Участие митохондриального АТФ-ингибируемого калиевого канала в адаптации животного к гипоксическому состоянию

2







Федеральное агентство по образованию

Пензенский государственный педагогический университет

им. В. Г. Белинского

	          Факультет	Кафедра

Естественно-географический                                              биохимии







Дипломная работа



Участие митохондриального АТФ-ингибируемого калиевого канала в адаптации животного к гипоксическому состоянию









Студент  ____________________________________________ 

                                                                подпись

Руководители  __________________________________  Сметанин В. А.

                                                                подпись

                          ______________________________________  

                                                                подпись





К защите допустить. Протокол № от « _ »             200  г

	Зав. кафедрой  ____________________________________    Генгин М.Т.

	                                                                 подпись

Пенза, 2007 г


Содержание



Список сокращений ………………………………………………………...…..

Введение ……………………………………………………………………...….

Глава 1. Обзор литературы ……………………………………….………..........

1.1 Системы транспорта ионов калия в митохондриях ……………………….

1.2 Свойства и регуляция митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала………………………………………………………………………………

1.3 Фармакологическая модуляция митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала ………………………………………………………………...

1.4 Структура митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала ……

1.5 Нарушения гомеостаза, вызванные гипоксией и механизмы его восстановления ………………………………………………………………….

Глава 2. Материалы и методы …………………………………………………

2.1 Выделение белка с молекулярной массой 55 кДа из митохондрий печени крыс………………………………………………………………………………

2.1.1 Выделение митопластов из митохондрий печени крыс………………...

2.1.2 Экстрагирование белков из митопластов………………………………..

2.1.3 Отделение водорастворимых белков от нерастворимых……………….

2.1.4 Ионообменная хроматография на DEAE-целлюлозе……………………

2.1.5 SDS-электрофорез в ПААГ……………………………………………….

2.1.6 Определение проводимости бислойных липидных мембран (БЛМ)….

2.1.7 Нативный электрофорез…………………………………………………..

2.1.8 Концентрирование белка методом обратного диализа с помощью полиэтиленгликоля …………………………………………………………...…

2.2 Выделение митохондрий из печени крыс……………………………….....

2.4 Выделение митохондрий из сердца крыс………………………………….

2.5 Определение параметров транспорта К+ с помощью

К+ -селективного электрода……………………………………………………..

2.6 Определение параметров дыхания с помощью кислородного электрода Кларка……………………………………………………………………………

2.7 Спектрофотометрическое определение скорости набухания митохондрий…………………………………………………………………….

2.8 Определение устойчивости к гипоксии крыс и адаптация к ней низкоустойчивых крыс…………………………………………………………

Глава 3. Результаты и обсуждение………………………………………….…

3.1 Выделение белка с молекулярной массой 55 кДа…………………………

3.2 Определение параметров дыхания у крыс с различной устойчивостью к гипоксии и адаптированных к ней……………………………………………...

3.3 Изучение параметров АТФ-зависимого транспорта ионов калия в митохондриях…………………………………………………………………….

3.4 Определение количества ионов К+ в митохондриях различных групп крыс……………………………………………………………………………….

Выводы…………………………………………………………………………..

Список литературы…………………………………………………………….


Список сокращений



БЛМ – бислойные липидные мембраны

митоКАТФ – митохондриальный АТФ-зависимый калиевый канал.

цитоКАТФ – цитоплазматический АТФ-зависимый калиевый канал.

АФК – активные формы кислорода.

митоKIR – канальная субъединица митоКАТФ

митоSUR – регуляторная субъединица митоКАТФ

ДЕБ – п-диметиламиноэтилбензоат

GSH/GSSG – окисленная / восстановленная форма глутатиона

МЭ – 2-меркаптоэтанол

ТЕМЕД – N,N,N',N'-Тетраметилэтилендиамин

Тris – трис(гидроксиметил)метиламин

ПЭГ – полиэтиленгликоль

НУ – низкоустойчивые животные

ВУ – высокоустойчивые животные

А – адаптированные животные

5- НD – 5-гидроксидеканоат

HEPES - N-2-гидроксиэтилперазин–N’-этансульфоновая кислота


Введение



Любое патологическое состояние прямо или косвенно связано с нарушением кислородного гомеостаза организма. Инсульты, инфаркты, ишемические состояния различных органов, инфекционные заболевания - это лишь небольшой перечень тех патологий, в основе генеза которых лежит гипоксия.

В настоящее время многие исследователи склоняются к тому, что активация митохондриального АТФ-ингибируемого калиевого канала является важным моментом в адаптации к гипоксии. [23, 30, 51]. 

Следует отметить, что этот канал был впервые изолирован из внутренней митохондриальной мембраны в лаборатории митохондриального транспорта [4], и в настоящее время проводится изучение его свойств [42].

В данной работе приводятся доказательства участия митохондриального АТФ-ингибируемого калиевого канала в адаптации животного к гипоксическому состоянию. Нами впервые обнаружено, что адаптация ведет к активации калиевого цикла в митохондриях. 

В настоящее время обнаружен ряд модуляторов канала, влияющих на его активность. В связи с этим, существует перспектива использования этих модуляторов для повышения адаптации организма к гипоксическому состоянию.

Полученные данные были представлены на Всероссийской конференции молодых ученых «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург 2007), на конференции.. (Пенза 2007), а также в сборнике научных работ «Современный мир, природа и человек» т.4 № 1 с. 40.(Томск, 2007)


Глава 1. Обзор литературы



1.1. Системы транспорта ионов калия в митохондриях



Известно, что во внутренней мембране митохондрий локализуются ферменты синтеза АТФ, системы транспорта ионов и субстратов дыхания, а также переносчики электронов дыхательной цепи. При работе последних на мембране митохондрий создается потенциал () около 190 мВ, который используется для синтеза АТФ. Существование высокого отрицательного  создает предпосылки для входа в митохондрии катионов, среди которых основным является калий. Вход катионов К+ ведет к набуханию митохондрий и нарушению их структуры. Поэтому было предположено, что для поддержания объема митохондрий в них, наряду с системой потенциалозависимого входа, должна существовать система выхода катиона [44]. В дальнейшем это было подтверждено экспериментально [24, 56].

	Так как скорость входа калия в митохондрии мала [14], первоначально полагали, что он осуществляется лишь благодаря диффузии иона через мембрану, проявляющейся в незначительных токах утечки [25]. Действительно, кажется маловероятным, что на внутренней мембране митохондрий, при наличии столь высокой электродвижущей силы, природа создала специфические каналы для калия. Однако, еще в 1981 году в  лаборатории митохондриального транспорта Г. Д. Мироновой [4], а в дальнейшем и другими исследователями [17], из внутренней мембраны митохондрий был выделен селективный для калия канал, выполняющий функцию унипортера, причем антитела к этому белку-каналу специфически ингибировали работу данного канала, не влияя на другие функции митохондрий [6]. В настоящее время уже общепринято, что в митохондриях существует две системы транспорта калия: система унипортера, осуществляющего вход калия по электрохимическому потенциалу, и K+/H+-обменник, транспортирующий калий из митохондрий в обмен на Н+ [26,27]. То есть, в митохондриях существует так называемый калиевый цикл (рис 1).



Рис 1. Митохондриальный калиевый цикл

 (по Garlid and Paucek, 2003).

ЭТЦ – электрон-транспортная цепь; ММП – межмембранное пространство.



