Влияние предшественника лей-энкефалина на активность ферментов обмена регуляторных пептидов головного мозга и периферических органов крыс в норме и при эмоционально-болевом стрессе

2



ПЕНЗЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ В.Г. БЕЛИНСКОГО





На правах рукописи

ФИРСТОВА Наталья Вадимовна







ВЛИЯНИЕ ПРЕДШЕСТВЕННИКА ЛЕЙ-ЭНКЕФАЛИНА НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ ОБМЕНА РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ ГОЛОВНОГО МОЗГА И ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ ОРГАНОВ КРЫС В НОРМЕ И ПРИ ЭМОЦИОНАЛЬНО-БОЛЕВОМ СТРЕССЕ





03.00.04 – Биохимия



Диссертация на соискание

ученой степени кандидата

биологических наук

Научный руководитель

кандидат биологических наук

профессор Генгин М.Т.







ПЕНЗА – 1999


СОДЕРЖАНИЕ



СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ…………………...…………..………………...….5

	ВВЕДЕНИЕ……………………………………………..……………...……….6

	ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…..……………..……………………...…11

1.1. Опиоидные пептиды и физиолого-биохимические аспекты их действия……………………………………………………...…………………11

1.2. Обмен регуляторных пептидов ………………………………..………..18

1.2.1. Биогенез нейропептидов………….......................................……….18

1.2.2. Механизмы регуляции активности ферментов обмена нейропептидов..………………………………………….…………..………..30

1.3. Опиоидные пептиды при воздействии стрессорных факторов..……...34

1.4. Ферменты обмена нейропептидов при стрессе………………….......…41

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ…….…………48

2.1. Материалы исследования……………………………………..………....48

2.2. Методы исследования………………………………………..…………..49

2.2.1. Схема введения предшественника лей-энкефалина ……………...49

2.2.2. Моделирование острого эмоционально-болевого стресса……….49

2.2.3. Метод определения активности карбоксипептидазы Н……..……50

2.2.4. Метод определения активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы……………………………………………....……...…51

2.2.5. Метод определения активности ангиотензинпревращающего фермента………………………………………………………………...…….51

2.2.6. Методы определения активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ in vitro…………………………...……...……………………..……..52

2.2.7. Метод определения белка по Лоури………………..…...…………52

2.2.8. Статистическая обработка результатов исследования...………….52

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ………………….………….53

3.1. Региональное и тканевое распределение КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ у самцов крыс..……………………………...…………………....53

3.1.1. Распределение активности КПН………………….……………...…53

3.1.2. Распределение активности АПФ………………………….………...54

3.1.3. Распределение активности ФМСФ-ингибируемой КП ……...…...55

	3.2. Исследование влияния острого эмоционально-болевого стресса на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы и АПФ……56

	3.2.1.	Активность КПН в головном мозге надпочечниках и семенни-ках крыс при воздействии острого эмоционально-болевого стресса…….57

3.2.2. Активность ФМСФ-ингибируемой КП в головном мозге надпочечниках и семенниках крыс при воздействии острого эмоционально-болевого стресса ……………..……………………………………..…....60 

	3.2.3	Активность АПФ в головном мозге надпочечниках и семенниках крыс при воздействии острого эмоционально-болевого стресса ……....62

	3.3.	Исследование влияния предшественника лей-энкефалина на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ…..………………... 65

3.3.1. Активность КПН в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс при введении лей-энкефалин-арг…………………………………...67

	3.3.2. Активность ФМСФ-ингибируемой КП в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс при введении лей-энкефалинарг..……69

3.3.3. Активность АПФ в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс при введении лей-энкефалин-арг……………….……...………...…72

	3.4.	Исследование влияния лей-энкефалин-арг на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ in vitro…………………..………………..…..74

	3.5.	Исследование влияние лей-энкефалин-арг на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы и АПФ у крыс на фоне острого эмоционально-болевого стресса..........…..………...………………..…...75 

	3.5.1.	Активность КПН при введении лей-энкефалин-арг на фоне острого эмоционально-болевого стресса..…..…………………………………....77

	3.5.2.	Активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы при введении лей-энкефалин-арг на фоне острого эмоционально-болевого стресса……………………………………………………………………....80

	3.5.3.	Активность АПФ при введении лей-энкефалин-арг на фоне острого эмоционально-болевого стресса………........…………….………………84

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ…………88

ВЫВОДЫ……………………..…………………………………………...…114

ЛИТЕРАТУРА………………………………..………………………...…....116

ПРИЛОЖЕНИЕ…………….…………..…………………………...…….....146


СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

		

АКТГ - адренокортикотропный гормон

АПФ- ангиотензинпревращающий фермент

ГГНС- гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система

ГГБ- гисто-гематический барьер

ГЭБ- гемато-энцефалический барьер

ГЭМЯК - гуанидилэтилмеркаптоянтарная кислота

КП - карбоксипептидаза

КПН - карбоксипептидаза Н

ПВДС (ДСИП) - пептид, вызывающий дельта сон (дельта-сон инду- 

 цирующий пептид)

САС- симпато- адреналовая система

ФМСФ- фенилметилсульфонилфторид

ЭБС- эмоционально-болевой стресс


ВВЕДЕНИЕ.



Одной из наиболее актуальных проблем современной биологии и медицины является исследование влияния острых стресс-факторов на организм. Особый интерес вызывает изучение молекулярных механизмов возникновения и развития стресса. Известно, что кратковременное острое стрессирование приводит к экстренной и генерализованной активации ряда физиологических систем, участвующих как в процессах развития (стресс-реализующие), так и в процессах торможения (стресс-лимитирующие) стресс-реакции [4, 5, 21, 29, 33, 116, 121, 125, 144, 145]. Ведущая роль в регуляции функций этих систем принадлежит нейропептидам, веществам, выступающим в организме в роли нейромедиаторов, нейромодуляторов и гормонов [126, 134, 204, 221, 258]. В ответ на стресс в первую очередь вовлекаются пептиды гипофиза: адренокортикотропин (АКТГ), -эндорфин, пролактин [136]. Важную роль в адаптации организма к стрессу играют эндогенные биологически активные пептиды - компоненты стресс-лимитирующих систем: вещество Р, пептид, вызывающий дельта сон, энкефалины [27, 28, 69, 107, 110, 135, 152, 241]. Одной из наиболее универсальных стресс-лимитирующих систем, обеспечивающих адаптацию к изменениям, вызванным реакцией на действие экстремального фактора, является система эндогенных опиоидных пептидов [14, 103, 104, 116, 125, 266]. Выраженным антистрессорным действием обладают, в частности, энкефалины [23, 69, 134, 140, 266]. Установлено, что при воздействии стресса содержание опиоидов в структурах мозга, крови и ликворе животных увеличивается [33, 34, 140, 243]. 

Уровень биологически активных пептидов, а, следовательно, и степень реализации ответной реакции физиологических и биохимических систем на воздействие стресс-фактора в значительной мере определяется активностью пептидгидролаз – ферментов, участвующих в образовании и/или деградации молекул регуляторных пептидов [20, 40, 71, 193, 209, 212, 218, 241, 256, 262]. 

Нейропептиды синтезируются в организме в виде неактивных высокомолекулярных предшественников. На заключительных этапах процессинга регуляторных пептидов, приводящих к образованию их активных форм, принимают участие карбоксипептидазо-Б-подобные ферменты, катализирующие отщепление остатков основных аминокислот - аргинина и лизина - с С-конца предшественников биологически активных пептидов [39, 188, 192, 264, 268]. Одним из основных ферментов генеза таких нейропептидов как энкефалины, вещество Р, АКТГ, окситоцин, вазопрессин является карбоксипептидаза Н (КПН) (Кф 3.4.17.10) [39, 40, 63, 68, 192, 264]. Недавно появились сведения об участии в обмене регуляторных пептидов фермента, активность которого ингибируется фенилметилсульфонил-фторидом - ФМСФ-ингибируемой КП [49, 53]. Данный фермент обладает сходной с КПН субстратной специфичностью, что же касается биологической роли фермента, то этот вопрос до сих пор остается открытым. Известно, что уровень активных форм энкефалинов и других нейропептидов в организме контролируется также ангиотензинпревращающим ферментом (АПФ) (Кф 3.4.15.1), участвующим как в процессинге, так и в деградации регуляторных пептидов [66, 180, 183, 196, 209, 259]. Однако, несмотря на столь важную роль этих ферментов в организме, многие аспекты проявления их функциональной активности изучены недостаточно. Практически отсутствуют сведения об эндогенных механизмах регуляции активности этих ферментов, а также их свойствах при различных патологических и функциональных состояниях организма. 

Одним из видов воздействия, оказывающим влияние на уровень нейропептидов в структурах мозга и периферических тканях и приводящим к экстренному повышению адаптивных способностей организма животного, является острый эмоционально-болевой стресс (ЭБС) [37, 52, 70, 112, 145]. Увеличение синтеза и секреции многих регуляторных пептидов при развитии стресс-реакции, наряду с инициацией ряда адаптационных механизмов, приводит к истощению нейрогуморальных и ферментативных систем. В связи с этим, одной из наиболее актуальных задач функциональной биохимии и медицины является поиск путей коррекции изменений, возникающих в функционировании ряда физиологических систем при воздействии острых стресс-факторов. Наиболее благоприятным способом устранения и/или ограничения стресс-нарушений является искусственное повышение активности эндогенных стресс-лимитирующих систем за счет экзогенного введения стресс-протективных веществ пептидной природы, в частности энкефалинов [69, 116, 135]. Известно, что выраженным адаптогенным действием обладает предшественник лей-энкефалина – лей5-энкефалин-арг6 [69, 135] Введение извне компонентов стресс-лимитирующих систем способствует не только усилению потенциальных возможностей организма, но и инициации синтеза ряда биологически активных веществ, которые также обладают антистрессорным действием [11, 13, 59, 78, 107, 119, 132]. 

Одной из основных причин, ограничивающих широкое применение веществ пептидной природы в клинической практике при разного рода стресс-повреждениях, является трудность при прохождении ими гистогематических барьеров (ГГБ), в частности гемато-энцефалического барьера (ГЭБ) [30, 108]. Показано, что при периферическом введении веществ модуляторного типа, наблюдается общая закономерность: сами вещества не проходят ГЭБ, в то время как их ближайшие предшественники хорошо проникают через гемато-энцефалический барьер и вызывают соответствующие изменения в функционировании физиологических систем [82]. Кроме того, большое значение имеет выбор способа введения исследуемого стресс-протективного вещества. Известно, что одним из наиболее благоприятных способов введения веществ является инстилляция на конъюнктиву глаза [1, 119], поскольку такое введение способствует максимальному проникновению вещества в мозг и практически не травмирует животное. 

Введение извне биологически-активных пептидов, их предшественников, а также синтетических аналогов влияет на обмен эндогенных регуляторных пептидов [6, 69, 79, 101, 105, 198], а, следовательно, и на активность ферментов их генеза. Однако механизмы модуляции такого рода биохимических процессов практически не изучены. 

В связи с вышесказанным, особый интерес представляет сравнительный анализ изменений активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ - ферментов различающихся по своей тканевой локализации и биологической роли, при воздействии острого ЭБС и вещества, корректирующего сдвиги в метаболизме при стрессе – лей5-энкефалин-арг6. 

Исходя из вышеизложенного, целью настоящей работы было исследование влияния предшественника лей-энкефалина (лей5-энкефалин-арг6) на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ головного мозга и периферических тканей крыс, подверженных воздействию острого эмоционально-болевого стресса. При выполнении работы были поставлены следующие задачи:

Исследование регионального и тканевого распределения активности карбоксипептидазы Н, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс.

Исследование влияния острого эмоционально-болевого стресса на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс через различные промежутки времени. 

	Изучение влияния лей-энкефалин-арг на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ головного мозга, надпочечников и семенников крыс в различные сроки после инстилляции.

	Исследование влияния предшественника лей-энкефалина на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ головного мозга и периферических тканей крыс в динамике острого эмоционально-болевого стресса.

Полученные данные позволят полнее раскрыть роль исследуемых ферментов в механизмах функционирования пептидергических систем при возникновении и развитии стресс-реакции, более детально изучить механизмы регуляции активности ферментов обмена нейропептидов, а также понять роль протеолитических ферментов - КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ в развитии адаптационных реакций организма при остром ЭБС, инициированных введением лей-энкефалин-арг. 




ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ



	1.1.	ОПИОИДНЫЕ ПЕПТИДЫ И ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИХ ДЕЙСТВИЯ.



Регуляторные пептиды представляют собой полифункциональную группу биологически активных веществ, которым отводится важная роль среди известных природных биорегуляторов [126, 181, 204, 221, 258]. К настоящему времени описано и изучено более шестисот биологически активных пептидов [62], действующих в организме в качестве нейромедиаторов, нейромодуляторов и гормонов [62, 126, 134, 221]. Они широко представлены в центральной, периферической нервной системе, присутствие регуляторных петидов отмечено также в некоторых биологических жидкостях организма и периферических органах [156, 166, 197, 221]. 

Важной особенностью действия биологически активных пептидов является способность одних и тех же пептидных молекул вызывать различные как по характеру, так и по месту проявления реакции [62, 174, 184, 204, 271]. Кроме того, было доказано, что один пептид может быть фактором регуляции, как частных метаболических реакций организма, так и глобальных форм системного поведения [29, 35, 51, 62, 199]. Показано, что нейропептиды принимают участие в регуляции таких процессов, как память, обучение [96, 243], сон [117,131, 200, 217, 254], поведение, регуляция аппетита, жажды, дыхания, сексуальная и локомоторная активность, мышечный тонус [51, 162, 164, 204], ощущение боли [29], стресс-реакции [27, 26, 89, 101, 154, 161, 236] и др. 

Современная классификация регуляторных пептидов основана на сочетании функционального, структурного и топологического принципов. В настоящее время выделяют около 40 семейств нейропептидов [12]. 

Самым многочисленным (свыше 30) и разнообразным по функциям и влияниям в организме является семейство опиоидных пептидов. 

Обнаружение в мозге высокоспецифичных рецепторов классических непептидных опиатов - морфина и др. позволило начать целенаправ-ленный поиск их эндогенных лигандов. Первые работы по изучению опиоидных пептидов принадлежат А. Голдстайну, Дж. Хьюсу, Х. Костерлицу, С. Снайдеру, Л. Терениусу [211, 258]. В исследованиях Дж. Хьюса и Х. Костерлица в 1975 году впервые из мозга свиньи были выделены и идентифицированы два морфиноподобных кислото-растворимых пентапептида – тир-гли-гли-фен-лей и тир-гли-гли-фен-мет, впоследствии названных лей-и мет-энкефалинами [211]. 

В экстрактах гипофизов животных было обнаружено присутствие других, более крупных агонистов морфина - - - и - эндорфинов [225, 242, 253]. В настоящее время определена структура практически всех эндогенных опиоидных пептидов. Кроме мозга они обнаружены в легких, кишечнике, сердце, печени, почках, поджелудочной железе, мышцах, а также в биологических жидкостях организма: спинномозговой жидкости, крови [157, 166, 197, 219, 221]. 

Более детальное изучение эффектов, проявляемых опиоидными пептидами, показало ряд значительных отличий в ответах организма на морфин и опиоидные пептиды [95, 133]. Полученные данные позволили предположить существование более чем одного класса опиатных рецепторов [95]. Сегодня известно 7 основных типов опиатных рецепторов: -, -, -, -, -, -, - рецепторы [81, 95, 235, 254]. Они представляют собой специфичные к опиоидным пептидам регулирующие центры ферментативных комплексов или ионных каналов, локализованных преимущественно на цитоплазматической мембране соответствующих клеток-мишеней [95, 169, 173, 265]. 

Показано, что, опиоидные пептиды способны оказывать воздействие на нейрональную активность [15, 139, 159, 198], память [96], поведение [51, 168, 199], участвовать в регуляции процессов восприятия боли [29, 86, 216, 266], эндокринных функций организма [93, 235], иммунных реакций [148, 167, 172, 173, 214, 244], стрессовых воздействий [14, 125, 238], сердечно-сосудистой деятельности [35, 115], вовлекаются в развитие и патогенез многих психических и неврологических заболеваний [32, 120, 129,134, 158, 253] и др. 

Из большого числа биологических свойств опиоидных пептидов особо следует выделить следующие: действие в весьма низких концентрациях, высокая селективность, отсутствие накопления в организме и низкая токсичность [3, 16]. Отмеченные свойства позволяют использовать опиоидные пептиды в комплексе терапевтических воздействий, направленных на повышение потенциальных возможностей организма при различных функциональных состояниях организма. 

Одним из факторов, ограничивающих широкое применение этих пептидов в клинической практике, является сложность при прохождении ими гистогематических барьеров (ГГБ) [82, 108]. ГГБ рассматриваются как сложная физиолого-гомеостатическая система, которая сохраняет постоянство внутренней среды организма в целом и мозга в частности [30, 108]. Известно, что проникновение в мозг большинства исследованных веществ происходит, преимущественно, через стенку кровеносных капилляров [82, 108]. Таким образом, проницаемость ГГБ зависит в большей степени от плотности сети капилляров в структурах, на которые непосредственно наносится исследуемое вещество, то есть от способа его введения в организм [108]. Известно, что максимальное количество вещества проникает в мозг при внутривенном, внутриартериальном, а также внутрижелудочковом введении, внутримышечное и внутрибрюшинное введение показывают меньший эффект [108]. Обнаружено, что достаточно эффективно вещества проникают через гемато-офтальмический барьер (ГОБ) [1, 24, 30]. 

Особое место в ряду опиоидных пептидов отводится энкефалинам. В отличие от эндорфинов они широко распространены как в мозге, так и в периферических тканях [34, 172, 185, 197, 212]. Иммуногистохимическими методами энкефалин-содержащие клетки и их терминали были обнаружены в ядрах среднего мозга, ретикулярной формации, ядрах гипоталамуса, лимбической системе, продолговатом мозге, таламусе, желатинозной субстанции спинного мозга [84, 156, 212]. Радиоиммунохимические исследования показали максимальное содержание энкефалинов в бледном шаре и хвостатом ядре, далее в порядке убывания в гипоталамусе, гипофизе, среднем мозге, таламусе, продолговатом мозге, гиппокампе, коре [14, 96, 147, 185]. Среди периферических органов высокое содержание энкефалинов отмечено в надпочечниках, где они сосредоточены преимущественно в мозговом слое [34], поджелудочной железе, печени [219], семенниках [197]. 

Работы первых исследователей были посвящены изучению преимущественно анальгетического действия энкефалинов [165]. Обнаружено, что введение опиоидных пептидов вызывает эффект обезболивания или снижения порога болевой чувствительности [75, 86, 165, 228]. Анальгетическое действие пептидов реализуется преимущественно через δ-рецепторы гипоталамуса, стриатума и спинного мозга [86, 237, 271]. 

Достаточно детально исследовалось участие эндогенных энкефалинов и эндорфинов в патогенезе психических и неврологических заболеваний [32, 36, 134]. Предполагается, что опиоидые пептиды участвуют в патогенезе шизофрении и депрессии [216]. Показано, что при депрессиях отмечается снижение опиоидов в организме, а их системное введение приводит к временному улучшению состояния депрессивных больных [216]. Сходство эффектов опиоидных пептидов с действием нейролептиков позволило предположить, что причиной психо-патологических состояний может быть нарушение образования или чрезмерной инактивации этих регуляторных пептидов [114]. Многогранная нейротропная активность энкефалинов и эндорфинов дает основание считать, что они могут играть определенную роль в нейрохимических механизмах действия различных нейортропных препаратов, в том числе и антидепрессантов [114, 120]. Показанное изменение содержания эндогенных опиоидных пептидов и влияние их экзогенного введения было обнаружено и у больных, предрасположенных к наркомании и алкоголизму [32, 64]. 

Иммуногистохимическими методами была выявлена высокая концентрация опиоидов в зонах мозга, осуществляющих центральную регуляцию кровообращения [35]. Дальнейшие исследования показали участие эндогенных энкефалинов в деятельности сердечно-сосудистой и дыхательной системы [104, 273], в регуляции артериального давления через систему ренин-ангиотензин [87]. 

Обнаружение опиатных рецепторов - и - классов на иммуноцитных мембранах, показало, что энкефалины являются активными регуляторами иммунных реакций [93, 148, 152, 173, 244], осуществляя свое действие посредством активации Т-лимфоцитов мембран [172]. Экспери-ментальные работы ряда авторов подтвердили модулирующее действие энкефалинов на защитные механизмы в периферических и, в особенности воспаленных тканях [214]. 

Присутствие высоких концентраций опиоидных пептидов в гипоталамусе и надпочечниках [34, 156], связанных с реализацией ряда эндокринных функций в организме, позволило предположить участие энкефалинов и эндорфинов в регуляции действия эндокринной системы [15, 159, 176]. Показано, что энкефалины и эндорфины влияют на секрецию гормона роста, меланостатина, тириоидного гормона [15, 172]. Кроме того, известно, что через опиатные пути осуществляется связь между иммунной и эндокринной системой, что дает возможность диагностировать специфические заболевания, которые имеют в своей основе нейроэндокринные и иммунные расстройства [93]. 

Данные ряда исследователей указывают на влияние энкефалинов на двигательную активность и поведение крыс [51, 168, 199]. Обнаружено, что опиоидные пептиды, вводимые в высокой концентрации внутрь мозга, вызывают состояние тонической неподвижности. Введение этих пептидов в более низких концентрациях влечет за собой менее глубокие изменения локомоторной активности у крыс, и характеризуется первоначальной фазой снижения активности и последующим периодом гиперактивности. Минимальные концентрации опиоидных пептидов вызывают стимулирующий эффект. 

Различная локализация по отделам мозга и периферическим тканям лей- и мет-энкефалинов свидетельствует о возможном различии в функциях этих опиоидных пептидов в регионах [62, 242]. Использование различных методов введения энкефалинов позволяет полнее представить картину влияния их на физиологические процессы в организме. Так, например, при внутрижелудочковом введении было получено подтверждение того, что мет-энкефалин проявляет более выраженное анальгетическое действие, чем лей-энкефалин [29, 75]. Мет-энкефалин также является более действенным иммуностимулятором [214]. Наиболее выраженный наркотический и эйфоригенный потенциал напротив свойственен лей-энкефалину, мет-энкефалин практически не проявляет таких свойств [32].

Столь широкий спектр эффектов опиоидных пептидов связан не только с гетерогенностью опиатных рецепторов и разнообразной локализацией их в организме, но и с тем, что опиоидные пептиды могут реализовывать свое действие и посредством функциональных связей с различными биологически активными веществами, в частности, с регуляторными пептидами других семейств [125, 239, 240] и биогенными аминами [31]. 

Известно, что энкефалины в отличие от эндорфинов быстро разрушаются аминопетидазами – время полужизни энкефалинов в крови крыс при введении их in vivo составляет примерно две минуты [20, 166, 189]. Однако согласно данным современных исследований, физиологи-ческое действие короткоживущих пептидов может быть достаточно продолжительным [11, 78, 107, 117]. Подобные эффекты описаны для энкефалинов, ПВДС и др [11, 13, 117]. Основной из гипотез, объясняющих пролонгированное действие регуляторных пептидов, признана концепция Ашмарина И.П. о регуляторном континууме [11, 13, 78]. Предполагается, что экзогенно введенные или эндогенно синтезированные, при каком-либо воздействии, регуляторные пептиды, являются своеобразными индуктора-ми для высвобождения ряда других регуляторных пептидов [11, 13, 78, 107]. 

Таким образом, экспериментальные данные указывают на то, что опиоидные пептиды могут оказывать разнообразное фармакологическое и физиологическое влияние не только на центральную нервную систему, но и на множество других функциональных систем организма. Подобное воздействие осуществляется как непосредственно - через опиатные рецепторы соответствующих клеток-мишеней, так и путем формирования сложных регуляторных цепей и каскадов образования других регуляторных пептидов. 

Степень реализации тех или иных эффектов опиоидных пептидов зависит от уровня активных форм эндогенных пептидов, который определяется активностью ферментных систем обмена нейропептидов, участвующих в образовании и/или деградации молекул регуляторных пептидов [2, 65, 189, 204, 218, 257, 262, 268].


1.2. ОБМЕН РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ.



1.2.1. Биогенез нейропептидов.

Выделяют два возможных пути образования нейропептидов [55, 89]. Один из них нерибосомальный, биосинтез при этом осуществляется с участием специфических ферментов-синтетаз. Другой путь связан с рибосомами, локализованными на мембранах шероховатого эндоплазма-тического ретикулума. В этом случае нейропептиды синтезируются в организме в виде неактивных высокомолекулярных предшественников, которые преобразуются в активную форму в результате ограниченного протеолиза [71, 229, 268]. Более детальное изучение молекулярно-биологических характеристик опиоидных пептидов позволило установить некоторые закономерности их образования. Так к настоящему времени показано существование трех высокомолекулярных белковых предшественников, которые являются источниками всех известных опиоидных пептидов: проопиомеланокортин, проэнкефалин и продинорфин [268]. Каждый из них закодирован отдельным геном в молекуле ДНК [268]. 

Для всех нейропептидов характерно наличие ряда общих особенностей в структуре и процессинге препропептидов :

наличие с N-конца сигнальной последовательности, состоящей из 15-20 остатков гидрофобных аминокислот. Функция ее состоит в обеспечении транслокации синтезируемого пептида через мембраны шероховатого эндоплазматического ретикулума (ЭПР) [71, 268]. В полости ЭПР отщепление этой последовательности осуществляется при участии эндоолигопептидазы - сигнальной пептидазы, которая специфична для определенной последовательности гидрофобных аминокислот [268];

в структуре предшественников, биологически активные пептиды ограничены парами остатков аргинина и лизина, по которым происходит расщепление [71,268], причем расщепление может происходить не по всем парам остатков основных аминокислот. В связи с этим следует предполагать наличие многообразия и высокой специфичности эндопептидаз к участкам расщепления; 

предшественники нейропептидов могут содержать несколько копий различных пептидов. Например, проопиомеланокортин содержит в своей структуре последовательности мет-энкефалина, адренокортикотропина, -меланотропина, -липотропина и -эндорфина, причем в разных отделах один и тот же предшественник может стать источником различных активных пептидов. Это характерно, например, для предшественника энкефалина в мозге и надпочечниках [272].

Эндопептидазы процессинга представляют собой достаточно большую группу ферментов [171, 203, 227, 267]. На основе их субстратной специфичности выделяют следующие группы:

эндопептидазы специфичные для пар остатков основных аминокислот (сериновые, аспартильные, тиоловые);

эндопептидазы, расщепляющие связи при единичных остатках основных аминокислот (тиоловые, металлопептидазы);

эндопептидазы, расщепляющие пропептиды не по основным остаткам аминокислот (тиоловые, металлопептидазы );

высокомолекулярные мультиферментные протеазы;

Следует отметить, что некоторые из эндопептидаз обладают очень узкой субстратной специфичностью, что важно для генеза структур пептидной природы. 

Результатом действия эндопептидаз являются неактивные пептиды, содержащие со стороны С- или N-конца остатки аргинина или лизина, которые затем удаляются экзопептидазами с карбоксипептидаза-Б- и аминопептидаза-Б-подобной активностью [208, 229, 268]. Образующиеся в результате биологически активные пептиды, под влиянием какого-либо стимула выбрасываются из клетки либо в кровяное русло, либо в синаптическую щель и мигрируют к клеткам-мишеням, где происходит их связывание со специфическими рецепторами. 

По локализации ферменты обмена нейропептидов делят на две большие группы [48]:

	Ферменты секреторных везикул и эндоплазматического ретикулума (карбоксипептидаза Н (Кф 3.4.17.10), аминопептидаза-В-подобный фермент и др). Эти ферменты участвуют в образовании активных форм нейропептидов.

	Ферменты вневизикулярной локализации – внеклеточной жидкости и внешней поверхности цитоплазматических мембран – ангиотензинпревращающий фермент (Кф 3.4.15.1), карбоксипептидаза N (Кф 3.4.12.7), различные аминопептидазы и др. Роль ферментов вневизикулярной локализации состоит не только в образовании активных форм нейропептидов, то есть процессинге, но и в инактивации нейропептидов.

Таким образом, основную роль в регуляции уровня активных нейропептидов, а, следовательно, и в запуске реакций их биологического действия, играют ферменты конечной стадии процессинга и инактивации [189, 209]. Особого внимания в этой связи заслуживают основные КП, поскольку эти ферменты участвуют не только в конечной стадии образования активных пептидов, но и в начальных стадиях их деградации.

Ключевую роль в генезе нейропептидов мозга играет КПН - фермент секреторных везикул, отщепляющий остатки аргинина и лизина с С-конца неактивных пептидов [187, 193, 195, 248]. Известно, также, что данный фермент может участвовать в начальных стадиях инактивации активных пептидов, содержащих остатки основных аминокислот с С-конца молекулы [40, 248]. 

Недавно в лаборатории нейрохимии Пензенского государственного педагогического университета им. В.Г.Белинского в растворимой фракции серого вещества головного мозга кошки была обнаружена новая экзопептидаза, отщепляющая остатки аргинина с С-конца синтетических аналогов энкефалинов [49, 53]. Активность этой основной КП полностью ингибировалась фенилметилсульфонилфторидом (ФМСФ), в связи, с чем фермент был назван ФМСФ-ингибируемой КП [49]. Особенности тканевого и регионального распределения фермента позволяют отнести ФМСФ-ингибируемую КП, к ферментам, которые наряду с КПН вовлекается в обмен регуляторных пептидов [48, 53].

