Галофильные микроорганизмы озера Мраморное

ФГОУ ВПО «АСТРАХАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Институт биологии и природопользования





Кафедра «Прикладная биология

и микробиология»







Курсовая работа



На тему: «Галофильные микроорганизмы озера Мраморное»































Астрахань 2007


Содержание



	ВВЕДЕНИЕ

	Глава 1. Галофильные микроорганизмы, их разнообразие и применение в промышленности. 

	1.1. Разнообразие галофильных прокариот и места их обитания

	1.2. Физиолого-биохимические особенности галофильных микроорганизмов

	1.3. Формирование условий среды обитания микроорганизмов

	1.4. Продукция и деструкции органического вещества микроорганизмами

	1.5. Разнообразие трофических связей в микробном сообществе

	1.6. Использование галофильных микроорганизмов в промышленности

	1.7. Описание исследуемого водоема

	Глава 2. Объекты и методы исследования

	Глава 3. Результаты исследования

	Выводы

	Литература

	ПРИЛОЖЕНИЕ




ВВЕДЕНИЕ



Соленые озера относятся к малоизученным в гидробиологическом отношении водным объектам. Экстремальные условия соленых озер (физико-химические условия: условия по газу, по обмену, по энергетике, по концентрациям и градиентам) порождают находки уникальных организмов. В этом аспекте актуальным является исследование биоразнообразия соленых озер, механизмов адаптации организмов к экстремальным условиям среды обитания, исследования энергопластического обмена этих организмов. Подобные исследования могут иметь необычный интерес, как вариант доступных на Земле, но экстремальных условий существования или как модели условий существования древних экосистем.

Многие соленые озера имеют достаточно бедную функциональную структуру. Например, гиперсоленые озера (соленость < 100 г/л) имеют практически минимальную структуру, состоящую из звена продуцентов и зачастую одновидового (рачок Artemia salina) звена консументов. В этом аспекте соленые озера можно исследовать, как возможную модель функционирования экосистем в случае уменьшения структурного биоразнообразия, вызванного антропогенным воздействием. В Астраханской области существует много озер с повышенной концентрацией соли, поэтому изучение галофильных микроорганизмов, обитающих в экстремально соленых внутренних водоемах в этом регионе, приобретает особую актуальность.

Целью исследования явилось выделение галофильных микроорганизмов из вод повышенной солености. 

В задачи исследования входило:

выделение из проб воды оз. Мраморное галофильных микроорганизмов, определение их численности;

родовая идентификация чистых культур.


Глава 1. Галофильные микроорганизмы, их разнообразие и применение в промышленности.



1.1. Разнообразие галофильных прокариот и места их обитания.



По своему количеству и разнообразию одноклеточные далеко превосходят всех остальных обитателей нашей планеты. Их находят в почве на глубине в несколько сотен метров, во всей толще Мирового океана, во льдах ледников, в водах систем охлаждения ядерных реакторов. 

Среди них ярко выделяются микроорганизмы - экстремофилы, обитающие в настолько неблагоприятных условиях, что на первый взгляд жизнь там кажется невозможной. К ним относятся термофилы (теплолюбивые), которых можно найти даже в одах горячих гейзеров, ацидофилы, развивающиеся только в кислых средах, алкофилы, предпочитающие щелочную среду, галофилы (солелюбивые), обитающие в сильно соленых водах, радиорезистентные, способные жить при радиоактивных излучениях в сотни и тысячи раз более интенсивных, чем может выдержать человек.

Интерес к экстремофильным бактериям в последние годы исключительно высок с точки зрения их биологической уникальности (Заварзин, 1993) и использования в биотехнологии (Гончиков, Намсараев, 2000). 

Галофилы занимают особое место среди остальных микроорганизмов. Это единственные бактерии, живущие в средах с высоким содержанием солей. В Мертвом море, например, концентрация соли достигает 26-27% в некоторые годы повышаясь до 31%, а при 36% соль выпадает из раствора в осадок. Галлофилы встречаются на кристаллах соли в прибрежной полосе, на соленой рыбе, на засоленных шкурах животных, на рассольных сырах, в капустных и огуречных рассолах. Большие скопления галофилов благодаря высокому содержанию в них каратиноидов имеют бледно-морковный оттенок (Заварзин, 1993).

Микробное сообщество в соленых водоемах подвергается осмотическому стрессу. Деструкция органического вещества (ОВ) в этих водоемах идет до полного его разложения (Заварзин и др., 1999). При этом главная роль в биогеохимических процессах в соленых озерах принадлежит серному циклу, в котором активные процессы обусловлены сульфатредукцией, а окислительную часть проводят главным образом фототрофные анаэробы (Заварзин, 1996).

Изучение функционального и филогенетического разнообразия галофильных прокариот в озерах было инициировано гипотезой Г.А.Заварзина о том, что микробные сообщества соленых водоемов могут рассматриваться как реликтовые и, возможно могли являться центрами микробного биоразнообразия (Заварзин, 1993). Исследования ряда гиперсоленых озер Кении, Египта, Северного Казахстана, Монголии, а также среднеминерализованных озер Северной Америки, Тывы и Забайкалья показали, что "микробный пейзаж" чрезвычайно богат и разнообразен (Заварзин и др., 1999). Среди них выявлены основные представители функциональных ключевых групп трофической цепи, которые составили новые роды и виды цианобактерий (Герасименко и др., 1996), аноксигениых фототрофных бактерий (Брянцева, 2000), спорообразующих бацилл (Жилина, 2001), ацетогенов (Заварзин, 1993), сульфатредукторов (Кевбрин и др., 1999; Пикута и др., 1997), метилотрофов (Doronina е1 а1, 2003) и метанотрофов (Калюжная и др., 1999; Троценко, Хмеленина, 2002).

Судя по их строению, галофилы – одни из древнейших обитателей нашей планеты. Человечеству они известны довольно давно по красноватому налету на продуктах, консервируемых с использованием больших количеств поваренной соли. Впервые галофилы были выделены в начале нашего столетия из микрофлоры лиманной грязи, однако их систематическое изучение началось только в конце второго десятилетия ХХ века. Известный естествоиспытатель Бекинг в 1928 г. назвал галофильные бактерии организмами, «живущими на грани физиологических возможностей». У них практически нет врагов или конкурентов, способных жить в таких же условиях, и поэтому галофилы свободно эволюционировали на протяжении всей истории развития жизни на Земле. 

Галофильные микроорганизмы представлены двумя основными типами: умеренными галлофилами, которые развиваются при содержании соли 1-2%, хорошо растут в среде с 10% соли, но могут выносить даже 20%-ное ее содержание (большинство бактерий не переносят концентрации NaCl выше 5 %) и экстремально галофильными бактериями родов Halococcus и Halobacterium, которые требуют около 12-15 % солей и способны хорошо расти в насыщенном растворе NaCl- при 32% - ной концентрации соли.

Действие высоких концентраций солей на микроорганизмы может быть обусловлено как самим растворенным веществом, так и его влиянием на активность воды. 

В живых клетках вода служит средой, в которой молекулы разных размеров взаимодействуют между собой. Структура воды, в которой находятся растворенные вещества, контролирует все жизненно важные процессы в клетке: действие ферментов и регуляцию их активности, ассоциацию и диссоциацию органелл, структуру мембран и их функционирование. Небольшие изменения в концентрации растворенных веществ и активности воды могут приводить к значительным физиологическим изменениям. Многоклеточные организмы выработали специальные физиологические механизмы для поддержания постоянного состава не только жидкостей тела, но и внутриклеточной среды (Самарина, 1977).

Однако микробные клетки должны самостоятельно приспосабливаться к внешней водной среде. Клетки, растущие при высоких концентрациях растворенных веществ, не способны поддерживать цитоплазму в более разбавленном состоянии. Хотя внутриклеточная среда микроорганизмов по химическому составу сильно отличается от внешней, не известно ни одного вида, который был бы способен поддерживать внутри клеток общую концентрацию растворенных веществ на более низком уровне, чем в окружающей среде (Заварзин и др., 1999). 

Источником галофильных бактерий служат природные соленые озера. Экосистемы соленых озер, как правило, обладают низким биоразнообразием по сравнению с другими водными и наземными экосистемами. В то же время, поддержание устойчивого биотического круговорота требует определенного минимального уровня биоразнообразия. Поэтому соленые озера, возможно, являются примерами экосистем с биоразнообразием, близким к минимально возможному для устойчивого функционирования биотического круговорота. Например, Мертвое море, откуда было получено несколько штаммов, используемых учеными Израиля со времени первых исследований микрофлоры этого водоема (Агре, 1988). Следует отметить, что не во всех озерах такого рода NaCl является главным солевым компонентом: в Мертвом море содержание Мg2+ выше, чем содержание Na+. Существуют и другие интересные соленые озера, которые, однако, в микробиологическом отношении либо мало, либо совсем не изучены. В этих озерах, по-видимому, нет никаких форм жизни, кроме бактерий и других микроорганизмов, встречающихся в них в большом изобилии. Это не означает, что такие микроорганизмы относятся к постоянным обитателям данных озер. Так, например, в озере Ассал, находящемся в отдаленной и почти недоступной части Французского Сомали, был выявлен ряд бактерий, среди которых преобладали пресноводные и эвригалинные виды (растущие в среде, содержащей Na концентрации от 1 до 5%); были также найдены умеренные и экстремальные галлофилы. Большинство выделенных видов не могло развиваться при тех концентрациях соли, которые были обнаружены в этом озере. Поэтому кажется наиболее вероятным, что к природным обитателям озера относятся только галофилы, остальные же микроорганизмы приносятся несколькими впадающими в него реками. Значительную часть обнаруженных микроорганизмов составляют бациллы. Это говорит о хорошей выживаемости данных видов в очень соленой воде (Громов, 1989). Некоторое время считали, что бактерии могут расти в незамерзающем пруду Дон-Жуан в Антарктике, где вода, активность которой (QW) близка к 0,45, представляет собой насыщенный раствор хлорида кальция. Полученные позже результаты убедительно свидетельствуют в пользу того, что найденные в этом пруду бактерии были принесены внешними потоками. Поэтому величина, равная 0,62, может по-прежнему рассматриваться как минимальная активность воды, при которой еще возможен рост микроорганизмов (Летунова, Ковальский, 1978).

Организмы, толерантные к солям и другим растворенным веществам, широко распространены среди бактерий, грибов, дрожжей, водорослей и простейших, а также среди вирусов, специфичных для некоторых из этих организмов. К наиболее характерным для этой группы организмам относятся экстремально галофильные бактерии родов Наlobaсterium и Наlососсus, способные к росту на насыщенном растворе NаС1 (около 32% или 5,2М). Они характеризуются тем, что нижний, критический для их роста предел содержания NаCl составляет 12—15%, в то же время целый ряд других организмов, способных к росту в насыщенном растворе NaС1, нуждается в значительно меньших его количествах, чем экстремальные галофилы, галобактерии и галококки обладают многими биохимическим свойствами, отличающими их от других форм микроорганизмов. Не давно открытый актиномицет Аctinopoliispora halophila, для которого минимальная потребность в NaС1 составляет 10% на твердой среде и 12% на жидкой, также может рассматриваться как экстремальный галофил, правда занимающий пограничное положение, так как у него отсутствуют некоторые из биохимических «маркеров», характерных для других экстремальных галофилов. Статус пограничного организма должен быть также присвоен фотосинтезирующей бактерии Есtothiorhodospira halophila, которая может расти при несколько более низкой концентрации NaCl, чем экстремальные галофилы (Летунова, Ковальский, 1978).

К умеренным галофилам было отнесено несколько организмов, вызывающих порчу пищевых продуктов и способных расти при концентрациях NaCl от 0,5 до 3,5 М (приблизительно 3—20%) (Агре, 1988). Это определение относится также ко многим морским бактериям, которые нуждаются для своего роста в присутствии NаС1 в концентрации около 0,5 М (3%), но, как было установлено при дальнейшем исследовании, выдерживают значительно более высокие концентрации NаС1, например 20, 25 и даже 30% (Дзюба, 1997). Полученные в последнее время данные показывают, что точное определение нижней концентрации соли, необходимой для роста умеренно галофильных бактерий, невозможно, если при этом не указывается температура. При 20°С описанный недавно вид Рlanococcus halophilus растет при почти полном отсутствии в среде ионов Nа+ (0,01 М). При повышении температуры до 25°С или выше концентрация NаС1 должна быть увеличена по крайней мере до 0,5М, причем NаС1 не может быть заменен КС1 или какими-либо ионными веществами. Таким образом, если эксперименты проводятся при 25°С, то данный организм (способный расти в присутствии 4,0 М NаС1) можно классифицировать как высокотолерантный к соли, тогда как при 20°С его следует рассматривать как умеренный галлофил (Ляликова, 1970).

Большая часть галофильных организмов, то есть «любящих» высокую концентрацию солей (лат. Halo- соль) входят в класс Archeobacteria. К этому классу относятся бактерии (называемые архебактериями), обладающие уникальными физиологическими, биохимическими свойствами и экологией, резко отличающими их от остальных прокариот. В частности, они отличаются от других бактерий составом и первичной структурой рибосомальных 16 S и 5 S РНК; составом мембранных липидов и образованием однослойной липидной мембраны (у других бактерий липидные мембраны двухслойные); составом клеточных стенок (они состоят не из муреина, а из других биополимеров, кислых полисахаридов, белков и псевдомуреина). К группе галобактерий отнесены роды Halococcus, Halobacterium, «квадратная бактерия» и другие, отличающиеся способностью развиваться на средах с высокими концентрациями NaCl (20-25%). Это так называемые экстремальные галлофилы. Среди них имеются аэробы и факультативные анаэробы. Участвуют в превращении углерода и азота в засоленных почвах, водоемах и других субстратах (Мишустин, 1987). 