Первым компонентом этого цикла, выполняющим функцию унипортера, является белок-канал с молекулярной массой 55 кДа [3, 4, 43]. Этот белок, при встраивании в бислойные липидные мембраны (БЛМ), формирует селективные для ионов калия каналы. Позднее было обнаружено, что данный канал ингибируется АТФ [53]. Существование природного ингибитора канала вполне логично, так как закрытие канала предотвращает неконтролируемое набухание митохондрий. К настоящему времени митоКАТФ был обнаружен во внутренней мембране интактных митохондрий методом петч-кламп в нескольких лабораториях [12, 15, 20, 31, 45, 64]. 

Другим компонентом калиевого цикла является К+/Н+ - антипортер, который в настоящее время также выделен из внутренней мембраны митохондрий и молекулярная масса которого, по данным профессора Гарлида, равна 82 кДа [37]. Предполагается, что антипортер ответственен за поддержание объема митохондрий при увеличении скорости входа калия через внутреннюю митохондриальную мембрану. Открытие митоКАТФ кратковременно сдвигает баланс между К+ - унипортером и К+/Н+ - антипортером до тех пор пока скорость выхода К+ через последний не достигает скорости входа К+. 

В настоящее время установлено, что митоКАТФ участвует не только в поддержании объема митохондрий, но и в адаптации животных к экстремальным воздействиям. По результатам, полученным на моделях гибернирующего суслика и адаптированных к холоду животных, в лаборатории митохондриального транспорта было высказано предположение об участии митоКАТФ в несократительном термогенезе [2,18]. Продолжение исследований в этом направлении может иметь значение для решения проблем анабиоза и гипотермического наркоза. Кроме того, в настоящее время стала широко изучаться роль митоКАТФ в кардиопротекции, что будет обсуждаться ниже.


1.2. Свойства и регуляция митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала



Изучение свойств митоКАТФ показало, что он относится к семейству АТФ-зависимых калиевых каналов, впервые обнаруженных в цитоплазматических мембранах [46]. Основное общее свойство всех каналов, относящихся к этому семейству, состоит в том, что они ингибируются физиологическими концентрациями АТФ [31, 49, 53] и, являясь селективными для калия, обладают выпрямляющими свойствами, т.е. имеют разные скорости транспорта калия в зависимости от направления переноса ионов [31, 49].

Функционирование как митоКАТФ, так и цитоКАТФ зависит от редокс состояния активных групп белков-каналов. Установлено, что окислительно- восстановительные агенты модулируют работу митоКАТФ. Донор электронов п-диметиламиноэтилбензоат (ДЕБ) активирует митоКАТФ, а акцептор электронов - пеларгонидин ингибирует канал [29]. Эти реагенты влияют, вероятно, на SH-группы канала.

При гипоксии, как известно, в клетках значительно изменяется редокс баланс: наблюдается увеличение концентрации активных форм кислорода, изменение соотношений GSH/GSSG и НАД+/НАДН. Такие сдвиги могут привести к модификации тиоловых групп цистеинов. 

Хорошо известно, что АФК образуются и накапливаются в организме при различных патологических состояниях, в частности, при ишемии. Однако, они могут образовываться в клетке при нормальном функционировании [48, 52] как побочные продукты аэробного метаболизма и играть значительную роль в работе дыхательной цепи [33], а также в процессах внутриклеточной сигнализации [22, 50].

В экспериментах со встроенным в БЛМ митоКАТФ было показано, что добавление в среду инкубации системы генерации радикала супероксид аниона – ксантин/ксантин оксидазы, приводило к активации канала уже в течение первой минуты инкубации [64]. При этом вероятность открытого состояния митоКАТФ возросла приблизительно в три раза. По-видимому, действие свободных кислородных радикалов на канал опосредовано различными механизмами и направлено на его сульфгидрильные группы.

Другим универсальным фактором регуляции метаболизма является оксид азота II (NО). 

Недавно стало известно, что синтез NO может происходить локально в митохондриях, возможно, за счет существования специфичной митохондриальной NO-синтетазы – mtNOS [59]. Было показано, что образованный в тканях NO обладает активирующим действием на митоКАТФ [15, 36, 57]. Так как дыхательная цепь митохондрий является постоянным источником супероксид аниона, который легко вступает в реакцию с NO, вполне вероятно, что в митохондриях происходит образование пероксинитрита ONOO- [38]. Предполагают, что активирующий эффект NO и пероксинитрита (ONOO-) на митоКАТФ осуществляется через активацию протеинкиназы С [35].


1.3. Фармакологическая модуляция митохондриального 

АТФ-зависимого калиевого канала



Классификация митоКАТФ как селективного К+ канала, напоминающего изоформу цитоКАТФ, следует, в основном, из того, что оба канала имеют общие активаторы и ингибиторы. В настоящее время обнаружено большое количество подобного рода фармакологических агентов [51]. Эти данные обобщены в таблице 1.



Таблица 1. Модуляторы цитоплазматического и митохондриального КАТФ каналов.

Модуляторы

митоКАТФ

митоКАТФ и цитоКАТФ

цитоКАТФ

Активаторы

диазоксид

никорандил

BMS-180448

BMS-191095

ДЕБ

Тестостерон

УДФ

кромакалим

пинацидил

Р-1060

силденафил

изофуран

EMD60480

априкалим

P-1075

β- эстрадиол









МСС-134



Ингибиторы

5-HD

МСС-134

глибенкламид

HMR1098(1833)

Глимепирид



Селективность действия модулятора зависит от типа изучаемых клеток, условий эксперимента и, в основном, от используемых концентраций. Диазоксид и никорандил, например, активируют не только митоКАТФ, но в более высоких концентрациях также активируют и цитоКАТФ [16,58]; 5-HD помимо митоКАТФ ингибирует при низких значениях рН цитоКАТФ, активируемый АДФ [47].

Известно, что MCC-134, аналог априкалима, в поджелудочной железе ингибирует, а в гладкой мускулатуре активирует КАТФ каналы. Недавно было показано, что этот препарат ингибирует митоКАТФ, но активирует цитоКАТФ в кардиомиоцитах. 

Недавно, в лаборатории митохондриального транспорта было показано, что дифосфонуклеотиды являются активаторами канала, причем наиболее выраженный эффект наблюдался при активации канала УДФ.

Было показано, что дифосфонуклеотиды, такие как АДФ и ГДФ активируют реконструированную в БЛМ канальную субъединицу [29,43]. Данные по активирующему действию ГДФ в дальнейшем были подтверждены и другими исследователями [12]. Недавно было показано, что в ряду дифосфонуклеотидов наиболее эффективным является уридиндифосфат (УДФ) [42]. Этот фосфонуклеотид в микромолярных концентрациях активирует митоКАТФ. Для активации цитоКАТФ нужны значительно большие концентрации УДФ [8]. Реконструированный в БЛМ канал (митоKIR), после ингибирования АТФ, полностью реактивируется 20 мкМ УДФ. В интактных митохондриях, где присутствуют обе субъединицы, канал реактивируется теми же концентрациями УДФ, и эта активация снимается глибенкламидом и 5-НD  [42]. Следовательно, участок связывания УДФ локализуется на канальной субъединице.

Функцию метаболических регуляторов могут выполнять также гормоны. Еще на первых этапах исследования митоКАТФ в лаборатории митохондриального транспорта обнаружено, что прогестерон ингибирует его канальную субъединицу. В настоящее время появились данные о том, что женский половой гормон -эстрадиол является, вероятно, активатором митоКАТФ, так как он обладает кардиопротекторным действием, которое снимается 5-НD [61].

