Исследование денатурации белка под действием ионных детергентов

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

физический факультет кафедра общей физики











ДОКЛАД

На тему:











«Денатурация белков под  действием ионных детергентов»

















































Выполнила студентка группы 505

Даренская Татьяна Владимировна

















Москва – 2010

Оглавление

	1. Белки и их структура.	3

	2. Денатурация белков	6

	3. Детергенты	8

	4. Денатурация под действием ионных детергентов	11





































































1. Белки и их структуры.

Белки - полимерные молекулы, в которых мономерами служат аминокислоты. Пептидные цепи содержат десятки, сотни и тысячи аминокислотных остатков, соединённых прочными пептидными связями. За счёт внутримолекулярных взаимодействий белки образуют определённую пространственную структуру, называемую "конформация белков". Линейная последовательность аминокислот в белке содержит информацию о построении трёхмерной пространственной структуры. Различают 4 уровня структурной организации белков, называемых первичной, вторичной, третичной и четвертичной структурами (рис. 1.1). Существуют общие правила, по которым идёт формирование пространственных структур белков. 



Рис. 1.1 - Этапы формирования конформации белков. 1 - первичная структура; 2 - вторичная структура; 3 - третичная структура; 4 - четвертичная структура.

Аминокислотные остатки в пептидной цепи белков чередуются не случайным образом, а расположены в определённом порядке. Линейную последовательность аминокислотных остатков в полипептидной цепи называют "первичная структура белка". 

Каждый из 50 000 индивидуальных белков организма человека имеет уникальную для данного белка первичную структуру. Все молекулы данного индивидуального белка имеют одинаковое чередование аминокислотных остатков в белке, что в первую очередь отличает данный индивидуальный белок от любого другого. 

Линейные полипептидные цепи индивидуальных белков за счёт взаимодействия функциональных групп аминокислот приобретают определённую пространственную трёхмерную структуру, называемую "конформация". Все молекулы индивидуальных белков (т.е. имеющих одинаковую первичную структуру) образуют в растворе одинаковую конформацию. Следовательно, вся информация, необходимая для формирования пространственных структур, находится в первичной структуре белков. 

В белках различают 2 основных типа конформации полипептидных цепей: вторичную и третичную структуры. 

Вторичная структура белков - пространственная структура, образующаяся в результате взаимодействий между функциональными группами, входящими в состав пептидного остова. При этом пептидные цепи могут приобретать регулярные структуры двух типов: α-спираль и β-структура. 

В α-спирали пептидный остов закручивается в виде спирали за счёт образования водородных связей между атомами кислорода карбонильных групп и атомами азота аминогрупп, входящих в состав пептидных групп через 4 аминокислотных остатка. Водородные связи ориентированы вдоль оси спирали (рис. 1.2). На один виток α-спирали приходится 3,6 аминокислотных остатка. 

В образовании водородных связей участвуют практически все атомы кислорода и водорода пептидных групп. В результате α-спираль "стягивается" множеством водородных связей. Несмотря на то, что данные связи относят к разряду слабых, их количество обеспечивает максимально возможную стабильность α-спирали. Так как все гидрофильные группы пептидного остова обычно участвуют в образовании водородных связей, гидрофильность (т.е. способность образовывать водородные связи с водой) α-спиралей уменьшается, а их гидрофобность увеличивается. 



Рис. 1.2 - -Спираль. На рисунке показаны пространственное строение -спирализованного участка полипептидной цепи и образование водородных связей, участвующих в формировании -спирали.

β -Структура формируется за счёт образования множества водородных связей между атомами пептидных групп линейных областей одной полипептидной цепи, делающей изгибы, или между разными полипептидными цепями, β-Структура образует фигуру, подобную листу, сложенному "гармошкой", - β-складчатый слой (рис. 1.3). 



Рис. 1.3 - Вторичная структура белков в виде β-складчатого слоя.



Когда водородные связи образуются между атомами пептидного остова различных полипептидных цепей, их называют межцепочечными связями. Водородные связи, возникающие между линейными участками внутри одной полипептидной цепи, называют внутрицепочечными. В -структурах водородные связи расположены перпендикулярно полипептидной цепи. 

