Влияние алкогольной интоксикации на активность основных карбоксипептидаз в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла

1



1



ПЕНЗЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ В. Г. БЕЛИНСКОГО



На правах рукописи

Сметанин Владимир Анатольевич









ВЛИЯНИЕ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ НА АКТИВНОСТЬ ОСНОВНЫХ КАРБОКСИПЕПТИДАЗ В ТКАНЯХ САМОК КРЫС НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ ЭСТРАЛЬНОГО ЦИКЛА





03.00.04 – Биохимия



Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор биологических наук профессор Генгин М.Т.







ПЕНЗА 2004


СОДЕРЖАНИЕ



	СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ………………………………………………............5

	ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………..6

	ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………..........10

	1.1. Биологическая роль нейропептидов и их обмен………………………….10

1.2. Функционирование пептидэргических систем на разных стадиях эстрального цикла………………………………………………………………..12

1.2.1. Уровень нейропептидов на разных стадиях эстрального цикла…………………………………………………………………………......12

1.2.2. Ферменты обмена нейропептидов на разных стадиях эстрального цикла……………………………………………………………………………...17

	1.3. Этанол и его влияние на пептидэргические системы…………………….21

	1.3.1. Влияние этанола на уровень нейропептидов в организме…..................21

1.3.2. Влияние этанола на активность ферментов обмена нейропептидов………………………………………………………….….……29

	1.4. Карбоксипептидаза Н………………………………………………...........32

	1.5. ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза…………………………..……35

	1.6. Карбоксипептидаза М…………………………………………….…...........37

	ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ………………..…39

	2.1. Материалы исследования…………………………………………..............39

	Методы исследования……………………………………………………………......40

	2.2.1. Метод определения активности карбоксипептидазы Н и карбоксипептидазы М……………………………………………………............40

	2.2.2. Метод определения активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы…………………………………………………………..…..41

	2.2.3. Статистическая обработка результатов исследования………………….…42

	2.3. Схема эксперимента………………………………………………………....43

	ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ…………………………........44

3.1. ИССЛЕДОВАНИЕ АКТИВНОСТИ ОСНОВНЫХ КАРБОКСИПЕПТИДАЗ В ТКАНЯХ САМОК КРЫС НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ ЭСТРАЛЬНОГО ЦИКЛА………………………………………….44

3.1.1. Изучение активности карбоксипептидазы Н в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла……………………………………............44

	а) Распределение активности карбоксипептидазы Н в тканях интактных самок крыс…………………………………………………………………..……44

 б) Активность карбоксипептидазы Н при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самок …………………………………..45

 в) Исследование активности карбоксипептидазы Н при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самок крыс………………………………………...48

3.1.2. Изучение активности ФМСФ-КП в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла……………………………………………………..59

а) Распределение активности ФМСФ-КП в тканях интактных самок крыс………………………………………………………………………………59

б) Активность ФМСФ-КП при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самок ………………………………….60

в) Исследование активности ФМСФ-КП при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самок крыс……………………………………………………62

3.1.3. Активность карбоксипептидазы М в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла……………………………………………….……74

а) Определение активности карбоксипептидазы М у интактных самок крыс………………………………………………………………………………74

б) Активность карбоксипептидазы М при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самок …………….…………………..75

в) Исследование активности карбоксипептидазы М при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самок крыс……………………………………….76

3.2. ИССЛЕДОВАНИЕ АКТИВНОСТИ ОСНОВНЫХ КАРБОКСИПЕПТИДАЗ В ТКАНЯХ САМЦОВ КРЫС …………………….81

	3.2.1. Изучение активности карбоксипептидазы Н в тканях самцов крыс…81

а) Распределение активности карбоксипептидазы Н в тканях интактных самцов крыс………………………………………………………………………81

 б) Активность карбоксипептидазы Н при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самцов………………………………….82

 в) Исследование активности карбоксипептидазы Н при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самцов крыс……………………………………….84

	3.2.2. Изучение активности ФМСФ-КП в тканях самцов крыс……………..91

а) Распределение активности ФМСФ-КП в тканях интактных самцов крыс……………………………………………………………………………….91

б) Активность ФМСФ-КП при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самцов………………………………….92

в) Исследование активности ФМСФ-КП при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самцов крыс…………………………………………………..94

	3.2.3. Активность карбоксипептидазы М в тканях самцов крыс……………100

а) Определение активности карбоксипептидазы М у интактных самцов крыс……………………………………………………………………………...100

б) Активность карбоксипептидазы М при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самцов…………….…………………..100

в) Исследование активности карбоксипептидазы М при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самцов крыс……………………………………...101

	ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ…………..105

	ВЫВОДЫ……………………………………………………………………….133

	ЛИТЕРАТУРА…………………………………………………………….........135


СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ



АКТГ – адренокортикотропный гормон 

АПМЯК – аминопропилмеркаптоянтарная кислота

АПФ – ангиотензинпревращающий фермент

ГГГС – гипоталамо-гипофизарно-гонадная система

ГГНГС – гипоталамо-гипофизарно-надпочечниково-гонадная система

ГГНС – гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система

ГРФ – гонадотропин-рилизинг-фактор

ГПЯК – гуанидинопропилянтарная кислота

ГЭМЯК – гуанидиноэтилмеркаптоянтарная кислота

ДСИП – дельта-сон-индуцирующий пептид

КПА – карбоксипептидаза А

КПВ – карбоксипептидаза В

КПН – карбоксипептидаза Н

КПM – карбоксипептидаза M

КПN – карбоксипептидаза N

ЛГ – лютеинизирующий гормон

ЛКПА – лизосомальная карбоксипептидаза А

ЛКПВ – лизосомальная карбоксипептидаза В

ПОМК – проопиомеланокортин

ПХМБ – п-хлормеркурийбензоат 

ПХМФС - п-хлормеркурийфенилсульфонат

ФМСФ – фенилметилсульфонилфторид

ФМСФ-КП – фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая 

карбоксипептидаза

ФСГ – фолликулостимулирующий гормон

ЭПР – эндоплазматический ретикулум

ЭДТА – этилендиаминтетраацетат натрия

ВВЕДЕНИЕ



Проблема алкоголизма, особенно женского, является крайне актуальной для человечества, как с социальной, так и с медицинской точки зрения. Клинические наблюдения указывают на то, что под действием этанола в организме женщины возникают существенные изменения в эндокринной системе, что сопровождается нарушениями половой функции [2, 81].

При алкоголизме существенно меняется уровень целого ряда нейропептидов, многие из которых играют существенную роль в этиологии и патогенезе данного заболевания [19, 61, 74, 88]. Изменение уровня биологически активных пептидов при алкогольной интоксикации во многом определяется ферментами их обмена, к которым, в частности, относятся карбоксипептидаза Н, фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая кар-боксипептидаза и карбоксипептидаза М – основные карбоксипептидазы, катализирующие отщепление остатков аргинина и лизина с С-конца пептидов [28, 41, 144, 212].

Интерес к этим ферментам вызван тем, что они участвуют в процессинге, модуляции и инактивации биологически активных пептидов [28, 41, 144]. В связи с тем, что нейропептиды выполняют функции нейромедиаторов, нейромодуляторов и гормонов, они участвуют в регуляции практически всех функций организма, в том числе и в регуляции функционирования полового цикла [11, 72], а также вовлекаются в развитие многих патологических состояний, среди которых для современной биологии и медицины особую значимость представляет алкоголизм [19, 74, 88]. Прогресс в изучении природы этого заболевания неотделим от понимания нейробиологических процессов, лежащих в его основе [80]. В этой связи представляется очень важным исследование активности основных карбоксипептидаз при острой алкогольной интоксикации. Чем глубже будут наши представления об энзимопатологии, о роли протеолитических ферментов в гомеостазе, тем более целенаправленным будет поиск лекарственных средств для лечения алкоголизма среди регуляторов активности ферментов.

Одним из важных аспектов проблемы алкоголизма является исследование нарушений, происходящих в организме женских особей при алкогольной интоксикации. Однако при этом необходим учет особенностей женского организма, связанных с наличием полового цикла, который сопровождается комплексом физиологических, биохимических и других изменений, происходящих во всем организме. В ходе эстрального цикла наблюдаются значительные изменения в функционировании пептидэргических систем [11], что, несомненно, связано с изменением активности ферментов участвующих в обмене биологически активных пептидов [28, 41] и в свою очередь, вероятно, определяет особенности ответной реакции женского организма на острую алкогольную интоксикацию на разных стадиях эстрального цикла [101, 164].

Кроме того, известно, что некоторые аспекты проявления острой алкогольной интоксикации определяются в значительной степени полом. Предполагают, что это связано с различиями в гормональном статусе самцов и самок [44]. Различный уровень нейропептидов, определяемый активностью ферментов их обмена, у особей разного пола приводит к появлению отличий в количестве потребляемого этанола, в скорости развития зависимости, а также появлению различий в течение алкогольной интоксикации у особей противоположного пола [5, 19, 64, 65].

Изучение активности карбоксипептидазо-В-подобных ферментов при острой алкогольной интоксикации может способствовать уточнению биологической роли этих ферментов, а также выяснению механизмов функционирования пептидэргических систем при данном патологическом состоянии.

Целью нашей работы было изучение активности основных карбоксипептидаз (карбоксипептидазы Н, фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы и карбоксипептидазы М) в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла при острой алкогольной интоксикации.

При выполнении работы были поставлены следующие задачи:

Изучить активность исследуемых карбоксипептидаз на разных стадиях эстрального цикла в тканях интактных самок крыс.

Исследовать активность карбоксипептидазы Н, фенилметил-сульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы и карбокси-пептидазы М у самок крыс на разных стадиях эстрального цикла при введении этанола через различные промежутки времени. 

Сравнить активность исследуемых ферментов у самцов и самок при острой алкогольной интоксикации.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые изучено влияние острой алкогольной интоксикации на активность карбоксипептидазы Н, фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы и карбоксипептидазы Н в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла. Для определения половых отличий в течении и развитии алкогольной интоксикации исследована активность этих ферментов в тканях самцов крыс. Установлена зависимость изменения активности исследуемых ферментов от стадии эстрального цикла, пола, дозы этанола и времени после его введения. Полученные результаты представляют интерес для понимания механизмов функционирования пептидэргических систем и проясняют роль основных карбоксипептидаз в норме, а также при алкогольной интоксикации и могут быть использованы для разработки эффективных методов профилактики и лечения алкоголизма, нарушений полового цикла и бесплодия.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научных конференциях Российской Академии Естествознания (Россия, Дагомыс, октябрь 2003 г. и Египет, Хургада, февраль 2004 г.) и на итоговых научных конференциях ПГПУ (2002, 2003 гг.). По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из 6 разделов: введение, обзор литературы по теме диссертации, материалы и методы исследований, результаты, обсуждение, выводы. Работа изложена на 162 страницах, иллюстрирована 6 рисунками, 21 таблицей и 2 схемами. Список литературы содержит 268 наименований на русском и иностранных языках.


ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ



1.1. Биологическая роль нейропептидов и их обмен.



Важное место в химической передаче информации занимают нейропептиды [72]. Многие из нейропептидов выполняют функции нейромедиаторов, нейромодуляторов, гормонов, факторов роста [9, 51, 77, 139, 164].

Вероятно, именно биологически активным пептидам принадлежит важная роль в интеграции функциональных систем организма, обеспечении их слаженной работы в изменяющихся условиях окружающей среды. Они играют ключевую роль в регуляции полового цикла, деятельности иммунной системы, в морфогенезе, участвуют в формировании поведенческих реакций, в процессах обучения, механизмах консолидации памяти, влияют на половую дифференциацию [8, 11, 60, 70, 72, 210], вовлекаются в развитие и патогенез многих психических и неврологических расстройств, в том числе и алкоголизма. Так, например, у особей исходно склонных к развитию алкоголизма, выявлен центральный (тотальный или региональный) дефицит нейропептидов, функция которых связана с активацией системы положительного подкрепления (с эйфоризирующим, антистрессорным, анксиолитическим действием). Одновременно отмечается увеличение содержания нейропептидов, активирующих систему негативного подкрепления (проконвульсанты, пептиды, индуцирующие страх, агрессию, дисфорию). Как правило, однократное введение этанола, особенно в низких, анксиолитических дозах, нивелирует эти диспропорции, с чем, очевидно, и связано развитие влечения к этанолу, особенно у предрасположенных к алкоголизму индивидуумов[15, 19, 62, 80].

По современным представлениям функционирование конкретного регуляторного пептида связывается с местом его образования, высвобождения и наличия соответствующих рецепторов [52, 53, 54, 69]. Таким образом, для понимания механизмов действия нейропептидов существенным моментом является изучение их образования и деградации.

Большинство биологически активных пептидов синтезируется в составе высокомолекулярных неактивных предшественников – препробелков, которые подвергаются посттрансляционной модификации различного типа [75, 114, 181, 256]. Секретируемые белково-пептидные продукты синтезируются на мембраносвязанных рибосомах ЭПР [156, 256]. Благодаря наличию на N-конце препроформы нейропептида набора гидрофобных аминокислот, так называемой сигнальной последовательности, предшественник транслоцируется через мембрану ЭПР. Внутри ЭПР сигнальная последовательность отщепляется от полипептидной цепи сигнальной пептидазой. Далее процессинг осуществляется в ходе передвижения молекул пропептидов по гранулярному ЭПР, комплексу Гольджи и в секреторных везикулах [29, 256]. 

Сначала под действием эндопептидаз, расщепляющих нейропептиды по синглетным и дуплетным остаткам основных аминокислот, (фурин, РС1/3, РС2, РС4 [242], проопиомеланокортин-превращающий фермент [193, 194], тиоловая прогормонконвертаза [96, 97], динорфин-превращающий фермент [129] и др.) образуются неактивные пептиды [1, 29, 72], содержащие, как правило, “лишние” N- или, в основном, С-концевые остатки аминокислот. Удаление этих аминокислот в секреторных везикулах осуществляется соответственно аминопептидазо-В-подобным(и) [41, 156] и карбоксипептидазо-В-подобным(и) ферментами [27, 29, 41, 144, 145].

Таким образом, уровень биологически активных пептидов в организме в значительной степени определяется активностью ферментов их обмена.

Основным карбоксипептидазам как ферментам, участвующим в конечных стадиях образования и начальных стадиях деградации, принадлежит важная роль в регуляции уровня нейропептидов в организме. В связи с этим, большой интерес представляет изучение активности основных карбоксипептидаз в норме и при различных физиологических и патологических состояниях организма, сопровождающихся изменением содержания биологически активных пептидов.



1.2. Функционирование пептидэргических систем на разных стадиях эстрального цикла



1.2.1. Уровень нейропептидов на разных стадиях эстрального цикла

Большой интерес представляет изучение гормонального статуса организма в разных физиологических состояниях, в том числе в ходе эстрального цикла. В регуляции полового цикла ключевую роль играют пептидные гормоны гипофиза и гипоталамуса: ГРФ, ЛГ, ФСГ, пролактин [57, 58, 57, 82, 84, 265], а также многие нейропептиды, основные функции которых не связаны с половой системой: энкефалины [182], эндорфины, АКТГ [264], вещество Р [224] и др. Установлено, что уровень многих нейропептидов изменяется в зависимости от стадии эстрального цикла [11].

Так у крыс в преоптической области гипоталамуса самая высокая концентрация люлиберина отмечается в диэструсе, самая низкая – в эструсе, в ходе проэструса она имеет промежуточное значение. В медиобазальном гипоталамусе концентрация люлиберина возрастает от диэструса к проэструсу, затем содержание нейропептида уменьшается, происходит овуляция и наступает эструс [11]. 

В плазме крови в течение цикла концентрация люлиберина изменяется незначительно. Существенные изменения прослеживаются только в проэструсе, когда концентрация люлиберина увеличивается почти в 1,5 раза. Концентрации ФСГ и ЛГ в крови крыс на стадии диэструса остаются практически постоянными и только в проэструсе концентрации гормонов увеличиваются в несколько раз, а с началом эструса уменьшаются до исходной величины [11]. Сходная динамика изменения содержания в плазме крови ФСГ и ЛГ прослеживается у свиней [185].

В ходе эстрального цикла меняется уровень не только ГРФ и гонадотропных гормонов, но и содержание других нейропептидов, в том числе опиоидных. 

Так в перивентрикулярном и вентромедиальном ядрах гипоталамуса овец происходит существенное сокращение количества образующегося проэнкефалина в фолликулярную стадию и во время преовуляторного выброса ЛГ по сравнению с лютеальной стадией [263]. В антеровентрикулярных и перивентрикулярных ядрах преоптической области гипоталамуса в проэструсе происходит снижение уровня мРНК проэнкефалина относительно диэструса [246]. По другим данным уровень мРНК проэнкефалина в медиобазальном гипоталамусе крыс значительно увеличивался в проэструсе, оставался высоким до первого дня диэструса и возвращался к исходному уровню во второй день диэструса. Эти изменения были специфичны для вентромедиальных и вентролатеральных ядер гипоталамуса, в то время как в дорсомедиальных и аркуатных ядрах гипоталамуса такие изменения не наблюдались [155].

Уровень мРНК проэнкефалина значительно меняется в течение эстрального цикла в яичниках и матке (в 3-6 раз). Самая высокая концентрация мРНК проэнкефалина в яичниках крысы наблюдалась в эструсе, а в матке – в метаэструсе и диэструсе. В отличие от мРНК проэнкефалина мРНК ПОМК оставалась на одном уровне в ходе эстрального цикла и в яичниках, и в матке [174].

В нейронах антеровентрикулярного и паравентрикулярного ядер преоптической области самый низкий уровень мРНК продинорфина наблюдается на стадии проэструса [246].

Уровень иммунореактивного леуморфина в гипоталамусе и аденогипофизе крыс значительно выше в проэструсе, чем в эструсе и метаэструсе. Увеличение концентрации иммунореактивного леуморфина в проэструсе коррелирует с выраженностью полового поведения в течение эстрального цикла. Уровень иммунореактивного леуморфина не изменялся в гиппокампе и нейрогипофизе в ходе эстрального цикла [257]. 

Во время эстрального цикла меняется не только уровень экспрессии самих опиоидных пептидов, но и их рецепторов [162, 219]. Так плотность и характер распределения μ-рецепторов в медиальной преоптической области гипоталамуса существенно изменялись в ходе эстрального цикла. Высокая концентрация μ-рецепторов наблюдалась в центральной части медиальной преоптической области в метаэструсе и диэструсе. Обнаружено также, что в этой части мозга плотность и распределение μ-рецепторов зависят как от стадии эстрального цикла, так и от пола животного. Интересно отметить, что для κ-рецепторов такой закономерности не обнаружено [162]. Однако в работе [219] указывается на наличие изменений в ходе эстрального цикла и на отсутствие половых различий в распределении и плотности [3Н][D-ала,D-лей-5]-энкефалин-связывающих δ-рецепторов в мозге хомяков. Эти данные указывают, на то что, скорее всего эндогенные и экзогенные опиоидные пептиды оказывают свое влияние на репродуктивную функцию через μ- и κ-рецепторы, но не через δ-рецепторы [219].

Результаты многих работ указывают на то, что содержание эндогенных опиоидов и их рецепторов находится под влиянием стероидных половых гормонов [162, 163].

После внутрибрюшинного введения прогестерона овариоэктомированным крысам увеличивалось количество μ-опиатных рецепторов в медиальной преоптической области, кроме того возрастало содержание мРНК ПОМК в нейронах, иннервирующих эту часть мозга [163]. В другой работе указывается, что увеличение количества μ-рецепторов в медиальной преоптической области гипоталамуса крыс происходит только в случае совместного введения эстрадиола и прогестерона [202].

У овариоэктомированных мышей уменьшалась плотность μ-опиатных рецепторов в вентролатеральной преоптической области. Однако, если у мышей с удаленными яичниками проводилась заместительная терапия половыми стероидными гормонами, то отличий в распределении μ-опиатных рецепторов в мозге по сравнению с интактными животными не наблюдалось [176].

Такое вызванное гормонами изменение плотности μ-рецепторов в преоптической области, вероятно, может влиять на физиологические эффекты, вызванные опиоидными пептидами, по отношению к секреции гонадотропинов и репродуктивному поведению самок крыс [202].

В яичниках крысы и хомяка 17-β-эстрадиол и прогестерон не влияли на уровень мРНК проэнкефалина. Однако прогестерон увеличивал синтез мРНК проэнкефалина в яичнике в 2-3 раза в случае предварительной обработки животных эстрадиолом [211].

В матке крысы и хомяка эстрадиол не оказывал значительного влияния на транскрипцию мРНК проэнкефалина, но при действии прогестерона уровень транскрипции, а также содержание проэнкефалина увеличивались. Глюкокортикоиды и андрогены оказывали действие, сходное с прогестероном. Интересно, что эстрадиол оказывал различное воздействие на экспрессию мРНК проэнкефалина, стимулированную прогестероном у крыс и хомяков. У крыс эстрадиол подавлял экспрессию мРНК проэнкефалина, а у хомяков два гормона действовали синергично, повысив в 15-16 раз содержание мРНК проэнкефалина [211].

Эти результаты указывают на существование обратной положительной связи между опиоидными пептидами, которые действуют через μ-рецепторы и половыми стероидными гормонами, что представляется важным компонентом в сложных регуляторных процессах, которые управляют воспроизводством [176, 202].

В ходе эстрального цикла меняется уровень не только опиоидных, но и других нейропептидов. Так наиболее высокий уровень окситоцина в плазме крови крыс наблюдается в проэструсе. Содержание этого гормона уменьшалось в паравентрикулярных и супраоптических ядрах в проэструсе и эструсе по сравнению с диэструсом и увеличивалось в нейрогипофизе в проэструсе по отношению к эструсу и диэструсу [106].

Концентрация брадикинина, а также мРНК β2-рецепторов брадикинина и самих рецепторов в матке свиньи была наибольшей в эструсе. В матке крыс наибольшее количество β2-рецепторов кинина обнаружено в конце проэструса и эструсе [141].

Обнаружены циклические изменения в концентрации рецепторов ангиотензина II в яичниках: более высокое содержание рецепторов было в эструсе, по сравнению с диэструсом [240].

Циклические изменения уровня гонадотропных гормонов гипофиза по механизму обратной связи приводит к изменениям уровня половых стероидных гормонов. Так, известно, что уровень эстрогенов увеличивается в фолликулярную стадию цикла, достигая максимума, как правило, к середине проэструса, и к началу эструса уровень эстрадиола приближается к уровню, характерному для диэструса. В начале цикла отмечается сравнительно низкая концентрация прогестерона, однако в середине к началу пика ЛГ наблюдается увеличение концентрации прогестерона в плазме крови, после чего его концентрация снижается, но остается более высокой на стадии эструса по сравнению с диэструсом [12, 17, 45].

В регуляцию эстрального цикла помимо гонадотропных гормонов гипофиза, половых стероидных гормонов, опиодных пептидов вовлекаются и другие нейромедиаторные системы. Так, норадреналинэргические нейроны играют значительную роль в стимуляции секреции ЛГ, вызванной кастрацией или эстрогенным возбуждением циклического центра. Дофамин способен стимулировать высвобождение ЛГ за счет активного влияния на нейроны аркуатной области. Серотонинэргические нейроны могут выступать в роли как тормозящих, так и стимулирующих выделение ЛГ факторов [46].

Таким образом, в ходе эстрального цикла происходит изменение уровня гонадотропных гормонов, а также нейропептидов, основная функция которых не связана с половой системой. Интересно отметить, что энкефалины, β-эндорфин, вазопрессин и половые стероидные гормоны, уровень которых определяется гонадотропными гормонами, влияют на формирование и поддержание влечения к этанолу, развитие зависимости и толерантности [19, 74, 88]. Поэтому кажется вполне вероятным, что у самок крыс на разных стадиях эстрального цикла могут наблюдаться отличия в развитии и течении алкогольной интоксикации [5], которые отчасти связаны с функциональными особенностями ферментов, принимающих участие в обмене нейропептидов.



1.2.2. Ферменты обмена нейропептидов на разных стадиях эстрального цикла

В ходе эстрального цикла наблюдаются изменения в уровне регуляторных пептидов, эти изменения связаны с перестройками в функционировании ферментных систем, участвующих в их синтезе и деградации [28, 41]. В связи с этим представляется интересным изучение активности ферментов обмена нейропептидов в ходе эстрального цикла в норме и при различных патологических состояниях, в том числе при острой алкогольной интоксикации.

De Gandarias и соавт. обнаружили, что активность растворимой формы тирозинаминопептидазы существенно увеличивается в гипоталамусе крысы в проэструсе по сравнению с другими стадиями. Активность мембраносвязанной формы не изменялась во всех изученных отделах мозга. Однако было обнаружено значительное повышение активности мембраносвязанной пуромицин-нечувствительной активности в гипоталамусе и гипофизе в проэструсе [126]. При исследовании фронтальной, париетальной, окципитальной коры, обонятельных луковиц, таламуса, гипоталамуса, гиппокампа, амигдалы, стриатума и гипофиза было обнаружено, что лизин- и лейцин-аминопептидазная активность в гипоталамо-гипофизарной системе наиболее высокая в проэструсе; лей-аминопептидазная активность возрастала также и в окципитальной коре. В других исследованных отделах мозга активность фермента не подвергалась изменениям в ходе эстрального цикла [124, 125, 126]. Отмечается, что аргинин-аминопептидазная активность повышалась во всех изученных отделах мозга крысы в проэструсе, относительно диэструса и эструса [128]. Активность аспартатаминопептидазы не изменялась в течение эстрального цикла во всех исследованных отделах мозга [124, 127]. В ходе эстрального цикла наиболее высокий уровень сывороточной окситоциназы у мышей отмечен в диэструсе по сравнению с эструсом и проэструсом [203].

Инъекция 17-β-эстрадиола приводила к умеренному увеличению активности цистеинариламидазы независимо от стадии цикла и эндогенного уровня гормонов. Самая значительная активация фермента в гипоталамусе в ответ на применение прогестерона происходила в такие периоды цикла, когда содержание эндогенного прогестерона было низким. При введении внутрь желудочков головного мозга ЛГ или простогландина Е2 во время различных стадий цикла максимальное увеличение активности наблюдалось в диэструсе. По мнению авторов, цистеинариламидаза, вероятно, играет модулирующую роль в регуляции тонической секреции ЛГ в течение эстрального цикла, но, очевидно, не влияет на ациклическую секрецию ЛГ [187].

Уровень активности пролилэндопептидазы и эндопептидазы-24.15 существенно не изменялся в ходе эстрального цикла, хотя наблюдалась тенденция к снижению пролилэндопептидазной активности во время преовуляторного пика ЛГ. Снижение активности пролилэндопептидазы наблюдалось у овариоэктомированных овец, у которых повышение концентрации ЛГ было вызвано экзогенными эстрогенами по сравнению с контрольной группой овец. Эти данные свидетельствуют о возможном наличии отрицательной обратной связи между активностью пролилэндопептидазы и уровнем эстрадиола. Возможно, что подобная связь существует и между активностью эндопептидазы-24.15 и гонадными стероидными гормонами, так как после овариоэктомии активность фермента в аденогипофизе, медиальных и латеральных преоптических ядрах увеличивалась [105]. Введение ингибитора эндопептидазы-24.15 – N-[1(R,S)-карбокси-3-фенилпролил]-ала-ала-тир-п-аминобензоата не влияло на секрецию ЛГ. Кроме того, введение ингибиторов пролилэндопептидазы – бацитрацина или более специфичного – Z-пропролинала также не вызывало изменений в секреции ЛГ [190]. 

Обнаружено, что в ГГНС системе мышей экзогенные тестостерон и прогестерон вызывали, в основном, снижение активности КПН и ФМСФ-КП. Изменение активности исследуемых ферментов при введении половых стероидных гормонов зависели от пола животного и времени после инъекции и, практически, не зависели от дозы вводимого гормона. Наиболее существенное изменение активности КПН и ФМСФ-КП при введении тестостерона и прогестерона выявлено в гипофизе и половых железах у животных обоего пола. Минимальное влияние половых стероидных гормонов на активность ферментов обнаружено в гипоталамусе [78, 256]. 

Пептидгидролазная активность, способная инактивировать ГРФ, в гипоталамусе была понижена в проэструсе и в первый день диэструса по сравнению с другими стадиями эстрального цикла крыс. Уменьшение такой активности в проэструсе по мнению авторов способствует накоплению ГРФ и ЛГ перед преовуляторным пиком этих гормонов. Сниженная пептидазная активность в гипофизе в первый день диэструса возможно уменьшает деградацию синтезирующихся в нем рецепторов ГРФ, которые синтезируются до проэструса [216].

Общее количество АПФ не изменяется в яичниках крыс в течение эстрального цикла. Растущие и атретические фолликулы характеризуются высоким уровнем АПФ, хотя в преовуляторных фолликулах АПФ либо отсутствует, либо его уровень очень низок. Возможно, что АПФ участвует в ранних стадиях фолликулярного созревания и атрезии [121]. Активность мембраносвязанной формы АПФ в матке крупного рогатого скота значительно выше в диэструсе, чем в эструсе [239]. Активность АПФ в фаллопиевых трубах свиньи была выше в ампулярной части, чем в перешейке независимо от стадии эстрального цикла. В свою очередь, в перешейке фаллопиевых труб наблюдались периодические изменения активности АПФ в ходе цикла: в эструсе и метаэструсе активность была выше, чем в проэструсе [138]. Высокий уровень экспрессии мРНК и высокая активность АПФ обнаружены в конце секреторной фазы в эндометрии матки человека. Предполагается важная роль АПФ в инициации менструации [191].

Высокая концентрация проренина обнаружена в фолликулах яичника человека в середине менструального цикла. У кошек общее количество ренина в яичниках было самым низким в анэструсе, увеличивалось в эструсе и становилось еще большим в период овуляции [235]. Активность плазматического ренина у крыс была увеличена в эструсе по сравнению с проэструсом и диэструсом [130]. Но такие изменения не наблюдались, если крысы были овариоэктомированы. При совместной обработке эстрадиолом и прогестероном таких крыс содержание проренина изменялось подобно тому, как оно менялось в эстральном цикле у интактных животных [130].

Экспрессия мРНК пролилолигопептидазы и активность этого фермента в яичниках крыс увеличивается в лютеальную фазу, что позволяет предположить наличие связи олигопептидазы с формированием и/или регрессией желтого тела [184]. КПМ не обнаруживается в гранулярных клетках растущих и незрелых фолликулов, но появляется в больших количествах на поверхности гранулярных клеток, обработанных лютеинизирующим гормоном, и во время овуляции; обнаруживается в клетках жёлтого тела во время менструации и на ранних стадиях беременности [267].

Таким образом, протеолитическим ферментам, вероятно, принадлежит важная роль в регуляции уровня биологически активных пептидов в организме, а также в различных физиологических процессах, связанных с функцией размножения.

1.3. Этанол и его влияние на пептидэргические системы



1.3.1. Влияние этанола на уровень нейропептидов в организме

Острая и хроническая алкогольная интоксикация приводит к изменению уровня и/или соотношения уровней многих нейропептидов, что можно рассматривать в качестве одного из первичных патогенетических факторов алкоголизма [88, 186].

Изменение эндогенной опиатной системы у экспериментальных животных при однократном и хроническом контакте с этанолом показано в ряде работ. Однако вследствие использования в них неидентичных фармакологических моделей и антисывороток различной специфичности результаты этих исследований не отличаются однородностью. Так K. Blum описал снижение суммарного содержания энкефалинов и позднее лей-энкефалина в базальных ганглиях мозга золотистых хомячков после добровольного потребления этанола в течение года [102]. В то же время другие авторы не выявили каких-либо изменений в уровне мет-энкефалина в гипоталамусе и лей-энкефалина в стриатуме, гипоталамусе и коре мозга после острого и хронического введения этанола [110, 236]. В то же время указывается на значительное повышение уровня мет-энкефалина в стриатуме в результате однократной инъекции этанола в дозе 2,5 г/кг и выраженное снижение содержания этого пептида в стриатуме, в суммарном препарате продолговатого мозга и моста, в среднем мозге после 4-недельного принудительного введения 20% этанола [241].

Эти данные нашли свое подтверждение в работах Seizinger и соавт., исследовавших региональный уровень α-неоэндорфина, динорфина и мет-энкефалина в мозге крыс после хронического введения этанола в виде компонента жидкой диеты. Такой вид алкоголизации вызывал резкое снижение содержания мет-энкефалина в стриатуме и гипоталамусе, но уровень пептида в среднем мозге и гиппокампе оставался неизменным. Иммунореактивность динорфина и α-неоэндорфина уменьшалась более чем на 50% в гипоталамусе и гиппокампе, но не изменялась в среднем мозге, стриатуме, аденогипофизе и нейроинтермедиальной его доле [243]. Параллельность изменений динорфина и α-неоэндорфина, очевидно, обусловлена наличием у них общего предшественника (проэнкефалина В), в то время как мет-энкефалин является дериватом другого пептида – проэнкефалина А [72, 166].

Стабильное содержание динорфин/α-неоэндорфина в стриатуме в условиях алкоголизации гарантирует и поддерживает нормальную продукцию лей-энкефалина. Неизменный уровень лей-энкефалина на фоне сниженного содержания мет-энкефалина демонстрирует дезинтегрирующие свойства этанола на центральные энкефалинэргические системы мозга. Вероятно, алкоголизация снижает скорость биогенеза мет-энкефалина и увеличивает интенсивность его ферментативной деградации [19, 165].

Большинство исследователей указывают на отсутствие изменений или незначительное снижение иммунореактивности β-эндорфина в гипофизе крыс после однократной инъекции этанола [241, 243]. Однако Gianoulakis и соавт. отмечают значительное снижение β-эндорфин подобной иммунореактивности в аденогипофизе, но не в нейропромежуточной доле [159].