Мужской половой гормон – тестостерон, также оказывал как активирующее митоКАТФ, так и кардиопротекторное действие [20]. При измерении активности митоКАТФ по флуоресценции флавопротеидов в митохондриях сердца, а также методом петч-кламп по регистрации электрических характеристик мембран митопластов было установлено, что тестостерон вызывал окисление флавопротеидов и активацию каналов. Оба эффекта зависели от присутствия в среде К+ и были чувствительны к АТФ. Показано, что тестостерон оказывал эффект только на митоКАТФ и не влиял на цитоКАТФ [20].

Каналы, образованные в БЛМ белком с молекулярной массой 55 кДа, регулируются АТФ, как было ранее показано [3], который способен значительно снижать проводимость модифицированной белком мембраны. Ионы Mg2+ не оказывали значительного влияния на ингибирование канала АТФ. 

В интактных митохондриях можно также наблюдать АТФ-зависимый транспорт калия, используя модель энергозависимого входа калия. АТФ в присутствии MgCl2 способен был подавлять энергозависимый вход калия в митохондрии. Однако, в отличие от данных, полученных при реконструкции этого белка в искусственные мембраны, действующая концентрация АТФ значительно ниже. Другим отличием является абсолютная необходимость Mg2+ для ингибирования АТФ в случае интактных митохондрий, в то время как при реконструкции белка с Мr 55 кДа в БЛМ, Mg2+ не оказывает существенного влияния на эффект ингибирования калиевого канала АТФ.

Различия в действии Mg2+, возможно, объясняются тем, что Mg2+ - связывающий участок локализован на регуляторной субъединице канала. Связывание регуляторной субъединицы с магнием увеличивает, вероятно, сродство к АТФ каналообразующей субъединицы.

Ингибирование нуклеотидом, вероятнее всего, осуществляется за счет его связывания в специфическом участке, а не в результате фосфорилирования белка, хотя таковое может иметь место. Интересно, что присутствие магния не является необходимым условием для ингибирующего эффекта АТФ при реконструкции митоKir (белка с Мr 55 кДа) в искусственные мембраны, следовательно, Mg2+ проявляет свой эффект только в интактных митохондриях, то есть при наличии двух субъединиц.

Так как ингибирующий эффект АТФ проявляется и при реконструкции только каналоформирующей субъединицы (митоKir) в БЛМ и липосомы, логично предположить, что нуклеотидсвязывающий участок расположен на каналообразующей субъединице, однако регуляторная субъединица (митоSUR) повышает сродство каналов к нуклеотиду.

В исследовании по регуляции транспорта калия адениновыми нуклеотидами с использованием модели выхода ионов K+ из митохондрий в присутствии разобщителя окислительного фосфорилирования было обнаружено, что ингибитор адениннуклеотидтранслоказы ― атрактилозид в концентрации 1 мкМ полностью предотвращал ингибирующее действие АТФ. Следовательно, можно предположить, что для ингибирования канала АТФ должен транспортироваться внутрь митохондрий, где и происходит его связывание с каналом. Исходя из этого, представляется, что нуклеотидсвязывающий участок митохондриального АТФ-чувствительного калиевого канала располагается на обращенной в сторону матрикса части белка-канала.


1.4. Структура митохондриального АТФ-зависимого 

калиевого канала



Структура цитоКАТФ и ген ее кодирующий к настоящему времени известны. Установлено, что этот канал состоит из двух субъединиц: канальной и регуляторной. Канальная субъединица имеет Мr 43-46 кДа и формирует АТФ-зависимый калиевый канал, который не регулируется специфическими модуляторами канала. Регуляторная субъединица имеет Мr от 60 до 174 кДа, в зависимости от ткани, и придает каналу чувствительность к модуляторам [7].

Несмотря на то, что свойства, регуляция и физиологическое значение митоКАТФ в настоящее время широко изучаются, солюбилизация его из митохондриальных мембран и изучение структуры проводятся лишь в отдельных лабораториях. Так как митоКАТФ  имеет ряд общих свойств с цитоКАТФ и регулируется общими регуляторами, было предположено, что по структуре он близок к цитоплазматическому каналу [43] и состоит из канальной субъединицы [42] и регуляторной [10]. МитоКАТФ, также как и клеточный, является, по всей вероятности, гетеромультимером, состоящим из калиевого канала, белка с молекулярной массой 55 кДа, который имеет выпрямляющие свойства и который, по аналогии с цитоплазматическим каналом, назвали митоKIR [42] и рецептора, чувствительного к сульфонилмочевинам и поэтому названного митоSUR (Рис. 2) [10, 43].

Рис 2. Рабочая модель структуры митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала (по Mironova et al., 2004) 

Белок, выделенный из внутренней мембраны митохондрий печени крысы, который формирует в БЛМ АТФ-зависимые каналы и имеет Мr 55 кДа (митоKIR), не ингибируется глибенкламидом и специфическим ингибитором митоКАТФ 5-HD, и не активируется кромакалимом и диазоксидом. В то же время эти препараты влияли на АТФ-зависимый калиевый транспорт в изолированных митохондриях [42].

Константа ингибирования АТФ на реконструированном в БЛМ митоKIR была значительно выше, чем в интактных митохондриях и Mg2+ для этого ингибирования не требовался. В то же время, для ингибирования фосфонуклеотидом канала, локализованного в интактных митохондриях, присутствие ионов магния было необходимо [42]. Те же различия были обнаружены при сравнительном изучении влияния АТФ и сульфонилмочевины на цитоKIR и целый цитоКАТФ [62]. Целый цитоКАТФ ингибировался значительно меньшими концентрациями АТФ, чем канальная  субъединица и был чувствителен к сульфонилмочевине и активаторам, в то время как канальная субъединица такой чувствительности не проявляла. Из этих данных был сделан вывод, что основной участок связывания АТФ в цитоКАТФ локализован на канальной субъединице, а регуляторная субъединица повышает сродство канальной субъединицы к АТФ и обеспечивает чувствительность целого канала к активаторам и ингибиторам [62].

Приведенные выше результаты исследований митоКАТФ подтверждают  предположение о том, что белок с Мr 55 кДа является канальной субъединицей целого митоКАТФ. Однако, для более прямого подтверждения этого предположения нами были получены антитела (АТ) на этот белок и показано, что они ингибируют АТФ-зависимый калиевый транспорт в интактных митохондриях, не влияя при этом на другие функции митохондрий, такие как окислительное фосфорилирование и транспорт кальция [6]. Функцию регуляторной субъединицы выполняет, вероятно, белок с Мr 63 кДа, связывающийся с меченым глибенкламидом [10].


1.5. Нарушения гомеостаза, вызванные гипоксией и механизмы его восстановления



Известно, что при гипоксии недостаток кислорода приводит к восстановлению переносчиков дыхательной цепи [1]. Восстановление переносчиков I и III комплексов цепи, приводит к увеличению образования АФК, которые активируют свободнорадикальные процессы в клетке [19, 32]. 

