Радиоактивные изотопы и соединения

Радиоактивные изотопы и соединения, меченные радиоактивными изотопами, широко применяются в самых разных областях человеческой деятельности. Промышленность и технологический контроль, сельское хозяйство и медицина, средства связи и научные исследования — охватить весь спектр применения радиоактивных изотопов практически невозможно, хотя все они возникли чуть более, чем за 100 лет. Представленный ниже материал посвящён использованию радиоактивных изотопов в различных молекулярно-биологических исследованиях и является учебно-методическим пособием, а не строгой научной публикацией. К сожалению, значительная часть начинающих молодых ученых, работающих в области life science, представляет себе специфику работ с радиоактивными веществами поверхностно и фрагментарно. Это неудивительно, так как в России образование на медицинских и биологических факультетах не дает ни основных теоретических представлений о радиоактивности, ни практических навыков в этой области. У химиков ситуация лучше, потому что некоторые основные понятия о природе радиоактивности входят в учебную программу.
Хотя представленный материал рассчитан на малоподготовленного читателя, надеюсь, что он может оказаться полезным и для профессионалов.




1. Основные понятия и терминология

Радиоактивность (radioactivity) — это обозначение удивительного явления природы, открытого Беккерелем в конце XIX века, суть которого заключается в самопроизвольном спонтанном превращении атомных ядер некоторых элементов в другие, которое сопровождается выделением трёх видов "лучей". Природу лучей установили быстро: α-лучи — это двукратно ионизированные атомы гелия, β-лучи — это электроны, γ-лучи — это жесткое коротковолновое электромагнитное излучение. Элементы, способные к таким превращениям стали называться радиоактивными, т.е. способными к этому превращению. В зависимости от типа излучения, радиоактивные атомы стали определять соответственно как α, β или γ излучатели или источники. Правда, вскоре было установлено, что некоторые радиоактивные атомы излучают сразу два (а возможно, и три) вида лучей, поэтому такая классификация дополняется пояснениями — это "чистый" α-излучатель или имеется сопутствующее γ-излучение. К первоначальным трём типам ядерных превращений (α, β и γ — радиоактивный распад) добавились новые, однако, общие закономерности для всех остались неизменными. В конце ХХ века было рекомендовано термин "изотоп" заменить на "нуклид" и, соответственно, "радиоактивный изотоп" на "радионуклид". Особенно широкого распространения это нововведение не получило, и оба термина используются в научной литературе как синонимы.

Количественная характеристика радиоактивности получила у физиков название "активность" (activity). Так как физикам никто не давал монопольного права на термин "активность", то со временем выяснилось, что в разных областях науки под "активностью" понимают совсем разные понятия. Сравните: активность радиоактивного изотопа, химическая активность элемента или соединения, энзимологическая активность фермента, биологическая (например, антивирусная) активность препарата — всё это совершенно различные понятия. Сближение различных научных дисциплин ещё больше запутывает положение. Попробуйте охарактеризовать фермент, меченный радиоактивным изотопом углерода-14. Активность такого фермента — это его энзимологическая характеристика или радиоактивная? Поэтому в современной научной литературе (особенно биологической) все чаще термин "активность" для радиоактивных веществ заменяется термином "радиоактивность".

За единицу активности (радиоактивности) радиоактивного вещества в Международной системе СИ принята скорость радиоактивного распада, равная 1 распаду в секунду, которая получила название беккерель — Бк (в английской версии Bq). Устаревшая, но по-прежнему используемая единица активности кюри — Ки (в английской версии Ci) — это активность препарата, эквивалентная активности 1 г металлического радия-226 и равная 3,7х1010 распадов в секунду, т.е. 3,7х1010 Бк.

Строго говоря, радиоактивный распад — это превращение ядра атома радиоактивного элемента, которое сопровождается выделением продуктов такого превращения. Например, электронный захват представляет собой поглощение электрона ядром с выделением γ-кванта, и такой тип "радиоактивного распада" более точно следует называть "ядерным превращением". Впрочем, оба термина используются в литературе на равных, несмотря на предпочтительность "ядерного превращения".

Основной закон радиоактивного распада описывается замечательной формулой:

Nt = N0e-λt

где: 
      Nt — количество распавшихся радиоактивных атомов;
      N0 — начальное количество радиоактивных атомов;
      е — основание натурального логарифма;
      λ — константа скорости радиоактивного распада;
      t — время.

На практике для работы ею никто не пользуется, однако, из этой формулы следует сразу несколько довольно простых, но очень важных выводов и следствий, которые надо знать всем работающим с радиоактивными изотопами:

Количество радиоактивных атомов, распавшихся за некоторое время наблюдения, зависит только от их исходного количества и времени наблюдения (распада). Никакие другие параметры: астрономические, физические, химические, парапсихологические и "волшебные" на радиоактивный распад не влияют. Константа скорости радиоактивного распада [ λ ] (иногда ее называют константой распада) определяется только природой изотопа и для каждого изотопа имеет свою величину. Все попытки замедлить радиоактивный распад охлаждением (даже в жидком азоте) или ускорить распад нагреванием абсолютно бессмысленны. Вы можете влиять на стабильность химического соединения, меняя температуру его хранения, но количество радиоактивных атомов в препарате при этом не изменится.

Скорость радиоактивного распада меняется по экспоненте (т.е. нелинейно), и рассчитывать количество радиоактивного материала в вашем препарате надо с учетом этого факта, пользуясь либо вышеприведенной формулой, либо соответствующими таблицами распада (что обычно и делают на практике).

Представьте себе, что в формуле радиоактивного распада Nt = 1/2 N0 , т.е. распалась ровно половина радиоактивных атомов, содержащихся в препарате. Время этого процесса — константа Т1\2 — называется периодом полураспада. Физический смысл — время, за которое распадается половина радиоактивных атомов данного изотопа. Эта величина весьма полезна для работающих с радиоактивностью, т.к. позволяет быстро оценить "потери на распад" препарата.

Физический смысл константы скорости радиоактивного распада [ λ ] — это активность 1 моля (или ммоля) 100% радиоактивного изотопа и соответственно размерность этой константы — Бк/моль (Bq/mol) или Ки/ммоль (Ci/mmol). То есть, это теоретически достижимая молярная активность (активность одного моля радиоактивного вещества), знание которой позволяет оценить чувствительность метода и качество радиоактивного препарата. Ниже об этом будет сказано подробнее.



2. Детекция и количественные измерения радионуклидов

Детектирование радиоактивного распада основано на его различных физических свойствах: 

способность взаимодействовать с кристаллами бромистого серебра, засвечивая светочувствительные материалы, — авторадиография,

способность вызывать "свечение" при столкновении продуктов распада с некоторыми веществами — сцинтилляция,

способность ионизировать молекулы окружающей среды продуктами радиоактивного распада — ионизация,

способность вызывать дефекты в кристаллических решетках,

способность осуществлять (или катализировать) некоторые химические реакции.

Все эти способности были задействованы при создании различных измерительных приборов и индикаторов различного назначения. Однако, для измерения активности, т.е. количества ядерных превращений в единицу времени, наиболее широкое распространение получили приборы, основанные на использовании сцинтилляции или ионизации. При этом в life science используют, как правило, сцинтилляционные приборы и авторадиографию, а для физических, инженерных и медицинских работ — приборы, измеряющие ионизацию среды. Впрочем, такое разделение весьма условно, так как разнообразных приборов и средств измерений было создано за 100 лет очень много.

Следует особо выделить приборы для измерения ионизирующей способности излучения. Это важнейшая составляющая контроля за облучением персонала, работающего с источниками ионизирующего излучения (в том числе и с радиоактивными веществами). Контроль за радиационной обстановкой осуществляется по особым правилам, и краткая информация о нормах радиационной опасности и единицах, в которых эти нормы установлены. Пока следует подчеркнуть, что активность радиоактивного препарата и радиационная обстановка возле этого препарата — это совершенно разные характеристики, например, как масса вещества и его твердость. Единицы активности (Бк или Ки) говорят о количестве ядерных превращений в единицу времени. Наиболее популярная единица экспозиционной дозы для γ- (рентгеновского) излучения — рентген (Р) — говорит о величине потока ионизирующего излучения (потока энергии), проходящего через слой сухого воздуха и вызывающего ионизацию определенного числа молекул воздуха. Поэтому никакой прямой связи между этими величинами нет. Большая часть радионуклидов, которые используются в life science (об этом ниже), вообще никак не может быть охарактеризована термином экспозиционная доза, который введен для γ- (рентгеновского) излучения.



2.1. Авторадиография

Это исторически самый первый и, по-прежнему, весьма популярный метод детекции различных радионуклидов. Главное преимущество авторадиографии — простота и доступность. Выдержите (проэкспонируйте) образец с рентгеновской пленкой, затем проявите пленку в стандартных условиях — и получите картину распределения радионуклида по поверхности образца: геля, тонкослойной хроматограммы и т.д.

Если полученная "картинка" вас не устраивает — можно повторить экспозицию с новой пленкой, увеличивая (или уменьшая) время по своему желанию. Обычно время экспозиции меняют в 2÷3 раза, так как изменение времени экспозиции на 20÷30% существенных изменений в картину не вносит.