1.2. Физиолого-биохимические особенности галофильных микроорганизмов



Галофильные архебактерии распространены там, где есть подходящие для этого условия с высоким содержанием NaС1 и других необходимых ионов: в природных соленых водоемах, бассейнах для выпаривания соли, белковых материалах, консервируемых с помощью соли (рыба, мясо, шкуры). Могут расти в насыщенном растворе NаС1 (30 %). Нижний предел концентрации соли для роста большинства видов составляет 12—15% (2—2,5 М); оптимальнее содержание — между 20 и 26 % (3,5—4,5 М). Высоки потребносш галобактерий и в других ионах: оптимальный уровень Мg2+ в среде - 0,1—0,5 М, К+ - примерно 0,025 М (Гусев, 2003).

Влияние ионов на галобактерий достаточно специфично. Для поддержания клеточной стабильности в первую очередь требуется хлористый натрий. Ионы Na+ взаимодействуют с отрицательнш заряженными молекулами клеточной стенки галобактерий и предают ей необходимую жесткость. Внутри клетки концентрация NaCl невысока. Основной внутриклеточный ион — К+, содержание которого может составлять от 30 до 40 % сухого вещества клеток, а градиент между внеклеточной и внутриклеточной концентрациями достигать 1:1000. Ионы К+ (наряду с другими) необходима для поддержания ионного равновесия вне и внутри клетки, стабилизации ферментов, мембран и других клеточных структур.

В Определителя бактерий (Берги, 1989) экстремально галофильные архебактерии объединены в порядок Halobacteriales семейство Наlоbасtеriaсеае и включает 6 родов и более 20 видов, различающихся формой клеток (палочки, кокки, квадраты), способностью к движению, отношением к кислотности среди, устойчивостью к NaСl и другими признаками.

В составе клеточных стенок не обнаружен пептидогликан. У представителей рода Наlоbасtеriит клеточная стенка толщиной 15 — 20 нм построена из регулярно расположенных гексагональных субъединиц, состоящих в основном из гликопротеинов. Клеточная стенка галобактерий рода Наlососсиs имеет толщину 50- 60 нм и состоит из гетерополисахаридов (Егоров, 1976).

ЦПМ содержит около 1/3 липидов и 2/3 разных белков, включая обычные для эубактериальных мембран наборы флавопротеинов и цитохромов. Основная масса липидов экстремальных галофилов отличается от характерных для эубактерий липидов тем, что в их молекуле глицерин связан не с остатками жирных кислот, а с С20-терпеноидным спиртом — фитанолом. Фосфолипидные и гликолипидные производные глицеринового диэфира могут в определенных условиях составлять до 80 % общего содержания липидов в клетках. Помимо уникальных липидов клеточные мембраны экстремальных галофилов содержат много каротиноидных пигментов (основной — бактериоруберин), обусловливающих окраску колоний от розового до красного цвета, что имеет для галофилов немаловажное значение как средство защиты против избыточной радиации, поскольку для их мест обитания характерна обычно высокая освещенность.

При недостатке в среде О2 в ЦПМ галобактерий индуцируется синтез хромопротеина — бактериородопсина, белка, соединенного ковалентной связью с С20-каротиноидом ретиналем. Свое название хромопротеин получил из-за сходства с родопсином — зрительным пигментом сетчатки позвоночных. Оба белка содержат в качестве хромофорной группы ретиналь, различаясь строением полипептидной цепи. Бактериородопсин откладывается в виде отдельных пурпурных областей (бляшек) на ЦПМ красного цвета, обусловленного высоким содержанием каротиноидов. При выращивании клеток на свету в условиях недостатка О2 пурпурные участки могут составлять до 50 % поверхности мембраны. В них содержится от 20 до 25 % липидов и только один белок — бактериородопсин. При удалении из среды солей клеточная стенка растворяется, а ЦПМ распадается на мелкие фрагменты, при этом участки мембраны красного цвета диссоциируют, а пурпурные бляшки сохраняются и могут быть получены в виде отдельной фракции (Кузнецов, 1970).

Генетический материал экстремальных галофилов представлен в виде основной и сателлитных ДНК. Последние составляют от 11 до 30 % всей содержащейся в клетках ДНК и состоят из замкнутых кольцевых молекул. Основная и сателлитные ДНК различаются нуклеотидным составом: молярное ГЦ-содержание основной ДНК — порядка 66—68, а сателлитных — 57—60 %. Высокий уровень сателлитных ДНК — уникальная черта организации генетического материала экстремальных галофилов, значение которой пока не ясно. Предполагается, что сателлитные ДНК — не эписомы, а составная часть генома этих бактерий (Овчинников, 1982).

Экстремальные галофилы имеют сложные пищевые потребности. Для роста большинства видов в состав сред должны входить дрожжевой экстракт, пептон, гидролизат казеина, набор витаминов. Высокой требовательностью к среде отличаются представители родов Наlоbacterium и Наlососсus. Основным источником энергии и углерода служат аминокислоты и углеводы. Метаболизм глюкозы осуществляется по модифицированному пути Энтнера—Дудорова, отличающемуся тем, что глюкоза без фосфорилирования окисляется в глюконовую кислоту. Последняя превращается в 2-кето-З-дезоксиглюконовую кислоту, которая расщепляется на два С3-фрагмента: пировиноградную кислоту и глицериновый альдегид. Из глицеринового альдегида в результате нескольких ферментативных преобразований также образуется пировиноградная кислота. Дальнейшее ее окисление происходит в замкнутом ЦТК.

Основной способ получения энергии экстремальными галофилами — аэробное дыхание. В ЦПМ обнаружены цитохромы b, с, а также цитохромоксидаза о-типа (Ляликова, 1970). Электроны в дыхательную цепь поступают с НАД-зависимых дегидрогеназ. В анаэробных условиях в темноте источником энергии может служить анаэробное дыхание с использованием NO3- в качестве конечного акцептора электронов, а также процесс сбраживания аргинина и цитрулина. Свет служит дополнительным источником энергии, аппарат для использования которого подключается при недостатке O2.

Используемый галобактериями механизм преобразования солнечной энергии в энергию химических связей, пригодную для использования в биологических процессах, отличается от механизма фотосинтеза в растениях и зеленых водорослях, содержащих хлорофилл. Для этой цели в галобактериях используется бактериородопсин – вещество, сходное с родопсином, обеспечивающим зрительное восприятие у человека и животных. В клетках Н. salinarium и некоторых других галобактерий обнаружены 3 фотоактивных пигмента, все они ретинальсодержащие белки. Один из них, названный сенсорным родопсином (5-родопсин), обеспечивает фототактическую реакцию бактерий. Красный и желто-синий свет действуют на них как аттрактанты, синий и УФ — как репелленты. S-родопсин существует в двух спектрально различных формах, каждая из которых претерпевает фотохимические превращения. Поглощение фотона красного света приводит к генерированию сигнала, по которому бактерии начинают перемещаться в направлении к источнику света. При поглощении фотона синего света наблюдается противоположная реакция. Максимальный эффект в обоих случаях достигается при длине волны 565 и 370 нм соответственно. Фотосенсорная реакция обеспечивает оптимальную для клеток галобактерий пространственную ориентацию. Клетки покидают области, в которые проникает губительное коротковолновое излучение и с помощью жгутиков или газовых вакуолей концентрируются в зонах с благоприятным для них световым режимом. Этим достигаются и оптимальные условия для фотофосфорилирования, так как область спектра, вызывающая положительную тактическую реакцию, и спектр поглощения фотосинтетического пигмента совпадают (Шлегель, 1987).

Длительное время считали, что без участия хлорофилла фотосинтез не возможен. Способность некоторых экстремально галофильных археобактерий осуществлять фотосинтез бесхлорофилльного типа была обнаружена в начале 70-х гг. XX в. Д.Остерхельтом и В. Стокениусом, идентифицировавшими в ЦПМ Halobacterium salinarium бактериородопсин - белок, ковалентно связанный с каратиноидом, и показавшими способность этого белка к светозависимому переносу протонов через мембрану, приводящему в конечном итоге к синтезу АТФ. Фотофосфорилирование, обнаруженное у этих архебактерий,- единственный пример превращения энергии света в химическую энергию АТФ без участия электронтранспортной цепи.

Использование световой энергии для создания трансмембранного градиента протонов происходит с участием бактериородопсина и не связано с переносом электронов по цепи переносчиков. Этот хромопротеин с молекулярной массой 26 кДа содержит полипептидную цепь, построенную из 248 аминокислотных остатков и на 75 % состоящую из а-спиральных участков. Последние образуют 7 тяжей, ориентированных перпендикулярно плоскости мембраны. Ретиналь расположен параллельно плоскости мембраны и, следовательно, перпендикулярно белковым тяжам. Связь между ретиналем и полипептидной цепью осуществляется через Шиффово основание, образованное в результате взаимодействия альдегидной группы ретиналя с е-аминогруппой 216-го лизинового остатка.

Шиффово основание в темноте находится в протонированной форме. Поглощение кванта света бактериородопсином вызывает изменение конформации ретиналя и приводит к отщеплению Н+ от Шиффова основания.

Бактериородопсин, в молекуле которого Шиффово основание находится в протонированной форме, поглощает свет с длиной волны 570 нм, а в депротонированной — при 412 нм. Протон, отделившийся на свету от Шиффова основания, переходит во внеклеточное пространство, а Н+, протонирующий Шиффово основание, поглощается из цитоплазмы. Таким образом, под действием света бактериородопсин «перебрасывает» протоны с одной стороны мембраны на другую. В результате работы циклического механизма, получившего название бактериородопсиновой протонной помпы, при освещении по разные стороны мембраны возникает градиент концентрации Н+, достигающий 200 мВ, в создании которого участвуют электрический и химический компоненты. Разрядка А(1H+ с помощью Н+ — АТФ-синтазьг приводит к синтезу АТФ (Гусев, 2003).

Несмотря на кажущуюся простоту, очевидно, что бактериородопсиновая протонная помпа представляет собой сложную систему. Прежде всего, путь, который должен пройти Н+, чтобы пересечь мембрану, составляет не менее 5 нм, т. е. значительно превышает расстояние, на которое он может быть перенесен при любом конформационном изменении ретиналя. Это означает, что поглощение кванта света должно приводить к возникновению напряженной конформации всего бактериородопсинового комплекса, служащей в дальнейшем источником энергии для переноса Н+ против электрохимического градиента. В организации такого переноса принимают участие ориентированные поперек мембраны а-спиральные тяжи и мембранные липиды, формирующие протонные каналы, природа и механизм действия которых пока не известны. 

Все эти данные говорят об обособленности группы галофильных микроорганизмов, их особом эволюционном пути, об их уникальности и необходимости изучения данных микроорганизмов, обитающих в соленых озерах, почвах и других субстратах (Власов, 1973).

1.3 Формирование условий среды обитания микроорганизмов



Средой обитания для микроорганизмов в водоемах является вода и донные осадки. Между ними существует постоянный обмен вещества и энергии. Поэтому формирование условий среды носит взаимозависимый характер (Кузнецов, 1970; Горленко и др., 1977; Романенко, 1985).

Формирование природной воды определяется взаимодействием ряда факторов: геоструктурных особенностей отдельных участков земной коры, образовавшейся в течение длительной геологической истории, современной физико-географической обстановки, взаимодействием породы, воды, газа и живых организмов (Самарина, 1977; Крамаренко, 1983). Испытывая влияние комплекса физико-географических факторов и гравитационного поля Земли, все воды подчиняются закону гидрохимической зональности, проявляющуюся как по площади, так и по вертикали водного слоя (Самарина, 1977). Суть данного закона заключается в том, что с переходом от климатических зон избыточного и нормального увлажнения (гумидный климат) к зонам скудного и малого увлажнения (аридный климат) изменяются параметры химического состава озерной воды. В степной и полупустынной зонах, где отмечается более засушливый климат, чем в лесной и тундровой зонах, вместо пресных озер встречаются солоноватые и соленые озера (Алабышев, 1932; Кузнецов, 1970).

Большое значение на формирование состава озерных вод оказывают кристаллические породы, слагающие положительные формы рельефа (Горленко и др., 1999). В процессе их химического выветривания, протекающих непрерывно и в огромных масштабах в природе, образуются растворимые соли. Наибольшей растворимостью обладают плагиоклазы, затем калиево-полевые шпаты и наименьшей - кварц (Самарина, 1977). В аридной и полуаридной зоне (рН>7) в процессе химического выветривания полевых шпатов ряд катионов (К+, Ка+, Са2+ и др.) частично удаляются в системе, где образуется глинистый материал. Образующиеся карбонатные и гидрокарбонатные соли щелочей и щелочеземель переходят в раствор, придающие воде соответствующую реакцию.

Состав озерных вод во многом определяется типом его питания. Водно-солевое питание озера получают за счет грунтовых вод и временных дождевых потоков. Грунтовые воды по составу различны, чаще преобладают гидрокарбонатные. Общая сумма солей достигает до 2,5 г/л.

Большое влияние на формирование и режим озер оказывает многолетняя и сезонная мерзлота. Она повышает уровень грунтовых вод, ускоряет процесс засоления почв, а, следовательно, и накопление солей в озерах.

Для бессточных водоемов степных районов роль атмосферных осадков в составе озерных вод оказывается лишь в многолетнем цикле (Богданова, 1973). Воды этих осадков имеют низкую минерализацию. Количество солей, вносимых атмосферными осадками на зеркало озер, составляет 0,01-0,50%. Незначительная мощность снежного покрова в степях предопределяет малую роль снега в водно-солевом балансе бессточных озер. Свежевыпавший снег имеет минерализацию 0,01-0,03 г/л. Талые воды и временные вешние потоки функционируют очень короткое время, чаще во второй половине апреля, и наблюдаются не каждый год. Эти воды характеризуются содержанием солей до 0,01-0,60 г/л. Состав их гидрокарбонатно-натриевый и кальциевый.

