Биологическая роль, структура и выделение митохондрий из печени крыс.

Биологическая роль, структура и выделение митохондрий из печени крыс. 

Содержание

1. Введение

История вопроса

Перспективы исследований

Биологическая роль митохондрий 

Ультраструктура митохондрий

Общие принципы организации 

Особенности строения мембраны митохондрий

Описание общих принципов различных методов выделения митохондрий 

  Гомогенизация материала

Механическая

На основе кавитации газов

Ультразвук 

  Разделение субклеточных компонентов

Центрифугирование

Разделение в двухфазной системе, содержащей два полимера

Электрофорез

Ферменты - маркеры митохондрий

Методики

Заключение

Список литературы



Введение

История вопроса.

Кёлликер одним из первых описал характерным образом ориентированные гранулы в саркоплазме поперечно-полосатой мышцы. Ему принадлежит так же честь первого выделения митохондрий из клеточных структур. В 1888 году он выделил эти гранулы из мышцы насекомых и показал, что они обладают мембраной и набухают в воде. Началом новой эры в цитологическом изучении митохондрий явилась работа Бенсли и Хэрра, которые предприняли попытку выделить митохондрий из взвеси разрушенных клеток печени, применив метод дифференциального центрифугирования. Из-за отсутствия подходящей среды для суспендирования и несовершенства метода центрифугирования Бенсли не удалось получить интактные митохондрий, но именно новаторская работа Бенсли определила слияние цитологических исследований митохондрий с исследованиями дыхания.

Перспективы исследований.

В настоящее время основная задача изучения митохондрий на молекулярном уровне сводится к выделению ферментативных компонентов окислительных циклов, определения их молекулярной структуры и механизма действия, анализу их участия в полиферментных системах в митохондриях и картированию их локализации на структурах митохондрий. То обстоятельство, что ферменты дыхательной цепи составляют более 25 % белка митохондриальных мембран заставляют рассматривать эти ферменты не только как функциональные, но и как структурные элементы митохондрии. 



Биологическая  роль митохондрий. 

На протяжении ста с лишним лет, т. е. со времени первых работ Кёлликера (1850), наблюдавшего гранулы в саркоплазме поперечнополосатых мышц, велись кропотливые морфологические исследования, которые постепенно подготавливали почву для всестороннего изучения природы митохондрий. Но только в 1949 г. Кеннеди и Ленинджер установили, что в митохондриях протекает цикл окислительного фосфорилирования, т.е. что митохондрий служат местом генерирования энергии. С этого момента начинается новая эра в изучении митохондрий — эра, в которой блистательные открытия следуют одно за другим. В короткий срок были открыты осмотическая, сократительная, регуляторная и генетическая функции митохондрий и найдены многие из тех молекулярных структур, которые служат первичным субстратом 'этих функций. Было показано также, что митохондрий обеспечивают интеграцию многочисленных процессов клеточного обмена. Эти исследования еще не, завершены, но они могут служить примером плодотворности нового подхода к изучению живого, того подхода, который отличает молекулярную биологию.

В развитии молекулярной биологии за последнее время наметился новый этап. До сих пор это были исследования главным образом, на уровне однородных молекул белков и нуклеиновых кислот, исследования, посвященные их структуре, функции и биосинтезу. Теперь же исследователь не довольствуется этим и переходит к изучению специфически организованных надмолекулярных комплексов, каковыми являются клеточные органеллы. Некоторые функции этих органелл также могут быть истолкованы на уровне индивидуальных молекул, например молекул отдельных ферментов. Но главная особенность клеточных органелл — это интеграция ферментативных процессов. Так, благодаря наличию в составе митохондрий различных белков, липидов, нуклеиновых кислот и углеводов, соединению их между собой и упорядоченному размещению в пространстве в виде трехслойных мембран эти образования приобретают свойства, которые исчезают при их расчленении на отдельные молекулы. Свойства эти: векторный характер действия митохондриальных ферментов (в отличие от скалярного, т. е. не зависящего от направления, действия растворимых ферментов), способность к непосредственному преобразованию энергии окисления в осмотическую и механическую энергию, способность к автономному синтезу белков и т. д. Каждое из этих свойств определяется не простой суммой реакций, катализируемых отдельными ферментами, а обусловлено взаимодействием точно ориентированных ферментных и неферментных макромолекул. Само собой разумеется, что глубокое исследование и познание природы клеточных органелл возможно лишь путем расчленения их на отдельные молекулы с последующей реконструкцией. 