Можно выделить две основные физиологические роли свободнорадикального окисления в организме. Во-первых, этот процесс имеет место при катаболизме многих липидов и белков, что облегчает дальнейшее действие фосфолипаз и протеаз, сродство которых намного выше именно к  окисленному субстрату [63], а также при синтезе физиологически активных веществ липидной природы (лейкотриены, тромбоксаны, простагландины). Во-вторых, АФК участвуют в начальных этапах клеточной сигнализации (редокс–сигнализация) в условиях стресса, гипоксии, воспаления, воздействия высоких и низких температур, физической нагрузки, и других патологических состояниях. Характер клеточного ответа будет зависеть от продолжительности и интенсивности воздействия вышеперечисленных факторов. При умеренном воздействии формируется неспецифический ответ, повышающий адаптацию организма к новым условиям. При воздействии высокой интенсивности, например, при глубокой гипоксии наступает некроз тканей, в том числе и за счет повреждающего действия АФК, активирующих перекисное окисление липидов и других биологических молекул [5].

Механизм протекторного действия заключен, по-видимому, в окислительно-восстановительных модификациях сульфгидрильных групп сенсорных белков, что приводит к активации тирозинкиназного пути клеточного ответа [5].

Одним из важнейших следствий инициации редокс-сигнализации и АФК-опосредованной передачи сигнала является активация ядерных факторов транскрипции, которые находятся в неактивном состоянии до тех пор, пока в их молекуле не произойдет отщепление ингибиторного домена. После этого, ядерные факторы транскрипции оказываются способными индуцировать многочисленные гены. Важную роль в настоящее время придают таким факторам транскрипции, как NF-kB [21], AP-1[41].

Среди известных к настоящему времени белков, которые синтезируются в ответ на редокс-сигнал от адаптирующего фактора, наибольшее значение имеет, прежде всего, ряд неспецифических молекул, таких как ферменты антиоксидантной защиты, белки семейства HSP и другие белки срочного ответа, которые могут синтезироваться в ответ на гипоксию, стресс, ишемию, реперфузию и т.д. [41]. Кроме того, синтезируются  специфические молекулы с шапероновой активностью по отношению к конкретным белкам клетки, как показано, например для специфического шаперона Са-насоса саркоплазматического ретикулума [13], либо белки, специфически синтезирующиеся в ответ на действие конкретного фактора, например, в ответ на гипоксию [28].

Следует отметить, что на сегодняшний день одним из наиболее эффективных способов предотвращения повреждений тканей, вызванных гипоксическим состоянием, является интервальная гипоксическая тренировка. До настоящего времени считалось, что основной механизм адаптационного эффекта всех видов гипоксической тренировки обусловлен активацией антиоксидантных ферментов, усиливающих защиту организма от воздействия активных форм кислорода [28,41]. Недавно в лаборатории Скулачева было показано, что незначительное снижение мембранного потенциала (~ на 13%) ведет к существенному (до 80%) уменьшению продукции супероксид-анионов  [34]. Следует отметить, что в митохондриях образуется до 95% супероксид-анионов клетки [11,54,60].

Ранее было высказано предположение, что активация митоКАТФ и увеличение экспрессии гена, кодирующего этот белок, играют роль в формировании устойчивости организма к кислородному голоданию [39,55,65], однако прямых доказательств этому предположению получено не было, поэтому в данной работе была поставлена цель – выяснить роль митоКАТФ в адаптации к гипоксии.


Глава 2. Материалы и методы



	2.1. Выделение белка с молекулярной массой 55 кДа  из митохондрий печени крыс

	

	В работе использовали самцов крыс линии Вистар.

	Для выделения белка проводили выделение митопластов, экстракцию белков из митопластов, отделение водорастворимых белков от нерастворимых в воде. Дальнейшее разделение водорастворимых белков осуществляли методом ионообменной хроматографии, с повторным проведением хроматографии фракций, где был обнаружен белок с Мr 55 кДа. Фракции после хроматографии проверяли с помощью SDS-электрофореза и, если было необходимо, на приборе для определения проводимости бислойных липидных мембран. Далее проводили нативный форез фракций после повторной хроматографии, в которых с помощью SDS-фореза был обнаружен белок с Мr 55 кДА и концентрирование белка методом обратного диализа с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ).

	

	2.1.1. Выделение митопластов из митохондрий печени крыс

	

	Для одного выделения обычно декапитировали 10 крыс, у которых извлекали печень. 

	Печень измельчали в специальном прессе, затем гомогенизировали в десятикратном объеме 300 мМ раствора сахарозы в 10 мМ Tris-HCl, рН 7.4 с использованием автоматического гомогенизатора при 240 об/мин.

	Далее гомогенат центрифугировали на центрифуге  К-70: 4 мин при 1200 об/мин (400g), затем 6 мин при 1500 об/мин (600g). В этих условиях осаждаются ядра и мембранные структуры. 

	Супернатант центрифугировали на РС-6 20 мин при 4800 об/мин (3500g). В этих условиях осаждается митохондриальная фракция. Осадок собирали и промывали в 300 мМ раствора сахарозы в 10 мМ Tris-HCl рН 7.4, затем ресуспендировали.

	Повторное центрифугирование проводили на РС-6 20 мин. при 4800 об/мин (3500g). Осадок собирали, мерили его объем.

	Доводили полученные митохондрии Tris-HCl (10 мМ, pH 7.4) до 500 мл.

	Оставляли при перемешивании и температуре 4°С на 30 мин. В результате  получались митопласты.

	Митопласты центрифугировали при 5500 об/мин на РС-6 (4000g) в течение 20 мин.

	Осадок объединяли. Измеряли его объем и концентрацию белка. Концентрацию белка измеряли спектрофотометрически (длина волны 750 нм) по методу Лоури (Лоури, 1965). Исходя из полученных данных, митопласты разводили бидистиллированной водой до концентрации 44 мг/мл.

	

	2.1.2. Экстрагирование белков из митопластов

	

	К полученной суспензии митопластов добавляли 9 объемов 66%-го этилового спирта. Экстракцию белков вели при перемешивании суспензии в течение 30 мин при 4°С. После экстракции суспензию центрифугировали при 5500 об/мин (4000g) в течение 15 мин.

	

	2.1.3. Отделение водорастворимых белков от нерастворимых

	

	Полученный супернатант диализовали против 5 мМ Tris-HCl pH 7.4 (c 2-меркаптоэтанолом – 0,0005%). Объем буфера составлял 2 л. Затем центрифугировали при 100000g 30 мин.

	

	2.1.4. Ионообменная хроматография на DEAE-целлюлозе

	

	Буфер «А» (Tris  50 mM,  EDTA 0.5 mM pH 7.4; 125 мкл 2-меркаптоэтанола на 250 мл буфера после доведения рН)

	Буфер «Б» (1М КСl в буфере «А»). Из него готовили ступенчатый градиент: 50, 100, 150, 200, 250, 300, 500 мМ КСl.

	Взвешивалили DEAE-целлюлозу из расчета 1 г целлюлозы на 1 мл колонки. Целлюлозу промывали три раза деионизированной водой, затем буфером «А». Наносили на колонку. Промывали буфером «А» после нанесения.

	Супернатант наносили на колонку c DEAE-целлюлозой (высота 2 см, объем 2 мл), предварительно уравновешенную буфером «А». После нанесения белков колонку промывали двойным объемом буфера «А» (Tris  50 мM,  EDTA 0.5 мM pH 7.4).

	Белки элюировали градиентом KCl: 50, 100, 150, 200, 250, 300, 500 мМ. Собирали по две фракции каждой концентрации соли. Каждая фракция по 2 мл. Полученные фракции проверяли на электрофорезе в ПААГ.