Небольшое уменьшение гипофизарного пула β-эндорфина и повышение его в гипоталамусе на 30% после 14 дней потребления 10% раствора этанола в качестве единственного источника жидкости обнаружили Cheng и соавт.[110], а при употреблении крысами 20% раствора уровень β-эндорфина в промежуточной доле гипофиза крыс снижался более чем на 70% [241]. Повышение уровня β-эндорфина в гипоталамусе после однократной инъекции этанола и снижение его при хроническом потреблении позволяет предположить участие гипоталамических эндорфинэргических путей в реализации эмоциогенных эффектов этанола, причем дифференцированность этой реакции может быть расценена как проявление эмоционально позитивных (острое введение) и эмоционально негативных (хроническое введение) свойств этанола [19].

При однократном введении крысам 20% раствора этанола внутрибрюшинно в дозе 4 г/кг в надпочечниках уже через 15 минут происходило снижение уровня мет-энкефалина, через 1 час после введения этанола величина этого показателя существенно превышала контрольный уровень, а через два часа соответствовала контрольным значениям. В плазме крови животных сразу же после инъекции этанола наблюдалось некоторое повышение концентрации мет-энкефалина, но через 2 часа уровень его был достоверно ниже по сравнению с контролем. Авторы приходят к выводу, что в действии этанола на метаболизм энкефалинов в системе надпочечники – кровь можно выделить 2 фазы: первая характеризуется усиленным высвобождением мет-энкефалина из надпочечников в кровь на фоне неизменной скорости образования пептида, вторая – угнетением высвобождения мет-энкефалина на фоне сначала усиленного, а затем пониженного его образования в ткани надпочечников [15].

Острая алкогольная интоксикация приводила к значительному повышению [94, 159, 222, 261], а хроническая – к уменьшению уровня плазматического β-эндорфина у крыс [94, 104]. 

Уровень мРНК ПОМК в гипоталамусе крыс возрастал при хронической алкоголизации [95] и значительно уменьшался в случае острой алкогольной интоксикации [268]. 

Хроническая алкоголизация крыс повышает скорость синтеза de novo ПОМК и пептидов, связанных с β-эндорфином, в промежуточной доле и в аденогипофизе. Несмотря на это, отношение β-эндорфина, определяемого при помощи моноклональных антител к суммарному β-эндорфину + β-ЛПГ резко снижено в передней доле [243]. 

Считается, что пул биологически активного β-эндорфина уменьшается в обеих долях гипофиза алкоголизированных крыс, но за счет различных механизмов: в аденогипофизе путем замедления энзиматического образования β-эндорфина из предшественника интермедиата β-ЛПГ, а в промежуточной доле – за счет усиления инактивационных преобразований [243]. 

Острая алкогольная интоксикация самок овариоэктомированных крыс приводит к значительному уменьшению содержания β-эндорфина и мет-энкефалина в гипоталамусе. К тем же результатам приводит подкожное введение эстрадиола. Совместное введение этанола и эстрадиола способствует снижению уровня мет-энкефалина в гипоталамусе и увеличению уровня этого пептида в среднем мозге и гиппокампе, коре больших полушарий. Уровень β-эндорфина в этих условиях понижался в гипоталамусе и среднем мозге. Приведенные результаты показывают, что эстрадиол может значительно модифицировать ответную реакцию опиоидэргической системы на действие этанола [107].

В реестре эндокринопатий, вызываемых введением этанола, первое место занимает поражение ГГГС [19]. Однако литературные данные, касающиеся уровня гонадотропных гормонов при алкогольной интоксикации, достаточно противоречивы. Так, отмечено, что единичный прием спирта в дозе 0,5-1,5 г/кг массы тела повышал концентрацию ЛГ в крови мужчин [135, 207], не изменял ее [86, 135] или снижал [86]. Аналогичные результаты получены для женщин [135, 208]. Более детально влияние этанола на ГГГС исследовано на животных [108]. У них обнаружена четкая связь между дозой вводимого этанола и степенью снижения концентрации ЛГ. В ряде опытов после однократной инъекции зафиксировано уменьшение этого показателя практически до неизмеримой величины [86].

Острая алкогольная интоксикация крыс в проэструсе отменяет преовуляторный пик ЛГ и овуляцию за счет подавления активности ядер гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию ГРФ, что в свою очередь приводит к снижению концентрации ГРФ в проэструсе. Экзогенное введение ГРФ крысам, подвергшихся острой алкогольной интоксикации, вызывало увеличение секреции ЛГ и овуляцию [179].

Инъекция этанола крысам в дозе 0,5-3 г/кг приводила к значительному снижению плазматического уровня ЛГ, причем у самок эти изменения были выражены сильнее, чем у самцов [231]. В то же время уровень ФСГ у опытных животных достоверно не отличался по сравнению с контрольными [231].

Самки крыс, у которых секреция ЛГ была стимулирована кастрацией или введением налоксона, этанол вызывает значительное снижение концентрации гормона в плазме крови. Депрессивный эффект этанола по отношению к гонадотропинам у кастрированных крыс снимается введением ГРФ [115].

Наиболее вероятно, что эффект реализуется в гипоталамусе, так как однократное введение этанола не изменяет ответа на ГРФ у здоровых добровольцев и животных [189]. Нормальный ответ может быть достигнут даже при очень высоких дозах спирта [248]. Все эти данные, а также прямое измерение концентрации ГРФ в портальной крови гипофиза после введения этанола подтверждает тезис о том, что в данной экспериментальной ситуации нарушается функция гипоталамуса [123]. Снижение высвобождения ГРФ при острой алкогольной интоксикации определяется, вероятно, наличием опиодной активности у этанола [207].

Однако в работе, проведенной на самках макак-резусов, было показано, что при острой алкогольной интоксикации уровень ФСГ в плазме крови не изменяется в ответ на введение синтетического аналога ГРФ. Вероятно, за счет этого этанол нарушает нормальное созревание фолликулов яичника, приводит к неадекватному протеканию послеовуляторной фазы цикла или ановуляции, что часто наблюдается у женщин с алкогольной зависимостью и у животных со смоделированным алкоголизмом [206].

К изменениям в функционировании ГГГС приводит и хроническая алкогольная интоксикация. Повышенное содержание пролактина отмечено практически у всех больных алкоголизмом и у здоровых мужчин после острого введения этанола [66, 67, 206], сходные данные получены относительно самок крыс [257].

В сравнении с контрольной группой у мужчин с хронической интоксикацией алкоголем выявлено понижение содержания ФСГ [67] и ЛГ [135] в плазме крови, по другим данным содержание ЛГ достоверно не отличается от контрольной группы [66].

У самцов крыс после хронической алкогольной интоксикации уровень ФСГ и ЛГ в плазме крови более чем в 2 раза снижался по сравнению с контрольными животными, в то время как в гипофизе уровень этих гормонов был сходен с контролем [238], у самок крыс в этих условиях наблюдалось уменьшение уровня ЛГ, при неизменном уровне ФСГ [257]. 

Однократное поступление алкоголя в организм сопровождается повышением активности ГГНС: усиливается образование катехоламинов [88], КРФ [80], β-эндорфина [94, 159, 222, 261], кортикостероидов [80, 230]. Эффект, вероятно, реализуется на самых высоких уровнях регуляции этой оси, так как снимается гипофизэктомией или введением антисыворотки к КРФ и обусловлен в значительной мере специфической мембранотропной активностью этанола [86], что подтверждается экспериментами in vitro. Этанол дозозависимо увеличивал освобождение АКТГ из суперфузируемых аденогипофизов мыши и фрагментов аденогипофизов крысы [228]. При этом отмечено снижение чувствительности рецепторов к КРФ, что можно трактовать как дополнительный стимул к секреции этого фактора in vivo. In vitro этанол влияет и на продукцию КРФ гипоталамусом, причем в концентрациях, соответствующих содержанию этилового спирта в тканях in vivo. Эффективны также дозы на порядок выше [227, 228]. Интересно отметить, что секреция гипофизом АКТГ в ответ на различные дозы этанола была многофазной и включала в себя 3 пика. Так как АКТГ и β-эндорфин выделяются обычно совместно, можно предположить, что β-эндорфин, подобно АКТГ, имеет волнообразную динамику секреции. Вероятно, это может частично объяснить несогласованность результатов различных лабораторий относительно влияния этанола на уровень β-эндорфина [158].

При острой алкогольной интоксикации, а также на ранних стадиях развития алкоголизма наблюдается увеличение уровня плазматического АКТГ у людей и животных [158, 230]. Причем у самок секретируется больше АКТГ и кортикостероидов, чем у самцов в ответ на одинаковую дозу этанола [217]. Кроме того, ответ ГГНС на алкоголь был меньше у интактых самцов по сравнению и с другими феминизированными группами (гонадэктомированными самцами и самками). У самок крыс при острой алкогольной интоксикации более высокая концентрация АКТГ и кортикостероидов в плазме крови наблюдается в течение проэструса и эструса по сравнению с диэструсом [230].

Однако длительная гиперфункция ГНС при значительных сроках алкоголизации сменяется у большинства особей снижением содержания АКТГ и кортикостероидов в плазме крови, что связано с истощением ГНС [232]. Так у крыс, с хронической алкогольной интоксикацией, концентрация АКТГ в плазме крови составляла примерно половину от контрольного уровня [191].

Хроническое потребление этанола животными (в течение 7 недель) снижало уровень нейропептида Y, обладающего анксиолитическими свойствами, в гипоталамусе [136, 137, 173, 252]. Однократное введение этанола в дозе 1г/кг внутрибрюшинно приводило к увеличению содержания ДСИП в стриатуме [22], таламусе [22, 93] и среднем мозге [22]. Увеличение дозы этанола приводило к снижению эффекта. Хроническое введение этанола изменяет как синтез ДСИП в мозге, так и поражает системы, через которые он реализует свое действие синхронизатора биоритмов [22]. Острая алкогольная интоксикация приводит к подъему уровня гастрина и снижению уровня инсулина в крови. В случае хронической алкогольной интоксикации наблюдалось повышение уровня гастрина, нейротензина, вещества Р и снижение уровня инсулина, соматотропного гормона, окситоцина, вазопрессина в плазме крови [3, 4]. 

Однако не стоит забывать, что алкогольная интоксикация воздействует не только на пептидэргическую систему, но и вызывает дисфункции в других нейромедиаторных системах: дофаминовой, серотониновой, ГАМК-ергической, холинергической и др.[19, 80, 88].

Так большинство исследователей склоняются к мысли о том, что под влиянием однократного введения этанола кругооборот дофамина и серотонина в мозгу ускоряется. Исследования в области прижизненной визуализации мозга показали увеличение концентрации дофамина в мозговой системе “вознаграждения”. Ряд авторов считает, что изменения дофаминовой нейромедиации является основным звеном формирования алкогольной зависимости [80, 88].

Алкоголь вызывает повышение активности главной тормозящей системы мозга – ГАМКэргической. Доказано, что этанол влияет на комплекс рецептор ГАМКА/хлорный канал, вызывая значительное повышение входа Cl- внутрь клетки. Замечено, что стероидные гормоны способны оказывать модулирующее влияние на функцию ГАМКА, что может объяснить некоторые половые различия в молекулярных эффектах этанола [80, 88, 120].

Этанол специфически и селективно изменяет синаптическое действие глутамата – основного возбуждающего нейротрансмиттера мозга. Алкоголь в концентрации 0,03% ингибирует поток ионов через NMDA – рецептор в культуре нервных ткани [80]. Этанол вызывает дозозависимое угнетение высвобождения ацетилхолина в различных структурах мозга in vitro и in vivo, а также торможение вхождения ионов Na+ в клетку. Холинэргические синапсы коры мозга более устойчивы к действию этанола, чем синапсы подкорковых структур. При посмертном исследовании мозга алкоголиков найден сниженный уровень норадреналина в различных структурах мозга. У животных потребление этанола повышает уровень активности норадренэргических нейронов [80]. 

Таким образом, алкоголь модифицирует деятельность всех эндокринных желез, что приводит к качественным и количественным изменениям метаболизма многих нейромедиаторов [8, 19, 62]. Однако стоит отметить, что данные об уровне различных нейромедиаторов весьма противоречивы, что, вероятно, связано с особенностями проведения эксперимента. 



1.3.2. Влияние этанола на активность ферментов обмена нейропептидов

Под влиянием этанола отмечаются нарушения в функционировании ферментных систем, в том числе тех, которые участвуют в образовании и инактивации нейропептидов [26, 31, 36]. Последние в свою очередь напрямую или опосредованно могут влиять на предпочтение к этанолу, развитие толерантности, а также вовлекаются в ответную реакцию организма на алкогольную интоксикацию. Поэтому очень важным представляется исследование активности ферментов обмена нейропептидов при алкогольной интоксикации.

Mayas и соавт. изучено влияние этанола на активность аминопептидаз синаптосом головного мозга мышей in vitro. Под действием этилового спирта дозозависимо ингибировалась аланинаминопептидаза; активность аргинин-, цистеин-, лейцин-, тирозинаминопептидазы под действием малых доз этанола увеличивалась, большие дозы оказывали противоположный эффект. Инкубация синаптосом в среде 25 мМ К+ в присутствии этанола приводит к ингибированию всех исследованных аминопептидаз [205].

При хронической алкогольной интоксикации содержание мРНК АПФ и нейтральной эндопептидазы заметно уменьшается в мозге мышей [265]. Имеются данные о том, что активность нейтральной эндопептидазы в сыворотке крови людей коррелирует с количеством потребляемого алкоголя [142], выявлено увеличение активности ренина в плазме крови у лиц в состоянии алкогольного опьянения [63]. Активность катепсина А и D у людей с острой алкогольной интоксикацией не изменялась по сравнению с контролем, в то время как она увеличивалась в сыворотке у хронических алкоголиков [178].

Хроническое потребление этанола самцами крыс приводит к снижению активности АПФ в гипофизе, гипоталамусе и стриатуме, что может способствовать повышению уровня опиоидных и стресс-пептидов [31]. Острая алкогольная интоксикация ведет к изменению активности КПN в сыворотке крови крыс, причем эти изменения зависят от дозы вводимого этанола. При остром и хроническом потреблении этанола животными наблюдается достоверное повышение активности энкефалиназы А в стриатуме, гипоталамусе и среднем мозге. Авторами работы высказывается предположение, что нарушения деградации энкефалинов играют ключевую роль в реализации действия этанола на энкефалинэргическую систему мозга [76].

Через 6 часов после внутрибрюшинного введения этанола в дозе 1г/кг происходило повышение активности КПН в гипофизе, гипоталамусе, среднем мозге и стриатуме. В сером веществе и гиппокампе активность фермента не изменялась. Введение этанола в дозе 4 г/кг вызывало повышение активности фермента в гипофизе, гипоталамусе и сером веществе; в среднем мозге и стриатуме активность не изменялась [26]. В другой работе указывается, что у самцов крыс, которым вводили внутрибрюшинно этанол в дозе 4 г/кг через 3 и 6 часов после его введения отмечено повышение удельной активности энкефалинконвертазы в коре мозга и среднем мозге; в гиппокампе изменения активности фермента носили синусоидальный характер [14]. Хроническое потребление этанола вызывало снижение активности КПН в гипофизе [25, 26], гипоталамусе [26], стриатуме [26, 36], коре мозга и среднем мозге [14]. Во всех исследованных отделах активность мембраносвязанной формы изменялась более значительно, чем растворимой, что, вероятно, связано с мембранотропным эффектом этанола [256].

Достоверные изменения активности КПМ при хроническом потреблении этанола выявлены в гиппокампе, где активность КПМ увеличивается, но снижается в больших полушариях, не обнаружено достоверных отличий в активности фермента в гипоталамусе, стриатуме и четверохолмии [36]. Хроническая алкоголизация существенно влияла на активность ФМСФ-КП: активность фермента повышалась в гипоталамусе, стриатуме, четверохолмии, то есть тех отделах головного мозга, в которых при алкоголизации наблюдаются наиболее существенные изменения уровня энкефалинов и некоторых других нейропептидов. Активность ФМСФ-КП при хронической алкогольной интоксикации осталась на прежнем уровне в гиппокампе и больших полушариях [36]. 

Интересные данные о влиянии внутрибрюшинного введения самцам крыс физиологического раствора на активность ферментов обмена нейропептидов приводятся в работе Вернигоры и соавт. [38]. Ими обнаружено повышение активности КПН в гипофизе и стриатуме, АПФ в гипофизе и сыворотке крови, КПN в сыворотке. Эти ферменты участвуют в обмене целого ряда НП, поэтому внутрибрюшинное введение физраствора может приводить к значительным изменениям в функционировании пептидэргических систем. Причем эти изменения затрагивают стресс-систему, опиоидэргическую и ангиотензин-брадикининовую систему. Поэтому при проведении острых экспериментов необходимо рассматривать все наблюдаемые явления с учетом изменений, вызванных внутрибрюшинной инъекцией [38]. В ряде работ указывается, что, по-видимому, КПН, КПN и АПФ вовлекаются в реализацию стресс-протективного действия этанола [26, 40].

Таким образом, этанол вызывает изменение активности ряда протеолитических ферментов. Это, в свою очередь, ведет к изменению уровня многих регуляторных пептидов, что можно рассматривать как один из патогенетических факторов алкоголизма.


1.4. Карбоксипептидаза H (КФ 3.4.17.10)



КПH (КПE, энкефалинконвертаза) впервые выделена и охарактеризована Fricker и Snyder из хромаффинных гранул надпочечников быка, как фермент, образующий энкефалины из их предшественников [152]. Позднее фермент был выделен и очищен из мозга [34, 153, 154], гипофиза [153, 154], островков Лангерганса поджелудочной железы [122, 133, 161, 198]. Фермент, выделенный из разных тканей разных видов животных, имеет очень близкие физико-химические и каталитические свойства. 

КПH является одноцепочечным гликопротеином и существует как в растворимой, так и в связанной с мембранами формах [34, 122, 197]. Существуют две формы мембраносвязанной КПH, отличающиеся по прочности связывания с мембранами. Одна из этих форм экстрагируется из мембран при pH 5,6 1 M раствором NaCl, вторая – только при совместном воздействии 1 M NaCl и 1% Тритона X-100 [147, 258].

Фермент синтезируется в виде неактивного зимогена с Mr 75000 [209], который превращается в активную форму под действием трипсиноподобных ферментов в ходе созревания секреторных везикул [140, 161]. Сначала образуется неактивная форма с Mr 65000 [168, 169], которая превращается в активные формы с Mr 52000 - 53000 и 55000 - 57000 [140, 161, 220]. Отличия в Mr этих форм не связаны с различиями в степени гликозилирования [161, 220, 221]. Форма с Mr 55000 - 57000 отличается от формы с Mr 52000 - 53000 наличием N-концевого сигнального пептида [220]. Обе формы существуют и в растворимом, и в связанном с мембранами виде [161, 140]. Активность растворимой формы фермента в расчёте на молекулу фермента выше, чем мембраносвязанной [143, 147]. Соотношение между растворимой и мембраносвязанной формами изменяется по мере созревания секреторных везикул [171]. За связывание фермента с мембранами отвечает C-концевая амфифильная последовательность, которая присутствует только у мембраносвязанной формы [147]. Она состоит из 21 остатка чередующихся гидрофобных и гидрофильных аминокислот. В аминокислотной последовательности КПH обнаружен также Ca2+-связывающий участок [213], но ионы Ca2+ влияют не на активность, а на стабильность, агрегацию и способность к связыванию с мембранами [255].

КПН проявляет максимальную активность при рН 5,5-6,0, что соответствует рН внутри секреторных везикул и является тиолзависимым металлоферментом, в активном центре которого находится ион Zn2+ [149, 153]. Данный фермент сильно (примерно в 5-10 раз) активируется ионами Со2+, в меньшей степени (в 2-3 раза) – ионами Ni2+, ингибируется ионами Сd2+ и Cu2+, хелатирующими агентами: ЭДТА, о-фенантролином, при применении которых активность фермента восстанавливается добавлением ионов Zn2+. Фермент также ингибируется реагентами на сульфгидрильные группы: ПХМФС, ПХМБ, N-этилмалеимидом и органическими кислотами, содержащими амино- или гуанидиновую группу: ГЭМЯК, ГПЯК, АПМЯК, АПЯГ, МГТК. Наиболее эффективными ингибиторами являются ГЭМЯК и ГПЯК с Кi 8,8 и 7,5 нМ соответственно.

ФМСФ, 2-меркаптоэтанол, а также ионы Мg2+ и Mn2+ не влияют на активность КПН [149, 152, 153, 167, 258].

КПH отщепляет остатки аргинина и лизина с C-конца синтетических и природных пептидов. Скорость отщепления остатков аргинина в несколько раз больше, чем остатков лизина. Остатки гистидина отщепляются с очень маленькой скоростью, по сравнению с остатками лизина. Остатки ароматических аминокислот не отщепляются. Скорость расщепления субстратов зависит от предшествующего аминокислотного остатка. Скорость расщепления дансил-фен-ала-арг на порядок выше, чем скорость расщепления дансил-фен-гли-арг, дансил-фен-лей-арг и дансил-фен-иле-арг [167, 172, 234, 254].

Локализация фермента в целом соответствует распределению биологически активных пептидов и их предшественников [50, 144, 145]. Наиболее высокая активность КПH обнаружена в аденогипофизе, хромаффинных гранулах надпочечников [152, 153, 154] и островках Лангерганса поджелудочной железы [122, 161]. Более низкая (примерно на порядок) активность фермента обнаруживается в задней доле гипофиза [172, 177], гипоталамусе, стриатуме, гиппокампе, среднем мозге, коре больших полушарий [89]. Наиболее низкая активность КПH обнаружена в стволовой части головного мозга, спинном мозге, легких, сердце, желудочно-кишечном тракте, печени и почках. Установлено, что КПH ассоциирована со структурными элементами ЭПР, комплекса Гольджи и секреторными везикулами, где протекает процессинг предшественников различных биологически активных пептидов [144]. Фермент обнаружен в секреторных везикулах, содержащих энкефалины [196], атриальный натрийуретический фактор [197], глюкагон [161, 218], инсулин [122, 133], АКТГ [134, 201], пролактин [150], вещество P [111], вазопрессин и окситоцин [214, 234] и другие регуляторные пептиды. Различные ингибиторы и активаторы секреции координировано регулируют выделение КПH и энкефалинов [151, 170], АКТГ [182, 183, 201], пролактина [150], вазопрессина [103, 200] и инсулина [160].

Физико-химические свойства, субстратная специфичность, тканевая, клеточная и субклеточная локализация, особенности изменения активности фермента при различных фармакологических воздействиях на культуры клеток, нарушение синтеза нейропептидов у мышей с дефектной КПН свидетельствуют о том, что исследуемый фермент вовлекается в процессинг многих биологически активных пептидов, таких как энкефалины, АКТГ, -эндорфин, вазопрессин, окситоцин, нейротензин, меланоцитстимулирующий гормон, вещество Р и др. 

Показано, что КПН вовлекается в определение агрессивности [52], предрасположенности к потреблению этанола[56], в развитие физической зависимости от этанола[14, 49, 52, 55], в ответ на различные стрессирующие воздействия [30, 33, 48, 52], введение стероидных гормонов in vivo [39], имеются данные о наличии половых различий в активности фермента [78].

1.5. ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза



В 1995 г. Вернигора и соавт. обнаружили в растворимой фракции серого вещества головного мозга кошки основную КП, активность которой полностью подавляется ФМСФ [42].

Фермент, по результатам гель-фильтрации, имеет Мr 100000; проявляет максимальную активность при рН 6,0-6,5, но сохраняет 40-45% активности при рН 5,5. Фермент полностью ингибировался ФМСФ и ПХМБ, примерно на 40% ингибировался иодацетамидом. ЭДТА, 2-меркаптоэтанол, N-этилмалеимид, ионы Co2+ и ГЭМЯК не влияли на его активность. Фермент почти в 2 раза активировался 50 мМ NaCl, несколько слабее – NaBr, KCl и KJ. Повышение концентрации NaCl не приводило к увеличению степени активации фермента [42, 47].

Согласно данным тонкослойной хроматографии частично очищенный фермент отщеплял аргинин от лей5-энкефалин-арг6 и дансил-фен-лей-арг с образованием лей5-энкефалин и дансил-фен-лей соответственно. Более глубокого гидролиза субстратов не наблюдалось. Фермент также не расщеплял субстрат КПA – карбобензокси-гли-лей [42, 47]. Таким образом, по субстратной специфичности ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза сходна с ЛКПB. Вместе с тем физико-химические свойства фермента (ингибирование ФМСФ, нечувствительность к ЭДТА, ГЭМЯК и ионам Co2+) отличают его от ЛКПB [1, 192]. Ингибирование фермента ФМСФ позволяет предположить, что он является сериновой карбоксипептидазой. В тканях млекопитающих обнаружены две сериновые карбоксипептидазы – ЛКПА (КФ 3.4.16.1, катепсин A, лизосомальная карбоксипептидаза L) и карбоксипептидаза C (КФ 3.4.12.4, ангиотензиназа C, пролилкарбоксипептидаза). Но ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза отличатся от карбоксипептидазы C по молекулярной массе и субстратной специфичности [226, 249]. 

В то же время, ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза имеет сходные с ЛКПA молекулярную массу, оптимум pH, ингибиторный профиль, но отличается от последней по субстратной специфичности и тканевой локализации [204, 226].

Активность ФМСФ-ингибируемой КП обнаружена во всех отделах мозга и в большинстве тканей, за исключением почек, в которых присутствуют лишь следы ее активности. Наибольшая активность фермента отмечается в надпочечниках, примерно на 40% ниже - в гипофизе, в печени и селезенке его активность составляет примерно 30-35% от активности в гипофизе. В семенниках активность ФМСФ-ингибируемой КП примерно в 2,5 раза ниже, чем в надпочечниках. В отделах мозга активность фермента примерно в 2-3 раза ниже, чем в гипофизе. Наиболее высокая активность ФМСФ-ингибируемой КП в мозге обнаруживается в обонятельных луковицах, наиболее низкая - в четверохолмии и гиппокампе [35]. 

Обращает на себя внимание тот факт, что сродство обнаруженного фермента к дансил-фен-лей-арг (Кm гидролиза – 48 мкМ), выше, чем сродство КПН (Кm гидролиза – 96 мкМ). Это позволяет предположить, что энкефалин-лей5-арг6 может быть лучшим субстратом для ФМСФ-ингибируемой КП, чем для КПН. ФМСФ-КП проявляет существенную активность при значениях рН, соответствующих таковому внутри секреторных везикул. Таким образом, возможно, что обнаруженный фермент вовлекается в процессинг нейропептидов, в частности энкефалин-лей5-арг6, тем более, что в литературе имеются данные о том, что региональное распределение КПН и энкефалинов не всегда соответствует друг другу [75].

ФМСФ-КП вовлекается в развитие алкогольной зависимости [36, 37], в ответ на различные стрессирующие воздействия [13], обнаружены половые различия в активности ФМСФ-КП, причем у самок активность фермента во многих тканях выше, чем у самцов [44, 91, 139].


1.6. Карбоксипептидаза M (КФ 3.4.17.2)



Карбоксипептидаза M представляет собой мембраносвязанный одноцепочечный гликопротеин с молекулярной массой 62 кДа, заякоренный в плазматической мембране при помощи остатка гликозил-фосфатидилинозитола [123, 248]. Обработка трипсином и фосфолипазой C приводит к удалению гидрофобного хвоста и высвобождению фермента из клеточной мембраны [121, 250].

Высвобождение КПM из плазматической мембраны происходит и in vivo, поскольку фермент обнаружен в различных биологических жидкостях, в частности в моче и амниотической жидкости [250].

При химическом дегликозилировании образуется полипептид с Mr 48000, который состоит из 439 аминокислотных остатков [245, 251]. Аминокислотная последовательность фермента на 41% идентична КПN и КПH, на 15% - КПB и КПA. Многие остатки активного центра идентичны таковым КПA и КПB, но перекрёстной реакции с антисыворотками к другим КП фермент не даёт [251, 260]. 

Фермент отщепляет остатки только основных аминокислот, при отсутствии ионов Co2+ предпочтительней отщепляет аргинин, а в присутствии Co2+ - лизин. Эстеразная активность фермента значительно выше, чем пептидазная [123, 248]. КПM проявляет максимальную активность при pH 7,0, ионы Co2+ повышают активность фермента в 1,5-2 раза, причём степень активации возрастает при снижении pH [123]. Активность КПM подавляется ионами Cd2+, о-фенантролином, МГТК и ГЭМЯК [123, 248].

ПХМФС, HgCl2, дитиотреитол, ФМСФ, апротинин, каптоприл и фосфорамидон не влияют на активность фермента [123, 248]. 

Фермент локализован преимущественно в плаценте, почках, эндотелиальных клетках кровеносных сосудов, обнаружен в периферической нервной системе и головном мозге[123, 212]. 

КПМ in vitro отщепляет С-концевые остатки основных аминокислот от динорфина А 1-13, мет-энкефалин-арг6, мет-энкефалин-лиз6, лей-энкефалин-арг6, брадикинина [1, 123, 248,], фактора роста эпидермиса [175], образует интактные кинины и анафилотоксины С3а, С4а, С5а [223]. Предполагают, что фермент может инактивировать или модулировать пептидные гормоны перед или после взаимодействия последних с рецепторами [28]. 

Стоит отметить, что если физико-химические свойства КПН, ФМСФ-КП и КПМ изучены достаточно хорошо, то биологическая роль данных ферментов, в том числе их участие в различных физиологических и патологических процессах исследованы значительно хуже. Поэтому представляется весьма интересным изучение их активности при различных процессах в организме, в том числе при острой алкогольной интоксикации.


ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ



2.1. Материалы исследования



Опыты проводили на самках и самцах белых беспородных крыс массой 150-200 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария.

В работе использовали четыре группы животных. У самок крыс определяли стадию эстрального цикла по влагалищному мазку [59], при цитологическом исследовании которого животных разделяли на три группы. Животные первой группы находились в стадии диэструса, второй – в стадии проэструса, третьей – в стадии эструса, четвертую группу составляли самцы. Каждую из четырех групп разбивали на четыре подгруппы: первая – интактная. Животным второй подгруппы внутрибрюшинно вводили 5% раствор этанола, в дозе 1 г на кг веса тела, а животным третьей – 20% раствор этанола в дозе 4 г на кг веса. Животным четвертой подгруппы вводили внутрибрюшинно эквивалентное количество физиологического раствора. Животных декапитировали через 0,5 часа, 4часа и 18 часов после инъекции. Декапитацию самок крыс в стадии проэструса проводили только через 0,5 часа и 4 часа после инъекции, так как продолжительность данной стадии эстрального цикла около 12 часов. Затем извлекали гипофиз, гипоталамус, стриатум, надпочечники и половые железы. Ткани помещали в предварительно охлажденный физиологический раствор, очищали от кровеносных сосудов и оболочек, высушивали фильтровальной бумагой.

Для определения активности ферментов ткани взвешивали, а затем гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в 10 мМ натрий-ацетатном буфере (рН 5,6), содержащем 50 мМ NaCl в соотношении 1:100 (вес:объем) для отделов мозга, надпочечников и яичников, 1:50 для семенников.

В качестве специфических ингибиторов применяли ФМСФ (“Serva”, США) и ГЭМЯК (любезно предоставлена доктором О.Л. Варламовым). Субстраты дансил-фен-ала-арг, дансил-фен-лей-арг были синтезированы к.х.н. В.Н. Калихевичем. Для внутрибрюшинных инъекций применялся дважды перегнанный медицинский спирт. В работе использовали ацетат натрия (“Merck”, Германия), трис-НСl (“Serva”, США), все остальные реактивы были отечественного производства с квалификацией ”ХЧ” и ”ОСЧ”.



2.2. Методы исследования



2.2.1. Метод определения активности карбоксипептидазы Н и карбоксипептидазы М

Активность КПН определяли модифицированным методом Fricker и Snyder [153]. 

Для определения активности КПН 50 мкл гомогената ткани добавляли к 150 мкл (в случае опытной пробы) 50 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 5,6, содержащего 50 мМ NaCl или к смеси 140 мкл вышеуказанного буфера и 10 мкл 25 мкМ водного раствора ингибитора ГЭМЯК (в случае контрольной пробы). Для определения активности КПМ делали также, с той лишь разницей, что в качестве буфера использовали 200 мМ трис-НCl, рН 7,4. Далее пробы преинкубировали 8 минут при 37˚С. Реакцию начинали прибавлением 50 мкл предварительно нагретого до 37˚С 210 мкМ раствора дансил-фен-ала-арг, приготовленного на воде (конечная концентрация в реакционной смеси 42 мкМ). Пробы инкубировали 60 минут при 37˚С. Реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1М раствора HCl.

Для экстракции продукта реакции дансил-фен-ала к пробам приливали по 1,5 мл хлороформа, интенсивно встряхивали в течение 60 с. Хлороформную и водную фазы разделяли центрифугированием в течение 10 минут при 1000об/мин.

Флюоресценцию хлороформной фазы измеряли на флюориметре ФМЦ-2 при λex=360 нм и λem=530 нм в кювете толщиной 1 см. В качестве стандарта использовали 1 мкМ раствор дансил-фен-ала в хлороформе.

Активность фермента определяли как разность прироста флюоресценции в пробах, не содержащих и содержащих ГЭМЯК, и выражали в нмоль дансил-фен-ала, образовавшегося за 1 минуту инкубации в пересчете на 1 мг белка.



2.2.2. Метод определения активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы

Активность ФМСФ-КП определяли флюориметрически [42] с использованием дансил-фен-лей-арг в качестве субстрата.