Известно, что важную роль в обмене таких биологически активных пептидов как энкефалины, ангиотензины, АКТГ, ПВДС, вещество Р и др. играет ангиотензинпревращающий фермент (АПФ), участвующий не только в процессинге, но и в инактивации активных форм пептидов [180, 182, 183]. В последнее время особое внимание исследователей обращено на исследование АПФ мозга. 

Ниже представлены сведения о физико-химических свойствах этой группы ферментов.



КАРБОКСИПЕПТИДАЗА Н (Кф 3.4.17.10).

Карбоксипептидаза Н (КПН, энкефалинконвертаза, КПЕ) была впервые выделена из хромаффинных гранул надпочечников быка Fricker и Snyder в 1982 году [192, 193]. Позднее КПН была обнаружена и выделена из различных органов и тканей [191, 194, 203, 206, 230]. При этом было показано, что каталитические и физико-химические свойства КПН из различных источников были достаточно близки. 

Фермент является гликопротеином и состоит из одной полипептидной цепи, максимальную активность проявляет при рН 5,6-6,0, что соответствует рН внутри секреторных гранул, Мr 50-55кДа [40, 192, 193]. Показано также, что КПН является тиолзависимым металлоферментом, в активном центре которого находится Zn2+ [189]. Фермент активизируется ионами Co2+ и Ni2+, ингибируются ЭДТА, реагентами на сульфгидрильные группы и органическими кислотами, в состав которых входят амино- или гуанидиновые группы при последнем атоме углерода (GEMSA- гуанидилэтилмеркаптоянтарная кислота, GPSA - гуанидинопропилянтарная кислота, APMSA – аминопропилмеркапто-янтарная кислота и 2 меркапт- 3 гуанидинтиопропановая кислота) [256].

Предложены различные методы определения активности КПН. Наиболее широко применяется метод Fricker и Snyder [194], с использованием дансилированных трипептидов – дансил-фен-ала-арг и дансил-фен-лей-арг – в качестве субстратов. Для определения активности КПН предложены также даларгин [127], лей5-энкефалин-арг6 [127], [3Н]-бензоил-фен-лей-арг [247], [3Н]-бензоил-фен-ала-арг [247]. Количественное определение КПН в тканях производится методом связывания [3Н]ГЭМЯК [263].

 Согласно первоначальным исследованиям фермент представлен в организме двумя формами - растворимой и мембраносвязанной, которые отличаются по величине Мr [187, 193, 205, 264], значение которой для мембраносвязанной формы выше. Такое отличие связывали с наличием у мембраносвязанной формы С-концевой “якорной” последовательности, состоящей из 15-20 гидрофобных аминокислотных остатков, основное назначение которой состоит в обеспечении рН - зависимой ассоциации КПН с мембранами. Показано также, что активность мембраносвязанной КПН намного меньше активности растворимой формы данного фермента [189, 264]. Было выдвинуто предположение, что фермент, связанный с мембранами секреторных гранул, является предшественником растворимой формы КПН и превращается в нее в результате протеолитического расщепления связи c C-конца у основания “якорной” последовательности. Показано, что при этом активность фермента возрастает в 2-3 раза [186]. По мнению ряда авторов, такое различие в активностях мембраносвязанной и растворимой форм КПН может быть связано ассоциацией менее активной формы с компонентами мембран [71], что ставит под сомнение гипотезу о зависимости активности мембраносвязанной формы от наличия гидрофобной “якорной” последовательности. 

В дальнейшем было обнаружено, что фермент, связанный с мембраной секреторных гранул отличается от растворимой формы не только по величине Мr, но и по локализации. Так в хромаффинных гранулах надпочечников, в мозге, передней и промежуточной доле гипофиза преобладает растворимая форма КПН, а мембраносвязанная форма локализована преимущественно в задней доле гипофиза [37, 40, 186]. В связи с этим, было высказано предположение, что описанные формы КПН участвуют в процессинге различных по своей функциональной роли пептидов: растворимая КПН принимает участие преимущественно в образовании секреторных пептидов, в то время как мембраносвязанная форма участвует процессинге пептидов, обладающих местным действием [40, 65]. 

Тканевая, региональная, клеточная и субклеточная локализация фермента была изучена с применением флюориметрических и радиометрических методов определения активности КПН. Наиболее высокая активность КПН обнаружена в хромаффинных гранулах надпочечников, аденогипофизе и островках Лангерганса поджелудочной железы [191, 194, 203, 206]. Более низкая - в задней доле гипофиза, стриатуме, гипоталамусе, гиппокампе, среднем мозге, коре больших полушарий [37, 149, 194]. Самая низкая активность КПН отмечена в стволовой части головного мозга, спинном мозге, сердце, легких, желудочно-кишечном тракте, печени и почках [149]. Установлено, что фермент локализован в хромаффинных гранулах надпочечников, нейронах мозга, содержащих вещество Р, энкефалины и другие нейропептиды, гормон-продуцирующих клетках гипофиза, - и - клетках островков Лангерганса поджелудочной железы, продуцирующих инсулин и глюкагон [189, 192, 194, 248, 256]. Данные о субклеточной локализации КПН показали, что фермент ассоциирован со структукными элементами комплекса Гольджи, ЭПР и секреторными везикулами, где осуществляется процессинг предшественников биологически активных пептидов [195]. 

Первоначально КПН была описана как фермент, участвующий в образовании энкефалинов из их предшественника, однако данные последующих исследований показали участие его в процессинге многих нейропептидов: глюкагона, инсулина, пролактина, вещества Р, вазопрессина и окситоцина и других регуляторных пептидов [38, 175, 187, 190].

Ряд экспериментальных исследований показал, что КПН вовлекается в ответ организма на воздействие различных факторов, таких как стресс [37, 42, 45, 56, 57, 64], введение in vivo этанола [19, 54, 60, 67], резерпина, диазепама [58] и др.



ФМСФ-ИНГИБИРУЕМАЯ КАРБОКСИПЕТИДАЗА.

ФСМФ-ингибируемая КП впервые была обнаружена в растворимой фракции серого вещества головного мозга котов [49]. Фермент имеет Мr в пределах 100-110 кДа, максимальная активность фермента проявляется при рН 6,0 - 6,5, однако она сохраняется и при рН 5,5, что соответствует рН внутри секреторных везикул [49, 53]. Активность данного фермента полностью ингибируется ФМСФ и п-хлормеркурийбензоатом, 2-меркаптоэтанол, ГЭМЯК, ЭДТА и N-этилмалеимид не оказывали влияния на активность ФСМФ-ингибируемой КП. Полученные сведения об отсутствии влияния хелатирующих агентов, а также специфических ингибиторов металлозависимых КП на активность ФСМФ-ингибируемой КП, свидетельствуют о том, что данный фермент не является металлозависимым. Показано, что активность фермента изменяется в присутствии ионов некоторых металлов, так ионы Zn2+ сильно подавляют активность ФСМФ-ингибируемой КП, что, вероятно связано с их влиянием на стабильность данного фермента. Литературные данные свидетельствуют также об увеличении активности ФСМФ-ингибируемой КП в присутствии NaCl, Na2SO4, NaBr, что позволяет использовать их для повышения стабильности исследуемого фермента в растворах [49]. 

По субстратной специфичности ФСМФ-ингибируемая КП сходна с КПН и КПN: отщепляет остатки основных аминокислот с С-конца соответствующего субстрата [49, 53]. Однако в отличие от КПН, предпочтительными субстратами для которой являются пропептиды содержащие в качестве предпоследних остатки глицина и аланина, ФСМФ-ингибируемая КП, обладает большим сродством к тем субстратам, у которых остатку основной аминокислоты предшествует лейцин и метионин [53, 119]. Так показано, что величина Кm для гидролиза дансил-фен-лей-арг ФСМФ-ингибируемой КП приблизительно равна 48 мкМ, а для дансил-фен-ала-арг – 96 мкМ [49]. 

По своим физико-химическим свойствам фермент сходен с лизосомальной КПА (Кф 3.4.16.1), однако есть отличия по субстратной специфичности и, возможно, субклеточной локализации [49, 53, 233]. Данные о тканевом и региональном распределении ФМСФ-ингибируемой КП хорошо коррелируют с данными для КПН, что позволяет предположить участие данного фермента в процессинге предшественников биологически активных пептидов и секретируемых белков [49, 50, 149]. Так отмечено, что активность ФСМФ-ингибируемой КП в гипофизе - отделе, где синтезируются пептидные гормоны - значительно выше, чем в отделах центральной нервной системы, что, вероятно, свидетельствует об участии данного фермента в процессинге предшественников этих гормонов. Наиболее высокая активность ФСМФ-ингибируемой КП в мозге показана в обонятельных долях и сером веществе – отделах, образованных телами нейронов [49, 149]. Активность фермента в отделах с высоким содержанием проводящих путей (больших полушариях, варолиевом мосте и продолговатом мозге) значительно ниже [149]. Полученные данные позволили выдвинуть предположение, что активность ФСМФ-ингибируемой КП преимущественно связана с телами нейронов. Высокая активность ФСМФ-ингибируемой КП обнаружена также в тканях, связанных преимущественно с деградацией белка (почки, селезенка) [149]. В связи с этим, не исключается возможность вовлечения ФМСФ-ингибируемой КП в катаболизм белков или инактивацию биологически активных пептидов. 

Таким образом, вопрос о биологической роли ФСМФ-ингибируемой КП до сих пор остается открытым. Имеющийся ряд предположений, может быть подтвержден или опровергнут только в результате исследований влияния на ее активность факторов, которые вызывают уже известные перестройки в метаболизме, например, стресс-воздействие, введение различных биологически активных веществ. Интересным, для выяснения биологической роли, представляется также сравнение активности ФСМФ-ингибируемой КП с другими КП, биологические функции которых известны. 



АНГИОТЕНЗИНПРЕВРАЩАЮЩИЙ ФЕРМЕНТ (Кф 3.4.15.1).

Ангиотензинпревращающий фермент (АПФ, дипептидилкарбоксипептидаза, пептидил дипептидаза А) впервые был выделен Скеггом и соавт. из сыворотки крови лошади [255]. В настоящее время известно, что АПФ достаточно широко представлен в различных органах и тканях организма: в эндотелии кровеносных сосудов легких, мозга, сердечной ткани, в сыворотке крови, Т-лимфоцитах, фибробластах, в эпителиальных клетках почек, плаценты, кишечника, репродуктивных органах [182, 196, 209, 223, 259]. 

По структуре АПФ представляет собой мембраносвязанный гликопротеин, состоящий из одной большой полипептидной цепи, активируется ионами Сl-, NO3- ,SO42- [66, 170], ингибируется 2-меркаптоэтанолом [66].Детальное изучение физико-химических свойств данного фермента способствовало созданию ряда высокоспецифических ингибиторов, первым из которых стал каптоприл [178]. Сегодня известно по крайней мере семь ингибиторов АПФ – это эналаприл, лизиноприл, рамиприл, цилазаприл, фосфоприл и др. [179], проявляющих характерную селективность по отношению к АПФ различной тканевой локализации

Согласно современным представлениям АПФ существует виде двух изоформ: “соматической”, сосредоточенной на поверхности эндотелиальных, эпителиальных и нейроэпителиальных клеток и “репродуктивной”, найденной в семенной жидкости большинства млекопитающих [182, 183]. “Соматическая” форма АПФ имеет молекулярную массу 170кДа и включает С- и- N-гомологичные домены, обладающие энзиматической активностью. “Репродуктивная” форма имеет молекулярную массу около 100кДа и соответствует С-домену первой формы [182]. 

Известно, что АПФ участвует в отщеплении С-концевого гистидиллейцина от декапептида ангиотензина  и превращении его в физиологически активный октапептид ангиотензин  [209, 222, 234, 259]. Кроме того, АПФ участвует в деструкции брадикинина, пептида, функциональное действие которого противоположно действию ангиотензина , путем последовательного удаления двух С-концевых дипептидов [66, 222, 234]. Таким образом, АПФ проявляет двойственную функцию в отношении основных субстратов - брадикинина и ангиотензина I. 

Началом нового направления в исследовании роли АПФ в организме послужили работы Гантен и др., которые обнаружили в ткани мозга весь спектр компонентов ренин-ангиотензиновой системы – ангиотензиногена, ангиотензина I, ангиотензина  и АПФ [196]. АПФ был найден в мозге в телах и аксонах нервных клеток, в гипофизе, базальных ганглиях и черной субстанции [183, 210]. Обнаруженное соответствие между региональным распределением АПФ и ряда нейропептидов в мозге позволило предположить, что АПФ участвует не только в метаболизме ангиотензинов и кининов. Сегодня известно, что АПФ может гидролизовать такие функционально активные пептиды, как мет-энкефалин, нейротензин, -эндорфин, вещество Р, -цепь инсулина (в этих превращениях АПФ действует еще и как эндопептидаза), играя роль одного из регулирующих факторов в обмене этих биологически активных веществ [180, 182, 183]. Обнаружено также, что АПФ может участвовать в процессинге энкефалинов, гидролизуя энкефалинсодержащие пептиды - мет-энк-арг6-фен7 в мет-энкефалина и мет-энк-арг6-глу7-лей8 в мет-энк-арг6 [250]. Окончательно роль АПФ в мозге еще не выяснена. 

Таким образом, в настоящее время первоначальное определение АПФ как фактора, связующего калликреин-кининовую и ренинангиотензиновую системы крови несколько расширено. Показано, что АПФ участвует в регуляции работы сердца, почек, уровня артериального давления крови, иммунной и репродуктивной системы, связан с метаболизмом нейротрансмиттеров [180, 182, 183, 209, 223, 224, 251, 259]. Кроме того, известно, что ангиотензинпревращающий фермент вовлекается в ответ организма на воздействие стресс-факторов различной природы [64, 99]. В настоящий момент особое внимание исследователей обращено на создание возможных методов регуляции активности АПФ при различных физиологических и патологических состояниях организма.


1.2.2. Механизмы регуляции активности ферментов обмена нейропептидов

Данные о вовлечении ряда ферментов в процессинг нейропептидов, а также о возможности контроля активности ферментов физиологически активными пептидами являются причиной повышенного интереса к исследованию малоизученных механизмов регуляции их активности. Изучение механизмов, по которым осуществляется регуляция активности ферментов, имеет большое практическое значение, так как предполагает управление течением процессов образования или деградации биологически активных пептидов. 

Известно, что регуляция активности ферментов процессинга может осуществляться in vivo на разных уровнях [38, 39, 48, 246] : 

на уровне экспрессии гена; 

на уровне процессинга предшественников ферментов; 

на уровне зрелой, активной формы ферментов;

В настоящее время не вызывает сомнений, что активность КПН in vivo может регулироваься на уровне экспрессии гена [38, 202]. Поскольку ген КПН состоит из большого количества регуляторных участков, структура которых различна в разных типах клеток, следовательно, и влияние агентов на экспрессию гена КПН будет различным и избирательным. Так, стимуляция надпочечников инсулином ведет за собой значительное повышение уровня мРНК КПН, изменения в уровне мРНК фермента при этом менее значительны, чем для нейропептида [213, 246]. Тот факт, что влияние различных факторов не всегда согласовано и одинаково для экспрессии генов КПН и экспрессии нейропептидов, позволяет предположить, что регуляция на уровне экспрессии генов не единственный механизм, по которому осуществляется регуляция активности КПН.

Известно, что КПН синтезируется в виде препрофермента, который не обладает ферментативной активностью [38, 39]. Активация неактивной формы фермента происходит в результате отщепления N-концевой последовательности предшественника в секреторных везикулах по мере их продвижения от тел нервных клеток по аксонам, т.е. по мере их созревания [38]. Протеолитическое удаление С-концевой последователь-ности проформы КПН происходит в секреторных везикулах при участии фермента, активируемого ионами Са2+, что приводит к превращению мембраносвязанной формы в растворимую [38, 186, 264]. Теоретически, можно предположить, что регуляция активности КПН на этом этапе возможна за счет изменения концентрации ионов Са2+. Однако тот факт, что в распределении активности между растворимой и мембраносвязанной формами в клетках с различным уровнем экспрессии и активности КПН нет различий [264], говорит в пользу того, что регуляция активности КПН на уровне превращения мембраносвязанной формы в растворимую невозможно [38].Таким образом, доказательств регуляции процессинга КПН в процессе созревания секреторных везикул нет. Что же касается предположения о регуляции активности КПН на уровне превращения неактивного предшественника фермента в активную форму, то оно остается в силе, хотя, на данном этапе еще нет достоверных доказательств этого.

Особый интерес у исследователей вызывает регуляция активности ферментов обмена регуляторных пептидов на уровне зрелой формы. Известно, что изменения активности ферментов достигаются при воздействии ионов металлов, продуктов ферментативных реакций, их субстратов, эндогенных активаторов и ингибиторов, а также изменением рН [38, 39, 48]. 

Возможность регуляции активности ферментов обмена регуляторных пептидов эндогенными активаторами и ингибиторами пептидной природы описана для вневезикулярных ферментов, в частности для ангиотензинпревращающего фермента [73]. Для внутривезикулярных ферментов (например, КПН) такие данные полностью отсутствуют, поскольку механизмов проникновения в секреторные везикулы веществ пептидной природы не обнаружено. 

Обнаружено, что активность внутривезикулярных и вневезикулярных ферментов in vitro ингибируется биологически активными пептидами и их предшественниками [188, 206, 215, 233]. Так показано, что активность КПН in vitro ингибируется ее субстратами - мет5-энкефалин-арг6, лей5-энкефалин-арг6, мет5-энкефалин-лиз6, лей5-энкефалин-лиз6 [119, 193, 194, 205], а также продуктами каталитических реакций фермента – мет- и лей-энкефалином, арг-вазопрессином, веществом Р, тиротропин-рилизинг фактором [119, 193]. Регуляция активности внутривезикулярных ферментов таким способом возможна только в том случае, если при нанесении веществ пептидной природы в секреторных везикулах изменяется суммарная концентрация и нейропептида и его предшественника, что предполагает проникновение субстратов и продуктов каталитических реакций в сформировавшиеся везикулы. Однако установлено, что концентрация активного пептида и пропептида в секреторных везикулах, где осуществляется их процессинг, остается постоянной, что свидетельствует о невозможности регуляции активности ферментов внутривезикулярной локализации таким способом. 

В случае вневезикулярных ферментов (например, АПФ) регуляция активности биологически активными пептидами и их предшественниками может иметь место, поскольку фермент является более “доступным” для них. Показано, что активность АПФ in vitro ингибируется энкефалинами, -эндорфином, веществом Р, АКТГ, брадикинином, -липотропином [160].

Обнаружено, что in vivo активность КПН и ФМСФ-ингибируемой КП головного мозга, надпочечников и семенников активируется лей- и мет-энкефа-линами, введенными методом инстилляции на конъюнктиву глаза, причем влияние лей-энкефалина более выражено [119]. Механизмы влияния исследо-ванных пептидов на активность ферментов не изучены. Предполагается, что экзогенные лей- и мет-энкефалины влияют на уровень экспресси мРНК КПН и ФМСФ-ингибируемой КП, что приводит к изменению активности фермента. 

Сходная тенденция к повышению активности при введении лей- и мет-энкефалинов обнаружена для АПФ [119]. Вероятно, что данные пептиды могут влиять на уровень и активность эндогенных активаторов, способствующих увеличению активность данного фермента.

Обнаруженное под воздействием субстратов и продуктов каталитических реакций, изменение активности ферментов обмена регуляторных пептидов, вероятно имеет важный биологический смысл для регуляции уровня нейропептидов при различных патологических состояниях организма, таких как алкоголизм, стресс-реакции и т.д.

В целом ряде работ имеются данные о повышении активности некоторых ферментов обмена нейропептидов (КПН и АПФ) при введении этанола [19, 41], глюкокортикоидов [47], резерпина, каптоприла [58]. Поскольку in vitro подобных эффектов не обнаружено, то предполагается, что показанное воздействие опосредовано механизмами регуляции активности данных ферментов и является одним из звеньев неспецифической реакции организма на действие экстремальных факторов. 

Таким образом, сведения, касающиеся механизмов регуляции активности ферментов обмена регуляторных пептидов активными формами нейропептидов, а также их предшественниками носят фрагментарный характер. Вместе с тем изучение этого вопроса позволит понять принципы функциональной организации ферментов, с тем, чтобы использовать эти сведения на практике при разного рода патологических состояниях организма, таких как алкоголизм, стресс-реакции и т.д. 


1.3. ОПИОИДНЫЕ ПЕПТИДЫ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ СТРЕССОРНЫХ ФАКТОРОВ.



В числе актуальных проблем современной биологии и медицины все большее внимание уделяется проблеме стресса. Такой интерес к изучению этого вопроса обусловлен многими факторами, в числе которых постоянное ускорение темпов жизни, шум, урбанизация, которые, так или иначе, воздействуют на организм человека и животных, провоцируя развитие стресса. Достаточно сильное и продолжительное действие стресс-факторов может стать причиной различных функциональных нарушений и патологий [4, 90]. 

Определение стресса как “неспецифической реакции организма на любое требование извне”, данное Г.Селье [132], а также предложенная им концепция развития стресс-реакции, подверглись критическому анализу со стороны многих ученых. Сегодня, стресс рассматривается как совокупность общих, неспецифических биохимических, физиологических и психических реакций организма, возникающих в ответ на действие чрезвычайных раздражителей различной природы и характера, обеспечивающих мобилизацию организма в целях поддержания гомеостаза или его адаптации [144].

Общей концепцией ограничения стресс-реакции признана концепция сопряжения действия стресс-лимитирующих и стресс-реализующих (АКТГ-подобных) систем [116, 138, 144]. Существование в организме специализированных стресс-лимитирующих систем, ограничивающих само возбуждение стресс-реализующих систем, обеспечивает резистентность к стрессу [124, 125, 134, 135]. Известно, что при воздействии стрессорных факторов происходит активация центральных и местных (антиоксидантная и аденозинэргическая системы) стресс-лимитирующих систем и механизмов. Среди центральных лимитирующих систем активируются такие как: ГАМК-эргическая, серотонинэргическая, холинэргическая и опиоидэргическая системы [29, 116]. Обнаружено, что характер и интенсивность развития стресс-реакции, а также степень участия в ней различных функциональных систем, во многом зависит от исходного состояния организма [80, 232, 270]. Различия животных по врожденной реакции на стресс-раздражители, послужили основанием для деления их на стрессустойчивых (низкоэмоциональных) и стресснеустойчивых (высокоэмоциональных, предрасположенных к стрессу). Основным показателем принадлежности животных к тому или иному типу является проявление их двигательной активности в тесте “открытое поле”: высокий уровень активности позволяет отнести животных к сильному типу (стрессустойчивому) и наоборот [51, 80]. Показано, что устойчивость к эмоциональному стрессу обусловлена прежде всего высоким уровнем опиоидных пептидов, вещества Р, ПВДС [131, 236, 243]. 

Степень развития стресс-реакции, во многом, определяется видом стресс-воздействия. Например, известно, что, кратковременное острое импульсное стрессирование приводит к экстренному повышению адаптивных способностей организма [37, 70, 145, 151]. Одним из таких воздействий может быть признан острый эмоционально-болевой стресс (ЭБС) [37, 52, 64, 121]. Показано, что при ЭБС происходит мобилизация ГГНС, адренэргической, симпато-адрееналовой и опиоидэргичекой систем. Литературные данные свидетельствуют о возможности включения в круг этих систем и мозговой железы - эпифиза [7]. Осуществление эпифизом своей антистрессорной защиты достигается при участии эндогенных опиоидов. 

Таким образом, опиоидным пептидам принадлежит важная роль среди известных естественных биорегуляторов, участвующих в формировании адаптации к стрессорным факторам. Ниже представлены сведения о роли данной группы пептидов в реакциях стресса.

Система эндогенных опиоидных пептидов представляет собой одну из основных регуляторных систем, функционирующих в условиях стресса и адаптации [8, 102, 106, 134, 242]. Течение стресс-реакции сопровождается глубоким сдвигом в опиоидной системе, причем в ответ на воздействие болевого фактора наблюдается повышение уровня опиоидных пептидов, а при воздействии эмоционального - снижение их содержания [14, 18, 72, 239]. Увеличение содержания опиоидов при воздействии стресс-факторов отмечается в крови, ликворе, головном и спинном мозге [33, 34, 72, 140, 243]. Изменения метаболизма в головном мозге при воздействии сильных раздражителей, вызывают повышение проницаемости гемато-энцефалического барьера (ГЭБ) во всех его отделах [88, 97, 108]. Подобные изменения способствуют более интенсивному проникновению различных биологически активных веществ в структуры головного мозга, особенно эмоциогенные и гипофиз [88]. Повышенная проницаемость ГЭБ отмечена в гипоталамусе, что связывают с большой плотностью сети капилляров в нем [88]. При этом концентрация различных представителей семейства опиоидных пептидов также неодинакова, так как при эмоциональном стрессе в гипоталамусе преобладает мет-энкефалин, а уровень -эндорфина достаточно низок, если же к этому воздействию присоединяется болевой фактор, то отмечается преобладание лей-энкефалина и концентрация -эндорфина повышена [14, 18, 140, 242]. Повышение уровня энкефалинов способствует стабилизации внутренней среды организма, результатом чего является ограничение или прерывание стресс-реакции [6, 33, 100, 134, 238].

Функционирование этой системы самостоятельно, без взаимодействия с некоторыми регуляторными системами представляется маловероятным. Установлены антагонистические взаимоотношения между опиоидными пептидами и симпатоадреналовой, гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системами [74, 124, 139, 176, 270], которые играют ключевую роль в генерации первой стадии общего адаптационного синдрома. 

В течение первых суток (фаза тревоги) наблюдается снижение уровня энкефалинов в крови [134, 135, 140], в результате чего развивается острый адаптационный синдром, который сопровождается активацией ГГНС [21, 25, 128, 142, 143]. Дальнейшее, повышение уровня эндогенных опиоидных пептидов, в ответ на стресс-воздействие, способствует блокаде ГГНС [135, 261]. Торможение ГГНС опиоидными пептидами эффективно и препятствует избыточной стимуляции ГГНС, если стресс-воздействие осуществляется в легкой форме и непродолжительно по времени. При длительном стресс-воздействии опиоидная система не эффективна, в результате чего развивается гиперэргическая реакция со стороны ГГНС, заканчивающаяся общим стресс-повреждением организма [128, 142].

Одной из важных характеристик стресса является активация симпато-адреналовой системы (САС) [21, 150]. В общий ответ САС на действие раздражителя вовлекаются в первую очередь катехоламины – дофамин, норадреналин и адреналин. Установлено, что активация системы катехоламинов является основным фактором, обуславливающим увеличение концентрации опиоидных пептидов в мозге, а также выброс -эндорфина из гипофиза в кровь [52, 79, 125, 139]. Опиоидные пептиды, действуя через -рецепторы, снижают уровень катехоламинов в мозге, приближая их содержание к норме, тем самым ослабляя стресс-реакцию [125, 144]. Активация САС сопровождается также интенсивным высвобождением АКТГ [18, 106, 232]. Установлено, что эндогенные опиоидные пептиды модулируют процессы избыточного синтеза и секреции АКТГ, приближая их уровень к норме [18, 125]. 

Показанные выше взаимодействия системы опиоидных пептидов с другими функциональными системами организма, а также обнаруженное модулирующее влияние на процессы транссинаптической передачи нервного импульса и активность нейронов, являются следствием включения цепи сложных механизмов внутри клетки [10, 118, 122, 135, 261, 269]. В первую очередь к ним следует отнести депрессивное влияние опиоидных пептидов на систему циклических нуклеотидов, концентрация которых при воздействии экстремальных факторов эмоциональной и болевой природы, повышается [18, 109]. Такое изменение концентрации циклических нуклеотидов в клетке при воздействии стресс-фактора приводит к значительному снижению возбудимости нейронов и оказывает влияние на транспорт нейротрансмиттеров. Действие опиоидных пептидов основано на угнетении активности аденилатциклазы и, как следствие, снижении концентрации цАМФ в клетке [18, 109, 135]. Возможно, также, что энкефалины в первую очередь индуцируют повышение уровня цГМФ, после чего наблюдается активация фосфодиэстеразы и лишь затем идет торможение аденилатциклазы [18]. В любом случае, результатом является снижение избыточного синтеза цАМФ в клетке, что ведет к торможению ряда физиологических реакций, усугубляющих стресс-повреждения систем организма [18, 109 135]. 

Известно, что при тяжелых и продолжительных видах стресса той активации, которая достигается под влиянием опиоидных пептидов при легких и кратковременных стрессах недостаточно, в результате чего наблюдается неадекватность синтеза и секреции опиоидных пептидов и/или блокада опиоидных рецепторов продуктами метаболизма [112, 134, 145, 261]. Эти изменения влекут за собой истощение нейрогуморальной системы. В этой связи, необходимым становится экзогенное введение опиоидных пептидов с целью повышения потенциальных возможностей системы эндогенных опиоидов [102, 116, 125, 134, 135]. 