Дождевые воды более концентрированы, чем снеговые осадки. Они имеют гидрокарбонатно-натриевый, кальциевый или магниевый тип (Богданова, 1973). Общая сумма солей их составляет 6-150 мг/л.

В условиях аридного климата формирование химического состава воды и осадков характеризуется сложностью процессов, протекающих в водоемах. В этих бессточных озерах расход воды осуществляется путем испарения и превалирует над его притоком, что обуславливает концентрирование раствора. Общая сумма солей, формирующихся рассольных озер, нередко достигает сотен грамм на 1 литр. Наиболее важным в гидрохимии этих озер является насыщение их в процессе концентрирования рядом легко воднорастворимых солей, вследствие чего соли переходят в твердую фазу, и устанавливается равновесие.

При кристаллизации выделяются в первую очередь наименее растворимые соли. Состав солей рассольных озер весьма разнообразен, поскольку формируются соли (минералы) с неодинаковым количеством кристаллической воды, двойные и тройные соли и т.д. Наиболее распространенными являются NaС1 - галит, NаСl*Н2O - гидрогалит, Nа2SО4*10Н2O - мирабилит, Nа2СO3 - сода, Na2СO3*NаНСO3*3Н2O - трона, КСl*MgСl2 -карналлит, Nа2SO4- тенардит, МgSO4*7Н2O - эпсолит, СаSO4-2Н2O - гипс и др. (Алабышев, 1932; Кузнецов, 1970).

Важная роль в формировании химического состава воды принадлежит биогенным процессам. Живые организмы извлекают соли из воды даже при очень малых его концентрациях или осаждают такие элементы, как Са2+ , в виде карбонатов путем изменения физико-химических свойств самой озерной воды. Интенсивнее всего биологические процессы осуществляются в "малых озерах". В таких водоемах, хорошо прогреваемых и аэрируемых, наиболее активны биохимические процессы, обусловленные живыми организмами. Основная часть привноса биогенных веществ в водоемы связана с круговоротом углерода и серы, в процессе которого вовлекаются, прежде всего, главные компоненты воды - SO42-, СОз2- и НСОз2-. В результате биологического круговорота в водоемах присутствуют различные формы углерода (СО2, Сорг, СОз2-, НСОз-, СН4) и серы (SO42-, сера белка, Н2S, свободная S), изменчивы карбонатное и сульфидное равновесие, а также содержание связанных с ними равновесиями веществ. Образующиеся продукты в процессе деструкции ОВ (Н2S, S, СН4, СO2) частично выходят из общего круговорота веществ - поступают в атмосферу или консервируются в виде минералов, например FеS, либо участвуют в дальнейшем круговороте веществ, определяя особенности газового состава воды (Самарина, 1977).

В газовом составе озерных вод основную роль играют газы атмосферы, с которыми озерные воды находятся в тесном контакте, и газы биохимического происхождения. В озерах Забайкалья, различающихся по трофности, интенсивность газовыделения была 400 мл газа/(м2 сут.) (озеро Иван) и более 2 400 мл/(м сут.) (озеро Иргень) (Тополов, 1991). Компонентный состав газа в озерах был одинаков и состоял из N2, СН4, Н2, СO2, O2. Концентрация N2 и СН4 в исследованных озерах преобладала над остальными газами. Содержание СO2 и O2 определялось сезонными изменениями. Концентрация Н2 в газовом составе было наименьшим, либо отсутствовало в определенные сезоны года. Сезонный ход газоотделения во всех исследованных Иваново-Арахлейских озерах было одинаковым: в конце периода открытой воды и в начале подледного периода (август-декабрь) присутствовал метаново-азотный газ. Содержание СН4 в пробах достигало до 90%. В конце подледного периода и в начале периода открытой воды (декабрь-май) - азотно-метановый газ. Интенсивность газоотделения в Иваново-Арахлейских озерах коррелировала с численностью бактерий в осадках и содержанием в них ОВ. В прибрежной зоне озер плотность бактериального населения и интенсивность газообразования были выше, чем в центральной части озера. Межгодовые изменения состава газа были несущественными.

В пределах одной географической зоны солевой состав озерной воды в течение года не является постоянной величиной, т.к. почти каждый элемент в той или иной мере участвует в круговороте веществ в водоеме. Поступление солей в водоем зависит не только от подтока извне с поверхностными и грунтовыми водами, но и во многом определяется диффузией из ила (Тополов, 1991).

Активность бактериальных процессов и солевой состав рассольных озер	во многом определяется температурой окружающей среды. С понижением температуры воды осенью и до полного его замораживания зимой происходит осаждение солей согласно их эвтектическим точкам. 

Природная вода является многокомпонентной системой, в которой точки кристаллизации, стадии метаморфизации химического состава могут более или менее смещаться от эмпирических данных для простой системы. Так, Na2SO4 и КСl кристаллизуются из простых растворов при t=-1,2°С и t=-10,6С, а из морской при t=-8,2 С и t=-34,2 С соответственно. Таким образом, в рассольных озерах на температуру кристаллизации солей оказывают влияние соли с болeе низкими их значениями, что в целом определяет снижение температуры замерзания всего раствора (Власов, Филиппова, 1973; Стрижова, Орлик, 1991).

С повышением температуры весной и таянием льдов на озерах многие соли (сода, гидрогалит и др.) переходят в раствор. В результате годичных изменений в озерах протекает циклический процесс: садка - растворение, растворение — садка и т.д. Нередко цикл полностью не замыкается, и часть солей, как правило, это мирабилит, остается не растворенной, в виде твердой фазы. Новосадка - свежеосажденная соль, выпавшая в течение данного года - очень рыхлая и иногда выбрасывается волнами, образуя вдоль побережья озера валы соли (Власов, Филиппова, 1973).

При длительной аридности климата новосадка уплотняется и переходит в старосадку, которая при дальнейшей перекристаллизации (образование более устойчивых минералов) и уплотнении превращается в корневую соль. Пластовые отложения солей, в составе которых выявлены мирабилит и гидрогалит имеются на озерах Дабас-нур, Борзинское, Цаган-Нор, Бабье и др. Мощность корневого слоя достигает до 1,05 м (Власов, Филиппова, 1973)

Периодическое осаждение и растворение солей в разные сезоны года, несомненно, влияют на физико-химические показатели воды, такие как минерализация, рН, соленость, общая щелочность и т.д. В зимний период -ноябрь - март - происходит подледная садка солей. Озеро Горбунка зимой 1994-1995гг до дна не промерзало (Кулырова, 1999). Вследствие осаждения СОз2- и НСОз- -ионов и высокой концентрации СО2 в воде значения рН были низкими по сравнению с другими сезонами года. Показатель кислотности воды в озере Горбунка в январе составляла 8,7, в озере Ножей - 7,3 (Кулырова, 1999). Весной с апреля по май с переходом водорастворимых солей повышается общая щелочность, значения рН воды и соленость. Летом и в начале осени на исследуемой территории наблюдается повышение минерализации озерных вод, обусловленное высокой температурой воздуха и незначительным количеством осадков. В августе наблюдается опреснение озер и снижение общей суммы солей в воде. В начале октября начинается период ледового покрытия, сопровождающегося садкой мирабилита и других солей (Франк-Каменецкий, 1932; Власов, Филиппова, 1973).

Насыщенность воды рассольных озер рядом солей и наличие твердой фазы, сравнительная бедность их живыми организмами приводят к тому, что главными в гидрохимии рассольных озер являются процессы, связанные с равновесиями типа твердое вещество (соли) — раствор, при подчиненном значении биохимических реакций (Самарина, 1977).

Биохимические процессы, протекающие в "малых" озерах в разные сезоны года неодинаковы и обуславливают вертикальную стратификацию воды. Небольшая глубина и хорошая прогреваемость в летнее время засушливом сезоне, начинается выпадение солей из рапы. Таким образом, донные отложения соленых озер формируются под воздействием трех факторов одновременно: геологического, биохимического и физико-химического. Они проявляют себя по-разному в разное время. Весной в образовании осадков преобладает геологический фактор, летом - доминирует биохимический фактор, ближе к осени обычно на первое место выдвигается физико-химический фактор. В зимнее же время значение геологического и биохимического факторов ничтожно (Перфильев, 1972).

Таким образом, как солеобразование, так и илообразование протекают закономерно, последовательно сменяющимися фазами в течение годового цикла. Следовательно, каждый год характеризуется сменой визуально различимых сезонных прослоек - микрозон: минеральной, органической и солевой, а в совокупности они образуют отложение одного года. Эта тройственная природа годового слоя не всегда выступает с достаточной ясностью, так как не во всех озерах проявляют себя все три фактора. Чередование в осадках минеральных озер иловых и солевых отложений свидетельствует о периодической смене климата. Образование илов связано с увлажнением климата; накопление корневой соли указывает на наступление длительного или более кратковременного периода сухого и жаркого климата. Таким образом, можно определить возраст водоема, так как процесс илообразования осуществляется путем формирования сезонных слоев -микрозон, а в основе процесса галогенеза лежит образование годовых прослоек соли, толщина которых измеряется в сантиметрах.



1.4. Продукция и деструкции органического вещества микроорганизмами



В соленых озерах непрерывно протекают процессы образования и разложения ОВ при участии различных физиологических групп бактерий. В таких водоемах высокие значения минерализации ограничивают развитие высших форм жизни (Заварзин и др., 2000). Первичными продуцентами в них являются цианобактерии, фототрофные и хемолитотрофные бактерии (Герасименко и др., 1993). В синтезе автохтонного ОВ в высокоминерализованных озерах Африканского рифта, в солоноватых щелочных озерах Тувы и Бурятии участвуют цианобактерии рода Synechocyctis, Рhormidium, Оscillatoria, Spirulina, Aphanothece, Rhabdonema и др (Дубинин, 1995; Герасименко, 1996; Заварзин и др., 1999).

При благоприятных экологических условиях бентосные сообщества микроорганизмов образуют слоистые образования - микробные маты. Высокая плотность мата (1,383 ±0.007 г/см3) исключает его всплытие со дна. Плотная кожистая пленка галофильного мата ограничивает взмучивание, и вода остается прозрачной при самых сильных волнениях (Герасименко, Заварзин, 1993). В циано-бактериальном мате солоноватого озера Хилганта, толщиной 10 мм, различают 4 слоя, разделенных минеральными прослойками. В верхнем слое выявлены цианобактерий рода Phormidium molle и Мicrocoleus, Aphanothece salina и Веggiatoa, в 3-ем слое -доминировали Chromatium, Rhodopseudomonas, в 4 слое - бактерии встречались редко, но сохранившиеся клетки цианобактерий имели нормальную ультраструктуру (Заварзин и др., 1999). Минеральные прослойки в основном были представлены СаСОз, СаSO4, гидротроилитом.

В цианобактериальных матах лагун Арабатской косы (озеро Сивгш) с соленостью от 16 до 20%, доминирует Мicrocoleus chtonoplaster, а при повышении солености - Aphanocapsa salina и зеленая микроводоросль (Бонч-Осмоловская и др., 1988). 

Развитие пурпурных бактерий является одной из характерных черт микробного сообщества соленых озер. Они образуют анаэробный окислительный фильтр, работающий на свету в отсутствии O2. Массовое развитие их делает наиболее значительными во вторичной продукции ОВ, сопряженного с регенерацией сульфата путем окисления H2S, который образуют сульфатредукторы (Заварзин, 2000). Типичными представителями пурпурных бактерий алкалофильных и галофильных сообществ являются бактерии рода Ectothiorhodospira, откладывающих капли серы вне клетки в процессе окисления Н2S до сульфатов. Кроме Н2S они могут окислять также Н2 и ацетат.

Одним из постоянных показателей биологической продуктивности водоемов является концентрация фотосинтетических пигментов в планктоне.

Так, по концентрации хлорофилла "а" можно судить об общей биомассе и о продукции фитопланктона, которая обычно коррелирует с первичной продукцией (Герасименко, Заварзин, 1993). В соответствии с концентрацией хлорофилла "а" различают следующие группы озер (Бульон, 1983).

Помимо автохтонного ОВ в водоемы поступает аллохтонное ОВ с прибрежных участков в виде растительного опада. Аллохтонное и автохтонное ОВ в дальнейшем подвергается разнообразным превращениям, общим итогом которого является постепенное разрушение ОВ - его деструкция.

Процесс деструкции ОВ является важнейшим процессом, определяющим существование биологического круговорота элементов в природ и обеспечивающим устойчивость биоценозов.

Микробное сообщество водоемов получает ОВ в виде растворенных веществ и взвешенных частиц, которые составляют основную массу остатков. В аэробной зоне, прежде всего, используются легкодоступные ОВ: мономеры углеводов, аминокислот, пептиды. Основными конечными продуктами процесса являются углекислота, вода и бактериальная биомасса.

Большую часть ОВ микробные сообщества водоемов получают в виде твердофазной мортмассы фотоавтотрофов, находящихся в виде биополимеров (белки, липиды, полисахариды, нуклеиновые кислоты и др. соединения). Эти крупные, имеющие сложное строение молекулы не могут быть утилизированы микроорганизмами, поскольку они не способны проникать через клеточную мембрану. Поэтому первой фазой разложения ОВ является деструкция биополимеров до более простых фрагментов.

Процесс деструкции осуществляют специализированные группы микроорганизмов, получивших название гидролитических. Стратегией гидролитиков является заселение поверхности субстрата и перевод веществ твердой фазы в раствор, гидролизуя их вне клетки под действием соответствующих экзоферментов - гидролаз: протеаз, липаз, целлюлаз. В поверхностном слое ила биополимеры минерализуются разными видами микроорганизмов Caulobacter, Spirillum, Flexibacter и т.д. (Кузнецов и др., 1985). В результате процесса "твердофазной ферментации" вместо индивидуальных полимеров появляются унифицированные мономеры (аминокислоты, жирные кислоты, углеводы и др.), поступающие в общий резервуар растворенных веществ. Полученные таким образом мономеры усваиваются как самими гидролитиками, так и другими группами микроорганизмов (Пристл, 1987).