В контрольные пробы вносили 140 мкл 50 мМ натрий-ацетатного буфера, содержащего 50 мМ NaCl, pH 5,6, 50 мкл препарата фермента и 10 мкл 25 мМ ФМСФ, приготовленного на этаноле. ФМСФ вносили в реакционную смесь после внесения препарата фермента. Опытные пробы содержали 150 мкл указанного буфера и 50 мкл препарата фермента. Пробы преинкубировали 8 мин при 37oC, затем вносили 50 мкл предварительно нагретого до 37oC 210 мкМ раствора дансил-фен-лей-арг, приготовленного на воде. Далее пробы обрабатывали как описано для КПH и КПМ. В качестве стандарта использовали 1 мкМ раствор дансил-фен-лей в хлороформе.

Активность фермента определяли как разницу прироста флюоресценции в пробах, не содержащих и содержащих ФМСФ и выражали в нмоль дансил-фен-лей, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.

Количество белка в пробах определяли по методу Lowry и соавт. [195].



2.2.3. Статистическая обработка результатов исследования

Достоверность отличий между средними определяли с использованием t-критерия Стьюдента [68]. Корреляционный и дисперсионный анализы проводили с помощью программы Statgraphics (версия 3.0) (“STSC, Inc.” США) в режимах Simple Correlation, One-Way ANOVA и Multifactor ANOVA. Принадлежность подгрупп животных к разным гомогенным группам оценивали с помощью Multiple range analysis (Statgraphics (версия 3.0) (“STSC, Inc.” США)). Принадлежность экспериментальных (временных) подгрупп к разным гомогенным группам проводили только в случае достоверности критерия Фишера. При этом оценивали количество гомогенных групп, образуемых экспериментальными подгруппами, с уровнем достоверности р<0,05. Баллы подгруппам присваивали на основании их принадлежности к разным гомогенным группам по мере увеличения среднего. При этом минимальный балл получала временная подгруппа с минимальным средним, максимальный балл – временная подгруппа с максимальным средним, а дробный балл получали подгруппы, входящие одновременно в две гомогенные группы. На основании присвоенных баллов судили о динамике изменения активности ферментов.



2.3. Схема эксперимента



Самки



Самцы

Определение стадии эстрального цикла



Диэструс

Проэструс

Эструс



норма

контроль

этанол

норма

контроль

Этанол

норма

контроль

Этанол

норма

контроль

этанол





1г/кг

4г/кг





1г/кг

4г/кг





1г/кг

4г/кг





1г/кг

4г/кг



Забой животных через 0,5, 4 и 18 часов после воздействия



Определение активности КПН, ФМСФ-КП и КПМ


3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ



3.1. Исследование активности основных карбоксипептидаз в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла



3.1.1. Изучение активности карбоксипептидазы Н в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла

а) Распределение активности карбоксипептидазы Н 

в тканях интактных самок крыс 

Результаты исследований показали, что в зависимости от стадии эстрального цикла меняется активность КПН в гипофизе, гипоталамусе, стриатуме и яичниках (табл.1).

Разные стадии эстрального цикла могут быть расположены по мере убывания активности КПН в гипофизе в ряд: проэструс-эструс-диэструс. 

Таблица 1. Активность КПН на разных стадиях эстрального цикла в норме (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, Mm, n=68).



Отдел

Стадия эстрального цикла



Диэструс

Проэструс

Эструс

Гипофиз 

0,445±0,04^^^

1,229±0,143

0,690±0,048<<, ^^

Гипоталамус

0,238±0,019

0,211±0,012

0,247±0,011^

Стриатум

0,153±0,013

0,168±0,015

0,195±0,012<

Надпочечники

0,091±0,012

0,071±0,004

0,067±0,009

Яичники 

0,029±0,015^

0,094±0,027

0,042±0,027



Примечание. Здесь и в табл. 5 достоверность отличий критерия Стьюдента по сравнению с диэструсом и проэструсом: < – p<0,05, << – p<0,01 и ^ – p<0,05, ^^ – p<0,01, ^^^ – p<0,001 соответственно.

Известно, что стадия проэструса характеризуется наиболее высоким уровнем секреции эстрогенов созревающими фолликулами яичника, а стадия диэструса низким уровнем эстрогенов в организме [12, 17, 45]. В свою очередь секреция эстрогенов находится под влиянием ФСГ и ЛГ, концентрация которых также возрастает в проэструсе и уменьшается в диэструсе [11, 46]. Эти данные позволяют предположить, что КПН, возможно участвует в регуляции уровня этих гормонов в гипофизе на разных стадиях эстрального цикла.

Активность КПН в гипоталамусе на стадии эструса выше чем на стадии проэструса на 17%. В стриатуме в эструсе активность фермента выше по отношению к диэструсу на 27%. Так как КПН вовлекается в процесс биосинтеза энкефалинов, то, возможно, что такое увеличение активности фермента, приводящее к росту содержания энкефалинов в стриатуме, объясняет существенное снижение добровольного потребления этанола самками крыс в эструсе [19, 45].

В надпочечниках достоверных изменений активности КПН в зависимости от стадии эстрального цикла не выявлено. 

В яичниках активность КПН на стадии проэструса достоверно выше, чем в диэструсе, что позволяет предположить возможность вовлечения фермента в циклические изменения уровня биологически активных пептидов в этом органе [18, 240].

Таким образом, вероятно, КПН принадлежит важная роль в регулировании уровня нейрогормонов на разных стадиях эстрального цикла.

б) Активность карбоксипептидазы Н при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самок 

На стадии ДЭ через 4 часа после введения физиологического раствора активность КПН изменялась в гипофизе, гипоталамусе и надпочечниках (рис. 1). При этом в гипофизе она возросла почти в 2 раза, а в гипоталамусе и надпочечниках уменьшилась на 29% и 51% соответственно. Уменьшение активности КПН в гипоталамусе, вероятно, может способствовать увеличению количества выводимой из организма жидкости, за счет уменьшения образования вазопрессина [72]. Через 0,5 и 18 часов после инъекции достоверных изменений активности КПН не обнаружено. В стриатуме и яичниках введение физиологического раствора не влияло на активность КПН.

На стадии проэструса активность КПН в гипофизе через 0,5 и 4 часа после внутрибрюшинного введения физиологического раствора была достоверно ниже на 35% и 53% соответственно по сравнению с интактными самками. В надпочечниках снижение активности КПН отмечено только через 0,5 часа после инъекции физраствора на 34% по сравнению с интактной группой крыс. Вероятно, такие изменения активности фермента связаны с особенностями оказываемого воздействия, при котором в организм поступает дополнительное количество жидкости [38]. В гипоталамусе, стриатуме и яичниках активность КПН достоверно не изменялась при введении физиологического раствора. 

На стадии эструса в гипофизе через 0,5 и 4 часа после введения физраствора активность КПН была ниже нормы на 48% и 42% соответственно. В стриатуме через 0,5 часа после инъекции активность КПН была ниже на 25% по сравнению с интактной группой животных. В гипоталамусе, надпочечниках и яичниках активность КПН достоверно не изменялась при введении физиологического раствора.

Сравнение активности КПН на разных стадиях эстрального цикла при введении физиологического раствора показало, что на стадии эструса в гипофизе через 0,5 часа после оказания воздействия активность фермента достоверно ниже по отношению к диэструсу и проэструсу. Через 4 часа после введения физраствора активность уменьшалась при переходе от диэструса к проэструсу и далее к эструсу. В гипофизе через 18 часов после инъекции активность КПН была достоверно выше в диэструсе по сравнению с эструсом.

В гипоталамусе на стадии эструса через 4 часа после внутрибрюшинного введения физиологического раствора активность КПН выше, чем в диэструсе и проэструсе, а через 18 часов в диэструсе ниже, чем в эструсе.

В стриатуме на стадии диэструса через 0,5 часа после инъекции 0,9 % раствора NaCl активность фермента была выше, чем в проэструсе. Через 4 часа после оказанного воздействия в стриатуме активность КПН в эструсе достоверно выше по отношению к диэструсу и проэструсу, через 18 часов активность фермента в эструсе продолжала оставаться на более высоком уровне, чем в диэструсе.

В надпочечниках на стадии диэструса активность КПН через 0,5 часа после введения физиологического раствора достоверно выше, чем в эструсе и проэструсе, а через 4 часа соотношение активностей фермента на этих стадиях меняется на обратное.

В яичниках на стадии проэструса активность КПН достоверно выше, чем на стадии эструса. Через 4 и 18 часов в диэструсе активность ниже по сравнению с эструсом. Таким образом, введение физраствора приводит к изменению соотношения активности фермента в исследуемых отделах в ходе эстрального цикла и ведет в свою очередь к изменению соотношения нейропептидов, что, вероятно отражает один из механизмов нарушения функционирования половой системы при стрессе. 

Введение физраствора не оказывало влияния на активность КПН через 0,5 часа после воздействия на стадии диэструса и через 18 часов на стадиях диэструса и эструса. Активность КПН в яичниках не зависела от инъекции физраствора. Наиболее существенные изменения после введения физраствора в активности фермента наблюдались в гипофизе и менее существенные в гипоталамусе, стриатуме и надпочечниках, причем во всех этих отделах, за исключением активности фермента в гипофизе через 4 часа после введения изотонического раствора NaCl, активность фермента была ниже, чем у интактных животных. Кроме того, активность КПН при внутрибрюшинном введении физиологического раствора во всех изученных отделах зависела от стадии эстрального цикла. Все это приводит к тому, что после инъекции физраствора соотношение активностей фермента в зависимости от стадии эстрального цикла во всех органах отличается от нормы.

в) Исследование активности карбоксипептидазы Н при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самок крыс 

На стадии диэструса в гипофизе через 4 часа после введения этанола в дозе 1 г на кг веса наблюдалось снижение активности КПН на 33% по сравнению с контрольной группой животных. В гипоталамусе, надпочечниках и яичниках через тот же промежуток времени активность фермента была выше, чем у контрольной группы животных на 33%, 47% и 112% соответственно. В гипоталамусе через 0,5 часа после инъекции раствора этанола активность КПН была выше на 37% по сравнению с контрольными самками (рис.1). Наши данные согласуются со сведениями об усилении образования и секреции энкефалинов, АКТГ, β-эндорфина при острой алкогольной интоксикации [94, 158, 241], в биосинтезе которых принимает участие КПН [27, 28, 29]. 

Этанол в дозе 4 г/кг в диэструсе измененял активность фермента в гипофизе: через 0,5 и 18 часов она была выше контрольных значений на 43% и 140% соответственно, а через 4 часа – ниже на 57%. В гипоталамусе через 0,5 и 4 часа после введения этанола активность КПН была выше на 26% и 38% соответственно, а через 18 часов – ниже на 31% по сравнению с контрольной группой животных. Снижение активности фермента, возможно, направлено на нормализацию пептидэргических систем. В яичниках только через 0,5 часа после инъекции этанола в дозе 4г/кг активность фермента была выше таковой по сравнению с контролем в 3,6 раза. Увеличение активности КПН при острой алкогольной интоксикации согласуется с представлением об активации многих пептидэргических систем при острой алкогольной интоксикации [19, 86].

Интересно отметить, что в стриатуме на стадии диэструса этанол не оказывал влияния на активность КПН, что, вероятно, может объясняться особенностями биохимического и физиологического статуса животных на разных стадиях эстрального цикла [17, 45, 247].

Достоверные отличия в активности КПН в стадии диэструса при введении различных доз этанола обнаружены в гипофизе и гипоталамусе через 18 часов, а также в яичниках через 0,5 часа после инъекции. При этом этанол в дозе 1г/кг не вызывал изменений в активности фермента, однако при введении этанола в дозе 4 г/кг активность КПН возрастала в 2 раза в гипофизе, в 2,8 раза в яичниках и уменьшалась в гипоталамусе на 23%.

Таким образом, введение этилового спирта на стадии диэструса вызывает разнонаправленные изменения активности КПН. Кроме того, через 18 часов после инъекции этанола в дозе 1 г/кг активность фермента оставалась на прежнем уровне во всех рассмотренных отделах.

Для более полного понимания характера выявленных изменений активности фермента первичный экспериментальный материал был подвергнут дисперсионному анализу влияния времени после инъекции при введении различных доз этанола (табл.2).

Дисперсионный анализ показал отсутствие влияния времени на активность КПН при введении физиологического раствора и этанола в дозе 1г/кг в диэструсе. Однако при инъекции этанола в дозе 4 г/кг наблюдается достоверная зависимость активности КПН от времени в гипофизе и гипоталамусе. При этом этанол в дозе 4г/кг вызывал в гипофизе U-образное изменение активности фермента, а в гипоталамусе активность фермента плавно снижалась с течением времени. 

Таблица 2. Дисперсионный анализ влияние времени на активность карбоксипептидазы Н в диэструсе (значения отношения Фишера FФ и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).



Отдел

Воздействие

Fф

Норма

Временные подгруппы









0,5 ч.

4 ч.

18 ч.



Гипофиз

Физраствор

3,45*

1

1

1

1



Этанол 1г/кг

2,87

-

-

-

-



Этанол 4 г/кг

7,03**

1,5

2,5

1

3



Гипоталамус

Физраствор

2,57

-

-

-

-



Этанол 1г/кг

2,09

-

-

-

-



Этанол 4 г/кг

4,03*

1,5

2

1,5

1



Стриатум

Физраствор

0,90

-

-

-

-



Этанол 1г/кг

0,93

-

-

-

-



Этанол 4 г/кг

1,05

-

-

-

-



Надпочечники

Физраствор

0,56

-

-

-

-



Этанол 1г/кг

0,52

-

-

-

-



Этанол 4 г/кг

0,26

-

-

-

-



Яичники

Физраствор

0,62

-

-

-

-



Этанол 1г/кг

0,33

-

-

-

-



Этанол 4 г/кг

2,79

-

-

-

-



Примечание. Здесь и в табл.3-4, 6-8, 10-12, 14, 16, 18, 19 показана достоверность критерия Фишера: * - p<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001; прочерк - определение не проводилось.

На стадии проэструса активность КПН при введении этилового спирта (доза 1г на кг массы тела) в гипофизе через все исследованные промежутки времени была ниже контрольных значений: на 45% через 0,5 часа и на 24% через 4 часа. В других отделах этанол в дозе 1г/кг не изменял активность КПН относительно контроля.

В дозе 4г/кг в проэструсе этанол вызывал снижение активности в гипофизе через 0,5 часа и в надпочечниках через 4 часа на 32% и 48% соответственно по сравнению с контрольной группой крыс. В яичниках через 

4 часа после инъекции этанола активность фермента составляла 174% по отношению к контрольной группе.

На стадии проэструса достоверное влияние различных доз этанола обнаружено в надпочечниках и яичниках через 4 часа после оказанного воздействия: этанол в дозе 1 г/кг не изменял активность КПН по сравнению с контролем, однако в дозе 4 г/кг в надпочечниках уменьшал, а в яичниках увеличивал активность фермента.

Следует отметить, что в проэструсе введение этанола в дозе 1 г/кг и 4 г/кг не влияло на активность КПН в гипоталамусе и стриатуме через все исследованные промежутки времени.

 Согласно результатам дисперсионного анализа активность КПН в проэструсе не зависела от времени. Однако в гипофизе инъекция физраствора или этанола приводила к снижению активности фермента через 0,5 и 4 часа по сравнению с нормой (табл.3).

В стадии эструса этанол в дозе 1 г/кг через 0,5 часа после инъекции увеличивал активность КПН во всех исследованных органах, кроме яичников: в гипофизе на 162%, в гипоталамусе на 39%, в стриатуме на 29% и в надпочечниках на 106% по сравнению с контрольной группой животных. В гипофизе активность КПН повышалась и через другие исследованные промежутки времени: через 4 и 18 часов на 92% и 30% соответственно по отношению к контролю. В то же время в стриатуме через 4 часа после внутрибрюшинного введения этилового спирта в дозе 1 г/кг активность фермента относительно контрольной группы уменьшилась на 19%. В надпочечниках через 18 часов после инъекции этанола в дозе 1 г/кг активность КПН была выше на 44%, чем в контрольной группе животных.

На стадии эструса через 0,5 и 18 часов после введении этанола в дозе 4 г/кг ни в одном органе активность фермента не отличалась от контрольных 

Таблица 3. Дисперсионный анализ влияние времени на активность карбоксипептидазы Н в проэструсе (значения отношения Фишера FФ и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).



Отдел

Воздействие

Fф

Норма

Временные подгруппы









0,5 ч.

4 ч.



Гипофиз

Физраствор

10,88***

2

1

1



Этанол 1г/кг

17,14***

2

1

1



Этанол 4 г/кг

12,71***

2

1

1



Гипоталамус

Физраствор

1,12

-

-

-



Этанол 1г/кг

0,36

-

-

-



Этанол 4 г/кг

1,07

-

-

-



Стриатум

Физраствор

1,10

-

-

-



Этанол 1г/кг

0,12

-

-

-



Этанол 4 г/кг

0,97

-

-

-



Надпочечники

Физраствор

3,80*

1

1

1



Этанол 1г/кг

0,94

-

-

-



Этанол 4 г/кг

3,63

-

-

-



Яичники

Физраствор

1,55

-

-

-



Этанол 1г/кг

2,71

-

-

-



Этанол 4 г/кг

1,66

-

-

-



величин, кроме яичников, где через 18 часов после воздействия активность КПН уменьшилась в 2,6 раза. В гипоталамусе и стриатуме через 4 часа после воздействия этанола в дозе 4 г/кг активность фермента была ниже на 24% и 52% соответственно по отношению к контрольным самкам.

Статистически значимые отличия во влиянии разных доз этанола на активность КПН на стадии эструса обнаружены в гипофизе через 0,5 часа, в гипофизе, гипоталамусе и стриатуме через 4 часа, а также в надпочечниках и яичниках через 18 часов после внутрибрюшинной инъекции алкоголя. При этом этанол в дозе 1 г/кг повышал активность КПН в гипофизе и надпочечниках, но не влиял на активность в дозе 4 г/кг по сравнению с контролем. В гипоталамусе и яичниках меньшая доза алкоголя не вызывала изменений, а большая приводила к снижению активности КПН. В стриатуме при введении этанола в дозе 4 г/кг активность фермента была ниже, чем при введении этанола в дозе 1 г/кг по сравнению с контрольной группой животных. Различия во влиянии двух доз этанола, возможно, связаны со спецификой действия больших и малых доз этанола [19].

Активность КПН в эструсе зависела от времени при введении физиологического раствора в гипофизе и гипоталамусе, а при введении этанола в дозе 1г/кг – в гипоталамусе и надпочечниках и при инъекции этанола в дозе 4 г/кг, как и в случае с физраствором – в гипофизе и гипоталамусе (табл.4).

При этом в контрольной группе животных активность фермента в гипофизе через 0,5 и 4 часа была выше по сравнению с нормой, а через 18 часов возвращалась к исходному уровню. В то же время при введении этанола в дозе 1 г/кг зависимость от времени после инъекции не наблюдалась и активность КПН достоверно не отличалась от нормы. При введении этанола в дозе 4 г/кг активность фермента имела тенденцию к снижению к 4 часам, к 18 часам наблюдалось повышение активности фермента.

В гипоталамусе на стадии эструса введение физиологического раствора приводило к постепенному увеличению активности КПН при переходе от 0,5 часа к 18 часам, при введении этанола в дозе 4 г/кг через 0,5 часа наблюдалось повышение активности фермента, к 4 часам активность понижалась и возвращалась к уровню, характерному для интактных крыс через 18 часов, сходная тенденция наблюдалась и при введении этанола в дозе 1 г/кг.

В надпочечниках влияние времени на активность КПН наблюдается только при введении этанола в дозе 1 г/кг.

Таблица 4. Дисперсионный анализ влияние времени на активность карбоксипептидазы Н в эструсе (значения отношения Фишера FФ и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).



Отдел

Воздействие

Fф

Норма

Временные подгруппы









0,5 ч.

4 ч.

18 ч.



Гипофиз

Физраствор

12,47***

2

1

1

2



Этанол 1г/кг

2,58

-

-

-

-



Этанол 4 г/кг

7,17**

2,5

1,5

1

3



Гипоталамус

Физраствор

3,67***

1,5

1

1,5

2



Этанол 1г/кг

6,16**

1

2

1

1,5



Этанол 4 г/кг

3,92*

1,5

2

1

1,5



Стриатум

Физраствор

3,26*

1

1

1

1



Этанол 1г/кг

0,93

-

-

-

-



Этанол 4 г/кг

3,03

-

-

-

-



Надпочечники

Физраствор

3,01

-

-

-

-



Этанол 1г/кг

7,95**

1

1,5

1

2



Этанол 4 г/кг

0,60

-

-

-

-



Яичники

Физраствор

1,07

-

-

-

-



Этанол 1г/кг

0,42

-

-

-

-



Этанол 4 г/кг

1,61

-

-

-

-



При сравнении активности КПН на различных стадиях эстрального цикла при внутрибрюшинном введении этанола было обнаружено, что активность фермента в гипофизе через 0,5 часа и гипоталамусе через 4 часа после инъекции этанола в дозе 1г/кг достоверно выше в эструсе, по сравнению с диэструсом и проэструсом, кроме того, в диэструсе она выше, чем в проэструсе. В гипоталамусе через 0,5 часа и гипофизе через 4 часа активность фермента на стадии эструса и диэструса достоверно выше, чем в проэструсе, а в надпочечниках через 0,5 часа после инъекции этанола в дозе 1 г/кг выше в эструсе по отношению к проэструсу. В стриатуме и яичниках активность фермента при введении этанола в дозе 1 г/кг не изменялась в зависимости от стадии эстрального цикла. В гипофизе и гипоталамусе через 18 часов после введении этанола в количестве 1 г/кг активность КПН была выше в эструсе, чем в диэструсе.

Через 0,5 часа после инъекции этанола в дозе 4 г/кг активность в гипофизе и яичниках на стадии диэструса была достоверно выше, чем в эструсе и проэструсе, но не отличалась достоверно между последними двумя стадиями, а через 4 часа в этих отделах высокая активность КПН была на стадиии проэструса и низкая в эструсе и диэструсе. При внутрибрюшинном введении этанола в дозе 4 г/кг в надпочечниках активность КПН в диэструсе и эструсе была выше, чем в проэструсе. В гипоталамусе через 18 часов после воздействия этанола в дозе 4 г/кг активнсть КПН в эструсе была достоверно больше по сравнению с диэструсом.

Таким образом, острая алкогольная интоксикация приводит к существеннному изменению активности КПН в тканях самок, причем в большинстве случаев активность фермента увеличивалась, что согласуется с данными, полученными другими исследователями на самцах [14, 25, 26]. Наиболее существенные изменения претерпевала активность фермента в гипофизе и яичниках. В ряде случаев активность КПН зависела от дозы вводимого этанола, причем инъекции этанола в дозе 1 г/кг и 4 г/кг могут оказывать как сходное, так и разнонаправленное влияние на активность фермента в исследуемых отделах. Зависимость активности КПН от времени обнаруживается в гипофизе на всех стадиях эстрального цикла, в гипоталамусе на стадии диэструса и эструса, а на последней стадии и в надпочечниках, но только при введении физраствора. При инъекциях этанола наблюдалась зависимость активности КПН от стадии эстрального цикла во всех исследованных отделах, причем, как правило, активность фермента на стадии диэструса и эструса выше, чем в проэструсе. Таким образом, внутрибрюшинное введение этанола приводит к изменению активности КПН на разных стадиях эстрального цикла по сравнению с интактной и контрольной группами животных, что, возможно, является одним из патогенетических факторов алкоголизма и, вероятно, может приводить к нарушению нормального созревания фолликулов яичника, к неадекватному протеканию фаз полового цикла, ановуляции [2, 73].



3.1.2. Изучение активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла

а) Распределение активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях интактных самок крыс 

В ходе проведения эксперимента достоверное изменение активности ФМСФ-КП обнаружено только в яичниках. В этом органе активность фермента на стадии проэструса и эструса была в 1,7 и 1,9 раза соответственно выше по сравнению с диэструсом (табл.5).

Наличие зависимости активности ФМСФ-КП от стадии эстрального цикла в яичниках позволяет предположить, что, вероятно, она, наряду с КПН, может вовлекаться в циклические изменения уровня биологически активных пептидов в этом органе, а также в процессы развития фолликула и желтого тела.

Таблица 5. Активность ФМСФ-КП на разных стадиях эстрального цикла в норме (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, Mm, n=68).



Отдел

Стадия эстрального цикла



Диэструс

Проэструс

Эструс

Гипофиз 

0,647±0,087

0,529±0,031

0,624±0,064

Гипоталамус

0,218±0,026

0,200±0,030

0,216±0,016

Стриатум

0,170±0,024

0,199±0,011

0,218±0,028

Надпочечники

0,810±0,091

1,005±0,079

1,069±0,188

Яичники 

0,258±0,035^^

0,436±0,034

0,481±0,046<<



б) Активность ФМСФ-КП при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самок

На стадии диэструса в гипофизе через 4 после введения физраствора активность ФМСФ-КП уменьшалась на 46% по сравнению с интактными животными. В стриатуме через 0,5 часа после воздействия активность фермента была выше на 31%, чем в норме. В надпочечниках через 0,5 и 18 часов после введения физиологического раствора наблюдалось повышение активности фермента на 70% и 50% соответственно. В яичниках через все исследуемые интервалы времени активность ФМСФ-КП была увеличена: через 0,5 часа в 2,9 раза, через 4 часа в 4,1 раза, через 18 часов в 8,5 раз по сравнению с интактными самками. В гипоталамусе отличий от нормы после введения физраствора не обнаружено (рис. 2).

На стадии проэструса в гипофизе, гипоталамусе и надпочечниках инъекция изотонического раствора NaCl не изменяла активность ФМСФ-КП. В стриатуме через 0,5 и 4 часа отмечено снижение активности ФМСФ-КП на 24% и 28% соответственно, а в яичниках увеличение активности фермента через те же промежутки времени в 4,2 и 3 раза соответственно по отношению к интактным крысам. 

На стадии эструса в гипофизе активность ФМСФ-КП после введения физиологического раствора уменьшалась через 0,5 и 18 часов на 32% и 45% соответственно по сравнению с нормой. В гипоталамусе и стриатуме снижение активности происходило только через 18 часов после инъекции физраствора на 25% и 33% соответственно. В яичниках через 0,5 часа после введения физиологического раствора активность ФМСФ-КП не отличалась от нормы, через 4 часа была выше на 339%, а через 18 часов ниже на 35% по сравнению с нормой. В надпочечниках введение физиологического раствора не влияло на активность ФМСФ-КП.

Сравнение активности ФМСФ-КП на разных стадиях эстрального цикла при введении физиологического раствора выявило, что в гипофизе через 4 часа после инъекции активность фермента на стадии эструса достоверно выше, чем в диэструсе, через 18 часов после воздействия соотношение активностей ФМСФ-КП на этих стадиях меняется на противоположное.

В гипоталамусе и надпочечниках через 0,5 часа после внутрибрюшинного введения физиологического раствора активность в фермента в эструсе и проэструсе ниже, чем в диэструсе; через 4 часа наблюдается более высокая активность в эструсе по сравнению с проэструсом, а через 18 часов на стадии эструса она ниже, чем в диэструсе.

В стриатуме через 0,5 часа в эструсе и диэструсе активность ФМСФ-КП была более высокой, чем в проэструсе. Через 4 часа после внутрибрюшинной инъекции активность фермента уменьшалась в ряду: эструс-диэструс-проэструс. В надпочечниках через 4 часа после введения изотонического раствора NaCl активность ФМСФ-КП в эструсе была выше по сравнению с диэструсом и проэструсом. В яичниках через 0,5 после инъекции физраствора наиболее высокая активность фермента наблюдалась в проэструсе, самая низкая – в эструсе и была промежуточной по своему значению в диэструсе, через 4 часа в эструсе фермент был более активен, чем в проэструсе, где в свою очередь активность фермента была выше, чем в диэструсе. Через 18 часов после внутрибрюшинного введения физиологического раствора в яичниках активность ФМСФ-КП в эструсе была ниже по сравнению с диэструсом.

Таким образом, инъекция физраствора вызывает изменение активности ФМСФ-КП во всех исследуемых отделах и приводит к появлению зависимости активности фермента от стадии эстрального цикла в гипофизе, гипоталамусе, стриатуме, надпочечниках, чего не наблюдалось у интактных крыс, что, по-видимомому, приводит к изменению соотношения различных нейропептидов на разных стадиях эстрального цикла и приводит к нарушению овуляции и другим аномалиям в функционировании половой системы [2, 73]. 

в) Исследование активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самок крыс

В диэструсе при введении этанола в дозе 1 г/кг активность фермента возрастала в гипофизе и яичниках через 0,5 часа на 55% и 252%, через 4 часа на 116% и 89% соответственно, но не отличалась от контроля через 18 часов. В других исследованных органах активность ФМСФ-КП возрастала только через 4 часа после инъекции этилового спирта в дозе 1г/кг: в гипоталамусе на 36%, в стриатуме на 26% и в надпочечниках на 55% по сравнению с контрольной группой животных (рис.2).

На стадии диэструса при введении этанола в дозе 4 г/кг через 4 часа активность ФМСФ-КП была выше, чем в контроле в гипофизе на 128%, в гипоталамусе на 46%. Через 18 часов после введения этанола в дозе 4 г/кг активность фермента снижалась в гипофизе на 50%, в гипоталамусе на 38% по отношению к контрольным самкам. В яичниках наблюдается постепенное снижение активности ФМСФ-КП во времени: через 0,5 часа активность фермента выше контрольных значений в 4,4 раза, через 4 часа в 1,5 раза, а через 18 часов ниже контроля в 9,5 раз.

Стоит отметить, что введение этанола в дозе 4 г/кг в диэструсе не приводило к изменению активности ФМСФ-КП в стриатуме и надпочечниках через все исследованные промежутки времени.

Таким образом, на стадии диэструса наиболее существенные изменения в активности фермента наблюдались в яичниках.

Достоверные различия во влиянии разных доз спирта на активность ФМСФ-КП обнаружены в гипофизе через 0,5 часа, в стриатуме через 0,5 и 4 часа, в гипоталамусе и яичниках через 18 часов после инъекции. При этом этанол в дозе 1 г/кг в гипофизе и стриатуме через 4 часа активировал ФМСФ-КП, но не изменял активность фермента при введении этанола в дозе 4 г/кг по сравнению с контрольными животными. В стриатуме большая доза этанола через 0,5 часа после воздействия сильнее активировала фермент, чем меньшая. В гипоталамусе при внутрибрюшинном введении этанола в дозе 1 г/кг не было обнаружено изменения активности, однако при увеличении дозировки этилового спирта наблюдалось уменьшение активности ФМСФ-КП по отношению к контрольным самкам. После введения этанола в дозе 1 г/кг активность ФМСФ-КП в яичниках не отличалась от контроля, но была в 7,8 раза выше по сравнению с активностью фермента при введении этанола в дозе 4 г/кг.

Таким образом, на стадии диэструса этанол в дозе 1 г/кг повышал или не оказывал влияния на активность фермента, а в дозе 4г/кг оказывал разнонаправленное воздействие.

Результаты дисперсионного анализа влияния времени на активность ФМСФ-КП в диэструсе выявили, что активность зависела от времени при введении физиологического раствора и этанола в дозе 4г/кг в гипофизе и гипоталамусе (табл.6). В стриатуме влияния времени на активность фермента не обнаружено. В надпочечниках зависимость от времени после введения растворов этилового спирта и хлорида натрия оказалась сходной: при введении физраствора активность увеличивалась к 0,5 часа, несколько снижалась к 4 часам и в интервале 4 –18 часов достоверно не изменялась, в случае введения этанола снижение наблюдалось при переходе к 18 часам. В яичниках введение физраствора вызывало постепенное увеличение активности ФМСФ-КП; через 0,5 часа после инъекции этанола в дозе 1 г/кг активность фермента увеличичалась и оставалась на этом уровне вплоть до 18 часов. Введение этанола в дозе 4 г/кг приводило к тому, что активность фермента в яичниках резко увеличивалась через 0,5 часа, а затем постепенно снижалась, достигая к 18 часам исходного уровня.

В проэструсе этанол в дозе 1 г/кг не вызывал изменений в активности ФМСФ-КП в гипофизе и яичниках.

Таблица 6. Дисперсионный анализ влияние времени на активность ФМСФ-КП в диэструсе (значения отношения Фишера FФ и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).



Отдел

Воздействие

Fф

Норма

Временные подгруппы









0,5 ч.

4 ч.

18 ч.



Гипофиз

Физраствор

4,43*

1,5

1,5

1

2



Этанол 1г/кг

0,69

-

-

-

-



Этанол 4 г/кг

3,40*

1,5

1,5

2

1



Гипоталамус

Физраствор

4,74*

1,5

2

1

1,5



Этанол 1г/кг

1,38

-

-

-

-



Этанол 4 г/кг

4,65*

1,5

2

2

1



Стриатум

Физраствор

1,54

-

-

-

-



Этанол 1г/кг

2,39

-

-

-

-



Этанол 4 г/кг

2,71

-

-

-

-



Надпочечники

Физраствор

4,49*

1

2

1,5

1,5



Этанол 1г/кг

6,19**

1

2

2

1,5



Этанол 4 г/кг

6,14**

1

2

2

1,5



Яичники

Физраствор

22,24***

1

1,5

2

3



Этанол 1г/кг

16,74***

1

2

2

2



Этанол 4 г/кг

63,60***

1

3

2

1



В гипоталамусе и стриатуме через 4 часа после инъекции этанола в дозе 1 г/кг активность фермента была на 24% и 36% выше, если доза этанола составляла 4 г/кг, то активность фермента была на 52% и 61% соответственно выше по сравнению с контрольной группой животных.