Весь сиквенс ДНК и РНК с радиоактивным фосфором использовал исключительно авторадиографию. Флюоресцентная метка практически полностью вытеснила радиоактивные изотопы из секвенирования, однако авторадиография остается широко применяемым методом детекции.

Главный недостаток авторадиографии — сложности с количественной оценкой. При визуальном определении даже интуитивно ясно, что интенсивность "почернения" пленки пропорциональна количеству радиоактивных атомов в этом месте. Но вопрос об этой "пропорциональности" нуждается в пояснении. Существует несколько типов сканеров, позволяющих довольно точно определять интенсивность "зачернения" пленки и, следовательно, сравнивать пятна инструментально, а не "на глаз". Оказалось, что диапазон активности препарата, в котором интенсивность "зачернения" пленки прямо пропорциональна количеству радиоактивных атомов, очень невелик и зависит от времени экспозиции образца с пленкой, типа пленки, природы радионуклида (тип распада и энергия излучения) и даже от режима обработки пленки. Например, для фосфора-32 за ночь экспозиции линейная зависимость "зачернения" пленки от активности образца находится в диапазоне 0,5÷25 Бк на мм2 (примерно 30÷1500 имп/мин). Дальнейшее увеличение активности образца, например, до 100 Бк на мм2 не приводит к большей интенсивности "зачернения" — всё уже "зашкалило".

Поэтому, простой совет для начинающих работать с количественной авторадиографией. Сделайте несколько калибровок — нанесите ряд пятен диаметром 1÷1,5 мм с активностью 1 · 3 · 10 · 30 · 100 · 300 Бк, проэкспонируйте их с рентгеновской пленкой различное время и после обработки пленки просканируйте её на своем приборе. Вы сразу определите диапазон, в котором ваши последующие количественные измерения радиоавтографов будут корректными. Для разных радионуклидов такой диапазон различается очень существенно, но учитывать его надо в любом случае.

Для увеличения чувствительности авторадиографии (точнее, для уменьшения времени экспозиции) можно воспользоваться усиливающими экранами. Это весьма эффективно для фосфора-32 или йода-125, однако практически бесполезно для мягких (слабоэнергетических) β-излучателей. Использование экрана для фосфора-32 позволяет снизить время экспозиции в 2÷3 раза, но за это приходится "платить" ухудшением разрешения, которое происходит за счет "размывания зон".



2.2. Сцинтилляционные счетчики

Эффект сцинтилляции для количественного определения радионуклидов начинали использовать еще во времена Резерфорда, который визуально считал сцинтилляционные вспышки под микроскопом. За сто лет принципиальных изменений не произошло. Рядом с источником излучения помещают сцинтиллятор и ФЭУ (фотоэлектронный умножитель), который считает вспышки. Сцинтиллятор может быть твердым, а может быть и жидким (чаще, растворенным в жидкости). Во флакон (vial) с жидким сцинтиллятором добавляют тестируемый образец, и в этом случае можно эффективно измерять даже самое "слабое", низкоэнергетическое излучение.

При измерении активности (радиоактивности) любых образцов и для любых средств измерения необходимо помнить несколько простых, но важных правил: 

Радиоактивный распад является классическим примером случайного, вероятностного природного процесса и, рассматривая измерение активности как регистрацию случайных событий, мы получаем математическую ошибку измерения активности:

n1/2/n x 100%

где n — число "событий" (в нашем случае распадов)

   Например, для 400 зарегистрированных импульсов на любом приборе независимо от времени измерения (наблюдения) 4001/2 / 400 х 100% = 5%, т.е. ошибка 5%. Это означает, что чем больше число измерений (собственно счет), тем меньше математическая ошибка измерения. Более того, вопреки устоявшейся традиции, для снижения математической ошибки измерения надо считать не число зарегистрированных прибором распадов (импульсов) за единицу времени, а время, необходимое для "накопления нужного" числа импульсов — например, 10000 имп. Тем не менее, во всем мире активность с помощью счетчиков измеряют как количество импульсов за единицу времени (обычно по 1 минуте).

Все счетчики имеют верхний предел измерения, после которого их точность падает, так как счетчик не успевает регистрировать — "захлебывается". Для сцинтилляционных счетчиков — это активность на уровне 106÷107 расп./мин. Некоторые типы счетчиков имеют встроенную блокировку и отказываются считать образцы, активность которых превышает установленную для данной модели. Оптимальная активность образца для точного измерения 104÷106 расп./мин.

Проводя количественные измерения, например, определяя концентрацию радионуклида в растворе, всегда делайте хотя бы 2, а лучше 3 измерения независимых аликвот и активность определяйте как среднюю из 2 — 3 измерений. Затраты времени на "лишние" процедуры будут с лихвой компенсированы отсечением случайных "выбросов". Разброс в измерениях, особенно у начинающих исследователей, может достигать 200% и более, хотя в норме не должен превышать обычную ошибку рутинного отбора аликвот.

Ни один измерительный прибор не регистрирует 100% всех "распадов" (decompositions) в измеряемом образце. Эффективность счета — это коэффициент, который связывает зарегистрированные прибором импульсы (counts) и реальные распады (decompositions). Поэтому для любого измерения распады/мин. (dpm — decompositions per min.) больше импульсов/мин. (cpm — counts per min.). Правда, для большинства радионуклидов, применяемых в life science, эффективность жидкостного сцинтилляционного счета составляет более 90%. Однако, тритий удается измерять с эффективность не более 50÷60%. Обычно эффективность счета для каждого радионуклида указывается в технической документации к прибору, и долгое время негласное соревнование между фирмами за более высокую эффективность счета трития было чуть ли не главным двигателем технического прогресса в этой области.

Все измерительные приборы имеют собственный "фон" — регистрируют какое-то количество импульсов без источника ионизирующего излучения (радиоактивного препарата). Природа фона различна: космическое излучение, электронный шум, содержание природных радионуклидов в помещении, где установлена измерительная аппаратура и т.д. Поэтому минимально достоверная величина активности, измеряемая прибором, увязывается с фоном и обычно принимается равной трехкратному превышению фона данного прибора. Если в вашем "эпохальном" эксперименте активность "главного" образца едва-едва превышает фон, попытайтесь увеличить время измерения (можно до 20 мин.) — тогда достоверность измерения возрастёт.

В большинстве случаев в life science абсолютные измерения активности не нужны, и гораздо важнее получить информацию об относительной активности образцов: распределение активности по гелю, хроматографической пластинке или по элюированным с колонки продуктам; доля субстрата, превратившегося в продукт под действием фермента; доля лиганда, связанного с рецептором; детекция продуктов метаболизма соединения, меченного радионуклидом, и другие аналогичные задачи. Поэтому очень важно, чтобы условия приготовления и измерения образцов в конкретном эксперименте были одинаковыми, тогда абсолютные погрешности в измерениях не окажут существенного влияния на биологические результаты.
   Наиболее ярко эту относительность измерений иллюстрирует широкое использование минимониторов — приборов, предназначенных для определения загрязнения поверхностей рабочих столов, одежды и т.д. Небольшие карманные приборы, имеющие ионизационный счетчик (обычно это ионизационная камера или счетчик Гейгера), оказались очень удобными для детекции меченного фосфором-32 фрагмента ДНК в агарозном геле или меченного йодом-125 белка в ПААГ и т.п. Некоторые ухитряются по показаниям такого прибора оценивать включение меченых предшественников биосинтеза в биополимеры после разделения продуктов реакции, используют мониторы для измерения активности образцов на фильтрах, кусках фильтровальной или хроматографической бумаги и даже в пробирках. Это удобно и полезно для качественных и полуколичественных оценок, но следует помнить , что приборные ошибки в таких измерениях могут быть очень значительными и достигать 200—300%. 

Жидкостные сцинтилляционные счетчики уже многие годы остаются главным инструментом для количественного измерения радионуклидов в life science. Несмотря на разнообразие конструкций, с точки зрения пользователя, все они измеряют активность образцов, помещенных в специальный стеклянный или пластиковый флакон и заполненный жидким сцинтиллятором. Поскольку измерение активности сводится к подсчету вспышек света, жидкость во флаконе должна быть прозрачная для счета и гомогенная по составу. Все отклонения от этого требования снижают эффективность счета, причем иногда существенно. Образование осадка или двухфазной несмешивающейся жидкой системы, наличие образцов биологических тканей или фильтровальных материалов — все эти факторы снижают эффективность счета. То же самое касается добавок многих химических веществ: кислот, щелочей, концентрированных растворов сахаров, солей, мочевины и многое другое. Особенно это касается измерений трития, где разница в эффективности счета для гомогенного, почти идеального, образца и образца, нанесенного на хроматографический сорбент, может быть в 10÷30 раз и даже больше. Это необходимо учитывать, если при составлении баланса по активности вдруг куда-то исчезнет часть радиоактивного материала или откуда-то внезапно появится "лишнее".