Показано, что экзогенное введение пептидных лигандов опиатных рецепторов приводит к снижению степени гипертрофии надпочечников [9, 34, 100], ослаблению инволютивных процессов в тимусе и селезенке [6], снижению степени стресс-повреждения сердца [102, 104, 238], а также положительно влияет на общее состояние животных при острой ишемии миокарда [103, 145, 269]. В ряде работ показана способность экзогенных опиоидов оказывать седативное действие при аффективных состояниях на синтез и секрецию стресс-гормонов [129], а также влиять на эмоциональный компонент стресса [136, 141, 151]. Стресс-лимитирующий характер действия опиоидных пептидов опосредуется через ингибирование избыточной секреции АКТГ, катехоламинов и других катаболических гормонов на начальных этапах развития общего адаптационного синдрома. В фазу резистентности реализация эффектов экзогенных опиоидных пептидов осуществляется через стимуляцию образования анаболических инкретов - пролактина, соматотропина и др. [101].

Предполагается, что адаптогенным действием обладает предшественник лей-энкефалина – лей5-энкефалин-арг6 [69, 134, 135]. 

Основными причинами, ограничивающими широкое использование регуляторных пептидов в клинике являются: слабовыраженный эффект при приеме внутрь, зависимость эффекта от исходного функционального состояния организма, трудности при прохождении ГЭБ, а также кратковременность действия, обусловленная в основном их быстрым протеолизом. Одним из наиболее известных препаратов, устойчивым к действию пептид-гидролаз, обладающим селективным пролонгированным действием, а также биодоступным, является даларгин - аргининсодержащий гексапептидный аналог лей- энкефалина ( Д-ала2-лей5-арг6-энк ) [69, 94, 105, 123, 146]. Внутримышечное введение его стимулирует репаративную регенерацию периферических нервных образований в условиях их повреждения, повышает активность коры надпочечников при стрессе [34], положительно влияет на организм после перенесенного инфаркта миокарда, симптоматика которого сходна с изменениями, возникающими в организме, подверженном острому эмоционально-болевому стрессу [245]. Показана также возможность использования даларгина для профилактики и патогенетической коррекции стресс-индуцированных нарушений иммунитета [148]. Выраженное антистресорное действие аргининсодержащего гексапептидного аналога обусловлено наличием аргининового компанента [101]. Важное значение в механизмах действия даларгина при стрессе имеет стимулирующее влияние его на опиатные рецепторы нейрональных структур мозга, а также на тормозную ГАМК-эргическую систему [101, 146]. Обнаруженные эффекты способствуют ограничению стресс-реакции на стадии тревоги и формированию резистентности к действию стресса в ходе общего адаптационного синдрома [89, 101].

Таким образом, экспериментально и теоретически доказана значимость системы опиоидных пептидов в адаптации и устойчивости организма к стрессу. Одним из важных, и в то же время малоизученных, вопросов в понимании механизмов регуляции активности нейропептидов в организме при воздействии стресса является выяснение путей их синтеза и деградации при экстремальных условиях. 



ФЕРМЕНТЫ ОБМЕНА НЕЙРОПЕПТИДОВ ПРИ СТРЕССЕ



В настоящее время протеолиз рассматривается не только как процесс катаболической утилизации биологически активных пептидов, но и как регуляторный фактор, функция которого состоит в запуске и прерывании ряда биохимических и физиологических процессов при различных функциональных состояниях организма [22, 77, 177, 226]. Практически неизученным остается вопрос об изменениях в функции ферментов обмена нейропептидов при стрессе, в то время как именно активность этих ферментов определяет уровень биологически активных пептидов в организме и, следовательно, степень реализации ответной реакции организма на воздействие экстремальных факторов. 

Согласно литературным данным характер изменения активности ферментов обмена нейропептидов при стрессе зависит от эмоционального статуса животного, который в свою очередь определяется генетически запрограммированной предрасположенностью к той или иной форме экспериментальных неврозов [22, 48, 80, 83, 138, 210, 236]. Исследования показывают, что у крыс с различным поведением в тесте “открытого поля” наблюдаются различия в уровне катехоламинов в мозге [232]. Поскольку регуляция функций САС при стрессе реализуется при участии опиоидных пептидов, способных влиять на направление адаптивных процессов в организме [139, 146], то не исключается, что устойчивость к стрессу зависит от функциональной активности ферментов обмена опиоидных пептидов. 

 Подобная зависимость отмечена для КПН, АПФ, КПN при эмоциональном стрессе [43, 44]. Отмечено, что у устойчивых к стрессу животных активность ферментов обмена нейропептидов более чувствительна к воздействию эмоционального стресса, чем у предрасположенных. 

Обнаружено, что у устойчивых к стрессу животных в гипоталамусе и стриатуме активность КПН при воздействии стресса повышается [41, 42, 43, 56]. Авторами высказано предположение, что такой эффект наблюдается в связи с активацией синтеза в исследованных отделах нейропептидов (энкефалинов, вещества Р и др.), играющих ключевую роль при адаптации к стрессу. В гипофизе, где синтезируется АКТГ, активность растворимой фракции КПН, напротив, существенно повышалась у предрасположенных к стрессу животных. Предполагается, что причина отмеченных изменений состоит в том, что КПН участвует в процессинге АКТГ, который в свою очередь усиливает чувство страха и тревоги и тем самым усугубляет эмоциональный стресс [189]. 

Известно, что КПN и АПФ также участвуют в обмене ПВДС, -эндорфина [40, 209], уровень которых различен у предрасположенных и устойчивых к стрессу животных [92, 130,131]. Повышение содержание этих пептидов в мозге и крови у животных связывают, прежде всего, с высокой скоростью их обмена. Показано, что у устойчивых к эмоциональному стрессу животных, активность КПN и АПФ в сыворотке крови выше, чем у предрасположенных [44]. В связи с этим, авторами высказано предположение о более интенсивном обмене нейропептидов у этих животных и косвенном влиянии КПN и АПФ на эмоциональный статус организма [44]. 

Немаловажную роль в изменении функциональной активности ферментативных систем мозга и периферических тканей при стрессе играет вид стресс-воздействия (хронический и острый звуковой, иммобилизационный, эмоционально-болевой и т.д.). 

Такая зависимость показана, в частности, для КПН [37, 41, 42, 43, 45, 64]. Активность данного фермента при воздействии стресса различной природы, в основном, повышалась, однако, степень ее повышения была различной, что обуславливают спецификой воздействия, вызывающего стресс. Так при хроническом эмоционально-болевом стрессе (ЭБС) повышение активности фермента было меньшим, чем при остром воздействии стресс-факторов [37, 42]. Кроме того, показано, что повышение активности фермента было различным для растворимой и мембраносвязанной форм КПН, что свидетельствует о различной роли этих форм фермента в организме [45, 186]. Наиболее выраженными изменения активности фермента были в гипофизе - отделе, отвечающем за синтез и секрецию стресс-пептидов [37, 45]. Значительное повышение активности показано также в стриатуме – отделе, где синтезируется ряд биологически активных пептидов стресс-протективного действия. Причем отмечено, что при однократном ЭБС такое повышение активности сохранялось в течение достаточно длительного промежутка времени, что указывает, на длительный характер биосинтеза нейропептидов при оказанном воздействии. Предполагается, что причина различия в динамике изменения активности КПН при остром и хроническом воздействии стресса состоит в развитии адаптации организма к неблагоприятным факторам среды при хроническом (многократном) стресс-воздействии [37]. 

Особый интерес представляют исследования, касающиеся влияния различных веществ на ферменты обмена нейропептидов при стрессе. Известно, что этанол ослабляет некоторые физиологические проявления стресса, усиливает секрецию стресс-пептидов, а так же активирует энкефалинэргическую систему [19, 41]. Поскольку уровень опиоидных и стресс-пептидов в организме контролируется КПН, то представляется возможным, что КПН определяет характер влияния этанола на организм при стрессе [19, 41]. Характер влияния этанола на физиологические проявления стресса связан с особенностями стрессирующего фактора [61]. Сведения о гиперактивации КПН при совместном действии этанола иммобилизационного или хронического ЭБС в отделах мозга, где синтезируются опиоидные пептиды, вещество Р, подтверждают данные об адаптогенном действии этанола при стрессе. Однако такая активация пептидэргических систем ведет к тяжелым последствиям для организма, так как вызывает более быстрое истощение этих систем [41]. 

Дальнейшее изучение механизмов, предотвращающих возникновении стресс-реакции, способствовало поиску новых веществ, обладающих стресс - протективным действием. Особое место в ряду таких веществ отводится транквилизаторам (резерпин, диазепам), которые широко используются в клинической практике. Однако влияние их на пептидэргические системы и ферменты обмена нейропептидов изучено недостаточно. Между тем этот вопрос достаточно важен, для понимания механизмов развития стресса. 

Известно, что резерпин повышает уровень энкефалинов в организме [58]. При введении резерпина, активность ферментов процессинга, обладавших КПБ-подобной активностью (КПН и КПN), повышалась в 2-3 раза [58]. Предполагается, что изменение активности изучаемых ферментов является причиной активизации энкефалинэргической системы. 

Транквилизаторы бензодиазепиновой природы также обладают стресс - протективным действием. Изучение их воздействия на ферменты обмена нейропептидов при стрессе становится тем более интересным, что в цепи реакций, которые они осуществляют в организме есть вещества, которые являются либо продуктами их деятельности, либо они участвуют в регуляции их синтеза. Так бензодиазепиновые транквилизаторы модулируют уровень АКТГ как в норме так и при воздействии стресс-факторов [114, 252], в частности введение фенозепама уменьшает концентрацию АКТГ при стрессе. Поскольку известно, что КПН участвует в биосинтезе АКТГ, то особый интерес представляет изучение возможности вовлечения этого фермента в стресс-протективное действие транквилизаторов. 

Данные исследований показывают, что активность КПН при совместном воздействии диазепама и стресса, в основном, ниже, чем только при стрессе [39]. Активность АПФ в сыворотке при введении диазепама изменяется сходным образом. Поскольку АПФ участвует в деградации энкефалинов, вещества Р и ПВДС - биологически активных пептидов, основная роль которых заключается в адаптации организма к стрессу [107, 135, 152], то не исключается, что антистрессорное действие диазепама обусловлено его модулирующим действием на активность КПН и АПФ. Изменение активности данных ферментов может привести к уменьшению содержания АКТГ и увеличению содержания опиоидных нейропептидов, способствуя тем самым развитию адаптационных реакций в организме. 

Таким образом, изменения в проявлении функциональной активности ферментов процессинга и инактивации биологически активных пептидов при стрессе свидетельствуют о важной роли этих ферментов в регуляции уровня активных нейропептидов, участвующих, как в развитии, так и в торможении размаха стресс-реакции. 

Суммируя вышеизложенные сведения необходимо отметить следующее: 

Опиоидные пептиды, их синтетические аналоги (например, даларгин), а также предшественники (лей5-энкефалин-арг6) обладают стресс-протективным свойством. 

При воздействии на организм стресс-факторов различной природы наблюдаются значительные изменения в обмене биологически активных пептидов, а также жизнедеятельности организма в целом. Наиболее существенные изменения отмечаются при остром стресс-воздействии.

Важная роль в обмене регуляторных пептидов принадлежит ферментам пептид-гидролазам, которые регулируют уровень биологически активных пептидов при различных функциональных состояниях организма, в том числе и при стрессе. Особое место в ряду этих ферментов занимают основные карбоксипептидазы, которые действуют на конечном этапе процессинга предшественников регуляторных пептидов, а также ферменты, участвующие в инактивации активных форм нейропептидов.

Стресс-протективные вещества различной природы влияют на активность ферментов обмена нейропептидов мозга и периферических тканей стрессированных животных, что свидетельствует об изменениях в метаболизме нейропептидов у этих животных. 

В связи с этим, представляет интерес изучение влияния предшественника лей-энкефалина на активность некоторых ферментов обмена нейропептидов головного мозга и периферических тканей животных, подверженных воздействию острого ЭБС. Полученные данные могут способствовать выяснению роли пептидгидролаз в механизмах развития стресс-реакции, а также в реализации эффектов экзогенного предшественника на организм, подверженный стрессу. 


ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.



2.1. МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.



Объектом исследования служили головной мозг и периферические ткани (надпочечники и семенники) самцов белых беспородных крыс в возрасте 5 месяцев, массой 160-190 г. Животных содержали в стандартных условиях вивариума.

Животных декапитировали, извлекали головной мозг, гипофиз, надпочечники и семенники. Затем ткани помещали в охлажденный физиологический раствор, очищали от оболочек и кровеносных сосудов, высушивали фильтровальной бумагой. Затем выделяли отделы мозга - гипоталамус, средний мозг, гиппокамп, стриатум, большие полушария.

Образцы выделенных отделов мозга и тканей гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Поттера в 20 мМ натрий ацетатном (NaAc) буфере рН 5,6, содержащем 50 мМ NaCl. Соотношения вес/объем были различны: 1/400- для гипофиза, 1/200- для надпочечников, 1/100- для семенников, 1/50- для отделов мозга. Гомогенаты использовали в качестве источников КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ.

В работе были использованы 4 группы животных. 1 группа – интактные животные. Животным 2 группы вводили раствор лей5-энкефалин-арг6 в дозе 20 мкг/кг соответственно. Животные 3 группы подвергались воздействию острого ЭБС. Животным 4 группы перед воздействием острого ЭБС инстиллировали на конъюнктиву глаза 2 мкл раствора предшественника лей-энкефалина - лей5-энкефалин-арг6 в дозе 20 мкг/кг. 



	
2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.



2.2.1. Схема введения предшественника лей-энкефалина

Введение предшественника лей-энкефалина - тир-гли-гли-фен-лей-арг (лей-энкефалин-арг) осуществлялось способом инстилляции на конъюнктиву глаза (доза 20 мкг/кг веса). Раствор лей-энкефалин-арг наносился на правый глаз крысы, с помощью дозатора с мягким катетером из поливинилхлорида (объем наносимого раствора 2 мкл). Введение предшественника энкефалина осуществлялось утром в одно и то же время. 

	Раствор лей-энкефалин-арг был приготовлен на физиологическом растворе. 

Декапитацию животных производили через 0,5 часа, 4 часа, 24 часа, 72 часа и 10 суток после введения лей-энкефалин-арг, физиологического раствора и через 0,5 часа, 4 часа, 24 часа, 72 часа и 10 суток с начала воздействия острого ЭБС.



2.2.2. Моделирование острого эмоционально-болевого стресса

Для моделирования острого эмоционально-болевого стресса (ЭБС) крыс помещали в клетку с полом из металлической проволоки и встроенной в нее электрической лампочкой и звонком.

Для создания модели стресса крыс в течение 20 мин через каждые 10 секунд в беспорядочном режиме подвергали воздействию одного из трех факторов: вспышке света (лампа накаливания мощностью 100 Вт, расстояние 0,5 м), звука силой 70 Дб, электрокожному раздражению пороговой силы (2 мА). Длительность каждого воздействия составляла 1 сек.


2.2.3. Метод определения активности КПН.

Активность КПН определяли флюориметрически, используя метод Fricker и Snayder c некоторыми модификациями [193]. Активность фермента определяли по освобождению дансил-фен-ала из дансил-фен-ала-арг при рН 5,6, как активность ингибируемая ГЭМЯК - высокоспецифичным ингибитором КПН [193].

	Для определения активности КПН смешивали 150 мкл 50 мМ NaAc буфера рН 5,6, содержащего 50 мМ NaCl (проба без ГЭМЯК - контрольная) или 150 мкл раствора, содержащего ГЭМЯК, в том же буфере – опытная проба (концентрация в пробе 1 мкМ) с 50 мкл препарата фермента. Затем пробы преинкубировали 8 мин, при 37 0С, по истечении этого времени прибавляли предварительно нагретый до 37 0С раствор дансил–фен–ала–арг (концентрация 210 мкМ), объемом 50 мкл (конечная концентрация субстрата в пробе 42 мкМ). Реакционную смесь инкубировали 60 мин при t = 37 0С, реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1 н. НСl.

	К пробам приливали хлороформ объемом 1,5 мл. и тщательно встряхивали в течение 60 сек. При этом продукты реакции переходят в хлороформную фазу, а субстрат, нерастворимый в хлороформе, остается в водной фазе. Для разделения хлороформной и водной фаз пробы центрифугировали в течение 5 мин при 1000 об/ мин.

	Флюоресценцию хлороформной фазы измеряли на флюориметре ФМЦ - 2 в кювете толщиной 1 см при ex = 360 нм и em= 530 нм. В качестве стандартного раствора использовали 1 мкМ раствор дансил-фен-ала в хлороформе.

	Активность КПН определяли как разность в накоплении продуктов реакции в пробах, содержащих и не содержащих ГЭМЯК. Активность выражали в нмоль дансил-фен-ала, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.


Метод определения активности

ФМСФ – ингибируемой карбоксипептидазы.

Активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы определялась флюориметрически, методом, разработанным в лаборатории нейрохимии ПГПУ им. В.Г. Белинского [49]. В качестве субстрата использовали раствор дансил-фен-лей-арг.

В контрольные пробы вносили 150 мкл 50 мМ NaAc буфера, содержащего 50 мМ NaCl рН 5,6 и 50 мкл препарата фермента. Опытные пробы содержали 140 мкл указанного буфера и 50 мкл препарата фермента, ингибитор фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ), приготовленный на этаноле, вносился в пробу непосредственно перед преинкубацией в объеме 10 мкл. Пробы преинкубировали 8 мин при 370С, затем вносили 50 мкл 210 мкМ раствора дансил-фен-лей-арг. Далее контрольные и опытные пробы обрабатывали, как описано для КПН. 

Активность ФМСФ - ингибируемой карбоксипептидазы определяли как разность в накоплении продуктов реакции в пробах, содержащих и не содержащих ФМСФ и выражали в нмоль дансил-фен-лей, образовавше-гося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.



2.2.5.Метод определения активности АПФ.

Активность АПФ также определялась флюориметрически. В качестве субстрата использовали дансил-фен-ала-арг, приготовленный на воде. В качестве ингибитора использовали высокоспецифичный ингибитор АПФ - каптоприл.

Контрольные пробы содержали 100 мкл 200 мМ трис НСl рН 7,6 и 100 мкл препарата фермента. В опытные пробы вносили 90 мкл указанного буфера, 10 мкл 25 мМ каптоприла, приготовленного на воде и 100 мкл гомогената. Пробы преинкубировали в течение 8 мин при 370С, затем в каждую пробу прибавляли предварительно нагретый до 370С раствор субстрата дансил-фен-ала-арг объемом 50 мкл. Реакционные смеси инкубировали в течение 30 мин при 37 0С, реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1н раствора НСl. Далее пробы обрабатывали по схеме, приведенной для КПН.

Активность фермента определяли как разницу в приросте флюорисценции в пробах содержащих и не содержащих ингибитор АПФ - каптоприл и выражали в нмоль дансил-фен-ала, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.



2.2.6. Методы определения активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ in vitro

В опытах in vitro, влияние лей-энкефалин-арг на активность ферментов изучали в гомогенатах гипофиза, надпочечников и больших полушарий. Раствор лей-энкефалин-арг добавляли непосредственно в среду инкубации, концентрация исследуемого предшественника составляла 2,4 мМ. Все последующие операции по определению активности ферментов проводили по схеме, описанной выше.



2.2.7. Метод определения содержания белка

Содержание белка в пробах определяли по методу Лоури [65]. Метод основан на способности белка окрашиваться раствором Фолина. В качестве стандарта для построения калибровочной кривой использовали БСА.



2.2.8.Статистическая обработка результатов исследования.

Результаты подвергали статистической обработке с использованием t-критерия Стьюдента, различия считали достоверными при p<0,05 [98].


ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.



3.1. РЕГИОНАЛЬНОЕ И ТКАНЕВОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ КПН, ФМСФ-ИНГИБИРУЕМОЙ КП И АПФ У САМЦОВ КРЫС.



Известно, что уровень биологически активных пептидов регулируется пептидгидролазами, которые отщепляют остатки аргинина и лизина с С-конца пропептидов. Неоднородное распределение нейропептидов, а также разница в течение процессинга регуляторных пептидов в тканях (нервной и периферической) [14, 212, 271] указывают на необходимость изучения тканевого и регионального распределения активности ферментов их обмена. Особый интерес вызывает изучение распределения активности ФМСФ-ингибируемой КП - фермента, биологическая роль которого в полной мере не определена. Важным представляется, также, сравнение уровня активности этого фермента с активностью КПН и АПФ - ферментов, тканевое и региональное распределение и биологическая роль которых известны. 

Результаты исследования распределения активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ в отделах мозга и некоторых периферических тканях представлены в таблице 1 (приложение).



3.1.1.Распределение активности КПН.

Максимальная активность КПН обнаружена в гипофизе - отделе, синтезирующем группу биологически активных пептидов. В отделах мозга активность КПН примерно в 6-7 раз ниже, чем в гипофизе. По убыванию активности КПН отделы мозга можно расположить следующим образом: средний мозг, гипоталамус, гиппокамп. В этих регионах мозга секреторные пептиды не синтезируются, однако данные отделы характеризуются достаточно высоким их содержанием [221]. Далее по убыванию активности КПН следуют стриатум и большие полушария, уровень активности фермента, в которых примерно одинаков. В семенниках и надпочечниках активность КПН на порядок ниже, чем в отделах мозга. 

Таким образом, высокая активность КПН обнаружена в отделах мозга, связанных с образованием, секрецией или высоким содержанием регуляторных пептидов [221]. Полученные данные хорошо согласуются с литературными о распределении активности КПН [39, 40, 193, 194].

Следует указать на то, что в наших исследованиях активность КПН определялась как активность, ингибируемая ГЭМЯК, являющейся высокоспецифичным ингибитором КПН, в то время как другие авторы использовали данные по активности КПН, стимулируемой ионами Со2+ [188, 193, 194], что предполагает несколько завышенные результаты, не всегда соответствующие действительному уровню активности этого фермента в мозге и тканях. В связи с этим значения активности КПН в наших исследованиях несколько ниже значений, имеющихся в литературе. 



3.1.2. Распределение активности АПФ.

Максимальная активность АПФ у интактных животных обнаружена в гипофизе. В стриатуме активность АПФ примерно в 3 раза ниже. В других отделах мозга и надпочечниках активность фермента находится на уровне предела чувствительности метода. Высокая активность АПФ обнаружена также в семенниках.

Таким образом, полученные данные хорошо согласуются с распределением регуляторных пептидов в мозге и периферических тканях крыс, что подтверждает участие данного фермента в процессах модификации белков и пептидов в этих регионах. 


3.1.3.Распределение активности ФМСФ-ингибируемой КП

Полученные данные свидетельствуют, что активность ФМСФ-ингибируемой КП обнаружена во всех исследуемых регионах мозга и периферических тканях крыс (табл.1). Наибольшая активность фермента показана в надпочечниках, в гипофизе активность составляет 74% от активности ФМСФ-ингибируемой КП в надпочечниках, в других отделах активность примерно одинакова и составляет 23% от активности фермента в гипофизе.

Данные наших исследований о сравнительно высокой активности ФМСФ-ингибируемой КП в надпочечниках и гипофизе, отделах, характеризующихся высоким содержанием нейропептидов, а также их интенсивным метаболизмом [14, 34], указывают на вероятность вовлечения этого фермента в обмен биологически активных пептидов. 

Сравнение регионального распределения КПН и ФМСФ-ингибируемой КП показывает некоторое сходство, так максимальный уровень активности этих ферментов отмечен в гипофизе. Однако если активность ФМСФ-ингибируемой КП характеризуется высокими показателями в надпочечниках, где синтезируется большое количество энкефалинов, то для КПН эти значения на порядок ниже. Кроме того, различия в уровне активности ФМСФ-ингибируемой КП, обнаруженные между гипофизом и отделами мозга, менее значительны по сравнению с таковыми для КПН. Полученные данные позволяют выдвинуть предположение о некоторых различиях в биологической функции этих ферментов. Вероятно, что КПН и ФМСФ-ингибируемая КП участвуют в обмене разных регуляторных пептидов или в процессах модификации одних и тех же нейропептидов, но на различных этапах их обмена. 


3.2. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ОСТРОГО ЭМОЦИОНАЛЬНО-БОЛЕВОГО СТРЕССА НА АКТИВНОСТЬ КПН, ФМСФ-ИНГИБИРУЕМОЙ КП И АПФ



Известно, что воздействие стресс-факторов вызывает значительные изменения в функционировании многих систем организма, таких как гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая (ГГНС), симпато-адреналовая (САС) и др. [5, 21, 76, 270]. Неотъемлемой частью развивающихся гормонально-медиаторных изменений при стрессе является активация пептидэргических систем головного мозга и периферических тканей [8, 91, 111, 137]. Одной из наиболее многофункциональных регуляторных систем, действующих в условиях стресса и адаптации, является система эндогенных опиоидных пептидов [116, 118, 242]. Обнаружено, в частности, что стресс-воздействие является стимулирующим фактором, приводящим к генерализованной активации стресс-лимитирующей энкефалинэргической системы [79, 100, 101]. Причем, наиболее выраженное повышение адаптивных способностей организма достигается при кратковременном остром воздействии стресс-факторов [144, 145]. В связи с этим, непродолжительное острое стрессирование рассматривается как физиологически адекватный способ изучения свойств эндогенных регуляторных пептидов при экстремальных воздействиях. Кроме того известно, что сильные раздражители, такие как электрический ток, резкий звук, вызывают повышение проницаемости ГЭБ для эндогенных биологически активных веществ, синтезируемых в ответ на стресс-воздействие [88, 97]. 

Практически не изучены ферментативные механизмы, обеспечивающие обмен регуляторных пептидов при остром ЭБС. Известно, что уровень нейропептидов при различных физиологических и патологических состояниях, а, следовательно, и степень реализации ответной реакции организма на оказанное воздействие, зависят от проявления функциональной активности ферментов их обмена. Участие КПН и АПФ в образовании и/или деградации энкефалинов, пептидных гормонов гипофиза и других регуляторных пептидов при стрессе сегодня не вызывают сомнений. Что же касается включения в процессы обмена нейропептидов ФМСФ-ингибируемой КП, то, на данный момент, это является только предположением. В связи с этим, для более детального определения биологической роли этого малоизученного фермента, особый интерес представляет сравнение изменений активности ФМСФ-ингибируемой КП с активностью КПН и АПФ при остром эмоционально-болевом стрессе (ЭБС). Большой интерес в связи с данными о длительном и фазном выбросе нейропептидов при воздействии стресс-факторов [134, 135, 144], вызывает изучение динамики изменения активности исследуемых ферментов. 

Проведено исследование влияния острого ЭБС на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс через 0,5 часа, 4 часа, 24 часа, 72 часа и 10 суток после воздействия острого ЭБС. Сравнение активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ проводилось относительно интактной группы животных (норма). Результаты данной серии исследования представлены в таблице 2 (приложение).



3.2.1. Активность КПН в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс при воздействии острого эмоционально-болевого стресса

	Обнаружено, что острый ЭБС вызывал статистически достоверное изменение активности КПН во всех исследованных отделах мозга и гипофизе (табл.2, рис.1). Активность КПН в надпочечниках и семенниках крыс при воздействии острого ЭБС практически не изменялась. Показано, что изменения активности изучаемого фермента в отделах мозга и гипофизе отличались по динамике, направленности и степени выраженности. Наиболее выраженное повышение активности КПН обнаружено в гипофизе и стриатуме. В гиппокампе, среднем мозге и надпочечниках после воздействия ЭБС отмечено снижение активности КПН.

Активность КПН в гипофизе через 0,5, 4, 24 и 72 часа была выше нормы. Наиболее существенное повышение активности фермента отмечено через 0,5 и 72 часа после воздействия острого ЭБС, активность КПН превышала показатели интактных животных на 43%, p<0,01 и 54%, p<0,001, соответственно. Через 10 суток статистически достоверных отклонений от нормы не обнаружено

В стриатуме активность фермента повышалась постепенно. Максимальное повышение активности фермента отмечено через 24 часа после начала воздействия стресс-фактора и отличалось от контрольного уровня на 44%, p<0,01. Через 72 часа активность КПН составляла 133%, p<0,05, от показателей активности фермента у интактных животных. Через 10 суток достоверных изменений не обнаружено.

В больших полушариях острый ЭБС вызывал статистически значимое увеличение активности КПН через 72 часа (+33%, p<0,05) после начала эксперимента.

Через 4 часа после воздействия острого ЭБС активность КПН в среднем мозге и гиппокампе была ниже показателей активности интактных животных на 18%, p<0,05 и 32%, p<0,01, соответственно. 

В надпочечниках активность КПН также снижена по сравнению с показателями активности животных, не подвергавшихся воздействию ЭБС через 4 и 24 часа на 40%, p<0,05.

Таким образом, наиболее выраженные изменения активности КПН при остром ЭБС наблюдались в гипофизе. Полученные данные согласуются с данными об увеличении синтеза и секреции гормонов гипофиза пептидной природы при стрессе [232], а также с данными о повышении активности КПН при других видах стресса [42, 64]. Высокая активность фермента обнаружена также в стриатуме – отделе, где синтезируются такие нейропептиды, как энкефалины, вещество Р, т.е. биологически активные пептиды обладающие выраженным антистрессорным действием, [134, 153]. 



3.2.2. Активность ФМСФ-ингибируемой КП в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс при воздействии острого эмоционально-болевого стресса

Влияние ЭБС на активность ФМСФ-ингибируемой КП наблюдается практически во всех отделах мозга, гипофизе, надпочечниках и семенниках, однако динамика изменения активности отличается от таковой для КПН (табл.2, рис.2). 