	

	2.1.5. SDS-электрофорез в ПААГ

	

	Белки разделяются по их молекулярным массам. Додецилсульфат натрия (SDS), связываясь с заряженными молекулами, компенсирует различия между зарядами белков. 

	Приготовление проб: в 30 мкл каждой фракции с DEAE-cell колонки добавляли по 15 мкл SLB.

	Приготовление SLB:

		SLB без меркаптоэтанола: 1.4 г SDS + 6 г глицерина + буфер, pH 6.8, без SDS - 7.5 мл, доводили деионизированной водой до 20 мл.

		SLB для проб: 1 мл SLB без МЭ (1); 45 мкл МЭ; 45 мкл бромфеноловый синий . 

	Приготовление маркера:

	10 мкл маркера (0.1 мг/мл) + 120 мкл SLB (1)

	Приготовление кумасси: 600 мг кумасси голубого; 200 мл 96% этанола; 40 мл ледяной уксусной кислоты растворить в 200 мл воды.

	Концентрированный буфер для форезной камеры: 7.6 г Tris-HCl + 36 г глицина доводили дистиллированной водой до 800 мл и рН 8.3-8.8. После этого в буфер добавляли 2.5 г додецилсульфата натрия.

	Рабочий буфер для форезной камеры: Разводили концентрированный буфер в 5 раз.

	Буфер для разделяющего геля: Tris-HCl 1.5 M (9.1 г на 50 мл воды доводили до рН 8.8), затем добавляли 200 мг SDS на 50 мл.

	Буфер для концентрирующего геля: Tris-HCl 0.5 М (3 г на 50 мл). После доведения рН до 6.8 добавляли 200 мг SDS на 50 мл.

	40% - бис-акриламид (60 мл): акриламид 23.34г.;  бис-акриламид 0.64г.

	Приготовление гелей: сведения представлены в таблице 2.

	

	Таблица 2. Приготовление гелей для SDS-электрофореза в ПААГ.

	Вещество

	Разделяющий 10 % (20 мл)

	Концентрирующий 5% (5 мл)

	40% бис-акриламид

	5 мл

	0,72 мл

	Буфер для геля

	5 мл

	1,6 мл

	Вода

	9,3 мл

	3,95 мл

	Персульфат аммония (1%)

	0,7 мл

	0,6 мл

	TEMED*

	10 мкл

	15 мкл

	

	П р и м е ч а н и е: TEMED вносится непосредственно перед заливанием геля.

	После полимеризации гелей пробы (в т.ч. метчик) кипятили на водяной бане в течение 5 минут и горячими наносили в карманчики геля. Маркер (рабочий) наносили в объеме 1/6 от объема проб. 

	Электрофорез проводили при силе тока 20 мА на одну пластинку. Когда пробы входили в разделяющий гель, силу тока увеличивали в 2 раза и оставляли до тех пор, пока краска не доходила до конца геля (1.5-2 часа). 

	Красили кумасси примерно 15 мин. Затем отмывали 7.5 % уксусной кислотой в течение ночи на шейкере. Если было необходимо, окрашивали серебрением (таблица 3).

	Таблица 3. Окрашивание серебрением (Silver staining, Shevchenko at al., 1996)

	

	Реагент

	Экспозиция

	50 % метанол + 10% уксусная кислота

	2*20 мин

	20% этанол

	10 мин

	Вода

	10 мин

	Тиосульфат натрия (0.2 г/л)

	1 мин

	Вода

	2*20 сек

	Нитрат серебра (2 г/л)

	30 мин

	Вода

	20 сек

	Проявитель: карбонат натрия (30 г/л); 37% формалин 1.4 мг/л; тиосульфат натрия 10 мг/л

	Пока не проявится (около 20 мин)

	1% уксусная кислота

	Минимум 20 мин

	

	Фракции, в которых при электрофорезе обнаружен белок с Mr 55 кДа, диализовали против 5 мМ Tris-HCl, pH 7.4.

	Диализат наносили на вторую колонку с DEAE-целлюлозой (высота 1 см, объем 1 мл).

	Смывали белки таким же градиентом по два объема колонки.

	Фракции после первой и второй колонки проверяли на приборе для определения проводимости бислойных липидных мембран (БЛМ).

	
2.1.6. Определение проводимости бислойных липидных мембран (БЛМ)

	

	Электрическая часть прибора для измерения проводимости бислойных липидных мембран представляет собой амперметр, измеряющий силу тока при определенной разности потенциалов между электродами. Сила тока  зависит от проницаемости (сопротивления) мембраны, разделяющей раствор электролита в кювете.  Исходя из этого, можно определить проводимость мембраны (проводимость = 1/ сопротивление).

	Проводимость билипидного слоя очень близка к нулю (10-12 пСм) при умеренном напряжении. Абсолютное значение напряжения более 150 мВ «рвет» билипидный слой.

	Проводимость отличная от нуля определяется белками, встроенными в билипидный слой. 

	Проводимость нелинейно зависит от напряжения (в случае БЛМ), поэтому определяется проводимость при различных напряжениях. 

	Подготовка кювет: до и после работы кюветы отмывали детергентами, затем 10-15 минут споласкивали в струе воды (в стакане). Промывали дистиллятом, протирали спиртом, промывали дистиллятом от спирта. Ставили сушиться. Когда кюветы высыхали, смазывали отверстие в меньшей кювете липидами снаружи и внутри и давали высохнуть. Вставляли меньшую кювету в большую. Наливали в каждую кювету по 1 мл среды.

	Среда для БЛМ: 3 M KCl; 20 мМ Tris, pH 7.4. 

	Приготовление липидов: 20 мкл общих липидов мозга и 26 мкл кардиолипина (Blight et al., 1959). Смесь близка по составу к митохондриальным липидам.

	Затем эту смесь сушили аргоном, чтобы испарился хлороформ и метанол.

	В пробирку с высушенными липидами добавляли 80 мкл н-декана, чтобы растворить липиды перемешивали.

	Работа на приборе: наливали в каждую кювету по 800 мкл буфера; вставляли два электрода в кюветы; включали приборы; наносили липиды на отверстие в меньшей кювете, используя микроскоп. Ждали, пока цветная (полислойная) мембрана станет черной (бислойной).

	В одну из кювет (обычно транс-) добавляли необходимое количество белка, а в другую (цис-) такое же количество среды для БЛМ, причем с расчетом, чтобы содержание KCl в обеих кюветах было изоосмотическим.

	В случае появления проводимости, ее регистрировали две-три минуты, затем меняли напряжение, и ингибировали проводимость АТФ.

	

	2.1.7. Нативный электрофорез

	

	При нативном электрофорезе не используются детергенты, белки разделяются как по заряду, так и по молекулярной массе. При обнаружении (возможном) не одной, а нескольких полос (загрязнение) проводится элюция с геля всех полос, затем белки идентифицируются на SDS-форезе.

	Концентрированный буфер для элюции (рН=8.8): 3г Tris на 500 мл воды; 14.4 г глицина на 500 мл воды. 

	Буфер для элюции: концентрированный буфер развести в 10 раз.

	Приготовление гелей: сведения представлены в таблице 4.

	

	Таблица 4. Приготовление гелей для нативного электрофореза.