Концентрация образующихся олиго- и мономеров в большинстве случаев контролируется синтезом экзоферментов бактерий. При низких концентрациях они являются индукторами синтеза соответствующих экзоферментов, а при высоких — репрессорами. Поэтому, более эффективное разложение полимеров осуществляется микробными консорциями, которые состоят из гидролитических и диссипотрофных микроорганизмов. Диссипотрофы обладают сходной с гидролитиками физиологией и метаболизмом, но не способны к гидролизу полимеров. В микробном сообществе диссипотрофы используют образовавшиеся мономеры и снижают их концентрацию ниже порогового уровня, останавливающего синтез гидролаз (Заварзин, 2000).

Выделенные протеолитические организмы из высокоминерализованных щелочных озер Восточно-Африканского рифта группировались вместе с грамотрицательными родами Deleya — Наlоmonas — Paracoccus на уровне самостоятельных видов в гамма ветви Proteobacteria. Липолитические организмы относились к псевдомонадам и были близки на уровне самостоятельных видов к Pseudomonas, а штамм из озера Натрон принадлежал к роду Stenotrophomonas. Небольшая группа штаммов была отнесена к группе энтеробактерий Vibrio/Alteromonas. Грамположительные организмы, в том числе липолитические, относились к роду Васillus (Заварзин и др., 1999).

Для соляных чеков содового комбината озера Магади выделены галоалкалофильные археи Natronobacterium и Natronococcus, занимающих определенную трофическую позицию, пользуясь концентрированием ОВ при испарении рассола с его погибающим микробным населением (Заварзин и др., 1999). Они являются обитателями содовых водоемов и содовых солончаков. Мелководные бессточные водоемы испытывают огромное влияние изменения климатических условий, и большинство из них являются пересыхающими водоемами. В таких озерах встречаются споровые организмы т.к. они имеют переживающие стадии, выдерживающие высушивание в сильноминерализован¬ном почвенном растворе. Это, прежде всего, спорообразующие бациллы - В.lentus - В.firmus, среди алкалофильных - грамотрицательный вид В.horti.

Также в разложении ОВ в аэробной зоне участвуют алкалофильные стрептомицеты, коринебактерии, микрококки, псевдомонады. Выделенные органотрофные копиотрофы используют все природные субстраты, среди них пептон, глюкоза, дрожжевой экстракт, казеин, оливковое масло, целлюпоза, крахмал (Заварзин и др., 1999).

В мелководных соленых озерах аэробы полностью поглощают кислород в 2-3 мм от поверхности осадка, обеспечивая анаэробные условия (Заварзин, 2000). Поэтому в этих водоемах анаэробная деструкция играет первостепенную роль в разложении мортмассы цианобактерий. Облигатные анаэробы условно можно разделить на 2 группы: первичные анаэробы, которые не нуждаются во внешнем стоке электронов, и вторичные анаэробы, которые могут использовать внешние акцепторы электронов.

Группа первичных анаэробов - анаэробные гидролитики и диссипотрофы осуществляют кислотогенную (водородную) фазу в процессе брожения за счет веществ, получаемых исключительно из субстрата. Поэтому большинство из них способно к выбросу молекулярного водорода, катализируемому выделяющей гидрогеназой. Особенности брожения связаны с вариациями в использовании разных внутренних акцепторов водорода, имеющих термодинамическую обусловленность.

В аэробных условиях полное окисление ОВ до СО2 и воды может осуществляться самими гидролитиками и диссипотрофами. В анаэробных условиях полное разложение ОВ одной группой микроорганизмов термодинамически невозможно, т.к. в отсутствии такого эффективного акцептора электронов как О2 возникает проблема регенерации НАД(Ф)Н . Окисление НАД(Ф)Н происходит только при низких концентрациях водорода в среде. У анаэробных микроорганизмов этот процесс реализуется разными способами.

У некоторых групп бактерий (молочнокислых, пропионовокислых) процесс брожения ОВ идет без образования Н2. Центральным метаболитом биохимических процессов является пируват, трансформация которого приводит к образованию низкомолекулярных продуктов, преимущественно органических кислот. Такие бактерии обладают стабильным метаболизмом, не зависящим от концентрации Н2 в среде. Однако, при благоприятных условиях (обилие доступных веществ) для развития первичных анаэробов может происходить накопление органических кислот, что приводит к резкому снижению рН среды, являющимся консервирующим фактором для анаэробов (Пристл, 1987).

Другой способ анаэробного окисления субстратов с удалением Н2 из сферы реакции и регенерации НАД(Ф)Н осуществляется синтрофными бактериями. Из несбраживаемых соединений они образуют ацетат и водород. Эти микроорганизмы не способны использовать какие-либо другие акцепторы электронов кроме Н+. Соответственно, их метаболизм полностью зависит от концентрации этого продукта в среде. Синтрофы развиваются совместно только с Н2 - использующими анаэробными бактериями, которые способны потреблять Н2 и тем самым поддерживать его концентрацию в среде на низком уровне. Для разных групп бактерий существует свои пороговые значения, до которых они могут снижать содержание Н2 (Заварзин, Колотилова, 2001). Среди них важны две группы бактерий: литотрофные метаногены и сульфидогены. Развитие синтрофов обусловлено выигрышем свободной энергии за счет уменьшения концентрации продукта. Синтрофные отношения наиболее часто встречаются при разложении малодоступных веществ анаэробными бактериями (Симанькова, Ножевникова, 1989).

Радиоизотопные исследования в щелочных озерах Забайкалья показали высокую активность и водородного метаногенеза, но не ацетатного (Намсараев и др., 1999), тогда как в гиперсоленых озерах доминирует метилотрофныи метаногенез (Жилина, 1992). В озерах Южного Забайкалья и северных районов Монголии на образование СН4 бактериальным сообществом используется до 14.0 мг С/м2 сут (Намсараев, 2003).

Мелководные соленые водоемы, несмотря на отсутствие стабильной окислительно-восстановительной обстановки вследствие ветрового перемешивания водной массы, характеризуются высокой интенсивностью процессов круговорота серы. Сульфатредукция в них является доминирующим анаэробным терминальным процессом в разрушении ОВ. Как правило, процесс протекает в иловых отложениях, и лишь на участках, находящихся в ветровой тени, там, где возникают анаэробные условия, кроме того, наблюдается и в водной толще. За счет восстановления сульфатов минерализуется от 0,3 до 35,0 мг Сорг/дм3 ила в сутки (Кузнецов и др., 1985).



1.5. Разнообразие трофических связей в микробном сообществе



Трофическая структура микробного сообщества определяется взаимодействиями между функциональными группами микроорганизмов. Это обуславливает функционирование сообщества как целостной системы с путями метаболизма, определяемыми термодинамическими закономерностями. Из имеющегося набора функционально сходных организмов доминируют те кинетические характеристики, которые наиболее соответствуют условиям, складывающимся в сообществе (Заварзин, Колотилова, 2001).

Микробные сообщества существуют в разных условиях и сильно различаются. Тем не менее, трофические взаимоотношения между разными группировками микроорганизмов сходны в общих чертах (Заварзин, 1993).

Структура микробных сообществ во многом определяется возможностями развития первичных продуцентов, причем требованиям устойчивости удовлетворяют только оксигенные фототрофные организмы. Аноксигенные фототрофы участвуют либо в прямых трофических цепях с глубинным источником Н2 или Н2S, либо во вторичной продукции, замыкая процесс деструкции ОВ. Развитие аноксигенных фототрофов обеспечивает также полное поглощение света в сообществе, способствующих деятельности бактерий - деструкторов. Фотосинтез определяется реакцией СO2+Н2O=СН2O+O2, где СН2O - символ органического углерода, более точно отражаемого уравнением Редфильда (СН2О)106(NНз)16(НзРO4)4.

Разложение мортмассы начинают гидролитики специализированные по определенным полимерам. Деструкторы биополимеров делятся на две группы: организмы, разлагающие легко гидролизуемые соединения (чаще всего аммонификаторы), и организмы, разлагающие устойчивые полимеры клеточной стенки (например, целлюлозоразлагающие бактерии). Гидролиз последних идет вне клетки, поэтому часть их продуктов, такие как дисахариды, рассеиваются и служат субстратом для диссипотрофов. Типичным примером этой группы в анаэробных условиях являются спирохеты. Процесс деструкции легкогидролизуемых веществ (пектина, крахмала) идет быстро и из диссипотрофов выигрывают организмы с большей скоростью рoста, составляющие значительную часть выделяемых в чистую культуру организмов-копиотрофов. Преимущественно они представлены протеобактериями, включающими большинство грамотрицательных организмов с развитым перипластом. Если гидролитики ограничены поверхностью гидролизуемых веществ твердой фазы, то для диссипотрофов ограничения обусловлены притоком рассеиваемых веществ. Существенно, что среди бактерий практически отсутствуют организмы, способные разлагать лигнин. Большинство бактерий не обладают лигниназной активностью или же обладают ею в очень слабой степени (Заварзин, 1998).

Конечными продуктами обмена первичных анаэробов являются несбраживаемые продукты: Н2, ацетат, ЛЖК. Соответственно используемым субстратам выделяют гидрогенотрофные и ацетотрофные организмы. Разложение иных продуктов брожения, в том числе спиртов, суммарно обозначаемых как ЛЖК, включает два варианта: прямое окисление при достаточном окислительном потенциале акцептора или конверсию в водород и ацетат особой группой синтрофных организмов.

Возможность использования несбраживаемых продуктов этой первой фазы обычно связывают с внешними акцепторами электрона: нитратами, окисным железом и марганцем, сульфатами. Их осуществляют бактерии, составляющие группировку вторичных анаэробов.

Вторичные анаэробы используют лишь ограниченное число простых органических соединений - лактат, этанол, Н2 и др. Ключевым процессом при разложении несбраживаемых веществ служит межвидовой перенос Н2 и сопряженный с ним ацетогенез. Межвидовой перенос Н2 обуславливает термодинамическую возможность разложения несбраживаемых веществ, если Н2 удаляется из системы. За счет межвидового переноса Н2 существует группа синтрофных организмов. Внутренним акцептором Н2 в системе может служить только СО2. Ее восстановление в катаболических реакциях осуществляют литотрофные организмы: метаногены и гомоацетогены. Внутриклеточный обмен их во многом сходен, но в одном случае продуктом восстановления служит СН4 по уравнению 4Н2+СО2=СН4+2Н2О, а во втором - ацетат по уравнению 3Н2+2СО2=СН3СООН+2Н2О. Существенное отличие между гомоацетогенами и метаногенами заключается в нижней пороговой концентрации Н2, достигаемой в результате их деятельности. Для водородных метаногенов эта величина в мезофильных условиях значительно превышает значения, чем у ацетогенов (Боднар и др., 1987). Поэтому водородные метаногены оказываются движущей силой всего анаэробного разложения ОВ, обеспечивая возможность окисления продуктов брожения.

В сообществе необходимо взаимодействие всех групп, причем гидрогенотрофные метаногены играют роль конечного стока для Н2, обеспечивающего возможность разложения ЛЖК синтрофами. В противном случае Н2 ингибирует разложение ЛЖК. Сходную роль выполняют и диссипотрофы по отношению к гидролитикам. Т.е в сообществе имеются термодинамически обусловленные обратные связи, и регуляторные связи. К регуляторным связям относиться также и приостановка процесса деструкции ОВ микроорганизмами вследствие накопления органических кислот и снижения рН за счет избыточного поступления легкодоступных углеводов.

Ацетат оказывается ключевым продуктом в системе и поступает из нескольких источников: 1) при гидролизе полимеров, таких как углеводы, белки, липиды; 2) как важный продукт брожений; 3) продукт синтрофов при ацетогенном сдвиге обмена; 4) продукт гомоацетатных организмов. Ацетат не оказывает такого сильного ингибирующего действия на продуцирующие его организмы, как водород. Для разложения ацетата известен ацетокластический метаногенез, осуществляемый только двумя родами метаногенов Metanosarcina и Меtanotrix по уравнению СНзСООН=СН4+СO2. Другая возможность использования ацетата представляет синтрофное разложение ацетата подобно ЛЖК с удалением Н2 водородными метаногенами. Разложение ацетата может осуществляться за счет внешних акцепторов, из которых наиболее вaжны сульфидогенез с Desulfobacter и восстановление Fе(Ш) как прямое, так и синтрофное (Пристл, 1987). Таким образом, разложение ацетата или С2 -путь в анаэробном сообществе представляется ключевым процессом.

В присутствии СO2 разложение ОВ идет по пути образования СН4. Если же Н2 не используется гидрогенотрофными метаногенами в силу каких-либо причин (низкая температура и др.), то начинает действовать гомоацетатный шунт, в котором гидрогенотрофные гомоацетатные бактерии образуют ацетат по реакции: ЗН2 + 2СO2 = СН3СООН + Н2O

В условиях поступления сульфата сообщество развивается по пути сульфидогенеза. Они осуществляют: 1) сток Н2, обеспечивая работу синтрофов и благоприятный термодинамический баланс сообщества; 2) используют лактат, образуемый из углеводов молочнокислыми бактериями в результате удерживают рН системы не давая закислиться среде; 3) группа ацетотрофных сульфидогенов использует ацетат, однако, с некоторым запозданием относительно гидрогенотрофных организмов (Заварзин, Колотилова, 2001).

Характерным во взаимодействии сульфидогенного и метаногенного сообществ служит существование "неконкурентного С1-пути". Например, при разложении пектина образуется метанол, не используемый сульфатредукторами, но окисляемый метилотрофными метаногенами.