Третичная структура белков - трёхмерная пространственная структура, образующаяся за счёт взаимодействий между радикалами аминокислот, которые могут располагаться на значительном расстоянии друг от друга в полипептидной цепи. 

При укладке полипептидная цепь белка стремится принять энергетически выгодную форму, характеризующуюся минимумом свободной энергии. Поэтому гидрофобные радикалы аминокислот стремятся к объединению внутри глобулярной структуры растворимых в воде белков. Между ними возникают так называемые гидрофобные взаимодействия, а также силы ван дер Ваальса между близко прилегающими друг к другу атомами. В результате внутри белковой глобулы формируется гидрофобное ядро. Гидрофильные группы пептидного остова при формировании вторичной структуры образуют множество водородных связей, благодаря чему исключается связывание с ними воды и разрушение внутренней, плотной структуры белка. 

Гидрофильные радикалы аминокислот стремятся образовать водородные связи с водой и поэтому в основном располагаются на поверхности белковой молекулы. 

Все гидрофильные группы радикалов аминокислот, оказавшиеся внутри гидрофобного ядра, взаимодействуют друг с другом с помощью ионных и водородных связей.

Ионные связи могут возникать между отрицательно заряженными (анионными) карбоксильными группами радикалов аспарагиновой и глутаминовой кислот и положительно заряженными (катионными). Водородные связи возникают между гидрофильными незаряженными группами (такими как -ОН, -CONH2, SH-группы) и любыми другими гидрофильными группами. Белки, функционирующие в неполярном (липидном) окружении, например белки мембран, имеют обратное устройство: гидрофильные радикалы аминокислот расположены внутри белка, в то время как гидрофобные аминокислоты локализованы на поверхности молекулы и контактируют с неполярным окружением. В каждом случае радикалы аминокислот занимают наиболее выгодное биоэнергетическое положение. 

Третичную структуру некоторых белков стабилизируют дисульфидные связи, образующиеся за счёт взаимодействия SH-групп двух остатков цистеина. Эти два остатка цистеина могут находиться далеко друг от друга в линейной первичной структуре белка, но при формировании третичной структуры они сближаются и образуют прочное ковалентное связывание радикалов.

Большинство внутриклеточных белков лишено дисульфидных связей. Однако такие связи распространены в белках, секретируемых клеткой во внеклеточное пространство. Полагают, что эти ковалентные связи стабилизируют кон-формацию белков вне клетки и предотвращают их денатурацию. К таким белкам относят гормон инсулин и иммуноглобулины. 

Все белки с одинаковой первичной структурой, находящиеся в одинаковых условиях, приобретают одинаковую, характерную для данного индивидуального белка конформацию, определяющую его специфическую функцию. Функционально активную конформацию белка называют "нативная структура". 

Если полипептидная цепь белка содержит более 200 аминокислот, как правило, её пространственная структура сформирована в виде двух или более доменов. Домен - участок полипептидной цепи, который в процессе формирования пространственной структуры приобрёл независимо от других участков той же цепи кон-формацию глобулярного белка. Так, лёгкая цепь иммуноглобулина G состоит из двух доменов. В некоторых случаях доменами называют отдельные структурные участки полипептидной цепи. 

Домены обычно можно выделить, действуя на белок протеолитическими ферментами, легко разрывающими пептидные связи на участке полипептидной цепи, расположенной между доменами. После этого некоторые домены могут сохранять свои биологические свойства. 

Многие белки содержат в своём составе только одну полипептидную цепь. Такие белки называют мономерами. К мономерным относят и белки, состоящие из нескольких цепей, но соединённых ковалентно, например дисульфидными связями (поэтому инсулин следует рассматривать как мономерный белок). 

В то же время существуют белки, состоящие из двух и более полипептидных цепей. После формирования трёхмерной структуры каждой полипептидной цепи они объединяются с помощью тех же слабых взаимодействий, которые участвовали в образовании третичной структуры: гидрофобных, ионных, водородных. 

Количество и взаиморасположение полипептидных цепей в пространстве называют "четвертичная структура белков". Отдельные полипептидные цепи в таком белке носят название протомеров, или субъединиц. Белок, содержащий в своём составе несколько протомеров, называют олигомерным. В состав олигомерных белков может входить от двух до нескольких десятков протомеров, хотя наиболее часто встречают белки, содержащие от двух до четырёх полипептидных цепей (димерные, тетрамерные белки). 

