяса, молока, яиц биологически более ценны, поскольку их аминокислотный состав ближе к АК составу организма и тканей человека. Растительные белки содержат весь необходимый набор АК, но в другом соотношении. Поэтому для удовлетворения потребностей организма в белках их необходимо значительно больше.

Заменимые: глицин, аланин, аспарагин, серин, тирозин, глутамин, пролин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты, цистеин.

Незаменимые: треонин, валин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, триптофан, лизин, метионин, глутамин и гистидин.

Следует особо подчеркнуть, что недостаток какой-либо одной незаменимой АК ведет к неполному усвоению и других АК. Следует учитывать и видовые различия незаменимости отдельных АК.

Белковые резервы. Под термином резервные белки понимают не особые отложения белков, а легкомобилизуемые при необходимости тканевые белки, которые после гидролиза под действием тканевых протеиназ служат поставщиками АК, необходимых для синтеза ферментов и гормонов.

Наблюдения за больными в клинике свидетельствует о том, что при голодании или тяжелых инфекционных заболеваниях, когда наблюдается интенсивный распад органов, то в первую очередь снижается масса печени и мышц, без существенного изменения массы мозга и сердца. Организм как бы жертвует белками печени и мышц для обеспечения нормальной деятельности жизненно важных органов. Принято считать, что белки плазмы крови, печени и мышц могут служить в качестве “резервных”, хотя по своему существу резко отличаются от ресурсов углеводов (отложение гликогена в печени и мышцах) и липидов (отложение жиров). Существование в организме механизма срочной мобилизации белковых ресурсов в экстремальных условиях имеет важное физиологическое значение.

Аминокислоты в организме подвергаются разнообразным превращениям, все они участвуют в процессе биосинтеза белка. Установлено, что носителями наследственной информации являются молекулы ДНК, на которых закодированы генетические особенности организма, в том числе состав и структура синтезируемых белков.

Первичная структура ДНК представляет собой определенную последовательность мононуклеотидов, каждые три из которых носят названия триплет и кодируют вполне определенную аминокислоту.


Синтез белка можно условно разделить на три этапа. 



1 этап – синтез информационной РНК - транскрипция. Синтез информационной РНК происходит в ядре клетки и заключается в том, что молекула ДНК, как имеющая двойную спираль, в определенные моменты раскручивается и на одной из нитей ДНК строится молекула информационной РНК. В результате этого молекула последней в точности повторяет чередование азотистых оснований ДНК и служит переносчиком генетической информации, т. е. матрицей, по которой строится белок. 

2 этап – начинается с активации аминокислот при участии ферментов и АТФ с образованием комплексов – аминоациладенилатов. Для каждой АК имеется своя определенная транспортная РНК, к которой присоединяется только данная активированная АК, и такой комплекс переносится к рибосомам.

3 этап – собственно синтез белка - трансляция. На молекуле информационной РНК выделяются определенные триплеты (кодоны), которые комплементарны соответствующим антикодонам транспортной РНК. По мере передвижения информационной РНК по рибосоме происходит присоединение транспортной РНК своими антикодонами к кодонам информационной РНК и соединенные аминокислоты взаимодействуют между собой, образуя полипептидную цепь, специфичную для данного белка, т. е. его первичную структуру. В дальнейшем она подвергается спирализации и определенной упаковке в пространстве, что формирует вторичную и третичную структуру данного белка.



Регуляция биосинтеза АК.



1. Регуляция биосинтеза белка осуществляется подавлением первой стадии биосинтеза по принципу обратной связи. Первая реакция, которая обычно необратима, катализируется аллостерическим ферментом (регуляторным).

2. Генетическая репрессия и депрессия синтеза ферментов. Изменение скорости транскрипции ДНК. Репрессия происходит тогда, когда продукт данной реакции присутствует в клетке или среде в концентрации, достаточной для удовлетворения метаболических потребностей.



Переваривание белков.