Практически все продукты первичных анаэробов (Н2, ацетат, ЛЖК) и Н2S как продукт сульфидогенов в фотической анаэробной зоне могут быть окислены аноксигенными фототрофами. Образующийся сульфат, при окислении Н2S, в котором участвуют фототрофы из гамма-подкласса протеобактерий или зеленые бактерии, может быть снова восстановлен. СВБ и аноксигенные фототрофы могут образовывать весьма прочно связанные и морфологически оформленные консорциумы.

Среди организмов окислительного фильтра характерны хемолитотрофы и метанотрофы. Окисляемыми соединениями являются СН4 для метанотрофов, Н2 для водородных бактерий, СО - для карбоксидобактерий, NНз - для нитрификаторов, Н2S — для серобактерий, устойчивые к окислению соедигения серы, как тиосульфат - для тионовых бактерий.

Вместе с газообразными конечными продуктами обмена вторичных анаэробов в зону хемоклина поступают и органические соединения, преимущественно ацетат и ЛЖК, которые окисляются органотрофами.

Разложение ОВ микроорганизмами приводит к постепенному накоплению наиболее трудно используемых компонентов, которые служат предшественниками гумусовых соединений. Тем не менее, разложение их идет и обусловлено деятельностью автохтонной микрофлоры (Пристл, 1987). 

Наиболее важным конечным продуктом в процессе разложения ОВ для системы трофических связей является СO2, используемый оксигенными фотоавтотрофами в аэробной зоне. Они определяют вход в систему биогеохимических циклов реакциями синтеза биомассы и образования О2 и конкурируют между собой за свет, воду, биогены. Растворимое ОВ разлагается под действием гидролаз до СО2 и Н2О и вновь включается в круговорот веществ. Взвешенное ОВ в водоемах в значительной степени оседает на дно и, вследствие медленной диффузии О2, поступает в анаэробную зону. Дальнейший процесс деструкции ОВ осуществляется функциональными группами микроорганизмов, обладающих специализированным набором ферментов.

Таким образом, микробное сообщество представляет хорошо согласованную систему. Наиболее тесные трофические взаимодействия осуществляются между филогенетически удаленными видами (Заварзин, 1993). 

Пространственная организация тесно связана с трофической и отчетливо проявляется в бентосных сообществах, приобретающих аналогию с тканью. Принцип кооперативной трофической связи между функциональными различными группами бактерий состоит в том, что, продукты обмена одних групп организмов являются субстратом для других (Заварзин и др., 1999).

Питание бактерий осуществляется исключительно путем молекулярной диффузии, движущей силой которой служит градиент концентрации вещества вокруг клетки. Перенос вещества от одного организма к другому пропорционально квадрату расстояния. Чем ближе клетки бактерий от источника питания, тем эффективнее поступление вещества в клетку. Поскольку в бентосных сообществах действуют функциональные группы бактерий, то для взаимодействующих организмов важно сближение на минимальное диффузионное расстояние.

Подобное распределение обусловлено двумя противоположными явлениями в микробном сообществе: образование микроколоний из однородных организмов в процессе размножения и необходимость взаимодействия различных видов. Это биологическое приспособление определило структурную организацию в природном сообществе, где образуются группировки разных организмов часто объединенных общей слизью в микроагрегаты.

Источник вещества является не единичным и точечным, а некоторое их число распределено в трехмерном пространстве.

Перемещение клеток бактерий не служит для облегчения поступления питательных веществ, но их движения с остановками и хаотическим изменением направления движения приводит к диффузии в направлении субстрата, причем с более частыми остановками или увеличением скорости. Этот механизм создает микрозоны, где бактерии движутся особенно интенсивно и образуют тонкие слои, которые могут достигать нескольких сотен микрон.

Микрозоны создают следующую размерную ступень после требований, обусловленных минимальными диффузионными расстояниями в десятки микрон.

Особое значение в микробном сообществе имеет образование биологических приспособлений, способствующих гетерогенности системы. Одним из важных является гликокаликс. Функции его могут быть разные: 1) образование световых колодцев для фотосинтезирующих организмов; 2) для удержания на расстоянии разнородных организмов; 3) образование диффузионных каналов; 4) обобществление разнородных организмов и объединение их в морфологически оформленное сообщество.

В циано-бактериальных матах организмы развиваются не в водно-солевой среде, а в коллоидной матрице. В биопленке создается закономерная морфологическая структура - "псевдоткань", сложенная разнообразными организмами.

Микрозоны объясняют возможность сосуществования, казалось бы, несовместимых процессов. В зоне оксигенного фотосинтеза присутствуют и развиваются анаэробные микроорганизмы. Обычным является нахождение анаэробов в аэрируемом слое почвы. Наружный слой сферической гранулы (комочка почвы) сложен аэробными организмами. При достаточном поступлении растворимого субстрата из внутренней зоны, где разлагается нерастворимое ОВ, и вследствие медленной диффузии О2 внутри образуется анаэробная зона, где может развиваться анаэробное сообщество (Пристл, 1987).



1.6. Использование галофильных микроорганизмов в промышленности



У галофильных бактерий есть уникальные свойства, благодаря которым они приспособились к жизни в заливе Кара-Богаз-Гол, озере Баскунчак и соленых озерах Америки и Египта. Это единственные живые существа, обитающие в безжизненных водах Мертвого моря, научившиеся жить в концентрированном растворе соли под лучами испепеляющего израильского солнца. Логично предположить, что химические вещества, которые позволили галобактериям защитить себя от такой агрессивной внешней среды, должны быть мощными адаптогенами.

Отличительное свойство галобактерий - наличие в них бактериородопсина, сложного молекулярного комплекса, состоящего из белка бактериоропсина и ретиналя (вещество, которое содержится в сетчатке глаза человека). Если пролистать научную литературу в поисках информации о галобактериях, можно прийти к выводу, что кроме бактериородопсина, который является ценным промышленным сырьем, в них нет ничего полезного, и, судя по всему, никаких открытых научных исследований их влияния на организм человека и животных не проводилось. Это тем более странно, если учесть, что галофильные бактерии используются в ряде косметических средств в качестве биологически активной добавки (например, серия Dr. Nona).

Кроме бактериородопсина, о котором уже шла речь, клетки галофилов синтезируют белки, нуклеиновые кислоты, каротиноиды (такие, как ксантофиллы, бактериоруберин, бета-каротин), липиды (фосфатидилглицерофосфат, фосфатидилглицеросульфат), глицерин, кардиолипин, гликолипиды, гликопротеины, а также витамины А, Е, С, бета-каротин, В1, В2, В3, В6, Н, РР.

Липиды галобактерий не содержат азота и характеризуются почти полным отсутствием жирных кислот. Мембранные липиды представлены в основном фосфолипидами, жирными спиртами и сложными молекулами с очень длинными названиями. Кроме того, в клетках галобактерий были обнаружены сквалены, производные гераниевого масла, бактериоруберины, ликопин (каротеноид, обладающий большей антиоксидантной активностью, чем бета-каротин), ретиналь.

Почти все галофилы имеют желтую, оранжевую или пурпурную окраску. Это объясняется высоким содержанием в их тканях каротиноидов, которые защищают бактерии от повреждающего действия УФ-излучения. Ученые университета г. Хиросимы в Японии показали, что бактериоруберин и другие каротиноиды с 50-звенными углеродными цепочками защищают клетки галофилов от мутагенных факторов, таких, как УФ-излучение, ионизирующая радиация, перекись водорода и антибиотик митомицин С. Известно, что в организме человека и животных каротиноиды работают как ловушки свободных радикалов, повышают иммунный статус, улучшают состояние кожи, благотворно влияют на зрение.

Галофилы богаты бетаинами и эктоинами. Эти вещества способны защищать биологические молекулы и живые клетки от экстремальных воздействий (замораживания/размораживания, высушивания, нагревания).

Кроме того, клетки галофилов содержат все разнообразие минералов Мертвого моря - К, Na, Ca, Mg, Fe, Mn, Zn, P, Cu, Se, Cr и др. Особенно много в галофилах калия, так как высокая внутриклеточная концентрация этого вещества служит ионным противовесом концентрированному раствору NaCl в окружающей среде. Чем более концентрирован раствор соли, тем больше калия накапливают клетки галобактерий. При низкой концентрации NaCl клетки галобактерий разрушаются, поэтому организм человека как среда обитания для них непригоден - среди этих бактерий нет ни одного патогенного штамма (Жилина, 2001).

Итак, достаточно взглянуть на химический состав галобактерий, чтобы сделать вывод: галофильные бактерии - это уникальные лаборатории биологически активных веществ, в которых в роли непогрешимого фармацевта выступает сама природа. Известно, что естественные комплексы биологически активных веществ усваиваются организмом человека лучше, чем искусственно созданные смеси витаминов и минералов. Это объясняется тем, что в живых системах биологически активные вещества действуют сообща - одни компоненты восстанавливаются за счет других, активные соединения модулируют действие друг друга или работают как кофакторы в различных биохимических реакциях. Не исключено, что среди веществ, которые позволяют галобактериям адаптироваться к сложным условиям существования, есть неизвестные науке вещества, которые могут быть адаптогенами и для человека.

В России галобактериями в первую очередь занялись физики, которых галобактерии интересовали исключительно как сырье для получения бактериородопсина. В начале 90-х гг. российские ученые научились выращивать галобактерии в водно-минеральной среде и разработали технологию получения биомассы, обогащенной бактериородопсином. 

Заинтересовавшись галофильными бактериями, которые так щедро насыщены каротиноидами, было установлено, что в них могут содержаться и другие вещества, исключительно полезные для организма человека.

Об этом свидетельствовал как химический состав галобактерий, так и экстремальные условия жизни этих удивительных созданий. И тогда на основании предварительных исследований группа ученых фирмы "Аксон" разработала оригинальный препарат Баксин на основе лиофилизированной биомассы галобактерий. Эксперименты показали способность Баксина влиять на процессы, протекающие с участием свободных радикалов, - замедлять образование малонового диальдегида в гомогенатах печени, в 2.7 раза снижать цитотоксическое действие противоопухолевого препарата ПХ+В в культуре клеток аденокарциномы человека, более чем вдвое снижать смертность мышей от лучевой болезни, вызванной гамма-излучением (Калюжная, 1999).

Антиоксидантная активность Баксина, оцененная по его действию на растертую ткань печени мышей, составила от 5 до 11 у. е. на 1 мг препарата, что значительно выше антиоксидантной активности витамина Е (2 у. е. на 1 мг препарата).

Токсикологические исследования показали, что препараты, содержащие лиофилизированную массу галобактерий, не обладают острой и хронической токсичностью, раздражающим и аллергенным действием, мутагенностью, эмбриотоксичностью, тератогенным действием.

 В процессе эволюции галофильные бактерии приспособились к жизни в концентрированном растворе соли при высокой интенсивности УФ-излучения. Это потребовало от них развития мощной антиоксидантной системы и других высокоэффективных защитных систем. Устойчивость галофилов к действию повреждающих факторов, уникальный химический состав, а также отсутствие среди галофилов патогенных штаммов стали основанием для использования этих микроорганизмов в качестве источника биологически активных веществ. В настоящее время отечественные препараты, содержащие лиофилизированные галобактерии (Баксин и мазь баксиновая), прошли испытания на эффективность и безопасность в условиях in vitro и in vivo. Доказано антиоксидантное и радиопротекторное действие Баксина. Получено разрешение на применение Баксина в качестве пищевой добавки на территории РФ, а также разрешение на использование баксиновой мази в ветеринарии.

Кроме использования в медицине, существует возможность применения биополимеров в качестве управляемых светом или электрическими импульсами модулей компьютерных и оптических систем (Калюжная, 1999).

Значительный интерес в связи с этим представляют белки, основная функция которых связана с трансформацией энергии света в химическую в различных фотосинтетических системах. Наиболее вероятным кандидатом среди них является светозависимый протонный насос - бактериородопсин (БР) из галофильного микроорганизма Halobacterium salinarum (ранее Halobacterium halobium), открытый в 1971 году (Звягинцев, 1999). 

Бактериородопсин - ретиналь-содержащий генератор протонного транспорта представляет собой трансмембранный белок в 248 аминокислот с молекулярным весом 26 кДа, пронизывающий мембрану в виде семи -спиралей; N- и C-концы полипептидной цепи находятся по разные стороны цитоплазматической мембраны: N-конец обращен наружу, а C-конец - внутрь клетки. 

БР содержится в клеточной мембране H. salinarum - галофильной архебактерии, которая живет и размножается в соленых болотах и озерах, где концентрация NaCl может превышать 4 М, что в 6 раз выше, чем в морской воде (~ 0,6 М). Этот уникальный белок во многом подобен зрительному белку родопсину, хотя их физиологические функции различны. В то время как зрительный родопсин действует как первичный фоторецептор, который обеспечивает темновое зрение большинства позвоночных животных, физиологическая роль БР заключается в том, чтобы давать возможность галобактериям действовать как факультативным анаэробам в случае, когда парциальное давление кислорода в окружающей среде мало. Белок функционирует как светозависимый протонный насос, который обеспечивает образование электрохимического градиента протонов на поверхности мембраны клетки, который, в свою очередь, служит для аккумулирования энергии. Первичная работа, производимая градиентом, заключается в синтезе АТФ через анаэробное (фотосинтетическое) фосфорилирование и, в этом случае, представляет собой классический пример хемиосмотической гипотезы Митчелла об окислительном фосфорилировании. Когда освещение отсутствует, а парциальное давление кислорода высоко, бактерии возвращаются к аэробному окислительному фосфорилированию (Овчинников, 1982). 

