Клеточная инженерия 3

План:

Введение………………………………………………………………………3

Культивирование клеток растений…………………………………..4

Каллюсные структуры

Суспензионная культура

Культура протопластов.

Меристематическая культура.

Культура пыльников.

Регенерация

Клеточная инженерия в нанобиологии. ……………………………10	

Клеточная инженерия приморского края…………………………..14

Вывод………………………………………………………………………...17

Список литературы………………………………………………………….18



































Введение.

Большое значение в биотехнологии приобретают методы, получившие название клеточной инженерии. Предварительно клетки искусственно выделяют из организма и переносят на специально созданные питательные среды, где они в стерильных условиях продолжают жить и размножаться. Такие клеточные культуры (или культура тканей) могут служить для продукции ценных веществ. Например, культура клеток растения женьшень продуцирует лекарственное вещество, как и целое растение.

Клеточные культуры используют и для гибридизации клеток. Применяя  некоторые  специальные  приемы,   можно  объединить клетки разного происхождения организмов, обычная гибридизация которых половым путем невозможна. Метод клеточной инженерии   открывает   принципиально   новый   способ   создания гибридов на основе соединения в единую систему не половых, а соматических клеток. Уже получены гибридные клетки и организмы картофеля и томатов, яблони и вишни и некоторые другие. Открываются огромные перспективы для создания человеком новых форм культурных растений.

У животных получение гибридных клеток также открывает новые перспективы, главным образом для медицины. Например, в культуре получены гибриды между раковыми клетками (обладающими способностью к неограниченному росту) и некоторыми клетками кровилимфоцитами. Последние вырабатывают вещества, обусловливающие иммунитет (невосприимчивость) к инфекционным, в том числе вирусным, заболеваниям. Используя такие гибридные клетки, можно получать ценные лекарственные вещества, повышающие устойчивость организма к инфекциям.









Культивирование клеток растений

Полемика, вызванная успешным клонированием ряда животных, почему-то оставила в тени успехи, связанные с клонированием растений. Ведь уже достаточно давно мы имеем дело либо непосредственно с растениями, разводимыми на основе клонирования, либо с веществами, полученными из культивируемых растительных клеток и тканей. Так, с помощью культивирования меристемы, гарантирующего безвирусность растения, были выведены всюду продаваемые гвоздики, хризантемы, герберы и другие декоративные растения. Также можно купить и цветки экзотических орхидных растений, производство клонов которых уже имеет промышленную основу. Некоторые сорта клубники, малины, цитрусовых выведены с использованием техники клонирования. Прежде для выведения нового сорта требовалось 10-30 лет, теперь же, благодаря применению методов культивирования тканей этот период сокращен до нескольких месяцев. Весьма перспективными признаются работы, связанные с производством на основе культивирования тканей растений лекарственных и технических веществ, которые невозможно получить путем синтеза. Так, уже получают подобным способом из клеточных структур барбариса изохинолиновый алкалоид берберин, а из женьшеня - гинсеносид.

Основу культивирования растительных клеток и тканей составляют содержащаяся в каждой клетке информация о всех свойствах и возможностях организма и способность клетки к самостоятельному обмену веществ. Для культивирования подходят различные органы растений. Как правило, используют молодые листья и осевые побеги верхних мутовок, а также столоны, клубни, пыльники, кончики корней, пазушные почки и другие части растения. Меристемные ткани верхушек ростовых побегов и корней имеют особое значение для получения безвирусных клонов. Отобранный материал стерилизуется различными веществами. При этом необходимо соблюсти баланс времени, чтобы, с одной стороны, его продолжительность обеспечила уничтожение микроорганизмов, с другой - не повредила бы клетки самой растительной ткани. Подготовка материала к культивированию завершается многократным обмывом стерильной водой, после чего его помещают в стерильную рабочую банку на питательную среду и растят обязательно в стерильных условиях.