	10% гель:

	2.5% гель:

	30% акриламид – 3.3 мл

	30% акриламид – 0.5 мл

	1% бис-акриламид  - 1.3 мл

	1% бис-акриламид – 0.5 мл

	1.5 М трис (рН=8.7) – 2.5 мл

	0.5 М трис (рН = 6.8) – 1.25 мл

	вода  - 2.73 мл

	вода – 2.67 мл

	персульфат аммония  - 0.035 мл

	персульфат аммония - 0.025 мл

	ТЕМЕД – 0.003 мл

	ТЕМЕД – 0.0025 мл

	

	Пластинки заливали рабочим буфером для фореза. Проводили префорез: 30 мА 30 мин.

	Бромфеноловый синий в кислой среде бурый, при рН 8.3 синеет. Краску наносили на гель ровным слоем и устанавливали силу тока 30 мА на 1 мин, чтобы краска вошла в гель.

	Добавляли сахарозу и глицерин для увеличения плотности раствора. В краску тоже добавляли сахарозу. 

	Когда краска входила в гель, наносили пробу ровным слоем. Устанавливали силу тока 30 мА (примерно на 3 часа).

	После этого, вырезали боковые части геля, окрасили их 30 минут бромфеноловым синим, отмывали в 7.5% уксусной кислоте. Вырезали полосу геля, соответствующую полосе белка (должна быть чуть шире, чем полоса белка), измельчали, помещали в трубку для элюции. 

	Пробирки заполняли буфером, потом заливали буфер в верхнюю камеру, чтобы покрыло пробки. В наружной камере буфер должен покрывать мембрану.

	Камеру ставили в холодильник, проводили элюцию при 8 мА (для двух трубок) 12 часов. Доэлюцию (если было необходимо) проводили при 10 мА 1 час. 

	После этого, сливали буфер из внутренней камеры во внешнюю. Из трубок пипеткой вытягивали буфер. Аккуратно снимали пробку – в ней препарат. Осторожно, чтобы не повредить мембрану, вытягивали пипеткой элюат.

	

	2.1.8. Концентрирование белка методом обратного диализа с помощью полиэтиленгликоля 

	

	Фракцию помещали в диализный мешочек (его можно ставить вертикально, тогда ПЭГ должен покрывать мешочек на 1/3). Мешочек клали в бюкс или чашку Петри и засыпали ПЭГ. 

	
2.2. Выделение митохондрий из печени крыс

	

	Среда выделения (200 мл, рН 7.4): маннитол 210 мМ; сахароза 70 мМ; HEPES (N-2-гидроксиэтилперазин–N’-этансульфоновая кислота) 10 мМ. Среду разделяли на три части. В одну 37 мг ЭДТА на 100 мл среды, в другую 45 мкл 0,1 М ЭГТА на 100 мл среды. Третью (три миллилитра) оставляли без изменений.

	Все процедуры проводили при 4 °С. Взвешенный физраствор предварительно охлаждали. Затем взвешивали вместе с печенью. Измельчали печень в прессе, затем гомогенизировали, разбавив средой с ЭДТА в девять раз.

	Центрифугировали 4 мин при 250 g, затем 6 мин при 600 g. В результате этого осаждались ядра и обрывки мембран.

	Супернатант центрифугировали 20 мин при 4500 g.

	Осадок ресуспендировали в среде с ЭГТА и центрифугировали 20 мин при 4500 g.

	Осадок ресуспендировали в среде без ЭГТА и без ЭДТА в соотношении 100 мкл среды на каждый грамм ткани и ставили в лед.

	
2.4. Выделение митохондрий из сердца крыс

	

	Среда выделения (150 мл, рН 7.4): сахароза 70 мМ; маннитол 210 мМ; хепес 10 мМ; ЭГТА 2 мМ. Среду разделяли на три части. В одну (10 мл) добавляли 1 мг протеазы (непосредственно перед выделением). В другую (70 мл) - добавляли 140 мг БСА. В третью (70 мл) ничего не добавляли.

	Все процедуры проводили при 4 °С.

	Сердце помещали в предварительно охлажденный физраствор и взвешивали. Затем клали сердце в среду с протеазой на 10 минут, измельчая сердце ножницами. Через 10 минут часть жидкости сверху сливали, чтобы удалить частички жира и связки. Далее разводили средой с альбумином в 9 раз и гомогенизировали.

	Гомогенат центрифугировали пять минут при 650g (осаждаются ядра и обрывки мембраны).

	Супернатант центрифугировали 10 мин при 8000g. 

	Осадок ресуспендировали в среде без альбумина, центрифугировали 10 минут при 8000g.

	Осадок вновь ресуспендировали в среде без альбумина из расчета 0.1 мл среды на 1г ткани сердца и ставили в лед.

	
2.5. Определение параметров транспорта К+ с помощью 

	К+ -селективного электрода

	

	Ион-селективные электроды позволяют определять концентрацию ионов в растворе, которая зависит от разности потенциалов, возникающей между электродом и электродом сравнения. 

	Среда для К+ - электрода (рН 7.2-7.4): Сахароза 150 мМ; Трис(гидроксиметил)метиламин 10 мМ; NaH2PO4 5 мМ. Использовали прибор «Record 4».

	Калибровали шкалу.

	В ячейку добавляли: 1 мл среды; модуляторы каналов, ингибиторы цепи и т. п.; митохондрии; ДНФ (5 мкл); triton x-100 (5 мкл, 10%).

	После измерений кювету промывали.

	Определяли скорость выхода ионов калия и его количество в митохондриях.

	Пересчитывали скорость выхода калия и его количество на милиграмм белка митохондрий.

	
2.6. Определение параметров дыхания с помощью кислородного электрода Кларка

	

	Среда для электрода (рН 7.4): 150 мМ сахароза; 50 мМ хлорид калия; 5 мМ дигидрофосфат натрия; 0.5 мМ хлорид магния; 10 мМ хепес. Использовали прибор «Record 4».

	Калибровку шкалы выполняли по двум точкам. «Ноль» нмоль кислорода устанавливали при добавлении дитионита натрия (несколько мкг), так как дитионит является сильным восстановителем. 250 нмоль кислорода  соответствует содержанию кислорода в среде дыхания объемом 1 мл.

	В ячейку добавляли 1 мл среды. 1 мМ Rotenon, 5 мМ сукцинат,  митохондрии, 200 мкМ АДФ, ДНФ (5 мкл).

	Программа автоматически рассчитывает скорость дыхания. 

	Скорости: до добавления АДФ, после добавления АДФ, после фосфорилирования АДФ, после добавления разобщителя измеряли на самом прямом участке. 

	Пересчитывали скорость дыхания на миллиграмм белка митохондрий. 

	
2.7. Спектрофотометрическое определение скорости 

	набухания митохондрий

	

	Потенциал-зависимый вход ионов К+ в митохондрии вызывает вход осмотически облигатной воды, что ведет к набуханию и увеличению оптической плотности.

	Среда для набухания: КCl 50 mM; NaH2PO4 5 mM; MgCl2 0.5 mM; Hepes 5 mM; EGTA 100 мкM. 

	В кювету добавляли: 5 мкМ цитохром С - 4 мкл; 1 мМ Rotenone (если в качестве субстрата сукцинат) – 10 мкл; 2 мл среды; модуляторы, активные вещества, и. т. п; митохондрии.

	Использовали метод динамического определения оптической плотности при длине волны 520 нм, установив время измерения равное трем минутам. Через полторы минуты добавляли субстрат (сукцинат или малат с глутаматом). По окончании измерения данные сохраняли в Excel и рассчитывали изменение оптической плотности  в минуту на милиграмм белка митохондрий. 