Клетки H. salinarum содержат также два так называемых сенсорных родопсина (СР I и СР II), которые обеспечивают положительный и отрицательный фототаксис. Различные длины волн считываются СР I и СР II как детекторными молекулами, что вызывает каскад сигналов, управляющих жгутиковым двигателем бактерии. При помощи такого элементарного процесса светового восприятия микроорганизмы самостоятельно перемещаются в свет подходящего спектрального состава. Кроме того, в клетках имеется галородопсин (ГР), представляющий собой светозависимый насос ионов Cl–. Его основная функция - транспорт в клетку ионов хлора, которые постоянно теряются бактерией, перемещаясь в направлении изнутри —> наружу под действием электрического поля, создаваемого БР. 

БР локализован в участках клеточных мембран H. salinarum в виде пурпурных мембран (ПМ), образующих двумерные кристаллы с гексагональной решеткой. Эти участки содержат сам белок, некоторые липиды, каротиноиды и воду. Обычно они имеют овальную или круглую форму со средним диаметром около 0,5 мкм и содержат около 25 % липидов и 75 % белка. ПМ устойчивы к солнечному свету, воздействию кислорода, температуре более чем 80ºC (в воде) и до 140ºC (сухие), рН от 0 до 12, высокой ионной силе (3 М NaCl), действию большинства протеаз, чувствительны к смесям полярных органических растворителей с водой, но устойчивы к неполярным растворителям типа гексана. Большое практическое значение имеет существующая возможность встраивания ПМ в полимерные матрицы без потери фотохимических свойств. 

Уникальные свойства бактериородопсина обеспечивают широкий диапазон технических приложений, в которых он может использоваться, однако коммерчески осуществимы на сегодняшний день только оптические, поскольку их интеграция в современные технические системы наиболее проста (Пристл, 1987). 

Оптические приложения основаны на применении пленок БР - полимерных матриц различного состава с включенными в них молекулами белка. Впервые в мире такие пленки на основе дикого типа БР были получены и исследованы в нашей стране в рамках проекта "Родопсин"; в 80-х годах была продемонстрирована эффективность и перспективность применения таких материалов, названных "Биохром", в качестве фотохромных материалов и среды для голографической записи. 

Весьма интересной является возможность варьирования фотохимических свойств пленок БР: 

1.	заменой природного хромофора на модифицированный; 

2.	химическими (физико-химическими) воздействиями; 

3.	точечными заменами определенных аминокислотных остатков методами генетической инженерии. 

Такие модифицированные материалы могут обладать ценными специфическими свойствами, что предопределит их использование как элементной базы биокомпьютера. 



1.7 Описание исследуемого водоема



Объектом исследования явилась вода из водоема антропогенного происхождения - Мраморное озеро (народное название), расположенный в Ахтубинском р-не, Астраханской обл. Известно, что этот техногенный водоем возник в результате добычи гипса. Добыча гипса осуществляется с 1931 г. в результате разработки гипса образовался карьер глубиной 42 м. Карьер является местным базисом эрозии, на его склонах активно проявляются эрозионные и гравитационные процессы, способствующие обрушению хвалынских супесей, суглинков, перекрывающих гипсы. Гипс добывают с помощью ежедневных взрывных работ, в результате которых происходит разрушение гипса и становится возможным его транспортировка к заводу. Взрывы вызывают детонацию грунтов, что приводит к обрушению сводов над пустотами и образованию на дневной поверхности просадок, воронок. Особенно активно этот процесс проявляется к западу и юго-западу от карьера на местности с большим наклоном, обращенным к озеру.

В процессе разработки месторождения в гипсовом карьере был вскрыт водоносный горизонт на глубине 42м (абсолютная отметка - 15м). Для отвода грунтовых вод вблизи карьера с юга от него выкопали неглубокие каналы (0,5 – 0,7м) шириной до 1м. Однако процесс откачки оказался неэффективным, и каналы забросили. В связи со значительным уклоном поверхности от карьера в сторону озера (20м на 1кг) по заброшенным каналам активно проявляется регрессивная и глубинная эрозия, образуется промоины глубиной до 1,5 – 2,8 м. В днищах промоин вода просачивается вглубь, активизирует процессы выщелачивания и приводит к образованию просадок, многочисленных воронок. Дальнейшее углубление воронок приводит к выводу гипсов на дневную поверхность. 

Был определен химический состав воды Мраморного озера (табл. 1), т.к. от химического состава воды во многом зависит видовое и количественное разнообразие микрофлоры. 



Таблица 1

Химический состав воды Мраморного озера*

Хлориды

233,97 г/л

Общая минерализация

383,652 г/л

Жесткость

2400 мгэкв/л

рН

6

*химический состав воды определялся в лаборатории завода им. Кирова.



Эти данные говорят о очень высоком содержании хлоридов и о высокой минерализации воды Мраморного озера. 


Глава 2. Объекты и методы исследования.

	

	С целью выделения и изучения галофильных микроорганизмов были отобраны пробы воды из антропогенного водоема гипсового карьера оз. Мраморное (народное название). Исследовались пробы воды из оз. Мраморное, а также была поставлена микроэкосистема имитирующая оз. Мраморное и спустя 9 месяцев было произведено исследование проб воды из данной экосистемы. Исследования проводили с помощью следующих методов: прямое микроскопирование воды оз. Мраморное, высев воды из данного озера и микроэкосистемы на различные среды: МПА, ср. Сабуро, ср. Чапека, голодный агар все данные среды были приготовлены на воде из данного водоема. 

Отбор проб.

	Пробы воды были отобраны из оз. Мраморное в середине лета 2006 г. в пластиковые стерильные бутылки. 

	Методы отбора проб воды.

	Пробы отбирали в предварительно простерилизованные бутыли, тщательно завернутые в ту бумагу, в которой они стерилизовались. В эти бутыли на расстоянии 2-х метров от берега из оз. Мраморное отбирали с поверхности озера воду. Бутыли подписали, указав время отбора проб, место от куда пробы отобрали, и отправили на исследования в лабораторию.

	 Методы отбора проб ила и гипса.

	Ил и гипс отбирали лопаткой, обработанной спиртом, в стерильные стеклянные банки. Банки подписали и отправили в лабораторию для постановки микроэкосистемы данного озера. 

Методы отбора проб растений.

	Растения из оз. Мраморное отбирались стерильными пинцетами и помещались в бутылки с водой из этого озера. Бутылки были подписаны с указанием места и время отбора проб, и отправлены в лабораторию для постановки микроэкосистемы.

Постановка микроэкосистемы.

	 Микроэкосистема была поставлена 9 месяцев назад, в ней находятся все структурные компоненты оз. Мраморное: вода, гипс, ил (песчано-глинистый, имеющий черные включения и запах сероводорода), водные растения. Перед постановкой микроэкосистемы оз. Мраморное стеклянный аквариум протерли спиртом. На дно стерильного аквариума положили ил и гипс из оз. Мраморное, аккуратно налили воды и поместили водоросли из этого озера. В данную микроэкосистему периодически добавляется вода из оз.Мраморное. После 9-месячной экспозиции произошли измения: появился налет, обрастания на стенках аквариума, на листьях растений, налет толщиной до 1 см, зеленого и зелено-коричневого цвета.

	Эксперимент по выделению различных групп микроорганизмов из исследуемой воды был начат осенью 2006 г. Для выделения различных групп микроорганизмов было произведено прямое микроскопирование воды из оз. Мраморное, а также произведен ряд разведений воды оз. Мраморное и микроэкосистемы имитирующей оз. Мраморное и произведены микробиологические посевы.

Посевы производилсь глубинным методом, при этом в стерильную чашку Петри вносили разведение исследуемой воды и заливали расплавленным и охлажденным до 40-45С агаром. Агар выливали из пробирки в чашку, прямо на посевной материал. Немедленно по выливании агар тщателоно смешивали с посевным материалом путем легкого вращательного движения чашки по поверхности стола. Агар был распределен по дну чашки ровным тонким слоем без пузырьков воздуха и без не залитых им пространств. Когда агар в чашках затвердел, чашки перевернули вверх дном и таком положении поставили в термостат на 7 суток при 30С.

После 7 суток культивирования был произведен просмотр результатов.

Просмотр результатов осуществляли путем микроскопии фиксированных и окрашенных по Граму мазков культур микроорганизмов. Кроме этого производили измерение микроорганизмов. Измерения производили, пользуясь окулярным микрометром, значение которого было определено. Для этого сопоставили шкалу окулярного микрометра с шкалой объектного микрометра, линеечка которого равна 1 мм и разделена на 100 частей. Следовательно, одно деление объектного микрометра равно 0,01 мм, или 10мк. Объектный микрометр поместили на столик микроскопа и при тех же увеличениях, при которых производили измерения микробов. Определили, сколько делений окулярного микрометра придется на одно деление объектного микрометра. По установлении значения деления в дальнейшем пользовались уже только окулярным микрометром, но всегда при одном и том же увеличении микроскопа.

После просмотра культур проводился диагностический тест для определения принадлежности выделенных микроорганизмов к семейству Enterobacteriaceae. Идентификация микроорганизмов осуществлялась при помощи пластины биохимической, дифференцирующей энтеробактерии «ПБДЭ». Исследование проводилось в соответствии с инструкцией по применению «ПБДЭ» (приложение 1) .


Глава 3. Результаты исследования



На начальном этапе исследования производился посев разведений воды из оз. Мраморное и микроэкосистемы оз. Мраморное для выявления галофильных микроорганизмов различных трофических групп.

Спустя 7 дней инкубации в термостате при температуре 30С был произведен просмотр колоний, выросших на данных чашках Петри. Было определено общее число колоний микроорганизмов в 1 мл воды, а также определена родовая принадлежность выросших колоний микроорганизмов.

Результаты исследования воды из оз. Мраморное.

Посев производился на 4 различные среды для выделения разных групп микроорганизмов:

		Соленный МПА использовался для выявления галофильных гетеротрофов, обитающих в данных экстремальных условиях.

Общее число гетеротрофных микроорганизмов определялся посевом разведений 10-1 и 10-2 на твердую питательную среду- МПА глубинным способом.

В результате этого посева было определено ОМЧ:

ОМЧ=1,9*104 КОЕ/мл.

На МПА, приготовленном на основе воды из оз. Мраморное, были обнаружены колонии с различными культуральными признаками. Была проведена микроскопия фиксированных и окрашенных по Грамму микроорганизмов из этих колоний и определен родовой состав микроорганизмов, образующих данные колонии (табл.2). 


Таблица 2 

Культуральные и морфологические признаки гетеротрофных микроорганизмов

№

Культуральные признаки

Число колоний

Морфологические признаки

Предположительный род

1

Колонии круглой формы, с гладкими краями, блестящей поверхностью, слизистой консистенции, светло-коричневого цвета 

106

Г- длинные бесспоровые палочки, 1,0-3,0*2,0-3,0 мкм

р. Haloferax

2 

Колония амебовидной формы с волнистым краем, изогнутый профиль, блестящая, тянущейся консистенции, зернистая, молочного цвета с темно-коричневыми включениями

251

Кокки, 0,8-1 мкм, виде скоплений неправельной формы.

р.Halococcus

3

Колония круглой формы с валиком по краю, края ровные, профель изогнутый, блестящая, слизистой консистенции, молочного цвета, по краю переходящего в коричневый.

128

Г+ бесспоровые палочки, 1,0-1,2*1,0-3,0 мкм.

р.Halobacterium

4

Колонии круглые, выпуклые, блестящие, слизистой консистенции, светло-серого цвета.

956

Г+ споровые палочки, 1,3-2,1*1,5-3,0 мкм

Bacillus

5

Колонии круглые, глянцевые, с не ровными краями, выпуклые, зернистые, желтого цвета

26

Г+ короткие палочки, объединенные в цепь, спорообразующие

Bacillus

6

Колонии неправильной формы, зернистые, глянцевые, желтого цвета

3

Г+ кокки, 1,2-1,6 мкм, объединенные в не длинные цепочки

Streptococcus

7

Колонии неправильной формы, плоские, кожистые, серого цвета

23

Г- необразующие палочки, 1,3-1,6*1,8-2,3 мкм

Providencia

8

Колонии темно-бурого цвета, точечные, глянцевые

15

Г- кокки, 1,3-15*1,6-1,9 мкм

Pseudomonas



		Ср. Чапека используется для выделения грибной микрофлоры.

Посевы со ср.Чапека просматривались в течении 20 суток. В данных посевах было выявлено 4 разновидности грибов, и их общее количество на 1 мл воды составляет 50 КОЕ/мл. При прямой микроскопии данных колоний были выделены 2 рода грибов. 

		Колонии бархатистой консистенции, белого цвета по краю, в конидиальной зоне темно-зеленые. Не выделяют пигмент в агар. Предположительно данный гриб относится к роду Aspergillus.

		Колонии бархатистой консистенции, белые как по краю, так и в конидиальной зоне, пигмент в агар не выделяют. При микроскопии был определен предположительный род данного гриба- Acrеmonium.

		Колонии с очень сильно развитым воздушным мицешием, желтого цвета, пигмент в агар не выделяют, при дальнейшем росте приобретают серо-черную окраску. Предположительно данный гриб относится к роду Aspergillus.

		Колонии бархатистой консистенции, серо-зеленого цвета, пигмента не образуют. Предположительно относится к роду Aspergillus.

		Колонии бархатистой консистенции, в центре колонии имеют темно-зеленую окраску, по краям колонии окраска ярко-зеленая, предположительно относится к роду Aspergillus.

	Ср. Сабуро используется для выявления дрожжевой микрофлоры.

Счет колоний дрожжей производился 2 раза: первый раз через 5 суток и второй раз через 10 суток. Все выросшие колонии были прмикроскопированы, дрожжи были отмечены в некоторых из них. На ср. Сабуро были выявлены колонии дрожжей, их содержание в 1 мл = 120 КОЕ/мл, эти колонии имеют круглую форму, гладкие края, выпуклый профиль, блестящие, розового цвета. Производили микроскопию фиксированных мазков данных колоний, окрашенных по Граму. При микроскопии были обнаружены клетки дрожжей овальной и удлиненно- овальной формы, диаметром 6-10 мкм. Помимо дрожжевой микрофлоры было выявлено наличие колоний бактерий, но их содержание не значительно.