Составы сцинтилляторов весьма разнообразны и фирмы, производящие сцинтилляционные коктейли, часто не раскрывают их состав. Классический (едва ли не самым первый) жидкий сцинтиллятор — это толуольный раствор 2,5-дифенилоксазола (РРО) с добавкой 1,4-ди-[2-фенил-(5-окзазолил)]-бензола (РОРОР). Состав: 4 г РРО и 0,2 г РОРОР на 1 л толуола. Не вдаваясь в подробности, следует подчеркнуть, что это — неводная система, а водные растворы считать в таком сцинтилляторе не принято. Для измерения водных проб к такому сцинтиллятору добавляют тритон Х-100 до 30% по объему.

Другим вариантом "водолюбивого" сцинтиллятора является диоксановый: 60 г нафталина, 4 г РРО, 0,2 г РОРОР, 200 мл спирта и до 1 л диоксан марки "сцинтиляционный". Впрочем, большинство исследователей сегодня успешно пользуются готовыми фирменными коктейлями, справедливо не задумываясь над их составом.

Важными источниками ошибок для жидкостного сцинтилляционного счета являются "засветка" сцинтилляционной жидкости и электризация счетных флаконов. Оба эффекта легко нейтрализуются во времени (не спешите сразу считать, дайте пробам постоять в темном пространстве прибора несколько минут), кроме того, электризация почему-то чаще проявляется на стеклянных флаконах, и реже — на одноразовых пластиковых.

Внедрение в технологию биоскрининга радиометрических методов анализа подвигло разработчиков на создание высокопроизводительных сцинтилляционных счетчиков для измерения активности в планшетах. Для радиоактивных изотопов фосфора прибор используется в модификации с внешним твердым сцинтиллятором, который и является детектором. Для трития твердый сцинтиллятор добавляют прямо в лунку планшета в виде специальных бусинок и, так как эти бусинки являются одновременно компонентом биохимической реакции, то связанный с "бусами" меченый тритием лиганд считается сцинтиллятором, а не связанный, находящийся в растворе, — не считается. С радиохимической точки зрения эффективность счета в таких измерениях очень низкая, но для биоскрининга важно относительное распределение меченых соединений в системе "связанный-несвязанный", а высокая производительность и простота операций оправдывают колоссальные затраты на реализацию таких методов.



2.3. Иммиджеры

Очень полезной и эффективной оказалась "электронная авторадиография", возникшая сравнительно недавно, как результат развития микроэлектроники и компьютерной техники.

Фосфоимиджер — прибор для "электронной авторадиографии" фосфора-32. Кассета с многократно используемым экраном экспонируется с плоским образцом: гелем, хроматографической пластинкой и т.п. Затем экран помещается в прибор, в котором с помощью лазерного сканирования определяется местоположение и активность радиоактивного материала, экспонировавшегося с экраном.

Другая вариация на эту тему — это использование газопроточных счетчиков для "электронной авторадиографии". Представьте себе щетку для одежды, каждый волосок которой диаметром 0,2 мм является индивидуальным газопроточным счетчиком. Если вы совместите такую "щетку" общим размером 18 х 24 см с исследуемым плоским образцом, то на экране компьютера в реальном времени вы сможете наблюдать количественную картинку распределения "радиоактивных веществ" на плоскости вашего образца. Разные модификации такого прибора позволяют работать практически со всеми радионуклидами, которые применяются в life science.

Эффективность счета в этих приборах, конечно, не может быть высокой, однако для практической работы в life science этот недостаток с лихвой компенсируется быстротой и удобством "электронной авторадиографии", а также возможностью получения результата сразу в электронном виде.



3. Классификация и номенклатура

Все радиоактивные источники с технологической точки зрения делятся на закрытые и открытые. Закрытые источники — это радиоактивные препараты, помещенные в специальную защитную герметичную упаковку (как правило стальную), — предназначены для работ без вскрытия защитной оболочки. 

В молекулярно-биологических и биохимических исследованиях используют открытые источники — твердые, жидкие или газообразные радиоактивные вещества или их растворы. Практически все радиоактивные препараты, применяемые в life science — это растворы соединений, меченных радиоактивными изотопами. 

Для обозначения конкретного изотопа (в том числе и радиоактивного), согласно правилам номенклатуры, перед химическим символом элемента ставится надстрочечное число, обозначающее массу изотопа. Например, 14С — изотоп углерода с массой 14. В литературе допускается полное написание химического элемента и его массы через дефис, например, углерод-14. Обратите внимание, что пишется 14С, а произносится обычно С-14, т.е. для любого изотопа при написании первым всегда указывается массовое число изотопа над строкой, а затем символ химического элемента, а произносят наоборот: сначала элемент, затем масса изотопа.

Соединения, меченные радиоактивными изотопами, делят на две группы веществ. Во-первых, это конкретные химические соединения, у которых один атом (или несколько) заменён на атом радиоактивного изотопа того же элемента, т.е. химически такое соединение идентично "немеченому". Во-вторых, это молекулы соединений, модифицированные с помощью радиоактивного фрагмента (или дополнительного радиоактивного атома), которые отличаются от исходного немеченого соединения. К последнему случаю относятся всевозможные конъюгаты и модификации биологических макромолекул с неопределенным местоположением радиоактивного атома, например, молекула иммуноглобулина с введенным изотопом радиоактивного йода-125. Более подробно об этом ниже.

Для обозначения меченых соединений первой группы принято в обычное химическое наименование молекулы вставлять в квадратных скобках наименование изотопа, которым мечено соединение, и его место в молекуле перед названием части молекулы, содержащей меченый атом. В качестве примера ниже приведены наименования тимидин-5'-трифосфата, меченного различными радионуклидами и в разных положениях:

[6-3H] тимидин-5' трифосфат

[метил-3H] тимидин-5' трифосфат

[U-3H] тимидин-5' трифосфат

[5'-3H] тимидин-5' трифосфат

[6,2',3'-3H] тимидин-5' трифосфат

[2-14С] тимидин-5' трифосфат

[U-14С] тимидин-5' трифосфат

тимидин -5' [α-32P] трифосфат

тимидин -5' [γ-32P] трифосфат

В примерах 3 и 7 место радиоактивного атома в молекуле обозначено U — это означает, что точное место радиоактивного атома неизвестно и, возможно, речь идет о равномерно меченой молекуле. Обычно такое бывает, если способ получения соединения заключался в выращивании микроорганизма на среде, обогащённой целевым изотопом, с последующим выделением нужного соединения из клеточного лизата. Подробнее методы получения меченых соединений обсуждаются в других разделах. В примерах 8 и 9 α и γ — это не тип радиоактивного распада, а местоположение радиоактивных атомов фосфора-32 в трифосфатной группе.

Для наименования второй группы соединений обозначение радионуклида в квадратных скобках выносят перед наименованием молекулы: [125I]-альбумин — альбумин, меченный йодом-125 или [метил -3H]-альбумин — альбумин, меченный тритием за счет метилирования молекулы [3H]-метильной группой йодистого метила.



4. Основные радионуклиды в life science

Список радиоактивных изотопов, которые используются в life science, вообще крайне ограничен самой природой. В состав органических соединений входят водород, углерод, кислород, азот, а также гораздо реже фосфор и сера. Следовательно, для получения немодифицированных меченых соединений круг возможных радионуклидов ограничен этими биогенными элементами. Их характеристики приведены в таблице 1.



Радионуклид

Период полураспада

Удельная активность 100% изотопа

Тип распада

Энергия(max) [MeV]





[mCi/mmol]

[Бк/моль]





3H (тритий)

12.43 года

29.05

1,11x1015

β

0.0185

14C

5730 лет

0,062

2,3х1012

β

0.156

32P

14.3 дней

9104

0,33х1018

β

1.709

33P

25.4 дней

5138

0,19х1018

β

0.249

35S

87.4 дней

1491

0.5х1017

β

0.167

125I

60 дней

2167

0,8х1017

e.c.

0.25





К сожалению, радиоактивные изотопы кислорода и азота имеют совершенно неприемлемый для работы в life science период полураспада — от нескольких минут до миллисекунд. Такие ультра короткоживущие изотопы (УКЖ) уже применяются в медицине и технике, однако их использование в физико-химической биологии весьма проблематично.

Перечень радионуклидов, которые могут использоваться (и используются) для получения модифицированных молекул, может быть существенно расширен. Такие модифицированные молекулы часто используются не только в life science, но и в медицине (как для диагностики, так и для терапии). Весьма популярны для медико-биологических работ радионуклиды технеция, хрома и других. В этом материале не будут рассматриваться медицинские аспекты применения меченых соединений, поэтому сосредоточимся на использовании радионуклидов, приведенных в таблице 1.

Следует заметить, что все радионуклиды из таблицы 1 являются β-излучателями, кроме 125I, который "затесался" в этот список скорее в знак "особых заслуг", о которых ниже будет отдельная глава. На самом деле 125I для меченых соединений практически не используется, так как в живых организмах особого разнообразия молекул, содержащих йод, не наблюдается.

Вообще, "идеальный радионуклид" для life science должен отвечать следующим критериям: 

Элемент должен входить в состав всех органических молекул. Это понятно, так как делает возможным введение "меченого атома" в любую молекулу.