Белки играют центральную роль в реализации и регуляции практически всех процессов жизнедеятельности, протекающих в организмах на молекулярном уровне, поэтому проблема взаимосвязи структуры и функции белковых макромолекул является одной из центральных в современной науке. Для того чтобы белки эффективно осуществляли свои функции, необходима определенная стабильность белковой макромолекулы. Белковые макромолекулы способны претерпевать структурные перестройки под действием различных агентов. 




2. Денатурация белков

Разрыв большого количества слабых связей в молекуле белка приводит к разрушению её нативной конформации. Так как разрыв связей под действием различных факторов носит случайный характер, то молекулы одного индивидуального белка приобретают в растворе форму случайно сформировавшихся беспорядочных клубков, отличающихся друг от друга трёхмерной структурой. Потеря нативной конформации сопровождается утратой специфической функции белков. Этот процесс носит название денатурации белков. При денатурации белков не происходит разрыва пептидных связей, т.е. первичная структура белка не нарушается. 

В денатурированном белке гидрофобные радикалы, которые в нативной структуре молекулы спрятаны внутри гидрофобного ядра, оказываются на поверхности. При достаточно высокой концентрации белка и отсутствии сильного отталкивающего заряда молекулы могут объединяться друг с другом гидрофобными взаимодействиями, при этом растворимость белка снижается и происходит образование осадка. 

Компактная, плотная пространственная структура нативного белка при денатурации резко увеличивается в размерах и становится легко доступной для расщепления пептидных связей протеолитическими ферментами. Термическая обработка мясной пищи перед употреблением не только улучшает её вкусовые качества, но и облегчает её ферментативное переваривание в пищеварительной системе. Кроме того, денатурирующим действием на пищевые белки обладает и кислая среда желудка, вызывающая денатурацию тех белков, которые не подвергались предварительной температурной обработке, а также оказывает денатурирующее действие на белки микроорганизмов, попавших в желудок с пищей. 

Денатурацию белков вызывают факторы, способствующие разрыву гидрофобных, водородных и ионных связей, стабилизирующих конформацию белков: 

высокая температура (более 50 °С), увеличивающая тепловое движение атомов в молекуле и приводящая к разрыву слабых связей; 

интенсивное встряхивание раствора, приводящее к соприкосновению белковых молекул с воздушной средой на поверхности раздела фаз и изменению конформации этих молекул; 

органические вещества (например, этиловый спирт, фенол и его производные) способны взаимодействовать с функциональными группами белков, что приводит к их конформационным изменениям. Для денатурации белков в биохимических исследованиях часто используют мочевину или гуанидинхлорид, которые образуют водородные связи с амино- и карбонильными группами пептидного остова и некоторыми функциональными группами радикалов аминокислот. Происходит разрыв связей, участвующих в формировании вторичной и третичной структуры нативных белков, и образование новых связей с химическими реагентами; 

кислоты и щелочи, изменяя рН среды, вызывают перераспределение связей в молекуле белка; 

соли тяжёлых металлов (такие как медь, ртуть, серебро, свинец и др.) образуют прочные связи с важными функциональными группами белков (чаще всего с -SH), изменяя их конформацию и активность; 

детергенты - вещества, содержащие гидрофобный углеводородный радикал и гидрофильную функциональную группу (такие вещества называют амфифильными). 



Рис. 2.1 - Структура нативной молекулы белка (в центре) и трёх денатурированных молекул этого же белка.





































3. Детергенты

Детергенты (от лат. detergere — мыть, очищать) представляют собой поверхностно-активные вещества с моющим действием, которое обусловлено их способностью образовывать в воде устойчивые коллоидные растворы. Поверхностная активность детергентов, то есть способность адсорбироваться на границе раздела фаз (типа вода—воздух или вода—масло), связана с амфифильностью их молекул. Амфифильными (от греч. фило — любящий и амфи — обоих) называют вещества, в молекулах которых имеются четко разграниченные гидрофильные и гидрофобные области, благодаря чему такие молекулы обладают сродством не только по отношению к воде, но и к неполярным органическим растворителям.