			Голодный агар используется для выявления олиготрофной микрофлоры водоема.

	Спустя 7 дней инкубации была определенна общая численность олиготрофов в 1 мл воды оз. Мраморное ОМЧ=3,3*102 КОЕ\мл.

При просмотре посевов отмечались культуральные и морфологические признаки выросших колоний. Морфологические признаки определялись путем микроскопии фиксированных и окрашенных по Граму мазков с исследуемых колоний (табл.3).



Таблица 3

Культуральные и морфологические признаки

 олиготрофных микроорганизмов

№

Культуральные признаки

Число колоний

Морфологические признаки

Предположительный род

9

Точечные колонии, матовые, плоские, серого цвета. 

33

Г- длинные неправильной формы бесспоровые палочки, 1,0-3,0*2,0-3,0 мкм

Pseudomonas

10

Колонии выедающие агар



Г+ бесспоровые палочки, 1,3-2,1*1,5-3,0 мкм

Halobacterium

11

Колонии точечные, глянцевые, выпуклые, оранжевого цвета

128

Г+ кокки, 0,5-2,0 мкм, образующие скопления не правильной формы

Micrococcus

12

Колонии круглые с неровными краями, плоская, жидкой консистенции, молочного цвета

21

Г+ бесспоровые палочки, слегка изогнутые

Bacillus

13

Колонии круглые с неровными краями, зернистая, темно-коричневого цвета в центре, по краю светлые

15

Г- бесспоровые палочки, изогнутые, 1,2-1,5*2,4-2,7 мкм

Pseudomonas



Результаты исследования воды из микроэкосистемы имитирующей оз. Мраморное.

		МПА использовался для выявления галофильных гетеротрофов, обитающих в данной микроэкосистеме.

Общее число гетеротрофных микроорганизмов определялся посевом разведений 10-1 и 10-2 на твердую питательную среду - МПА глубинным способом.

В результате этого посева было определено ОМЧ:

ОМЧ=9,3*104 КОЕ/мл.

На МПА, приготовленном на основе воды из микроэкосистемы оз. Мраморное, были обнаружены колонии с различными культуральными признаками. Была проведена микроскопия фиксированных и окрашенных по Грамму микроорганизмов из этих колоний и определена родовая принадлежность микроорганизмов, образующих данные колонии (табл.4).



Таблица 4

Культуральные и морфологические признаки микроорганизмов, выросших на МПА из воды микроэкосистемы оз. Мраморное 

№

Культуральные признаки 

Число колоний данного типа

Морфологические признаки

Предположительный род

14

Колонии круглой формы, с гладкими краями, блестящей поверхностью, слизистой консистенции, выпуклый профиль, серого цвета 

98

Г- бесспоровые палочки, 0,5-1,3*1,0-4,2 мкм

Pseudomonas

15

Колония круглой формы, размером не более 0,5 см, края ровные, профель выпуклый, блестящая, слизистой консистенции, серого цвета,

962

Г+ кокки, 0,7-1,5 мкм, одиночные или в парах, 

Providencia 

16

Колонии точечные, круглые, выпуклые, блестящие, слизистой консистенции, оранжевого цвета.

956

Г+ кокки, 1,0-2,3 мкм, 

Micrococcus

17

Колонии круглые, с ровными краями, плоские, глянцевые, темно-коричневого цвета

214

Г+ споровые палочки, 0,8-1,2*1,3-1,6 мкм

Bacillus



		Ср. Чапека используется для выделения и определения родовой принадлежности грибов.

На ср. Чапека было обнаружено родовое разнообразие грибной микрофлоры. Было выявлено 71 колония грибов по своим культуральным и морфологическим признакам разнообразные. Общее количество грибов на 1 мл воды составляет 1,3*102 КОЕ/мл. При прямой микроскопии колоний грибов были выделены несколько различных родов.

Колонии бархатистой консистенции, белого цвета по краю, в конидиальной зоне темно-зеленые, не выделяют пигмент в агар, предположительно относятся к роду Aspergillus.

	Колонии бархатистой консистенции, белые как по краю, так и в конидиальной зоне, пигмент в агар не выделяют. Предположительно относятся к роду Acremonium

	Колонии бархатистой консистенции, темно-коричневого цвета в конидиальной зоне, светло-коричневые по краю, не выделяют пигмент в агар. Предположительно относятся к роду Alternaria.

	колонии пушистой консистенции, в центре и по краю темно-зеленого цвета, а в середине колонии белого, пигмент не выделяют. Предположительно относятся к роду Aspergillus.

	колонии пушистой консистенции, желтго-зеленого цвета, пигмент не выделяют, предположительно относится к роду Aspergillus.

Ср. Сабуро используется для выявления дрожжевой микрофлоры.

Счет колоний дрожжей производился 2 раза: первый раз через 5 суток и второй раз через 10 суток. Все выросшие колонии были промикроскопированны, дрожжи были отмечены в некоторых из них. На ср. Сабуро были выявлены колонии дрожжей, их содержание в 1 мл составило 2,3*103 КОЕ/мл, эти колонии имеют круглую форму, гладкие края, выпуклый профиль, блестящие, розового цвета. Производили микроскопию фиксированных мазков данных колоний, окрашенных по Граму. При микроскопии были обнаружены клетки дрожжей овальной формы, диаметром 5-9 мкм. Помимо дрожжевой микрофлоры было выявлено наличие колоний бактерий, но их содержание не значительно.

Голодный агар используется для выявления олиготрофной микрофлоры водоема.

	Спустя 7 дней инкубации просматривались посевы на голодный агар, при этом было отмечено, что наблюдается рост только колоний выедающих агар. При микроскопии фиксированных и окрашенных мазков было установлено наличие Г+ бесспоровых палочек не правильной формы, 1,3-2,6*1,4-3,6 мкм, предположительно относятся к роду Halobacterium.

	3) результаты исследования выделенных колоний с применением пластины биохимической дифференцирующей энтеробактерии.

	Перед проведением исследования был произведен предварительный пересев культур на МПБ на 4 ч при температуре 37 °С, затем был осуществляен пересев культуры на скошенный мясо-пептонный агар. Посевы инкубировались в течение 24 ч при температуре 37 °С.

	Культуру с мясо-пептонного агара используовали для приготовления суспензии в фосфатно-солевом буферном растворе рН 6,0-6,2 и в 4,0 мл стерильного фосфатно-солевого буферного раствора была внесена исследуемуемая (2-3 петли) культура до образования видимой мутности.

	Затем было проведено исследование культур с помощью ПБДЭ согласно инструкции (приложение 1).

	Спустя 24ч инкубации пластин при температуре 37 °С был произведен учет полученных результатов. Идентификацию культур микроорганизмов осуществляли с использованием таблицы биохимических свойств энтеробактерий, диагностического «ключа», каталога кодов. При этом было установлено, что две культуры из воды исследуемого водоема относятся к семейству энтеробактерий, это культуры № 7 и №15. культура №7 по полученным данным биохимического теста относится к Providencia stuartii, а культура №15, предположительно относится к виду Providencia alcalifaciens. 

	В результате проделанной работы все полученные данные по численности и по родовому разнообразию были объединены в сводные таблицы 5 и 6. 

	

	Таблица 5

	Численность групп водных микроорганизмов оз. Мраморное.

	Группа микроорганизмов

	Количество микроорганизмов в воде оз.Мраморное, КОЕ/мл

	Количество микроорганизмов в воде микроэкосистемы оз.Мраморное, КОЕ/мл

	Сапрофиты 

	1,9*104

	9,3*104

	Олиготрофы 

	50

	1,3*102

	Плесневые грибы

	120

	2,3*103

	Дрожжи 

	3,3*102

	-

	

	Таблица 6

	Родовой состав групп водных микроорганизмов оз. Мраморное 

	 Группа микроорганизмов

	Рода микроорганизмов в воде оз.Мраморное

	Рода микроорганизмов в воде микроэкосистемы оз.Мраморное

	Сапрофиты 

Pseudomonas Providencia

Bacillus

Halococcus, 

Haloferax

Halobacterium

Streptococcus

Pseudomonas

Providencia 

Bacillus

Micrococcus



	Олиготрофы 

Halobacterium

Pseudomonas

Micrococcus

	Bacillus

	Halobacterium

	Плесневые грибы

Aspergillus

Acrеmonium

	

Aspergillus

Acremonium

	 Alternaria




Выводы



 Из воды озера Мраморное выделены микроорганизмы различных трофических групп, определенна их численность. Выделенные микроорганизмы являются галофильными, так как растут на средах, приготовленных на основе воды оз.Мраморное, которая характеризуется повышенной минерализацией.

 В состав выделенных микроорганизмов оз. Мраморное входят сапрофитные и олиготрофные бактерии родов Halobacterium, Pseudomonas, Providencia, Micrococcus, Bacillus, Halococcus, Haloferax, Streptococcus, также в воде данного озера часто встречаются плесневые грибы родов Aspergillus, Acrеmonium. Alternaria.


Литература 



		Агре Н.С. Археобактерии. – Пущино, 1988.- С.241

		Алабышев В.В. Зональность озерных отложений. – 1932, Вып. 6. - С. 1-44.

		Богданова Л.Л. Химический состав атмосферных осадков Забайкалья // в кн.: Геохимия и гидрохимия природных вод восточной Сибири. – Иркутск, 1973.-С. 207-214. 

		Бонч-Осмоловская Е.А., Заварзин Г.А., Герасименко Л.М., Венецкая С.Л. Исследование терминальных процессов анаэробной деструкции нагонных масс кладофоры в озере Сиваш //Микробиология. – 1988, Т. 57, Вып. 2. - 312 с.

		Брянцева И.А. Аноксигенные фототрофные бактерии содовых озер Юго-Восточного Забайкалья. Автореферат на соискание ученой степени канд. биол. наук. - Москва. – 2000, С. 5 - 22.

		Бульон В.В. Первичная продукция планктона внутренних водоемов. -Ленинград: "Наука" ЛО, 1983, 148с.

		Власов Н.А., Филиппова Г.Р. Физико-химическая характеристика минеральных озер Юго-Восточного Забайкалья // в кн.: Геохимия и гидрохимия природных вод восточной Сибири. – Иркутск, 1973, С. 3-57.

		Герасименко Л.М., Дубинин А.В., Заварзин Г.А. Алкалофильные цианобактерии содовых озер Тувы и их экофизиология // Микробиология, 1996, Т.65, №6, С.844-849.

		Герасименко Л.М., Заварзин Г.А. Реликтовые цианобактериальные сообщества // в кн.: Проблемы доантропогенной эволюции биосферы / Отв. ред. д. г. м. н. А. Ю. Розанов. - М.: Наука, 1993, С.222-254

		Гончиков Г.Г., Намсараев Б.Б. Экстремофилы как клеточные фабрики: молекулярная эволюция, экология, биотехнологические перспективы // журн. Инженерная экология. -2000, №1, С.3-13.

		Горленко В.М. Намсараев Б.Б., Кулырова А.В., Заварзина Д.Г., Жилина Т.Н. активность сульфатредуцирующих бактерий в донных осадках содовых озер Юго-Восточного Забайкалья // Микробиология, 1999,- Т, 68, №5, С.664-670.

		Громов Б.В., Павленко Г.В. Экология бактерий. - Л.: Изд-во ЛГУ, 1989, С. 102-104.

		Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология.-М.: Изд-во «Академия», 2003, С. 417-423.

		Дзюба А.А., Тулохонов А.К., Абидуева Т.И., Гребнева П И. Распространение и химизм соленых озер Прибайкалья и Забайкалья // журн. География и природные ресурсы, 1997, №4, С. 65-71.

		Дубинин А.В., Герасименко Л.М., Заварзин Г.А. Экофизиология и видовое разнообразие цианобактерий содового озера Магади // Микробиология, 1995, Т, 64, С.845-849.

		Жилина Т.Н., Заварзин Г.А. Новая экстремально-галофильная гомоацетатная бактерия Acetohalobium arabaticum gen. nov., sp. nov. // Докл. ЛН СССР. 1990, Т. 311, С. 745-747.

		Жилина Т.Н., Гарнова Е.С., Турова Т.П., Кострикина Н.А., Заварзин Г.А. Amphibacillus fermentum sp. nov., Amphibacillus tropicus sp. nov. - новые алкалофильные и факультативно-анаэробные сахаролитические бациллы из озера Магади. // Микробиология, 2001, Т.70, №6, С. 825 - 837.

		Жилина Т.Н., Гарнова Е.С., Турова Т.П., Кострикина Н.А., Заварзин Г.А. Halonatronum saccharophilum gen. nov. sp. nov. - новая галоалкалофильгая бактерия порядка Haloanaerobiales из озера Магади. // Микробиология, 2001, Т.70, №1, С. 77-85.

		Заварзин Г.А. Развитие микробных сообществ в истории Земли // в кн.: Проблемы доантропогенной эволюции биосферы. - М.: Наука, 1993, С. 206-220.

		Заварзин Г.А., Жилина Т.Н., Пикута Е.В. Вторичные анаэробы в галоалкалофильных сообществах озер Тувы // Микробиология, 1996, Т. 65, №4, С. 546-553.

		Заварзин Г.А., Жилина Т.А., Кевбрии В.В. Алкалофильное микробное сообщество и его функциональное разнообразие // Микробиология, 1999, Т. 68. №3, С. 579-599.

		Заварзин Г.А., Жилина Т.Н. Содовые озера природная модель древней биосферы континентов //Природа, 2000, №2, С. 45-55.