Период полураспада "идеального радионуклида" 10÷100 дней. Это будет соответствовать теоретической молярной активности в диапазоне 1018÷1017 Бк/моль и сможет обеспечить высокую чувствительность метода.

Чистый β-излучатель с максимальной энергией излучения не более 0,4 Мэв.Это позволяет сравнительно просто детектировать радионуклид и в тоже время сохраняет высокое разрешение методов, связанных с авторадиографической детекцией меченых продуктов.

К сожалению, ни один из приведенных в таблице радионуклидов не соответствует "идеалу". Тритий и углерод имеют слишком большой период полураспада, т.е. низкую молярную активность (особенно, углерод), а очень низкая энергия излучения трития сильно осложняет его детекцию и радиометрию. Весьма удобные ядерно-физические характеристики радиоактивных изотопов фосфора и серы не могут компенсировать ограниченность распространения этих элементов в органических молекулах. Поэтому выбор радионуклида, который предполагается использовать для исследования, приходится делать с учетом разных факторов, которые подробно разбираются ниже.

Все приведенные в таблице радионуклиды — искусственные, реакторные изотопы. В природе существуют радиоактивные изотопы 3H и 14C, но их содержание очень низкое, и препаративное выделение таких изотопов как сырья для синтеза меченых соединений является задачей с экономической точки зрения абсолютно разорительной. Кратко способы получения радионуклидов из таблицы 1 будут сообщены в соответствующих разделах. 



5. Технические характеристики меченых соединений

Все препараты меченых соединений, которые используются в life science, имеют технические характеристики, подробно указанные фирмой-производителем в паспорте (сертификате) и кратко — на флаконе с препаратом. Ниже подробно разбираются термины технических характеристик и их значение.



5.1. Радионуклидная чистота [ % ]

Это характеристика радиоизотопной чистоты препарата. Для большинства радионуклидов, применяемых в life science, не очень важна. Примеси других радионуклидов в тритиевых или 35S соединениях отсутствуют. Однако, для соединений, меченных фосфором-33, это важнейшая характеристика, т.к. часто наличие примеси фосфора-32 более 2÷3% делает препарат фосфора-33 весьма сомнительным по качеству с точки зрения многих методик.

Иногда фирмы-производители искусственно "подогревают" интерес биохимиков к препаратам с очень высокой радионуклидной чистотой. Например, у йода много радиоактивных изотопов со своими индивидуальными ядерно-физическими характеристиками. Самый популярный в life science радиоизотоп йода — 125I. Фирма "Амершам" (Amersham) очень гордится тем, что предлагает исследователям 125I с очень высокой радионуклидной чистотой — содержание примесного 126I менее 0,01%. В то же время, практически для всех исследований в life science, включая радиоиммуноанализ, эта характеристика не является важной, и содержание других радиоактивных изотопов йода в целевом 125I может быть 0,1% и даже 1% без какого-либо ущерба для биологического осмысления полученных результатов.



5.2. Радиохимическая чистота [ % ]

Радиохимическая чистота (РХЧ) — это содержание основного вещества, которое определяется обычно хроматографически (ВЭЖХ или ТСХ) в двух разных системах (условиях). Как правило, РХЧ не ниже 95%. Для большинства исследователей в life science РХЧ начинает представлять интерес, когда они "угробили" эксперимент и пытаются понять почему это произошло. 



5.3. Объемная активность [МБк/мл (мКи/мл)]

Иногда объемную активность называют концентрацией радиоактивности (radioactive concentration), что вполне отражает суть. На все производимые меченые соединения в паспорте (сертификате) обязательно указывается дата паспортизации и "reference data" — дата, на которую дается значение объемной активности. Большинство препаратов для life science, особенно соединения, меченные фосфором-32 или 33, имеют высокую объемную активность, и перепроверять (перемерять) заново величину, указанную в паспорте, просто жалко — слишком большой расход материала. Так что исследователи просто рассчитывают необходимую им для работы активность, исходя их данных паспорта с учетом периода полураспада используемого радионуклида. Естественно, что учет распада радионуклида проводится для короткоживущих радиоактивных изотопов: фосфора, серы и йода, а для трития, и тем более для 14С этого не делают. 



5.4. Молярная активность [Бк/моль (Ки/ммоль)]

Молярная активность — это активность одного моля вещества, содержащего какой-то радионуклид. Устаревшие единицы измерения Ки/ммоль по-прежнему используются и даже чаще, чем современные Бк/моль. Это просто удобнее, т.к. величина высокой молярной активности (например, фосфора-32), выраженная в Бк/моль, часто вызывает у биологов панику. Сравните: 5000 Ки/ммоль равно 1,85х1017 Бк/моль.

В зарубежной научной литературе чаще используется термин "специфическая активность" (specific activity), который является синонимом молярной активности.

В русскоязычной литературе существует термин "удельная активность" — активность одного грамма (иногда микрограмма) вещества, содержащего радионуклид. Обычно такая характеристика дается соединениям, молекулярный вес которых не определен или не известен. Например, препараты биополимеров (ДНК, РНК, белков) обычно характеризуют удельной активностью — активностью одного микрограмма вещества. В англоязычной литературе термин "специфическая активность" (specific activity) означает и молярную, и удельную активность.

Молярная активность — важнейшая характеристика меченого соединения, причем по нескольким причинам.

Во-первых, вы можете оценить долю собственно меченых соединений в препарате, предложенном вам для работы. Например, если препарат L-[35S]-метионина имеет молярную активность 300 Ки/ммоль, то, учитывая теоретическую молярную активность (1491 Ки/ммоль) для серы-35, нетрудно подсчитать, что в препарате только пятая часть молекул содержит изотоп 35S (300 : 1491 = 1/5), а остальные — "холодные" молекулы — не содержат радиоактивных атомов. Во-вторых, можно подсчитать молярную концентрацию меченого препарата. Для этого надо разделить объемную активность препарата (Ки/мл) на его молярную активность (Ки/ммоль) и получить концентрацию вещества в растворе в ммоль/мл (моль/л). Только будьте внимательны к единицам и множителям, чтобы не разделить объемную активность в мКи/мл на молярную активность в Бк/моль (или наоборот).

В-третьих, вы можете оценить предельно достижимую для вашего препарата чувствительность обнаружения соединения. Так, если ваш препарат [γ-32P] ATP имеет молярную активность 1000 Ки/ммоль, то, учитывая границу достоверной количественной регистрации фосфора-32 в 10-10 Ки, вы сможете определить 10-10 / 103= 10-13 ммоль, т.е. 10-16 моль вещества. К сожалению, эта замечательная чувствительность на практике часто остается недостижимой, т.к. в количественных измерениях в life science обычно "биологический фон" эксперимента гораздо выше физического или приборного. Это подробно будет обсуждаться на примере использования соединений, меченных фосфором-32.

Следует подчеркнуть один очень интересный феномен, связанный с молярной активностью. Если молярная активность меченого препарата близка к теоретически возможной (более 90% от максимальной), то, независимо от периода полураспада радионуклида, величина молярной активности препарата будет практически постоянной. Это хорошо видно на примере 33Р-ортофосфорной кислоты с молярной активностью около 5000 Ки/ммоль. Действительно, согласно схеме радиоактивного распада фосфор-33 превращается в серу-33 и, следовательно, вместе с убыванием количества радиоактивных атомов (распадом) убывает (уменьшается) количество молекул фосфорной кислоты, т.к. из фосфорной H333РO4 образуется серная (H233SO4).



6. Радионуклид 3Н (тритий)

Тритий — радиоактивный изотоп водорода, "чистый" β-излучатель, который легко нарабатывается в реакторе в значительном количестве.

Схема распада: 3Н —> e + 3He 

Для life science тритий является самым востребованным и удобным радионуклидом по нескольким соображениям. Во-первых, практически любую органическую молекулу можно пометить тритием (лишь бы содержала водород). Во-вторых, тритий легко вводится в разные соединения, и химия этих процессов разработана лучше, чем для любого другого радионуклида. В-третьих, тритий — это самый дешевый радионуклид, из используемых в life science. Есть прекрасная подробная монография по синтезу соединений, меченных тритием, (В.П. Шевченко, И.Ю. Нагаев, Н.Ф. Мясоедов, "Меченные тритием липофильные соединения" Москва, изд. "Наука" 2003г.), поэтому я только кратко перечислю основные методы получения 3Н-соединений.

Химический синтез гидрированием 3Н2 ненасыщенных связей, дегалоидирование и восстановление гидроксильных или карбонильных соединений.

Каталитический или термоактивированный водородный обмен.

Модификация соединений с помощью 3Н-метильных или 3Н-ацетильных групп.

Гидрирование Li[B3H4] или Li[Al3H4]

Введение 3Н за счет тритиевой воды (гидролиз или обмен).

Ферментативный синтез из 3Н-меченых предшественников.

Можно добавить биосинтез — выращивание микроорганизмов на среде, содержащей 3Н-предшественник (например, [метил-3H] тимидин, для получения меченой ДНК), с последующим выделением целевого соединения. Однако, этот способ достаточно специфический и обычно применяется только в лабораторной практике для получения биополимеров.