Так во всех отделах мозга после острого ЭБС активность ФМСФ-ингибируемой КП была несколько ниже показателей активности интактных животных через 0,5, 4 и 24 часа при этом статистически достоверных отличий от нормы обнаружено не было. Через 72 часа после начала воздействия активность ФМСФ-ингибируемой КП повышалась и составляла в гипофизе - 123%, p<0,01, в среднем мозге - 119%, p<0,05, в гипоталамусе - 121%, p<0,01, в гиппокампе - 127%, p<0,01, в больших полушариях - 157%, p<0,001 от активности фермента в норме (рис.2). 

	В отличие от КПН, наиболее выраженные изменения активности ФМСФ-ингибируемой КП по сравнению с группой интактных животных отмечены в надпочечниках. Так через 4 и 24 часа после острого ЭБС активность фермента была ниже показателей нормы на 12 (p<0,05) и 21 (p<0,01) %, соответственно. Затем активность ФМСФ-ингибируемой КП повышалась и через 72 часа превышала показатели активности интактных животных на 57%, p<0,01.

	В семенниках статистически достоверные изменения в активности ФМСФ-ингибируемой КП по сравнению с интактной группой животных обнаружены только через 0,5 часа. Активность фермента в этом регионе превышала показатели группы животных, не подвергавшихся воздействию стресса, на 50%.

Таким образом, при воздействии острого ЭБС статистически достоверные отклонения активности от нормы, во всех исследуемых отделах мозга и надпочечниках, отмечены только через 72 часа после начала воздействия. В отличие от КПН максимальное повышение активности фермента обнаружено в больших полушариях и надпочечниках. Полученные сведения могут свидетельствовать о различии в биологической функции КПН и ФМСФ-ингибируемой КП при стрессе.



3.2.3. Активность АПФ в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс при воздействии острого эмоционально-болевого стресса

Результаты определения активности АПФ в головном мозге, надпочечниках и семенниках при воздействии острого ЭБС приведены в табл.2 и на рис.3. 

Полученные данные показывают, что при воздействии острого ЭБС статистически достоверных изменений активности АПФ в головном мозге, гипофизе и надпочечниках не обнаружено. Острый ЭБС вызывал изменение активности АПФ в семенниках.

Активность фермента через 0,5 часа после начала стресс-воздействия была выше нормы на 51%, p<0,05. Через 4 часа активность снижалась и до 72 часов оставалась приблизительно на одном уровне. Показатели активности при этом были ниже соответствующих показателей группы интактных животных на 11-23%. Через 10 суток после острого ЭБС достоверных отличий от нормы не обнаружено.

В среднем мозге, гиппокампе, гипоталамусе и больших полушариях активность АПФ была ниже уровня чувствительности метода определения (табл.2).

В гипофизе и стриатуме через 4 часа после воздействия острого ЭБС обнаружено достоверное понижение активности АПФ. Активность фермента в этих отделах была ниже соответствующих показателей активности животных, не подвергавшихся воздействию острого ЭБС на 28%, p<0,01 и 32%, p<0,01, соответственно. 

Таким образом, обнаружено, что острый ЭБС вызывал понижение активности АПФ в гипофизе и стриатуме через 4 часа. В семенниках через 0,5 часа после воздействия обнаружено повышение, а 4 и 24 часа снижение активности фермента. В других отделах мозга и надпочечниках активность фермента характеризуется очень низкими показателями. 

Полученные данные показывают, что при воздействии острого ЭБС активность КПН изменялась во всех исследуемых регионах мозга и гипофизе, активность ФМСФ-ингибируемой КП во всех отделах мозга (исключение стриатум), гипофизе, надпочечниках и семенниках и активность АПФ – в гипофизе, стриатуме и семенниках. Обнаружено, что острый ЭБС вызывал различные по динамике, степени выраженности и направленности изменения активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ. Наиболее выраженное повышение активности КПН отмечено в гипофизе – через 0,5 и 72 часа и стриатуме – через 24 часа. В среднем мозге и гиппокампе показано снижение активности фермента через 4 часа после воздействия стресса. В отличие от КПН наиболее выраженное повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП в головном мозге, гипофизе и надпочечниках отмечалось через 72 часа после начала стресс-воздействия. Острый ЭБС вызывал разнонаправленные изменения активности АПФ в семенниках. Активность фермента в гипофизе и стриатуме через 4 часа после воздействия снижалась. В других отделах мозга и надпочечниках изменений активности АПФ не обнаружено. 



3.3. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПРЕДШЕСТВЕННИКА ЛЕЙ-ЭНКЕФАЛИНА НА АКТИВНОСТЬ КПН, ФМСФ-ИНГИБИРУЕМОЙ КП И АПФ



В последнее время интенсивное развитие получило учение о пептидах - природных регуляторах, причем, именно малых пептидов, способных проникать в клетку, взаимодействуя с клеточными рецепторами. Быстрая реакция организма на введение пептидов, высокая биологическая активность, эндогенное происхождение - все эти важные качества привлекают внимание многих исследователей. Особенно интересны в этом отношении энкефалины. 

Известно, что при периферическом введении нейромедиаторов, в том числе и опиоидных пептидов, отмечается общая закономерность: сами вещества практически не проходят ГЭБ, в то время как их ближайшие предшественники хорошо проникают в структуры мозга и вызывают соответствующие изменения в функционирование других систем, в частности тех, которые включаются в ответ организма на действие экстремального фактора [82]. Результаты этих работ явились определя-ющим фактором для использования в наших исследованиях предшественника лей-энкефалина – лей5-энкефалин-арг6. 

Известно, что экзогенное введение дополнительного источника жидкости приводит к изменению в функционировании пептидэргических систем, таких как ренин-ангиотензиновая, гипофизарно-надпочечниковая и опиоидэргическая [34, 86, 104, 125, 134], деятельность которых во многом определяется ферментами обмена биологически активных пептидов. Несомненно, что подобное воздействие отражается и на активности этих ферментов. Согласно данным исследований, при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в отделах мозга отмечается увеличение активности КПН [46]. Изменения такого характера могут быть связаны, прежде всего, с реакцией организма на введение избыточного количества жидкости, а также с развитием стрессорных повреждений, вызванных внутрибрюшинной инъекцией. Показано, что введение физиологического раствора методом инстиляции на конъюнктиву глаза, является достаточно мягким способом введения, не травмирующим животное [119]. В связи с этим, а, также, учитывая тот факт, что нашим исследованием предусмотрено изучение механизмов возникновения и развития стресс-реакции, наиболее предпочтительным будет являться именно этот способ введения. Кроме того, метод инстилляции вещества на конъюнктиву глаза позволяет использовать минимальный объем жидкости, обеспечивает высокую вероятность проникновения вещества через ГЭБ [1, 24, 119], что предполагает активное включение вводимого вещества в обмен регуляторных пептидов в исследуемых регионах.

Активность исследуемых ферментов обмена нейропептидов - КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ - в мозге, надпочечниках и семенниках крыс определялась через 0,5 часа, 4 часа, 24 часа, 72 часа и 10 суток после инстилляции лей-энкефалин-арг в дозе 20 мкг/кг веса животного. Сравнение уровня активности ферментов при введении лей-энкефалин-арг проводилось относительно интактной группы животных (контроль). Полученные данные представлены в таблице 3 (приложение). 



3.3.1. Активность КПН в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс при введении лей-энкефалин-арг.

При введении лей-энкефалин-арг во всех исследованных отделах мозга и тканях наблюдалось повышение активности КПН относительно контрольной группы животных (табл.3, рис.4). Наиболее выраженные изменения активности фермента обнаружены в гипофизе, стриатуме и надпочечниках. Статистически достоверные изменения активности КПН в исследованных отделах мозга и периферических тканях отмечены уже через 0,5 часа после введения лей-энкефалин-арг. Кроме того, показано достаточно длительное действие исследуемого пропептида, что проявлялось повышением активности КПН до 72 часов после введения предшественника в отделах и тканях, связанных с образованием и секрецией биологически активных пептидов. Так в гипофизе активность фермента была выше соответствующих показателей контрольной группы животных через 0,5, 4, 24 и 72 часа на 152, 111, 64 и 78%, соответственно, p<0,001. Через 10 суток достоверных изменений не обнаружено. Сходная динамика изменения активности КПН обнаружена в среднем мозге, гипоталамусе, гиппокампе и больших полушариях, однако в них изменения носили менее выраженный характер. Максимальное повышение активности фермента отмечено также через 0,5 часа, затем активность КПН плавно снижалась. Через 10 суток статистически достоверных изменений обнаружено не было. В стриатуме, отделе, где синтезируются многие нейропептиды [62, 156, 221], изменения носили более выраженный характер, чем в других исследуемых отделах мозга и несколько отличались от последних динамикой. Так, активность КПН в них превышала соответствующие показатели группы контрольных животных через 0,5часа на 139%, p<0,001, через 4 часа активность снижалась (+56%, p<0,001), а через 24 и 72 часа отмечен всплеск активности КПН (+72%, p<0,001). 

Сходная со стриатумом динамика изменения активности КПН показана в надпочечниках, органе связанном преимущественно с образованием энкефалинов, однако повышение активности КПН относительно контрольной группы животных было более выраженным. Активность фермента превышала контрольные показатели на 150, 100,130 и 80%, p<0,001, через 0,5, 4, 24 и 72 часа соответственно. В семенниках активность КПН была выше показателей контрольной группы животных на протяжении всех исследуемых промежутков времени и превышала их в 1,8-2 раза. 

Таким образом, введение лей-энкефалин-арг вызывает в целом сходный характер изменения активности КПН: повышение через 0,5 часа и дальнейшее снижение с незначительными колебаниями, что свидетельствует о включении данного фермента в ответную реакцию организма на введение предшественника энкефалина.



3.3.2. Активность ФМСФ - ингибируемой КП в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс при введении лей-энкефалин-арг

При введении лей-энкефалин-арг во всех исследуемых отделах мозга и надпочечниках наблюдалось достоверное повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП по сравнению с показателями контрольной группы (табл.3, рис.5). Наиболее выраженные изменения активности фермента обнаружены в надпочечниках и гипоталамусе. В семенниках активность ФМСФ-ингибируемой КП была ниже соответствующих контрольных показателей. Сходная динамика изменения активности фермента выявлена в гипофизе, среднем мозге, гипоталамусе, стриатуме и надпочечниках. В гиппокампе, больших полушариях и семенниках изменения носили несколько иной характер. 

Максимальное повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП отмечено через 0,5 часа после введения лей-энкефалин-арг. Наиболее выраженное повышение активности фермента показано в надпочечниках, где активность ФМСФ-ингибируемой КП превышала показатели контрольной группы животных на 184%, p<0,001. Затем в порядке убывания исследуемые отделы располагаются следующим образом: гипоталамус (+130%, p<0,001), гиппокамп (+109%, p<0,001), в гипофизе и среднем мозге активность ФМСФ-ингибируемой КП превышала контрольные показатели в 2 раза, p<0,001, в стриатуме на 88%, p<0,001, в больших полушариях на 46%, p<0,001. Через 4 часа статистически достоверное повышение активности зарегистрировано только в надпочечниках (+140%, p<0,001), среднем мозге (+74%, p<0,01), гипоталамусе (+52%, p<0,01), гипофизе (+37,5%, p<0,01) и стриатуме (+29%, p<0,01). Через 24 часа повышения активности ФМСФ-ингибируемой КП по сравнению с контрольными показателями обнаружено не было. Через 72 часа повышенная по сравнению с контролем активность фермента отмечена в гипофизе (+38%, p<0,05) 

Таким образом, можно выделить следующие закономерности во влиянии лей-энкефалин-арг на активность ФМСФ – ингибируемой карбоксипептидазы: повышение активности фермента практически во всех отделах мозга и надпочечниках через 0,5 и 4часа и дальнейшее снижение ее. Наиболее существенное и длительное повышение активности фермента при введении лей-энкефалин-арг обнаружено в отделах, связанных с синтезом и секрецией регуляторных пептидов. Показанная динамика изменения активности фермента сходна с таковой КПН, что свидетельствует о включении ФМСФ-ингибируемой КП, наряду с КПН, в ответную реакцию организма на введение предшественника лей-энкефалина.



3.3.3. Активность АПФ в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс при введении лей-энкефалин-арг

При однократной инстилляции лей-энкефалин-арг статистически достоверные отклонения в активности АПФ обнаружены в гипофизе, стриатуме и семенниках (табл.3, рис.6). В других отделах мозга и надпочечниках статистически значимых изменений активности фермента не отмечено. 

Активность фермента в семенниках, гипоталамусе, стриатуме и гипофизе и через 0,5 часа после введения лей-энкефалин-арг превышала показатели контрольной группы животных на 116, 83, 63 и 56% соответственно, p<0,001. Активность АПФ через 4, 24, 72 и 240 часов в стриатуме и гипофизе практически не отличалась от показателей интактной группы животных. 

В семенниках отмечено более длительное влияние лей-энкефалин-арг на активность АПФ, здесь она превышала контрольные значения через 4 и 24 часа на 47%, p<0,01 и 26%, p<0,05 соответственно. Через 72 часа изменения уже не носили статистически достоверного характера. 

Таким образом, динамика изменения активности АПФ при введении лей-энкефалин-арг несколько отличается от таковой для КПН и ФМСФ-ингибируемой КП, как в отделах мозга, так и в периферических тканях. Что свидетельствует о специфической роли АПФ, в исследованных регионах. Показанное существенное и достаточно длительное повышение активности АПФ в семенниках при однократной инстилляции лей-энкефалин-арг, вероятно, свидетельствует о включении данного фермента в процессы синтеза биологически активных пептидов в данной ткани. 

Сравнение уровня активности исследуемых пептид-гидролаз показывает наличие ряда сходных черт в динамике изменения активности ферментов. Так КПН и ФМСФ-ингибируемая КП практически во всех исследованных отделах мозга и тканях, а также АПФ в гипофизе, стриатуме и семенниках характеризуются достоверным повышением активности через 0,5 и 4 часа. Наиболее выраженный характер изменения носили в тех отделах мозга и органах, которые характеризуются повышенным содержанием таких регуляторных пептидов как ПВДС, энкефалины, вещество Р [156]. Увеличение активности исследуемых ферментов при введении лей-энкефалин-арг показано также в отделах синтезирующих нейропептиды. Полученные данные, свидетельствуют о включении КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ в ответ организма на введение предшественника лей-энкефалина.

	3.4.	ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ЛЕЙ-ЭНКЕФАЛИН-АРГ НА АКТИВНОСТЬ КПН, ФМСФ-ИНГИБИРУЕМОЙ КП И АПФ IN VITRO



Согласно литературным данным активность КПН in vitro ингибируется такими нейропептидами, как энкефалины, вазопрессин, вещество Р, окситоцин [207]. Подобное действие оказывают опиоидные пептиды и -липотропин на активность АПФ [160].

Особый интерес для выяснения механизмов действия экзогенно-введенного лей-энкефалин-арг представляет исследование in vitro влияния предшественника лей-энкефалина на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ. Полученные данные представлены в таблице 3.

В опытах in vitro на изолированных надпочечниках, гипофизе и больших полушариях обнаружено, что добавление лей-энкефалин-арг в концентрации 2,4мМ, приводит к подавлению активности КПН и АПФ. Более выраженное подавление активности КПН и АПФ обнаружено в надпочечниках. Активность ФМСФ-ингибируемой КП в изолированных надпочечниках, гипофизе и больших полушариях in vitro практически не изменяется по сравнению с контрольными пробами.

Как было показано выше, в опытах in vivo активность ферментов при инстилляции пропептида повышалась. Обнаруженное несоответствие во влиянии лей-энкефалин-арг на активности изучаемых ферментов обмена регуляторных пептидов in vitro и in vivo показывает, что влияние предшественника лей-энкефалина на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ опосредовано.


ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ЛЕЙ-ЭНКЕФАЛИН-АРГ НА АКТИВНОСТЬ КПН, ФМСФ-ИНГИБИРУЕМОЙ КП И АПФ НА ФОНЕ ОСТРОГО ЭМОЦИОНАЛЬНО-БОЛЕВОГО СТРЕССА.



Известно, что коррекция последствий острых стресс-воздействий с использованием традиционных средств в большинстве случаев не достаточно эффективна. Наблюдаемая после воздействия стресса несоответствие процессов синтеза и секреции многих регуляторных пептидов, а также блокада их рецепторов продуктами метаболизма приводит к истощению нейрогуморальных систем [22, 106, 111, 176]. Одним из способов естественной профилактики повреждений, вызванных чрезмерной реакцией на действие экстремальных факторов, является активация эндогенной стресс-лимитирующей системы опиоидных пептидов за счет их экзогенного введения [116, 135]. Однако полифункциональность опиоидов, становится лимитирующим фактором для их применения при различных патологиях ЦНС. Известно, что введение извне энкефалинов, их предшественников и синтетических аналогов, устойчивых к действию пептидгидролаз, может в значительной мере ослабить или даже устранить патологические изменения в условиях разных видов стресс-воздействия [23, 69, 102]. При этом, особенности фармакологического действия энкефалинов зависят от их энзимоустойчивости и стабильности в крови, способности проникать через гемато-энцефалический барьер (ГЭБ).

Известно, что при стрессе предварительное введение лей-энкефалина или его синтетического аналога даларгина уменьшает подъем уровня кортикостерона в организме – одного из компанентов стресс-реализующих систем [69, 105, 123]. Полагают, что экзогенно вводимые опиоидные пептиды могут способствовать “запуску” ряда эндогенных реакций синтеза или деградации других биологически активных пептидов, в том числе и обладающих антистрессорным действием [11, 13, 78, 113, 119]. Известно, что образование и инактивация регуляторных пептидов осуществляется при участии ферментов пептид-гидролаз. 

В связи с вышесказанным интересным представляется исследование влияния предшественника лей-энкефалина на активность изучаемых ферментов обмена регуляторных пептидов в динамике острого ЭБС.

Проведены исследования влияния лей-энкефалин-арг на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс, подверженных острому ЭБС. Предшественник лей-энкефалина вводился непосредственно перед началом стрессирования в дозе 20 мкг/кг веса животного. Активность ферментов в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс определяли через 0,5 часа, 4 часа, 24 часа, 72 часа и 10 суток после совместного воздействия пропептида и острого ЭБС. Сравнение полученных данных проводилось относительно соответствующих показателей активности ферментов интактных и животных, подверженных ЭБС. Результаты исследования представлены в таблицах 5-7 (приложение) и рис. 7-9.



3.5.1. Активность КПН при введении лей-энкефалин-арг на фоне острого ЭБС.

Данные проведенных исследований (табл.5, рис. 7) показывают, что при введении предшественника лей-энкефалина стрессированным животным, активность КПН изменяется в тех отделах мозга, которые, по классическим представлениям, связаны с синтезом стресс-протективных веществ [14, 140, 156, 185]. Наиболее выраженное повышение активности фермента, по сравнению и группой интактных животных, обнаружено в гипофизе, стриатуме, гипоталамусе и больших полушариях. Существенное повышение активности отмечено также в семенниках. Как было показано выше (раздел 3.2.1.) активность КПН в гипофизе и стриатуме при воздействии острого ЭБС также повышается. 

Однако, как показывают данные проведенных исследований, изменения активности КПН у группы животных, которым на фоне стресса вводился лей-энкефалин-арг отличается от таковых при воздействии острого ЭБС по динамике и степени выраженности. 

Введение лей-энкефалин-арг перед началом стресс-воздействия предотвращало повышение активности КПН в гипофизе (табл.5, рис.7). Активность фермента через 0,5 и 4 часа не отличалась от нормы. Через 24 и 72 часа она была выше активности фермента у интактных животных на 21% (p<0,05) и 40% (p<0,01), соответственно (рис.7). Однако повышение активности КПН было меньшим по сравнению с животными, не получавшими лей-энкефалин-арг перед стрессом (рис.7). Через 10 суток статистически значимых изменений активности фермента, по сравнению с нормой и с стрессированными животными, обнаружено не было. 

В стриатуме через 0,5 и 4 часа активность КПН превышала показатели интактных животных на 28% (p<0,001) и 33%(p<0,01) и стрессированных животных на 28% (p<0,01) и 20% (p<0,01), соответственно (табл.5, рис.7). Через 24 часа не отличалась от активности фермента у обеих сравниваемых групп. Через 72 часа активность КПН была выше нормы на 39% (p<0,01) и не отличалась от таковой при стрессе. Через 10 суток после совместного воздействия лей-энкефалин-арг и острого ЭБС активность фермента не отличалась показателей нормы и стрессированных животных. 

Статистически достоверное повышение активности КПН, как по сравнению с интактными животными, так и по сравнению с группой животных, подверженных воздействию острого ЭБС, отмечено через 4 часа в больших полушариях – отделе, характеризующимся высоким содержанием нейропептидов (табл.5, рис.7). Активность фермента при этом превышала соответствующие показатели на 33%( p<0,01).

Предварительное введение перед стрессом лей-энкефалин-арг предотвращало снижение активности КПН в среднем мозге и гиппокампе через 4 часа после воздействия. Активность фермента при этом практически не отличалась от нормы и превышала соответствующие показатели стрессированных животных на 33%( p<0,01) в среднем мозге и на 63% (p<0,001) в гиппокампе (рис.7). Через 0,5, 24 , 72 часа и 10 суток после совместного воздействия лей-энкефалин-арг и стресса не отличалась от таковой у обеих сравниваемых групп (рис.7).

В надпочечниках через 0,5, 24, 72 часа и 10 суток активность КПН не отличалась от соответствующих показателей стрессированных и интактных животных, а через 4 часа была выше таковой, у животных подверженных воздействию острого ЭБС (+117%, p<0,001) и не отличалась от нормы (рис.7). 

В семенниках после совместного воздействия двух факторов обнаружены статистически достоверные отличия от группы интактных животных. Активность КПН в них через 0,5 и 4 часа превышала соответствующие показатели нормы на 50%, p<0,01 (рис.7).

Таким образом, предварительное введение лей-энкефалин-арг способом инстилляции на конъюнктиву глаза животным перед острым ЭБС предотвращало, обнаруженное при стрессе, повышение активности КПН в гипофизе, понижение активности фермента в среднем мозге и гиппокампе, и, напротив, приводило к повышению активности фермента в стриатуме гипоталамусе и больших полушариях. 

Полученные данные показывают, что при совместном воздействии острого ЭБС и предшественника лей-энкефалина изменения в активности КПН во всех исследованных регионах мозга и тканях, носят менее выраженный характер, чем при воздействии только лей-энкефалин-арг, где активность фермента повышается в 1,5-2 раза (рис.4).


3.5.2. Активность ФМСФ - ингибируемой КП при введении лей-энкефалин-арг у крыс на фоне острого ЭБС.

При введении предшественника лей-энкефалина стрессированным животным во всех исследованных отделах мозга и тканях отмечено повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП по сравнению с нормой (табл.6, рис.8). Динамика изменения активности несколько отличается от таковой для КПН. Кроме того, следует отметить, что если при воздействии острого ЭБС повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП, по сравнению с нормой, обнаружено через 72 часа, то при совместном действии двух факторов изменения такого рода отмечаются уже через 0,5 часа после начала воздействия. Затем активность ФМСФ-ингибируемой КП плавно снижается и через 24 часа приближается к норме. Через 72 часа и 10 суток активность фермента во всех отделах мозга и тканях (исключение семенники) близка к показателям интактных крыс. 

Наиболее выраженное повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП по сравнению с группой интактных и стрессированных животных отмечено в гипофизе и больших полушариях (рис.8) через 0,5 часа после совместного воздействия пропептида и острого ЭБС. Активность фермента в гипофизе и больших полушариях была выше нормы на 26,5 и 26% (p<0,05) (рис.8), соответственно и превышала соответствующие показатели стрессированных животных на 46 % (p<0,05) и 38% (p<0,01) (рис.8). В другие промежутки времени статистически достоверных отличий не обнаружено, т.е. показатели активности были близки к соответствующим показателям интактных животных. Обнаруженного после воздействия острого ЭБС повышения активности КПН через 72 часа (рис.2) не отмечено (рис.8). Активность фермента в гипофизе и больших полушариях через 72 часа после совместного воздействия лей-энкефалин-арг и острого ЭБС была ниже соответствующих показателей стрессированных животных на 26% (p<0,01) и 30% (р<0,001), соответственно (рис.8).

Динамика изменения активности ФМСФ-ингибируемой КП в надпочечниках при воздействии предшественника лей-энкефалина и острого ЭБС была сходной с таковой в гипофизе и больших полушариях, однако, изменения были менее выражены (рис.8). Активность фермента в них также превышала показатели животных, подверженных воздействию острого ЭБС и интактных животных через 0,5 часа на 21% (p<0,05) и 15% (p<0,05), соответственно.

В гипоталамусе, гиппокампе и семенниках при введении пропептида стрессированным животным активность ФМСФ-ингибируемой КП превышала показатели обеих сравниваемых групп через 0,5 и 4 часа, 0,5 часа и 4, 24 и 72 часа, соответственно (рис.8). 

Введение лей-энкефалин-арг перед началом стресса вызывало существенное по сравнению с стрессированными животными повышение активности в среднем мозге через 0,5 и 4 часа на 41% (p<0,01) и 24% (p<0,05), соответственно (рис.8). Активности фермента при этом практически не отличалась от интактных животных (рис.8). 

Сходная тенденция наблюдалась в стриатуме, здесь активность ФМСФ-ингибируемой КП через 0,5 часа превышала соответствующие показатели группы животных, подвергавшихся воздействию острого ЭБС на 32%, p<0,05 и не отличалась от нормы во все исследуемые промежутки времени. Введение предшественника лей-энкефалина предотвращало обнаруженное при стрессе повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП в стриатуме через 72 часа (рис.8). 

Таким образом, практически во всех исследованных регионах мозга введение лей-энкефалин-арг перед острым ЭБС вызывало повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП через 0,5 часа, по сравнению с соответствующими показателями стрессированных животных и предотвращало повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП через 72 часа. Активность фермента при этом была близка к норме.

Данные исследований показывают, что во всех исследованных отделах мозга и тканях активность ФМСФ-ингибируемой КП при совместном воздействии стресса и лей-энкефалин-арг (рис.8) была ниже соответствующих показателей активности фермента животных, которым инстиллировался предшественник пептида (рис.5).



3.5.3. Активность АПФ при введении лей-энкефалин-арг у крыс на фоне острого ЭБС.

Полученные данные об изменение активности АПФ при введении лей-энкефалин-арг стрессированным животным представлены в таблице 7 (приложение) и на рис. 9. 

 Результаты исследования показывают, что при предварительном введение проэнкефалина статистически достоверные отличия от группы интактных животных обнаружены только в гипофизе. Показатели активности АПФ при этом выше таковых у интактных животных через 24 часа на 36%, p<0,05 (рис.9). 

 При сравнении изменений активности АПФ при совместном действии лей-энкефалин-арг и острого ЭБС с соответствующими показателями стрессированных животных статистически достоверные отклонения обнаружены в гипофизе через 24 часа и в стриатуме через 4 часа (рис.9). Активность АПФ при предварительном введении лей-энкефалин-арг перед стрессом была выше показателей активности стрессированных животных на 36% (p<0,001) и 40% (p<0,05), соответственно. В другие исследованные промежутки времени статистически достоверных изменений не обнаружено. 

В семенниках через 0,5 часа после введения лей-энкефалин-арг активность АПФ была ниже соответствующих показателей животных подверженных воздействию острого ЭБС на 20% (p<0,05). Однако, уже через 4 часа отмечено повышение активности АПФ по сравнению с группой стрессированных животных на 30% (p<0,01). В другие исследованные промежутки времени активность фермента сохранялась на достаточно высоком уровне и превышала показатели активности АПФ стрессированных животных через 24 часа на 23% (p<0,01) , а через 72 часа на 41% (p<0,01).

Таким образом если ЭБС в исследуемых отделах мозга практически не вызывал изменения активности АПФ, то введение лей-энкефалин-арг на фоне острого ЭБС вызывает некоторые изменения в активности АПФ в этих отделах, особенно ярко эта тенденция прослеживается в гипофизе через 24 часа, а также в стриатуме через 4 часа. Стойкая динамика увеличения активности АПФ показана также в семенниках. 

Сравнение активности АПФ после введения лей-энк-арг стрессированным животным с введением этого пропептида интактным крысам показывает, что более выраженное влияние на активность фермента предшественник лей-энкефалина оказывает при введении его животным, не подвергающимся стресс-воздействию.

Таким образом, введение лей-энкефалин-арг перед началом острого ЭБС вызывает повышение активности КПН по сравнению с соответствующими показателями активности стрессированных и интактных животных в стриатуме - отделе мозга, связанном преиму-щественно с синтезом регуляторных пептидов стресспротективного действия. Предварительное введение предшественника лей-энкефалина предотвращало повышение активности КПН в гипофизе – отделе, где синтезируются стресс-пептиды. 

Введение лей-энкефалин-арг перед острым ЭБС вызывало повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП через 0,5 часа, по сравнению с соответствующими показателями стрессированных животных и предотвращало повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП через 72 часа. Особенно ярко такая тенденция прослеживается в тех отделах мозга и тканях, где осуществляется синтез биологически активных пептидов, проявляющих выраженную антистрессорную активность. Активность ФМСФ-ингибируемой КП при этом была близка к норме. 