Свойство питательной среды определяются поставленными целями культивирования растительного материала, поскольку именно от заданных условий зависит конечный продукт. Питательная среда бывает жидкой или твердой. Она, как правило, состоит из большого числа синтетических веществ с заданной концентрацией. Поскольку изолированные растительные клетки и ткани большей частью являются гетеротрофными, в ней должен содержаться органически связанный углерод, источником которого обычно служат глюкоза или сахароза. Азот добавляется в форме нитратов, используемых клетками с помощью нитратредуктазы. Применяют также фосфор, калий, кальций, магний, сульфаты. Необходимым компонентом являются витамины, в особенности группы В (В1, В2, В6), миоинозит, биотин, а также аминокислоты и органические соли. К безусловно необходимым микроэлементам относятся бор, марганец, иод, медь, кобальт, молибден. Так, недостаток марганца препятствует синтезу белков, уменьшает количество РНК и приводит к увеличению содержания свободных аминокислот. Железо имеет значение для деления ядра и для деятельности дыхательных ферментов. Наконец, необходимо наличие в питательной среде ряда фитогормонов. Манипулируя концентрациями различных веществ в питательных средах, кислотностью последних, температурой, освещенностью и влажностью в камерах для культивирования, можно получить растения и вещества с требуемыми свойствами. В зависимости от используемых растительных клеток и тканей, способов культивирования различают следующие основные типы структур: каллюсные, суспензионные, протопластов, меристематические, пыльников.





Каллюсные структуры

Для каллюсных структур исходным материалом является каллюс - это ткань, образующаяся у растений на местах ранений и способствующая их заживлению. Она состоит из более или менее однородных паренхимных клеток, начало которым дает раневая меристема. Элементы каллюса мало дифференцированы, однако вблизи его поверхности наблюдается рост, обусловленный активностью меристематических клеток. Впоследствии в каллюсе возможна дифференцировка его элементов и образование флоэмы, ксилемы и других тканей. Наружные клетки каллюса опробковевают. 

Для культивирования на выбранном органе делают надрез, на всей поверхности которого развивается ткань, состоящая из неорганизованно растущих клеток. Эта образовавшаяся ткань и культивируется в заданных условиях. В зависимости от вида растения и поставленной цели предварительно необходимо установить состав питательных сред и концентрации фитогормонов, требуемых для оптимального роста. Каллюсы могут выглядеть очень различно. Они бывают рыхлыми или плотными. Окраска каллюса позволяет судить об образовании вторичных веществ. Если каллюс содержать в полной темноте, он беловато-желтый. На свету он образует хлорофилл и становится зеленым. Красный свет указывает на наличие антоциана и бетациана. Чтобы ослабить или устранить эти эффекты, в питательную среду добавляют поливинилпирролидон, глутатион или аскорбиновую кислоту. Коричневые клетки образуются перед отмиранием, поэтому такую ткань необходимо поместить в свежую среду. При длительном культивировании каллюсы могут терять свой морфогенетический потенциал. После нескольких смен питательных сред и при добавлении ростовых гормонов каллюс дифференцирует и регенерирует, образует осевые побеги, корни и, наконец, все растение целиком, способное к размножению и выращиванию в грунте. Однако большей частью каллюсы используются в качестве исходного материала для клеточного или суспензионного культивирования.

Суспензионная культура

Для суспензионных культур исходным материалом могут быть кака изолированные целые клетки выбранного органа растения, так и измельченный каллюс. Образовавшиеся клетки помещают в жидкую питательную среду и культивируют при постояном перемешивании. Рост суспензионной культуры происходит во многих случаях существенно быстрее, чем каллюсной культуры, поскольку скопления клеток поглощают питательные вещества значительно большей общей поверхностью, а у каллюса это происходит лишь в той его части, которая лежит на субстрате. При этом происходит деление клеток, новые клетки не отделяются, и их скопление увеличивается. С помощью особых приемов суспензионную культуру можно перенести на твердую питательную среду. Здесь из клеток или комплексов клеток может образоваться способный к жизни каллюс. В суспензии могут возникнуть также и зародыши, которы после их переноса на агар образуют новое растение.

Культура протопластов.

Культуры протопластов получают главным образом из приготовленной из мезофила суспензии, обрабатывая ее ферментами, разрушающими клеточные стенки. В результате этого может произойти присоединение чужих органелл, а также чужой ДНК, которая встраивается в генетический материал ядра, что может выразиться в экспрессивности. Поскольку поверхности протопластов имеют отрицательный заряд, необходимо нейтрализовать их отталкивание друг от друга, после чего они соединяются. После слияния происходит регенерация клеточной стенки. Она образуется менее чем за сутки, после чего клетки начинают делиться и регенерируют новые растения. Во многих случаях удавались слияния протопластов разных родительских растений и последующая регенерация через культуру каллюса нового растения с заданными свойствами. Оказалось возможным скрещивать представителей разных видов и родов, что прежде не удавалось. Слиянием протопластов вырастили, например, гибрид картофеля и томата, "томофель". Этот способ имеет коммерческое значение при выведении новых сортов соевых бобов, цитрусовых, сахарного тростника, кукурузы, пшеницы и картофеля. Получен также гибрид двух видов дурмана, содержащий на 25% больше алкалоида тропана в сравнении с родительскими растениями.