Исторически так сложилось, что меченые тритием компоненты нуклеиновых кислот и аминокислоты стали инструментами для нескольких поколений ученых. Позднее к тритию добавился фосфор-32 (и фосфор-33) для нуклеиновых кислот и сера-35 для белков, и доля работ с тритием в этих направлениях снизилась.

Для исследователей липидов, простагландинов, гормонов, углеводов, антибиотиков, витаминов и многих других классов соединений, тритий — главный (часто единственно доступный) инструмент повышения чувствительности методов. Это же касается исследований рецепторов, модуляторов и вообще "сигнальных" систем организмов. Поэтому тритий, не имеющий пока особых альтернатив, по-прежнему, остается основным "рабочим" радионуклидом в life science.

Главным недостатком трития является трудность его детекции и количественного измерения из-за слишком "слабого" β-излучения. Наиболее эффективный способ измерения — жидкостной сцинтилляционый счет, о котором более подробно дана информация в разделе 2.2. Особо следует подчеркнуть, что именно для трития снижение эффективности счета ("гашение") играет существенную роль в количественных измерениях. 

Авторадиография тритиевых соединений тоже имеет ряд специфических особенностей. Прямая детекция β-излучения трития фоточувствительным материалом — процесс очень долгий и используется редко. Зато была предложена оригинальная модификация, согласно которой образец, содержащий тритий, обрабатывается сцинтилляционными веществами, и авторадиография превращается в своеобразную "автофлюорографию". Для пластин ТСХ — это опрыскивание раствором РРО, который уже упоминался в разделе "жидкостной сцинтилляционный счет". После высушивания такая пластинка экспонируется с рентгеновской плёнкой, и далее — как обычно.

Для ПААГ предложена процедура пропитки геля тем же РРО. Сначала приходится заместить воду в геле на диметилсульфоксид (DMSO), т.к. РРО нерастворим в воде. Затем гель пропитывают раствором РРО в DMSO, после чего обратно замещают DMSO на воду (РРО выпадает в геле в осадок и гель становиться белым). После всех этих процедур гель высушивают и экспонируют с рентгеновской пленкой. "Занудность" этих операций окупается сторицей — получается возможность детекции продуктов, меченных тритием, (например пептидов, меченных 3Н-лейцином) сразу после электрофореза в ПААГ.

Еще одна "деликатная" сторона использования соединений, меченных тритием, — это химическая стабильность таких соединений. Как ни странно на первый взгляд, но радиолиз — химическое разрушение молекул под действием ионизирующего излучения — именно для соединений трития играет весьма существенную роль. Это важно помнить, т.к. большой период полураспада (12 лет) якобы позволяет использовать синтезированные вещества в течение месяцев ( а иногда и лет) с момента паспортизации. Здесь надо быть очень осторожным, т.к. часто при неправильных условиях хранения вместо целевого соединения остается сложнейшая смесь продуктов радиолиза, где нужного соединения не более трети. Типичная ошибка — хранение водного раствора тритиевого соединения в замороженном виде. В замороженном виде высокомеченные тритием соединения "рассыпаются" гораздо быстрее, чем в растворе. Поэтому для длительного хранения меченых тритием соединений при -20°С обязательно добавляют спирт или другой "антифриз", препятствующий замерзанию раствора.

С химической стабильностью соединений трития связана еще одна проблема. Устойчивость химической связи водорода (любого изотопа водорода) с другими атомами в молекуле зависит от природы этой связи. Соответственно, возможность обмена водорода в молекуле меченого соединения с растворителем, например с водой, обязательно надо учитывать. Водород карбоксильной группы в воде за счет электролитической диссоциации обменивается мгновенно, а водород в алкильном или арильном фрагменте молекулы обменивается очень трудно — при нормальных условиях обмена нет. Между этими "крайними" примерами находится огромное многообразие молекул с разной способностью к "водородному обмену", и для разных биохимических процессов вопрос о стабильности тритиевой метки может быть или чрезвычайно актуальным или совершенно несущественным.



7. Радионуклид 14C

Радионуклид 14C получают облучением нитрида алюминия по реакции: 

14N + 0n —> 14C + 1p 

в виде 14C-карбида. Из него 14C выделяют в виде 14CО2, который обычно поглощают Ba(OH)2, и полученный 14C-карбонат является основным радиоактивным сырьем для всех синтезов 14C-соединений. Всё обилие 14C-меченых соединений в каталогах разных фирм-производителей синтезируется двумя путями: 

Биосинтез. В питательную среду к микроорганизмам (обычно это водоросли типа хлореллы) добавляют 14CО2 в качестве единственного источника углерода. После выращивания из биомассы выделяют равномерно меченые 14C-соединения. Таким путем получают аминокислоты, нуклеозиды, сахара, липидные компоненты и другие природные соединения. Иногда 14C-биомассу водорослей используют как источник углерода (своего рода меченый пептон) для выращивания штамма-продуцента какого-нибудь важного соединений. 

Химический синтез. Синтез всего многообразия органических веществ из карбоната — классическая задача органической химии. Знаменитые цепочки превращений органических соединений (кошмар многих поколений студентов и школьников) в полной мере реализованы в синтезе 14C-соединений. Все органические соединения, которые не удается получить биосинтезом, синтезируют химически. 

Схема распада углерода-14: 14C —> 14N + e. Хотя с детекцией 14C особых проблем не возникает, применение 14C-соединений в life science крайне ограничено. Это связано с очень низкой молярной активностью 14C-соединений, и даже кратно меченые молекулы не меняют ситуацию радикально. Обычно молярная активность 14C-соединений не превышает 20÷50 мКи/ммоль, (у соединений трития почти в 1000 раз выше, а у фосфора-32 или 33 еще в 100 раз выше) и, следовательно, по чувствительности методы с использованием 14C-соединений значительно уступают методам, в которых используют 3Н-соединения. На сегодняшний день 14C-соединения прочно удерживают за собой только одну "нишу" в life science — это изучение метаболизма новых лекарственных (или косметических) препаратов. Для изучения деградации, накопления в органах, скорости и путей выведения, биодоступности и прочих аспектов метаболизма равномерно меченые 14C-соединения остаются востребованными, несмотря на очень высокую стоимость и трудоемкость синтеза.



8. Радионуклиды 32P и 33P

Радионуклиды 32P и 33P — очень удобны для life science, но их применение ограничено природой, т.к. фосфор в природных органических соединениях присутствует гораздо реже, чем водород, углерод или кислород.

Получение радиоактивных изотопов фосфора (32Р и 33Р) с технической точки зрения одинаково: облучение элементарной серы особой чистоты в ядерном реакторе.

Однако, с экономической точки зрения разница колоссальная. Дело в том, что 32Р получают по реакции 32S + 0n —> 32P + 1p в виде 32P-ортофосфата. Стартовый материал мишени — природная элементарная сера, содержащая более 92% стабильного изотопа 32S. Изотоп 33Р получают по реакции 33S + 0n —> 33P + 1p также в виде 33P-ортофосфата. Но мишенью для этой реакции служит изотоп 33S, содержание которого в природе составляет доли процента. Для получения 33Р высокого качества необходимо использовать для облучения только 33S с обогащением не ниже 98,5÷99,0%. Это сразу существенно увеличивает стоимость продукта, т.к. стоимость обогащенной серы-33 больше природной серы примерно на 6 порядков (в миллион раз). Поэтому соединения фосфора-33 всегда будут дороже аналогичных соединений, меченных фосфором-32.

Схемы распада радионуклидов фосфора : 32P —> 32S + e и 33P —> 33S + e 

Исходным радиоактивным сырьем для получения соединений, меченных радиоактивными изотопами фосфора, всегда является ортофосфорная кислота (32Р или 33Р соответственно). Так как химия и биохимия 32Р и 33Р абсолютно одинаковы, в дальнейшем речь пойдет о фосфоре-32, с учетом того, что все это распространяется и на фосфор-33. В особых случаях, когда необходимо, будут отмечаться различия. Собственно сама 32Р-орто-фосфорная кислота в life science используется редко. Обычно это выращивание микроорганизмов (бактерий или дрожжей) или культуры клеток в среде, содержащей 32Р-ортофосфат. Полученную меченую биомассу отделяют от культуральной жидкости, а затем исследуют. Несколько замечаний по этому процессу.

Исходная 32Р-ортофосфорная кислота без носителя (этот термин означает, что в препарат не добавляли специально нерадиоактивную ортофосфорную кислоту) имеет молярную активность не менее 5000 Ки/ммоль, и, соответственно, концентрация собственно фосфата в среде только за счет радиоактивного фосфора будет не выше 10-8 М. Для биологических (микробиологических) работ такая концентрация фосфата в среде слишком низкая — клетки будут "считать", что фосфора нет вообще. Поэтому в культуральную среду обязательно добавляется "холодный" фосфат в концентрации, необходимой для усваивания. Обычно это не ниже 10-4 М. Не пытайтесь "включить" радиоактивный фосфат в культуру клеток без "холодного" носителя. Часть радиоактивного фосфата просто сорбируется на поверхности посуды или клеток, а включения в клеточный обмен не произойдет.