На стадии проэструса в надпочечниках через 0,5 часа после введения этанола в дозе 1 г/кг активность фермента была на 25%, а через 4 часа на 19% выше, чем в контроле. Повышение активности ФМСФ-КП согласуется с данными об увеличении синтеза и секреции энкефалинов, β-эндорфина, АКТГ, пролактина при острой алкгольной интоксикации [94, 158, 241] и позволяет предположит причастность этого фермента к процессингу регуляторных пептидов. 

Этанол в дозе 4 г/кг снижал активность фермента относительно контрольной группы в гипофизе, надпочечниках и яичниках через 0,5 часа в 2,2, 1,9 и 5,5 раз соответственно. В гипоталамусе, стриатуме и яичниках при введении этанола в дозе 4 г/кг через 4 часа наблюдалась активация ФМСФ-КП на 52%, 61% и 63% соответственно по отношению к контрольной группе.

Таким образом, на стадии проэструса при введении этанола в дозе 1 г/кг наиболее существенные изменения в активности ФМСФ-КП происходили в стриатуме, а при введении этанола в дозе 4 г/кг – в яичниках. Кроме того, этанол в большей дозе вызывал более значимые сдвиги в активности фермента, что согласуется с мембранотропным эффектом этанола, сила которого увеличивается с ростом концентрации алкоголя [10,19, 88].

В проэструсе обнаружено достоверное отличие в действии, которое оказывают разные дозы алкоголя: в гипоталамусе через 4 часа после инъекции этанола в дозе 4 г/кг ФМСФ-КП активируется сильнее, чем при инъекции этанола в дозе 1 г/кг. Кроме того, в яичниках через 0,5 часа под влиянием этанола в дозе 4 г/кг активность фермента уменьшалась, а при внутрибрюшинной инъекции этанола в дозе 1 г/кг не отличалась от контрольных значений; через 4 часа после воздействия этанола в дозе 4 г/кг наблюдалось увеличение активности фермента, а при внутрибрюшинном введении этанола в дозе 1 г/кг отличий от контроля зафиксировано не было.

Согласно результатам дисперсионного анализа в проэструсе зависимость активности ФМСФ-КП от времени после воздействия в гипофизе и надпочечниках наблюдается только при введении этанола в дозе 4 г/кг (табл. 7). В гипоталамусе на стадии проэструса активность фермента не зависела от времени. В стриатуме зависимость обнаружена только при введении физиологическго раствора (активность ФМСФ-КП с течением времени уменьшается), тогда как в яичниках активность фермента 

Таблица 7. Дисперсионный анализ влияние времени на активность ФМСФ-КП в проэструсе (значения отношения Фишера FФ и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).



Отдел

Воздействие

Fф

Норма

Временные подгруппы









0,5 ч.

4 ч.



Гипофиз

Физраствор

1,41

-

-

-



Этанол 1г/кг

3,18

-

-

-



Этанол 4 г/кг

6,03*

2

1

1,5



Гипоталамус

Физраствор

1,19

-

-

-



Этанол 1г/кг

0,25

-

-

-



Этанол 4 г/кг

1,06

-

-

-



Стриатум

Физраствор

5,40*

2

1,5

1



Этанол 1г/кг

0,15

-

-

-



Этанол 4 г/кг

0,93

-

-

-



Надпочечники

Физраствор

1,21

-

-

-



Этанол 1г/кг

1,23

-

-

-



Этанол 4 г/кг

9,05**

2

1

2



Яичники

Физраствор

28,41***

1

2

2



Этанол 1г/кг

7,73

1

2

1,5



Этанол 4 г/кг

41,96***

1

1

2



изменялась с течением времени при введении как физраствора, так и растворов этилового спирта.

На стадии эструса после инъекции этанола в дозе 1 г/кг активность ФМСФ-КП в гипофизе была выше, чем в контрольной группе животных через 0,5 и 4 часа на 61%, а через 18 часов на 133%. Через 0,5 и 18 часов после введения этанола в дозе 1 г/кг активность фермента больше, чем в контроле: в надпочечниках на 47% и 78%, а в яичниках в 5,2 и 5,1 раза соответственно. В гипоталамусе активность ФМСФ-КП возрастает через 4 и 18 часов после инъекции алкоголя в дозе 1 г/кг на 35% и 68% соответственно.

В эструсе введение этанола в дозе 4 г/кг не изменяло активность ФМСФ-КП в гипофизе через 0,5 часа после инъекции, уменьшало активность фермента через 4 часа на 25% и повышало через 18 часов на 124% по отношению к контрольной группе животных. В гипоталамусе под действием той же дозы этанола активность фермента увеличивалась только через 18 часов после оказанного воздействия на 82%. В стриатуме и надпочечниках активность ФМСФ-КП имела U-образную зависимость от времени после введения этанола (доза 4 г на кг): повышение активности через 0,5 часа на 66% и 25% и через 18 часов на 82% и 58% и снижение активности через 4 часа на 46% и 28% соответственно по отношению к контрольным крысам. В яичниках через 0,5 часа после инъекции этанола в дозе 4 г/кг активность ФМСФ-КП снижалась на 36%, через 4 часа не было достоверных отличий, а через 18 часов – повышение активности в 5,8 раза по сравнению с контролем.

Таким образом, на стадии эструса при введении этанола наиболее существенные изменения в активности ФМСФ-КП происходили в гипофизе и яичниках.

Обнаружены статистически значимые различия во влиянии различных доз этанола. Так в гипофизе алкоголь в дозе 1 г/кг через 0,5 и 4 часа после инъекции повышал активность ФМСФ-КП, а в дозе 4 г/кг, напротив, понижал по сравнению с контрольной группой животных. В гипоталамусе через 4 часа после внутрибрюшинного введения этанола меньшая доза вызывала активацию фермента в отличие от большей, под действием которой активность по отношению к контролю не менялась. В стриатуме и надпочечниках две дозы этанола также оказывали разное влияние: при введении этанола в дозе 1 г/кг через 4 часа не было изменений в активности ФМСФ-КП, в то время как его инъекция в дозе 4 г/кг вызывала снижение активности фермента.

Таким образом, в эструсе, также как и на стадии диэструса, введение этанола в меньшей дозе либо не вызывало изменений в активности ФМСФ-КП, либо приводило к ее увеличению, в то время как инъекция большей дозы могла приводить и к снижению активности фермента.

Дисперсионный анализ влияния времени после инъекции при введении физраствора и различных доз этанола на стадии эструса показал, что в гипофизе и стриатуме зависимость от времени обнаруживалась при инъекции физиологического раствора и этанола в дозе 4 г/кг, однако активность ФМСФ-КП не зависела от времени после введения этанола в дозе 1 г/кг (табл.8). 

Таблица 8. Дисперсионный анализ влияние времени на активность ФМСФ-КП в эструсе (значения отношения Фишера FФ и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).



Отдел

Воздействие

Fф

Норма

Временные подгруппы









0,5 ч.

4 ч.

18 ч.



Гипофиз

Физраствор

3,72*

2

1,5

1,5

1



Этанол 1г/кг

1,23

-

-

-

-



Этанол 4 г/кг

6,86**

1,5

1

1

2



Гипоталамус

Физраствор

1,49

-

-

-

-



Этанол 1г/кг

3,80*

1

1,5

1,5

2



Этанол 4 г/кг

3,14

-

-

-

-



Стриатум

Физраствор

4,43*

1,5

1,5

2

1



Этанол 1г/кг

0,37

-

-

-

-



Этанол 4 г/кг

4,83*

1,5

2

1

1,5



Надпочечники

Физраствор

2,59

-

-

-

-



Этанол 1г/кг

1,89

-

-

-

-



Этанол 4 г/кг

1,21

-

-

-

-



Яичники

Физраствор

21,20***

1

1

2

1



Этанол 1г/кг

44,49***

1

3

3

2



Этанол 4 г/кг

31,85***

1

1

2

2



В гипоталамусе зависимость от времени наблюдалась только при введении этанола в дозе 4 г/кг, а в надпочечниках ее не выявили. В яичниках на стадии эструса при введении физраствора активность возрастала при переходе от 0,5 часа к 4 часам, а к 18 часам снижалась до исходного уровня. При введении этанола в дозе 1 г/кг активность фермента резко возрастала к 0,5 часа, оставалась на высоком уровне вплоть до 4 часов и несколько снижалась к 18 часам, но все же оставалась выше исходной 

Следует отметить, что активность ФМСФ-КП при введении растворов этанола сильно изменялась в зависимости от стадии эстрального цикла, таким образом, ответная реакция на острую алкогольную интоксикацию, вероятно, определяется стадией эстрального цикла.

Так в гипофизе, яичниках (доза 1 г на кг) и надпочечниках (доза 4 г на кг) через 0,5 часа после инъекции этанола самая высокая активность ФМСФ-КП была в диэструсе, самая низкая в проэструсе и промежуточной по своему значению в эструсе. В гипофизе через 4 часа, в гипоталамусе через 0,5 часа, а в стриатуме и надпочечниках через оба этих промежутка времени после введения этанола в дозе 1 г/кг активность ФМСФ-КП была достоверно выше в диэструсе и эструсе по отношению к проэструсу. Через 18 часов после инъекции этанола в дозе 1г/кг в гипофизе активность фермента на преовуляторной стадии цикла была более высокой, чем после овуляции, а через 0,5 и 4 часа после внутрибрюшинного введения этанола в дозе 4 г/кг активность ФМСФ-КП в диэструсе была выше, чем на других стадиях.

В гипоталамусе через 4 часа после инъекции этанола в дозе 1 г/кг активность ФМСФ-КП была достоверно выше в эструсе, чем в проэструсе и диэструсе. В том же отделе головного мозга через 18 часов после введения этанола в дозе 1 г/кг активность фермента в эструсе больше, чем в диэструсе. При введении этанола в дозе 4 г/кг через 0,5 часа активность ФМСФ-КП была достоверно выше в эструсе по сравнению с проэструсом. В гипоталамусе, надпочечниках и яичниках после инъекции этанола (доза 4 г/кг) через 18 часов, а в последнем органе и через 4 часа в эструсе фермент был более активен, чем в диэструсе. В надпочечниках через 4 часа и в яичниках через 0,5 часа после введения этанола в дозе 4 г/кг активность фермента в проэструсе и эструсе была ниже по сравненению с диэструсом.

Интересно отметить, что если в норме достоверные изменения активности ФМСФ-КП в зависимости от стадии эстрального цикла были обнаружены только в яичниках, то при введении физраствора или этанола такая зависимость появлялась во всех исследованных органах. Причем, как правило, в диэструсе и эструсе активность фермента была выше, чем в проэструсе. Разнонаправленные изменения активности ФМСФ-КП, наблюдаемые на разных стадиях эстрального цикла, возможно, свидетельствуют о различном уровне алкогольной мотивации крыс на разных этапах полового цикла.

Итак, при введении этанола наиболее значительные изменения в активности ФМСФ-КП были обнаружены в гипофизе и яичниках, тем самым подтверждает тезис о том, что первое место в реестре эндокринопатий при острой алкогольной интоксикации занимает поражение гипофизарно-гонадальной системы. 

На стадии диэструса активность фермента зависела от дозы вводимого этанола во всех отделах, кроме надпочечников, в эструсе такая зависимость не обнаруживалась только в яичниках, а в проэструсе была выявлена в гипоталамусе и яичниках. Зависимость активности ФМСФ-КП от времени в гипофизе при введении физраствора обнаруживалась на всех стадиях эстрального цикла, а при введении этанола (доза 4 г на кг) – только в эструсе, в яичниках активность фермента изменялась с течением времени, как при инъекции физраствора, так и этилового спирта. В гипоталамусе зависимость активности ФМСФ-КП от времени выявлена в диэструсе при введении физраствора, и в эструсе при введении этанола в дозе 4 г/кг, в стриатуме активность фермента зависела от времени только в эструсе после инъекции раствора хлорида натрия и этанола (доза 4 г на кг). В надпочечниках подобная зависимость выявлена в диэструсе после инъекции как физраствора, так и этилового спирта и в проэструсе при введении физиологического раствора.

Таким образом, внутрибрюшинное введение этанола приводит к изменению активности ФМСФ-КП, причем характер этих изменений определяется отделом, в котором исследуется активность ФМСФ-КП, стадией эстрального цикла, дозой вводимого этанола и временем, через которое проводится определение активности фермента. 



3.1.3. Активность карбоксипептидазы М в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла

а) Определение активности карбоксипептидазы М у интактных самок крыс 

В гипофизе, надпочечниках и гонадах активность фермента была ниже чувствительности метода определения, поэтому в случае карбоксипептидазы M исследование проводили только в гипоталамусе и стриатуме. В гипоталамусе и стриатуме не обнаружено зависимости активности КПМ от стадии эстрального цикла (табл. 9). Возможно, что в этих отделах КПМ участвует в регуляции базального уровня биологически активных пептидов в ходе полового цикла, но, вероятно, не влияет на циклические изменения их уровня. 

Таблица 9. Активность КПМ на разных стадиях эстрального цикла в норме (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, Mm, n=68).



Отдел

Стадия эстрального цикла



Диэструс

Проэструс

Эструс

Гипоталамус

0,114±0,013

0,095±0,006

0,114±0,004

Стриатум

0,051±0,005

0,065±0,007

0,066±0,011



б) Активность карбоксипептидазы М в тканях самок крыс при внутрибрюшинном введении физиологического раствора

На стадии диэструса введение физиологического раствора не оказывало влияния на активность КПМ в гипоталамусе. Однако в стриатуме через 0,5 часа после инъекции физраствора активность КПМ возрастала на 88%, а через 4 часа снижалась на 45% по сравнению с интактными животными (рис.3).

На стадии проэструса в гипоталамусе через 4 часа и в стриатуме через 0,5 часа после введения изотонического раствора NaCl активность КПМ была ниже на 25% и 49% соответсвенно, чем в норме.

В гипоталамусе на стадии эструса активность фермента через 4 часа после введения физраствора снижалась на 24% по отношению к интактной группе животных. В стриатуме активность КПМ не менялась при введении физиологического раствора.

Таким образом, наиболее существенное влияние ввведение физраствора оказывало на активность КПМ в стриатуме в диэструсе и проэструсе. Через 18 часов после инъекции физиологического раствора активность фермента достоверно не изменялась ни в гипоталамусе, ни в стриатуме.

При изучении зависимости активности КПМ от разных стадий эстрального цикла после введения физиологического раствора обнаружено, что в стриатуме через 0,5 часа после воздействия активность фермента в диэструсе и эструсе была достоверно выше, чем в проэструсе. Через 4 часа в том же отделе головного мозга активность КПМ в диэструсе оказалась ниже при сравнении с проэструсом и эструсом. Через 18 часов после внутрибрюшинной инъекции физраствора активность на стадии эструса была выше, чем в диэструсе. Разнонаправленные изменения активности КПМ на разных стадиях эстрального цикла, возможно, свидетельствуют о том, что устойчивость к стрессу у самок изменяется в ходе полового цикла [45].

В гипоталамусе при введении физиологического раствора активность КПМ не изменялась в зависимости от стадии эстрального цикла.

Таким образом, введение физраствора приводит к появлению зависимости активности фермента от стадии эстрального цикла в стриатуме, но не в гипоталамусе.

в) Исследование активности карбоксипептидазы М при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самок крыс

Активность КПМ на стадии диэструса в гипоталамусе через 0,5 часа после инъекции этанола в дозе 1 г/кг была на 43% выше, а через 18 часов на 39% ниже по сравнению с контрольной группой животных. В стриатуме при введении этанола в дозе 1 г/кг через 4 часа наблюдалось увеличение активности фермента на 118% по отношению к контрольным крысам (рис.3).

На стадии диэструса введение этанола в дозе 4 г/кг не влияло на активность КПМ в гипоталамусе. В стриатуме через 4 и 18 часов инъекция этанола (доза 4 г на кг) приводила к увеличению активности фермента в 3,4 и 1,4 раза соответственно по сравнению с контролем.

В диэструсе обнаружены достоверные отличия во влиянии различных доз этанола в гипоталамусе и стриатуме. При этом в гипоталамусе через 0,5 часа после инъекции этанола в дозе 1 г/кг происходило возрастание активности фермента, а при введении этанола в дозе 4 г/кг активность КПМ не изменялась относительно контроля. В стриатуме через 0,5 и 4 часа после введения алкоголя в дозе 1 г/кг активность фермента была достоверно ниже, чем при инъекции этанола в дозе 4 г/кг.

Согласно результатам дисперсионного анализа в диэструсе зависимость активности КПМ от времени после воздействия в гипоталамусе обнаружена только при введении этанола в дозе 1 г/кг: активность фермента постепенно снижалась при переходе от 0,5 к 18 часам. В стриатуме только при введении физиологического раствора активность фермента зависела от времени: наблюдалось повышение к 0,5 часам и возвращение к исходному уровню к 4 часам, в интервале 4-18 часов активность КПМ статистически достоверно не изменялась (табл. 10).

В проэструсе в гипоталамусе выявлены отличия в активности КПМ от контрольной группы только при введении этанола в дозе 1 г/кг: через 0,5 часа после оказанного воздействия активность фермента уменьшалась по сравнению с контрольными животными на 53%.

В стриатуме на стадии проэструса через 4 часа после инъекции этанола в дозе 1 г/кг наблюдалось снижение активности фермента на 53%, а при введении этанола в дозе 4 г/кг – увеличение через 0,5 часа в 2,8 раза по отношению к контрольной группе животных.

Таблица 10. Дисперсионный анализ влияние времени на активность КПМ в диэструсе (значения отношения Фишера FФ и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).



Отдел

Воздействие

Fф

Норма

Временные подгруппы









0,5 ч.

4 ч.

18 ч.



Гипоталамус

Физраствор

0,71

-

-

-

-



Этанол 1г/кг

10,25***

2

2

1,5

1



Этанол 4 г/кг

1,50

-

-

-

-



Стриатум

Физраствор

12,93***

1

2

1

1



Этанол 1г/кг

1,55

-

-

-

-



Этанол 4 г/кг

3,89*

1

1

1

1



Достоверные различия между двумя дозами этилового спирта выявлены как в гипоталамусе, так и в стриатуме на стадии проэструса. Если введение этанола дозе 4 г/кг не изменяло активность фермента, то его введение дозе 1 г/кг приводило к уменьшению активности КПМ относительно контроля. В стриатуме через 0,5 часа после инъекции этанола в дозе 4г/кг происходило повышение активности, а при введении этанола в дозе 1 г/кг изменений активности КПМ не было, через 4 часа после инъекции этанола в дозе 4 г/кг активность фермента достоверно не изменялась, однако при введении этанола в дозе 1 г/кг наблюдалось уменьшение активности по сравнению с контролем.

Дисперсионный анализ не выявил зависимости активности КПМ от времени в стриатуме на стадии проэструса. В гипоталамусе такая зависимость наблюдалась только при введении этанола в дозе 1 г/кг: при переходе к 0,5 часам активность КПМ понижалась, оставаясь на этом уровне вплоть до 4 часов (табл.11).

Таблица 11. Дисперсионный анализ влияние времени на активность КПМ в проэструсе (значения отношения Фишера FФ и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).



Отдел

Воздействие

Fф

Норма

Временные подгруппы









0,5 ч.

4 ч.



Гипоталамус

Физраствор

1,83

-

-

-



Этанол 1г/кг

13,54***

2

1

1



Этанол 4 г/кг

1,98

-

-

-



Стриатум

Физраствор

4,01*

1

1

1



Этанол 1г/кг

4,25*

1

1

1



Этанол 4 г/кг

1,68

-

-

-



На стадии эструса в гипоталамусе через 0,5 и 4 часа не выявлено достоверных отличий в активности КПМ от контроля при введении этанола в дозе 1 г/кг. Только через 18 часов обнаруживалось снижение активности фермента на 39% по сравнению с контрольными самками. В гипоталамусе при внутрибрюшинном введении этанола в дозе 4 г/кг активность КПМ достоверно не изменялась. 

В стриатуме в эструсе при введении этанола в дозе 1 г/кг и 4 г/кг активность фермента через 0,5 часа после инъекции составляла 58% и 39% от контрольных величин; между двумя этими дозами этанола обнаружено статистически достоверное отличие. Через другие промежутки времени инъекция этанола не оказывала влияния на активность КПМ.

Дисперсионный анализ влияния времени после инъекции показал отсутствие статистически значимой зависимости КПМ на стадии эструса (табл.12).

Активность КПМ при внутрибрюшинном введении зависела от стадии эстрального цикла. Так в гипоталамусе при инъекции этанола в дозе 1 г/кг через 0,5 часа и в стриатуме через 4 часа после воздействия активность КПМ была достоверно выше в эструсе и диэструсе по сравнению с проэструсом. В гипоталамусе через 4 часа после инъекции этанола в том же количестве самая

Таблица 12. Дисперсионный анализ влияние времени на активность КПМ в эструсе (значения отношения Фишера FФ и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).



Отдел

Воздействие

Fф









Гипоталамус

Физраствор

1,75



Этанол 1г/кг

2,58



Этанол 4 г/кг

0,40



Стриатум

Физраствор

0,63



Этанол 1г/кг

0,56



Этанол 4 г/кг

1,97



высокая активность фермента была в диэструсе, самая низкая – в проэструсе. Через 18 часов после инъекции этанола в дозе 4 г/кг в гипоталамусе и в дозе 1г/кг в стриатуме отмечалась более высокая активность фермента в эструсе по сравнению с диэструсом. В стриатуме через 0,5 часа после введения алкоголя в дозе 1 г/кг активность КПМ на стадии диэструса была выше, чем в проэструсе. При введении этанола в дозе 4 г/кг в стриатуме через 4 часа наблюдалось достоверное повышение активности фермента в диэструсе и эструсе относительно проэструса.

Таким образом, введение этанола вызывает более существенные изменения активности КПМ в стриатуме, чем в гипоталамусе. В обоих исследованных отделах активность фермента зависела от дозы вводимого этанола. Зависимость активности КПМ от времени выявлена в гипоталамусе на стадии диэструса и проэструса (при введении этанола в дозе 1г/кг) и в стриатуме на стадии диэструса (при введении физраствора). Кроме того, в гипоталамусе и стриатуме появляется зависимость активности фермента от стадии эстрального цикла, чего не наблюдалось в норме. Интересно отметить, что, как правило, активность КПМ на стадии диэструса и эструса была достоверно выше, чем в проэструсе.



3.2. Исследование активности основных карбоксипептидаз в тканях самцов крыс



3.2.1. Изучение активности карбоксипептидазы Н в тканях самцов крыс

а) Распределение активности карбоксипептидазы Н в тканях интактных самцов крыс

Полученные данные о распределении активности КПН в тканях самцов крыс представлены в таблице 13. 

Таблица 13. Активность КПН в тканях самцов в норме (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, Mm, n=68).



Гипофиз

Гипоталамус

Стриатум

Надпочечники

Семенники 

0,458±0,043

0,231±0,017

0,157±0,015

0,072±0,010

0,029±0,008



Максимальная активность фермента у самцов обнаружена в гипофизе, в гипоталамусе активность была примерно в 2 раза ниже, в стриатуме почти в 3 раза ниже, а в надпочечниках и семенниках в 6 раз и 9 раз соответственно ниже, чем в гипофизе.

При сравнении активности КПН у самцов и самок на разных стадиях эстрального цикла обнаружено, что в норме активность фермента в гипофизе не отличается у самок в стадии диэструса и у самцов, но достоверно выше у самок в проэструсе и эструсе на 168% (р<0,001) и 51% (p<0,01) соответственно по сравнению с самцами.

В активности КПН в гипоталамусе и надпочечниках нет половых отличий. В стриатуме отличия зафиксированы между самками на стадии эструса и самцами, причем у первых активность была выше на 24% (p<0,05), чем у последних.

В яичниках активность КПН на стадии проэструса достоверно выше на 224% (p<0,05) по сравнению с семенниками. Вероятно, что КПН, участвуя в обмене пептидов, вовлекается в формирование половых различий, которые существуют в уровне многих биологически активных пептидов [44, 90]. 

б) Активность карбоксипептидазы Н при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самцов

В гипофизе активность КПН возрастала после введения физиологического раствора через все исследованные промежутки времени: через 0,5 часа на 113%, через 4 часа на 60% и через 18 часов на 106% по сравнению с интактной группой самцов (рис. 4), что согласуется с представлениями об увеличении синтеза АКТГ в ответ на стресс, которым можно считать инъекцию физраствора.

В гипоталамусе через 4 часа после инъекции физраствора наблюдалось снижение активности КПН на 21%, а в стриатуме через тот же промежуток времени происходило увеличение активности фермента относительно интактной группы животных. Приведенные нами данные о повышении активности КПН после введения физраствора в гипофизе и стриатуме согласуются с полученными ранее [38]. 

В надпочечниках и семенниках не выявлено влияния внутрибрюшинного введения физиологического раствора на активность КПН. 

То есть инъекция физраствора приводит к изменению функционирования пептидэргических систем гипофиза, гипоталамуса и стриатума самцов крыс.

При введении физраствора наблюдаются половые отличия в изменении активности КПН. Так у самок через 0,5 часа после инъекции физиологического раствора на стадии диэструса во всех изучаемых отделах активность фермента не меняется, в проэструсе в гипофизе и надпочечниках, а на стадии эструса в гипофизе и стриатуме уменьшается по сравнению с нормой. У самцов же инъекция физраствора вызывает увеличение активности КПН только в гипофизе по сравнению с нормой, но не в других отделах.

Через 4 часа после введения изотонического раствора NaCl происходит увеличение активности КПН в гипофизе у самцов и самок в стадии диэструса, и уменьшение активности фермента в проэструсе и эструсе по отношению к интактной группе животных. В гипоталамусе у самцов и самок на стадии диэструса инъекция физраствора приводила к снижению активности КПН, в то время как у самок в эструсе и проэструсе активность фермента не отличалась от таковой у интактных животных. Введение физраствора вызывало увеличение активности КПН в стриатуме у самцов, однако у самок активность фермента не изменялась относительно нормы. Через 4 часа после инъекции физиологического раствора активность КПН у самок в диэструсе и проэструсе уменьшалась, но оставалась на прежнем уровне у самцов и самок в эструсе по сравнению с интактной группой крыс. В гонадах внутрибрюшинное введение физраствора не влияло на активность КПН.

Через 18 часов после инъекции физиологического раствора активность фермента у самок не изменилась относительно нормы ни в одном из исследованных отделов, у самцов такие изменения наблюдались только в гипофизе, где происходило увеличение активности КПН.

Таким образом, у особей разного пола при введении физраствора наиболее существенные изменения в активности фермента обнаруживались в гипофизе. Следует отметить, что характер изменений активности КПН в гипофизе и стриатуме был различным: у самцов активность фермента увеличивалась, а у самок в подавляющем большинстве случаев уменьшалась. Кроме того, если у самцов при введении физиологического раствора активность фермента в надпочечниках оставалась на прежнем уровне, то у самок через 0,5 часа в проэструсе и через 4 часа в диэструсе и проэструсе после воздействия активность КПН была ниже нормы. Возможно, это связано с половыми особенностями в ответе организма на стресс, коим, вероятно, для крыс является введение физраствора. Интересно также отметить, что единственным органом, в котором на активность энкефалинконвертазы не влияло введение физраствора у животных обоего пола были гонады. 

в) Исследование активности карбоксипептидазы Н при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самцов крыс

В гипофизе через 4 часа после инъекции этанола в дозе 1 г/кг активность КПН была выше на 46%, в то же время через 18 часов она была ниже на 23% по сравнению с контролем. При введении этанола в дозе 4 г/кг через 0,5 часа в гипофизе выявлено уменьшение активности КПН в 2 раза по отношению к контрольной группе животных, однако через другие промежутки времени активность фермента не изменялась под влиянием инъекции этанола (рис. 4).

В гипоталамусе через 0,5 и 4 часа после внутрибрюшинного введения этанола в дозе 1 г/кг активность КПН была на 10% и 25% соответственно выше, чем у контрольных животных. Введение этанола в дозе 4 г/кг приводило к увеличению активности фермента в гипоталамусе через 0,5 и 4 часа на 16% и 14% соответственно и к уменьшению активности через 18 часов на 12% по отношению к контрольным самцам. Повышение активности 

КПН в гипофизе и гипоталамусе самцов согласуется с данными об увеличении уровня КРФ, β-эндорфина при острой алкогольной интоксикации [19, 86].

В стриатуме через 4 часа после инъекции этанола в дозе 1 г/кг активность КПН уменьшалась на 20%, а через 18 часов возрастала на 34% относительно контроля. Через 0,5 часа после введения этанола в дозе 4 г/кг активность КПН была на 20% выше, а через 4 часа на 31% ниже контрольных величин.

В надпочечниках инъекция этанола в дозе 1 г/кг не влияла на активность КПН, однако в дозе 4 г/кг приводила к увеличению активности фермента через 0,5 часа на 48% и к уменьшению через 4 часа на 199% по сравнению с контролем.

В семенниках через 0,5 часа после введения этанола в дозе 1 г/кг и 4 г/кг активность КПН была ниже, чем у контрольных животных на 37% и 33% соответственно, активность также снижалась через 18 часов после введения этанола в дозе 4 г/кг на 30%.

Таким образом, наиболее существенные изменения в активности КПН у самцов при инъекции этанола в дозе 1 г/кг были зафиксированы в гипофизе, а при введении этанола в дозе 4 г/кг – в надпочечниках. Введение этанола (доза 1 г на кг) не оказывало влияния на активность КПН в надпочечниках, через все исследованные промежутки времени.

Обнаружены достоверные отличия во влиянии разных доз этанола на активность КПН. Так в гипофизе через 0,5 часа, в надпочечниках через 4 часа, в яичниках через 18 часов после введения этанола в дозе 4 г/кг активность КПН уменьшалась, а после инъекции этилового спирта в дозе 1 г/кг активность фермента достоверно не изменялась относительно контрольных животных. В стриатуме также обнаружены достоверные отличия между двумя дозами этилового спирта: через 0,5 часа после воздействия большая доза этанола сильнее активировала фермент, чем меньшая, через 18 часов наблюдалась обратное влияние двух доз этанола. 

При введении физиологического раствора или этилового спирта в любой дозе в гипофизе наблюдалась зависимость активности КПН от времени (табл. 14). При введении физраствора активность фермента увеличивалась через 0,5 часа, несколько снижалась к 4 часам, а к 18 часам возвращалась к уровню, характерному для 0,5 часа. После инъекции этанола в дозе 1 г/кг наблюдалось повышение активности КПН в гипофизе вплоть до 4 часов, а затем снижение к 18 часам. При введении этанола в дозе 4 г/кг активность КПН через 0,5 часа не отличалась от таковой у интактных самцов, повышалась при переходе к 4 часам, в интервале 4 –18 часов активность КПН статистически достоверно не изменялась.

Таким образом, зависимость активности КПН от времени у самцов была обнаружена в гипофизе, как при введении физраствора, так и при введении этилового спирта и в надпочечниках, но только после инъекции этанола в дозе 4 г/кг.

Интересно отметить, что через 0,5 часа после введения этанола в дозе 1 г/кг происходит увеличение активности КПН у самцов в гипоталамусе и снижение активности фермента в семенниках, у самок на стадии диэструса в гипофизе активность фермента также увеличивалась, но не подвергалась изменениям в проэструсе по отношению к контрольной группе животных.

Таблица 14. Дисперсионный анализ влияние времени на активность КПН (значения отношения Фишера FФ и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).



Отдел

Воздействие

Fф

Норма

Временные подгруппы









0,5 ч.

4 ч.

18 ч.



Гипофиз

Физраствор

11,53***

1

2

1,5

2



Этанол 1г/кг

11,21***

1

2,5

3

1,5



Этанол 4 г/кг

8,27**

1

1

2

2



Гипоталамус

Физраствор

2,39

-

-

-

-



Этанол 1г/кг

0,12

-

-

-

-



Этанол 4 г/кг

2,04

-

-

-

-



Стриатум

Физраствор

2,66

-

-

-

-



Этанол 1г/кг

1,38

-

-

-

-



Этанол 4 г/кг

2,46

-

-

-

-



Надпочечники

Физраствор

0,90

-

-

-

-



Этанол 1г/кг

3,05

-

-

-

-



Этанол 4 г/кг

4,70*

1

2

1

1,5



Семенники

Физраствор

3,28*

1

1

1

1



Этанол 1г/кг

0,63

-

-

-

-



Этанол 4 г/кг

0,65

-

-

-

-

На стадии проэструса изменение активности энкефалинконвертазы было зафиксировано только в гипофизе, где она уменьшалась относительно контроля. В эструсе активность КПН увеличивалась относительно контроля не только в гипоталамусе, но и в гипофизе, стриатуме и надпочечниках. Активность КПН в гонадах у самок оставалась на прежнем уровне, в отличие от самцов.

Через 4 часа после инъекции этанола в дозе 1 г/кг активность КПН в гипофизе у самцов и самок на стадии эструса возрастала, а в диэструсе и проэструсе снижалась относительно контрольной группы животных. В гипоталамусе у самцов активность КПН уменьшалась, а у самок на стадии диэструса увеличивалась и оставалась неизменной в проэструсе и эструсе по сравнению с контролем. Обнаружены разнонаправленные изменения активности у самок в эструсе и самцов в стриатуме: у первых активность КПН увеличивалась, а у вторых уменьшалась. В надпочечниках и гонадах у самцов и самок на стадии проэструса и эструса активность КПН не изменялась, однако в диэструсе и проэструсе активность КПН увеличивалась по сравнению с контролем.