В воде молекулы детергентов стремятся ассоциировать друг с другом, давая мицеллы (рис. 3.1). Эти агрегаты состоят из большого числа детергентных молекул (обычно от нескольких десятков до нескольких сот), ориентированных в мицелле таким образом, что их неполярные группы формируют внутреннее гидрофобное ядро мицеллы, а гидрофильные полярные группировки находятся на ее поверхности и контактируют с окружающими молекулами воды.







Цилиндрические мицеллы





Рис. 3.1 - Различные типы мицелл, образуемых детергентами в воде в зависимости от их химического строения, концентрации и условий среды. Сферические мицеллы имеют минимальные размеры (около 4 нм) и обычно существуют в области концентраций, ненамного превышающих ККМ. С ростом концентрации детергента сферические мицеллы переходят в цилиндрические мицеллы, средняя длина которых зависит от концентрации детергента. Эллипсоидальные мицеллы образуют детергенты, у которых соотношение между размерами полярной и неполярной областей молекулы может меняться, а также детергенты в смеси с другими амфифильными соединениями.



Именно благодаря наличию гидрофобного ядра мицеллы способны солюбилизировать, то есть переводить в раствор неполярные вещества, практически нерастворимые в воде. В качестве параметров, характеризующих способность детергентов к мицеллообразованию, обычно используют критическую концентрацию мицеллообразования (ККМ) и число агрегации. ККМ — это та концентрация, при которой детергент начинает образовывать мицеллы. До этого он находится в воде в мономерной форме в состоянии истинного раствора. Число агрегации показывает, сколько молекул детергента приходится на одну мицеллу.

В настоящее время известно несколько сот различных детергентов. Все они разделяются на два основных класса: ионные и неионные детергенты в зависимости от наличия или отсутствия заряженных групп в гидрофильной области их молекул. 

Неионогенные ПАВ растворяются в воде, не ионизируясь. Растворимость неионогенных ПАВ в воде обуславливается наличием в них функциональных групп. Как правило, они образуют клатраты в водном растворе вследствие возникновения водородных связей между молекулами воды и атомами кислорода полиэтиленгликолевой части молекулы ПАВ. К ним относятся: полигликолевые эфиры жирных спиртов и кислот, полигликолевые эфиры амидов жирных кислот, ацилированные или алкилированные поли гликолевые эфиры алкиламидов. Ярким представителем неионогенных ПАВ является Тритон Х-100 . Добавление этого сурфактанта в раствор зачастую улучшает растворимость белка, при этом не вызывая его денатурацию.

	Основную долю в фармацевтических, косметических, медицинских и биохимических исследованиях составляют ионные детергенты, с их помощью влияют на энергетическое состояние и структуру межфазной поверхности и через неё регулируют свойства микрогетерогенных систем.

	Благодаря высокой поверхностной активности и способности к растворению белков и липидов, а также способности вызывать диссоциацию и денатурацию белков, инактивацию вирусов и токсинов именно ионные детергенты широко применяются для приготовления медицинских фармацевтических препаратов (например, бактерицидных и дезинфицирующих), а также дерматологических и косметических средств.

Ионные детергенты по типу заряда делятся на катионные, анионные, и цвиттерионные (амфотерные).



Рис. 3.2 – Структурная формула додецилсульфатаАнионные ПАВ - это соединения, которые в водных растворах диссоциируют с образованием анионов, обусловливающих поверхностную активность. Среди них наибольшее значение имеют линейный алкилбензосульфонат, сульфаты и сульфоэфиры жирных кислот. Широко используемым примером является детергент, додецилсульфат натрия (рис. 3.2). 



Рис. 3.3 – Структурная формула цетилтриметиламмонийбромидаКатионные ПАВ в водном растворе диссоциируют с образованием катионов, определяющих поверхностную активность. Среди катионных ПАВ наибольшее значение имеют четвертичные аммониевые соединения, имидазалины и жирные амины. Одним из ярких представителей катионных детергентов является цетавлон (ЦТАБ) (рис. 3.3). 

Детергенты изменяют конформацию белка, в связи с этим исследование взаимодействия ПАВ, как ДСН и ЦТАБ, является важной задачей.