Оптимальная концентрация фосфата для таких экспериментов подбирается индивидуально для разных задач и видов клеток. "Переносить" данные по оптимальной концентрации с одного вида экспериментов (или клеток) на другой надо осторожно.

Основными соединениями фосфора-32, применяемыми в life science, являются нуклеозид-5'-трифосфаты, меченные в альфа или гамма положении. В конце 60-х — начале 80-х годов ХХ века было разработано несколько способов синтеза этих соединений, но после работы Джонсона и Валсеса, предложенный ими ферментативный способ стал рутиной как для лабораторного синтеза, так и для масштабного производства. Химические методы синтеза меченных фосфором-32 соединений используются, когда нет ферментативного пути, например для синтеза синтетических аналогов нуклеотидов.

Измерение активности радионуклидов 32Р и 33Р — операция достаточно простая — любой жидкостной сцинтилляционный β-счетчик считает 32Р и 33Р с эффективностью не ниже 90%. Для фосфора-32 использование сцинтиллятора совсем не обязательно. Обычно измерение фосфора-32 проводят за счет "свечения Черенкова" — эффекта, обусловленного взаимодействием высокоэнергетических электронов с окружающей средой. Не вдаваясь в физические аспекты Черенковского свечения, следует знать, что сцинтилляционные счетчики "считают" фосфор-32 без всякого сцинтиллятора с эффективностью около 30%. Черенковское свечение фосфора-32 можно легко увидеть. Нанесите на подложку (пластинку ТСХ или фильтровальную бумагу) 1 мкл раствора 32Р-ортофосфорной кислоты (или любого другого соединения фосфора-32) с активностью 50 мкКи (около 2МБк) и поместите подложку между плоскостями двух кусков обычного стекла, толщиной 4÷5 мм. В темноте (только без "красного" света) через 3÷5 мин. адаптации глаза будет хорошо видно зеленовато-голубое свечение пятна, соответствующего точке нанесения раствора на подложку. Не подносите такой источник близко к глазам — все прекрасно видно с расстояния 40÷60 см.

Весьма полезным для работы является возможность измерения фосфора-32 прямо в пластиковых пробирках, помещенных в стандартный сцинтилляционный флакон. На практике это означает, что вы можете измерять активность своего образца, например, вырезанный кусок из агарозного геля или пробирку с фракцией элюата хроматографического разделения, а затем использовать образец для дальнейшей работы. Такая особенность фосфора-32 является его важнейшим преимуществом перед другими β-радионуклидами, применяемыми в life science. Все остальные β-радионуклиды, приведенные выше в таблице 1, включая фосфор-33, требуют для измерения в сцинтилляционном счетчике прямого контакта с сцинтилляционной жидкостью, т.е. добавления образца прямо во флакон, содержащий сцинтиллятор. Естественно, после этого образец для дальнейшей работы теряется.

Среди радионуклидов, применяемых в life science, фосфор-32 является "рекордсменом" по чувствительности методик с его использованием. Однако, простой расчет чувствительности метода (поделите обычный предел обнаружения фосфора-32, т.е. около 3÷4 Бк, на максимальную молярную активность используемого соединения, т.е. около 2х1017 Бк/моль) показывает величину около 10-17 моля. К сожалению, это неправильно. Причина этого в высоком "биологическом" фоне. Например, при постановке ДНК-полимеразной реакции контрольная проба, в которую добавляют все компоненты реакции кроме фермента, также показывает некоторое "включение" радиоактивного фосфора в ДНК, на самом деле обусловленное просто неспецифической сорбцией радиоактивного предшественника биосинтеза. Такая неспецифическая сорбция есть всегда в любом биохимическом эксперименте и фактически чувствительность метода будет определяться величиной этого "биологического" фона. Например, в реакцию добавлено 0,1 МБк [α-32P] dNТР (это примерно 2х106 срм по Черенкову), ферментативое включение в ДНК около 30%, а неспецифическая сорбция — фон — составляет около 0,1%, т.е. 2х103 срм. Граница достоверности определяемой величины будет определяться именно неспецифической сорбцией (в этом примере 2х103 срм), которая обычно гораздо выше фона измерительной аппаратуры. В этом примере фон 2000 срм, и, следовательно, достоверная величина измеряемого эффекта должна быть не ниже 6000 срм, что в 30 раз снижает чувствительность по сравнению с "идеальной" расчетной.

Использование фофора-32, а позднее и фосфора-33, начиналось еще в 50-х годах ХХ века, однако после разработки методов секвенирования ДНК с помощью фосфора-32 спрос на соединения, меченные фосфором-32, достиг просто огромных величин. В "пике" потребления нуклеотиды, меченные фосфором-32, производились в мире в объеме несколько десятков кюри ежемесячно (это десятки тысяч фасовок каждый месяц), и только флюоресцентные методы секвенирования спустили потребление радиоактивного фосфора с заоблачных высот к нынешнему состоянию.

Традиционно меченые фосфором нуклеотиды используются по нескольким направлениям:

Введение в ДНК (РНК) за счет нуклеозид-5' — [α-32Р]-трифосфатов и изучение соответствующих ферментов.

Введение в олигонуклеотиды 32Р фосфорилированием 5'-конца с помощью [γ-32P] ATP и полинуклеотидкиназы.

Фосфорилирование белков протеинкиназами с помощью [γ-32P] ATP.

Наиболее востребованным меченым соединением фосфора-32 является аденозин-5'-[γ-32P] трифосфат, который обычно сокращенно обозначают [γ-32P] АТР. Это вполне объяснимо, т.к. кроме широко известной методики введения 32Р-метки на 5'-конец олигонуклеотида с помощью Т4 полинуклеотидкиназы, [γ-32P] АТР используют для изучения различных фосфотрансфераз (киназ), в том числе и для биоскрининга химических библиотек протеин-киназными тестами. Нуклеозид-5'трифосфаты, меченные фосфором-32 в α-положении, сокращенно обозначают [α-32Р] NТР или [α-32Р] dNТР (рибо- или 2'-дезоксирибонуклеотиды соответственно) и используют, в основном, для введения "метки" в нуклеиновые кислоты с помощью РНК- или ДНК-полимераз. Естественно, сюда же примыкают исследования биосинтеза нуклеиновых кислот и их ферментативного аппарата. Технология введения 32Р-метки в нуклеиновые кислоты подробно изложена в "классике методов" ( Маниатис Т. Фрич Э. Самбрук Дж. "Молекулярное клонирование" М. "Мир" 1984 г.). Поэтому я отмечу только некоторые характерные для начинающих ошибки.

Вполне естественное стремление каждого исследователя получить меченый препарат ДНК (например ДНК-зонд для гибридизации) с максимальной удельной активностью имеет свои ограничения. Считается, что препарат ДНК, имеющий удельную активность не менее 108 срм на мкг ДНК, "пометился" хорошо и может дать при гибридизации чувствительность, близкую к максимальной. Если удельная активность препарата 107÷108 срм на мкг ДНК, то результат получится весьма посредственный, а если синтезированный вами препарат имеет удельную 106 срм на мкг ДНК, то вы что-то сделали неправильно — такой препарат к работе мало пригоден.

Еще одна характерная ошибка начинающих исследователей — попытка синтеза высокомеченного ДНК-зонда с помощью замены нерадиоактивных dNTP на [α-32Р] dNТР. К сожалению, попытки использовать для синтеза меченой ДНК 2÷3, а иногда и всех 4-х меченых [α-32Р] dNТР вместо одного, заранее обречены. В лучшем случае использование двух меченых [α-32Р] dNТР даст почти такой же результат (как правило, все-таки немного ниже) как использование одного [α-32Р] dNТР. В остальных вариантах, независимо от конкретных нуклеотидов, удельная активность такой 32Р-ДНК будет существенно ниже. Это обусловлено двумя причинами. Во-первых, оптимальная концентрация dNTP для синтеза меченой ДНК не ниже 10 мкМ (часто делают ещё выше), а молярная концентрация меченого [α-32Р] dNТР в реакции — примерно 0,2÷0,4 мкМ. Замена "холодного" dNTP на [α-32Р] dNТР снижает концентрацию в 20÷40 раз. Следовательно, замена всех dNTP на радиоактивные [α-32Р] dNТР снижает концентрацию всех предшественников биосинтеза до величин ниже Км (константы Михаэлиса) для каждого dNТР, что в данном случае почти останавливает реакцию. Во-вторых, химическая чистота "холодных" dNTP, как правило, выше [α-32Р] dNТР и, соответственно, количество примесей, способных ингибировать ДНК-полимеразу, возрастает, если заменять все dNTP на соответствующие [α-32Р] dNТР.

Аналогичная ситуация наблюдается и при использовании [α-32Р] NТР в синтезе РНК. Так как величина Км большинства РНК-полимераз находится в интервале 10÷100 мкМ, то использовать [α-32Р] NТР без добавления в реакцию "холодного" трифосфата до приемлемой концентрации бессмысленно — реакция не идет. Более того, РНК-полимеразы более "капризны", чем ДНК-полимеразы, и требования к химической чистоте всех ингредиентов, в том числе и меченых предшественников биосинтеза РНК, еще более жесткие.