Ультраструктура митохондрии

Общие принципы организации. 

Внутренне пространство митохондрии окружено двумя непрерывными системами мембран, каждая из которых представляет собой замкнутый мешок; эти мешки расположены так, что всю митохондрию можно представить себе, как мешок внутри мешка. Просвет внутреннего мешка не сообщается с пространством между двумя мембранами. Наружная мембрана гладкая, а внутренняя образует многочисленные впячивания, которые в самом простом случае имеют форму перегородок, но могут принимать крайне сложные очертания. Палад назвал эти впячивания митохондриальными кристами.  Другой характерный компонент структуры митохондрии - это матрикс, который заполняет просвет, окруженный внутренней мембраной.  Известно, что он содержит много белка и некоторое количество липидов; по-видимому, он обладает определенной организацией и более или менее жесткой структурой. Наконец, митохондрии, фиксированные осмием часто содержат в матриксе ряд мелких гранул. Число, диаметр и плотность этих внутримитохондриальных гранул изменяются в зависимости от состояния обмена веществ в тканях.

Особенности строения мембраны митохондрии. 

Так как наибольшее практическое значение представляют внутренние мембраны митохондрии, содержащие дыхательные ансамбли, имеет смысл более детально познакомиться с ультраструктурой митохондриальной мембраны. При детальном анализе было выявлено, что митохондриальные мембраны содержат 35 -40 % липидов, преимущественно фосфатидов, и 60 - 65 % белка. Небольшие различия, которые иногда наблюдаются обусловлены различными условиями получения при использовании различных физических и химических способов разрушения структуры митохондрии.

Митохондрии печени крысы содержат значительные количества фосфатидилэтаноламина, фосфатидилхолина, инозитфосфатидов, кардиолипина и фосфатидилсерина; содержание плазмалогена и сфингомиелина невелико, иногда они вовсе отсутствуют. Характерное содержание и количественное содержание липидов в митохондриальной мембране, вероятно обусловлены необходимостью поддержания термодинамически устойчивого двойного слоя липидов, образующего остов мембраны, который служит опорой для дыхательных ансамблей. По-видимому, большое значение имеет тот факт, что практически все липиды митохондриальной мембраны экстрагируются смесью хлороформ - метанол. Это указывает на наличие лишь незначительного числа ковалентных связей между липидами и белковыми элементами или даже на полное их отсутствие; этот факт свидетельствует о высокой степени стабилизации липидов и белков мембранных структурах. Крейн показал, что цитохром с соединяется с фосфатидилэтаноламином, образуя устойчивый комплекс. Возможно, что именно такое взаимодействие липид - белок совместно с гидрофобными связями и обеспечивает такую стабилизацию мембранной структуры. Криддл и сотрудники выделили мономерную форму, которую они назвали структурным белком митохондриальной мембраны. При нейтральном рН структурный белок находится в полимерной форме и не растворим в воде. Мономерная форма имеет молекулярный вес около 22000, но тенденция к полимеризации нарушает точность седиментационных и электрофоретических исследований. Структурный белок способен соединяться с чистыми цитохромами а, Ь, и ее образованием растворимых в воде комплексов в молярном отношении 1:1, причем условия этого взаимодействия для каждого случая различны. Предполагается, что в таких комплексах образуются преимущественно гидрофобные связи. Далее, оказалось, что структурный белок соединяется с фосфолипидами. Таким образом, структурный белок способен к взаимодействию с двумя другими основными молекулярными элементами мембраны - с переносчиками электронов и с фосфолипидами. Склонность цитохромов, флавопротеидов и структурного белка к существованию в мономерной и полимерной формах указывает на выраженную тенденцию этих молекул к образованию очень

устойчивых макромолекулярных ансамблей, имеющих пластинчатую структуру.