Аргинизированный лей-энкефалин влиял на активность АПФ головного мозга, надпочечников и семенников стрессированных животных в гораздо меньшей степени, чем на активность КПН и ФМСФ-ингибируемой КП. Наибольшее влияние пептида обнаружено в семенниках. 

Обнаружено, что введение лей-энкефалин-арг интактным и стрессированным животным вызывает различные по степени выражен-ности и направленности изменения активности изучаемых ферментов. Наиболее значительные изменения активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ обнаружены у животных, не подвергавшихся воздействию стресса.


ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.



В настоящее время одной из наиболее актуальных проблем биохимии, физиологии и медицины является изучение молекулярных механизмов возникновения и развития стресса. Особую значимость при этом приобретает изучение острого стресс-воздействия на организм, поскольку именно кратковременное импульсное стрессирование приводит к экстренному повышению адаптивных способностей. Менее всего изучено влияние острого эмоционально-болевого стресса (ЭБС). Важную роль в устранении и/или ограничении стрессорных нарушений играет система эндогенных опиоидов [8, 14, 102, 106, 135, 236, 242]. Синтез природных опиоидных пептидов и их синтетических аналогов открыл перспективы для их использования при разного рода стресс-повреждениях организма [123]. Было показано, что выраженным антистрессорным действием обладают лей- и мет-энкефалины, лей-энкефалин-арг, синтетический аналог лей-энкефалина – даларгин [69, 105]. Несмотря на короткую продолжительность жизни экзогенных опиоидных пептидов в организме, проявляемые ими эффекты сохраняются на протяжении достаточно длительных промежутков времени [10, 11, 13, 119]. Одним из малоизученных вопросов в понимании механизмов длительного последействия экзогенных опиоидных пептидов является выяснение путей образования и инактивации других регуляторных пептидов, синтезируемых в ответ на введение опиоидов. Поскольку известно, что уровень большинства биологически активных пептидов и, следовательно, степень реализации адаптационных реакций при стресс-повреждениях организма, в значительной степени определяется активностью пептидгидролаз, то особый интерес вызывает изучение механизмов регуляции активности ферментов обмена нейропептидов при стресс-воздействии. 

Исходя из вышеизложенного, интересным представляется изучение влияния экзогенного предшественника лей-энкефалина – лей5-энкефалин-арг6 на активность некоторых ферментов обмена нейропептидов – КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ в норме и при воздействии острого ЭБС.

Поскольку КПН и АПФ участвуют в формировании стрессовой реакции организма, а дополнительное экзогенное введение жидкости влечет за собой возникновение стресса, то введение пропептида осуществлялось способом, который согласно данным [1, 24, 119] менее всего травмирует животное, обеспечивает более полное проникновение экзогенного вещества в мозг и позволяет использовать меньшие концентрации веществ – инстилляцией на конъюнктиву глаза. 

Существенную роль в проявлении специфической активности изучаемых ферментов по отношению к регуляторным пептидам играют особенности их тканевой локализации. В связи с этим, представляется необходимым более детальное изучение регионального и тканевого распределения активности КПН, ФМСФ - ингибируемой КП и АПФ. 

Максимальная активность КПН у интактных животных показана в гипофизе – отделе, где синтезируются стресс-пептиды и многие нейропептиды стресс-протективного действия (табл.1). Высокий уровень активности фермента обнаружен также в гипоталамусе, четверохолмии, стриатуме - отделах лимбической системы, богатых опиоидными и другими нейропептидами [156, 168, 169, 221, 247]. Надпочечники и семенники характеризуются низкими показателями активности КПН. Полученные данные о региональном и тканевом распределении активности КПН, хорошо согласуются с литературными [37, 187, 248]. Таким образом, полученные нами сведения о высоком уровне активности этого фермента в отделах мозга и тканях, связанных с образованием и секрецией многих регуляторных пептидов [235] подтверждают участие КПН в процессинге нейропептидов в этих регионах.

Биологическая роль ФМСФ-ингибируемой КП в организме к настоящему моменту остается неясной. Сведения о тканевом и региональном распределении ФМСФ-ингибируемой КП носят фрагментарный характер. У исследованных нами групп животных высокая активность ФМСФ-ингибируемой КП обнаружена в надпочечниках и гипофизе (табл.1). Регионы мозга характеризуются более низкими показателями, при этом активность ФМСФ-ингибируемой КП распределена достаточно равномерно. Полученные нами данные о распределении активности ФМСФ-ингибируемой КП согласуются с уровнем нейропептидов в этих структурах, что подтверждает ранее выдвигаемые предположения [49, 53, 119, 149]о вовлечении этого фермента в обмен регуляторных пептидов. Однако более конкретное определение роли этого фермента в обменных процессах остается на данном этапе открытым вопросом. В связи с вышесказанным, представляется необходимым более детальное изучение некоторых характеристик этого фермента: сравнение уровня его активности с активностью КПН – фермента, биологическая роль которого определена, а также исследование распределения активности ФМСФ-ингибируемой КП в отделах мозга и органах при различных функциональных и патологических состояниях организма.

Интересно отметить, что в гипофизе – отделе, в котором синтези-руются многие нейропептиды и гормоны пептидной природы [232], активность КПН существенно не отличается от таковой для ФМСФ-ингибируемой КП, в то время как в надпочечниках - отделе, где синтезируются преимущественно энкефалины [33, 34], активность ФМСФ-ингибируемой КП существенно выше активности КПН. Как показывают данные некоторых исследований, пептидные гормоны, синтезирующиеся в гипофизе, содержат в неактивной форме перед остатком основной аминокислоты остатки аминокислот - аланина и глицина [62]. Образующиеся в надпочечниках энкефалины содержат в качестве предпоследних остатки гидрофобных аминокислот (лейцина и метионина) [62]. Принимая во внимание, также, особенности регионального распределения КПН и ФМСФ-ингибируемой КП можно высказать предположение об участии этих ферментов в процессинге предшественников нейропептидов, различных по своему качественному составу. Возможно, что ФМСФ-ингибируемая КП участвует в процессинге проформ, содержащих в качестве предшествующей основным аминокислотам - аргинину и лизину, гидрофобной аминокислоты. Что же касается КПН, то она, вероятно, участвует в процессах модификации проформы с предшествующей аминокислотой, содержащей короткий алифатический радикал (аланин и глицин). 

Достаточно высокий уровень активности ФМСФ-ингибируемой КП, по сравнению с КПН, обнаружен в семенниках. Поскольку известно, что семенники, наряду с образованием некоторых регуляторных пептидов, характеризуются и достаточно высоким уровнем катаболизма белков, а свойства ФМСФ-ингибируемой КП во многом схожи с таковыми у лизосомальной КПА (Кф 3.4.16.1), которая вовлекается в интенсивный катаболизм белка, то показанная высокая активность ФМСФ-ингиби-руемой КП может являться свидетельством вовлечения ее в процессы инактивации регуляторных пептидов в периферических тканях. В связи с этим, можно выдвинуть предположение о существовании различных форм фермента, по-разному проявляющих свою активность в мозге и периферических тканях. 

Распределение активности АПФ хорошо изучено во внемозговых образованиях, что же касается исследования активности этого фермента в различных регионах мозга, то данному вопросу, до недавнего времени уделялось недостаточное внимание. Известно, что АПФ участвует в процессинге ангиотензина , инактивации брадикинина, в последова-тельном гидролизе энкефалиновой молекулы [66, 180, 182, 196, 209, 234].

Изучение активности АПФ у интактной группы животных показало, что наибольшая активность фермента обнаруживается в гипофизе и семенниках (табл.1), где синтезируются многие биологически активные пептиды. Достаточно высокие показатели активности отмечены, также, в стриатуме - отделе, характеризующимся высоким содержанием нейропептидов [62, 221]. Данные ряда исследований свидетельствуют о том, что закономерности, описывающие роль периферической ренин-ангиотензиновой системы не могут быть перенесены на системы центральной регуляции, ввиду существования определенной автономии и биохимической специфичности АПФ в мозге и на периферии [66, 196, 222]. В связи с этим, присутствие высокой активности АПФ как в отделах мозга, так и в семенниках может быть признано как свидетельство участия этого фермента в обмене различных по своему функциональному составу нейропептидов, содержащихся в мозге и периферических тканях. Не исключена также возможность участия АПФ в обмене нейропептидов, одинаковых по своему функциональному составу, хотя этот процесс, вероятно, по-разному протекает в мозге и тканях, что может свидетельствовать в пользу существования изофермента [66].

 Таким образом, полученные нами сведения о региональном и органном распределении АПФ хорошо согласуются с литературными данными по локализации нейропептидов в структурах мозга и тканях [156, 196, 221], что подтверждает участие АПФ в обмене регуляторных пептидов [182, 183]. 

Основой для более детального представления о биологической роли изучаемых ферментов в мозге и периферических тканях могут послужить исследования по изучению их активности при экстремальных воздействиях. 

Известно, что при воздействии стресс-факторов осуществляется мобилизация важнейших физиологических систем организма, направленная на поддержание его гомеостаза и адаптации к неблагоприятным условиям среды [144]. Развитие адаптационных реакций является следствием активации стресс-лимитирующих систем, таких как ГАМК-эргическая, серотонинэргическая, энкефалинэргическая [5, 116], что в первую очередь выражается в усилении синтеза их основных компонентов. Известно, что одним из видов воздействия, приводящим к генерализованной мобилизации стресс-лимитирующих и стресс-реализующих систем организма является острый ЭБС [37, 70, 121, 141, 145, 155]. Однако многие аспекты возникновения и развития стресс-реакции при воздействии ЭБС изучены недостаточно. Менее всего исследованы ферментативные механизмы, обеспечивающие функцио-нирование физиологических систем при остром ЭБС.

Изучение активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ у крыс при воздействии острого ЭБС показало изменение их активности в изучаемых отделах мозга и периферических тканях (табл. 2, рис.1-3). 

Наиболее выраженное повышение активности КПН при остром ЭБС отмечено в гипофизе. Активность фермента была выше показателей интактных животных (табл.2, рис.1), что согласуется с изменениями его активности при других видах стресса [42, 64]. Повышение активности КПН в ранний период после стресса в гипофизе - отделе, где синтези-руются стресс-пептиды [142, 232, 243], по-видимому, связано с увеличением их синтеза и секреции. Поскольку известно, что КПН in vivo вовлекается в образование АКТГ [189], являющегося важным компонентом стресс-реализующих систем, то повышение активности КПН через 0,5 и 4 часа после воздействия является специфичным ответом организма на стресс и способствует увеличению размаха стресс-реакции в организме. Достаточно длительное повышение активности КПН отражает длительный характер ответной реакции организма на воздействие стресс-фактора. Известно, что после однократного ЭБС вслед за катаболической стадией, развивается более длительная – анаболическая, которая характе-ризуется генерализованной активацией синтеза различных физиологически активных веществ, способствующих адаптации организма к стрессовой ситуации [121, 122]. Поскольку гипофиз обладает повышенным содержанием энкефалинов [221], вещества Р [241], то, вероятно, повышение в нем активности КПН через 24 и 72 часа связано с участием фермента в процессинге этих регуляторных пептидов. Необходимость в дополнительном синтезе пептидов стресс-протективного действия обусловлена интенсивной секрецией их в начальном периоде развития стресс-реакции и, следовательно, истощением их запаса. Таким образом, полученные результаты согласуются с литературными данными об участии КПН не только в развитии стресса, но и в ограничении интенсивности стресс-реакции [37, 142, 232, 243]. 

Установлено, что при воздействии стресса в мозге увеличивается содержание опиоидов, вещества Р, и др. [35, 138, 139, 236]. Обнаруженное на поздней стадии развития стресса повышение активности КПН в стриатуме и больших полушариях свидетельствует о вовлечении фермента в процессинг этих биологически активных пептидов, что приводит к увеличению их содержания в названных структурах мозга при остром ЭБС и способствует угасанию стресс-реакции. 

Содержание стресс-протективных пептидов - энкефалинов, вещества Р - в среднем мозге и гиппокампе при стрессе также увеличивается [56]. Однако в этих структурах мозга через 4 часа после воздействия активность фермента была ниже показателей интактной группы. Сходная тенденция к снижению активности КПН отмечена и в надпочечниках. Известно, что КПН локализована преимущественно в везикулах секреторных клеток [195]. В результате их опустошения после воздействия стресса высвобождаются как пептиды, так и локализованные в них молекулы КПН. Следовательно, обнаруженное снижение активности КПН может быть обусловлено уменьшением числа активных молекул фермента в секреторных везикулах. 

Таким образом, показанное после острого воздействия ЭБС, изменение активности КПН в отделах мозга, гипофизе и надпочечниках вызвано изменениями в метаболических процессах, которые связаны, прежде всего, с мобилизацией стресс-лимитирующих и стресс-реализующих систем.

В отличие от КПН, выраженное повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП во всех отделах мозга и надпочечниках наблюдалось через 72 часа после воздействия (табл.2, рис.2). Наиболее существенные изменения отмечены в больших полушариях и надпочечниках. 

Известно, что при остром ЭБС обнаруживается значительное увеличение активности лизосомальных ферментов, которые вовлекаются в деградацию избытка нейропептидов, синтезированных в ответ на стресс [121]. При этом отмечено, что активность лизосомальных ферментов остается повышенной даже через 5 суток после завершения стресс-воздействия [121]. Поскольку ФМСФ-ингибируемая КП, предположительно, является изоферментом лизосомальной КПА [53], то увеличение активности фермента через 72 часа после острого ЭБС может являться свидетельством участия ФМСФ-ингибируемой КП в деградации избытка регуляторных пептидов, синтезируемых в ответ на стресс. Повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП в надпочечниках – органе, содержание энкефалинов в котором при воздействии стресса увеличивается [34] и больших полушариях, характеризующихся высоким уровнем катаболизма [17, 22], подтверждает выдвинутое предположение. 

В отличие от ФМСФ-ингибируемой КП, активность которой существенно повышалась в надпочечниках, наиболее выраженные изменения активности КПН наблюдались в гипофизе. Поскольку известно, что в надпочечниках синтезируются преимущественно энкефалины, а в гипофизе – гормоны пептидной природы, то полученные данные могут свидетельствовать об участии этих ферментов в обмене разных биологически активных пептидов. 

Сходная с КПН тенденция к повышению активности ФМСФ-ингибируемой КП в ранние периоды после стресса отмечена в семенниках, где активность фермента была выше нормы только через 0,5 часа. Не исключено, что в семенниках данный фермент может вовлекаться и в процессинг регуляторных пептидов при стрессе. 

Таким образом, в ответ на воздействие острого ЭБС вовлекается как КПН, так и ФМСФ-ингибируемая КП. Различная динамика изменений активности этих ферментов в мозге и периферических тканях позволяет выдвинуть предположение о включении этих ферментов на разных этапах обмена нейропептидов. При этом, обе КП участвуют в обмене регуляторных пептидов в тех отделах мозга и органах, которые предохраняют стресс-систему организма от истощения.

Одним из важных звеньев в механизмах функционального взаимодейтсвия энкефалинэргической, ренин-ангиотензиновой и гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (ГГНС) является АПФ [209]. В связи с этим, исследование активности АПФ после воздействия острого ЭБС рассматривается как значимое звено в цепи изучаемых реакций организма, так как изменения в активности АПФ в отделах мозга и периферических тканях могут отражать региональную функцию ангиотензин-образующей системы в условиях стресса.

Полученные нами данные показали снижение активности АПФ в стриатуме и гипофизе через 4 часа после воздействия ЭБС (табл.2, рис.3). При воздействии стресса наблюдается нарушение проницаемости мембран и повышение содержания ионов Na+, что может вызвать торможение синтеза АПФ [64], чем, вероятно, и объясняется наблюдаемое снижение активности АПФ. 

До настоящего времени функциональная роль АПФ в половых органах млекопитающих остается не до конца изученной. Известно, что функции семенников модулируются опиоидными пептидами [197], образование которых при воздействии острого ЭБС увеличивается. Структура энкефалинов такова, что АПФ может расщеплять их до ди- и три-пептидов [180]. В связи с этим, повышение активности АПФ в семенниках через 0,5 часа после острого ЭБС может быть охарактеризовано как ответная реакция организма на повышение уровня опиоидных пептидов, что направлено на стабилизацию вызванного стрессом повышенного баланса опиоидных пептидов. Возможно, что снижение активности АПФ в семенниках в последующие промежутки времени является следствием замедления процесса инактивации синтезированных в ответ на стресс-воздействие нейропептидов.

Таким образом, обнаруженные при воздействии острого ЭБС изменения активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ являются, вероятно, следствием их участия в процессах синтеза и/или деградации компонентов стресс-лимитирующих и стресс-реализующих систем. 

Наблюдаемое после стресс-воздействия увеличение синтеза и секреции многих биологически активных пептидов, приводит не только к развитию адаптационных реакций, но и к истощению нейрогуморальных систем [4, 145]. Интенсивное исследование системы эндогенных опиоидных пептидов показало их участие в механизмах физиолого-биохимической регуляции процессов, возникающих при стресс-повреждении организма [100, 101, 102, 125, 134]. Особое практическое значение, в связи с этим, имеет использование опиоидных пептидов и их синтетических аналогов в качестве агентов, компенсирующих изменения в метаболизме мозга и органов животных при стрессе. Повышенное стресс-протективное свойство аргининсодержащего гексапептидного аналога лей-энкефалина – даларгина объясняется, прежде всего, наличием в его молекуле концевого аргининового компонента [105, 146]. В связи с этим, не исключено, что в регуляцию метаболических процессов в мозге и органах может вовлекаться и аргинизированный предшественник лей-энкефалина (лей5-энкефалин-арг6). Установлено, что при периферическом введении повышенной проницаемостью ГЭБ, а, следовательно, и более выраженным воздействием на функциональные системы, характеризуются не сами биологически активные вещества, а их ближайшие предшественники [82]. Это обусловило использование в наших исследованиях лей5-энкефалин-арг6. Поскольку известно, что модулирующее действие экзогенных веществ зависит от исходного состояния физиологических систем и может по-разному проявляется при оптимальном и различных функциональных состояниях организма [107], то представляется необходимым исследование влияния лей5-энкефалин-арг6 на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ у интактных животных. 

Введение предшественника лей-энкефалина в дозе 20 мкг/кг массы крысы вызывало существенное повышение активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ во всех исследованных отделах мозга и тканях по сравнению с контролем (табл.3, рис.4-6). Полученные данные свидетельствуют о вовлечении изучаемых ферментов в ответ организма на введение лей5-энкефалин-арг6. 

Максимальное изменение активности ферментов в отделах мозга и периферических тканях обнаружено через 0,5 часа после инстилляции. Наиболее выраженное повышение активности КПН показано в гипофизе, ФМСФ-ингибируемой КП - в надпочечниках, АПФ – в семенниках. 

Полученные нами данные (рис.4-6) указывают на наличие достаточно длительного влияния лей-энкефалин-арг на активность данных ферментов, что согласуется с уже проведенными исследованиями [59, 107, 113, 119] о пролонгированном действии многих регуляторных пептидов. Одним из механизмов, способствующих проявлению такого рода длительных эффектов является их связывание с белками-переносчиками [78], которые способны защищать пептид от достаточно быстрого действия протеаз. Постепенная диссоциация образующегося комплекса “пептид-носитель” приводит к поддержанию концентрации пептида на уровне, необходимом для реализации физиологических эффектов в течение достаточно длительных промежутков времени. Проявление длительных эффектов экзогенно вводимых веществ объясняют, также, на основе теории о функциональной непрерывности [59, 113]. Существенной особенностью которой является способность каждого регуляторного пептида индуцировать или ингибировать образование или деградацию других пептидов. Вследствие развивающихся при этом каскадов биохимических реакций, эффект экзогенного пептида будет проявляться и тогда, когда исходное вещество уже полностью разрушено. Однако эти сведения представлены только для активных пептидов. В нашей же работе пролонгированное действие наблюдалось и при введении предшественника лей-энкефалина - лей-энкефалин-арг. Не исключено что изучаемые ферменты - КПН, ФМСФ-ингибируемая КП и АПФ участвуют в биогенезе биологически активных пептидов, синтезируемых в ответ на введение лей-энкефалин-арг, выступающего в роли индуктора. 

Длительное повышение активности КПН после введения лей-энкефалин-арг отмечено в гипофизе, стриатуме и гипоталамусе (табл.3, рис.4), где осуществляется синтез многих регуляторных пептидов [156, 221]. Наиболее существенное повышение активности КПН обнаружено в гипофизе. Вероятно, что экзогенно введенный лей-энкефалин-арг инициировал ряд последовательных реакций синтеза других регуляторных пептидов, в процессинге которых участвует КПН, что и вызывало длительное повышение активности изучаемого фермента. 

Значительное увеличение активности ФМСФ-ингибируемой КП наблюдалось в надпочечниках, гипофизе, гипоталамусе и среднем мозге (табл.3), характеризующихся высоким содержанием нейропептидов. Следовательно, можно выдвинуть предположение о вовлечении исследуемого фермента в процессинг регуляторных пептидов в этих регионах при введении лей-энкефалин-арг. Не исключено, что возрастание активности фермента в первые 0,5 часа после начала эксперимента может быть связано с вовлечением его в процессы преобразования в активную форму введенного пропептида (индуктора). Дальнейшее же увеличение активности, вероятно, является следствием участия ФМСФ-ингибируемой КП в процессинге регуляторных пептидов, которые образуются в ответ на введение индуктора в исследованных регионах мозга и надпочечниках.

Известно, что АПФ участвует как в процессинге, так и в инактивации нейропептидов, проявляя при этом дипептидилкарбоксипептидазную и эндопептидазную активности [182, 183, 209, 223, 241]. Поскольку предполагается, что экзогенный лей-энкефалин-арг инициирует процессы образования активных форм некоторых нейропептидов, то, не исключено, что АПФ может играть роль регулирующего фактора в этих реакциях, контролируя уровень введенного пропептида. Достаточно высокая активность АПФ после введения предшественника лей-энкефалина обнаружена в гипофизе и стриатуме (рис.6). Причем, следует подчеркнуть, что статистически достоверное повышение активности в этих отделах зарегистрировано только через 0,5 часа (рис.2). Возможно, что столь кратковременное повышение активности АПФ в исследуемых регионах мозга связано с его участием в инактивации введенного проэнкефалина или в деструкции избытка синтезируемых регуляторных пептидов. Существенное и длительное повышение активности АПФ при введении лей-энкефалин-арг отмечено в семенниках. Вероятно, что АПФ участвует в процессинге ряда биологически активных веществ, синтезируемых в этом органе в ответ на введение лей-энкефалин-арг. Известно также, что в семенниках высок уровень процессов катаболизма. Следовательно, не исключена возможность участия АПФ и в процессах инактивации избытка синтезируемых нейропептидов. 

Таким образом, обнаруженное после введения лей-энкефалин-арг повышение активности исследуемых ферментов в тех отделах мозга и тканях, где синтезируется большое количество нейропептидов, является свидетельством изменения метаболической активности головного мозга и периферических тканей. Вероятно, что КПН, ФМСФ-ингибируемая КП и АПФ участвуют в процессах синтеза и/или инактивации ряда биологически активных пептидов, синтезируемых в ответ на введение лей5-энкефалин-арг6. В связи с этим, не исключено, что цепные реакции образования или деградации регуляторных пептидов в ответ на введение индуктора “запускаются” посредством изменения активности данных пептидгидролаз. 

Следовательно, представляется интересным вопрос о механизме регуляции активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ под влиянием лей-энкефалин-арг. Обнаружено, что in vitro активность КПН и АПФ ингибируется пропептидом, что согласуется с литературными данными [160, 207]. На активность ФМСФ-ингибируемой КП предшественник лей-энкефалина не оказывал влияния (табл.4).

Показанный эффект ингибирования активности КПН может быть обусловлен конкуренцией двух субстратов (дансил-фен-ала-арг – субстрат для определения активности фермента и экзогенно введенный лей-энкефалин-арг) за связывание с ферментом [38]. Однако известно, что КПН локализована в секреторных везикулах, проникновение в которые экзогенного пропептида представляется маловероятным [187, 195]. Известно также, что энкефалины влияют на уровень экспрессии мРНК ряда нейропептидов [231, 246]. Уровень мРНК КПН и многих нейропептидов координированно регулируется секретогенами. Поэтому представляется более вероятным, что экзогенно введенный лей-энкефалин-арг, влияет на уровень экспрессии мРНК КПН, что приводит к изменению активности фермента. Активация АПФ, вероятно, объясняется действием экзогенного лей-энкефалин-арг на активность эндогенных ингибиторов АПФ [73, 85]. Таким образом, показанное несоответствие во влиянии лей-энкефалин-арг на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ in vivo и in vitro свидетельствует о существовании in vivo механизмов, опосредующих действие экзогенного предшественника лей-энкефалина. 

 Известно, что экзогенное введение опиоидных пептидов способствует стимуляции образования и выброса эндогенных опиоидов, что является одним из факторов естественной профилактики истощения стресс-лимитирующих систем и направлено на адаптацию организма к стрессу [69, 116, 198]. Выдвинутое ранее предположение о инициации процессов синтеза и деградации некоторых биологически активных пептидов при введении лей-энкефалин-арг, послужило основанием для использования этого вещества в качестве агента, повышающего активность эндогенной энкефалинэргической системы.

При введении лей-энкефалин-арг непосредственно перед моделированием острого ЭБС активность всех изучаемых протео-литических ферментов изменялась по сравнению с соответствующими показателями у животных, подверженных стрессу, введению пропептида и интактных животных. 

При совместном влиянии острого ЭБС и лей-энкефалин-арг активность КПН во всех исследуемых отделах мозга и периферических тканях крыс достоверно отличалась от соответствующих показателей стрессированных животных (табл.5, рис.7). Полученные данные свидетельствуют о вовлечении КПН в реализацию биохимических процессов, индуцированных введением пропептида. Наиболее существенное повышение активности фермента отмечено в отделах мозга, характеризующихся высоким содержанием стресс-протективных веществ. Не исключено, что предшественник лей-энкефалина, предварительно введенный в организм животного, способствовал “запуску” каскада биохимических реакций синтеза веществ, участвующих в адаптации организма к стресс-факторам [116, 132, 241, 242]. 

Согласно полученным данным, введение лей-энкефалин-арг перед началом стресс-воздействия предотвращало повышение активности КПН в гипофизе (табл.5, рис.7), отмеченное при остром ЭБС. Известно, что при любой форме стресса общим и наиболее существенным моментом является активация ГГНС, характеризующаяся избыточным образованием и секрецией гормонов стресса [21, 128, 134, 143, 144, 150]. Показано также, что введение энкефалинов блокирует активность ГГНС [74, 124, 134], приостанавливая процессы синтеза гормонов пептидной природы, в частности АКТГ. Поскольку, КПН участвует в биосинтезе АКТГ в гипофизе, то показанное после введения лей-энкефалин-арг снижение активности КПН по сравнению с группой стрессированных животных позволяет выдвинуть предположение о способности лей-энкефалин-арг проявлять эффекты сходные с таковыми активных форм энкефалинов. Ранее мы предположили, что повышение активности карбоксипептидазы Н в гипофизе на поздних этапах исследования (24 и 72 часа) после воздействия острого ЭБС показывает ее участие в активизирующихся при стрессе процессах синтеза стресс-протективных пептидов. Полученные в данной серии эксперимента результаты об увеличении активности КПН через 24 и 72 часа в гипофизе по сравнению с интактной группой, могут являться свидетельством того, что при введении пропептида стрессированным животным фермент также включается в процессы синтеза пептидов, способствующих адаптации организма к стресс-воздействию.

Таким образом, снижение активности КПН в гипофизе при совместном действии лей-энкефалин-арг и стресса через 0,5 и 4 часа может способствовать уменьшению выработки и секреции стресс-пептидов, а повышение активности через 24 и 72 часа – активизации процессов синтеза стресс-протективных веществ и, следовательно, адаптации к стрессу. 

Существенное повышение активности КПН отмечено в стриатуме – отделе, где синтезируются нейропептиды, обладающие выраженным антистрессорным действием [221] (табл.5, рис.7). В ранние промежутки времени (0,5 и 4 часа) активность КПН была выше по сравнению с активностью у стрессированных и интактных животных. Напротив, при воздействии острого ЭБС активность фермента в стриатуме повышалась (табл.2, рис.1) на более поздних этапах исследования (через 24 и 72 часа). Известно, что предварительное введение компонентов стресс-лимитирующих систем вызывает ограничение катаболической и удлинение анаболической стадии, которая характеризуется активацией синтеза веществ, играющих важную роль в развитии адаптационных реакций [121]. На основании полученных нами данных о повышении активности КПН в стриатуме на ранних стадиях после совместного воздействия двух факторов, можно предположить, что при инстилляции предшественника лей-энкефалина при ЭБС происходит активация синтеза многих стресс-протективных веществ (вещество Р, энкефалины и др), что способствует уменьшению размаха стресс-реакции.

Обнаруженное увеличение активности исследуемого фермента через 4 часа после введения лей-энкефалин-арг на фоне стресса (относительно группы стрессированных животных, не получавших пропептид) в гиппокампе, больших полушариях, гипоталамусе и надпочечниках - характеризующимися высоким содержанием нейропептидов [156] (табл.5, рис.7) свидетельствует, вероятно, о включении КПН в процессинг регуляторных пептидов в этих структурах. 