4. Денатурация под действием ионных детергентов

Гидрофобные радикалы белков взаимодействуют с гидрофобными частями детергентов, что изменяет конформацию белков. Денатурированный под действием детергентов белок обычно остаётся в растворённом виде, так как гидрофильные части денатурирующего вещества удерживают его в растворе. К наиболее известным детергентам относят различные мыла (рис. 4.1). 





Рис. 4.1 - Денатурация белков с помощью детергентов.



Эффективными денатурирующими агентами являются ионные детергенты, среди которых в биохимической практике особенно часто используют анионный детергент додецилсульфат натрия (ДСН) и катионный детергент цетилтриметиламмонийбромид (ЦТАБ, цетавлон).

Взаимодействие белков с детергентами может изучаться различными методами: дифференциальной сканирующей калориметрией (DSC), с помощью кругового дихроизма, флуоресценции и УФ-спектроскопии поглощения.

Рассмотрим на примере исследования денатурации сывороточного альбумина человека (САЧ) под действием ионных детергентов по анализу собственной триптофановой флуоресценции белка.

На рис. 4.2 изображены зависимости интенсивности в максимуме спектров триптофановой флуоресценции сывороточного альбумина человека от концентрации ДСН для различных значений pH. Видно, что в растворах с ДСН триптофановая флуоресценция сывороточного альбумина человека тушится. Тушение триптофановой флуоресценции белка в растворах с ДСН объясняется его денатурацией, вследствие которой при разворачивании белковых глобул хромофорная группа триптофана альбумина становится более доступной для молекул воды, тушащих её свечение.

Из рис. 4.2 видно, что более сильное тушение собственной триптофановой флуоресценции сывороточного альбумина, наблюдаемое в растворах с ДСН, при одинаковых концентрациях ДСН имеет место при более низких значениях pH. Данная закономерность говорит об электростатическом механизме взаимодействия сывороточного альбумина человека с ДСН. ДСН в растворе диссоциирует на положительно заряженные катионы натрия и додецилсульфат-анионы, которые и взаимодействуют с белком. Молекулы сывороточного альбумина человека в целом заряжены положительно при pH, меньших pI альбумина.

Поэтому при низких значениях pH происходит интенсивное связывание в целом положительно заряженных макромолекул белка с додецилсульфат-анионами, вследствие чего происходит сильное тушение триптофановой флуоресценции альбумина. По мере увеличения pH в целом положительный заряд макромолекулы альбумина уменьшается, а при pH, больших pI, макромолекулы альбумина приобретают в целом отрицательный заряд. Поэтому при высоких значениях pH (больших pI) происходит слабое связывание додецилсульфат-анионов и в целом отрицательно заряженных молекул альбумина, хотя еще и сохраняющих какие-то положительно заряженные участки на своих поверхностях, вследствие чего в растворах с ДСН происходит слабое тушение триптофановой флуоресценции альбумина. Следовательно, более сильная денатурация белка под действием ДСН имеет место при pH, меньших pI белка.

Установленные из экспериментальных данных зависимости интенсивности в максимуме спектра триптофановой флуоресценции сывороточного альбумина человека при различных значениях pH от концентрации ДСН (рис. 4.2) можно объяснить двустадийным механизмом денатурации этого белка в присутствии ДСН. первая переходная стадия денатурации белка – разрыхление белковых глобул, вторая стадия денатурации – разворачивание аминокислотной цепи белка. 

. При концентрациях ДСН, меньших 1 мМ, происходит тушение триптофановой флуоресценции альбумина для всех pH, что указывает на первую стадию денатурации сывороточного альбумина человека – разрыхление глобул. 

Дальнейшее увеличение (больше 1 мМ) концентрации ДСН при pH, больших изоэлектрической точки альбумина (pI 4,7) имеет практически постоянные значения интенсивности в максимуме спектра триптофановой флуоресценции, , следовательно, денатурация останавливается на первой стадии.