Так как для будущих исследований наибольший интерес представляет цитохром с, то следует уделить особое внимание именно этому ферменту.

Этот цитохром отличается от остальных тем, что он легко экстрагируется из митохондрий в растворимой форме с помощью кислот и нейтральных растворов солей. Молекулярный вес кристаллического фермента 12000, изоэлектрическая точка при высоком рН; в молекулу входит одна железопорфириновая группа, которая представлена производным протопорфирина и соединена (ковалентно) с двумя цистеиновыми остатками пептидной цепи, посредством двух тиоэфирных связей.

При рН 7,0 атомы железа в положениях 5 и 6, очевидно, координированы с остатками гистидина; при нейтральных значениях рН цитохром с не имеет тенденции реагировать с кислородом. Известно, что

третичная структура цитохрома с резко изменяется, как функция состояния окисления - восстановления.

Цитохром с восстанавливается тиолами, аскорбатом, хинолами, и восстановленными цитохромами b и с1, а восстановленный цитохром с окисляется феррицианидом, некоторыми красителями и цитохромом а.

Было показано, что в водных растворах цитохром с способен к полимеризации; удалось получить его димер и очистить так же тример и тетрамер. Вторичная и третичная структура цитохрома с изучается методом

рентгеноструктурного анализа. Цитохром с легко соединяется с липидами, в частности с фосфатидилэтаноламином он образует комплекс, названный липоцитохромом с.



Описание общих принципов различных методов выделения митохондрий.



Митохондрии и после выделения сохраняют свой вид, не смотря на то, что мембраны их несколько повреждаются и контуры сглаживаются. В сущности, в наше время их выделяют тем же самым способом, которым пользовался еще Варбург. Прежде всего ткани гомогенизируют, используя для этого изотонический или гипертонический раствор сахарозы (сахароза способствует сохранности митохондрий, стабилизируя митохондриальную мембрану). Затем методом дифференциального центрифугирования отделяют ядра и неразрушенные клетки, а полученную надосадочную жидкость вновь центрифугируют при более высоких скоростях. Митохондрий оседают при этом на дно, образуя плотный буроватый осадок. Промыв этот осадок несколько раз можно получить довольно чистую митохондриальную фракцию. Таким путем очищенные фракции митохондрий были выделены из самых различных клеток животного и растительного происхождения и даже из некоторых простейших.

В более ранних исследованиях митохондрий, как правило, получали из печени животных, так как её клетки очень легко разрушить, а так же потому, что она богата митохондриальной фракцией. После того, как было обнаружено, что бактериальная протеиназа разрушает клетку, не повреждая митохондрий, был разработан простой и быстрый метод получения мышечных митохондрий. Сахароза способствует сохранности митохондрий, стабилизируя митохондриальную мембрану. 



Гомогенизация материала.  Методы гомогенизации:



•  Разрушение клеток

(гомогенизатор Даунса 5-12 мл + плотно прилегающий пестик). Гипотонический шок + гомогенизатор.

•  Метод основанный на кавитации газов

( клеточная суспензия обогащенная газообразным азотом на 15-30 минут выдерживается при давлении до 65 атм., при быстром понижении давления до атмосферного, вследствие выделения азота происходит разрушение клеток. Органеллы остаются интактными).



•  Ультразвук.

Состав среды в которой разрушают клетки определяется применяемым методом гомогенизации. Для разрушения тканей используют изоосмотический раствор сахарозы из расчета 100 мл на 10 г сырого веса ткани, при этом нестрашно если раствора сахарозы будет немного больше, особенно при центрифугировании в роторе с большим объемом. Гипотоническая среда способствует разрушению клеток, но, если обработка длится слишком долго, при этом может происходить разрушение клеточных органелл. Остальные параметры среды трудно обобщить и каждый мембранный препарат требует индивидуального подхода. 



               Разделение субклеточных компонентов.



•  Центрифугирование.