Таким образом, предварительное введение стрессированным животным предшественника лей-энкефалина вызывает изменения активности КПН в регионах мозга и периферических тканях, способствующие адаптации к стрессу. Поскольку проникновение экзогенного пропептида в секреторные везикулы, где локализован фермент [38, 189] представляется маловероятным, следовательно, лей-энкефалин-арг при стрессе опосредовано влияет на активность КПН, вероятно, через изменение уровня экспресии гена фермента. 

При совместном воздействии лей-энкефалин-арг и острого ЭБС обнаружены разнонаправленные изменения активности ФМСФ-ингибируемой КП в отделах головного мозга и периферических тканях крыс. 

Предварительное введение лей-энкефалин-арг стрессированным животным предотвращает повышение активности фермента через 72 часа, отмеченное при воздействии острого ЭБС. В более ранние промежутки времени активность ФМСФ-ингибируемой КП была выше (табл.6, рис.8). Наиболее выраженные изменения обнаружены в гипофизе, среднем мозге, гипоталамусе и надпочечниках (рис.8) - структурах, богатых нейропептидами, синтез которых, по нашему предположению, усиливается под воздействием введенного пропептида.

Известно, что при совместном действии опиоидных пептидов и стресса обмен веществ, по прошествии более одного часа после воздействия, ускоряется, однако смещения его в сторону катаболизма, как это отмечается при стрессе, не происходит [18, 22, 121, 138]. ФМСФ-ингибируемая КП, предположительно, является изоферментом лизосомальной КПА, участвующей в деградации биологически активных веществ [49, 53, 233]. Следовательно, отмеченное через 72 часа после введения лей-энкефалин-арг стрессированным животным снижение активности фермента в гипофизе, среднем мозге, гипоталамусе, больших полушариях по сравнению с показателями стрессированных животных свидетельствует о снижении уровня катаболических процессов в исследуемых отделах. Активность фермента при этом практически не отличается от соответствующих показателей нормы (рис.8). 

Иная динамика изменения активности ФМСФ-ингибируемой КП обнаружена в стриатуме и гиппокампе – отделах лимбической системы, характеризующихся высоким содержанием нейропептидов, участвующих в регуляции эмоционального статуса организма [145, 221]. Повышение активности фермента наблюдалось только через 0,5 часа после совместного воздействия двух факторов. Снижения активности через 72 часа не обнаружено. У стрессированных животных активность ФМСФ-ингибируемой КП в стриатуме и гиппокампе через 72 часа повышалась незначительно (рис.2). На основании полученных экспериментальных данных можно предположить, что ФМСФ-ингибируемая КП стриатума и гиппокампа не вовлекается в деградацию избытка синтезированных в ответ на оказанное воздействие нейропептидов. Не исключено, что существенное повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП в стриатуме и гиппокампе может быть связано с участием фермента в процессинге биологически активных пептидов в этих отделах. 

Принципиально отличная динамика изменения активности ФМСФ-ингибируемой КП отмечена в семенниках (рис.8). Активность изучаемого фермента в них через 4, 24 и 72 часа существенно повышена, по сравнению с показателями активности как интактных, так и стрессированных животных. Известно, что в семенниках синтезируются многие биологически активные пептиды, кроме того, в них достаточно высок уровень катаболизма. Поскольку активность ФМСФ-ингибируемой КП при стрессе повышалась только через 0,5 часа, а процесс деградации является достаточно длительным процессом, то мы предположили, что исследуемый фермент не вовлекается в процессы катаболизма в семенниках. Известно также, что функции семенников модулируются опиоидными пептидами [197]. В связи с вышесказанным, существенное повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП в семенниках при совместном воздействии стресса и лей-энкефалин-арг может быть связано с включением фермента в процессинг биологически активных пептидов в этом органе. 

Таким образом, в исследуемых отделах мозга и периферических тканях отмечены различные, как по степени выраженности, так и по направленности, изменения в активности ФМСФ-ингибируемой КП. Показанные отличия могут быть связаны с присутствием в исследуемых тканях разных форм фермента с близкими физико-химическими свойствами, но, отличающимися при этом своей биологической ролью. 

По нашему предположению, лей-энкефалин-арг принимает участие в инициации синтеза многих нейропептидов, в том числе и опиоидных. Известно, что эндогенные опиоидные пептиды оказывают стимулирующее действие на стресс-лимитирующую – ГАМК-эргическую систему, способны ограничивать активацию стресс-реализующей адренергической и симпатоадреналовой системы [5, 74, 121, 240], следствием чего является ограничение стресс-реакции. Таким образом, можно заключить, что показанные изменения активности ФМСФ-ингибируемой КП в исследованных регионах мозга и органах свидетельствуют о вовлечении этого фермента в реализацию адаптационных реакций, индуцированных введением лей-энкефалин-арг. 

При совместном воздействии на организм животного острого ЭБС и лей-энкефалин-арг обнаружено, что активность АПФ изменялась. Наиболее выраженное и продолжительное повышение активности фермента по сравнению со стрессированными животными обнаружено в семенниках (рис. 9, табл. 7). Однако, по сравнению с нормой, статистически достоверных отличий не обнаружено. Известно, что АПФ принимает участие в инактивации энкефалинов и субстанции Р [180, 209]. Установлено, также, что клетки семенников связывают вещество Р, а их функции регулируются опиоиднами пептидами [197, 260]. В связи с этим, показанное в семенниках - органе, характеризующимся довольно высоким уровнем катаболизма белка, первоначальное (через 0,5 часа) снижение и существенное (через 4, 24 и 72 часа) повышение активности АПФ по сравнению с группой стрессированных животных (рис.9), свидетельствует, вероятно, об участии исследуемого фермента в инактивации избытка регуляторных пептидов, синтезированных в ответ на воздействие. 

В гипофизе и стриатуме – регионах, где синтезируются многие нейропептиды, обладающие антистрессорным действием [156, 201, 221], активность АПФ повышалась по сравнению со стрессированными животными (рис.9). Известно, что введение даларгина вызывает повышение активности АПФ и содержания ангиотензина II в мозге [87] и способствует ограничению активации ГГНС - важной составляющей стресс-реализующих систем [87, 125, 134, 150]. Активация ГГНС характеризуется, прежде всего, повышением синтеза стресс-гормонов в гипофизе [150]. На основании полученных нами данных, можно предположить, что предшественник лей-энкефалина, при введении которого в гипофизе и стриатуме отмечено повышение активности исследуемого фермента (рис.9), также принимает участие в регуляции функций ГГНС, вероятно, блокируя ее активность. Подтверждением этого является отмеченное ранее снижение активности КПН - фермента, который участвует в синтезе АКТГ в гипофизе. Поскольку, КПН включается также в процессинг ряда стресс-протективных веществ в отделах мозга, а АПФ - в образовании ангиотензина II - регуляторного пептида, обладающего противоположным действием, то показанное более существенное и продолжительное повышение активности КПН в мозге при совместном влиянии двух факторов может свидетельствовать о превалирующем содержании в нем компонентов стресс-лимитирующих систем. Выдвинутое предположение подтверждается экспериментальными данными о снижении роли ангиотензинового звена при увеличении активности энкефалинобразующей системы [87].

Полученные данные об изменении активности АПФ при совместном воздействии лей-энкефалин-арг и острого ЭБС, свидетельствуют о вовлечении фермента, наряду с КПН и ФМСФ-ингибируемой КП, в реализацию адаптивных эффектов лей-энкефалин-арг. 

Таким образом, инстилляция предшественника лей-энкефалина на конъюнктиву глаза крыс перед острым ЭБС вызывает изменения КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ и способствует адаптации к стрессу. Полученные данные позволяют выдвинуть предположение, что одним из механизмов регулирующего действия лей-энкефалин-арг при стрессе может быть его влияние на активность изучаемых ферментов. 

При сравнении полученных данных по влиянию предшественника лей-энкефалина на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ головного мозга и периферических тканей интактных крыс и крыс, подвергавшихся воздействию острого ЭБС, выявлены некоторые различия (рис. 4-6 и 7-9). При введении лей-энкефалин-арг интактным крысам наблюдалось более выраженное увеличение активности всех изучаемых ферментов. Известно, что важным фактором, определяющим проникновение в мозг экзогенно введенных веществ, является уровень обменных процессов в ЦНС [108]. В связи с этим, обнаруженное несоответствие во влиянии экзогенного пропептида на активность изучаемых ферментов при оптимальном функционировании физиологических систем и при патологических изменениях, вызванных стрессом, вероятно, объясняется снижением проницаемости ГЭБ для экзогенных веществ при воздействии острого ЭБС. 

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что в ответ на воздействие острого ЭБС вовлекаются все изучаемые ферменты. Изменения в активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ в различные сроки после воздействия острого ЭБС, по нашему предположению, связаны с их участием в инициирующихся при стрессе процессах синтеза и/или деградации регуляторных пептидов в отделах мозга и периферических тканях. Различия в динамике изменения активности КПН и ФМСФ-ингибируемой КП при воздействии острых стресс-факторов позволили предположить, что данные ферменты включаются в обмен регуляторных пептидов на разных этапах. Вероятно, что ФМСФ-ингибируемая КП участвует в процессах деградации избытка нейропептидов, синтезированных в ответ на стресс.

Изучение влияния предшественника лей-энкефалина на активность КПН, АПФ и ФМСФ-ингибируемой КП в норме и при действии острого эмоционально-болевого стресса, показало, что все исследуемые ферменты вовлекаются в ответ на введение пропептида. Однако обнаруженные изменения активности при введении лей-энкефалин-арг интактным животным несколько отличались от таковых при совместном воздействии стресса и пропептида и по степени выраженности и по направленности. Наиболее значительные изменения активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ при введении предшественника лей-энкефалина обнаружены в отделах мозга и периферических тканях животных, не подвергавшихся воздействию стресса. 

Введение лей-энкефалин-арг перед острым ЭБС предотвращало повышение активности ферментов в отделах мозга, связанных с синтезом и секрецией стресс-пептидов. Активность ферментов при этом практически не отличалась от нормы. В отделах мозга и периферических органах, где осуществляется синтез стресс-протективных веществ, активность ферментов повышалась в начальный период после введения лей-энкефалин-арг. Таким образом, инстилляция предшественника лей-энкефалина на конъюнктиву глаза вызывает изменения активности ферментов, способствующие адаптации к стрессу. Принимая во внимание данные ряда исследователей о способности экзогенных нейропептидов стимулировать синтез и выброс других биологически активных пептидов в организме [12, 13, 78, 113, 119, 132,], а также полученные в нашей работе результаты, мы предположили, что экзогенный лей-энкефалин-арг инициирует процессы синтеза регуляторных пептидов стресс-протективного действия. Образующиеся в результате каталитических реакций биологически активные пептиды способны в свою очередь модулировать деятельность различных функциональных систем организма [78]. Обнаруженные отличия в динамике изменения активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ между стрессированными животными и животными, получавшими перед стрессом лей-энкефалин-арг, могут свидетельствовать об участии изучаемых ферментов в каталитических реакциях синтеза и/или деградации регуляторных пептидов, индуцированных введением предшественника лей-энкефалина. 

Реализация показанных эффектов лей-энкефалин-арг в норме и при действии острого ЭБС, вероятно, осуществляется посредством влияния его на активность эндогенных активаторов и ингибиторов и/или уровень экспрессии генов изучаемых ферментов. Поскольку, в настоящее время эндогенные ингибиторы обнаружены только для АПФ [73, 85], то изменения активности данного фермента, вероятно, объясняются инициированием лей-энкефалин-арг механизмов действия этих эндогенных регуляторов. Изменения в активности КПН не могут быть следствием прямого действия экзогенного лей-энкефалин-арг на фермент, так как проникновение пропептида в секреторные везикулы, где локализована КПН представляется маловероятным. Мы предположили, что действие экзогенного лей-энкефалин-арг на активности КПН опосредовано через изменение уровня экспрессии гена фермента. ФМСФ-ингибируемая КП на данный момент является малоизученным ферментом. Возможно, что in vivo существуют сходные с КПН и/или АПФ механизмы, опосредующие влияние экзогенного предшественника лей-энкефалина на активность ФМСФ-ингибируемой КП. 

Таким образом, полученные в нашей работе данные свидетельствуют о вовлечении протеолитических ферментов - КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ в процессы адаптации организма к действию острых стресс-факторов, которые усиливаются при введении лей-энкефалин-арг. Одним из механизмов адаптогенного действия лей-энкефалин-арг при стрессе может быть влияние на активность изучаемых ферментов обмена нейропептидов. 


ЛИТЕРАТУРА



	Авроров В.Н. ГОБ, его значение в норме и при патологии глаза и пути регуляции с целью получения терапевтического эффекта. - Воронеж.-1982.-10с.

	Азарян А.В. Пептидгидролазы нервной системы и их биологическая функция //Ереван.- Айастан.- 1989. - 208с.

	Акопян Т.Н. Протеолитические превращения нейропептидов и пути их регуляции в центральной нервной системе // диссертац. на соискан. степени доктор биол.наук.- М.- 1989

	Алешин Б.В., Бондаренко Л.А. Стресс, адаптация и функциональные нарушения. - Кишинев: Штиинца. - 1984.- С.11-12

	Андреев Б.В., Игнатов Ю.Д., Никитина З.С., Сытинский И.А. Антистрессорная роль ГАМК-эргической системы мозга // Журн. высш. нервн. деят. - 1982.-т.32, №3.- С.511-519.

	Аргинтаев Э.С. Взаимоотношение между паращитовидной железой и системой опиоидных пептидов в физиологических условиях и в динамике стресс-реакции // диссертац. на соиск. степени канд.мед.наук. - Томск.- 1989

	Арушанян Э.Б. Участие эпифиза в антистрессорной защите мозга // Усп. Физиол.наук.- 1996.-т.27.-№3.-С.31-50

	Ашмарин И.П. Малые пептиды в норме и при патологии // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 1982.- №4.- С.13-27

	Ашмарин И.П. Перспективы практического применения и некоторые фундаментальные исследования малых регуляторных пептидов // Вопр. мед. химии. - 1984.- №3.- С.2-7

	Ашмарин И.П. Регуляторные пептиды сильного и быстрого действия // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 1988. - №3.- С.3.

	Ашмарин И.П., Каменская М.А. Нейропептиды в синаптической передаче // Итоги наук. и техн.- ВИНИТИ.- Физиология человека и животных. - 1988.-т. 34.-С.184-192

	Ашмарин И.П. Каразеева Е.П. Нейропептиды // в кн.”Нейрохимия” под ред. Ашмарина И.П., Стукалова П.В.- М.: Издательство института биомедицинской химии РАМН.-1996.- С.296-333

	Ашмарин И.П., Обухова М.Ф. Регуляторные пептиды. Функционально-непрерывная совокупность // Биохимия.-1986.-т.51, №4.- С.531-542 

	Ашмарин И.П., Обухова М.Ф. Содержание опиоидных пептидов в коре головного мозга и их центральная активность // Журн. высш. нервн. деят.- 1985.- т.36. - вып.2.-С.211-222.

	Бабичев В.Н., Миронов С.Ф. Нейропептиды мозга и их нейроэндокринные эффекты // Проблемы эндокринологии. - 1981.- №3.-С.78-85.

	Бахарев В.Д. Клиническая нейрофизиология регуляторных пептидов. - Свердловск: Издательство Уральского университета.- 1989.- 133с.

	Белик Я.В., Гриренко А.Г. Распад белков в морфологически и функционально разных макро-и микроструктурных образованиях головного мозга.// Вопросы биохимии нервной и мышечной систем. - Тбилиси: Мецниереба. - 1979.- т.3.-С.105-113

	Белоконь Л.Е. Особенности обмена нейропептидов гипоталамуса и гормонов гипофиза при стрессе и некрозе миокарда // дис. на соиск.степени канд.биол.наук. – Днепропетровск. - 1991

	Беляев Н.А., Генгин М.Т., Годына С.В., Калихевич В.Н., Панченко Л.Ф. Активность энкефалинконвертазы в отделах мозга крыс при алкогольной интоксикации // Вопр. мед.химии.- 1988.-34, № 4.- С.118-122.

	Беляев Н.А., Колесанова Е.Ф. и др. К вопросу о роли аминопептидаз в катаболизме энкефалинов: сравнение исследования регионального распределения аминопептидаз и энкефалиназы А в головном мозге крыс // Биохимия.- 1990.- 55, №10.-С.1778-1785.

	Белякова Е.И. Взаимодействие симпато-адреналовой и гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы в инициальном периоде стресса // дис. на соиск.степени канд.биол.наук.- Ростов Н/Д.- 1984

	Блехман Г.И. Синтез и распад макромолекул в условиях стресса // Усп.совр.биол. – 1992.-вып.2.- С.281-297.

	Бобков А.И., Семавин И.Е., Виноградов В.А. и др. О значении лей-энкефалина в механизмах стрессорной реакции. // Тез. докл. Всесоюзн. Конфер. ’’Нейропептиды: их роль в физиологии и патологии’’.- Томск.- 1985.-С.161-162.

	Боброва И.И. К вопросу о проницаемости гемато-офтальмического барьера при экспериментальном воспалении сосудистого тракта глаза // в кн. “Физиология и патология гисто-гематических барьеров”.- М.- Наука.-1968.- С.256-259

	Богданов А.И., Филаретова Л.П., Филаретов А.А. Градуальность реакции гипофизарно-адренокортикальной системы на активирующий и тормозной сигналы // Физиол.журн. - 1982.- №6.- С. 804-808.

	Бондаренко Т.И., Метаболизм гомокарнозина в мозгу животных разного возраста в экстремальных условиях среды // дис. на соискан. степени доктор биол.наук.- Ростов Н/Д. – 1990

	Бондаренко Т.И., Кричевская А.А., Шейкина И.В., Кирюхина Е.В. Влияние ПДС на содержание адреналина в тканях крыс в норме и при действии холодового стресса // Укр. биохим.журн. - 1990.- т.62.- №5.- С.34-37.

	Бондаренко Т.И., Милютина Н.П.., Михалева Н.И., Носкова Н.В. Мембраностабилизирующий эффект ?-сон индуцирующего пептида при стрессе // Бюл. Экспер.биол. и мед.- 1990. - № 9.- С.325-327.

	Брагин Е.О. Нейрохимические механизмы регуляции болевой чувствительности // М.- Издательство университета дружбы народов.- 1991.- 248с.

	Бредбери М. Концепция ГЭБ // М.- Медицина.- 1983.- 478с. 

	Булаев В.М, Раевский К.С. Взаимодействие опиатов и опиоидных пептидов с медиаторными системами мозга // Успехи физиол. наук.-1982.- т.13.-№2.-С.65-92.

	Буров Ю.В., Ведерникрва Н.Н. Нейрохимия и фармакология алкоголизма // М.- Медицина.- 1985.-23с

	Вакулина О.П. Содержание опиоидных пептидов в различных тканях животных при экстремальных воздействиях // дис. на соиск. степени канд.биол.наук.- М.-1984

	Вальдман А.В., Арефолов В.А., Дмитриев А.Д. Изменение содержания опиоидных пептидов в надпочечниках крыс при иммобилизационном стрессе // Бюл.Экспер.Биол.и Мед. - 1985.- т.99.-№4.- С.404-406.

	Вальдман А.В., Медведев О.С., Рожанская Н.И. Анализ роли эндогенных опиоидных пептидов при экспериментальной гипертензии // Физиол. журн.- 1982.- №8.-С.1091-1095.

	Ведерников Н.Н., Майский А.И. Опиаты и эндогенные морфиноподобные пептиды // Усп.совр.биол. – 1981. – т.91.– С.380-392.

	Вернигора А.Н. Карбоксипептидаза Н мозга животных в норме и при действии стресс-факторов // дис. на соиск. степени канд.биол.наук. – Днепропетровск. – 1991.

	Вернигора А.Н, Генгин М.Т. Механизмы регуляции активности и биологическая роль карбоксипептидазы Н – фермента процессинга нейропептидов // Биохимия. – 1995. – т.60. - №12.- С.1491-1497.

	Вернигора А.Н, Генгин М.Т. Протеолитические ферменты: субклеточная локализация, свойства и роль в обмене нейропептидов // Биохимия. – 1996. – т.61. - №5. – С.771-785.

	Вернигора А.Н., Генгин М.Т. Свойства основных, отщепляющих остатки аргинина и лизина карбоксипептидаз и их роль в функционировании биологически активных пептидов // Укр. биохим. журн.- 1993.-т.65.-№1.-С.3-12.

	Вернигора А.Н, Генгин М.Т. Эффект этанола на активность растворимой и мембраносвязанной КПН в областях головного мозга крыс в течение иммобилизационного стресса // Вопр. мед.химии. – 1994. – т.40. - №1.- С.54-56.

	Вернигора А.Н, Генгин М.Т., Макарова В.В. Влияние стрессовых факторов на активность КПН в отделах головного мозга крыс // Укр. биохим.журн. – 1992. – т.64. - №2. – С.45-49.

	Вернигора А.Н., Генгин М.Т., Никишин Н.Н. Об участии некоторых ферментов нейропептидов в механизмах эмоционального стресса // Физиол. журн.-1995.- т.81.- №5.- С.1025-1028

	Вернигора А.Н., Генгин М.Т., Никишин Н.Н., Щетинина Н.В. Активность карбоксипептидазы N и ангиотензипревращающего фермента в сыворотке крови крыс с различной устойчивостью к эмоциональному стрессу //Физиол.журн.-1994.-№4.- С.23-25

	Вернигора А.Н., Генгин М.Т., Никишин Н.Н., Щетинина Н.В. Активность растворимой и мембраносвязанной форм КПН в отделах головного мозга крыс при эмоциональном стрессе // Укр.биохим.журн.-1994.-т.66.-№4.-С.130-134

	Вернигора А.Н, Никишин Н.Н, Генгин М.Т. Влияние внутрибрюшинного введения физиологического раствора на поведение крыс в тесте “открытое поле” и активность ферментов участвующих в обменен нейропептидов // Физиол. журн. - 1995.-т.81.-№12.-С.23-26

	Вернигора А.Н., Никишин Н.Н., Генгин М.Т. Влияние глюкокортикоидов на активность растворимой и мембраносвязанной форм карбоксипептидазы Н in vivo // Укр.биохим.журн.-1995.-т.67.-№6.-С99-104

	Вернигора А.Н, Никишин Н.Н, Генгин М.Т. Протеолитические ферменты и регуляция уровня активности нейропептидов // Биохимия. – 1995. – т.60. - №10. – С.1575-1579.

	Вернигора А.Н, Никишин Н.Н, Генгин М.Т. Частичная характеристика основной ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы из головного мозга кошки // Биохимия. – 1995. – т.60. - №11. – С.1423-1427.

	Вернигора А.Н., Щетинина Н.В., Генгин М.Т. Исследование активности основных (отщепляющих остатки аргинина и лизина) карбоксипептидаз у крыс разного возраста // Биохимия. - 1997.- т.62.- вып.3.- С.1848-1856.

	Власова Т.И., Каменский А.А., Ашмарин Н.П. Влияние энкефалинов на двигательную активность и поведение крыс в условиях “открытого поля” // Журн.высш.нервн.деят. – 1983. – т. 33. – вып.6. – С.1079-1084.

	Воронцов Е.Я. Нарушение растяжимости и сократимости функций миокарда при ЭБС, их предупреждение и устранение // дис. на соиск. степени канд.биол.наук.- М. - 1985

	Генгин М.Т. Новая КП нервной ткани. Региональное распределение и некоторые физико-химические свойства // Нервная система. – Л. – ЛГУ. – 1991.- С. 29-30 

	Генгин М.Т., Вернигора А.Н. Влияние этанола на активность карбоксипептидазы Н в мозге крыс. // Укр.биохим.журн. - 1993. – т.65. - №1. – С.100-103.

	Генгин М.Т., Вернигора А.Н. Ферменты процессинга опиоидных пептидов и методы определения их активности // Укр.биохим.журн. – 1994. – т.66. - №2. – С.3-17.

	Генгин М.Т., Вернигора А.Н., Никишин Н.Н. Влияние эмоционально-болевого стресса на активность КПН - фермента процессинга нейропептидов головного мозга крыс // Физиол. журн. - 1994.-80.-№3.- С.23-27.

	Генгин М.Т., Вернигора А.Н., Никишин Н.Н., Керимов В.Ю. Эффект эмоционального стресса на активность карбоксипептидазы Н в отделах головного мозга крыс с различной к нему устойчивостью // Вопр.мед.химии.-1995.-т.41, №4.- С.8-9

	Генгин М.Т., Вернигора А.Н., Никишин Н.Н., Макеева Н.В. Влияние каптоприла и резерпина на активность некоторых ферментов обмена нейропептидов. // Вопр.мед.химии. – 1995. – т.41. - №5. – С.37-39.

	Герштейн Л.М., Доведова Е.Л., Узбеков М.Г., Галикова Т.Л., Сергубина А.В., Ашмарин И.П. Пролонгированное действие татрапептидамина, особенности обмена белков и медиаторов в отдельных микроструктурах мозга // Нейрохимия.- 1984.- т. 3.-№3.-С.236-243

	Годына С.В. Протеолитические ферменты головного мозга при алкогольной интоксикации // дис. на соиск. степени канд.биол.наук.- Днепропетровск.- 1988

	Голова И.Д. Влияние этанола на механизмы эмоционального стресса // Алкоголизм.- М.- 1989.- С.53-54

	Гомазков О.А. Мозг и нейропептиды // Справочно-информационное издание.- М.-1997

	Гомазков О.А. Роль ферментных систем в регуляции “триггерной” функции физиологически активных пептидов // Вопр.мед.химии. - 1988.- №1.- С.12-18.

	Гомазков О.А. Функциональная биохимия регуляторных пептидов. - М.- Наука.- 1993.- 159с. 

	Гомазков О.А., Григорьянц О.О. Регуляция биосинтеза энкефалинов: биохимические и физиологические аспекты // Усп.совр.биол. – 1989. – т.108. - №1. – С.109-124.

	Гомазков О.А., Калинина Е.В. Ангиотензинпревращающий фермент: бинарная активность. Ингибиторы и функциональная роль кининового звена // Усп. совр. биол.- 1997.-117.-№2.-С.172-183.

	Гомазков О.А., Панфилов А.Д., Ростовцев А.П., Комиссарова Н.В., Фомин В.В., Григорьянц О.О. Региональная активность энкефалин-и-ангиотензин ІІ образующих пептидаз мозга у крыс с различным влечением к этанолу // Вопр.мед.химии. – 1991. – т.37. - №4. – С.33-37.

	Григорьянц О.О. Гомазков О.А. Энкефалинобразующие ферменты // Вопр.мед.химии.- 1986.- №3.- С.15-20

	Дворцин Г.Ф., Шаталов В.Н. Антистрессорный эффект даларгина при иммобилизационном стрессе у крыс // Бюл.Экспер.Биол.и Мед. - 1991.-111.-№6.- С.617-619.

	Девяткина Т.А. Антиоксидантная система при стрессе и изыскание новых антистрессорных средств // дис. на соиск. степени док.мед.наук.- Киев.- 1990

	Дмитриев А.Д. Биосинтез нейропептидов // Итоги наук. и техн. ВИНИТИ.-Физиология человека и животных.- 1982.-13.-С.7-49.

	Дмитриев А.Д., Чиркова С.К., Дмитриева О.Ф., Теннов А.В., Шурин М.Р., Чирков А.М. Уменьшение содержания иммунореактивных ?- и ?-эндорфинов в крови и подавление их гиперсекреции под влиянием дексаметазона при эмоциональном стрессе у обезьян // Бюл. Экспер. Биол. и Мед.-1989.-57.-№5.-С.572-574

	Елисеева Ю.Е., Барсукова И.С., Орехович В.Н. Обнаружение ингибиторов карбоксикатепсина (ангиотензин-I-превращающего фермента) в лейкоцитах человека // Докл. АН СССР.-1988.- 302.- С.992-994

	Ельский В.Н., Сергеева Л.А., Самсоненко Р.А. Роль опиоидных пептидов в осуществлении функций гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы в норме и при шоке. // Тез.докл.всесоюзн.конференции “Нейропептиды: их роль в физиологии и патологии”. – Томск. – 1985. – С.53-54.

	Енин Л.Д., Акоев Г.Н., Лебедев В.П., Потехина И.П. Воздействие опиоидных пептидов мозга на сенсорные окончания кожи как один из механизмов анальгетического эффекта. // В сб. докл. научн. конфер.”Физиологическое и клиническое значение регуляторных пептидов”. – Пущино. – 1990. – С.55-63.

	Еремина С.А., Белякова Е.И., Кондрух Т.В. Роль катехоламинов различных классов в центральной регуляции гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы // Физиол. жур. им. Сеченова. - 1988.-№9.- С.1316-1320.

	Еропкин М.Ю. Роль протеолиза в процессинге и инактивации нейропептидов: его возможная роль в некоторых функциях мозга // Усп.совр.биолог. - 1983.- 95.-№1.- С.65-67.

	Ерошенко Т.М., Титов С.А., Лукьянова Л.Л. Каскадные эффекты регуляторных пептидов // Итоги наук. и техн. ВИНИТИ.-Физиология человека и животных .- 1991.- 46.- 203с.