Меристематическая культура.

Для меристематической культуры используют меристему - образовательную ткань растений, долго сохраняющую способность к делению и образованию новых клеток и отличающуюся высокой метаболической активностью. Для культивирования изолируют конусы нарастания побегов, корней, а также пазушные почки. Меристематические культуры более известны в садоводстве, так как они дают возможность получить безвирусные клоны. Из этого можно сделать вывод, что распределение вирусов в различных частях растения неравномерное, а меристема их лишена. Из безвирусной меристемы в большом количестве могут регенерировать генетически идентичные безвирусные растения. Этот способ используют для выведения сортов картофеля, винограда, а также декоративных растений и в лесоводстве. 

Культура пыльников.

Культура пыльников используется для получения галлоидных растений. Как правило, растение является диплоидным, т.е. в его клетках содержится два гомологичных набора хромосом. Только зародышевые клетки являются гаплоидными. Для получения гаплоидной культуры наиболее удобны незрелые пыльники, в которых пыльцевые зерна находятся еще в стадии, предшествующей первому делению микроспор на вегетативное и генеративное зерна. После переноса стерильных пыльников на питательную среду пыльцевые клетки начинают делиться. Развивается промежуточный каллюс или сразу образуется гаплоидный зародыш, который позднее дифференцируется в гаплоидное растение. Такие гаплоидные растения стерильны, но они могут перейти в диплоиды после воздействия колхицина или слияния протопластов. Так образуются плодовитые гомозиготные чистые линии растений, имеющие большое значение для селекции, поскольку в последующих поколениях всегда встречаются те же заданные признаки. Благодаря этому методу выведены новые сорта зерновых и табака, а также получены многочисленные лекарственные растения с улучшенными свойствами.

Регенерация

Регенерация - явление восстановления целого организма из его части. При культивировании регенерация может происходить разными путями: прямая регенерация из культур меристемы, верхушечных побегов, пазушных почек и узлов, причем дифференциация управляется фитогормонами, и косвенная, с промежуточной стадией каллюса. В последнем случае возможны также возможны два пути: при органогенезе определенными концентрациями и соотношениями фитогормонов вызывают образование придаточных побегов и корней; при соматическом эмбриогенезе в каллюсе образуются зародыши, из которых вырастает растение, затем переносимое в грунт.

































Клеточная инженерия в нанобиологии.

Второе направление развития нанобиотехнологии связано с клеточной инженерией. Культура растительных клеток может служить, прежде всего, источником свойственных данному растению вторичных продуктов. Пользуясь способностью клеток растений превращаться на специальных средах в сформированное растение, клеточные культуры применяют для получения безвирусных растений, пытаются проводить селекцию форм  нужными свойствами. Клетки животных более требовательны к условиям культивирования, им необходимы дорогостоящие среды. Все более широкое применение находят так называемые гибридомы, служащие источником белков, необходимых для диагностики и лечения болезней человека, животных и растений. 

В настоящее время нанобиотехнология становится основой крупного промышленного производства. Исследования по генной инженерии и получению новых материалов все более актуальны. Это, например, относится к применению растениеводческой продукции в качестве биотоплива. Предполагается, что в ближайшем будущем разработки нанобиоиндустрии будут востребованы еще больше. 

В связи с ростом населения в мире сельскому хозяйству предстоит не только увеличить продуктивность, но и уменьшить потери урожая в процессе уборки, послеуборочной обработки и хранения. Нанобиотехнология может внести существенный вклад в улучшения питания, сопротивляемости культур неблагоприятным погодным условиям, а также болезням и вредителям. 

 Свойства промышленного и сельскохозяйственного сырья на наноразмерном уровне позволят существенно сократить энергоемкость производства единицы продукции, повысить надежность, сроки службы, автоматизировать и внедрить компьютерную технологию в установки и приборы экспресс-контроля и определения качества пищевой продукции, лечения и удлинения продуктивной деятельности биообъектов.