Основан на различиях по скорости седиментации (определяется весом, размером и формой частиц). Вещество, используемое для приготовления градиента должно быть легко растворимо в воде, физиологически безвредно и химически инертно; его раствор должен быть невязким, прозрачным в видимой и УФ-областях спектра, должен создавать низкое осмотическое давление. Обычно разделение субклеточных компонентов проводят в градиенте плотности сахарозы. Он удовлетворяет большинству указанных требований, но при высоких концентрациях он весьма вязок. Как правило разделение осуществляется за 3-4 часа или в течение ночи при 80.000 д или выше в роторе с подвесными стаканчиками.

Обработка гомогената из печени крысы 10 мМ фосфатом калия увеличивает скорость седиментации митохондрий, не влияя на осаждение лизосом, что позволяет очищать последние в градиенте плотности перколла.



•  Разделение в двухфазной системе, содержащей два полимера.

Полезным и быстрым способом выделения мембран является разделение их в водной двухфазной системе декстран - полиэтиленгликоль (ПЭГ), особенно если отсутствуют необходимые ультрацентрифуги и роторы. Метод, продуктивность которого может быть легко повышена, основан на использовании целого ряда свойств мембран, включая электрический заряд, плотность, массу и гидрофобность. Различие в этих свойствах обуславливает разное распределение компонентов смеси между верхней и нижней фазами и поверхностью раздела. По сродству к верхней фазе компоненты животной клетки располагаются в следующем порядке: эндоплазматический ретикулум / митохондрий / лизосомы / аппарат Гольджи / плазматические мембраны Успех в применении фазовых систем зависит от адекватности выбора их состава. Качество разделения зависит не только от конкретного полимера (пока число их ограничено - в основном используют декстран и ПЭГ), но и от других параметров: молекулярной массы полимера, концентрации солей, рН, химической модификации полимера.

• Электрофорез.

С помощью высоковольтного электрофореза в свободном потоке можно получить препараты субклеточных мембран и органелл высокой степени чистоты. Подлежащую разделению смесь компонентов подают тонкой струйкой в разделяющий буфер, который движется в электрическом поле; мембраны, несущие разный электрический заряд перемещаются в разделяющей ячейке со скоростью, определяемой их зарядом, при этом достигается 100 %-ное разрешение. Это мягкий способ выделения мембран с высоким препаративным выходом. Методику электрофореза в свободном потоке впервые применили для выделения лизосом и митохондрий из печени крысы.



Таблица 1. Ферменты - маркеры митохондрий

Фракция



Маркерный фермент

Митохондрии

Внутренняя мембрана

Сукцинатдегидрагеназа, Цитохромкидаза, Ротеном-нечувствительная NADH – цитохром с – редуктаза

Митохондрии

Наружная мембрана

Моноаминооксидаза, Кинуренин-3-гидроксилаза



	В таблице 1 приведены ферментные маркеры, к которым относятся сравнительно стабильные ферменты, активность которых достаточно высока и ее удобно измерять. Обычно эти измерения проводят как можно быстрее после выделения; образец при этом хранят при 40С и не замораживают. Отмечено, что такой фермент, как цитохром с - редуктаза может оказаться лабильным и терять активность в замороженных препаратах мембран из печени. Для правильной оценки распределения фермента-маркера весьма существенным является пространственное расположение субстрат-связывающего сайта. 



Методики

Субфракционирование мембран и компонентов матрикса митохондрий.



Митохондрии выделяют из многочисленных источников стандартными методами. Субфракционирование их для получения внутренних и наружных мембран и компонентов матрикса проводят после замораживания - оттаивания препарата и / или обработки ультразвуком стандартного осадка митохондрий, суспендированных в среде, содержащей 1.2 М сахарозы и 2 мМ АТР (10 мг мембранного белка на 1 мл). При этом происходит разрушение митохондрий, а после центрифугирования в ступенчатом градиенте плотность сахарозы наружные мембраны концентрируются в полосе 0,45-1,12 М сахарозы, внутренние мембраны и компоненты матрикса собираются в осадке, под нижним слоем с концентрацией сахарозы 1,2 М, а промежуточная везикулярная фракция - между двумя предыдущими, в полосе 1,12-1,20М.