Главным образом животные продукты (мясо, рыба, сыр) и только некоторые растительные (горох, фасоль, соя) богаты белками, в то время как наиболее распространенные растительные продукты содержат мало белка. Белки пищи, за редким исключением, не усваиваются организмом, если они не будут расщеплены до стадии свободных АК. Гидролиз пищевых белков осуществляется путем последовательного действия протеолитических ферментов, лишая белки пищи видовой и тканевой специфичности и придавая продуктам гидролиза способность всасываться в кровь через стенку кишечника. Гидролиз химически сводится к разрыву пептидной связи -CO-NH- белковой молекулы с присоединением элементов воды к продуктам распада.

Протеолитические ферменты относятся к классу гидролаз или пептидаз. Имеются 2 группы:

Экзопептидазы, катализирующие разрыв концевой пептидной связи и эндопептидазы, гидролизующие пептидные связи внутри пептидной цепи. Эндопептидазы – пепсин, содержащийся в желудочном соке, трипсин, химотрипсин и эластаза, синтезирующиеся в поджелудочной железе. Экзопептидазы – карбоксипептидазы А и В – синтезируются в поджелудочной железе. Аминопептидазы – вырабатываются в клетках слизистой оболочки кишечника (аланинаминопептидаза и лейцинаминопептидаза).

Процесс переваривания пептидов, их расщепление до свободных АК в тонком кишечнике завершают три- и ди- пептидазы.

В настоящее время накапливается все больше данных о более широкой биологической роли протеолитических ферментов тканей в регуляции ряда процессов в организме. Некоторые из них выполняют защитную функцию. Регуляция включает превращение неактивного предшественника в активный белок, что связано с разрывом ограниченного числа пептидных связей в молекуле белка.

В регуляции синтеза протеолитических ферментов активно принимают участие ингибиторы протеиназ белковой природы, они содержатся в поджелудочной железе, плазме крови, курином яйце.



Переваривание белков в желудке.



В желудочном соке содержится активный фермент – пепсин. Он гидролизует преимущественно пептидные связи, образованные аминогруппами ароматических кислот (фенилаланин, тирозин). Расщепляет практически все природные белки. Исключение составляют кератиды, протамины, гистоны и мукополисахариды.

Реннин катализирует свертывание (створоживание) молока, т.е. превращение растворимого казеиногена в казеин.



Переваривание белков в кишечнике:



В поджелудочной железе вырабатываются 3 белковых фермента: трипсин, химотрипсин и карбоксипептидаза.

Трипсин и химотрипсин разрывают внутренние пептидные связи. Дальнейший гидролиз пептидов до свободных АК осуществляется под влиянием карбоксипептидазы, аминопептидазы и дипептидаз. Продукты гидролиза белков всасываются в желудочно-кишечном тракте в основном в виде АК. Аминокислоты после всасывания в кишечнике, через воротную вену поступают в печень, часть из них разносится кровью по всему организму и используется для физиологических целей.



В печени используются АК: 



Для синтеза белков и белков плазмы крови, пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, НАД. Различная скорость проникновения АК через биомембраны клеток свидетельствует о существовании в организме активной транспортной системы, обеспечивающей перенос АК как через внешнюю клеточную мембрану, так и через систему внутриклеточных мембран. Тонкие механизмы этого процесса нерасшифрованы.

Из других путей превращения АК важное значение играют следующие:

Дезаминирование, переаминирование и декарбоксилирование.

Дезаминирование – процесс расщепления АК под действием ферментов дезаминаз или оксидаз с выделением аммиака и образованием безазотистого остатка, происходящим несколькими путями, в том числе восстановительным, гидролитическим, внутримолекулярным и окислительным. У животных и человека преобладают два последних вида дезаминирования. Окислительному дезаминированию подвергается глутаминовая кислота, фермент глутаматдегидрогеназа.

Переаминирование – непосредственный перенос аминной группы от АК на кетокислоту без освобождения аммиака. Фермент – аминотрансфераза. Эти реакции обеспечивают а) биосинтез заменимых АК, б) распад АК, в) объединение путей обмена углеводов и АК.