В настоящее время большой интерес представляют так называемые  наноэлектротехнологии, т.е. биологические и физиологические процессы, осуществленные с помощью наноэлектрочастиц (электронов, протонов, ионов, фотонов) на уровне живых клеток и микроорганизмов. 

Под термином «наноэлектротехнология» понимаются электрофизические воздействия оптического излучения ультрафиолетового (УФ) диапазона на сельскохозяйственные объекты и их составные элементы на уровне биоклеток и их структур. 

 К УФ излучению относится часть оптической области спектра с длинами волн от 11 до 400 нм, которые обладают наибольшей энергетической активностью по сравнению с видимыми и инфракрасным (ИК) излучением. Исследованиями воздействия УФ излучения на организм животных и растений установлено выраженное разностороннее биологическое действие как естественного, так и искусственного излучения. 

Фитобиологические реакции независимо от того, в каком объекте они протекают, разделяются на две группы: функционально-физиологические и деструктивно-одифицирующие.

В научных коллективах агропромышленного профиля разработано и обосновано боле 110 энергосберегающих наноэлектротехнологий, в том числе с использованием  электромагнитных полей сверхвысоких частот (ЭМП СВЧ), оптических и ультразвуковых излучений, электрических зарядов и импульсов, элекроаэрозолей и ионов. 

Интерес к нанотехнологиям обусловлен тем, что при воздействии на наноуровне материалы и объекты изменяют свою структуру и преобретают некоторые превосходные свойства, включая химические, электрические и оптические. Перспективными направлениями применения нанотехнологий и наноматериалов в сельском хозяйстве могут быть следующие. 

Нанороботы (сравнимы по размерам с кровяными клетками или даже меньше их) способны исследовать каждый капилляр. Они поддаются управлению при проведении диагностических операций. Путем применения высокоскоростных беспроводных средств коммуникации нанороботы могут быть объединены в сеть с другими компьютерами, а также образовывать базы данных исследуемых объектов. 

Наноустройства, которые могут имплантироваться в растения, животные, позволяют получать и передавать в реальном времени данные о скорости роста и других физиологических характеристиках, обеспечивают определение структуры и продуктивности исследуемых объектов, состояния окружающей среды, а также уровней химических и физических рисков.

Ключевой особенностью биологических наноструктур является способность к распознаванию на молекулярном уровне, которая играет очень важную роль в процессах самосборки атомных и молекулярных структур. Процесс самосборки имеет две характерные особенности: молекулы обладают высокой аффинностью по отношению друг к другу, а в результате образования связей формируется структура с предсказуемыми свойствами. Ученые, которые стремятся создавать определенные наноструктуры, предпочли бы имитировать подобные механизмы сборки. Вместо того чтобы «спускаться» с макроскопического уровня, используя все более точные и дорогостоящие инструменты, удобнее было бы создавать наноконструкции «снизу вверх», начиная с химических систем.

Одно из преимуществ конструирования «снизу вверх» — огромное химическое разнообразие. Поскольку на поверхности компонентов клетки на единицу площади приходится множество функциональных групп, то в качестве строительного блока можно использовать всю эту сложную в химическом отношении поверхность. В принципе, возможно, менять положение и ориентацию такого блока. Конструирование «сверху вниз», напротив, основано на материалах с небольшим химическим разнообразием. Другое преимущество – значительные количества вещества, с которыми приходится иметь дело на химическом уровне. Всего 1 пмоль вещества содержит 1112 молекул. Компонент, который с наибольшим успехом применяется в экспериментах по имитации  биологической самосборки – ДНК. 

Обеспечение населения безопасными продуктами питания при минимальном загрязнении окружающей среды – основа выживания человечества. В этом аспекте роль нанотехнологий в сельском хозяйстве развитых и развивающихся стран, в том числе и Казахстана, вероятно, будет доминирующей.















































КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ PANAX GINSENG C.A.MEY

Флора Приморского края является богатейшим потенциальным источником традиционных и новых лекарственных средств растительного происхождения. По количеству уникальных лекарственных растений, неизвестных, или малоизвестных в нашей стране, но широко используемых за рубежом, Приморский край не имеет себе равных среди других районов России. Однако, как правило, эти растения представлены редкими или исчезающими видами, что не позволяет широко использовать их в медицине. 

В полной мере это относится и реликтовому дальневосточному растению - женьшеню настоящему (Panax ginseng C.A.Mey). 