	Захарова О.Ю О модулирующем влиянии энкефалинов на реакции системы крови при иммобилизационном стрессе // дис. на соиск. степени канд.мед.наук. - Томск.- 1988

	Иванова Т.М., Скоцеляс Ю.Г., Болякин В.И., Анохина И.П., Белова Т.И., Юматов Е.А., Судаков К.В. Устойчивость сердечно-сосудистой функции у крыс разных генетических линий в условиях эмоционального стресса // Жур.высш.нервн.деят.- 1979.-29.-№5.- С.1052 –1060

	Игнатов Ю.Д. Гетерогенность опиоидных рецепторов мозга и свойства их лигандов. // В сб. ”Нейрофармакология. Регуляция болевой чувствительности”. – Л. – 1984. – С.9-93.

	Ильюченок Р.Ю. Центральные эфекты фармакологических веществ и ГЭБ. // в кн. “Физиология и патология гисто-гематических барьеров”. – М. –Наука. – 1968. – С.179-186.

	Исмайлова Х.Ю., Гасанов Г.Г и др. Исследовательское поведение в открытом поле и норковой камере крыс с различной предрасположенностью к стрессу // Бюл.Экспер. Биол.и Мед. - 1992.-114.-№8.-С.130-132.

	Йохансон О., Хекфельд Т., Эльде Р.П., Шульценберг М., Террениус Л. Иммуногистохимическое распределение энкефалиновых нейронов // в кн. “Эндорфины” под ред. Коста Э., Трабука М.- М.- 1981.-С.61-79 

	Калинина Е.В., Позднев В.Ф., Комиссарова Н.В., Гомазков О.А. Влияние новых пептидных ингибиторов на соотношение ангиотензин  конвертирующей и кининдеградирующей активностей дипептидилкарбоксипептидазы (АПФ) // Биохимия. - 1997.- 62.- 3.- С.440-444.

	Калюжный Л.В. Физиологические механизмы регуляции болевой чувствительности / М.- Медицина.- 1984.- 215с.

	Каменская Л.Н., Кононенко В.А. Взаимодействие ренин-ангиотензиновой и энкефалинэргической систем мозга и гипофиза крыс в норме и при экспериментальной патологии гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой комплекса // Физиол.журн.- 1996.-82.-№4.- С.60-64.

	Кассиль Г.Н. Некоторые аспекты современных представлений о ГЭБ. // в кн. “Физиология и патология гисто-гематических барьеров”. – М. – 1968. – С.170-178.

	Клуша В.Е. Пептиды - регуляторы функций мозга .- Рига. - 1984.- с.

	Кокс Т. Стресс // М.- Мир.- 1980.- 180с.

	Кольдиц М. Участие ангиотензина ІІ в осуществлении отрицательных эмоциональных реакций. // Жур.высш нервн. деят. - 1985.-т.35.- С.280-287.

	Коплик Е.В., Ведяев Д.Ф., Михалева И.И. Пептид дельта-сна как фактор вызывающий устойчивость животных к эмоциональному стрессу // тез. Докл. АН СССР.- 1982.-267.-№1.-С.230-234.

	Корнева Е.А. Регуляторные пептиды как модуляторы защитных функций организма // Физиол.журн. –1989.-75, №5.- С. 656-665

	Коробов Н.В. Даларгин – опиоидоподобный пептид периферического действия // Фармакология и токсикология.- 1988.- №4.-С.35-38

	Костерлиц Т.В., Хьюс Д. Развитие концепций опиатных рецепторов и их лигандов // в кн. ”Эндорфины”, под ред. Коста Э., Трабукки М.- М.- Мир.- 1981.-С.43-55.

	Кругликов Р.И., Диш Т.Н., Коштоянц О.Х. Макарова М.Ю., Пузырева Т.Г. О некоторых механизмах действия нейропептидов и их аналогов на процессы обучения и памяти. // Нейрохимия. – 1987. – т.6. - №6. – С.199-205.

	Кузовков А.Г. Функциональное состояние ГЭБ и центральной нервной системы при воздействии некоторых экстремальных факторов // дис. на соиск. степени доктора мед. наук.– Л. – 1971

	Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.- Высшая школа.-1990.-352с.

	Ламзина Н.А. Закономерности действия АПФ в иммобилизационном состоянии // дис. на соиск. степени канд.хим.наук.- М.-1990

	Ласукова Т.В. Влияние опиоидных пептидов на функцию коры надпочечников в норме и при стрессе // дис. на соиск. степени канд.биол.наук.- Томск.-1991

	Лишманов Ю.Б., Братцев Н.Ф., Ламбина С.А. Нейропептиды. Их роль в физиологии и патологии // Томск.-1985.-С. 92-93.

	Лишманов Ю.Б., Маслов П.Н. Опиоидные нейропептиды, стресс и адаптационная защита сердца . – Томск. - 1994

	Лишманов Ю.Б., Маслов П.Н., Крылатов А.В., Ускина Е.В. Роль эндогенных опиоидных пептидов в механизмах антиаритмического эффекта адаптации // Физиол.журн.-1996.-82.-№5-6.-С.56-59

	Лишманов Ю.Б., Маслов П.Н., Ласукова Т.В. Роль опиоидной системы в адаптации организма и защите сердца при стрессе // Усп.физиол.наук. – 1997. – т.28. - №1. – С.75-97.

	Лишманов Ю.Б., Маслов Л.Н., Титов М.И. О механизме антистрессорного действия Д-ала2-лей5-арг6-энк // Бюл. Экспер.Биол.и Мед.-1985.-№9.-С.268-270.

	Лишманов Ю.Б., Маслова Л.В., Цибин А.Н., Трифонова Ж.А. Опиоидные пептиды и нейрогормональные реакции при стрессе и адаптации // Пат.физиология.- 1987.-№6.-С.51-53.

	Лысенко А.В. Протеолитические процессы в мозге крыс при стрессе и адаптации, влияние -сон индуцирующего пептида // дис. на соиск. степени канд.биол.наук.- Ростов Н/Д. -1993 

	Майзелис М.Я. ГЭБ и его регуляция. – М. – Медицина. – 1973. – 183с.

	Майзелис М.Я., Заблудовский А.А., Шихов С.Н. Об участии циклических нуклеотидов в механизмах действия энкефалинов // Бюл.Экспер.Биол.и Мед.-1982.-№3.-С.33-35.

	Малышенко Н.М., Ерошкин С.В. К механизму антистрессорного действия ПДС // Стресс, адаптация и функциональные нарушения.-Кишинев: Штиинца.- 1984.-С 84-85.

	Малышенко Н.М., Попова Н.С. Гормоны и нейропептиды в интегративных процессах // Усп.физиол.наук.- 1990.-21.-№2.-С.94-110.

	Маслов Л.Н., Лишманов Ю.Б., Нарыжная Н.В. Об участии различных типов опиатных рецепторов в механизмах стрессорного повреждения сердца // Физиол.журн.-1996.- 82, №5-6.-С.53-58 

	Масюк Т.В., Весельский С.Г., Масюк А.И. Влияние энкефалинов на секреторную функцию печени // Физиол.журн. – 1998.-84.-№4.- С.399-405

	Машковский М.Д. Фармакология антидепрессантов / под ред. Машковского М.Д., Андреевой Н.И, Полежаевой А.И.- М.- Медицина.- 1983.- 240с.

	Медведев О.С., Титов М.И. Опиоидные пептиды и регуляция сердечно-сосудистой системы. // Фармакология нейропептидов. - М.: Изд-во ин-та фармакологии.- 1982.-С.88-101.

	Меерсон Ф.З., Пшенников М.Г. Адаптация к стресс-ситуации и физиологической нагрузке. - М.- Медицина. -1988.-25c.

	Менджерицкий А.М., Маклецова М.Г. и др. Антистрессорный эффект ?-сон индуцирующего пептида при гипокинетическом стрессе // Укр.биохим.-1991.-63.-№1.-С.34-37.

	Механизмы развития стресса // Сб.статей.- Кишинев: Штиинца.- 1987.-222с.

	Митюшина Н.В. Влияние энкефалинов на активность ферментов обмена регуляторных пептидов в головном мозге и периферических тканях крыс // дис. на соиск. степени.канд.биол.наук.- Пенза.-1999

	Наркевич В.Б. Ингибиторы эндогенных пептидаз мозга: антидепрессантные свойства и взаимодействие с нейромедиаторными системами мозга // дис. на соиск. степени канд.биол.наук. - М.-1995

	Павлова В.И. Стресс-повреждение организма и его предупреждение метаболитами стресс-лимитирующих систем // дис. на соиск. степени доктора биол.наук.-Томск.-1990

	Панин Л.Е. Биохимические механизмы стресса /Новосибирск.-Наука.-1983.-232с.

	Пашутин С.Б. Синтетические пептиды биорегуляторы в обеспечении адаптации организма к экстремальным воздействиям // дис. на соиск. степени доктора биол.наук.-М.-1991

	Подвигина Т.Т., Богданова Т.С., Филаретов А.А. Значение нейропептидов в изменении свойств гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы после стресса. // Физиол.журн. – 1992. – т.78. - №4. – С.149-154.

	Пшенникова М.Т. Роль опиоидных пептидов в реакции организма на стресс // Пат.физиол. и экспер.терапия. – 1987. – вып.3. – С.85-90.

	Раевский К.С. Эндогенные опиоидные пептиды как возможные нейропередатчики // в кн. “Опиоидные пептиды и их рецепторы”.- Итоги науки и техники ВИНИТИ.-1982.-№13.-С.185-200.

	Ростовцев А.П., Григорьянц О.О., Гомазков О.А. Субстраты для исследования энкефалинобразующей карбоксипептидазы в мозге и надпочечниках крыс // Вопр.мед.химии.- 1988.-34, №1.-С. 126-129

	Рочас С.В., Подвигина Т.Т. Изменение реакции гипофизарно-адренокортикальной системы на стрессор при многократном его повторении // Физиол.журн.- 1998.- т.84.- №12.- С.1386-1394

	Саксон М.Е., Сафронова В.Г., Белоярцев Ф.Ф. Опиатные рецепторы сердца их роль в реализации ионотропных эффектов наркотических анальгетиков и опиоидных пептидов // Вестник АМН СССР.-1983.-№10.- С. 48-55

	Салиева Р.М., Коплик Е.В., Каменов З.А., Полетаев А.Б. Влияние бета-эндорфина и пептида, вызывающего дельта сон, на устойчивостью к эмоциональному стрессу // Бюл. Экспер. Биол. и Мед.- 1989.-т.58.-№10.-С.464-465

	Салиева Р.М. Яновский К. и др. ПВДС, как фактор повышающий содержание вещества Р в гипоталамусе и устойчивости крыс к эмоциональному стрессу // Журн.высш.нервн.деят.-1991.- т.41.- №3.-С.558-563.

	Селье Г. Стресс без дистресса. – М. –Прогресс.– 1979.– 124с.

	Сергеева М.Г. Кинетические закономерности рецептор-лигандного комплексообразования в механизме действия нейропептидов и морфина /М.-1995.-55с.

	Слепушкин В.Д., Золоев Г.К., Виноградов В.А., Титов М.И. Нейропептиды, их роль в физиологии и патологии / Томск.- Изд-во Томского ун-та.- 1988.-143с.

	Слепушкин В.Д., Лишманов Ю.Б., Золоев П.К., Прум И.А. Современные преставления о некоторых нетрадиционных механизмах стресса // Успехи физиол.наук.- 1985.-16.-№4.-С.422-424.

	Судаков К.В. Нейрохимическая природа “застойного” возбуждения в структурах мозга при эмоциональном стрессе // Пат.физиол.и экспер.терапия.- 1995.- №1.- С.3-8.

	Судаков К.С., Иванов В.Т., Бадиков В.И. и др. Механизмы антистрессорного действия ПВДС // Стресс, адаптация и функциональные нарушения.- Кишинев: Штиинца.-1984.-С356-357.

	Тигранян Р.А. Гормонально-метаболический статус организма при экстремальных воздействиях / М.- Наука.- 1990.- 228с.

	Тигранян Р.А. Реакция опиоидной системы головного мозга на стресс и ее зависимости от состояния катехоламинэргической системы // Нейрохимия.-1987.-6.-№1.-С.63-71

	Тигранян Р.А., Вакулина О.П. Содержание энкефалинов и эндорфинов в различных отделах головного мозга крыс при стрессе // тез. 9 всесоюзн. конф. по биохимии нервной системы. – Ереван. – 1983. – С.321-372.

	Ткаченко Л.Н. Отражение индивидуально-типологических свойств вегетативной нервной системы в характере вегетативных и поведенческих реакций при эмоционально-болевом стрессе // Бюл. Экспер. Биол. и Мед. – 1998. – т.126. - №12. – С.621-625.

	Тонких А.В. Роль гипоталамо-гипофизарной области в реакциях организма при экстремальных (стрессорных) ситуациях // Усп.физиол.наук. – 1976. – т.7. - №2. – С.3-12.

	Филаретов А.А., Богданов А.И., Ярушкина Н.И. Стресс-вызванная анальгезия. Роль гормонов гипофизарно-адренокортикальной системы // Физиол.журн.-1995.-81.-№2.-С.40-46.

	Фурдуй Ф.И. Современные представления о физиологических механизмах развития стресса. // в кн. “Механизмы развития стресса”. – Кишинев. – “Штиинца”. – 1987. – С.8-33.

	Фурдуй Ф.И. Физиологические механизмы стресса и адаптации при остром действии стресс-факторов // дис. на соиск. степени доктора биол. наук.-Л.-1987

	Хайсман И.Д., Арефолов Ю.П. Роль периферических катехоламинергических систем в антистрессорном действии нейропептидов //Бюл. Экспер. Биол. и Мед.-1991.-№6. - С.328-333

	Чайлдерс С.Р., Шварц Р., Койл Дж.Т., Снайдер С.Х. Радиоиммунологический тест на энкефалины. Содержание метионин-и лейцин-энкефалина в мозгу морфинозависимых и поврежденных каиновой кислотой крыс // в кн. “Эндорфины” под ред. Коста Э., Трабука М.- М.- 1981.-С.61-79 

	Шурин М.Р. Иммуномодуляторные свойства опиоидных пептидов // “Структура и функции иммунорегуляторных пептидов”.- Итоги науки и техн.- Иммунология. – М.-1988.-т.26.-с.168-173

	Щетинина Н.В. Активность основных карбоксипептидаз в тканях и отделах мозга крыс в онтогенезе.// дис. на соиск. степени канд.биол.наук.–Пенза.– 1997

	Эмоциональный стресс в условиях нормы и патологии человека / Л.- Медицина.- 1976.-223с.

	Юматов Е.А. Пептидные факторы устойчивости к эмоциональному стрессу: теоретические и прикладные аспекты исследования // в сб. Матер. 1 Сов-инд. симпозиума “Нейрофизиология”.- М.-1983.-С.127.

	Юматов Е.А., Гехт К., Скоцеляс Ю.Г. Субстанция Р как фактор устойчивости к эмоциональному стрессу // Журн. выс. нервн. деятельности.-1984.-34.-4.-С.771-777.

	Юматов Е.А., Кириллова О.И., Поппай М., Ратеак Р. Содержание субстанции Р в гипоталамусе у устойчивых и предрасположенных к эмоциональному стрессу крыс // Журн. выс. нервн. деятельности.-1987.-37.-№2.-С.371-372.

	Юханов Р.Ю., Рожанец В.В., Михалева И.И., Майский А.И. Анализ механизма стресс-протективного действия пептида, индуцирующего ?-фазу сна // Бюл. Экспер. Биол. и Мед.- 1990.- №1.- С.46-47.

	Якушев В.С., Давыдов З.В., Бушева В.В. Белковый обмен в больших полушариях головного мозга при эмоционально-болевом стрессе // Укр.биохим.журн. – 1985. – вып.57. - №2. – С.15-18.

	Янг Х.-Ю.Т., Хонг Дж.С., Фратта В., Коста Е. Энкефалины мозга крыс. Распределение и биосинтез // в кн.”Эндорфины”под ред. Коста Э., Трабукки М.- М.-1981.-С.155-164.



	Ahmed M.S., Cemerikis B., Agbas A. Propepties and functions of human placental opioid system // Life Sci.-1992.-V.50, №2.-P.83-97

	Akil H. Opiate tolerance and dependence: recent findings and synthesis. New.-Biol.1991.Oct. 3(10):915-23.

	Armstrong J.D. Esbeshade K.L., Coffey M.T., Heimer E. Opioid control of growth hormone in the suckled sow is primarily mediated through growth hormon releasing factor // Domest –Anim –Endocrinol.- 1990.-Apr.-v.7, №2. – P. 191-198

	Arregui A., Iversen L.L. Beta-lipotropin potently inhibisa purified angiotensin-conwerting enzyme from human brain // Biochem. Pharmacol.-1979.-v.28.- P.2693-2696

	Axelrod J. – In.: Stress: The role of catecholamines and other neurotransmitters /Eds. E.Usdin, R.Kvetnansky, J.Axelrod. – V.1. - P.3-13, Gordon and Breach Science Publishers. N.Y. 1984.

	Bado A., Roze C., Lewin M.J., Dubrasquet M. Endogenous opioid peptides in the control of food intake in cats //Peptides. – 1989, Sep.-Oct. – V.10. – N.5. – P.967-971.

	Barry N., Jones, Alvin S. Stern, et al. Structure of Two-Adrenal Polypeptides. Containing Multiple Enkephalin Sequences //Arch. Biochemistry and Biophisics, 1980. – V.204, 1. – P.392-395.

	Bauer A.I., Szurszewski I.H. Effect of opioid peptides on circular muscle of canine duodenum // J.Phisiol. – London. 1992. – Mar. 434: 409-22.

	Belluzzi J.D., Grant N., Garsky V., Sarantalus D., Wise C.D., Stein L. Analgesia induced in vivo by central administration of enkephalin in rats // Nature. – London. 260, 625. – 1976.

	Benter I.F., Hirsh E.M., Tuchman A.I., Ward P.E. N-terminal degradation of low molecular weight opioid peptides in human cerebrospinal fluid // Biochem. Pharmacol. – 1990. Aug. 40 (3): 465-72.

	Bhargava H.N. Opioid peptides, receptors, and immune function / NIDA. Res. Monogr. – 1990. – V.96. – P.220-233.

	Bloom F., Segal D., Ling N., Guillemin R. Endorphins: profound behaviaral factors in mental illeness // Science. – 1976. – V.194. – P.630-632.

	Blum A.I. Interactions of ligands with the opiate receptors of brain membrans regulations by ions and nucleotids // Proc. Nat. Acad. Sci. US. – 1978. – V.75. – P.1713-1717.

	Bunning P., Riordan F. Sulfate potentiation of the chloride activation of angiotensin-converting enzyme // Biochem. – 1987. – V.26. – P.3374-3377.

	Camargo A.C. et.al. Brain endooligopeptidase A , a putative enkephalin converting enzyme // J. Neurochem.- 1987.-48, №4.- P. 1258-1263

	Carr D.J. The role of endogenous opioids and their receptors in the immune system // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. – 1991, Nov . – V.198. – N.2. – P.710-200.

	Carr D.J., DeCosta B.R., Kim C.H., Jacobson A.E., Guarcello V., Rice K.C., Blalock I.E. Opioid receptors on cells of the immune system: evidence for delta and –kappa–classes // J. Endocrinol. – 1989, Jul. – V.122. – N.1. – P.161-168.

	Chevillard C., Duchene N., Pasguir R., Alexander I.M. Relation of the centrally evoked pressor effect of angiotensin II to central noradrenaline in the rabbit // Europ. J. Pharmacol. 1979. – V.58. – P.202.

	Cool D.R., Normant E., Shen F., Chen H.C., Pannell L., Zhang Y., Loh Y.P. Carboxypeptidase E is a regulated secretory pathway sorting receptor: genetic obliteration leads to endocrine disorders in Cpe(fat) mice // Cell. – 1997, Jan. 10. – V.88. – N.1. – P.73-83.

	Cover P.O., Buckingham J.S. Effects of selective opioid-receptor blockade on the hypothalamo-pituitary-adrenocortical responses to surgical trauma in the rat // J. Endocrinol. – 1989, May. – V.121. – N.2. – P.213-220.

	Covi G., Sheiban I., Gelmini G., Arcaro G., Tonni S., Bolner A., Piemonte G., Leãhi A. Left ventricular diastolic function during adrenergic stress in essential hypertension: acute and chronic effects of ACE inhibitiïn // Cardiovasc. Druggs. Ther. – 1996.- Jul. – V.10. – N.3. – P.321-329.

	Ãuóhman D.W., Ondetti M.A., Gordon E.M. et al. Rational design and biochemical utility of specific inhibitors of angiotensin-cïnverting enzyme // J. Cardiovasc. Pharmacol. – 1987. – V.10. – Suppl.7. – P.17-30.

	Cushman D.W., Wang F.L., Fung W.C. et al. Comparison in vitro, ex vivo, and in vivo of the actions of seven structurally diverse inhibitors of ACE // Brit. I. Clin. Pharmacol. 1989. – V.28. – P.115-131.

	Demmer W., Brand R. Processing and degradation of Met-enkephalin by peptidase associated with rat brain cortical synaptosomes / Proteasey potential role in health and disease. Prot. Int. Symp. Wirsburg. 17-20 Oct. – 1982. P.165-177.

	Duggan A.W. Enkephalins as transmitters in the central nervous system // Cire Res. – 1980. – V.46. – N.6. – Suppl.1. – P.149-1-153.

	Ehlers M.R., Riordan I.E. Angiotensin-converting enzyme: new concepts concerning its biological role // Biochem. – 1989. – V.28. – N.3. – P.5311-5318.

	Erdos E.G., Skidgel R.A. The angiotensin-I-converting enzyme // Lab. Invert. – 1987. – V.56. – P.345-348.

	Ernst A., Schulz P., Schoenenberger G.A. Cirdadian variation of DSIP – like immunoreactivity in human plasma / Sleep research. Brain information service. Brain research institute University of California. Los Angeles. – 1987. – V.16. – P.609.

	Evans C. et al. Opioid peptides in the adrenal pituitary axes // Psychopharm. Bull. – 1985. – N.3. – P.446-471.

	Fricker L.D. Activation and membrane binding of carboxypeptidase E // J. Cell Biochem. – 1988. – V.38. – P.279-289.

	Fricker L.D. Carboxypeptidase E // Ann. Rev. Physiol. – 1988. – V.50. – P.309-321.

	Fricker L.D. Neuropeptide biosynthesis: focus on the carboxypeptidase processing enzyme // Trends Neurosci. – 1985. – V.8. – N.5. – P.210-214.

	Fricker L.D. Peptide – processing exopeptidases: amino- and carboxypeptidases involved with peptide biosynthesis / Peptidal biosynthesis and processing. – Florida, 1991. – P.199-230.

	Fricker L.D., Berman Y.L., Leiter E.H., Devi L.A. Carboxypeptidase E activity is deficient in mice with the fat mutation. Effect on peptide processing // J. Biol. Chem. – 1996, Nov. 29. – V.271. – N.48. – P.30619-30624.

	Fricker L.D., Reaves B.J., Das D., Dannies P.S. Comparison of the regulation of carboxypeptidase E and prolactin in CH4G1 cells, a rat pituitary cells line // Neuroendocrin.-1990.- 51, №6.- P. 658-663

	Fricker L.D., Snyder S.H. Enkephalin convertase: purification and characterization of a specific enkephalin-synthesizing carboxypeptidase localized to adrenal chromaffin granules // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1982. – 79. – P.3886-3890.

	Fricker L.D., Snyder S.H. Purification and characterization of enkephalin convertase, an enkephaline-synthesizing carboxypeptidase // J. Biol. Chem. – 1983. – V.258. – N.18. – P.10950-10955.

	Fricker L.D., Supattapone S., Snyder S.H. Enkephalin convertase: a specific enkephalin synthesizing carboxypeptidase in adrenal chromaffin granules. Brain and pituitary gland // Life Sci. – 1982. – V.31. – P.1841-1844.

	Gainer H., Russel J.T., Loh Y.P. The enzymology and intracellular organization of peptide precursor processing: the secretory vesicle hypothesis // Neuroendocrin. – 1985. – 40. – P.171-184.

	Ganten D., Minnich J.L., Grander P. Et al. Angiotensin-forming enzyme in brain tissue // Ibid. – 1971. – V.173. – P.64-65.

	Gerendaei I. Modulation of testicular functions by testicular opioid peptides // J. Physiol. Pharmacol. . – 1991, Dec. – 42. – N.4. – P.427-437.

	Gibson A., Hart S., Shabib A. Leucinoenkephalin and methionine-enkephalin produce opposing effects on plasma corticosterone levels in ether-stressing mice //Brit. J. Pharmacol. – 1989. – V.70. – P.509-511.

	Gorelic D.A., Larlin D.H., George R., Li C.H. β-endorphin is behaviorally active in rats after chronic intravenous administration // Pharmacol. Biochem. Behav. – 1978. – V.9. – N.3. – P.385-386.

	Graf M., Kastin A.I. Delta-Sleep-Induãing Peptide (DSIP): A review // Neurosci. and Biobehav. Rev. – 1984. – V.8. – N.12. – P.83-93.

	Graf M., Schenenberger G.A. Delta-Sleep-Inducing Peptide Modulates the Stimulation of Rat-Pineal N-Acetyltransferase Activity bi Ivolving the α1-Adrenergetic Reception // J. Neurochemistry. – 1987. – V.48. – N.4. – P.1252-1257.

	Gregg D., Goedken E., Gaikin M., Wendell D., Gorski J. Decreased expression of carboxypeptidase E protein is correlated to estrogen-induction of rat pituitary tumors // Mol. Cell. Endocrinol. – 1996, Mar., 25. – V.117. – N.2. – P.219-225.

	Guest P.C. et.al. Molecular heterogeneity and cellular localization of carboxypeptidase H in the islets of Langerhans // Endocrinology.- 1991.-129, №2.- P.734-740

	Harmar A. J. Neuropeptides // Transm. Mol. In the brain. – 1987. – 2. – P.17-26.

	Hook Y.J.H., Eiden L.E. Two peptidases that convert 125J-Lys-Arg-(Met)-enkephalin, 125J-enkephalin-Arg6 and respectively, to 125J-(Met)-enkephalin in bïvine adrenal medullary chromaffin granules // FEBS Lett. – 1984. – 172. – N.2. – P.212-218.

	Hook V.Y.H., Eiden L.E., Pruss R.M. Selective regulation of carboxypeptidase peptide hormone-processing enzyme during enkephalin biosynthesis in cultured bovine anrenomedullary chromaffin cells // J. Biol. Chem. – 1985. – 260. N.10. – P.5991-5997.

	Hook V. Y.H., LaGamma E.F. Product inhibit of carboxypeptidase H // J. Biol. Chem.- 1987.-v.262.- № 26.-P. 12583-12588

	Hook V.J.H., Mezey E., Fricker L.D., Pruss R.M., Siegel R.E., Brownstein M.J. Immunochemical characterization of carboxypeptidase B-like peptide-hormone-processing enzyme // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1985. – 82. – P.4745-4749.

	Hooper N.M. Ançiotensin converting enzyme implications from molecular biology for its physiological functions // Int. J. Biochem. – 1991. – V.23. – N.7-8. – P.641-647. 

	Hooper N.M., Turner A.J. Isolation of two differentially glycosylated from of peptide-dipeptidases A (ACE) from pig brain: a reevaluation of teiner role in neuropeptide-metabolism // Biochem. 1987.-241, №15.-P.1455-1463

	Hughes J., Smith T.W., Kosterlitz H. Wetal Identification of two related pentapeptides from the brain with potent opiate agonist activity // Nature. – 1975. – V.258. – N.5536. – P.577-579.

	Hui K.-S., Lajlha A. Neuropeptidases / Handbook of Neurochemistry. – New York and London, 1983. – V.4. – P.1-19.

	I’Hereault S., Barden N. Regulation of proopiomelanocortin messenger RNA – concentrations by opioid peptides in primary all cultures of rat hypotalamus // Mol. Brain. Res. 1991. - 10 (2). – P.115-121.

	Jankovic B.D., Radulovic I. Enkephalins, brain and immunity: modulation of immune responses by methionine–enkephalin injected into the cerebral cavity // Int. J. Neurosci. – 1992, Nov-Dec. – V.67. – N.1-4. – P.241-270.

	Jiang Z.G., North R.A. Pre- and postsynaptic inhibition by opioids in rat striatum // J. Neurosci. – 1992, Jan. – V.12. – N.1. – P.356-361.

	Junkinz G. Changes of pain threshold aften stress-possible involvement of endogenous opiates // Arzeneimittel Forscheeng Drug. Res. – 1980. – V.30-2. N.8. – P.1237-1238.

	Kastin A.Y., Nissen C., Coy D.H. DSIP – like immunoreactivity in the developing rat brain // Brain. Res. Bull. – 1981. – 7. – P.687-690.

	Khanna A.S., Waisman D.M. Metabolism and intracellular processing of protein hormones /Hormones and their actions. Part 1. / Eds. B.A.Cooke et al. – Amsterdam, 1988. – P.117-132.