Декарбоксилирование – под действием декарбоксилаз АК происходит отщепление от АК углекислого газа и образуются соответствующие амины. Образующиеся амины называют биогенными аминами. Гистидин – вызывает расширение капилляров, сужение крупных сосудов, сокращение гладкой мускулатуры внутренних органов, усиление секреции соляной кислоты в желудке. Серотонин способствует повышению кровяного давления и сужению бронхов. Альфа-аминомасляная кислота служит медиатором торможения нервной системы. В организме биогенные амины находятся в неактивной связанной форме, из которой они освобождаются по мере необходимости, Разрушаются в печени моноаминооксидазами.

В итоге распада АК в организме образуется аммиак. Углекислый газ и вода. Углекислый газ частично выводится из организма или используется для синтеза жирных кислот, глюкозы и т.д. Аммиак очень токсичен и организм выработал механизмы его обезвреживания. Основные – образование глутамина. Это восстановительное аминирование – процесс, обратный дезаминированию.

Основная часть АК, поступивших с пищей или образовавшихся при распаде тканевых белков расходуется на биосинтез белка.

Оставшаяся часть АК подвергается специфическим превращениям и принимает участие в образовании:

Глицин –участвует в синтезе креатина, серина, гемоглобина, пуриновых азотистых оснований

Аланин – при его дезаминировании образуется пировиноградная кислота, он участвует в синтезе глюкозы, гликогена и ацетил КоА.

Метионин является участником синтеза холина, тимина, адреналина, креатина.

Серин – является исходным веществом для синтеза 3-фосфоглицериновой кислоты, одного из субстратов обмена глюкозы и гликогена, пировиноградной кислоты, цистеина.

Глутаминовая и аспарагиновая кислоты участвуют в обезвреживании аммиака, в реакциях цикла Кребса.

Аргинин участвует в синтезе мочевины

Гистидин – в синтезе гемоглобина, при распаде образует биогенный амин – гистамин.


Патология белкового обмена.



Одной из причин нарушения обмена белков является недостаточное его потребление. Может быть и вторичным, т.е. может развиваться на основе других заболеваний (нарушение переваривания, кровотечениях, заболеваниях печени).

Чаще всего связано с нарушением соотношения АК, имеющих экзогенное (при недостатке незаменимых АК) и эндогенное (связанное с нарушением обмена отдельных АК). Причиной экзогенной недостаточности является однообразное белковое питание с ограниченным потреблением животных белков и как следствие недостаточность незаменимых АК.

Экзогенные нарушения обмена АК могут быть вызваны наследственными заболеваниями, имеющими в своей основе падение активности ферментов, ответственных за синтез заменимых АК или их превращений.

Например, альбинизм возникает при нарушении синтеза пигмента меланина и сопровождается отсутствием характерной окраски волос, радужной оболочки глаз, кожи. Волосы и кожа имеют неестественный белый цвет.

Недостаток триптофана имеет следствием нарушение деятельности сердца и помутнение хрусталика (катаракта).

Снижение уровня метионина приводит к поражению поджелудочной железы.

Возникновение и дальнейшее развитие специфического патологического синдрома при этих заболеваниях обусловлено полным или частичным выключением определенных ферментативных активностей.

Организм либо теряет способность синтезировать данный фермент, либо его образуется недостаточное количество, либо синтезируется аномальный фермент, по структуре отличающийся от нативного.

Следствием является накопление в тканях повышенного содержания продуктов обмена, оказывающих токсическое действие на организм и в первую очередь на ЦНС.


ЛИТЕРАТУРА



Мецлер Д. Биохимия. Т. 1, 2, 3. “Мир 2000

Ленинджер Д. Основы биохимии. Т.1, 2, 3. “Мир” 2002

Фримель Г. Иммунологические методы. М. “Медицина 2007

Медицинская электронная аппаратура для здравоохранения. М 2001

Резников А.Г. Методы определения гормонов. Киев “Наукова думка 2000

Бредикис Ю.Ю. Очерки клинической электроники. М. “Медицина 1999