Маркерами внутренних митохондриальных мембран служат ферменты - переносчики электронов. Наружная митохондриальная мембрана, которая при фрагментации образует везикулы, сходные по плотности и морфологии с везикулами из плазматической мембраны содержит моноаминооксидазу. Описан также метод выделения наружных митохондриальных мембран из печени крыс. 



Метод противоточного распределения митохондрий.



Препараты митохондрий, выделенные из печени крысы, были исследованы Эрикссоном с помощью метода противоточного распределения. Митохондрий, входящие в состав каждого из этих препаратов, можно разделить на две основные популяции. Однако элетронно-микроскопическое исследование не позволило обнаружить никаких различий в структуре этих частиц.



Рабочая методика выделения митохондрий из печени крыс.



•  Среда выделения: 0,25 М раствор сахарозы, содержащий 0,001 М ЭДТА, рН 7,4

•   Сахароза - 0,25 М раствор

•  НС1 - 1 н и 0,1 н растворы

•   КОН - 1 н и 0,1 н растворы

Все реактивы готовятся на бидистиллированной воде.

Изолированную печень крысы погружают в 30 мл ледяной среды выделения. После 2х - Зх кратного промывания ткань измельчают ножницами на чашке Петри, стоящей на льду. Кашицу вновь помещают в стаканчик со свежей средой выделения и тщательно промывают. После оседания кусочков ткани на дно, жидкость осторожно сливают и промывание повторяют еще дважды. Ткань переносят в гомогенизатор, добавляют 40 мл среды выделения и измельчают в течение 30 - 40 секунд. К гомогенату добавляют 40 мл среды выделения, перемешивают медленно вращающимся пестиком и разливают его в 2 центрифужных стакана. Центрифугируют в течение 10 минут при 0-2 ОС, при 600 д для удаления обломков клеток и ядерной фракции.

Супернатант осторожно сливают и хранят на льду, остатки объединяют и вновь гомогенизируют 20 секунд в 20 мл среды выделения. Гомогенат центрифугируют при 600 д 10 минут, супернатант объединяют с полученным ранее.

Для осаждения митохондрии, объединенный супернатант центрифугируют в двух стаканах при 14000 g в течение 10 минут. Остатки объединяют в одном стакане и тщательно суспендируют с помощью пипетки на 1 мл в небольшом объеме среды выделения (около 0,5 мл). .Маленькими порциями, при осторожном встряхивании добавляют 10 мл среды выделения и осаждают митохондрии (14000 g, 10 минут). Осадок суспендируют в 0,25 М сахарозе, не содержащей ЭДТА, и вновь центрифугируют (14000 g, 10 минут). Супернатант сливают, на полученный осадок митохондрии осторожно наслаивают 0,2 - 0,3 мл 0,25 М сахарозы. Легким встряхиванием смывают верхний рыхлый слой осадка. Процедуру повторяют еще дважды и полученный плотный осадок митохондрии тщательно суспендируют с помощью пипетки в 0,4 - 0,5 мл 0,25 М сахарозы. Густую суспензию митохондрии переносят в пробирку и хранят на льду. 









Заключение



В данной работе предложены различные методики выделения митохондрии из печени крыс, но использоваться будет метод с применением ультрацентрифугирования, как наиболее приемлемый и удовлетворяющий критериям простоты работы и необходимой степени чистоты продукта.

В дальнейшем планируется фотометрическое изучение влияния этидиум бромида на активность цитохрома с из митохондрии печени крыс. Данная работа представляет практический интерес, так как цитохром с является индуктором апоптоза - программированной гибели клеток. Механизмы этого процесса в настоящее время представляют большой интерес (для лечения онкологических заболеваний).





Список литературы

Альбертсон Пер-Оке "Разделение клеточных частиц и макромолекул", Москва, 1974

Боуэн Т. "Введение в ультрацентрифугирование", Москва, 1973 

Под ред. Гилярова М.С. "Биология. Большой энциклопедический словарь", Москва, 1998

Ленинджер А. "Митохонрия" Москва "Мир", 1966

Решетников В.Н. и др. "Техника биохимического исследования субклеточных структур и биополимеров" т.2, Минск, 1977

Эванз У. Г. "Биологические мембраны. Методы", Москва, 1990











1



1