Через 18 часов после внутрибрюшинного введения этанола в дозе 1 г /кг происходило увеличение активности КПН в гипофизе у самцов и у самок на стадии эструса, в диэструсе активность фермента оставалась на прежнем уровне по отношению к контрольной группе животных. В стриатуме у самцов активность КПН повышалась после введения этанола, но оставалась на прежнем уровне у самок относительно контроля. На стадии эструса у самок возрастала активность КПН в надпочечниках, однако не подвергалась изменениям у самцов и самок на стадии диэструса. Введение этанола не вызывало изменений активности феремента у животных разного пола в гипоталамусе и гонадах.

Этиловый спирт через 0,5 часа после внутрибрюшинного введения в дозе 4 г/кг приводит к изменению активности КПН у самцов во всех изученных отделах, однако у самок в эструсе такие изменения отсутствовали. В гипоталамусе у самцов и самок на стадии диэструса активность фермента увеличивалась, а на стадии проэструса и эструса оставалась на прежнем уровне по отношению к контролю. В стриатуме через 0,5 часа после инъекции у самцов активность КПН возрастала, но оставалась неизменной у самок. В надпочечниках у самцов и самок на стадии проэструса активность КПН увеличивается. В яичниках на стадии проэструса активность КПН возрастала после инъекции этанола (доза 4 г на кг), но снижалась в семенниках относительно контрольных значений.

У самцов и самок на стадии диэструса и эструса в гипофизе через 4 часа после введения этанола в дозе 4 г/кг отсутствовали изменения в активности КПН, но они имелись у самок в диэструсе, где активность фермента уменьшалась по сравнению с контролем. В гипоталамусе у самцов, а также у самок в диэструсе активность КПН увеличивалась, однако в эструсе обнаруживалось уменьшение, а в проэструсе изменения в активности фермента отсутствовали по сравнению с контрольной группой животных. В стриатуме на стадии диэструса и проэструса достоверных изменений активности КПН не обнаружено через 4 часа после введения этанола в дозе 4 г/кг, но у самцов и самок в эструсе активность фермента снижалась по отношению контрольным значениям. У самцов под влиянием инъекции этилового спирта отмечалось уменьшение активности КПН в надпочечниках, однако у самок не было обнаружено изменений в активности фермента относительно контроля. В гонадах введение этанола в дозе 4 г/кг не оказывало воздействия на активность КПН.

Через 18 часов после воздействия этанола (доза 4 г на кг) происходило увеличение активности КПН в гипофизе у самок в диэструсе по сравнению с контрольной группой животных, но у самцов и самок в эструсе активность фермента не подвергалась изменениям. В гипоталамусе наблюдалось снижение активности КПН у самцов и самок на стадии диэструса, а в эструсе уровень активности фермента оставался прежним по сравнению с контрольными крысами. Через 18 часов после инъекции этилового спирта в дозе 4 г/кг активность КПН в стриатуме и надпочечниках не изменялась относительно контроля у особей разного пола. В половых железах отмечаются разнонаправленные изменения в активности фермента: у самок в эструсе – увеличение, а у самцов – снижение по отношению к контрольной группе животных.

Таким образом, активность КПН у особей разного пола изменяется под влиянием инъекции этанола. Однако за счет того, что у особей женского пола многие биохимические показатели, физиологическое состояние, а, следовательно, и активность ферментов в норме и при различных патологических состояниях зависит во многом от стадии эстрального цикла, в которой пребывает животное [45, 193, 247], активность КПН при введении этанола изменяется в зависимости от стадии эстрального цикла. При этом, в одном и том же отделе, но на разных этапах полового цикла активность фермента при инъекции этилового спирта может претерпевать прямопротивоположные изменения, которые могут как совпадать с теми изменениями, которые наблюдаются у самцов, так и не совпадать. Следует также отметить, что при введении этанола у самок наблюдались более существенные изменения активности КПН, чем у самцов при введении этилового спирта, что согласуется с данными о том, что при данном воздействии у самок наблюдается более существенное изменение уровня гонадотропных гормонов, АКТГ и кортикостероидов [217].



3.2.2. Изучение активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях самцов крыс

а) Распределение активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях интактных самцов крыс 

Полученные данные о распределении активности ФМСФ-КП в тканях самцов крыс представлены в таблице 15.

Максимальная активность фермента у самцов обнаружена в надпочечниках, в гипофизе активность была в 3,2 раза ниже, в гипоталамусе и стриатуме примерно в 6 раз ниже, а в семенниках в 10 раз ниже, чем в гипофизе. Приведенные нами данные о распределении активности ФМСФ-КП в тканях самцов хорошо согласуются с полученными ранее другими исследователями [35, 91]. 

Стоит отметить, что активность ФМСФ-КП в гипофизе и половых железах у самцов достоверно меньше, чем у самок на любой из стадий эстрального цикла.

Таблица 15. Активность ФМСФ-КП в тканях самцов в норме (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, Mm, n=68).



Гипофиз

Гипоталамус

Стриатум

Надпочечники

Семенники 

0,365±0,051

0,200±0,009

0,201±0,008

1,148±0,127

0,115±0,020



В надпочечниках у самцов активность фермента достоверно выше на 42% (p<0,05), чем у самок в стадии диэструса. В гипоталамусе и стриатуме половых отличий в активности ФМСФ-КП не обнаружено. Таким образом, вероятно, данный фермент вовлекается в детерминацию различий в уровне регуляторных пептидов у самок и самцов [90].

б) Активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самцов 

Через 0,5 часа после инъекции физраствора в гипофизе не наблюдалось изменений в активности фермента, однако через 4 и 18 часов активность ФМСФ-КП возрастала на 56% и 40% соответственно относительно интактной группы животных. В гипоталамусе увеличение активности ФМСФ-КП обнаруживалось только через 0,5 часа после внутрибрюшинного введения физиологического раствора на 23% по сравнению с нормой. В стриатуме, надпочечниках и яичниках введение физраствора не влияло на активность ФМСФ-КП (рис. 4).

Через 0,5 часа после введения физраствора активность ФМСФ-КП у самцов подвергалась изменениям только в гипоталамусе, где активность фермента увеличивалась относительно интактной группы животных. У самок же ни на одной из стадий эстрального цикла активность фермента не изменялась в этом отделе. На стадии диэструса введение физиологического раствора приводило к возрастанию активности ФМСФ-КП в стриатуме, надпочечниках и яичниках, на стадии проэструса – к уменьшению активности в стриатуме и к ее увеличению в яичниках по отношению к норме. На стадии эструса активность ФМСФ-КП через 0,5 часа после введения физраствора изменялась только в гипофизе, где она снижалась по сравнению с интактной группой животных.

Через 4 часа после инъекции физиологического раствора наблюдалось увеличение активности ФМСФ-КП у самцов только в гипофизе относительно нормы, в других отделах активность фермента не изменялась. У самок в гипофизе на стадии диэструса активность ФМСФ-КП, напротив, уменьшалась, а в проэструсе и эструсе не изменялась по сравнению с интактной группой крыс. В стриатуме на стадии проэструса активность фермента снижалась по отношению к норме. В яичниках на всех стадиях эстрального цикла активность ФМСФ-КП достоверно увеличивалась относительно нормы.

Через 18 часов после введения изотонического раствора NaCl у самцов, как и через 4 часа после воздействия, активность ФМСФ-КП в гипофизе была выше, чем в норме. У самок в эструсе активность фермента после введения физраствора в этом отделе, напротив, была выше, чем у интактной группы животных. Снижение активности ФМСФ-КП у самок на стадии эструса отмечалось также в гипоталамусе, стриатуме и яичниках по сравнению с нормой. В то время как в диэструсе в надпочечниках и яичниках активность ФМСФ-КП возрастала по отношению к интактной группе самок. 

Таким образом, введение физраствора приводило к более существенному изменению активности фермента у самок, чем у самцов, причем, у самок эти изменения затрагивали не только гипофиз и гипоталамус, но и другие исследуемые отделы. Кроме того, характер изменения активности ФМСФ-КП был разным у самцов и самок.

в) Исследование активности ФМСФ-КП при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самцов крыс 

Инъекция этанола в дозе 1 г/кг изменяла активность ФМСФ-КП в гипофизе только через 18 часов после воздействия: она уменьшалась на 25% относительно контроля. Введение этанола в дозе 4 г/кг не влияло на активность фермента в гипофизе (рис. 5).

В гипоталамусе после введения этанола в дозе 1 г/кг через 4 и 18 часов активность фермента была выше, чем у контрольной группы животных на 28% и 10% соответственно, при введении этанола в дозе 4 г/кг через 4 часа активность ФМСФ-КП также была выше, чем в контроле на 41%.

В стриатуме инъекция этанола не вызывала изменений в активности фермента. В надпочечниках активность ФМСФ-КП увеличивалась через 4 часа после введения этанола в дозе 1 г/кг и через 4 и 18 часов после введения этанола в дозе 4 г/кг на 20%, 45% и 18% соответственно по сравнению с контрольной группой самцов. В семенниках активность ФМСФ-КП достоверно возрастала только через 18 часов после инъекции этанола (доза 4 г на кг) в 2,7 раза по отношению к контролю. Такое отсроченное во времени изменение активности ФМСФ-КП, по сравнению с КПН, возможно, указывает на участие этих двух ферментов в биосинтезе различных нейропептидов.

Интересно отметить, что в гипофизе и стриатуме активность ФМСФ-КП через 4 часа после введения этанола в дозе 4 г/кг была достоверно выше, чем если этиловый спирт вводился в дозе 1 г/кг. В семенниках, напротив, через 0,5 часа после внутрибрюшинного введения этанола в дозе 1 г/кг активность фермента больше была, чем в том случае, если этанол вводился в дозе 4 г/кг. В надпочечниках также отмечено достоверное отличие во влиянии двух доз: через 18 часов после инъекции этанол в меньшей дозе не вызывал изменений в активности ФМСФ-КП, однако в большей дозе приводил к увеличению активности фермента относительно контроля.

Таким образом, наиболее существенные изменения в активности фермента наблюдались при введении этанола (доза 4 г на кг) в семенниках. Через 0,5 часа после инъекции этанола в любой из двух доз активность фермента оставалась на прежнем уровне во всех исследованных отделах. Через другие промежутки времени в тех отделах, где этанол вызывал изменения в активности ФМСФ-КП, характер этих изменений, в подавляющем большинстве случаев заключался в увеличении активности фермента. 

Активность ФМСФ-КП зависела от времени после воздействия в гипофизе: она увеличивалась к 0,5 часа и продолжала нарастать вплоть до 4 часов после введения физраствора, затем к 18 часам активность фермента снижалась до уровня 0,5 часа, после инъекции этанола в дозе 1 г/кг активность ФМСФ-КП возрастала к 0,5 часа, затем несколько снижалась, но оставалась на уровне более высоком, чем у интактных самцов, в интервале от 4 до 18 часов, после введения этанола в дозе 4 г/кг активность ФМСФ-КП имела тенденцию к росту в первые четыре часа, в промежутке 4-18 часов активность фермента не изменялась (табл. 16).

В гипоталамусе активность ФМСФ-КП зависела от времени после введения физраствора и этилового спирта в дозе 4 г/кг, однако при введении этанола в дозе 1 г/кг динамики в изменении активности фермента во времени не было обнаружено. После введения физраствора активность ФМСФ-КП возрастала к 0,5 часа, снижалась до исходного уровня к 4 часам и вновь немного увеличивалась к 18 часам. При инъекции этанола в дозе 4 г/кг активность фермента имела тенденцию к увеличению в первые четыре часа, а к 18 часам она несколько снижалась.

В стриатуме зависимость активности фермента от времени наблюдалась только при введении этанола в дозе 4 г/кг. Причем характер этих изменений был идентичен тем, которые происходили в гипоталамусе при введении той же дозы этанола.

Таблица 16. Дисперсионный анализ влияние времени на активность ФМСФ-КП (значения отношения Фишера FФ и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).



Отдел

Воздействие

Fф

Норма

Временные подгруппы









0,5 ч.

4 ч.

18 ч.



Гипофиз

Физраствор

3,47*

1

1,5

2

1,5



Этанол 1г/кг

4,75*

1

2

1,5

1,5



Этанол 4 г/кг

6,63**

1

1,5

2

2



Гипоталамус

Физраствор

7,97**

1

2

1

1,5



Этанол 1г/кг

1,38

-

-

-

-



Этанол 4 г/кг

5,57**

1

1,5

2

1,5



Стриатум

Физраствор

0,65

-

-

-

-



Этанол 1г/кг

0,76

-

-

-

-



Этанол 4 г/кг

3,63*

1

1,5

2

1,5



Надпочечники

Физраствор

1,48

-

-

-

-



Этанол 1г/кг

0,55

-

-

-

-



Этанол 4 г/кг

2,74

-

-

-

-



Семенники

Физраствор

1,14

-

-

-

-



Этанол 1г/кг

0,99

-

-

-

-



Этанол 4 г/кг

4,21*

1,5

1

1,5

2



В семенниках достоверное влияние времени на активность ФМСФ-КП также обнаружено только после введении этанола в дозе 4 г/кг. При этом через 0,5 часа активность фермента снижалась ниже уровня, характерного для интактных крыс, затем активность увеличивалась и к 18 часам была выше, чем в норме.

Таким образом, при введении этилового спирта активность ФМСФ-КП зависела от времени в гипофизе, гипоталамусе, стриатуме и семенниках (в последних трех случаях только при инъекции этанола в большей дозе). У самцов, в отличие от самок, в надпочечниках активность фермента при введении этанола не зависела от времени.

Через 0,5 часа после воздействия этанол в дозе 1 г/кг не вызывал изменений в активности ФМСФ-КП у самцов, но приводил к увеличению активности фермента в гипофизе и половых железах у самок на стадии диэструса, в эструсе активность увеличивалась не только в вышеназванных отделах, но и в надпочечниках относительно контроля. На стадии проэструса наблюдалось увеличение активности ФМСФ-КП в стриатуме и уменьшение активности фермента в надпочечниках.

Через 4 часа после введения этанола в дозе 1 г/кг на стадии диэструса у самок во всех изученных отделах активность ФМСФ-КП возрастала по сравнению с контрольной группой животных, на стадии эструса активность фермента увеличивалась только в гипофизе, а в проэструсе – в гипоталамусе и стриатуме. В то время как у самцов изменения наблюдались только в двух отделах: в гипоталамусе и надпочечниках, где активность фермента возрастала относительно контроля.

Через 18 часов после введения этанола в дозе 1 г/кг у самок в диэструсе не наблюдалось изменений в активности фермента, а в эструсе во всех исследованных отделах происходило увеличение активности фермента по сравнению с контрольной группой животных. У самцов в гипофизе в отличие от самок активность ФМСФ-КП уменьшалась, а в гипоталамусе активность фермента, так же как и у самок на стадии эструса, возрастала по отношению к контролю.

При введении этанола в дозе 4 г/кг через 0,5 часа после его введения у самцов не было выявлено изменений в активности ФМСФ-КП. У самок же на стадии диэструса в яичниках активность фермента увеличивалась, в проэструсе – уменьшалась в гипофизе, надпочечниках и яичниках, на стадии эструса в яичниках также наблюдалось снижение активности фермента, однако в надпочечниках и стриатуме активность ФМСФ-КП возрастала по отношению к контрольной группе животных.

Через 4 часа после инъекции этанола (доза 4 г на кг) у самцов активность ФМСФ-КП не подвергалась изменениям в гипофизе и половых железах. У самок на стадии диэструса в гипофизе активность фермента увеличивалась, уменьшалась в эструсе и только в проэструсе оставалась на прежнем уровне относительно контрольных значений. В яичниках активность ФМСФ-КП на стадии эструса, как и в семенниках, не подвергалась изменениям, но увеличивалась в диэструсе и эструсе относительно контроля. Однонаправленные изменения в активности ФМСФ-КП обнаружены через 4 часа после введения этилового спирта в дозе 4 г/кг в гипоталамусе у самцов и самок в диэструсе и проэструсе по отношению к контрольной группе крыс. В стриатуме у самцов и самок на стадии проэструса активность фермента также возрастала, однако у самок в стадии эструса она уменьшалась по сравнению с контролем. На стадии диэструса и проэструса инъекция этанола не вызывала у самок изменений в активности ФМСФ-КП, но приводила к уменьшению активности фермента в эструсе, а у самцов вызывала увеличение активности ФМСФ-КП относительно контрольной группы животных.

Через 18 часов после введения этанола в дозе 4 г/кг у самок на стадии диэструса активность фермента уменьшалась в гипофизе и гипоталамусе, а на стадии эструса, наоборот, наблюдалось увеличение активности фермента во всех изученных отделах по сравнению с контролем. У самцов только в надпочечниках и семенниках активность ФМСФ-КП возрастала и не изменялась в других исследованных отделах относительно контрольной группы животных.

Таким образом, этанол вызывал изменения в активности ФМСФ-КП у крыс обоего пола, однако более существенно активность фермента менялась у самок по сравнению с самцами. Характер изменений в активности фермента у самцов и самок мог быть как одно-, так и разнонаправленным и зависел от времени, через которое проводилось исследование, дозы этанола, стадии полового цикла и отдела, в котором определялась активность ФМСФ-КП.


3.2.3. Активность карбоксипептидазы М в тканях самцов крыс

а) Определение активности карбоксипептидазы М у интактных самцов крыс 

Полученные данные о распределении активности КПМ в тканях самцов крыс представлены в таблице 17.

Таблица 17. Активность КПМ в тканях самцов в норме (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, Mm, n=68).



Гипоталамус

Стриатум

0,131±0,014

0,069±0,014



Половых отличий в активности КПМ в гипоталамусе и стриатуме в норме не обнаружено. Вероятно, КПМ в исследованных отделах не вовлекается в формирование половых отличий в уровне нейропептидов.

б) Активность карбоксипептидазы М при внутрибрюшинном введении физиологического раствора в тканях самцов 

Влияние внутрибрюшинного введения физраствора обнаружено только через 0,5 часа после воздействия в гипоталамусе, где активность КПМ была на 24% ниже, чем у интактных животных (рис. 6).

У самок через 0,5 часа после инъекции, в отличие от самцов активность КПМ в гипоталамусе относительно нормы не менялась. Однако в стриатуме у самок на стадии диэструса наблюдалось увеличение активности фермента, а в проэструсе – снижение активности, в то время как у самцов и самок на стадии эструса активность КПМ не менялась по сравнению с интактной группой животных.

Через 4 часа после введения физиологического раствора происходит уменьшение активности фермента в гипоталамусе у самок на стадии проэструса и эструса, в стриатуме уменьшение наблюдается на стадии диэструса, у самцов и самок в проэструсе и эструсе такие изменения отсутствуют относительно нормы.

Через 18 часов после инъекции физраствора изменений в активности КПМ у самцов и самок не было обнаружено.

Таким образом, введение физраствора приводит к более существенным изменениям в активности фермента у самок по сравнению с самцами. Кроме того, характер этих изменений различен: у самцов введение физраствора приводило к уменьшению активности КПМ только через 0,5 часа в гипоталамусе, в то время как у самок наблюдались изменения в активности фермента как в гипоталамусе, так и в стриатуме через 0,5 и 4 часа после инъекции. Однако через 18 часов после воздействия активность КПМ не изменялась у крыс обоего пола. Отличия в изменении активности фермента у самцов и самок, вероятно, свидетельствуют о различной устойчивости к стрессу особей разного пола [33].

в) Исследование активности карбоксипептидазы М при внутрибрюшинном введении этанола в тканях самцов крыс 

Через 0,5 часа после введения этанола в дозе 1 г/кг в гипоталамусе активность КПМ была на 21% выше, чем в контроле. Через 18 часов после инъекции этилового спирта в дозе 4 г/кг активность фермента в гипоталамусе и стриатуме была на 18-19% ниже, чем в контроле. Интересно отметить, что достоверных отличий во влиянии разных доз этанола на активность КПМ не выявлено (рис. 6).





Рис. 6. Активность КПМ при введении физраствора и этанола в тканях самцов крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, Mm, n=68). 

Влияния времени на активность КПМ не обнаружено (табл. 18).

Таким образом, введение этанола вызывало примерно одинаковые изменения активности КПМ в гипоталамусе и стриатуме. Интересно отметить, что в стриатуме и гипоталамусе отсутствовала зависимость активности фермента от дозы вводимого этанола. 

У самцов и самок в диэструсе через 0,5 часа после введения этанола происходит увеличение активности КПМ в гипоталамусе, а в проэструсе – 

Таблица 18. Дисперсионный анализ влияние времени на активность КПМ (значения отношения Фишера FФ и баллы экспериментальных (временных) подгрупп).



Отдел

Воздействие

Fф



Гипоталамус

Физраствор

1,49



Этанол 1г/кг

0,74



Этанол 4 г/кг

1,33



Стриатум

Физраствор

0,21



Этанол 1г/кг

0,33



Этанол 4 г/кг

1,13



снижение активности фермента относительно контрольной группы животных. В стриатуме только у самок на стадии эструса наблюдается уменьшение активности КПМ, в остальных случаях изменений в активности фермента не происходит.

Через 4 часа после инъекции этанола в дозе 1 г/кг активность КПМ в гипоталамусе и стриатуме у самцов и в гипоталамусе у самок оставалась неизменной. В стриатуме у самок на стадии диэструса введение этанола вызывало увеличение, а в проэструсе уменьшение активности КПМ по отношению к контрольным животным.

Через 18 часов после введения этанола в дозе 1 г/кг у самцов активность КПМ в гипоталамусе и стриатуме не изменялась, у самок в стриатуме и гипоталамусе на стадии диэструса, а в последнем отделе и в эструсе активность фермента уменьшалась относительно контроля.

Через 0,5 и 4 часа после внутрибрюшинного введения этилового спирта (доза 4 г на кг) в гипоталамусе у особей разного пола изменений в активности КПМ не было обнаружено, в стриатуме у самцов активность фермента также оставалась на прежнем уровне, однако у самок через 0,5 часа в проэструсе наблюдалось увеличение активности, а в эструсе – снижение, через 4 часа на стадии диэструса активность КПМ возрастала по сравнению с контрольными цифрами.

Через 18 часов после инъекции этилового спирта в дозе 4 г/кг в гипоталамусе и стриатуме у самцов наблюдалось снижение активности КПМ, в то время как у самок изменения обнаруживались только в стриатуме на стадии диэструса, где активность фермента увеличивалась относительно контрольной группы животных.

Таким образом, введение этанола приводит к более существенным изменениям в активности КПМ у самок, чем у самцов. Причем изменения активности фермента у самцов и самок могли быть как одно-, так и разнонаправленными, что в свою очередь, определялось дозой вводимого этанола, стадией эстрального цикла, в которой находится животное, отделом, в котором определяется активность фермента и временем, через которое проводилось исследование.


ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ



Проблема алкоголизма на протяжении долгого времени остается и, видимо, еще долго будет оставаться актуальной для человечества в социальном, медицинском плане и даже в аспекте сохранения здорового генофонда людей. Отсюда понятен интерес к этой проблеме специалистов разных профилей, в том числе биохимиков. Данные экспериментальных исследований и клинические наблюдения не позволяют сделать однозначный вывод о том, какой пол более устойчив к действию этанола. Однако считается бесспорным, что алкоголизм у женщин приводит к нейроэндокринным расстройствам, нарушению генеративных функций и полового цикла [64, 81]. Несмотря на многочисленные работы отечественных и зарубежных авторов, посвященных изучению алкогольной интоксикации, патогенетический механизм вышеперечисленных нарушений и возможные пути их лечения изучены недостаточно [81].

Известно, что в этиологии и патогенезе алкоголизма важную роль играют такие регуляторные пептиды как энкефалины, β-эндорфин, АКТГ, ДСИП, нейротензин и ряд других [19, 61, 88]. Кроме того, острая алкогольная интоксикация изменяет уровень ГРФ и гонадотропинов [87, 207, 231], которые оказывают существенное воздействие на функционирование половой системы [11].

Уровень биологически активных пептидов зависит от активности ферментов, участвующих в их обмене [14, 52]. Изучение содержания уровня того или иного нейропептида в тканях не дает достаточно точных представлений о динамических процессах, происходящих в пептидэргической системе при острой алкогольной интоксикации. Более информативным является изучение процессов синтеза и утилизации нейропептидов [19]. Поэтому изучение активности КПН, ФМСФ-КП и КПМ при острой алкогольной интоксикации представляет значительный интерес как для понимания биологической роли самих ферментов, так и для понимания роли регуляторных пептидов в этиологии и патогенезе алкоголизма.

Максимальная активность КПН у интактных животных обоего пола показана в гипофизе, а также в гипоталамусе и стриатуме, то есть в тех отделах, которые характеризуются высоким уровнем нейропептидов [92]. Низкая активность фермента выявлена в надпочечниках и гонадах. Полученные данные о региональном и тканевом распределении КПН хорошо согласуются с литературными данными и подтверждают участие КПН в процессинге биологически активных пептидов [144, 233].

Наибольшая активность ФМСФ-КП отмечена в гипофизе, надпочечниках и половых железах. Установлено, что яичники продуцируют многие нейропептиды, в том числе окситоцин, релаксин, инсулиноподобные факторы роста, эндорфины и энкефалины [20, 84, 85, 109]. В надпочечниках синтезируется достаточно большое количество мет-энкефалина, однако активность КПН в этом органе невелика. Все это позволяет сделать предположение о возможном участии ФМСФ-КП, наряду с КПН в процессинге биологически активных пептидов. 

Обнаружена примерно одинаковая активность КПН и ФМСФ-КП в гипоталамусе и стриатуме, некоторые отличия в активности ферментов в гипофизе и существенные в надпочечниках и гонадах, где активность ФМСФ-КП существенно выше, чем КПН. Высокая активность ФМСФ-КП в половых железах может, вероятно, указывать на причастность этого фермента не только к обмену нейропептидов, но и к катаболизму белков, тем более, что гонады характеризуются высоким уровнем катаболизма белка. 

Следует отметить, что активность обеих карбоксипептидаз у самок, как правило, выше, чем у самцов. Полученные результаты согласуются с данными о половых отличиях в активности ряда протеолитических ферментов [44] и уровне нейропептидов [113, 132]. Не исключено, что выявленные различия связаны с половыми отличиями в функционировании ГГГС и ГГНС [44].

Согласно результатам эксперимента активность КПН в тканях интактных самок крыс зависела от стадии эстрального цикла в гипофизе, гипоталамусе, стриатуме и яичниках. Причем наиболее высокая активность фермента зафиксирована в гипофизе на стадии проэструса. Известно, что именно на этой стадии регистрируется наиболее высокий уровень ФСГ, ЛГ и пролактина в гипофизе и крови по сравнению с другими стадиями эстрального цикла [11, 17]. Кроме того, именно в проэструсе уровень эстрадиола в крови выше, чем в диэструсе и эструсе [17]. Установлено, что эстрадиол вызывал увеличение внутриклеточного уровня КПН в культуре клеток передней доли гипофиза – GH4C1 [150]. Вероятно, повышение уровня эстрадиола на стадии проэструса, может приводить к увеличению активности фермента в гипофизе. Эти данные позволяют предположить, что КПН, вероятно, участвует в регуляции уровня гонадотропных гормонов в гипофизе в ходе эстрального цикла, а активность фермента, по-видимому, регулируется уровнем половых стероидных гормонов в организме. Интересно отметить, что самая высокая активность аминопептидазо-В-подобных ферментов, которые наряду с основными карбоксипептидазами могут участвовать в биосинтезе этих гормонов, отмечается также в проэструсе [128].

В гипоталамусе повышение активности КПН на стадии эструса коррелирует с увеличением уровня опиоидных пептидов, однако не согласуется с изменением уровня люлиберина и окситоцина [11,106] в этом отделе мозга и сыворотке крови. Возможно, что в обмене этих нейропептидов принимают участие и другие основные карбоксипептидазы, в частности ФМСФ-КП.

Известно, что у крыс и мышей потребление этанола значительно уменьшается в период эструса [19, 45]. Возможно, что более высокая активность КПН в стриатуме на стадии эструса приводит к увеличению концентрации энкефалинов в этом отделе мозга. Предполагается, что повышение уровня мет-энкефалина в стриатуме соотносится с реализацией эйфоригенного эффекта с эмоционально положительно окрашенным восприятием [19], что, вероятно, может приводить к снижению добровольного потребления этанола. 

В яичниках, где обнаружены циклические изменения в уровне ряда нейропептидов [18, 240], активность КПН на стадии проэструса достоверно выше, чем в диэструсе, что позволяет предположить возможность вовлечения фермента в циклические изменения уровня биологически активных пептидов в этом органе.

Активность ФМСФ-КП зависит от стадии эстрального цикла только в яичниках, где на стадии диэструса она почти в 2 раза ниже по сравнению с проэструсом и эструсом. Именно в проэструсе и эструсе происходит разрыв и деградация фолликула, а затем развитие прогестативного тела [17], возможно, что ФМСФ-КП вовлекается в эти процессы. Отсутствие изменений в активности ФМСФ-КП в других исследованных отделах, возможно, указывает на то, что в них фермент участвует в регуляции тонической секреции регуляторных пептидов в ходе эстрального цикла, но, очевидно, не влияет на циклическую секрецию гормонов.

Активность КПМ в гипоталамусе и стриатуме у самок крыс достоверно не отличается от активности фермента у самцов. Вероятно, различный уровень регуляторных пептидов, обнаруживаемый у особей разного пола в данных отделах обусловлен функционированием других протеолитических ферментов. Кроме того, активность КПМ в гипоталамусе и стриатуме самок не зависит от стадии эстрального цикла. Возможно, что в гипоталамусе и стриатуме КПМ участвует в регуляции базального уровня биологически активных пептидов, но, вероятно, не вовлекается в циклические изменения уровня нейропептидов в ходе полового цикла. Отсутствие достоверных половых отличий в активности КПМ и зависимости активности фермента от стадии эстрального цикла, очевидно, может свидетельствовать о разной биологической роли КПМ и ФМСФ-КП, а также КПН [27, 28, 29].

У самцов крыс введение физраствора вызывало увеличение активности КПН. Увеличение активности фермента в гипофизе коррелирует с увеличением уровня АКТГ [19, 86], являющимся важным компонентом стресс реализующих систем и является специфичным ответом на стресс, которым, по-видимому, является внутрибрюшинная инъекция физраствора. Эти данные хорошо согласуются с полученными ранее [38]. 

У самок крыс введение физиологического раствора приводило к снижению активности КПН в гипофизе через 0,5 и 4 часа в проэструсе и эструсе, такие же изменения регистрировались в гипоталамусе самцов и самок крыс через 4 часа после инъекции. Вероятно, это связано с особенностями воздействия внутрибрюшинной инъекции физраствора, при которой в организм поступает дополнительное количество жидкости. Понижение активности КПН может способствовать ускорению высвобождения жидкости из организма благодаря уменьшению образования вазопрессина [72]. У самок обнаружено снижение активности КПН в надпочечниках, чего не наблюдалось у самцов. Вероятно, это обусловлено половыми отличиями в ответной реакции организма на стресс [45]. Обнаруженное уменьшение активности фермента в надпочечниках у самок может являться косвенным доказательством включения надпочечников в ответ на стресс [19, 86]. Полученные нами данные об изменении активности КПН у самок крыс при внутрибрюшинном введении физраствора хорошо согласуются с полученными ранее по влиянию инъекции оливкового масла на активность фермента у самок мышей [43]. 

Интересно отметить, что у самцов и самок отсутствовали изменения в активности КПН в гонадах, что подтверждает тезис о ведущей роли ГГНС в ответе на стресс [19, 86]. Отсутствие изменений в активности КПН во всех исследуемых органах у самок крыс через 18 часов после инъекции физраствора, возможно, свидетельствует о более быстром угасании стресс-реакции, по сравнению с самцами.

У самок в гипофизе после введения физиологического раствора активность ФМСФ-КП уменьшалась на стадии эструса, оставаясь на прежнем уровне на других стадиях эстрального цикла, в то время как у самцов наблюдалось увеличение активности фермента в этом отделе. У самцов введение физраствора вызывает изменение активности ФМСФ-КП также в гипоталамусе через 0,5 часа после воздействия, а у самок – и в других исследованных отделах. Принимая во внимание то, что уровень нейропептидов зависит от активности ферментов их обмена, можно предположить, что выявленные половые отличия в изменении активности ФМСФ-КП способствуют различной секреции биологически активных пептидов у самцов и самок при стрессе [30, 33]. 

Наиболее значительно активность ФМСФ-КП при введении физраствора изменялась в яичниках, причем в подавляющем большинстве случаев она увеличивалась. Не исключено, что ФМСФ-КП может вовлекаться в процессинг регуляторных пептидов при стрессе и/или в деградацию избытка нейропептидов, которые образуются в ответ на стресс. Кроме того, эти данные, возможно, могут частично объяснить нарушения эстрального цикла, прекращение овуляции под действием стресса [61, 81, 86].

Интересно отметить, что на стадии диэструса в большинстве отделов после введения физраствора активность ФМСФ-КП увеличивалась, а в эструсе, напротив, снижалась. Так как этот фермент, по всей видимости, вовлекается в процессинг нейропептидов, а, следовательно, может определять их уровень, от чего, в свою очередь, зависит устойчивость организма к стрессу, можно предположить, что эти результаты указывают на различную устойчивость к стрессирующему воздействию крыс на разных стадиях эстрального цикла [45].

Следует отметить, что активность обоих ферментов у самок изменялась более существенно, чем у самцов, что хорошо согласуется с имеющимися в литературе сведениями о том, что ГГНС самок более подвержена воздействию стресса, чем самцов [6].