	Khawaja X.Z., Green J.C., Thorpe J.R. The occurence and receptor specificy of endogenous opioid peptides within the pancreas and liver of the rat / Comporison with brain // J. Biochim.-1990.-Apr.1.- 267, №1.P. 233-240

	Kramer T.H., Toth G., Haaseth R.C., Matsunage T.O., Davis P., Hruby V.I., Burks T.F. Influence of peptidase inhibitors on the apparent agonist potency of delta celective opioid peptides in vitro // Life Sci. – 1991. – V.48. – N.9. – P.881-6.

	Krieger D.T. Brain peptides: what, where and why? // Science. – 1983. – V.222. – N.462. – P.975-985.

	Lansillo J.J., Stevens J., Dazaratty Y., Yotsumoto H., Fanburg B.L. Angiotensin-converting enzyme from human tessues, physicochemical, catalitic and immunological properties // J. Biol. Chem. – 1985. – V.260. – N.28. – P.14938-14944.

	Lantz I., Thornwall M., Kihlstrom J.E., Nyberg F. A comparison of human lung, brain, CSF and plasma angiotensin-converting enzyme with regard to neuropeptide metabolism // Biochem. Int. – 1992, Mar. – V.26. – N.3. – P.415-426.

	Lanzillo J.J., Stevens J., Dararatty Y. et.al. Angiotensin-converting enzyme from human tessues, physicochemical, catalic and immunological properties // J. Biol. Chem.-1985.-260, №28.-P.14938-14944

	Ling N., Burdus R., Guillemin R. Isolation primary structure and synthesis of α-endorphin and γ-endorphin, two peptides of hypothalamic hypophysial origin with morphinomimetic activity // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1976. – V.73. – P.3942-3943.

	Loe K.S., Frank S., Vanderklish P. Et al. Inhibitions of proteolisis protect hyppocampal neurons from ischemia // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1991. – V.88. – N.16. – P.7233-7237.

	Loh Y.P., Birch N.P., Castro M.G. Pro-opiomelanocortin and provasopressin converting enzyme in pituitary secretory vesicles // Biochemie.-1988.-70, №1.-P.11-16

	Loh M.H.., Theng L.F., Wei E., Li C.H. β-endorphin as a potent analgetic agent /Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1976. – V.73. – N.8. – P.2895-2898.

	Lynch D.R., Snyder S.H. Neuropeptides. Multiple molecular forms. Metabolic pathways and receptors // Anme. Rev. Biochem.-55.- Calif.Alto.-1986.- P.773-799

	Lynch D.R., Vanable J.C., Snyder S.H. Enkephalin convertase in the heart similar disposition to atrial natriuretic factor // Endocrinology.- 122, № 6.- P.2683-2691

	Mains R.E., Eipper B.A. Secretion and regulation of two biosyntetic enzyme activities, peptidil-glycine α-amidating monooxygenase and a carboxypeptidase, by mouse pituitary corticotropic tumor cells // Endocrinology.- 1984.-115, №5.-P.1683-1690

	Makara G.B., Palrovits M., Szentagothai J. The endocrine hypothalamus and the hormonal response to stress /Selyes guide to stress research. / Selye H. (eds.). – New York: Van Nostrand Reinhold Co. – 1980. – P.280-337.

	McDomald J.K., Schwabe C. Intracellular exopeptidases /Proteinases in Mammalian Cells and Tissues / Barrett A.I. (eds.). – Amsterdam: Elsevier /North Holland Biomedical Press. – 1977. – P.311-391.

	Mentein R., Roos T. Proteases involved in the metabolism of angiotensin II, bradykinin, calcitonin gene-related peptide (CGRP), and neuropeptide Y by vascular smooth muscle cells // Peptides. – 1996. – V.17. – N.4. – P.709-720.

	Meunier J.C. The opiad peptides and their receptors // Biochemie.- 1986.-68.- P.1153-1158

	Millan M.J., Emrich H.M. Endorphinegric system and the response to stress //Psychother. Psychosomat. – 1981. – V.36. – N.1. – P.43-56.

	Mulder A.H., Wardeh G., Hogenbom F., Frankhuyzen A.L. Selectivity of various opioid peptides toward delta-kappa-and mu-opioid receptors mediating presinaptic inhibition of neurotransmitter release in the brain // Neuropeptides.- 1989.-Aug-Sep.-14, №2.- P.99-104

	Nakamura M., Kamata R., Jnour H., Inaba M. Effects of opioid peptides administration in conscious rats on the changes in blood adrenaline levels caused by immobilization stress // Jap. J. Pharmacol. – 1989. – V.50. – N.3. – P.354-382.

	Nicolarakis K.E., Almeida O.F., Yassouridis A., Herz A. Presynaptic auto- and allelo-receptor regulation of hypothalamic opioid peptide release // Neurosci. – 1989. – V.31. – N.73. – P.269-273.

	North R.A., Williams J.T. How do opiates inhibit neurotransmitter release //Trends. Neurosci. – 1983. – V.6. – N.8. – P.337-339.

	Oehme P. Substance P: Regulatory functions // Wiss. Beitz. M.-luther Univ. Hall-Wittenberg P.- 1988.- 32.- P. 179-190

	Olson G.A., Olson R.D., Kastin A.J. Endogenous opiates 1985 // Peptides. – 1986. – V.7. – N.5. P.907-933.

	Patterson T.A., Schulteins G., Alvarado M.C., Martinez J.L.-J.R., Bennet E.L., Rossenzweig M.R., Hruby V.Y. Influence of opioid peptides on learningand memory process in the chick // Behav.-Neurosci.-1989.-Apr.-103, №2.- P.429-437

	Przewlocki R. et.al. Gene expression and lokalization of opioid peptides in immune cells of inflamed tissue: functional role in antinoception // Neurosci.-1992.-48, №2.- P.491-500

	Rakudi H., Yu H., Kamitani A., Nakamura Y., Ohishi M., Kamide K., Nakata Y., Takami S., Higaki J., Ogihara T. Links between hypertension and myocardial infarction // Am. Heart. J. – 1996, Jul. – V.132. – N.1. – P.213-221.

	Rodrigues C., Brayton K.A., Brownstein M., Dixon J.E. Rat preprocarboxypeptidase H: cloning, characterisation and sequence of the cDNA and regulation of the mRNA by corticotropin-releasing factor // J. Biol.Chem. –1989.- v.264.-P.5988-5995 

	Rossier J., Battenberg E., Piffman Q. et al. Hypothalamic enkephalin neurons may regulate the neurohypophysis // Nature. – 1979. – V.277. – P.653-655.

	Roth W.W., Mackin R.B., Spiess J., Goodman R.H., Noe B.D. Primary structure and tissue distribution of angelerfish carboxypeptidase H // Mol. Cell Endocrinol. – 1991. – V.78. – N.3. – P.171-178.

	Rothman R.B., Bycov V., Xue B.G., Xu H., De-Costa B.R., Jacobson A.E., Rice K.C., Kleinman J.E., Brady L.S. Interaction of opioid peptides and other drugs with miltiple kappa receptors in rat and human brain / Evidence for species differences //Peptides. – 1992, Sep.-Oct. – V.13. – N.5. – P.977-987.

	Ryoichi K., Reiko S., Takshi K. et.al. Hydrolysis of neo-kyotophin (Thr-Ser-Lys-Tyr-Arg) and [met]enkephalin – Arg6-Phe7 by ACE from moncey brain // Biochem. Pharmakol.-1986.-35, №24.- P.4499-4503

	Schmieder R.E., Schobel H.P., Gatzka C.E., Hauser W., Dominik P., Mann J.F., Luft F.C. Effects of angiotensin converting enzyme inhibitor on renal heamodynamics during mental stress // J. Hypertens. – 1996, Oct. – V.14. – N.10. – P.1201-1207.

	Seredenin S.B., Blednov Y u A., Badysktov B.A. Pharmacogenetic analyses of mechanisms of emotional stress: effects of benzodiazepines // Ann. Inst. Super. Sanitc. – 1990. – V.26. – P.81.

	Simantov R., Showman A.M., Synder S.V. A morphine – like factor enkephalin in rat brain subcellular localization // Brain Res. – 1976. – V.107. – P.650-657.

	Simon E.J. Opioid receptors and Endogenous opioid peptides // Med. Res. Rev. – 1991. – V.11. – N.4. – P.357-374.

	Skeggs L.T., Jr.Kahn J.R., Shumway N.P. The preparatia and function of hypertensin cïnverting enzyme // J. Exp. Med. – 1956. – V.103. – P.295.

	Skidgel R.A. Basic carboxypeptidases: regulators of peptide hormone activity //Trends Pharmacol. Sci. – 1988. – V.9. – N.8. – P.299-304.

	Skidgel R.A., Jonson A.R., Evda E.G. Hydrolisys of opioid hexapeptides by carboxypeptidase N. Presenc of carboxypeptidase in cell membranes // Biochem. Pharmacol. – 1984. – V.33. – N.21. – P.3471-3478.

	Snyder S.H. Brain peptides as neurotransmitters // Science. – 1980. – V.209. – P.976-983.

	Soffer R.L., Ei-Dorry H.A. Angiotensin-converting enzyme: immunological, structural and developmental aspects // Federation Proc.-1983.-P.2735-2739

	Stanisz A.M., Scicchitano R., Payan D., Bienestock J. In vitro studies of immunoregulation by substance P and somatostatin / Second Intern. Workshop on NIM: Scientific Programme and Abstracts. – Dubrobnik, 1986. – P.37.

	Stein E.A., Hiller J.M., Simon E.R. Effect of stress on opioid receptor binding in the rat central nervous system // Neurosci. – 1992, Dec. – V.51. – N.3. – P.683-690.

	Steiner D.F. The biosynthesis of biologically active peptides: a perspective / Peptide Biosynthesia and processing /Frisker L.D. (eds.). – CRC Press. – Boca Ration. – Florida, 191. – P.1-16.

	Strittmater S.M., Lynch D.R., Snyder S.H. (3H)guanidinoethyl merkaptosuccinic acid binding to tissue homogenates selective labeling of enkephalin convertase // J. Biol. Chem.- 1984.- 259, №19.- P.11812-11817

	Supattapone S., Frisker L.D., Snyder S.H. Purification and characterization of membranebound enkephalin-forming carboxypeptidase “enkephalin convertase” // J. Neurochem. – 1984. – V.42. – N.4. – P.1017-1023.

	Taub D.D., Eisenstein T.K., Geller E.B., Adler M.W., Rogers T.J. Immunomodulatory activity of mu – and Rappa-selective opioid agonists // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1991, Jan., 15. – V.88. – N.2. 

	Terenius L. Opioid peptides, pain and stress // Prog. Brain Res. – 1992.- 92.-P. 375-383

	Tezapsidis N., Parish D.C. Characterizatoin and partial purificatoin of a novel prohormone processing enzyme from bovine adrenal medulla // FEBS Lett.-1989.-246, №1.-P. 44-48

	Turner A.I. Neuropeptide processing enzymes // Trends. Neurosci.- 1984.-7, №7.- P.258-260

	Van-Giersbergen P.L., Cox-Van-Put J., De-Jong W. Central and peripheral opiate receptors appear to be activated during controlled haemorrhagic hypotension // J. Hypertens. Suppl. – 1989, Dec. – V.7. – N.6. – P.26-27.

	Vernicos-Danellis J., Heyback J.P. Psychophysiologic mechanismus regulating the hypothalamic-pituitary-adrenortical response to stress / Selyes guide to stress research /Eds. Selye H. – New York: Van Nostrand Reinhold Co., 1980. – P.206-251.

	Viel E., Lefrant J.Y., Aya G., Eledjam J.J. Opioids by the perimedullary route: mechanisms of opioid analgesia // Cah. Anesthesiol. – 1991. – V.39. – N.1.

	White J.D., Gall C.M. Proenkephalin is prozessed in a projectionspecific monner in the rat central nervous system // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. Biol. Sci.-1986.- 83, №18.- P. 7099-7103

	Yukimura T., Under T., Rascher W. Central peptidergic stimulation in blood pressure control: role of enkephalins in rats // Clin. Sci.-1981.-61, №7.-P.3475-3505


ПРИЛОЖЕНИЕ



Таблица 1. Активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ у интактных животных (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, М  m, n = 5-6, здесь и в таблицах 2-7: Г - гипофиз, СМ - средний мозг, ГТ – гипоталамус, ГК – гиппокамп, СТ – стриатум, БП – большие полушария, НП – надпочечники, СЕ - семенники)



Отделы мозга, органы

КПН 

ФМСФ – 

ингибируемая КП

АПФ



M±m

M±m

M±m

Г

1,54±0,01

1,36±0,08

0,53±0,06

СМ

0,22±0,02

0,31±0,03

0,05±0,02

ГТ

0,24±0,02

0,33±0,03

0,06±0,01

ГК

0,28±0,03

0,33±0,03

0,01±0,001

СТ

0,18±0,01

0,34±0,03

0,19±0,03

БП

0,18±0,01

0,35±0,02

0,03±0,01

НП

0,1±0,02

1,84±0,1

0,01±0,01

СЕ

0,06±0,01

0,3±0,04

0,53±0,03

	

	Таблица 2. Активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ в мозге и тканях крыс при воздействии острого ЭБС (нМ продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, М±m, n=5, *- p<0,05, **- p<0,01, ***- p<0,001 к норме, здесь и в таблицах 3-7: I – отдел мозга, орган, II – время после начала воздействия)

	

I

II

КПН

ФМСФ-инг. кп

АПФ





норма

ЭБС

норма

ЭБС

норма

ЭБС

Г

0,5 ч.

4 ч.

24 ч.

72 ч.

240 ч.

1,54±0,08

2,2±0,23**

1,87±0,1*

2,02±0,08**

2,37±0,12***

1,39±0,05

1,36±0,07

1,18±0,14

1,26±0,06

1,46±0,06

1,67±0,05**

1,45±0,07

0,53±0,06

0,48±0,03

0,38±0,06**

0,53±0,05

0,58±0,04

0,46±0,04

СМ

0,5 ч.

4 ч.

24 ч.

72 ч.

240 ч.

0,22±0,01



0,23±0,01

0,18±0,01*

0,22±0,01

0,22±0,01

0,21±0,01

0,31±0,02

0,27±0,02

0,29±0,01

0,3±0,02

0,37±0,01*

0,34±0,02

0,05±0,02

0,05±0,01

0,02±0,01

0,02±0,01

0,04±0,01

0,02±0,01

ГТ

0,5 ч.

4 ч.

24 ч.

72 ч.

240 ч.

0,24±0,02

0,28±0,02

0,20±0,01

0,24±0,01

0,27±0,03

0,23±0,02

0,33±0,01

0,31±0,02

0,31±0,01

0,32±0,02

0,4±0,01**

0,34±0,01

0,06±0,01

0,01±0,01

0,03±0,0,1

0,02±0,01

0,04±0,01

0,04±0,01

ГК

0,5 ч.

4 ч.

24 ч.

72 ч.

240 ч.

0,28±0,03

0,26±0,01

0,19±0,01**

0,27±0,01

0,29±0,02

0,25±0,02

0,33±0,02

0,29±0,01

0,32±0,01

0,35±0,03

0,42±0,02**

0,34±0,01

0,01±0,01

0,04±0,02

0,02±0,01

0,01±0,01

0,04±0,01

0,03±0,01

СТ

0,5 ч.

4 ч.

24 ч.

72 ч.

240 ч.

0,18±0,01

0,18±0,02

0,2±0,01

0,26±0,01**

0,24±0,03*

0,18±0,01

0,34±0,03

0,31±0,03

0,33±0,02

0,32±0,01

0,4±0,02

0,34±0,01

0,19±0,02

0,13±0,02

0,15±0,01**

0,15±0,01

0,18±0,02

0,19±0,01

БП

0,5 ч.

4 ч.

24 ч.

72 ч.

240 ч.

0,18±0,02

0,21±0,01

0,18±0,02

0,19±0,01

0,24±0,01*

0,198±0,01

0,35±0,02

0,32±0,01

0,35±0,01

0,34±0,01

0,55±0,01***

0,37±0,03

0,03±0,01

0,02±0,01

0,01±0,00

0,01±0,00

0,02±0,01

0,01±0,00

НП

0,5ч

4ч

24ч

72ч

240ч

0,1±0,02

0,08±0,01

0,06±,002

0,06±0,02

0,09±0,01

0,1±,02

1,84±0,05

1,72±0,09

1,62±0,05*

1,46±0,09**

2,88±0,04**

1,75±0,02

0,01±0,01

0,02±0,01

0,03±0,01

0,02±0,01

0,01±0,01

0,02±0,02

СЕ

0,5ч

4ч

24ч

72ч

240ч

0,06±0,01

0,07±0,01

0,07±0,02

0,07±0,02

0,05±0,01

0,06±0,01

0,3±0,02

0,45±0,01*

0,3±0,01

0,31±0,02

0,27±0,01

0,25±0,02

0,53±0,03

0,59±0,01*

0,45±0,03*

0,47±0,01***

0,41±0,01

0,51±0,02




Таблица 3. Активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ в мозге и тканях крыс при введении лей-энкефалин-арг (нМ продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, М±m, n=5, звездочками показана достоверность: *- p<0,05, **- p<0,01, ***- p<0,001 к норме)



	 I

	II

	КПН

	ФМСФ-инг. КП

	АПФ

	

	

	НОРМА

	ЛЕЙ-ЭНК-АРГ

	НОРМА

	ЛЕЙ-ЭНК-АРГ

	НОРМА

	ЛЕЙ-ЭНК-АРГ

	Г

	0,5ч

	4ч

	24ч

	72ч

	240ч

	1,54±0,01

	

	

	3,89±0,18***

	3,26±0,08***

	2,53±0,14*

	2,74±0,20

	2,80±0,09

	1,36±0,08

	2,72±0,28***

	1,87±0,07**

	1,49±0,09

	1,88±0,23*

	1,72±0,12

	0,53±0,06

	0,83±0,08**

	0,66±0,04**

	0,64±0,07*

	0,53±0,12*

	0,44±0,06*

	СМ

	0,5ч

	4ч

	24ч

	72ч

	240ч

	0,22±0,02

	0,47±0,01***

	0,35±0,01**

	0,30±0,01*

	0,30±0,03*

	0,25±0,01

	0,31±0,03

	0,62±0,03***

	0,54±0,04**

	0,35±0,02

	0,41±0,03*

	0,33±0,01

	0,05±0,02

	0,05±0,02

	0,07±0,04

	0,04±0,01

	0,03±0,01

	0,06±0,01

	ГТ

	0,5ч

	4ч

	24ч

	72ч

	240ч

	0,24±0,02

	0,49±0,02***

	0,36±0,01*

	0,34±0,02*

	0,31±0,01

	0,32±0,01

	0,33±0,03

	0,76±0,03***

	0,50±0,03-*

	0,37±0,02

	0,42±0,01*

	0,39±0,03

	0,06±0,01

	0,11±0,02**

	0,01±0,01

	0,04±0,01

	0,05±0,01

	0,01±0,01

	ГК

	0,5ч

	4ч

	24ч

	72ч

	240ч

	0,28±0,02

	0,57±0,01***

	0,36±0,02*

	0,33±0,02

	0,39±0,02

	0,34±0,02

	0,33±0,02

	

	0,69±0,04***

	0,35±0,02

	0,35±0,03

	0,38±0,02

	0,41±0,01

	0,01±0,0

	0,05±0,03

	0,03±0,01

	0,04±0,01

	0,06±0,02

	0,01±0,01

	СТ

	0,5ч

	4ч

	24ч

	72ч

	240ч

	0,18±0,01

	0,43±0,02***

	0,28±0,01

	0,31±0,01***

	0,31±0,01

	0,25±0,02

	0,34±0,03

	0,64±0,04***

	0,44±0,03

	0,40±0,04

	0,42±0,01

	0,41±0,01

	0,19±0,02

	0,31±0,01***

	0,20±0,01*

	0,17±0,01

	0,18±0,01

	0,17±0,03

	БП

	0,5ч

	4ч

	24ч

	72ч

	240ч

	0,18±0,02

	0,32±0,01***

	0,22±0,01

	0,25±0,01*

	0,24±0,02*

	0,26±0,01

	0,35±0,02

	0,51±0,02***

	0,37±0,02

	0,33±0,02

	0,44±0,02

	0,43±0,02

	0,03±0,01

	0,04±0,01

	0,02±0,01

	0,01±0,01

	0,01±00,1

	0,01±0,01

	НП

	0,5ч

	4ч

	24ч

	72ч

	240ч

	0,1±0,02

	0,25±0,04***

	0,20±0,02***

	0,23±0,01**

	0,18±0,02

	0,12±0,02

	1,84±0,05

	5,24±0,3***

	4,43±0,17***

	2,18±0,03

	2,33±0,11

	2,31±0,08*

	0,01±0,01

	0,04±0,02

	0,01±0,01

	0,03±0,01

	0,01±0,01

	0,02±0,02

	СЕ

	0,5ч

	4ч

	24ч

	72ч

	240ч

	0,06±0,01

	0,12±0,01***

	0,12±0,02***

	0,13±0,02***

	0,12±0,02***

	0,06±0,01

	0,3±0,02

	0,20±0,03*

	0,26±0,01

	0,20±0,06

	0,22±0,02

	0,25±0,02

	0,53±0,02

	1,15±0,16***

	0,78±0,07***

	0,67±0,03***

	0,61±0,03

	0,34±0,03

	

	Таблица 4. Влияние лей-энкефалин-арг на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ in vitro (в % от контроля, контроль 100%)

	

	ОТДЕЛ

	КПН

	ФМСФ-

	ингибир. КП

	АПФ

	Гипофиз

	-27

	-7

	-24

	Большие 

	Полушария

	-13

	-8

	-44

	Надпочечники

	-50

	0

	-100

	

	Таблица 5. Активность КПН при введении лей-энкефалин-арг на фоне острого ЭБС (*- p<0,05, **- p<0,01, ***- p<0,001).

	



I



II



Норма



ЭБС

ЭБС+ лей-энк-арг

К

норме

К 

ЭБС



Г

0,5 ч

4 ч

24 ч

72 ч

240 ч

1,54±0,08

2,2±0,23

1,87±0,1

2,02±0,08

2,37±0,12

1,39±0,05

1,75±0,11

1,74±0,29

1,86±0,13

2,17±0,27

1,36±0,07





*

**



**



СМ

0,5 ч

4ч

24ч

72ч

240ч

0,22±0,01

0,23±0,01

0,18±0,01

0,22±0,01

0,22±0,01

0,21±0,01

0,26±0,02

0,24±0,02

0,19±0,02

0,23±0,02

0,17±0,02





**



ГТ

0,5ч

4ч 

24ч

72ч

240ч

0,24±0,02

0,28±0,02

0,21±0,02

0,24±0,01

0,27±0,03

0,23±0,02

0,27±0,02

0,28±0,01

0,25±0,01

0,23±0,02

0,21±0,01



*









**



ГК

0,5ч

4ч

24ч

72ч

240ч

0,28±0,03

0,26±0,01

0,19±0,01

0,27±0,01

0,29±0,02

0,25±0,02

0,28±0,02

0,31±0,02

0,28±0,02

0,29±0,01

0,24±0,02





**



СТ

0,5ч

4ч

24ч

72ч

240ч

0,18±0,01

0,18±0,02

0,2±0,01

0,26±0,01

0,24±0,03

0,18±0,01

0,23±0,01

0,24±0,02

0,19±0,02

0,25±0,02

0,17±0,01

***

**



**

**

**



БП

0,5ч

4ч

24ч

72ч

240ч

0,18±0,02

0,21±0,01

0,18±0,02

0,19±0,01

0,24±0,01

0,18±0,01

0,22±0,02

0,24±0,02

0,23±0,03

0,21±0,01

0,17±0,01



*



**



НП

0,5ч

4ч

24ч

72ч

240ч

0,1±0,02

0,08±0,01

0,06±0,02

0,06±0,02

0,09±0,01

0,1±0,02

0,08±0,02

0,13±0,03

0,06±0,03

0,13±0,03

0,03±0,01





***



СЕ

0,5ч

4ч

24ч

72ч

240ч

0,06±0,01

0,07±0,01

0,07±0,02

0,07±0,02

0,05±0,01

0,06±0,01

0,09±0,02

0,09±0,01

0,08±0,02

0,07±0,01

0,06±0,01

**

**





	

	
Таблица 6. Активность ФМСФ-ингибируемой КП при введении лей-энкефалин-арг на фоне острого ЭБС (*- p<0,05, **- p<0,01, ***- p<0,001).

	



I



II



Норма



ЭБС

ЭБС+ лей-энк-арг

К 

норме

К 

ЭБС



Г

0,5 ч

4 ч

24 ч

72 ч

240 ч

1,36±0,08

1,18±0,14

1,26±0,06

1,46±0,06

1,67±0,05

1,45±0,07

1,72±0,11

1,25±0,12

1,31±0,12

1,24±0,08

1,39±0,14

*



*





**



СМ

0,5 ч

4ч

24ч

72ч

240ч

0,31±0,02

0,27±0,02

0,29±0,01

0,3±0,02

0,37±0,01

0,34±0,02

0,38±0,03

0,36±0,03

0,31±0,02

0,27±0,01

0,33±0,02



**

*



***



ГТ

0,5ч

4ч 

24ч

72ч

240ч

0,33±0,01

0,31±0,02

0,31±0,01

0,32±0,02

0,4±0,01

0,34±0,01

0,4±0,02

0,43±0,03

0,29±0,02

0,39±0,05

0,33±0,02

*

**

*

**



ГК

0,5ч

4ч

24ч

72ч

240ч

0,33±0,02

0,29±0,01

0,32±0,01

0,35±0,03

0,42±0,02

0,34±0,01

0,4±0,02

0,37±0,03

0,31±0,02

0,38±0,02

0,36±0,03

*

**



СТ

0,5ч

4ч

24ч

72ч

240ч

0,34±0,03

0,31±0,03

0,33±0,02

0,32±0,01

0,4±0,02

0,34±0,01

0,41±0,02

0,37±0,03

0,31±0,02

0,35±0,03

0,33±0,02



*



БП

0,5ч

4ч

24ч

72ч

240ч

0,35±0,02

0,32±0,01

0,35±0,01

0,34±0,01

0,55±0,01

0,37±0,03

0,44±0,03

0,4±0,04

0,33±0,02

0,39±0,02

0,36±0,03

*

**





***



НП

0,5ч

4ч

24ч

72ч

240ч

1,84±0,05

1,72±0,03

1,62±0,05

1,43±0,09

2,88±0,04

1,75±0,02

2,08±0,07

2,02±0,17

1,48±0,05

2,01±0,09

1,81±0,08

*



**

*





**



СЕ

0,5ч

4ч

24ч

72ч

240ч

0,3±0,02

	0,36±0,01

	0,3±0,01

	0,31±0,02

	0,27±0,01

	0,25±0,02

0,27±0,03

0,41±0,03

0,37±0,02

0,39±0,01

0,38±0,03



**

*

**

*



**

*

**

	

	Таблица 7. Активность АПФ при введении лей-энкефалин-арг на фоне острого ЭБС (*- p<0,05, **- p<0,01, ***- p<0,001 ).

	



I



II



Норма



ЭБС

ЭБС+ лей-энк-арг

К 

норме

К 

ЭБС



Г

0,5ч

4ч

24ч

72ч

240ч

0,53±0,06

0,48±0,03

0,38±0,06

0,53±0,03

0,58±0,04

0,46±0,04

0,66±0,1

0,41±0,06

0,72±0,06

0,71±0,06

0,4±0,08





*





***



СМ

0,5ч

4ч

24ч

72ч

240ч

0,05±0,02



0,04±0,01

0,05±0,01

0,05±0,01

0,04±0,01

0,05±001

0,06±0,01

0,05±0,01

0,06±0,01

0,05±0,01

0,05±0,01







ГТ

0,5ч

4ч

24ч

72ч

240ч

0,06±0,01

0,05±0,02

0,05±0,01

0,06±0,01

0,05±0,01

0,05±0,01

0,04±0,02

0,,5±0,01

0,05±0,01

0,06±0,01

0,06±0,01







ГК

0,5ч

4ч

24ч

72ч

240ч

0,01±0,01

0,02±0,01

0,01±0,01

0,01±0,01

0,02±0,01

0,01±0,01

0,01±0,01

0,03±0,02

0,02±0,01

0,01±0,01

0,01±0,01







СТ

0,5ч

4ч

24ч

72ч

240ч

0,19±0,02

0,16±0,03

0,13±0,01

0,15±0,01

0,18±0,02

0,19±0,01

0,17±0,01

0,18±0,01

0,15±0,02

0,22±0,02

0,16±0,03





*



БП



0,5 ч

4 ч

24 ч

72 ч

240 ч

0,03±0,01



0,02±0,01

0,02±0,01

0,03±0,01

0,03±0,01

0,03±0,01

0,02±0,01

0,03±0,01

0,03±0,01

0,02±0,01

0,03±0,01







НП

0,5ч

4ч

24ч

72ч

240ч

0,01±0,01

0,01±0,01

0,01±0,01

0,02±0,01

0,01±0,01

0,02±0,01

0,01±0,01

0,02±0,01

0,02±0,01

0,01±0,01

0,01±0,01







СЕ

0,5ч

4ч

24ч

72ч

240ч

0,53±0,02

0,61±0,01

0,45±0,03

0,47±0,01

0,41±0,01

0,51±0,02

0,41±0,04

0,59±0,05

0,58±0,02

0,58±0,04

0,47±0,03



*

**

**

**