2.8. Определение устойчивости к гипоксии крыс и адаптация к ней низкоустойчивых крыс



Группу самцов линии Вистар, поместив в барокамеру и снизив давление до 22 кПа, подвергли острой гипобарической гипоксии, соответствующей подъему на высоту 11500 м. Те животные, что выдерживали гипоксию в течение 10-15 минут, считались высокоустойчивыми. Низкоустойчивые крысы выдерживали эту высоту только в течение полутора минут. Среднеустойчивых крыс в эксперимент не брали. Адаптация низкоустойчивых крыс проводилась методом интервальной нормобарической гипоксии. Для этого животные помещались в камеру с контролируемой подачей воздуха. В течение двенадцати дней животным ежедневно по пять раз в день подавался воздух с вдвое сниженной концентрацией кислорода в течение 10 минут с трехминутными перерывами, во время которых животным подавался воздух с нормальной концентрацией кислорода.


3. Результаты и обсуждение



3.1. Выделение белка с молекулярной массой 55 кДа





1      2       3       4       5        6Выделение белка с м. м. 55 кДа  из внутренней мембраны митохондрий печени  крыс проводили методом водно-этанольной экстракции [3]. Очистка белка проводилась методом ионообменной хроматографии с использованием ДЭАЭ-целлюлозы в качестве носителя. Присутствие белка во фракциях обнаруживали с помощью SDS-электрофореза в 10%-ом ПААГ (рис 3). 



                                                                                

Рисунок 3. SDS-электрофорез фракций после повторной хроматографии. На треке 1 – маркер. На треках 2,3 – белок с Мr 55 кДа (фракции с 250 мМ КСl)



Дополнительная проверка фракций проводилась на приборе для определения проводимости искусственных бислойных мембран. При встраивании белка фракции, содержащих канальную субъединицу мито-К+АТФ обнаруживалась проводимость мембран, ингибируемая АТФ (рис 4). 

Для дополнительной очистки проводили повторную хроматографию активной фракции. Для окончательной очистки белка до электрофоретически гомогенного состояния проводился нативный электрофорез активной фракции с последующей элюцией белка с геля.



Рисунок 4. К+-транспортирующая АТФ-ингибируемая активность белка с молекулярной массой 55 кДа, реконструированного в искусственную мембрану. 



Электрофоретически гомогенный АТФ-ингибируемый К+-транспортирующий белок с Mr 55 кДа  замораживали и накапливали для иммунизации. При выделении вышеописанным методом из 100 г печени крыс получали 30-70 мкг очищенного белка. Иммунизацию кроликов проводили при накоплении 0.2-0.4 мг белка. 

	
3.2. Определение параметров дыхания у крыс с различной устойчивостью к гипоксии и адаптированных к ней





Определение проводилось с помощью кислородного электрода Кларка. Определялась скорость дыхания (V3) и скорость фосфорилирования АДФ (V2) в митохондриях печени и сердца трех групп крыс. Полученные данные представлены в таблице 5.

Как видно из таблицы 5, митохондрии печени высокоустойчивых к гипоксии крыс скорости дыхания во всех метаболических состояниях, а также в присутствии разобщителя ниже по сравнению с этими скоростями у низкоустойчивых животных. Этот эффект не зависел от наличия К+ в среде 

Среда

Группы

крыс

V2,  нмоль О2/мин*мг белка

V3,  нмоль О2/мин*мг белка

V4,  нмоль О2/мин*мг белка

VДНФ, нмоль О2/мин*мг белка

ДК

С ионами К+

ВУ

8.38±1.14

87.9±3.54

23.24±2.88

179.5±4.88

3.78±0.12



НУ

14.54±1.68

110.76±4.95

32.9±3.25

181.0±4.27

3.36±0.33



А

11.46±1.32

68.03±4.76

24.7±2.65

94.4±4.12

2.75±0.21

Без ионов К+

ВУ

8.46±0.93

35.01±3.87

11.61±2.54

112±5.21

3.1±0.26



НУ

14.6±2.05

64.01±3.24

26.58±3.44

166.78±5.8

2.4±0.19



А

8.76±1.39

45.95±4.77

19.92±1.76

79.55±4.22

2.3±0.14

Таблица 5. Скорость дыхания в митохондриях печени крыс с различной устойчивостью и адаптированных к гипоксии с использованием двух сред и сукцината в качестве дыхательного субстрата. 

инкубации митохондрий. Адаптация к гипоксии низкоустойчивых животных ведет также к снижению всех скоростей, однако, в присутствии ионов калия,

эти скорости дыхания снижаются не столь значительно. Последнее может указывать на активацию транспорта ионов К+ в митохондриях при адаптации животных к гипоксии. Следует отметить, что эти эффекты больше проявляются по отношению к скорости дыхания в присутствии субстрата (V2, V4) по сравнению со скоростью АДФ-стимулируемого дыхания (V3). Это может быть связано с увеличением концентрации АТФ в митохондриях после фосфорилирования добавленного АДФ. Как известно, АТФ ингибирует вход катионов К+ в митохондрии.

Обнаружено также, что у адаптированных к гипоксии животных дыхательный контроль в среде с ионами К+ снижен по сравнению с этим показателем у низкоустойчивых к гипоксии животных. Это снижение наблюдается только в среде, содержащей катионы К+, что может указывать на активацию энергозависимых процессов в митохондриях.

Совокупность полученных данных указывает на то, что 1) адаптация к гипоксии ведет к ингибированию работы фосфорилирующей дыхательной цепи, независимо от присутствия или отсутствия ионов К+ в среде, вероятно, за счет активации гликолиза и 2) адаптация ведет также к активации знергозависимого входа К+ в митохондрии.

Для подтверждения полученных данных у этих же животных  были определены параметры АТФ-зависимого транспорта ионов К+ в митохондриях, а также количество катионов К+ в них. 

		
3.3. Изучение параметров АТФ-зависимого транспорта 

		ионов калия в митохондриях

	

	

	Исследование параметров проводилось на двух моделях:

	А) Модель энергозависимого набухания митохондрий. 

Увеличение концентрации ионов К+ матриксе провоцирует осмотически облигатное поступление воды и, следовательно, набухание митохондрий. Изменение объема митохондрий влияет на их оптическую плотность. Следовательно, активность канала можно определить методом динамической спектрофотометрии. 

Скорость энергозависимого входа ионов К+ определялась у крыс с различной устойчивостью, а также адаптированных  к гипоксии крыс. Данные представлены в таблице 6.

Из полученных данных следует, что скорость энергозависимого транспорта К+ значительно выше у высокоустойчивых и адаптированных к гипоксии крыс по сравнению с низкоустойчивыми животными. 



Субстрат

Показатель

НУ

А

ВУ

Сукцинат

Скорость, D/мин*мг белка МХ

0.452+0.074

0.566+0.146

0.626+0.122

Малат + глутамат

Скорость, D/мин*мг белка МХ



0.339+0.032



0.548+0.038



0.537+0.156

Таблица 6. Энергозависимый вход калия в митохондрии  печени животных с различной устойчивостью к гипоксии, а также адаптированных к гипоксии животных. 

	Б) Модель энергозависимого набухания митохондрий. 

При сильном разобщении митоК+АТФ способен опосредовать выход ионов К+ из матрикса, то есть обращать свою работу, наблюдаемую в физиологических условиях. Показано, что эта активность ингибируется АТФ, что доказывает специфичность выхода ионов К+ в данной модели именно через этот канал. 