Введение физраствора приводит к снижению активности КПМ в гипоталамусе через 4 часа после воздействия у самок крыс на стадии проэструса и эструса и через 0,5 часа у самцов. Известно, что α-неоэндорфин, динорфин 1-13 в качестве С-концевой аминокислоты содержат лизин [72], следовательно, они могут выступать в качестве субстратов для КПМ [123, 248], которая локализуется на внешней стороне плазматической мембраны [123, 248]. Выявленное уменьшение активности КПМ, возможно приводит к замедлению разрушения этих пептидов, обладающих способностью проявлять седативное действие, снижать исследовательскую активность [19, 72]. Что коррелирует с данными о снижении подвижности крыс в тесте “открытое поле” через 4 часа после инъекции физраствора и частичном восстановлении активности через 24 часа после воздействия [38]. В стриатуме через 0,5 часа после инъекции активность КПМ на стадии диэструса повышалась, а в проэструсе снижалась; через 4 часа снижение активности наблюдалось только в диэструсе. Известно, что КПМ участвует в модуляции и инактивации нейропептидов, тем самым, влияя на их уровень в организме, от которого во многом зависит устойчивость к стрессу. Поэтому разнонаправленные изменения активности КПМ в стриатуме у самок могут свидетельствовать, о различной устойчивости к стрессу самок крыс на разных стадиях эстрального цикла [45]. Отсутствие изменений в активности фермента после инъекции физраствора у самцов и их наличие у самок, по-видимому, свидетельствует о различной устойчивости крыс разного пола к стрессирующему воздействию [2].

Введение этанола приводит к увеличению активности КПН в гипофизе на стадии эструса (доза 1 г на кг) и диэструса (доза 4 г/кг), что согласуется с представлениями об активации ГГНС и увеличении секреции и образования АКТГ, β-эндорфина, пролактина при острой алкогольной интоксикации [19, 86]. Однако в проэструсе и через 4 часа после инъекции этанола в диэструсе активность КПН была ниже по сравнению с контрольными животными. Вероятно, разнонаправленные изменения в активности КПН обусловлены различным физиологическим, а, следовательно, и гормональным статусом самок крыс на разных стадиях эстрального цикла [21, 60]. Принимая во внимание возможное участие КПН в биосинтезе гонадотропных гормонов [23], становятся понятными нарушения полового цикла за счет изменений в активности КПН, которые приводят к изменению уровня гонадотропинов. Особенно пагубным, вероятно, является снижение активности КПН на стадии проэструса по сравнению с контрольными и интактными группами животных, когда активность фермента, напротив, по результатам нашего эксперимента в норме увеличивается.

У самок введение этанола приводило к увеличению активности КПН в гипоталамусе через 0,5 часа в диэструсе и эструсе и через 4 часа в диэструсе, что также свидетельствует об увеличении активности ГГНС при острой алкогольной интоксикации и, в частности, коррелирует с данными о возрастании концентрации β-эндорфина в гипоталамусе, что связывают с проявлением эмоционально позитивных свойств этанола [19]. Однако введение этанола в дозе 4 г/кг приводит к снижению активности фермента в эструсе через 4 часа и в диэструсе через 18 часов, что, вероятно, ведет к уменьшению синтеза β-эндорфина и проявлению эмоционально негативных свойств этанола в больших дозах [19]. В проэструсе, когда в организме фиксируется высокий уровень эстрадиола, изменения активности КПН отсутствовали. Эти данные подтверждаются сведениями о снижении уровня опиоидных пептидов в гипоталамусе овариоэктомированных самок при совместном введении этанола и эстрадиола [107], что, по-видимому, свидетельствует о возможной модификации ответной реакции опиоидэргической системы на действие этанола эстрадиолом [107].

У самцов в гипоталамусе через 0,5 и 4 часа после инъекции этанола наблюдается повышение активности КПН, которое может быть связано с увеличением образования КРФ, β-эндорфина при острой алкогольной интоксикации [19, 86]. Однако через 18 часов после внутрибрюшинного введения этанола происходит снижение активности КПН по отношению к контрольной группе животных, что, возможно, является результатом действия компенсаторных механизмов, направленных на нормализацию функционального состояния пептидэргических систем гипоталамуса, а, следовательно, гипофиза и периферических желез внутренней секреции.

Введение этанола самцам вызывало в большинстве случаев менее существенные изменения активности КПН в гипофизе и гипоталамусе по сравнению с самками, что согласуется с данными о более существенном изменении уровня плазматических гонадотропинов, АКТГ и кортикостероидов у самок по сравнению с самцами [217, 231].

В стриатуме у самцов через 18 часов после введения этанола в дозе 1 г/кг и через 0,5 часа в дозе 4 г/кг обнаруживалось повышение активности КПН, что согласуется с данными об увеличении содержания мет-энкефалина [241], ДСИП в стриатуме [22]. Считается, что увеличение уровня метэнкефалина в стриатуме соотносится с реализацией эйфоригенного эффекта, а ДСИП приписывают, в том числе антистрессорные, анксиолитические свойства. Вероятно, именно такое действие этанола при однократном введении и связано с развитием влечения к этанолу, особенно у предрасположенных к алкоголизму индивидуумов [19].

Однако через 4 часа после инъекции этанола в любой из двух доз происходило снижение активности КПН в стриатуме у самцов, подобные изменения наблюдались также у самок на стадии эструса. Это, возможно, указывает на то, что в образование энкефалинов, ДСИП могут вовлекаться другие карбоксипептидазы, в том числе и ФМСФ-КП.

Введение этанола самкам крыс в дозе 1 г/кг на стадии диэструса и эструса приводит к увеличению активности КПН в надпочечниках, что согласуется с данными об активации ГГНС при острой алкогольной интоксикации [19]. При инъекции этанола в дозе 4 г/кг у самок в проэструсе и самцов происходит увеличение активности фермента через 0,5 часа после инъекции и снижение активности через 4 часа. Наши результаты согласуются с данными Беляева Н.А. и соавт. об усиленном образовании энкефалинов в промежутке между 15 и 60 минутами после внутрибрюшинного введения этанола и об угнетении синтеза через более длительный промежуток времени [15]. Что, вероятно, является результатом действия компенсаторных механизмов, направленных на нормализацию функционального состояния энкефалиновой системы надпочечников.

Введение этанола в дозе 1 г/кг приводит к возрастанию активности КПН в яичниках у самок на стадии диэструса через 4 часа после инъекции, в дозе 4 г/кг – к увеличению активности КПН в диэструсе через 0,5 часа и проэструсе через 4 часа и к уменьшению активности фермента в эструсе через 18 часов после инъекции – все это, вероятно, приводит к нарушению синтеза биологически активных пептидов в яичниках в ходе эстрального цикла.

В половых железах самцов через 0,5 часа после введения этанола в любой из двух доз активность КПН достоверно уменьшается по сравнению с контролем. Однако через 4 и 18 часов активность фермента достоверно не отличается от таковой у животных контрольной группы. Вероятно, это связано с тем, что этанол способен вызывать значительное снижение уровня тестостерона [98], экзогенное введение которого приводит к увеличению активности КПН в семенниках [78]. В то же время, после однократной инъекции алкоголя уровень тестостерона достаточно быстро нормализуется [98]. Следовательно, снижение уровня тестостерона и возвращение его к исходным значениям, вызванные инъекцией этанола, по-видимому, объясняет происходящие изменения в активности КПН.

 Известно, что введение этанола является стрессом для самцов и самок [19, 88], об этом свидетельствуют сходные изменения активности КПН при введении этанола и физраствора в гипофизе по сравнению с интактными животными. Однако необходимо заметить, что введение этанола в дозе 1г/кг в гипофизе на стадии эструса, в гипоталамусе и в стриатуме и инъекция этанола в дозе 4 г/кг в стриатуме не приводит к изменению активности КПН относительно нормы, хотя при введении физиологического раствора сдвиги в активности фермента наблюдались. Это, вероятно, можно объяснить тем, что этанол в определенных условиях может выступать в роли антистрессорного фактора. Результаты нашего эксперимента указывают на то, что меньшая доза этанола нормализует активность фермента в большем числе органов. Эти данные находят свое подтверждение в литературе, где приводятся сведения о том, что более выраженный анксиолитический, антистрессорный эффект присущ малым дозам этанола, а при увеличении дозы этанола начинает преобладать депрессивный, наркотический компонент [19].

Интересно отметить, что введение этанола в дозе 1 г/кг у самок на стадии эструса не вызывает изменения активности КПН относительно нормы, а в надпочечниках она повышается. Это, вероятно, связано с тем, что в гипофизе и надпочечниках синтезируются качественно разные пептиды в ответ на острую алкогольную интоксикацию: из гипофиза в кровяное русло в числе прочих нейропептидов поступает АКТГ [158, 230], который способствует развитию стресс-реакции в организме, а из надпочечников в кровь выделяется мет-энкефалин, который обладает стресспротективным действием [15]. Таким образом, возможно, что введение этанола в малой дозе на стадии эструса подавляет развитие стресс-реакции благодаря совместному действию двух вышеназванных факторов и, по-видимому, обладает более выраженным стресспротекторным действием, чем на других стадиях эстрального цикла.

Более существенные изменения активности КПН в гипофизе у самцов, а у самок в гипофизе и яичниках по сравнению с другими органами свидетельствует о том, что введение этанола существенно изменяет гормон продуцирующую деятельность гипофиза и подтверждает данные о том, что этанол в первую очередь поражает гипофизарно-гонадальную систему [19].

Введение самкам крыс этанола в дозе 1 г/кг приводило к увеличению активности ФМСФ-КП в гипофизе на стадиях эструса и диэструса, что согласуется с данными об увеличении уровня АКТГ, β-эндорфина, пролактина после острой алкогольной интоксикации [66, 94, 158, 159, 206, 230, 257]. Введение этанола вызывало изменения активности ФМСФ-КП и у самцов, однако, как правило, эти изменения были менее выражены. При введении этанола в дозе 1 г/кг в гипофизе только через 18 часов наблюдалось увеличение активности фермента. Эти данные, по-видимому, могут подтверждать предположение о роли ФМСФ-КП как фермента, участвующего в процессинге регуляторных пептидов [28, 29, 42]. Однако введение этанола на стадии проэструса приводит к снижению активности фермента более чем в 2 раза (подобные изменения обнаруживаются и для КПН), что, возможно, приводит к уменьшению биосинтеза гонадотропных гормонов и отсутствию их пика в периовуляторный период [179]. Таким образом, по-видимому, возникают грубые дискоординационные нарушения механизмов обратной связи в функции гипофизарно-гонадальной системы, которые могут быть обусловлены как снижением чувствительности гипоталамических регуляторных центров, так, и, вероятно, связаны с уменьшением синтеза гонадотропинов [86], за счет уменьшения активности ферментов, участвующих в их биосинтезе.

Введение этанола в любой из двух доз приводит к увеличению активности ФМСФ-КП в гипоталамусе через 4 и 18 часов после воздействия, что, возможно, указывает на вовлечение этого фермента в биосинтез нейропептидов, уровень которых изменяется после острой алкогольной интоксикации (КРФ, β-эндорфин, энкефалины). Однако такое отсроченное во времени изменение активности ФМСФ-КП по сравнению с КПН, возможно, указывает на участие этих двух ферментов в биосинтезе различных нейропептидов. Эту же мысль подтверждают данные работы, в которой указывается, что КПН имеет большее сродство к субстратам, в которых перед остатком основной аминокислоты содержится остатки глицина или аланина, а ФМСФ-КП – к субстратам, содержащих в качестве предшествующей аргинину и лизину аминокислоту с гидрофобным радикалом [75].

В гипоталамусе у самцов через 4 и 18 часов после инъекции этанола в дозе 1 г/кг активность ФМСФ-КП повышается, увеличивается она и после инъекции этанола в дозе 4 г/кг через 4 часа после воздействия. Разнонаправленные изменения активности фермента в гипофизе и гипоталамусе у самцов, возможно, связаны с тем, что в этих отделах синтезируются различные биологически активные пептиды [38], которые выполняют разные функции при острой алкогольной интоксикации. Так, в гипофизе синтезируется АКТГ, который регулирует синтез и секрецию кортикостероидов надпочечниками [19, 86]. В гипоталамусе синтезируются нейропептиды (вазопрессин, КРФ, энкефалины, вещество Р), регулирующие синтез и секрецию АКТГ [43].

У самок в стриатуме при введении этанола в обеих дозах в подавляющем большинстве случаев активность ФМСФ-КП повышалась. В стриатуме у самцов также наблюдается увеличение активности фермента через 4 часа после введения этанола в дозе 4 г/кг. Это, по-видимому, подтверждает высказанное нами ранее предположение об участии этого фермента в биосинтезе ряда нейропептидов в стриатуме.

В надпочечниках при введении этанола у самок крыс на стадии проэструса наблюдается уменьшение активности ФМСФ-КП, на стадии эструса – разнонаправленные изменения активности фермента в зависимости от времени и дозы этанола, а на стадии диэструса активность фермента либо не изменялась, либо увеличивалась. Разнонаправленные изменения активности фермента, наблюдаемые не только в надпочечниках, но и в остальных изученных отделах на разных стадиях эстрального цикла, могут приводить к изменению уровня нейропептидов (некоторые из которых определяют развитие влечения к алкоголю). Это может свидетельствовать о различном уровне алкогольной мотивации крыс на разных стадиях эстрального цикла. Так в литературе имеются данные о дифференцированной динамике изменения уровня пролактина, АКТГ, β-эндорфина, мет-энкефалина при введении этанола у крыс с различной предрасположенностью к алкоголю [19]. Эта гипотеза согласуется с данными о том, что у мышей, предпочитающих этанол, обнаружено существенное повышение уровня мРНК АПФ в стриатуме после отмены этанола при хронической алкоголизации по сравнению с животными, отвергающими этанол [265].

Увеличение активности ФМСФ-КП у самцов при алкогольной интоксикации в надпочечниках, где этот фермент, возможно, участвует в биосинтезе энкефалинов, уровень которых увеличивается после введения этанола, подтверждает данные об активации ГГНС при острой алкогольной интоксикации [19, 74].

Обращает на себя внимание очень сильное изменение активности ФМСФ-КП в яичниках при введении этанола по отношению к контрольной группе животных, причем более выраженное в эструсе. В ряде случаев повышение активности фермента после инъекции этанола превышало на 400% контрольные значения, при сравнении активности ФМСФ-КП в яичниках самок крыс, испытавших острую алкогольную интоксикацию, с интактной группой животных это увеличение было еще большим и превосходило активность в последней группе почти на 1200%. Что, вероятно, принимая во внимание возможное участие ФМСФ-КП в процессах деградации фолликула и формировании, а затем и в регрессии желтого тела, а также роль фермента в биосинтезе нейропептидов, может объяснять нарушения эстрального цикла, ановуляцию и другие патологические процессы, наблюдаемые при алкоголизме [64, 81]. В настоящее время важное значение в возникновении гаметопатий придают изменению гормональной регуляции репродуктивного процесса и к вызываемым им нарушениям гаметогенеза и овуляции [73]. Одним из факторов, вызывающих изменение гормонального статуса является этанол. Известно, что введение этанола крысам из расчета 3,6 г/кг существенно увеличивает частоту анеуплоидных гамет (на 25% по сравнению с контролем) [73]. Введение этанола приводит, как правило, к снижению уровня половых стероидных гормонов [2, 64, 65], которые могут оказывать влияние на активность исследуемых карбоксипептидаз [78]. Так, вероятно, инъекция этанола, ведет к снижению уровня прогестерона в организме, что приводит к увеличению активности ФМСФ-КП, более выраженному на стадии эструса, чем на стадии диэструса. Вероятно, это связано с тем, что в диэструсе уровень прогестерона ниже, чем в эструсе [17], поэтому инъекция этанола вызывает более значительное изменение этого гормона именно в послеовуляторной фазе цикла и, как следствие, более существенное изменение активности фермента. 

Введение этанола самцам крыс вызывало менее существенные изменения в активности ФМСФ-КП в гонадах: активность фермента возрастала только через 18 часов после инъекции этанола в дозе 4 г/кг. Вероятно, это может свидетельствовать о большей устойчивости пептидэргической системы половых желез самцов к действию этанола, по сравнению с самками. 

Данные об изменении активности ФМСФ-КП подтверждают мнение о том, что инъекция этанола является стрессом для животных [19, 74, 86, 88]. Так как она вызывает, как правило, увеличение активности ФМСФ-КП, что может, видимо, приводить к усиленному образованию нейропептидов, запускающих и ограничивающих стресс-реакцию [71, 83]. Кроме того, после инъекции этанола в большинстве случаев происходят изменения, сходные с теми, которые наблюдаются при введении физраствора.

Однако в ряде случаев, например, в проэструсе при введении физраствора активность ФМСФ-КП уменьшается, но введение этанола нивелирует эти изменения, вероятно, нормализуя функционирование пептидэргических систем.

Интересно отметить, что введение физраствора на стадии эструса приводит к снижению активности ФМСФ-КП во всех исследованных тканях, кроме надпочечников. Однако инъекция этанола вызывает противоположные изменения (причем более выраженные) активности фермента по отношению к норме, что приводит к значительному повышению активности ФМСФ-КП относительно контроля. Это, вероятно, связано с особенностями гормонального статуса животных на данной стадии эстрального цикла [17, 45, 247], а также указывает на специфичность воздействия этанола [86].

Внутрибрюшинное введение этанола приводит к увеличению активности КПМ в гипоталамусе у самок на стадии диэструса и у самцов через 0,5 часа после введения этанола в дозе 1 г/кг. Увеличение активности фермента наблюдается также в стриатуме у самок в проэструсе через 0,5 часа после инъекции этанола в дозе 4 г/кг и на стадии диэструса при введении этанола в любой из двух доз. Эти данные согласуются со сведениями о том, что под влиянием острой алкогольной интоксикации увеличивается уровень многих нейропептидов, которые обладают эйфоризирующим, антистрессорным, анксиолитическим действием, а также нейропептидов, активирующих систему негативного подкрепления (проконвульсанты, пептиды, индуцирующие страх, агрессию, дисфорию) [19]. Вероятно, увеличение активности КПМ связано с инактивацией большого количества пептидов, секретируемых из клетки в ответ на введение этанола.

Кроме того, увеличение активности КПМ может усиливать деградацию эндозепина (эндогенный антагонист ГАМК-рецепторов, содержит С-концевой лизин, а, следовательно, может быть субстратом для КПМ), повышенный уровень которого вызывает беспокойство, проконфликтное поведение [72]. Таким образом, видимо, влияя на активность КПМ, этанол может понижать уровень этого нейропептида, что, вероятно, может частично объяснить анксиолитический, антистрессорный эффект этилового спирта [19, 88].

Однако в ряде случаев активность КПМ снижается под влиянием инъекции этанола, что, по-видимому, может способствовать проявлению таких свойств этанола, как анальгезирующий и седативный эффекты, способность вызывать чувство эйфории за счет уменьшения инактивации динорфина А 1-13 и α-неоэндорфина. Тем более, что в гипоталамусе и стриатуме отмечается тенденция к увеличению уровня этих нейропептидов при острой алкогольной интоксикации [243]. Вероятно, механизм, посредством которого этанол проявляет свои специфические эффекты, частично определяется стадией эстрального цикла, в которой пребывает животное.

Для определения особенностей ответной реакции организма на острую алкогольную интоксикацию интересно рассмотреть влияние стадии эстрального цикла и силы оказываемого воздействия на активность исследуемых карбоксипептидаз.

Таблица 19. Дисперсионный анализ влияния стадии эстрального цикла, силы воздействия и их взаимодействия на активность КПН, ФМСФ-КП и КПМ (значения критерия Фишера: FФ1– влияние стадии эстрального цикла, FФ2 – влияние силы воздействия FФ3 – взаимодействие влияния стадии эстрального цикла и силы воздействия).



Фермент

Отдел

Самки

Самцы





FФ1

FФ2

FФ3

FФ2

КПН

Гипофиз

0,48

1,46

10,87***

1,94



Гипоталамус

12,83***

3,40*

0,47

3,41*



Стриатум

1,43

0,39

1,80

2,22



Надпочечники

1,13

0,39

0,93

1,99



Яичники

0,74

1,10

2,11

0,89

ФМСФ-КП

Гипофиз

6,96**

11,94***

3,80***

1,36



Гипоталамус

13,04***

7,45***

3,50**

3,14



Стриатум

16,10***

6,91**

2,75*

2,88



Надпочечники

8,26****

6,69**

1,46

4,89*



Яичники

3,13*

6,87**

4,78**

2,48

КПМ

Гипоталамус

3,63*

2,37

0,97

0,64



Стриатум

3,11*

0,49

2,31

0,74



Таким образом, обнаружено достоверное влияние стадии эстрального цикла на активность ФМСФ-КП и КПМ во всех исследованных отделах при острой алкогольной интоксикации. Активность КПН зависела от стадии эстрального цикла только в гипоталамусе. Сила воздействия влияла на активность ФМСФ-КП у самок во всех изученных отделах, а у самцов – только в надпочечниках. На активность КПН сила воздействия влияла у особей обоего пола только гипоталамусе и не влияла на активность КПМ. Можно предположить, что отличия в ответной реакции организма самок на острую алкогольную интоксикацию на разных стадиях эстрального цикла в большей степени обусловлены изменением активности ФМСФ-КП и КПМ в исследуемых отделах, чем КПН. Кроме того, специфичность действия больших и малых доз этанола и различия ответной реакции особей разного пола на алкоголь, вероятно, в большей степени, также опосредуется ФМСФ-КП.

Стоит отметить, что зависимость активности КПН от времени у самцов прослеживается только в гипофизе и надпочечниках, а у самок в гипофизе и гипоталамусе, причем она имеет сходный характер у самцов и самок в диэструсе и эструсе, где активность в подавляющем большинстве случаев повышалась через 0,5 часа после инъекции, понижалась к 4 часам, а к 18 часам, как правило, увеличивалась. При внутрибрюшинном введении физраствора динамика в изменении активности фермента была другой. Эти данные подтверждают представление о том, что острая алкогольная интоксикация приводит к активации многих пептидэргических систем, в частности, опиоидной [86, 88]. Стадия активации затем сменяется стадией, на которой активность КПН уменьшается, что, вероятно, способствует нормализации пептидэргических систем. Однако далее активность фермента вновь подвергается изменениям, что согласуется с данными о долговременном изменении уровня нейропептидов после алкогольной интоксикации. 

После введения физраствора или этанола также обнаруживалась зависимость активности ФМСФ-КП от времени, причем характер этих изменений, по-видимому, определялся полом животного, стадией эстрального цикла, а также органом, в котором проводилось определение активности фермента. В отличие от КПН, сходства в изменении активности ФМСФ-КП у особей разного пола, а также у самок на разных стадиях эстрального цикла, было меньше. Это позволяет предположить, что, возможно, ФМСФ-КП принадлежит более важная роль в дифференцированной реакции пептидэргических систем на острую алкогольную интоксикацию на различных стадиях полового цикла и в зависимости от пола. Обнаружено также наличие зависимости активности КПМ от времени после воздействия у самок крыс. Интересно отметить, что у самцов активность этого фермента не зависела от времени, вероятно, этим также можно частично объяснить половые различия в течении и развитии алкогольной интоксикации.

В норме в ходе эстрального цикла отмечается изменение содержания различных биологически активных пептидов как в мозге, так и в периферических тканях [11, 141, 257,]. Очевидно, что изменение уровня регуляторных пептидов во многом связано с изменениями в функционировании ферментных систем, участвующих в их синтезе и деградации [28, 41]. Острая алкогольная интоксикация вызывает изменение уровня различных нейропептидов, в том числе гонадотропных, опиоидных, нейропептида Y, адренокортикотропина, ДСИП и др. [22, 102, 137, 158, 159]. Возможно, что изменение активности КПН, ФМСФ-КП и КПМ, которые участвуют в обмене нейропептидов, у крыс с острой алкогольной интоксикацией отражает один из механизмов опосредованного нарушения содержания регуляторных пептидов на разных стадиях эстрального цикла, а также играет роль в этиологии и патогенезе алкоголизма.

Наблюдающееся в некоторых тканях при острой алкогольной интоксикации различное и/или разнонаправленное изменение активности КПН, ФМСФ-КП и КПМ или изменение активности только одного из ферментов, может быть одной из причин нарушения соотношения уровня разных нейропептидов в этих отделах. В частности, имеются сведения об избирательном изменении содержания энкефалинов в разных регионах мозга: снижение содержания уровня мет-энкефалина в стриатуме, таламусе и продолговатом мозге при неизменном уровне лей-энкефалина и снижение уровня мет-энкефалина в коре головного мозга при алкогольной интоксикации [19, 243]. При длительной алкоголизации наблюдается нарушение в соотношении АКТГ/β-эндорфин [157]. 

В норме наблюдаются половые отличия активности КПН и ФМСФ-КП и в мозге, и в периферических тканях. Острая алкогольная интоксикация, зачастую по-разному изменяя активность изучаемых ферментов, приводит к нарушению этого соотношения. Так активность КПН и ФМСФ-КП в гипофизе выше у самок, однако после алкогольной интоксикации активности ферментов у особей разного пола выравниваются, либо у самцов активность КПН и ФМСФ-КП становится выше. Кроме того, в тех тканях, в которых не было половых отличий, они появляются после инъекции этанола.

Интересно также отметить, что в тех отделах, где не наблюдалось зависимости КПН, ФМСФ-КП и КПМ от стадии эстрального цикла, она появлялась после инъекции этанола. Известно, что алкогольная интоксикация изменяет содержание половых гормонов и нейропептидов, регулирующих их секрецию [2, 87, 98]. Известно также, что активность КПН и ФМСФ-КП зависит от половых гормонов [78, 79]. Таким образом, изменение активности ферментов у алкоголизированных особей и изменение их соотношения у самцов и самок, вероятно, отражает один из механизмов нарушения функционирования половой системы, а также может носить этиопатогенетический характер для синдромологии алкоголизма.

Интересно отметить, что после введения этанола в дозе 1 г/кг и 4 г/кг активность исследуемых ферментов на стадии проэструса была, как правило, ниже, чем в эструсе и диэструсе, хотя в норме чаще наблюдалось обратное соотношение активности, что также можно рассматривать как один из механизмов негативного влияния этанола на половую систему самок крыс. Вероятно, это связано с тем что в ходе эстрального цикла меняется уровень половых стероидных гормонов, которые могут оказывать влияние на активность КПН, ФМСФ-КП и, возможно, КПМ [78, 79, 183].

Для более полного понимания биологической роли ФМСФ-КП, которая является менее изученным ферментом, чем КПН и КПМ, мы провели корреляционный анализ (табл. 20, 21).

Таблица 20. Коэффициенты корреляции между активностью основных КП в тканях и отделах мозга самок крыс при острой алкогольной интоксикации (* - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001).



Ткань, отдел мозга

КПН и ФМСФ-КП

КПН и КПМ

ФМСФ-КП и КПМ

Гипофиз

0,202* (115)

-

-

Гипоталамус

0,472*** (137)

0,310***(146)

0,083 (137)

Стриатум

0,518*** (142)

0,005 (144)

0,009 (138)

Надпочечники

-0,063 (133)

-

-

Яичники

0,137 (114)

-

-



Таблица 21. Коэффициенты корреляции между активностью основных КП в тканях и отделах мозга самцов крыс при острой алкогольной интоксикации (** - р<0,01).



Ткань, отдел мозга

КПН и ФМСФ-КП

КПН и КПМ

ФМСФ-КП и КПМ

Гипофиз

0,246 (46)

-

-

Гипоталамус

0,254 (53)

0,383** (55)

-0,05 (55)

Стриатум

0,017 (53)

0,377** (54)

-0,139(54)

Надпочечники

0,003 (55)

-

-

Семенники 

0,192 (49)

-

-



У самок отмечена высокая положительная корреляция между активностью КПН и ФМСФ-КП в гипофизе, гипоталамусе и стриатуме, но не в надпочечниках и яичниках. Это может быть связано с тем, что ФМСФ-КП, вероятно, выполняет разные функции в мозге и периферических тканях, например, в мозге вовлекается в процессинг, а в тканях в деградацию нейропептидов. Возможно также существование нескольких форм фермента, различающихся тканевой и региональной локализацией. Не исключено, что в мозге и тканях ФМСФ-КП представлена разными ферментами с близкими физико-химическими свойствами. Свойства ФМСФ-КП очень сходны со свойствами ЛКПА [204, 226]. Возможно, что ФМСФ-КП и ЛКПА являются изоферментами, которые отличаются тканевой и субклеточной локализацией. В этом случае представляется вероятным, что изофермент, преобладающий в нервной ткани, выполняет функции, отличные от изофермента, преобладающего в периферических тканях. Однако у самцов положительной корреляции между активностью КПН и ФМСФ-КП не обнаружено ни в одном из изученных отделов. Известно, что активность ферментов, вовлекающихся в обмен нейропептидов различна у самцов и самок [44, 129, 225]. Поэтому, возможно, что ФМСФ-КП по-разному функционирует у самцов и самок и/или вовлекается в разные процессы, связанные с ответом на острую алкогольную интоксикацию. Интересно отметить, что между КПН и КПМ обнаруживается статистически значимая положительная корреляция в гипоталамусе, а у самцов в гипоталамусе и стриатуме. Возможно, что изменение интенсивности биосинтеза нейропептидов под действием КПН влечет за собой соответствующее изменение скорости их инактивации и модификации при участии КПМ.

Весьма важным является вопрос о механизмах изменения активности основных карбоксипептидаз под влиянием внутрибрюшинного введения этанола. Ген КПH содержит достаточно большое количество регуляторных участков, которые отличаются у разных типов клеток, что позволяет предположить возможность различной регуляции экспрессии гена фермента в разных типах клеток и возможность регуляции экспрессии различными агентами [177, 188, 253], которыми могут быть как сам этанол, так и продукты его метаболизма. Аналогичные механизмы регуляции можно предположить для ФМСФ-КП и КПМ. Для КПН и ФМСФ-КП показана зависимость активности от стероидных гормонов [78, 79]. Возможно, что этанол, изменяя уровень тестостерона, прогестерона, эстрадиола, кортикостерона приводит к изменению интенсивности транскрипции мРНК данных ферментов.

Известно также, что острое введение этанола стимулирует активность аденилатциклазы в ЦНС и периферических органах, а также в культуре нервных клеток [237, 262] (предполагается, что в разных структурах мозга алкоголь может взаимодействовать с разными функциональными компонентами аденилатциклазной системы) [259]. Поэтому, не исключено, что во влиянии этанола на активность исследуемых карбоксипептидаз могут быть задействованы цАМФ-зависимые механизмы.

Острая алкогольная интоксикация вызывает усиленное высвобождение в синаптическую щель опиоидных пептидов, кроме того, этанол и/или его метаболиты также могут взаимодействовать с опиоидными рецепторами (в основном δ-типа) [88], что, вероятно, приводит к оккупации большей части опиоидных рецепторов, это, в свою очередь, может вызывать по механизму обратной связи изменение уровня биосинтеза соответствующих нейропептидов [92], в образовании которых принимают участие КПН и, возможно, ФМСФ-КП, а в деградации – КПМ. По-видимому, изменение активности изучаемых ферментов в данном случае может происходить на уровне транскрипции их генов.

Известно, что острая алкогольная интоксикация приводит к понижению внутриклеточной концентрации Са2+ [10]. Несмотря на то, что ионы Са2+ непосредственно не влияют на активность КПН, в ее составе обнаружен участок связывания данных ионов [213]. Ионы Са2+ способствуют агрегации КПН и связыванию ее с мембраной [255]. Возможно, что биологическая роль растворимой и мембраносвязанной КПН отличается [32, 39, 97]. Предполагают, что обе формы принимают участие в процессинге, но мембраносвязанная, наряду с этим, способна принимать участие в сортировке пептидов [118, 119, 215, 244,]. Кроме того, имеются сведения о том, что активность прогормонконвертазы – фермента, участвующего в процессинге проКПН, регулируется ионами Са2+ [148]. Изложенное выше позволяет предположить, что действие этанола на активность КПН может быть опосредовано изменением внутриклеточной концентрации ионов Са2+. Это может приводить как к изменению уровня активности фермента, так и к изменению соотношения растворимой и мембраносвязанной форм, что в свою очередь влияет на процессинг и сортировку биологически активных пептидов. Возможно, что аналогичный механизм будет действовать и в отношении ФМСФ-КП, так как для нее также обнаружена мембраносвязанная форма.

В связи с тем, что КПН и ФМСФ-КП существуют в мембраносвязанной форме [34, 47, 122, 197], а КПМ является мембраносвязанным эктоферментом [123, 248], изменение активности вышеперечисленных ферментов можно объяснить изменением состояния мембран под действием этанола [112]. В опытах in vitro на синаптосомальных плазматических мембранах и миелиновых мембранах было показано, что уже в концентрации 1 мМ и выше этанол приводит к дозозависимому снижению упорядоченности мембраны, т.е. повышает ее текучесть, жидкостность, что вызывает изменение активности ряда ферментов, инкорпорированных в мембрану [199].

 В проведенных нами опытах in vitro (данные не приводятся) этанол в концентрациях, соответствующих дозам при введении in vivo не влиял на активность ФМСФ-КП, КПН и КПМ. Однако не исключено, что активность изучаемых ферментов может изменяться за счет изменения конформации их молекул под влиянием продуктов метаболизма этанола, в частности ацетальдегида. Ацетальдегид благодаря наличию чрезвычайно реакционноспособного карбонила взаимодействует с аминогруппами аминокислот, входящими в состав полипептидов, модифицируя белки, что влечет за собой изменение функций молекул и структур клетки, в которые они входят. Существенно, что связывание ацетальдегида характеризуется отсутствием специфичности, так как осуществляется в результате неферментных реакций [16]. Известно, что ацетальдегид модифицирует белки сыворотки крови, белки и фосфолипиды клеточных мембран, нарушает биогенез ферментных систем мембран и сыворотки крови, приводит к образованию межмолекулярных сшивок, вызывает деградацию некоторых высокомолекулярных белковых структур [16, 99, 180]. Также, ацетальдегид неблагоприятно влияет на основные процессы посттрансляционной модификации белков: ацилирование, фосфорилирование, метилирование, из-за чего извращаются регуляторные эффекты гормонов и нейромедиаторов [16, 80].