Все фирмы-производители нуклеозид-5'трифосфатов, меченых фосфором-32 (или 33), поставляют эти соединения с добавками, снижающими химическую деструкцию веществ, обусловленную воздействием ионизирующего излучения, и в криостатах с сухим льдом (при -70°С). Такие добавки, "продлевающие" жизнь меченым соединениям, получили название радиопротекторов — по аналогии с веществами, снижающими вредное воздействие ионизирующего излучения на живые организмы. Каждый производитель использует свои, как правило, запатентованные радиопротекторы, продлевающие сроки использования меченых препаратов. Часто такие радиопротекторы (или их комбинации) окрашены в яркие цвета, что создает определенное удобство для работы — хорошо видно даже минимальный объем окрашенного меченого соединения. Естественно, что важнейшее требование к радиопротектору для меченых соединений в life science — это нетоксичность или "безвредность" самого радиопротектора и продуктов его радиолиза для тех биологических и ферментативных систем, в которых используется данный меченый препарат. Иными словами, радиопротектор не должен участвовать в биологическом процессе, который вы собираетесь изучать с помощью меченого соединения, содержащего радиопротектор. Соединения, меченные фосфором-32 или фосфором-33, которые производили и производят в России, окрашены за счет радиопротектора в ярко-красный цвет. При длительном хранении цвет будет "желтеть". Пожелтевший препарат лучше выбросить сразу — весь радиопротектор в таком препарате уже разрушился, и ничего хорошего от его радиоактивных остатков ждать не следует.

Вообще, саморадиолиз соединений, меченных фосфором-32 или фосфором-33, очень неудобное для работы явление, и его надо учитывать. Без радиопротекторов меченные фосфором-32 соединения в концентрированном растворе (более 15 мКи/мл) могут храниться очень недолго, а в сухом виде оставлять их дольше нескольких часов не следует, т.к. скорость химических превращений, под действием ионизирующего излучения в этом случае очень высокая.

Основное отличие фосфора-33 от фосфора-32 заключается в энергии β-излучения этих радионуклидов, т.к. различие в периоде полураспада менее чем в 2 раза несущественно. При этом преимущество более слабого излучения фосфора-33 (кроме психологического комфорта) проявляется только при необходимости авторадиографии с высоким разрешением близко расположенных меченых продуктов, например, автограф геля после электрофоретического разделения меченых фрагментов нуклеиовых кислот. Действительно, эффективность "ручного радиоактивного" сиквенса определялась разрешающей способностью электрофоретического разделения продуктов реакции терминации синтеза ДНК (в методе Сэнгера) или фрагментов химического расщепления [5'-32P]-одноцепочечной ДНК (по Максаму-Гилберту). Для 32Р-меченых фрагментов с одного геля квалифицированный специалист мог "прочитать" 350÷400 нуклеотидов. "Зубры" секвенирования ДНК в Москве и Новосибирске довели эту величину до 700 нуклеотидов. Однажды, автору этого обзора в новосибирском Академгородке с гордостью продемонстрировали автограф геля, с которого удалось "прочитать" почти 750 нуклеотидов. В научном фольклоре встречались даже более высокие величины (вплоть до 1000), однако, таких задокументированных результатов я не встречал. Переход на фосфор-33 только за счет более мягкого β-излучения сразу увеличивал разрешение в 1,5÷2 раза и, следовательно, повышал производительность труда при сиквенировании ДНК. Впрочем, автоматические секвенаторы ДНК, использующие флюоресцентную метку, полностью прекратили эту гонку за производительностью "ручного сиквенса" с использованием радиоактивных изотопов.



9. Радионуклид 35S

Наработка радионуклида серы-35 проводится в ректоре облучением KCl или NaCl по реакции 35Cl + 0n —> 35S + 1p в виде 35S-сульфата. Некоторые специфические методики приготовления образцов KCl для облучения позволяют получать 35S в виде элементарной серы. Схема распада серы-35: 35S —> 35Cl + e . Удобный период полураспада и вполне приемлемая энергия β-излучения делают серу-35 очень популярным радионуклидом в своей "нише", вызывая досаду малой распространённостью соединений серы в живых организмах.

В life science сера-35 используется, в основном, для введения "метки" в белок за счет 35S-метионина или (реже) 35S-цистеина. Аминокислоты, меченные серой-35, получают биосинтезом, выращивая бактериальную биомассу на среде, содержащей 35S-сульфат. После кислотного гидролиза 35S-биомассы из белкового гидролизата выделяют аминокислоты. Иногда фирмы-производители вместо индивидуальных 35S-аминокислот предлагают просто 35S-белковый гидролизат, который может быть использован для выращивания культуры клеток в 35S питательной среде.

В 80-х годах ХХ-века на пике бума секвенирования ДНК с помощью радиоактивных изотопов фирма Амершам предложила использовать вместо нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32 (или 33), нуклеозид-5'-трифосфаты, меченные серой-35 по фосфатной группе, т.е. 35S- тиофосфаты. Однако, несмотря на широкую рекламу, большого распространения этот вариант секвенирования ДНК так и не получил. Во-первых, работа с радиоизотопами фосфора была привычней, а при массовой работе и регулярных поставках "свежей метки" надежней. Во-вторых, появившиеся вскоре флюоресцентные автоматические секвенаторы сделали это направление просто ненужным. Тем не менее, в арсенале life science остались нуклеозид-5' - [γ-35S] тиотрифосфаты и нуклеозид-5' - [α-35S] тиотрифосфаты для решения специальных задач, например, энзимологии протеинкиназ или энзимологии биосинтеза (деградации, коррекции) нуклеиновых кислот.

Главным недостатком соединений, меченных серой-35, которые используются в life science, является их низкая химическая стабильность. При том, что процессы радиолиза для этих соединений менее критичны, чем для трития или фосфора-32, 35S аминокислоты и тиотрифосфаты легко окисляются, поэтому их важно хранить при -20°С (лучше -70°С) и контролировать чистоту перед использованием.



10. Радионуклид 125I

Среди радиоактивных изотопов йода самым популярным для исследовательских работ в life science является 125I. Это реакторный изотоп, получающийся из стабильного изотопа ксенон-124. Среди радионуклидов в таблице, приведенной в разделе 4, йод-125 единственный γ-излучатель, хотя тип распада (точнее ядерного превращения) — электронный захват, в результате которого йод превращается в теллур с выделением γ-кванта. Йод-125 — очень удобный для детекции радионуклид. Во-первых, его можно измерять сцинтилляционным γ-счетчиком (не путайте с жидкостным сцинтилляционным β-счетчиком), и весь радиоиммуноанализ в пробирочном варианте был построен на этих измерениях. Во-вторых, йод-125 прекрасно детектируется авторадиографически на рентгеновской пленке или "электронной авторадиографией" с помощью имиджера. Наконец, йод-125 можно измерять на жидкостном сцинтилляционном β-счетчике во флаконе с сцинтиллятором, как тритиевый образец, за счет электронов Оже.

Несмотря на широкое применение йода-125 в life science, собственно 125I-меченные соединения почти не используются. Правильнее говорить об использовании йода-125 для "мечения" биологических макромолекул, т.е. получения меченых соединений второй группы — модифицированных соединений (см. раздел 3). Поэтому самым востребованным соединением йода-125 в life science является раствор йодистого калия — K125I — исходный материал для введения радионуклида в нужную молекулу.

Основным "потребителем" йода-125 являются исследования белков и пептидов. Традиционно йодирование белков проводят в нейтральной или слабокислой среде в присутствии окислителя, который окисляет йодид, обеспечивая его реакцию с аминокислотными остатками белка. Легче всего йод присоединяется по остаткам тирозина и гораздо хуже — по остаткам фенилаланина, триптофана или гистидина. Йодированный тирозиновый остаток практически не меняет физико-химические и иммунологические свойства белка, что очень важно для дальнейшего использования меченого препарата. В качестве окислителя использовались самые различные агенты: хлорамин Т, "йодоген", перекись водорода с лактопероксидазой и даже катод полярографа (при электрохимическом окислении). Каждый метод имеет свои особенности, но общий недостаток для всех — это окисление, которое для многих белков приводит к потере (или изменениям) ими своих свойств и функций. Даже кратковременное воздействие окислителя (реакция с хлорамином Т длится обычно 30÷40 сек.) для многих белков недопустимо. Поэтому был предложен реагент Болтона-Хантера — реагент, ацилирующий свободные аминогруппы белков. Такая модификация белка проходит без окисления, однако ацилирование аминогруппы меняет физико-химические характеристики исходного белка и может значительно изменить его иммунологические свойства. Особенно это касается небольших молекул, например, пептидов, где количество антигенных детерминант ограничено размерами самой молекулы.

Тем не менее, йодирование белков и пептидов йодом-125 широко используется для различных исследований, особенно иммунологических, рецепторных, гормональных и др. Такие 125I-меченные пептиды также используются для исследований, связанных с распределением пептидов по органам и тканям экспериментальных животных и их фармакокинетике.