Установлено, что биологически активными веществами женьшеня являются гинзенозиды, и главным образом, с этой группой веществ связаны целебные свойства женьшеня (Tanaka and Kasai, 1984). Доказано, что гинзенозиды оказывают сильное иммуностимулирующее, радиопротекторное, противоопухолевое, противовоспалительное, антиязвенное действие. Также эти вещества подавляют развитие тромбов, нормализуют кровяное давление, увеличивают продолжительность жизни нейронов коры головного мозга, положительно действуют на эндокринную систему и углеводный обмен. При применении препаратов женьшеня повышается работоспособность, замедляются процессы старения. Тем не менее, использование женьшеня в медицине ограничено низкими сырьевыми запасами природного растения. Исследованиями последних лет установлено, что генетические ресурсы дикорастущего женьшеня близки к истощению (Zhuravlev et al., 1996). 

Недостаток природного сырья можно преодолеть путем введения растительных клеток в культуру in vitro, т.е. в культуру клеток растущих вне организма на специально подобранных питательных средах. Введение в клеточную культуру ценных и редких растений решает одновременно две задачи: во-первых, создается возобновляемый источник сырья для выработки лекарственного препарата, во-вторых, создаются предпосылки для сохранения генофонда растения. Поэтому уже более 30 лет проводятся работы по созданию воспроизводимого биотехнологического источника гинзенозидов путем получения клеточных культур женьшеня, синтезирующих набор гинзенозидов в количествах и соотношениях, близких к нативному растению. В то же время большинство из полученных клеточных культур женьшеня отличаются от натуральных корней тем, что содержат не весь набор гинзенозидов, меньшим содержанием суммы гинзенозидов, соотношениями отдельных гинзенозидов. В настоящее время существует ряд методических приемов, направленных на активацию синтеза биологически активных веществ в культурах in vitro. 

В Биолого-почвенном институте ДВО РАН из различных органов растений женьшеня получены клеточные культуры (Журавлев и др. 1990; Булгаков и др., 1991), обладающие способностью к синтезу гинзенозидов. В 1992-1997 гг. нами впервые проведено сравнительное изучение эффективности различных путей регуляции синтеза гинзенозидов в полученных культурах. Увеличения выхода биологически активных веществ женьшеня удалось добиться посредством использования селекции, светового режима культивирования, биосинтетических предшественников гинзенозидов (мевалоновой кислоты и фарнезола) и определенных фитогормонов. Разработана схема комбинированной регуляции синтеза гинзенозидов путем изменения условий культивирования и состава сред в сочетании с методами генетической инженерии. Впервые предпринята работа по получению клеточных культур женьшеня, содержащих чужеродные гены и поиску гена ответственного за увеличение синтеза гинзенозидов. Применение методов генной инженерии позволило получить ряд высокопродуктивных трансгенных корневых культур женьшеня, обладающих способностью к стабильному синтезу целевых веществ в течение продолжительного культивирования, что делает эти культуры новым перспективным источником для выработки биологически активных веществ. Используя генетическую трансформацию геном rolC из Agrobacterium rhizogenes впервые удалось вызвать морфогенез (образование побегов и листьев) в клеточной культуре женьшеня. Установлено, что побеги и листья морфогенной культуры синтезируют гинзенозиды в количествах и соотношениях, свойственных надземной части плантационного растения.























































Вывод:

Подводя итог можно сказать, что клеточная инженерия – одно из наиболее важных направлений в биотехнологии. Она основана на использовании принципиально нового объекта – изолированной культуры клеток или тканей эукариотических организмов, а также на тотипотентности – уникальном свойстве растительных клеток. Применение этого объекта раскрыло большие возможности в решении глобальных теоретических и практических задач. В области фундаментальных наук стало осуществимым исследование таких сложных проблем, как взаимодействие клеток в тканях. Клеточная дифференцировка, морфогенез, реализация тотепотентности клеток, механизмы появления раковых клеток и др. при решении практических задач основное внимание уделяется вопросам селекции, получения значительных количеств биологически ценных метаболитов растительного происхождения, в частности более дешевых лекарств, а также выращивания оздоровленных безвирусных растений, их клонального размножения и др.































Список литературы:

«Основы биотехнологии» Егорова, Клунова, Живухина; М. 2003.

"Биология" - еженедельное приложение к газете "Первое сентября" (№21 1998)







2