Вероятно, активность КПН, ФМСФ-КП и КПМ регулируется на уровне экспрессии гена. Однако наличие существенных изменений в активности изучаемых ферментов уже через 0,5 часа после воздействия указывает на возможность и других способов регуляции активности фермента: на уровне процессинга проформы ферментов, который осуществляется эндопептидазами субтилизинового семейства, активируемых ионами Са2+, а также регуляция активности зрелой формы энзима за счет конформационных изменений молекулы, и как следствие, изменение свойств активного центра фермента.

 Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о вовлечении основных карбоксипептидаз: КПН, ФМСФ-КП и КПМ в ответную реакцию организма на острую алкогольную интоксикацию. Эти ферменты участвуют в формировании и поддержании влечения к этанолу, развитию толерантности и зависимости. Кроме того, КПН и ФМСФ-КП, по-видимому, посредством измененения уровня нейропептидов, регулирующих содержание половых стероидных гормонов, вовлекаются в формирование полового диморфизма и в контроль эстрального цикла. В свою очередь, изменение гормонального статуса животных вследствие острой алкогольной интоксикации, осуществляемое отчасти исследуемыми ферментами, может приводить к нарушениям репродуктивного процесса. 

Можно предположить следующий механизм, объясняющий возникновение патологий под действием алкоголя (схема 2): этанол, влияя на активность ферментов обмена регуляторных пептидов напрямую или опосредованно, приводит к изменению уровня ЛГ, ФСГ, а также опиоидных пептидов, окситоцина, АКТГ и других нейропептидов. Последние могут также оказывать влияние на уровень гонадотропинов. Помимо этого алкоголь вызывает дисфункции ГАМК-ергической, дофаминергической, серотонинергической нейромедиаторных систем [19, 80, 88], что также может влиять на уровень ЛГ и ФСГ [46]. Снижение уровня ЛГ и ФСГ приводит к уменьшению образования половых стероидных гормонов, этому же способствует высокий уровень кортикостероидов, которые способны непосредственно действуя на гонады, угнетать их синтез [86]. Снижение уровня эстрогенов и прогестерона нарушает гормональную регуляцию эстрального цикла, а также вызывает возникновение различных аномалий: неадекватному протеканию фаз полового цикла, нарушению его ритма, ановуляции, нарушению нормального созревания фолликулов. В то же время изменение уровня опиодных пептидов, АКТГ, пролактина под действием КПН, ФМСФ-КП и КПМ может приводить к формированию влечения, зависимости, развитию толерантности к этанолу, что в свою очередь количество потребляемого этанола. Формированию алкогольной мотивации и толерантности способствует также и измененный уровень половых стероидных гормонов, которые влияют на активность ферментов, участвующих в метаболизме алкоголя [19, 80, 88].






АЛКОГОЛЬНАЯ ИНТОКСИКАЦИЯ









ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ ОСНОВНЫХ КАРБОКСИПЕПТИДАЗ





КПН, ФМСФ-КП (?)

КПН, ФМСФ-КП (?), КПМ





             Другие                                                                                               

регуляторные пептиды

         ЛГ, ФСГ











Формирование влечения, зависимости, толерантности

Половые стероидные гормоны











           Количество 

потребляемого этанола

1. Неадекватное протекание фаз полового цикла.

2. Нарушение нормального созревания фолликулов.









Схема 2. Роль основных карбоксипептидаз в ответе организма на алкогольную интоксикацию.



На основании полученных нами данных, которые частично раскрывают роль основных карбоксипептидаз в патогенезе алкоголизма, могут быть, вероятно, определены основные пути поиска средств для профилактики и лечения алкоголизма и бесплодия путем целенаправленного поиска лекарственных средств среди регуляторов активности ферментов.


ВЫВОДЫ



Активность карбоксипептидазы Н у самок крыс зависит от стадии эстрального цикла в гипофизе, гипоталамусе, стриатуме и яичниках. Активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы определяется стадией эстрального цикла только в яичниках. Зависимости активности КПМ от стадий полового цикла в гипоталамусе и стриатуме не обнаружено.

Введение физраствора приводило к изменению активности карбоксипептидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системе у самцов и самок, а также карбоксипептидазы М в гипоталамусе и стриатуме у самок. Активность исследуемых ферментов более значительно изменяется у самок по сравнению с самцами.

Инъекция физиологического раствора вызывала разнонаправленные изменения активности ферментов на разных стадиях эстрального цикла, что может указывать на различную устойчивость к стрессирующему воздействию крыс на разных стадиях эстрального цикла.

Введение этанола вызывало наиболее существенные изменения активности карбоксипептидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в гипофизе и половых железах у особей обоего пола и карбоксипептидазы М в стриатуме у самок. Более значительные изменения активности ферментов обнаружены у самок.

Механизм, посредством которого острая алкогольная интоксикация проявляет свои эффекты, частично определяется стадией эстрального цикла, в которой пребывает животное. 

Более существенные изменения активности карбоксипептидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в гипофизе и половых железах свидетельствуют о том, что острая алкогольная интоксикация существенно изменяет функционирование гипофизарно-гонадальной системы.

При острой алкогольной интоксикации отмечается нарушение динамики изменения активности изучаемых ферментов в ходе эстрального цикла.

Различный характер изменений активности карбоксипептидазы Н, ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы и карбоксипептидазы М у самок и самцов свидетельствует о половых отличиях в ответной реакции организма на острую алкогольную интоксикацию.

Динамика изменения активности КПН у самок в мозге при острой алкогольной интоксикации коррелирует с динамикой изменений активности ФМСФ-КП, у самцов такой закономерности не обнаружено.


Литература



		Азарян А.В. Пептидгидролазы нервной системы и их биологические функции. – Ереван: Айастан, 1989. – 208 с.

		Аккер Л.В. Гормональные изменения и биологически активные вещества у женщин репродуктивного возраста, страдающих алкголизмом // Акушерство и гинекология. – 1991. – № 10. – С. 50-52.

		Алиев И.А. Нейрогормоны и алкоголизм // Патол. физиология и эксп. терапия. – 1989. – № 5. – С. 85-90.

		Аминджанов С.А., Барашкова Г.М. Содержание пептидов при хронической алкогольной интоксикции // Клиническая медицина. – 1987. – № 3. – С. 134-136.

		Андронова Л.М. Биологические механизмы и фармокотерапия экспериментального алкоголизма в зависимости от половых отличий // дис. на соиск. степени докт.мед.наук. – Москва, 1989.

		Анищенко Т.Г., Буршина С.Н., Шорина Л.Н. К анализу факторов, детерминирующих половые различия в стрессовых реакциях у белых крыс // Бюлл. эксперим. биол. медицины. – 1989. – Т. 108, № 11. – С. 616-618.

		Арушанян Э.Б., Боровкова Г.К., Конеев С.В., Терешкин О.В. Зависимость переобучения крыс в У-образном лабиринте и их чувствительности к галоперидолу от фазы эстрального цикла // Журн. высш. нерв. деятельности им. И.П. Павлова. – 1988. – Т. 38, № 6. – С. 1093-1097.

		 Афендикова А.П., Боднар П.Н. Влияние алкоголя на развитие эндокринных нарушений: обзор литературы // Врачебное дело. – 1987. – № 6. С. 16-20.

		Ашмарин И.П., Каменская М.А. Нейропептиды в симпатической передаче // Итоги Н. и Т. (ВИНИТИ. Сер. Физиология человека и животных). – 1988. – 34. – 184 с.

		Бабич Л.Г., Шлыков С.Г., Борисова Л.А. Влияние этанола на внутриклеточный обмен Са2+ // Укр. биохим. журн. – 2002. – Т. 74, № 1. – С. 19-26.

		Бабичев В.Н. Нейро-гуморальная регуляция овариального цикла. – М.: Медицина, 1984. – 240 с.

		Балбатун О.А., Слободская Н.С., Троян Э.И. Р50 и уровень эстрадиола в различные фазы эстрального цикла у крыс. Материалы международной научной конференции, посвященной 35-летию Гродненского медицинского института. – Гродно, 1993. - ч.1. – С.9-10.

		Балыкова Н.В., Мухина Е.С. Влияние хронического эмоционально-болевого стресса на активность основных карбоксипептидаз в гипоталамо - гипофизарно-надпочечниковой системе пренатально стрессиованных крыс // Вестник молодых ученых ПГПУ им. В.Г. Белинского. – 2003. - №2. – С. 8-10. 

		Беляев Н.А., Генгин М.Т., Годына С.В., Калихевич В.Н., Панченко Л.Ф. Активность энкефалинконвертазы в отделах мозга крыс при алкогольной интоксикации // Вопр. мед. химии. – 1988. – Т. 34, № 4. – С. 118-122.

		Беляев Н.А., Колесанова Е.Ф. Динамика содержания мет-энкефалина в надпочечниках и плазме крови крыс при острой алкогольной интоксикации // Вопросы мед. химии. – 1990. – Т. 36, № 3. – С.86-87.

		Божко Г. Х., Волошин П. В. Действие этанола на белки тканей и сыворотки крови человека и животных. // Усп. совр. биол. – 1989. – Т. 108, № 1 (4). – С. 52-65.

		Боровая Т.Г., Назаренко А.И., Волкова О.В., Адамская Е.И. Математическая модель физиологического эстрального цикла беспородных крыс. //Морфология. – 1993. – Т. 105, № 11-12, - С. 114-125.

		Боярский К.Ю. Фолликулогенез и современная овариальная стимуляция (обзор литературы) // Проблемы репродукции. – 2002. – № 3. – С. 36-43.

		Буров Ю.В., Ведерникова К.М. Нейрохимия и фармакология алкоголизма. – М.: Медицина, 1985. – 240 с.

		Бэйрд Д.Т. Яичник / Гормональная регуляция размножения у млекопитающих. – М.: Мир,1987. – С. 118-144.

		Васильева Ю.В., Макарова Т.М. Независимость некоторых форм поведения самок крыс от фаз эстрального цикла // Журн. высш. нерв. деятельности им. П.И. Павлова. – 1994. – 44, № 2. – С. 368-369.

		Ведерникова Н.Н., Майский А.И. Опиаты и эндогенные морфиноподобные пептиды: системный подход к оценке их роли в интеграции нервной и эндокринной регуляции в организме // Усп. совр. биол. – 1981. – 19, № 3. – С. 380-382.

		 Вернигора А.Н., Бардинова Ж.С., Сметанин В.А., Генгин М.Т. Активность основных карбоксипептидаз в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла // Укр. биохим. журн. – 2003. – 75, № 5. – С. 99-102

		Вернигора А.Н. Карбоксипептидаза Н мозга животных в норме и при действии стресс-факторов // дис. на соиск. степени канд. биол. наук. – Днепропетровск, 1991.

		 Вернигора А.Н., Генгин М.Т. Влияние эмоционально-болевого стресса и этанола на карбоксипептидазо-Н-подобную активность в гипофизе и сыворотке крови крыс // Вопр. мед. химии. – 1994. – Т. 40, № 1. – С. 54-56.

		Вернигора А.Н., Генгин М.Т. Влияние этанола на активность карбоксипептидазы Н в гипофизе и некотрых отделах головного мозга крыс при различных стрессирующих воздействиях // Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. – 1993. – Т. 79, № 3. – С. 34-38.

		Вернигора А.Н., Генгин М.Т. Механизмы регуляции активности и биологическая роль карбоксипептидазы H – фермента процессинга нейропептидов // Биохимия. – 1995. – Т. 60, № 12. – С. 1491-1497.

		Вернигора А.Н., Генгин М.Т. Основные (Отщепляющие остатки аргинина и лизина) металлокарбоксипептидазы тканей млекопитающих: структура, свойства и функции // Укр. биохим. журн. – 1998. – Т. 70, № 4. – С. 16-24.

		Вернигора А.Н., Генгин М.Т. Протеолитические ферменты: субклеточная локализация, свойства и роль в обмене нейропептидов // Биохимия. – 1996. – Т. 61, № 5. – С. 771-785.

		Вернигора А.Н., Генгин М.Т., Макарова В.В. Влияние стрессовых факторов на активность карбоксипептидазы Н в отделах головного мозга крыс // Укр. биохим. журн. – 1992. – Т. 64, № 2. – С. 45-49.

		Вернигора А.Н., Генгин М.Т., Никишин Н.Н. Влияние этанола, диазепама и резерпина на активность ангиотензинпревращающего фермента и карбоксипептидазы Н в норме и при стрессе // Вопр. мед. химии. – 1996. – Т. 42, № 2. – С. 127-130.

		 Вернигора А.Н., Генгин М.Т., Никишин Н.Н. Множественность молекулярных форм растворимых карбоксипептидазо-В-подобных ферментов головного мозга кошки // Укр. биохим. журн. – 1993.– Т. 65, № 4. – С. 17-21.

		Вернигора А.Н., Генгин М.Т., Никишин Н.Н. Об участии некоторых ферментов обмена нейропептидов в механизмах эмоционального стресса // Физиол. журн. – 1995. – Т. 81, № 5. – С. 103-112.

		Вернигора А.Н., Генгин М.Т., Никишин Н.Н. Очистка и физико-химические свойства растворимой карбоксипептидазы Н из серого вещества головного мозга кошки // Биохимия. – 1992. – Т. 57, № 11. – С. 1712-1719.

		Вернигора А.Н., Генгин М.Т., Салдаев Д.А., Щетинина Н.В. Распределение активности фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы в нервной ткани котов // Нейрохимия. – 1997. – Т. 14, № 4. – С. 423 - 425.

		Вернигора А.Н., Михайлова О.Е., Генгин М.Т., Рыжкова Ю.А., Мухина Е.С. Влияние хронического потребления этанола на активность основных карбоксипептидаз в отделах мозга крыс // Укр. биохим. журн. – 2002. – Т. 74, № 6. – С. 128-130.

		Вернигора А.Н., Мухина Е.С., Балыкова Н.В., Генгин М.Т. Влияние хронического потребления этанола на активность основных карбоксипептидаз в отделах мозга пренатально алкоголизированных крыс // Нейрохимия. – 2003. – Т. 20, № 1. – С. 56-59.

		Вернигора А.Н., Никишин Н.Н., Генгин М.Т. Влияние внутрибрюшинного введения физиологического раствора на поведение крыс в тесте “открытое поле” и активность ферментов обмена нейропептидов // Физиол. журн. – 1995. – Т. 81, № 12. – С. 121-125. 

		Вернигора А.Н., Никишин Н.Н., Генгин М.Т. Влияние глюкортикоидов на активность растворимой и мембраносвязанной форм карбоксипептидазы Н in vivo // Укр. биохим. журн. – 1995. – Т. 67, № 6. – С. 93-98.

		Вернигора А.Н., Никишин Н.Н., Генгин М.Т. Влияние этанола, диазепама и резерпина на активность ангиотензинпревращающего фермента и карбоксипептидазы H в норме и при стрессе // Вопр. мед. химии. – 1996. – Т. 42, № 2. – С.127-130.

		Вернигора А.Н, Никишин Н.Н, Генгин М.Т. Протеолитические ферменты и регуляция уровня активности нейропептидов // Биохимия. – 1995. – Т. 60, № 10. – С.1575-1579.

		Вернигора А.Н., Никишин Н.Н., Генгин М.Т. Частичная характеристика основной фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы из головного мозга кошки // Биохимия. – 1995. – Т. 60, № 11. – С. 1860-1866.

		Вернигора А.Н., Салдаев Д.А., Генгин М.Т. Влияние внутрибрюшинной инъекции оливкового масла на активность карбоксипептидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в гипоталамусе, гипофизе и надпочечниках мышей // Нейрохимия. – 2001. – Т. 18, № 4. – С.290-294.

		Вернигора А.Н., Щетинина Н.В., Генгин М.Т. Исследование активности основных (отщепляющих остатки аргинина и лизина) карбоксипептидаз у крыс разного возраста // Биохимия – 1996. – Т. 61, № 10. – С. 1848-1856.

		Виноградова Е.П., Чаадаева Е.В. Изменение уровня тревожности у самок белых крыс в течение эстрального цикла и в зависимости от хэндлинга // Журн. высш. нервн. деят. им. И.П. Павлова. – 1994. – Т. 44, № 2. – С. 277-282.

		Вундер П.А. О механизмах тормозного и стимулирующего влияния женского полового гормона на секрецию гонадотропинов // Успехи современной биологии. – 1992. – Т. 112, № 4. – С. 609-626.

		Генгин М.Т. Особенности структурно-функциональной организации и физико-химические свойства нелизосомальных пептидгидролаз мозга животных//дис. на соискание ученой степени д.б.н. – Москва, 2002.

		Генгин М.Т., Вернигора А.Н. Влияние эмоционально-болевого стресса на активность карбоксипептидазы Н - фермента процессинга нейропептидов головного мозга крыс // Физиол. журн. – 1994. – Т. 80, № 3. – С. 23-27.

		Генгин М.Т., Вернигора А.Н. Влияние этанола на активность карбоксипептидазы Н в мозге крыс // Укр. биохим. журн.- 1993. – Т. 65, № 1. – С. 100-103.

		Генгин М.Т., Вернигора А.Н. Ферменты процессинга опиоидных пептидов и методы определения их активности // Укр. биохим. журн. – 1994. – Т. 66, № 2. – С. 3-17.

		Гойло Т.А., Костроминова Т.Ю., Турилова В.И., Плескач В.А. Аутокринная регуляция пролиферации в культурах клеток. I. Исследование гепаринсвязывающих факторов с ростостимулирующей активностью, содержащихся в средах, кондиционированных трансформированными фибробластами крысы // Цитология. – 1991. – Т. 33, № 1. – С. 57-63.

		Гомазков О.А. Функциональная биохимия регуляторных пептидов.-М: Наука. 1993. – 160 с.

		Гомазков О.А. Энзимологические основы физиологического действия регуляторных пептидов // Биол. науки. – 1986. – № 2. – С. 13-23.

		 Гомазков О.А., Григорьянц О.О. Регуляция биосинтеза энкефалинов: биохимические и физиологические аспекты // Усп. совр. биол. – 1989. – Т. 108, № 1(4). – С. 109-124.

		Гомазков О.А., Панфилов А.Д., Комиссарова Н.В., Ростовцев А.П. Влияние длительного потребления этанола на физиологическое состояние и изменения активности пептидаз мозга у мурицидных (агрессивных) крыс // Журн. высш. нервн. деятельность. – 1992. – Т. 42, № 4. – С. 771-778.

		Гомазков О.А., Панфилов А.Д., Ростовцев А.П., Комиссарова Н.В., Фомин В.В., Григорьянц О.О. Регионарная активность энкефалин- и ангиотензин II-образующих пептидаз мозга у крыс с различным влечением к этанолу // Вопр. мед. химии. – 1991. – Т. 37, № 4. – С. 33-37.

		Гормонотерапия: Пер. с нем. / Под ред. Шамбаха Х., Кнаппе Г., Карола В. – М.: Медицина, 1988. – 416 с.

		Држевецкая И.А. Основы физиологии обмена веществ и эндокринной системы. – М.: Высш. шк., 1994. – 256 с.

		Дыбан А.П., Пучков В.Ф., Баранов В.С. // Объекты биологии развития. – М.: Наука, 1975. – С. 505-566.

		Замятнин А.А. Общие функциональные особенности эндогенных регуляторных олигопептидов // Физиол. ж. – 1992. – Т. 78, № 9. – С. 39-49.

		 Зилов В.Г., Рогачева С.К., Иванова Л.И. Субстанция и устойчивость биологических мотиваций к этанолу // Физ. журнал. – 1992. – Т. 78, № 12. – С. 22-29.

		Каюшева И.В. Алкоголизм и эндокринная система: (обзор) // Сов. медицина. – 1979. – № 7. – С. 87-91.

		Келешева Л.Ф. Ренин-ангиотензиновая система в механизмах алкогольной мотивации // Вестник Российской АМН. – 1994. – № 10. – С. 40-45.

		Кирпиченко Ан.А., Кирпиченко А.А. Алкогольная зависимость у женщин // Мед. новости. – 2002. – № 11. – С. 23-28.

		Ковалев А.А. Это интересно: Особенности алкоголизма у женщин // Глав. Врач. – 2000. – № 5. – С.77-83.

		Колупаев Г.П., Яковлев В.А. Гормональные нарушения при хронической интоксикации алкоголем // Журн. невропатологии и психиатрии им. Корсакова. – 1984. – Т. 84, № 11. – С.1712-1714.

		Колупаев Г.П., Яковлев В.А. Функциональное состояние гипоталамо-гипофизарно-гонадных систем у больных с хронической алкогольной интоксикацией // Журнал невропатологии и психиатрии им. Корсакова. – 1987. – Т. 87, № 11. – С. 1723-1725.

		Лакин Г.Ф. Биометрия. – М.: Высш. шк., 1990. – 352 с.

		Локшина Л.А., Былинкина В.С. Протеолитические ферменты в процессинге белков // Успехи совр. биол. – 1990. – Т. 109, № 2. – С. 219-237.(19)

		Медведев В.И., Миролюбов А.В. Проблема управления функциональным состоянием // Физиология человека. – 1984. – Т. 10, № 5. – С. 761-765.

		Меерсон Ф.З., Пшенников М.Г. Адаптация к стресс-ситуации и физиологической нагрузке. – М.: Медицина,1988. – 25 c.

		Нейрохимия / Под ред. Ашмарина И.П., Стукалова П.В. – М.: Изд-во Института биомед. химии РАМН, 1996. – 470 с.

		Никитин А.И., Китаев Э.М., Слозина Н.М., Неронова Е.Г. Нарушение формирования женских гамет и пренатальная патология // Акушерство и гинекология. – 1990. – № 1. – С. 45-48.

		Новиков Алкоголизм и гипофизарно-надпочечниковая система. – М.: “Антидор”, 2001. – 290 с.

		Оболенская Н.Е. Некоторые особенности образования нейропептидов // Успехи совр. биол. – 1989. – Т. 108, № 3(5). – С. 337-341.

		Панченко Л.Ф., Брусов О.С., Беляев Н.А. Исследование механизма действия этанола на активность энкефалиназы А мозга крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 1984. – № 6. – С.691-692.

		Раевский К.С. Эндогенные опиоидные пептиды как возможные нейропередатчики // Итоги науки и техники ВИНИТИ. Фармакол. химиотерапевт. средства. – 1982. – № 43. – С. 185-213.

		Салдаев Д.А. Активность основных карбоксипептидаз в тканях мышей при введении тестостерона и прогестерона // дис. на соискание ученой степени канд. биол. наук. – СПб. , 2001.

		Салдаев Д.А., Вернигора А.Н. Активность карбоксипептидазы Н в гипофизе и гипоталамусе самок мышей при введении тестостерона // Физиология и биомедицина, клеточная биология: Мат.IV Пущинской конф. Молодых ученых (Пущино, 1999). – Пущино, 1999. – С.13.

		Семке В.Я., Мельникова Т.Н., Бохан Н.А. Нейробиологические механизмы алкоголизма // Журнал неврологии и психиатрии им. Корсакова. – 2002. – Т. 102, № 8. – С.61-66.

		 Скосырева А.М., Балика Ю.Д., Кочиева С.К., Рудницкая С.Я. Влияние злоупотребления алкоголем на состояние здоровья женщин и их потомства // Акушерство и гинекология. – 1993. – № 2. – С. 48-52.

		Степанов М.Г., Секретарева Е.В., Проймина Ф.И., Савченко О.Н. Отрицательная и положительная фазы реакции гипоталамо-гипофизарно-гонадной системы самок крыс на введение половых гормонов // Физиол. журн. – 1991. – Т. 77, № 3. – С. 108-115.

		Тигранян Р.А. Гормонально-метаболический статус организма при экстремальных воздействиях. – М.: Наука, 1990. – 228 с.

		Физиология человека / Под ред. Косицкого Г.И. – М.: Медицина, 1985. – 544 с.

		Хип Р., Флинт А. Беременность / Гормональная регуляция размножения у млекопитающих. – М.: Мир, 1987. – С. 193-244.

		Хоха А.М. Угнетение этанолом биосинтеза половых гормонов и гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система // Успехи современной биологии. – 1994. – Т. 114, № 5. – С. 573-580.

		Цыганков Б.Д., Яковлев В.А. Значение исследований гипоталамо-гипофизарно-гонадной системы в изучении патогенеза и прогноза алкогольной зависимости // Профилактика и реабилитация в наркологии. – 2002. – № 1. – С .30-35.

		Шабанов П.Д., Калишевич С.Ю. Биология алкгоголизма. – СПб.: “Лань”, 1998. – 272 с.

		Щетинина Н.В. Активность основных карбоксипептидаз в тканях и отделах мозга крыс в онтогенезе // дис. на соиск. ученой степени кандидата биол. наук. – Спб., 1997.

		Щетинина Н.В., Вернигора А.Н., Генгин М.Т. Активность основных карбоксипептидаз у крыс разного пола // Укр. биохим. журн. – 1997. – Т. 70, № 3. – С. 110-113.

		Щетинина Н.В., Вернигора А.Н., Генгин М.Т., Фирстова Н.В. Тканевое и региональное распределение активности фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы и других карбоксипептидаз у крыс // Укр. биохим. журн. – 1997. – Т. 70, № 3. – С. 23-28.

		Эндорфины: пер. с англ./ Под ред. Э. Коста, М. Трабукки. Перевод Панова М.А.; под ред. и с предисл. Розена В.Б. – М.: Мир, 1981. – 368с.

		Юхананов Р.Ю., Рожанец В.В., Майский А.И. // Бюллетень эксп. биол. и мед. – 1989. – Т. 108, № 10. – С.455-457.

		 Adams M.L., Cicero T.J. Effects of alcohol on beta-endorphin and reproductive hormones in the male rat // Alcohol. Clin. Exp. Res. – 1991. – V. 15, № 4. – Р. 685-92.

		Angelogianni P., Gianoulakis C. Chronic ethanol alters proopiomelanocortin gene expression in the rat hypothalamus // Alcohol.Clin. and Exp.Res. – 1992. – V. 16, № 2. – P. 411.

		Azaryan A.V., Hook V.Y.H. Distinct properties of prohormone thiol protease compared to cathepsin B, cathepsin L, and cathepsin H - evidence for Ptp as a novel cysteine protease // Arch. Biochem. Biophys. – 1994. – V. 314, № 1. – P. 171-177.

		Azaryan A.V., Hook V.Y.H. Unique cleavage specificity of prohormone thiol protease related to proenkephalin processing // FEBS Lett. – 1994. – V. 341, № 2-3. – P. 197-202.

		Badr F.M., Smith M., Dalterio S., Bartke A. Role of pituitary and the adrenals in mediating the effects of alcohol on testicular steroidogenesis in mice. // Steroids. – 1979. – V. 34, № 4. – Р.477-482.

		Barry R. E., McGivan J.D. Acetaldehyde alone may initiate hepatocellular damage in acute alcoholic liver disease // Gut. – 1985. – V. 26, № 10. – P. 1065-1069.

		Baumann M.N., Rabii J. Inhibition of suckling-induced prolactin release by mu- and k-opioid antagonists // Brain Res. – 1991. – V. 567, № 2. – P. 224-230.

		Befler R.L., Snader R.K. Premenstrual factors as determinants of alcoholism in women. In M. Greenblatt, Schucki M.A. “Alcoholism problems in women and children”, N.Y., Grune,Stratton, 1976.

		Blum K., Briggs A.U., Elston S.F. Reduced leucine-enkephalinlike immunoreactive substance in hamster basal ganglia after long-term ethanol exposure. // Science. – 1982. - № 216. – Р.1425-1427.

		Bondy C.A., Whitnall M.H., Brady L.S. Regulation of carboxypeptidase H gene expression in magnocellular neurons: response to osmotic stimulation // Mol. Endocrinol. – 1989. – V. 3, № 12. – P. 2086-2092.

		Boyadjieva N., Dokur M., Advis J.P., Meadows G.G., Sarkar D.K. Chronic ethanol inhibits NK cell Cytolytic activity: role of opioid peptide – β-endorphin // The Journal of Immunology. – 2001, – № 167. – Р. 5645-5652.

		Brooks A.N., Lamming G.E., Lees P.D., Haynes N.B. Opioid modulation of LH secretion in the ewe // J. Reprod. Fertil. – 1986. – V. 76, № 2. – Р. 693-708.

		Caligioni C.S., Franci C.R. Oxytocin secretion induced by osmotic stimulation in rats during the estrous cycle and after ovariectomy and hormone replacement therapy // Life Sci. – 2002. – V. 71, № 24. – Р. 2821-2831.

		Carter A., Soliman M.R. Estradiol alters ethanol-induced effects on beta-endorphin and met-enkephalin levels in specific brain regions of ovariectomized rats // Pharmacology. – 1996. – V. 53, № 3. – Р.143-150.

		Chapin R.E., Breese G.R., Mueller R.A. Possible mechanisms of reduction of plasma luteinizing hormone by ethanol // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 1980. – V. 212, № 1. – Р. 6-10.

		Charnning C.P., Andersen L.D., Hoover D.J. Hormonal control of granulosa cell secretion of oocyte maturation inhibitor and inhibin-F activity // Follicular maturation and ovulation: Exp. Med. Intern. Congr. Amsterdam. – 1982. – P. 219-236.

		Cheng S.S., Tseng L.F. Chronic administration of ethanol on pituitary and hipotalamic β-endorphin in rats and golden hamsters // Pharmacol. Res. Commun. – 1982. – V. 14, № 10. – Р. 1001-1008.

		Chesselet M.F., Hook V.Y.H. Carboxypeptidase H-like immunoreactivity in the striatum of cats and monkeys // Regul. Pept. – 1988.- V. 20, № 2. – P. 151-159.

		Chin J., Goldstein D. Effects of low concentrations of ethanol on the fluidity of spin-labeled erythrocyte and brain membranes // Mol. Pharmacol. – 1977. – № 13. – Р. 435-441.

		Chisari A.., Carino M., Perone M., Gaillard R.C., Spinedi E. Sex and strain variability in the rat hypothalamo-pituitary-adrenal axis function // J. Endocrinol. Invest. – 1995. – V. 18, № 1. – P. 25-33.

		Chretien M., Seidah N.G. Precursor polyproteins in endocrine and neuroendocrine systems // Int. J. Peptide Protein Res. – 1984. – № 23. – P. 335-341.

		Cicero T.Y., Bernard Y.D., Newman K. Effects of castration and chronic morphine administration on liver alcohol dehidrogenase and the metabolism of ethanol in the male, Spraque-Dawley rat // J. Pharmacol. exp. ther. – 1980. - № 215. – Р. 317-324.

		Cicero T.J., Bernstein D., Badger T.M. Effects of acute alcohol administration on reproductive endocrinology in the male rat // Alcohol. Clin. Exp. Res. – 1978. – V. 2, № 3. – Р. 249-254.

		Cicero T.J., Meyer E.R., Bell R.D. Effects of ethanol on the hypothalamic-pituitary-luteinizing hormone axis and testicular steroidogenesis // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 1979. – V. 208, № 2. - 210-215.

		Cool D.R., Loh Y.P. Carboxypeptidase E is a sorting receptor for prohormones – binding and kinetic studies // Mol. Cell. Endocrinol. – 1998. – V. 139, № 1-2. – P. 7-13.

		Cool D.R., Normant E., Shen F.S., Chen H.C., Pannell L., Zhang Y., Loh Y.P. Carboxypeptidase E is a regulated secretory pathway sorting receptor: genetic obliteration leads to endocrine disorders in Cpe(Fat) mice // Cell. – 1997. – V. 88, № 1. – P. 73-83.

		Crews F., Morrow A.L., Criswell H., Breese G. Effects of ethanol on ion channels // Int.Rev.Neurobiol. – 1996. – №39. – Р. 283-367.

		Daud A.I., Bumpus F.M., Husain A. Characterization of angiotensin I-converting enzyme (ACE)-containing follicles in the rat ovary during the estrous cycle and effects of ACE inhibitor on ovulation // Endocrinology. – 1990. – 126, № 6. – Р. 2927-2935.

		Davidson H.W., Hutton J.C. The insulin-secretory-granule carboxypeptidase H. Purification and demonstration of involvement in proinsulin processing // J. Biochem. – 1987. – V. 245, № 2. – P. 575-582.

		Deddish P.A., Skidgel R.A., Kriho V.B., Li X.Y., Becker R.P., Erdos E.G. Carboxypeptidase M in Madin-Darby canine kidney cells. Evidence that carboxypeptidase M has a phosphatidylinositol glycan anchor // J. Biol. Chem. – 1990. – V. 265, № 25. – P. 15083-15089.

		De Gandarias J.M., Echevarria E., Irazusta J., Casis L. Cyclic changes of exopeptidase activities in the rat brain: a regional study // Exp Clin Endocrinol. – 1992. – V. 99, № 2. – Р. 64-67.

		De Gandarias J.M.; Irazusta-J.; Echevarria-E.; Casis-L. Neutral aminopeptidase activity levels during the estrous cycle and the pregnancy in the hypothalamus and the pituitary of the rat // Life Sci. – 1993. – V. 52, № 20. – Р. 1629-1632.

		De Gandarias J.M., Irazusta J., Gil J., Fernandez D., Casis L. Brain soluble and membrane-bound Tyr-aminopeptidase activities during the stages of estrous and proestrous in the female rat // Brain Res. – 1993. – V. 620, № 1. – Р. 146-148.