Были предприняты попытки использовать 125I для исследований нуклеиновых кислот. Действительно, можно "пройодировать" ДНК, используя хлорид таллия и K125I, для введения "метки" по остаткам цитидина (образуется 5-йодцитидин). Можно вводить 125I в ДНК за счет ферментативного синтеза, используя ДНК-полимеразу и [5-125I] цитидин-5' трифосфат - 125I-аналог dCTP. Тем не менее, широкого распространения эти методики не получили, так как особых преимуществ у 125I перед 32Р нет. Кроме того, высокомеченная 125I ДНК гораздо быстрее деградирует под действием продуктов радиолиза и электронов Оже, чем ДНК, меченная фосфором-32 или фосфором-33.



11. Основы радиационной безопасности

Всем, кто работает с источниками ионизирующего излучения, в том числе с радиоактивными веществами, приходится получать допуск к работе: проходить медкомиссию и сдавать экзамен по знанию норм и правил радиационной безопасности. Возможно, самым ярким примером тесного переплетения фундаментальных академических исследований и утилитарно-прикладных разработок являются правила работы с источниками ионизирующего излучения. Вся информация для проведения работ с радиоактивными веществами изложена в двух основных документах: "Нормы радиационной безопасности" (НРБ) и "Основные санитарные правила" (ОСП). Эти скучные строгие документы существуют уже более 30-ти лет. Регулярно (примерно раз в 10 лет) информация в этих документах обновляется в соответствии с развитием радиобиологических и биофизических исследований, вносятся изменения, иногда весьма серьезные, но общая структура документов не меняется. НРБ устанавливает нормативы по всем параметрам, связанным с радиоактивностью: дозы и уровни облучения, содержание различных радионуклидов в воде, воздухе и т.д., уровни загрязнения радионуклидами и пр. Следует подчеркнуть, что это не военно-технический или медико-терапевтический документ, а общие нормы, установленные для всех организаций и лиц, постоянно работающих с источниками ионизирующего излучения, в том числе с радиоактивными веществами.

Хотя в НРБ и ОСП даны кратко определения основных терминов и понятий, ниже я попытаюсь упрощенно систематизировать эту информацию для начинающих работать с радиоактивными веществами.

Экспозиционная доза — энергетическая характеристика γ- и рентгеновского излучения, которая оценивается по эффекту ионизации сухого атмосферного воздуха. Единица экспозиционной дозы рентген - поток γ- или рентгеновского излучения, который в 1 см3 сухого воздуха образует 2х109 пар ионов. Эта самая популярная единица измерения в дозиметрии, хотя и является устаревшей и внесистемной.

Поглощенная доза — собственно это и является характеристикой опасности излучения, так как определяется как отношение поглощенной энергии ионизирующего излучения к массе облученного вещества. Единицы поглощенной дозы — рад и грей. Рад — это внесистемная (но популярная) единица — rad (radiation absorbed dose) — равна 100 эрг/г. Грей — единица в системе СИ, равная 1 дж/кг. Значит, 1 Гр (грей) равен 100 рад.

Эквивалентная доза — произведение поглощенной дозы излучения на некий коэффициент качества излучения, учитывающий неблагоприятные биологические последствия. Единицы измерения — бэр и зиверт. Бэр - биологический эквивалент рентгена (иногда говорят рада) — доза любого вида ионизирующего излучения, производящая такое же воздействие на биологические объекты как доза γ- или рентгеновского излучения в 1 Р (рентген). В системе СИ принят зиверт — эквивалентная доза, соответствующая поглощенной доза в 1 Гр (грей) с коэффициентом качества 1.

Эффективная доза — величина, используемая для оценки меры риска возникновения отдаленных последствий облучения всего тела человека и его отдельных органов и тканей с учетом их радиочувствительности.

Вся эта "голубая муть" на дозовую тему для нормальной работы, конечно, не нужна. Тем более для работы в life science. Дозиметрические приборы (точнее, приборы радиометрического контроля) меряют или мощность экспозиционной дозы γ- или рентгеновского излучения (в миллирентгенах в час), или поток β-частиц с поверхности (количество частиц в сек. на 1 см2). Собственно поглощенная работником доза обычно измеряется специальными индивидуальными дозиметрами разных систем: ионизационными — типа ДП-22В, фотокасетными (количественная авторадиография) и даже современными термолюминисцентными. Однако, все замеры всеми типами дозиметров всегда показывали, что для работающих в life science, поглощенные дозы бесконечно малы и не могут быть достоверно измеряны существующими приборами.

Порядок работы с радиоактивными веществами определен в ОСП. Последняя редакция этого документа называется "Основные санитарные правила обеспечения радиационной безопасности" (ОСПОРБ-99), и название полностью соответствует содержанию. В ОСПОРБ-99 не только подробно изложен порядок работы с любыми радионуклидами, но и порядок их получения (передачи) от других организации, порядок списания источников и сдачи радиоактивных отходов и многое другое. Согласно классификации работ с радиоактивными веществами в этом документе в зависимости от уровня опасности, все исследования с радиоактивными изотопами в life science относятся к третьему (самому низкому) классу радиационной опасности. Эта "классность" работ определяется, во-первых, количеством радионуклида на рабочем месте, а во-вторых, "радиотоксичностью" радионуклида и характером работ по его использованию. Радиотоксичность — понятие, введенное для оценки вреда, который может нанести радионуклид человеку, и зависит от типа распада, энергии излучения, периода полураспада и способности радионуклида усваиваться организмом. Все радионуклиды разбиты на четыре группы радиотоксичности: А (самая опасная), Б, В, и Г (наименее опасная). Из радионуклидов, указанных в таблице 1, самым "вредным" является фосфор-32 — группа Б.

Опасность радионуклида при внешнем облучении определяется характером и энергией излучения. Для всех "мягких" β-излучателей (для life science радионуклидов из таблицы 1: тритий, углеров-14, фосфор-33, и сера-35) опасность минимальна. Электронный поток задерживается листом плотной бумаги, резиновыми хирургическими перчатками и т.д. Сложнее с фосфором-32. Кроме излучения высоко энергетических электронов для фосфора-32 характерно "тормозное излучение" — вторичное электромагнитное излучение, возникающее при торможении электрона в плотной среде. По своей природе такое тормозное излучение одинаково с рентгеновским и его проникающая способность очень высокая. Именно по этой причине для защиты от излучения фосфора-32 применяются дополнительны средства защиты: защитные экраны со свинцовыми стеклами и свинцовые контейнеры для препаратов. Аналогичная защита требуется и для работы с йодом-125. Гамма-излучение 125I экранировать легкой защитой из оргстекла не удается.

Существуют три защитных фактора от воздействия ионизирующего излучения на организм.

Расстояние. Чем дальше вы от источника излучения, тем лучше. Это не только вывод народной мудрости — "держаться подальше", но и научно обоснованная реальность, т.к. интенсивность излучения убывает пропорционально квадрату расстояния. Поэтому старайтесь не брать радиоактивные препараты руками (даже в перчатках), а пользуйтесь пинцетами, захватами и прочими дистанционными приспособлениями, если такая возможность есть. 

Время. Чем меньше время контакта с радиоактивным веществом, тем меньше вред воздействия. Поэтому готовьте заранее все реактивы, приборы, расчеты и продумывайте свои действия, чтобы сократить время непосредственного контакта с радиоактивным веществом до минимального.

Защитная среда (экранирование). Собственно защита с помощью различных контейнеров, стенок, экранов, защитной спецодежды, очков и т.д. Почему-то этому фактору уделяют самое большое внимание, хотя первый и второй гораздо важнее и проще.

Несколько сложнее ситуация с внутренним облучением. Понятно, что внутреннее облучение возможно только при попадании радионуклида вовнутрь вместе с пищей, водой или при вдохе. Так как такое попадание обычно не планируется, то и оценить количество радиоактивного материала и, соответственно, дозу внутреннего облучения очень сложно. Особенно это проблематично для слабых β-излучателей трития или углерода-14. Поэтому главным способом снижения внутреннего облучения персонала, работающего с радионуклидами, является аккуратность в работе с открытыми источниками и соблюдение санитарных и гигиенических норм и правил.

Вообще, вопреки разным слухам, количество радиоактивного материала, которое используется для life science, не может нанести серьезного ущерба для здоровья человека, работающего непосредственно с препаратом, и тем более для его будущих детей. Даже если в полном безумии кто-то проглотит 1÷2 полных фасовки [γ-32P] ATP (40 МБк), то ущерб будет выражаться, как материальные потери от нецелевого использования препарата, но не от физического вреда здоровью проглотившего. За многолетнюю работу многочисленных научных сотрудников в биологических НИИ в СССР, а затем в России, не зафиксировано ни одного случая отрицательного воздействия радиоактивных препаратов на здоровье работающего сотрудника. Слишком маленькие количества радиоактивных препаратов применяют для работы по III-му классу работ с радиоактивными веществами. Однако, это не относится к работам на предприятиях, производящих радионуклиды, и к другим организациям, где работают с радионуклидами по I или II классу работ.