		Калюжная М.Г., Хмеленина В.Н., Сузина., Лысенко A.M., Троценко Ю.А. Новые метанотрофные изоляты из щелочных озер Южного Забайкалья. .// Микробиология, 1999, Т.68, №5, С. 677 - 685.

		Кевбрин В.В., Жилина Т.Н., Заварзин Г.А. Разложение целлюлозы алкалофильным анаэробным сообществом // Микробиология, 1999, Т.68, №5, С.686-695.

		Крамаренко Л.Е. Геохимическое и поисковое значение микроорганизмов подземных вод. -Л.: Недра, 1983, С. 85 - 124.

		Кузнецов Н.Т., Мурзаев Э.М. Озерные стадии развития Центральной Азии в четверичное время. Озера полуаридной зоны. - М.: Изд-во АН СССР, 1963, С. 82-88.

		Кузнецов СИ. Микрофлора озер и ее геохимическая деятельность - Л.: Наука, 1970, С.21-50.

		Кулырова А.В. Влияние условий среды обитания на распространение и активность микроорганизмов содовых озер Южного Забайкалья. Автореферат на соискание ученой степени канд. биол. наук. - Улан-Удэ, 1999, С. 5-11.

		Летунова СВ., Ковальский В.В. Геохимическая экология микроорганизмов.-М.: Наука, 1978, С 147- 152.

		Ляликова Н.Н. Роль микроорганизмов в образовании и разрушении сульфидов в рудных месторождениях. - Геология рудн. минералов, 1970, № 1, С. 63-73.

		Мишустин Е.Н., Емцев В.Т. Микробиология.-М.: Агропромиздат, 1987, С 368.

		Намсараев Б.Б., Жилина Т.Н., Кулырова А.В., Горленко В.М. Бактериальное образование метана в содовых озерах Юго-Восточного Забайкалья // Микробиология, 1999, Т.68, №5, С.664-670.

		Намсараев Б.Б. Функциональная роль микробных сообществ экстремальных водных экосистем байкальской рифтовой зоны // Материалы Всероссийской конференции. Биоразнообразие и функционирование микробных сообществ водных и наземных систем Центральной Азии. - Улан-Удэ: Изд-во БГСХА, 2003, С.99-101.

		Перфильев Б.В., Габе Д.Р. Изучение методом микробного пейзажа бактерий, накопляющих марганец и железо в донных отложениях / Роль микроорганизмов в образовании железо-марганцовых озерных руд. - М.: Наука, 1964, С.59-82.

		Пикута Е.В., Лысенко A.M., Жилина Т.Н. Распространение Desulfonatronovibrio hydrogenovorans в содовых озерах Тувы // Микробиология. – 1997, Т.66, С. 262 - 268.

		Практикум по микробиологии. Под ред. Н.С.Егорова, МГУ.- 1976. - С.61-65

		Пристл Ф. Внеклеточные ферменты микроорганизмов- М.: Мир, 1987, 115с.

		Романенко В.И. Микробиологические процессы продукции и деструкции органического вещества во внутренних водоемах. - М.: Наука, 1985, С. 293-295.

		Самарина B.C. Гидрогеохимия.- Л.:ЛГУ, 1977, С.285-324.

		Симанькова М.В., Ножевникова А.Н. Термофильное гомоацетатное сбраживание целлюлозы комбинированной культурой Clostridium thermocellum и Clostridium thermoautotrophicum // Микробиология, 1989, Т. 58, С. 897 -902.

		Сорокин Д.Ю., Лысенко A.M., Митюшина Л.Л. выделение и характеристика алкалофильных хемоорганотрофных бактерий, окисляющих восстановленные неорганические серные соединения до тетратионата // Микробиология, 1996. Т.65, С.370 - 383.

		Стрижова Т.А., Орлик Л.А. Гидрохимический режим озера // Содовые озера Забайкалья: экология и продуктивность, Новосибирск. Наука, 1991, С. 19-80.

		Тополов А.А. Донное газообразование в озерах Забайкалья / Отв. ред. канд. биол. наук Парфенова В.В. - Новосибирск.- Наука, 1991, С.44-50.

		Троценко Ю.А., Хмеленина В.Н. Особенности биологии галоалкалофильных метанотрофов. // Микробиология, 2002, Т. 71, №2, С. 149-159.

		Франк-Каменецкий А.Г. Гуджирные озера Восточно-Сибирского края // За индустриализацию Советского Востока, 1932, №2, С. 25-34.

		Шлегель Г. Общая микробиология, М.: Мир, 1987, С. 556 - 559.

		Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Baltimore; Hong Kong; London; Sydney, 1984, 1986, 1989. Vol. 1-4.

		Gorlenko V.M., Bryantseva I.A. & Kompantseva E.I. Novel alkaliphilic heliobacteria from southeast Siberia soda lakes environments. In: Abstracts of the Workshop on "Green and Heliobacteria", Urbino, Italy, 1997 - p.6.


ПРИЛОЖЕНИЕ


МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННОЕ ОБЪЕДИНЕНИЕ

ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ СИСТЕМНЫ

ИНСТРУКЦИЯ

по применению пластины биохимической, дифференцирующей энтеробактерии «П Б Д Э»

ПБДЭ - система одноразового использования для дифференциации микроорганизмов семейства энтеробактерии.

ПБДЭ позволяет определить следующие биохимические свойства: утилизацию цитрата натрия, как в присутствии сахара (модификация цитратной среды Христенсена), так и без него (модификация цитратной среды Симмонса), малоната натрия, глюкозы лактозы, маннита, сахарозы, инозита, сорбита, арабинозы, мальтозы, образование индола сероводорода, ацетилметилкарбинола (реакция Фогес-Проскауэра), наличие уреазы, β-галактозидазы, декарбоксилаз орнитина и лизина, дегидролазы аргинина, дезаминазы фенилаланина.

ПБДЭ представляет собой панель с 20 конусообразными лунками, на дно которых нанесены соответствующие субстраты с индикатором, стабилизированные поливиниловым спиртом. Панель закрывается крышкой Панель и крышка изготовлены из полистирола.

Субстраты с индикаторами вносят в лунки в жидком виде, затем высушивают и стерилизуют.

Биологические свойства. Специфическое действие препарата заключается в возможности дифференцировать энтеробактерии на основе определения ферментативных систем по их действию на соответствующие субстраты.

Назначение. Пластина биохимическая -дифференцирующая, энтеробаетери предназначена, для определения ферментативной активности микроорганизмов семейства Еnterobacteriaceae, выделяемых в ходе бактериологического исследования, и идентификации представителей данного семейства до вида.

Способ применения

1.	Приготовление растворов

Фосфатно-буферный раствор (ФБР) рН 6.0-6,2 - для приготовления суспензии исследуемых образцов. Содержимое флакона с сухими компонентами ФБР растворяют в 100,0 мл дистиллированной воды.

Стерилизуют автоклавированием 30 мин при 0,5 атм, концентрацию водородных ионов рН контролируют на иономере универсальном.

Хлорид железа - для выявления наличия фенилаланиндезаминазы. Содержимое флакона растворяют в 1,8 мл дистиллированной воды

Парадиметиламинобензальдегид - для обнаружения индолообразования. Для приготовления реактива Эрлиха навеску растворяют в 1,9 мл 96% этилового спирта, а затем добавляют 0,4 мл 33% соляной кислоты

α-нафтол - для обнаружения образования ацетилметилкарбинола. Содержимое флакона растворяют в 2,38 мл 96% этилового спирта. Готовят ех tеmроrе.

Калия гидроокись - для обнаружения образования ацетилметилкарбинола. Содержимое флакона растворяют в 1,2 мл дистиллированной воды.

2.	Подготовка исследуемых образцов

Перед проведением исследования выделенная культура подлежит изучению на чистоту и принадлежность к семейству Еnterobacteriaceae.

Идентификацию культур, выделяемых непосредственно из нативного материала, производят со скошенного мясо-пептонного агара или со среды Олькеницкого. Используют культуры, выращенные в течение 18-24 ч при температуре 37°С, без предварительного подращивания их на мясо-пептонном бульоне.

Если выделенная культура микроорганизма находилась какое-либо время на хранении при комнатной температуре или в холодильнике, производят предварительный посев ее на мясо-пептонный бульон на 2-4 ч при. Температуре 37°С, затем осуществляют пересев культуры на скошенный мясо-пептонный агар. Посевы инкубируют в течение 18-24 ч при температуре 37 °С.

Культуру с мясо-пептонного агара или среды Олькеницкого используют для приготовления суспензии в фосфатно-солевом буферном растворе рН 6,0-6,2 и доводят мутность суспензии до 10 единиц по отраслевому стандартному образцу мутности бактерийных взвесей, стеклянному.

При отсутствии отраслевого стандартного образца в 4,0 мл стерильного фосфатно-солевого буферного раствора вносят исследуемую (2-3 петли) культуру до образования видимой мутности.

Проведение исследования

1.	Вскрывают упаковку.

2.	Регистрируют на крышке панели номер засеваемого штамма.

3.	Открывают крышку и располагают панель на столе.

4.	Добавляют пипеткой по 0,15 мл микробной суспензии во все лунки панели, кроме лунки для

обнаружения сероводорода (№ 11), куда вносят только одну каплю (0,05 мл) суспензии.

5.	Заливают лунку для обнаружения сероводорода (№ 11) 0,1 мл растопленного и охлажденного до температуры (38-40) °С мясо-пептонного агара, содержащего 0,6% агара микробиологического, и быстро все перемешивают концом раскапывающей пипетки.

6.	Для создания анаэробных условий добавляют 1-2 капли стерильного вазелинового масла в лунки для определения лизиндекарбоксилазы (№ 4), аргининдегидролазы (№ 5), орнитиндекарбоксилазы (№ 6), уреазы (№ 10) и образования сероводорода (№ 11)

7.	Закрывают крышку панели.

8.	Выдерживают ПБДЭ в течение 18-24 ч при температуре 37 °С.

Учет результатов. Учет результатов производят визуально в соответствии с цветовым указателем, приложенным к ПБДЭ, через 18-24 ч инкубации при температуре 37 °С, за исключением теста на обнаружение β-галактозидазы, который проводят дважды: через 3-5 ч и через 18-24 ч, т.к. у некоторых штаммов лимонно-желтое окрашивание через 18-24 ч исчезает.

Через 18-24 ч инкубации открывают крышку панели и в лунку для выявления фенилаланиндезаминазы (№ 7) добавляют 1 каплю 10 %-го раствора хлорида железа (железо треххлористое 6-водное), в лунку для определения ацетилметилкарбинола (№ 9) 1 каплю 6%-го раствора а-нафтола и затем 1 каплю 40%-го раствора гидроокиси калия, в лунку для выявления индола (№ 8) - 1-3 капли реактива Эрлиха. Реакции учитывают немедленно, выявление ацетилметилкарбинола осуществляют через 15-20 мин после закапывания реактивов.

Идентификацию культур микроорганизмов осуществляют с использованием таблицы биохимических свойств энтеробактерий, диагностического «ключа», каталога кодов - пособия для интерпретации результатов идентификации с использованием математического метода классификации.



Цветовой указатель

	

Тесты

Цвет среды в

 растворенном виде

Положительная реакция 

Отрицательная реакция

1

Утилизация цитрата натрия

желтый, светло-зеленый

темно-зеленый, синий

желтый, светло-зеленый

2

Утилизация малоната натрия

желтый

темно-зеленый, синий

желтый, светло-зеленый

3

Утилизация цитрата натрия с глюкозой

желтый коричневый

фиолетовый, бурый

желтый, коричневый

4

Наличие лизиндекарбоксилазы

желтый, светло-зеленый

темно-зеленый, синий

желтый, светло-зеленый

5

Наличие аргининдегидролазы

Желтый, светло-зеленый

темно-зеленый, синий

желтый, светло-зеленый

6

Утилизация орнитиндекарбоксилазы

Желтый, светло-зеленый

темно-зеленый, синий

желтый, светло-зеленый

7

Наличие фенилаланиндезаминазы

бесцветный

темно-зеленый

желтый

8

Образование индола

бесцветный

розовый

бесцветный

9

Образование ацетилметилкарбинола

бесцветный

розовый, малиновый

бесцветный

10

Наличие уреазы

желтый

малиновый, красный

желтый

11

Образование сероводорода

бесцветный

черный, темно-серый

желтый

12

Утилизация глюкозы

красный

желтый

красный

13

Наличие β-галактозидазы

бесцветный

лимонно-желтый

бесцветный

14

Утилизация лактозы

красный

желтый

красный

15

Утилизация маннита

красный

желтый

красный

16

Утилизация сахарозы

красный

желтый

красный

17

Утилизация инозита

красный

желтый

красный

18

Утилизация сорбита

красный

желтый

красный

19

Утилизация арабинозы

красный

желтый

красный

20

Утилизация мальтозы

красный

желтый

красный



Обезвреживание ПБДЭ Погружением (полным) на 60 мин в 3% раствор хлорамина Б или 6% раствор перекиси водорода с 0,5% СМС.

Форма выпуска. Выпускается в наборе, состоящем из 20 пластин в герметично запаянном пакете, 1 флакона с 0,95 г сухих компонентов ФБР рН 6,0-6,2, 1 флакона с 0,2 г хлорида железа (III), 1 флакона с 0,02 г парадиметиламинобензальдегида. 1 флакона с 0,8 г калия гидроокиси, 1 флакона с 6,12 г а-нафтола, 1 флакона с 8,0 г масла вазелинового, инструкции по применению, диагностического «ключа», таблицы биохимических свойств энтеробактерий и 20 штук кодовых карточек. Набор тест-системы упакован в коробку. По просьбе потребителей к набору может быть дополнительно приложен каталог кодов.

Условия хранения и транспортирования. Транспортирование и хранение препарата в защищенном от света месте при температуре от 2 до 25○С.

Срок годности 1 год.





2