		De Gandarias J.M., Irazusta J., Fernandez D., Echevarria E. Casis L. Brain Lys-Aminopeptidase Activity - Changes During Cycle and Pregnancy // European journal of endocrinology. – 1994. – V. 130, № 4. – Р. 373-377.

		De Gandarias J.M., Ramirez M., Echevarria E., Irazusta J., Casis L. Serum and brain aminopeptidase activities in cyclic rat //. Gen. Physiol. Biophys. – 1990. – V. 9, № 4. – Р.385-389.

		De Gandarias J.M., Ramirez M., Zulaica J., Casis L. Aminopeptidase (arylamidase) activity in discrete areas of the rat brain: sex differences // Horm. Metab. Res. – 1989. – V. 5, № 21. – P. 285-286.

		De Vito E., Guardia D.C., Cabrera R.R. Cyclical changes in plasma renin during the oestrous cycle in the rat: synchronized effect of oestrogen and progesterone // J. Endocrinol. – 1989. – V. 121, № 2. – Р. 261-267.

		Devi L. Tissue distribution of a dynorphin-processing endopeptidase // Endocrinology. – 1993. – V. 132, № 3. – P. 1139-1144.

		Dies-Guerra F.J., Bicknell R.J., Mansfield S. Effect of neonatal testosterone upon opioid receptors and the content of beta-endorphin, neuropeptide Y and neorotensin in the medialbasal areas in the rat brain // Brain Res. – 1987. – V. 44, № 2. – P. 225-230.

		Dochetry K., Hutton J.C. Carboxypeptidase activity in the insulin secretory granule // FEBS Lett. – 1983. – V. 162, № 1. – P. 137-141.

		Eipper B.A., Green C.B., Mains R.E. Expression of prohormone processing enzymes in neuroendocrine and non-neuroendocrine cells // Monogr. Natl. Cancer. Inst. – 1992. - № 13. – P. 163-168.

		Ellingboe J. Acute effects of ethanol on sex hormones in non-alcoholic men and women // Alcohol. – 1987. - № 1. – Р. 109-116.

		Ehlers C.L., Li T.K., Lumeng L. Neuropeptide Y (NPY) levels in ethanol-naive alcohol preffering and nonpreferring rats in Wistar rats following ethanol exposure // Alcohol Clin. Exp. Res. – 1998. - № 22. – Р. 1778-1782.

		Ehlers C.L., Somes C., Clontier D. Are some of the effects of ethanol mediated through NPY? // Pscychopharmacology. –1998. – № 139. – P. 136-144.

		Fernandez-Pardal J., Chaud M., Viggiano M., Gimeno M.F., Gimeno A. L. Converting enzyme activity in sow oviducts at different stages of the sex cycle. Influence of inhibitors of prostaglandin synthesis and its possible role in the inotropic effects of bradykinin // Pharmacol. Res. Commun. – 1986. – V. 18, № 1. – Р. 49-60.

		Ferriero D.M., Sheldon R.A., Messing R.O. Somatostatin enhances nerve growth factor induced neurite outgrowth in PC12 cells // Dev. Brain Res. – 1994. – V. 80, № 1-2. – P. 13-18.

		Fiedorek F.T.Jr., Parkinson D. Carboxypeptidase H processing and secretion in rat clonal beta-cell lines // Endocrinology. – 1992. – V. 131, № 3. – P. 1054-1062.

		Figueroa C.D., Chacon C., Corthorn J., Ehrenfeld P., Muller-Esterl W., Valdes G. Temporospatial changes of kinin b2 receptors during the estrous cycle and pregnancy in the rat uterus // Pharmacol. Res. Commun. – 1986. – 18, № 1. – Р. 49-60.

		Frette C., Pezet S., Nabout R.A., Bertrand J.P., Pham Q.T., Kauffmann F., Lafuma C. Relationship of serum neutral endopeptidase E.C.3.4.24.11 activity to alcohol consumption // Alcohol. Clin. Exp. Res. – 1998. – V. 22, № 7. – Р. 1405-1408.

		Fricker L.D. Activation and membrane binding of carboxypeptidase E // J. Cell. Biochem. – 1988. – № 38. – P. 279-289.

		Fricker L.D. Carboxypeptidase E // Ann. Rev. Physiol. – 1988. – № 50. – P. 309-321.

		 Fricker L.D. Neuropeptide biosynthesis: focus on carboxypeptidase processing enzyme // Trends Neurosci. – 1985. – V. 8, № 5. – P. 210-214.

		Fricker L.D., Das B., Angeletti R.H. Identification of the pH-dependent membrane anchor of carboxypeptidase E (EC 3.4.17.10) // J. Biol. Chem. – 1990. – V. 265, № 5. – P. 2476-2482.

		Fricker L.D., Das B., Klein R.S., Greene D., Jung Y.K. Regulation of carboxypeptidase E (enkephalin convertase) // NIDA Res. Monogr. – 1991. – № 111. – P. 171-187.

		Fricker L.D., Devi L. Posttranslational processing of carboxypeptidase E, a neuropeptide processing enzyme, in AtT 20 cells and bovine pituitary secretory granules // J. Neurochem. – 1993. – V. 61, № 4. – P. 1404-1415.

		Fricker L.D., Plummer T.H., Snyder S.H. Enkephalin convertase: potent, selective and irreversible inhibitors // Biochem. and Biophys. Res. Commun. – 1983. – V. 11, № 3. – P. 994-1000.

		Fricker L.D., Reaves B.J., Das B., Dannies P.S. Comparison of the regulation of carboxypeptidase E and prolactin in GH4C1 cells, a rat pituitary cell line. // Neuroendocrinology. – 1990. – V. 51, № 6. – P. 658-663.

		Fricker L.D., Rigual R.J., Diliberto E.J.Jr., Viveros O.H. Reflex splanchnic nerve stimulation increases levels of carboxypeptidase E mRNA and enzymatic activity in the rat adrenal medulla // J. Neurochem. – 1990. – V. 55, № 2. – P. 461-467.

		Fricker L.D., Snyder S.H. Enkephalin convertase: purification and charasterization of a specific enkephalin-synthesizing carboxypeptidase localized to adrenall chromaffin granules // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1982. – № 79. – P. 3886-3890.

		Fricker L.D., Snyder S.H. Purification and characterization of enkephalin convertase, an enkephaline-synthesizing carboxypeptidase // J. Biol. Chem. – 1983. – V. 258, № 18.- P. 10950-10955.

		Fricker L.D., Supattapone S., Snyder S.H. Enkephalin convertase: a specific enkephalin synthesizing carboxypeptidase in adrenal chromaffin granules, brain and pituitary gland // Life Sci. – 1982. – V. 31. – P. 1841-1844.

		Funabashi T., Brooks P.J., Kleopoulos S.P., Grandison L., Mobbs C.V., Pfaff D.W. Changes in preproenkephalin messenger RNA level in the rat ventromedial hypothalamus during the estrous cycle // Brain. Res. Mol. Brain Res. – 1995. – V. 28, № 1. – Р. 129-134.

		Gainer H., Russel J.T., Loh Y.P. The enzymology and intracellular organization of peptide precursor processing: The secretory vesicle hypothesis // Neuroendocrinology – 1985. – № 40. – P. 171-184.

		 Genazzani A.R., Faechinetti F., Petraglia F., Pintor C., Bagnoli F., Puggioni R., Corda R. Correlations between plasma levels of opioid peptides and adrenal androgens in prepuberty and puberty // J. Steroid. Biochem. – 1983. – V. 19, № 1. – P. 891-895.

		Gianoulakis C. The effect of ethanol on the biosynthesis and regulation of opiod peptides // Experentia. – 1989. –V. 45, № 5. – P. 428-435.

		Gianoulakis C., Barcomb A. Effect of acute ethanol in vivo and in vitro on the β-endorphin system in the rat // Life Sci. – 1987. – V. 40, № 1. – P. 19-28.

		Guest P.C., Pipeleers D., Rossier J., Rhodes C.J., Hutton J.C. Co-secretion of carboxypeptidase H and insulin from isolated rat islets of Langerhans // J. Biochem. – 1989. – V. 264, № 2. – P. 503-508.

		Guest P.C., Ravazzola M., Davidson H.W., Orci L., Hutton J.C. Molecular heterogeneity and cellular localization of carboxypeptidase H in the islets of Langerhans // Endocrinology. – 1991. – V. 129, № 2. – P. 734-740.

		Hammer R.P. Jr. Mu-opiate receptor binding in the medial preoptic area is cyclical and sexually dimorphic // Brain Res. – 1990. – V. 515, № 1-2. – Р. 187-192.

		Hammer R.P. Jr., Zhou L., Cheung S. Gonadal steroid hormones and hypothalamic opioid circuitry // Horm. Behav. – 1994. – V. 28, № 4. – Р.431-437.

		Harmar A.J. Neuropeptides // Transmitter Molecules in the Brain. – 1987. – № 1. – P. 17-26.

		Ho K.S., Rossi N. Suppression of ethanol consumption by metenkephalin in rats // J. Pharm. Pharmacol. – 1982. – V. 34, № 2. – Р .118-119.

		Hollt V. Multiple endogenous opioid peptide // Trend. Neurosci. – 1983, – V. 6, № 1. – Р.24-26.

		Hook V.Y. Carboxypeptidase B-like activity for the processing of enkephalin precursors in the membrane component of bovine adrenomedullary chromaffin granules // Neuropeptides. – 1984. – V. 4, № 2. – P. 117-126.

		Hook V.Y.H., Affolter H.U. Identification of zymogen and mature forms of human carboxypeptidase H. A processing enzyme for the synthesis of peptide hormones // FEBS Lett. – 1988. – V. 238, № 2. – P. 338-342.

		Hook V.Y.H., Affolter H.U., Palkovits M. Carboxypeptidase H in the hypothalamo-neurohypophysal system: evidence for processing of a prohormone-processing enzyme during axonal transport // J. Neurosci. – 1990. – V. 10, № 10. P. 3219-3226.

		Hook V.Y.H., Eiden L.E., Pruss R.M. Selective regulation of carboxypeptidase peptide hormone-processing enzyme during enkephalin biosynthesis in cultured bovine adrenomedullary chromaffin cells // J. Biol. Chem. – 1985. – V. 260, № 10. – P. 5991-5997.

		Hook V.Y.H., Eiden L.E. (Met)-enkephalin and carboxypeptidase processing enzyme are co-released from chromaffin cells by cholinergic stimulation // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1985. – №128. – P. 563-570.

		Hook V.Y., Loh Y.P. Carboxypeptidase B-like convertasing enzyme activity in secretory granules of rat pituitary // Cell Biol. – 1984. – № 81. – P. 2776-2780.

		Hwang B.H., Zhang J.K., Ehlers C.L. Innate differences of neuropeptide Y in hypotalamic nuclei and central nucleus of the amigdala between selectively bred rats with high and low alcohol preference // Alcohol Clin. Exp. Res. – 1999. – V. 23, № 6. – Р. 1023-1030.

		Jin D.F., Muffly K.E., Okulicz W.C., Kilpatrick D.L. Estrous cycle- and pregnancy-related differences in expression of the proenkephalin and proopiomelanocortin genes in the ovary and uterus // Endocrinology. – 1988. – V. 122, № 4. – Р. 1466-1471.

		Johansson G.B., Skidgel R.A. Carboxypeptidase M converts epidermal growthfactor to Des-Arg53-EGF // FASEB J. – 1994. – V. 8, № 5. – P. 930.

		Joshi D., Billiar R.B., Miller M.M. Modulation of hypothalamic mu-opioid receptor density by estrogen: a quantitative autoradiographic study of the female C57BL/6J mouse // Brain Res. Bull. – 1993. – V. 30, № 5-6. – Р .629-634.

		Jung Y.K., Kunczt C.J., Pearson R.K., Fricker L.D., Dixon J.E. Expression of the rat carboxypeptidase-E gene in neuroendocrine and nonneuroendocrine cell lines // Mol. Endocrinol. – 1992. – V. 6, № 12. – P. 2027-2037.

		Kaminski J., Kozuchowski J., Malinowska L. The activity of cathepsin A and cathepsin D in the serum of persons acutely intoxicated with ethanol and chronic alcoholics // Rocz. Akad. Med. Bialymst. – 1995. – V. 40, № 1. – Р. 209-212.

		Ogilvie К.М., Rivier С. Effect of Alcohol on the Proestrous Surge of Luteinizing Hormone and the Activation of LH-Releasing Hormone Neurons in the Female Rat // Society for Neuroscience. – 1997. – V. 17, № 7. – Р. 2595-2604.

		Kenney W. C. Formation of Schiff base adduct between acetaldehyde and rat liver microsomal phosphatidylethanolamine. // Alcohol. Clin. Exp. Res. – 1984. – V. 8, № 6. – P. 551-555.

		Khanna A.S., Waisman D.M. Metabolism and intracellular processing of protein hormones // Hormon. Act. - 1988. – № 1. – P. 117-132.

		Klein R.S., Das B., Fricker L.D. Secretion of carboxypeptidase E from cultured astrocytes and from AtT-20 cells, a neuroendocrine cell line: implications for neuropeptide biosynthesis // J. Neurochem. – 1992. – V. 58, № 6. – P. 2011-2018.

		Klein R.S., Fricker, L.D. Differental effects of a phorbol ester on carboxypeptidase E in cultured astrocytes and AtT-20 cells, a neuroendocrine cell line // J. Neurochem. – 1993. – V. 60, № 5.- P. 1615-1625.

		Kimura A, Takahashi T. cDNA cloning of rat prolyl oligopeptidase and its expression in the ovary during the estrous cycle // J. Exp. Zool. – 2000. – V. 286, № 6. – Р. 656-665.

		Knox R.V., Vatzias G., Naber C.H., Zimmerman D.R. Plasma gonadotropins and ovarian hormones during the estrous cycle in high compared to low ovulation rate gilts // J. Anim. Sci. – 2003. – V. 81, № 1. – Р. 249-260.

		Kopelman M.D. The Korsakoff syndrome // Brit. J. Psychiatry. – 1995. – V. 166, № 2. – Р. 154-173.

		Kuhl H., Rosniatowski C., Taubert H.D. Effect of sex hormones on LН-RH-degrading hypothalamic enzyme system during estrus cycle in rats // Endocrinol. Exp. – 1979. – V. 13, № 1. – Р. 29-38.

		Laslop A., Tschernitz C. Effects of nerve growth factor on the biosynthesis of chromogranin A and B, secretogranin II and carboxypeptidase H in rat PC12 cells // Neuroscience. – 1992. – V. 49, № 2. – P. 443-450.

		Leppaluoto J., Rapeli M., Varis R., Ranta T. Secretion of anterior pituitary hormones in man: effects of ethyl alcohol // Acta Physiol. Scand. – 1975. – V. 95, № 4. – 400-406.

		Lew R.A., Cowley M., Clarke I.J., Smith A.I. Peptidases that degrade gonadotropin-releasing hormone: influence on LH secretion in the ewe // J. Neuroendocrinol. – 1997. – V. 9, № 9. – Р. 707-712.

		Li X.F., Ahmed A. Compartmentalization and cyclic variation of immunoreactivity of renin and angiotensin converting enzyme in human endometrium throughout the menstrual cycle // Hum. Reprod. – 1997. – V. 12, № 12. – Р. 2804-2809.

		Lipperheide C., Otto K. Improved purification and some properties of bovine lysosomal carboxypeptidase B // Biochim. Biophys. Acta. – 1986. – V. 880, № 2-3. – P. 171-178.

		Loh Y.P., Birch N.P., Castro M.G. Pro-opiomelanocortin and pro-vasopressin converting enzyme in pituitary secretory vesicles // Biochimie. – 1988 . – V. 70, № 1. – P. 11-16.

		Loh Y.P., Parish D.C., Tuteja R. Purification and charasterization of a paired basic residue-specific pro-opiomelanocortin converting enzyme from bovine pituitary intermediate lobe secretory vesicles // J. Biol. Chem. – 1985. – V. 260, № 12. – P. 7194-7205.

		Lowry O.H., Rosebrought N.J., Farr A.G., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. – 1951. – V. 193, № 1. – P. 265-275.

		Lynch D.R., Braas K.M., Hutton J.C., Snyder S.H. Carboxypeptidase E: immunocytochemical localization in the rat central nervous system and pituitary gland // J. Neurosci. – 1990. – V. 10, № 5. – P. 1592-1599.

		Lynch D.R., Venable J.C., Snyder S.H. Enkephalin convertase in the heart: similar disposition to atrial natriuretic factor // Endocrinology. – V. 122, № 6. – P. 2683-2691.

		Lynch D.R., Venable J.C., Strittmatter S.M., Snyder S.H. Enkephalin convertase: charasterization and localization using [3H] guanidinoethylmercaptosuccinic acid // Biochimie. – 1988. – V. 70, № 1. – P. 57-64.

		Lyon R., Goldstein D. Changes in synaptic membrane order associated with chronic ethanol treatment in mice // Molec. Pharmacol. – 1982. - № 23. – Р.86-91.

		 Mahata S.K., Mahata M., Steiner H.J., Fischer-Colbrie R., Winkler H. In situ hybridization: mRNA levels of secretogranin II, neuropeptides and carboxypeptidase H in brains of salt-loaded and Brattleboro rats // Neurosci. – 1992. – V.48, № 3. – P. 669-680.

		Mains R.E., Eipper B.A. Secretion and regulation of two biosyntetic enzyme activities, peptidyl-glycine -amidating monooxygenase and a carboxypeptidase, by mouse pituitary corticotropic tumor cells // Endocrinology. – 1984. – V. 115, № 5. – P. 1683-1690.

		Mateo A.R., Hijazi M., Hammer R.P. Jr. Dynamic patterns of medial preoptic mu-opiate receptor regulation by gonadal steroid hormones // Neuroendocrinology. – 1992. – V. 55, № 1. – С.51-58.

		Matsumoto-H., Mori T. Changes in сystine aminopeptidase (oxytocinase) activity in mouse serum, placenta, uterus and liver during pregnancy or after steroid-hormone treatments // Zoological Science. – 1998, - V. 15, № 1. – Р. 111-115.

		Matsuzaki H., Ueno H., Hayashi R., Liao T.H. Bovine spleen cathepsin A – characterization and comparison with the protective protein // J. Biochem. – 1998. –V. 123, № 4. – P. 701-706.

		Mayas M.D., Ramirez-Exposito M.J., Garcia M.J., Ramirez M., Martinez-Martos J.M. Influence of alcohol on brain aminopeptidases. An in vitro study // Rev Neurol. – 2001. – V. 32, № 11. – Р. 1031-1040.

		Mello N.K., Mendelson J.H., Bree M.P., Skupny A.S. Alcohol effects on luteinizing hormone-releasing hormone-stimulated luteinizing hormone and follicle-stimulating hormone in female rhesus monkeys // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 1986. – V. 236, № 3. – Р. 590-595.

		Mendelson J. Н., Mello N. К., Ellingboe J. Effects of acute alcohol intake on pituitary-gonadal hormones in normal human males // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 1977. – V. 202, № 3. – Р. 676-682.

		Mendelson J.H., Mello N.K., Teoh S.K., Ellingboe J. Alcohol effects on luteinizing hormone releasing hormone-stimulated anterior pituitary and gonadal hormones in women // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 1989. – V. 250, № 3. – Р. 902-909.

		Mitra A., Song L.X., Fricker L.D. The C-terminal region of carboxypeptidase E is involved in membrane-binding and intracellular routing in Att-20 cells // J. Biol. Chem. – 1994. – V. 269, № 31. – P. 19876-19881.

		Morley J.E. Neuropeptide, behavior and aging // Ger. Biosci. – 1986. – V. 34, № 1. - P. 52-62.

		Muffly K.E., Jin D.F., Okulicz W.C., Kilpatrick D.L. Gonadal steroids regulate proenkephalin gene expression in a tissue-specific manner within the female reproductive system // Mol. Endocrinol. – 1988. – V. 2, № 10. – Р. 979-985.

		Nagae A., Deddish P.A., Becker R.P., Anderson C.H., Abe M., Tan F., Skidgel R.A., Erdos E.G. Carboxypeptidase M in brain and peripheral nerves // J. Neurochem. – 1992. – V. 59, № 6. – P. 2201-2212.

		Nalamachu S.R., Song L.X., Fricker L.D. Regulation of carboxypeptidase E - effect of Ca2+ on enzyme-activity and stability // J. Biol. Chem. – 1994. – V. 269, № 15. – P. 11192-11195.

		Norenberg U., Richter D. Processing of the oxytocin precursor: isolation of an exopeptidase from neurosecretory granules of bovine pituitaries // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1988. – V. 156, № 2. – P. 898-904.

		Normant E., Loh Y.P. Carboxypeptidase E acts as a sorting receptor for routing proinsulin and proenkephalin but not chromogranin A to the regulated secretory pathway // FASEB Journal. – 1997. – V. 11, № 9. – P. 431.

		O’Conner J.L., Lapp C.A., Mahesh V.B. Peptidase activity in the hypothalamus and pituitary of the rat: fluctuations and possible regulatory role of luteinizing hormone releasing hormone-degrading activity during the estrous cycle // Biol. Reprod. – 1984. – V. 30, № 4. – Р. 855-862.

		Ogilvie K.M., Rivier C. Gender difference in alcohol-evoked hypothalamic-pituitary-adrenal activity in the rat: ontogeny and role of neonatal steroids // Alcohol. Clin. Exp. Res. – 1996. – V. 20, № 2. – Р. 255-261.

		Orskov C., Buhl T., Rabenhoj L., Kofod H., Holst J.J. Carboxypeptidase-B-like processing of the C-terminus of glucagon-like peptide-2 in pig and human small intestine // FEBS Lett. – 1989. – V. 247, № 2. – P. 193-196.

		Ostrowski N.L., Hill J.M., Pert C.B., Pert A. Autoradiographic visualization of sex differences in the pattern and density of opiate receptors in hamster hypothalamus // Brain. Res. – 1987. – V. 421, № 1-2. – Р.1-13.

		Parkinson D. Two soluble forms of bovine carboxypeptidase H have different NH2-terminal sequences // J. Biol. Chem. – 1990. – V. 265, № 28. – P. 17101-17105.

		Parkinson D. Carboxypeptidase H in bovine pituitary gland: soluble forms are not processed at the C-terminus // Mol. Cell. Endocrinol. – 1992. – V. 86, № 3. – P. 221-233.

		Patel V.A., Pohoresky L.A. Acute and chronic ethanol treatment on β-endorphin and catecholamin levels // Alcohol. – 1989. – V. 6, №1. – Р. 59-63.

		Porcelli G., Raffaelli R., Sacchi A., Volpe A.R., Miani C. Localization and characterization of human salivary kininases // Agents Actions Suppl. – 1992. – V. 38, № 1. – P. 401-406.

		Potargowicz E., Traczyk W.Z. Role substance P in central control of ovulation in female rats // Endocrine regulations. – 1999. - № 33. – Р. 161-167.

		Prieto I., Arechaga G., Ramirez-Exposito M.J., De Gasparo M., Martinez-Martos J.M., Ramirez M. Aminopeptidases in the gonads of male and female rats // Fertil. Steril. – 2002. – V. 77, № 4. – Р. 802-804.

		Proteinases in Mammalian Cells and Tissues / Barrett A.J. (ed.). – Amsterdam: Elsevier/North Holland Biomedical Press, 1977.

		 Redei E., Brunch B.J., Gholami S., Lin Y.R., Taylor A.N. Effects of ethanol on CRF-release in vitro // Endocrinology. – 1988. – V. 123, № 6. – Р. 2736-2743.

		Redei E., Brunch J.B., Taylor A.N. Direct effect of ethanol on adrenocorticotropin (ACTH) release in vitro // J. Pharmac. Exp. Ther. – 1986. – № 237. – Р. 59-64.

		Rettori V., Skelley C.W., McCann S.M., Dees W.L. Detrimental effects of short-term ethanol exposure on reproductive function in the female rat // Biol. Reprod. – 1987. – V. 37, № 5. – Р.1089-1096. 

		Rivier C. Female rats release more corticosterone than males in response to alcohol: influence of circulating sex steroids and possible consequences for blood alcohol levels // Alcohol Clin. Exp. Res. – 1993. – V. 17, № 4. – Р. 854-859.

		Rivier C., Rivest S., Vale W. Alcohol-induced inhibition of LH secretion in intact and gonadectomized male and female rats: possible mechanisms // Alcohol Clin. Exp. Res. – 1992. – V. 16, № 5. – Р. 935-941.

		Rosman P.M., Farag A., Benn R., Tito J., Mishik A., Wallace E.Z. Modulation of pituitary-adrenocortical function: decreased secretory episodes and blunted circadian rhythmicity in patients with alcoholic liver disease // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 1982. – V. 55, № 4. – Р. 709-717.

		Roth W.W., Mackin R.B., Spiess J., Goodman R.H., Noe B.D. Primary structure and tissue distribution of angelerfish carboxypeptidase H // Mol. Cell Endocrinol. – 1991. – V. 78, № .3. – P.171-178.

		Rouille Y., Chauvet J., Acher R. Partial conversion of vasopressinyl-Gly-Lys-Arg into pharmacologically active vasopressin through secretory granule carboxypeptidase E and alpha-amidating processing enzymes // Biochem. Int. – 1992. – 26, № 4. – P.739-746.

		Rubattu S., Quimby F.W., Sealey J.E. Tissue renin and prorenin increase in female cats during the reproductive cycle without commensurate changes in plasma, amniotic or ovarian follicular fluid. // J. Hypertens. – 1991. – V. 9, № 6. – Р. 525-535. 

		Ryder S., Straus E., Lieber C.S., Yalow R.S. Cyolecystocinin and enkephalin levels following ethanol administration in rats // Peptides. – 1981. - № 2. – Р.223-226.

		Saito T., Lee J.M., Tabacoff B. Ethanol’s effects on cortical adenilate cyclase activity // J. Neurochem. – 1985. – № 44. - Р. 1037-1044.

		Salonen I., Huhtaniemi I. Effects of chronic ethanol diet on pituitary-testicular function of the rat // Biology of Reproduction. – 1990. - № 42 – Р. 55-62.

		Schauser K.H., Nielsen A.H., Dantzer V., Poulsen K. Angiotensin-converting enzyme activity in the bovine uteroplacental unit changes in relation to the cycle and pregnancy // Placenta. – 2001. – V. 22, № 10. – Р. 852-862.

		Schauser K.H., Nielsen A.H., Winther H., Dantzer V., Poulsen K. Localization of the renin-angiotensin system in the bovine ovary: cyclic variation of the angiotensin II receptor expression // Biol. Reprod. – 2001. – V. 65, № 6. – Р. 1672-1680.

		Schulz R., Wuster M., Duka D., Herz A. Acute and chronic ethanol treatment changes endorphine levels in brain and pituitary. – Psychopharmacologia (Berl.), 1980. – P. 221-227.

		Seidah N.G., Chretien M. Proprotein and prohormone convertases of the subtilisin family – recent developments and future perspectives // Trends Endocrinol. Met. – 1992. – 3, № 4. – P. 133-140.

		Seizinger B. R., Bovermann K., Maysinger D. Differential effects of acute and chronic ethanol treatment on particular opioid peptide systems in discrete regions of rat brain and pituitary // Pharmacol. Biochem. Behav. – 1983, – V.18, № 1. – Р. 1-9.

		Shen F.S., Loh Y.P. Intracellular Misrouting and Abnormal Secretion of Adrenocorticotropin and Growth Hormone in Cpe (Fat) Mice Associated with a Carboxypeptidase E Mutation // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1997. – V. 94, № 10. – P. 5314-5319.

		Shimamori Y., Kumagai Y., Watanabe Y., Fujimoto Y. Human placental carboxypeptidase M is anchored by a glycosyl-phosphatidylinositol moiety // Biochem. Int. – 1990. – V. 20, № 3. – P. 607-613.

		Simerly R.B., Young B.J., Carr A.M. Co-expression of steroid hormone receptors in opioid peptide-containing neurons correlates with patterns of gene expression during the estrous cycle // Brain Res. Mol. Brain Res. – 1996. – V. 40, № 2. – Р. 275-284.

		Simpson K.B., May D. Some effects of the oestric cicly in the female rats // J.of the Institute of Animal Technicions. – 1973. - № 24. - Р. 25.

		Skidgel R.A., Davis R.M., Tan F. Human carboxypeptidase M. Purification and characterization of a membrane-bound carboxypeptidase that cleaves peptide hormones // J. Biol. Chem.– 1989.– V. 264, № 4.– P. 2236-2241.

		Skidgel R.A., Erdos E.G. Cellular carboxypeptidases // Immunol. Rev. – 1998. – V. 161, № 2. – P. 129-141.

		Skidgel R.A., McGwire G.B., Li X.Y. Membrane anchoring and release of carboxypeptidase M: implications for extracellular hydrolysis of peptide hormones // Immunopharmacology. – 1996. – V. 32, № 1-3. – Р. 48-52.

		Skidgel R.A., Tan F.L., Deddish P.A., Li X.Y. Structure, function and membrane anchoring of carboxypeptidase M // Biomed. Biochim. Acta. – 1991. – V. 50, № 4-6. – P. 815-820.

		Slamecki C.J., Somes C., Ehlers C.L. Effects of chronic ethanol exposure on neurophysiological responses to corticotropinreleasing factor and neuropeptide Y // Alcohol and Alcoholism. – 1999. - № 34. – Р. 289-299.

		Smith D.R., Pallen C.J., Murphy D., Lim L. Pituitary-specific transcriptional initiation sites of the rat carboxypeptidase-H gene and the influence of thyroid hormone status // Mol. Endocrinol. – 1992. – V. 6, № 5. – P. 713-722.

		Smyth D.G., Maruthainar K., Darby N.J., Fricker L.D. Catalysis of slow C terminal processing reactions by carboxypeptidase H // J. Neurochem. – 1989. – V. 53, № 2. – P. 489-493.

		Song L., Fricker L.D. Calcium- and pH-dependent aggregation of carboxypeptidase E // J. Biol. Chem. – 1995. – 270, № 14. – P. 7963-7967.

		Steiner D.F. The biosynthesis of biologically active peptides: a perspective // Peptide Biosynthesis and Processing (Fricker L.D., ed.).- CRC Press, Boca Raton, Florida, 1991. – P. 1-16.

		Suda M., Nakao K., Sakamoto M., Morii N., Sugawara A., Imura H. Changes in the immunoreactivities of an opioid peptide leumorphin in the hypothalamus and anterior pituitary during the estrous cycle of the rat and their relation to sexual behavior // Brain Res. – 1986. – V. 374, № 2. – Р. 236-243.

		Supattapone S., Fricker L.D., Snyder S.H. Purification and characterization of membrane-bound enkephalin-forming carboxypeptidase, “enkephalin convertase” // J. Neurochem. – 1984. – V. 42, № 4.- P. 1017-1023.

		Tabakoff B., Hoffman P.L. Biochemical pharmacology of alcohol // Psychopharmacology: The third generation of progress/Ed. By H.Y. Meltzer. New.York: Raven Press. – 1987. – Р.1521-1526.

		Tan F., Chan S.J., Steiner D.F., Schilling J.W., Skidgel R.A. Molecular cloning and sequencing of the cDNA for human membrane-bound carboxypeptidase M. Comparison with carboxypeptidases A, B, H, and N // J. Biol. Chem. – 1989. – V. 264, № 22. – P. 13165-13170.

		Thiagarajan A.B., Mefford I.N., Eskay R.L. Single dose ethanol administration activities the hypotalamus-pituitary-adrenal axis:exploration of the mechanism of action // Neuroendocrinology. – 1989. – V. 50, № 4. – Р .427-432.

		Uhleman E.R., Robberecht P., Gardner J.D. Effects of alcohols on the actions of VIP and secretin on acinar cells from guinea pig pancreas // Gastroenterology. – 1979. - № 76. – Р.917-925.

		Walsh J.P., Rao A., Thompson R.C., Clarke I.J. Proenkephalin and opioid mu-receptor mRNA expression in ovine hypothalamus across the estrous cycle // Neuroendocrinology. – 2001. – V. 73, № 1. – Р. 26-36. 

		Wardlow S.L. Regulation of -endorphin, corticotropin-like intermediate lobe peptide, and -melanotropin-simulating hormone in the hypothalamus by testosterone // Endocrinology. – 1986. – V. 119, № 1. – P. 19—24.

		Winkler A., Buzas B., Siems W.E., Heder G., Cox B.M. Effect of ethanol drinking on the gene expression of opioid receptors, enkephalinase, and angiotensin-converting enzyme in two inbred mice strains // Alcohol Clin. Exp. Res. – 1998. – V. 22, № 6. – Р. 1262-1271.

		Yamamoto T., Nishiyama M., Naka A. Role of epidermal grouwth factor in reproduction // Acta Obstetr. Gynaecol. Jap. – 1988. – V. 40, № 5. – P. 649-654.

		Yoshioka S., Fujiwara H., Yamada S., Nakayama T., Higuchi T., Inoue T., Mori T., Maeda M. Membrane-Bound Carboxypeptidase M is expressed on human ovarian follicles and corpora-lutea of menstrual-cycle and early-pregnancy // Molecular Human Reproduction. – 1998. – V. 4, № 7. – Р. 709-717.

		Zhou Y., Franck J., Spangler R., Maggos C.E., Ho A., Kreek M.J. Reduced hypothalamic POMC and anterior pituitary CRF1 receptor mRNA levels after acute, but not chronic, daily “binge” intragastric alcohol administration // Alcohol Clin. Exp. Res. – 2000. – V. 24, № 10. – Р. 1575-1582.