Иной характер зависимостей от концентрации ДСН наблюдается при pH, меньших pI белка в области концентраций ДСН от 1 мМ до 2 мМ интенсивность в максимуме спектра триптофановой флуоресценции имеет практически постоянные значения. При этих концентрациях ДСН (до 2 мМ) происходит первая переходная стадия денатурации белка: белковые глобулы разрыхляются, но полного разворачивания еще не произошло. При дальнейшем увеличении концентрации ДСН до 3 мМ происходит дальнейшее тушение триптофановой флуоресценции альбумина, что говорит о том, что белковые молекулы из переходного состояния разрыхленности переходят во вторую стадию денатурации - стадию полного разворачивания. При увеличении концентрации ДСН свыше 3 мМ (до 7 мМ) более сильного тушения триптофановой флуоресценции альбумина не происходит, что указывает на полную денатурацию молекул альбумина. Следовательно, подобное двухэтапное тушение собственной флуоресценции белка при увеличении концентрации ДСН при этих значениях pH, меньших pI белка, объясняется двустадийным механизмом его денатурации и последовательными конформационными перестройками белковой глобулы, приводящими к оголению триптофана и увеличению его доступности для молекул воды, тушащих его флуоресценцию.

На рис. 4.3. изображена зависимость квантового выхода триптофановой флуоресценции сывороточного альбумина человека (5 мкМ) от концентрации ДСН при различных значениях рН растворов. Из этой зависимости следуют аналогичные выводы о денатурации САЧ под действием ДСН.









































Iфлmax, отн.ед



1000





[ДСН], мМ





Рис. 4.2 - Зависимость интенсивности в максимуме спектра триптофановой флуоресценции сывороточного альбумина человека (5 мкМ) от концентрации ДСН при различных значениях рН растворов

















































B









[ДСН], мМ







Рис. 4.3 - Зависимости квантового выхода триптофановой флуоресценции сывороточного альбумина человека (5 мкМ) от концентрации ДСН при различных значениях рН растворов





























На рис. 4.4 изображены зависимости квантового выхода триптофановой флуоресценции сывороточного альбумина человека (5 мкМ) от концентрации ЦТАБ при рН, больших pI белка.

 Видно, что в растворах с ЦТАБ триптофановая флуоресценция сывороточного альбумина человека тушится. Тушение триптофановой флуоресценции белка в растворах с ЦТАБ объясняется его денатурацией, вследствие которой при разворачивании белковых глобул хромофорная группа триптофана альбумина становится более доступной для молекул воды, тушащих её свечение.

Из рис. 4.4 видно, что более сильное тушение собственной триптофановой флуоресценции сывороточного альбумина, наблюдаемое при одинаковых концентрациях ЦТАБ имеет место при более высоких значениях pH. Данная закономерность говорит об электростатическом механизме взаимодействия сывороточного альбумина человека с ЦТАБ. ЦТАБ в растворе диссоциирует на отрицательно заряженные анионы брома и цетилтриметиламмоний-катионы, которые и взаимодействуют с белком.

При высоких значениях pH (больших изоэлектрической точки белка) макромолекулы белка в целом заряжены отрицательно, поэтому происходит сильное связывание цетилтриметиламмоний-катионов с молекулами белка, флуоресценция белка в растворах ЦТАБ тушится сильно. По мере уменьшения pH отрицательный заряд молекулы альбумина уменьшается, связывание происходит более слабо, поэтому и квантовый выход флуоресценции альбумина в растворах ЦТАБ уменьшается слабее.

При дальнейшем уменьшении pH, при значениях рН, меньших изоэлектрической точки, макромолекулы белка становятся заряжены в целом положительно, но при этом сохраняются и отрицательно заряженные участки. В связи с этим происходит слабое связывание САЧ с катионами ЦТАБ и триптофановая флуоресценция альбумина тушится слабо в растворах с ЦТАБ по сравнению с растворами, не содержащими ЦТАБ.

Видно, что денатурация альбумина под действием ЦТАБ носит одностадийный характер при всех значениях рН.

Процесс денатурации под действием обоих детергентов носит электростатический характер, в связи с этим, характер процессов денатурации белка отличается в зависимости от значений рН.

Было получено, что денатурация альбумина под действием ДСН носит двустадийный характер (первая стадия - разрыхление глобул, вторая - полное разворачивание аминокислотной цепи белка), а под действием ЦТАБ - одностадийный.

Аналогичные результаты были получены и с помощью других методов исследования.















Рис. 4.4 - Зависимости квантового выхода триптофановой флуоресценции сывороточного альбумина человека (5 мкМ) от концентрации ЦТАБ при рН, больших pI белка.























25

2