Скорость выхода катионов К+ определялась у всех групп крыс. 

Данные полученные на модели ДНФ-индуцируемого выхода ионов  К согласуются с данными, полученными на модели энергозависимого набухания митохондрий. То есть, указывают на изначально большую активность канала у высокоустойчивых крыс и повышение активности канала при адаптации. Данные представлены в таблице 7.



Таблица 7. Скорость ДНФ-индуцируемого выхода К+ из митохондрий печени животных с различной устойчивостью к гипоксии, а также адаптированных к гипоксии животных. 

Животные 

Скорость, мкМ / мин*мг белка митохондрий

Скорость после добавления 800 мкМ АТФ, мкМ / мин*мг белка

А

73.256±3.54

3,782±3.211

ВУ

70,02±3.76

6,18±3.742

НУ

42,309±3.86

3,537±2.349

	

	
3.4. Определение количества ионов К+ в митохондриях 

	различных групп крыс



Количество калия измеряется К-селективным электродом после добавления в среду тритона Х-100. Полученные данные представлены в таблице 8.



Таблица 8. Количество ионов калия в митохондриях печени животных с различной устойчивостью к гипоксии, а также адаптированных к гипоксии животных. 

Животные

Количество К+, мкМ / мг суммарного белка митохондрий

А

73,85±3.654

ВУ

112,29±3.322

НУ

63,37±3.782



Исследования показали, что концентрация калия в МХ высокоустойчивых и адаптированных крыс ниже, чем у низкоустойчивых животных. Полученные данные указывают, что адаптация ведет не только к активации митохондриального АТФ-чувствительного калиевого канала, но и системы выброса калия из митохондрий, осуществляемого, обычно, К+/Н+-обменником. Таким образом, при адаптации активируется калиевый цикл в митохондриях.

Известно, что активация калиевого цикла, способствует слабому разобщению митохондрий, которое ведет к снижению мембранного потенциала. Согласно данным, обсуждаемым в обзоре, незначительное снижение мембранного потенциала ведет к существенному уменьшению продукции супероксиданиона [34]. Таким образом, митоК+АТФ участвует в регуляции образования АФК в митохондриях. 

Недавно был обнаружен эффективный природный метаболический активатор митоКАТФ – уридин-5’-дифосфат (УДФ) [42]. Показано, что УДФ, а также УМФ и уридин обладают кардиопротекторными свойствами [9,40]. Использование метаболического активатора канала в качестве лекарственного средства будет иметь ряд преимуществ, по сравнению с их синтетическими аналогами, поскольку их концентрацию в клетке можно регулировать, и они не обладают побочными эффектами, присущими лекарственным препаратам.


Выводы



		Выделен белок с молекулярной массой 55 кДа, являющийся канальной субъединицей митоКАТФ, изучены его некоторые физико-химические свойства.

		При адаптации к гипоксии уменьшается скорость дыхания и окислительного фосфорилирования в митохондриях, независимо от присутствия или отсутствия К+ в среде.

		Показано, что скорость как ДНФ-индуцированного выхода, так и энергозависимого входа ионов К+ в митохондрии выше у высокоустойчивых крыс по сравнению с низкоустойчивыми и повышается при адаптации.

		Количество ионов К+ в митохондриях у высокоустойчивых ниже, а у адаптированных существенно ниже, чем у низкоустойчивых.

								
Список литературы

								

Лукьянова Л. Функционально-метаболические особенности животных с различной индивидуально резистентностью к гипоксии. // Проблемы гипоксии: молекулярные, физиологические и медицинские аспекты. - 2004, с. 156-170

Миронова Г., Маслова Т., Федотчева Н., Миронов Г. Эволюционные аспекты гипобиоза и зимней спячки. - Л., Наука; 1986; 64-68.

Миронова Г., Скарга Ю., Григорьев С. и др. АТР-зависимый калиевый канал митохондрий печени крысы. I. Выделение, очистка и реконструкция канала в БЛМ.// Биологические мембраны -1996; Т.13, № 4: 396-404.

Миронова Г., Федотчева Н., Макаров П., Проневич Л., Миронов Г.П. Белок из митохондрий сердца быка, индуцирующий канальную калиевую проводимость бислойных липидных мембран. // Биофизика, 1981 - 26(3): 451-457.

Сазонтова Т.Г., Архипенко Ю.В. Роль свободнорадикальных процессов в адаптации организма к изменению уровня кислорода// Проблемы гипоксии, 2004 – С. 112-138.

Скарга Ю.Ю., Долгачёва Л.П., Федотчева Н.И, Миронова Г. Влияние антител к митохондриальному К+-транспортирующему белку на транспорт К+ в митохондриях печени крысы. // Укр. Биохим. Журнал - 1987 - 59(6): 54-59.

Aguilar-Bryan L., Nichols C., Wechsler J. et al. Cloning of the beta cell high-affinity sulfonylurea receptor: a regulator of insulin secretion.// Science – 1995 - 268: 423-426.

Alekseev A.E., Brady P.A., Terzic A. Ligand-insensitive state of cardiac ATP-sensitive K+ channels. Basis for channel opening. //J. Gen. Physiol., 1998 - 111: 381-394.

Aussedat J, Ray A, and Rossi A. Uridine Incorporation in normal and ischaemic perfused rat heart.// Mol. Physiol, 1984 - 6: 247-56.

Bajgar R., Seetharaman S., Kowaltowski A.J., Garlid K.D., Paucek P. Identification and properties of a novel intracellular (mitochondrial) ATP-sensitive potassium channel in brain. //J. Biol. Chem. -2001 - 276: 33369-33374.

Beckman K., Ames B. Mitochondrial aging: open questions.// Ann. NY Acad.Sci. - 1998  - V 854. p 118-128.

Bednarczyk P., Dolovy K., Szewczyk A. Matrix Mg2+ regulates mitochondrial ATP-dependent potassium channel from heart.// FEBS.,  2005 - 579: 1625-1632.

Bhattacharyya D. Purification and functional characterization of a low-molecular-mass Ca2+,Mg2+- and Ca2+-ATPase modulator protein from rat brain cytosol// Biochem. J – 1998 vol 330 p 95- 101

Chaves E., Yung D., Brierley G. Energy-dependent exchange of K+ in heart mitochondria, K+ efflux. Arch. Bioch. //Biophys. 1977 - 183: 460-470.

Dahlem Y., Horn T., Butinas L., Gonoi T., Wolf T., Siemen D. The human mitochondrial KATP channel is modulated by calcium and nitric oxide: a patch-clamp approach.// Biochеm. Biophys. Acta., 2004 - 1656: 46-56.

D’Hahan N., Moreau C., Prost A., Jacquet H., Alekseev A., Terzic A., Vivaudou M. Pharmacological plasticity of cardiac ATP-sensitive potassium channels toward diazoxide revealed by ADP. // Proc Natl Acad Sci U S A, 1999 - 96: 11962–11967.

Diwan J.J., Haley T., Sanadi D.R. Reconstitution of K+ transport with 53 kDa mitochondrial protein.// Biochem Biophys Res Commun., 1988 - 153: 224–230.

Fedotcheva N.I., Sharichev A.A., Mironova G.D., Kondrasheva M.N. Inhibition of succinate oxidation and K+ transport in mitochondria during hibernation. Comp.// Biochem. Physiol, 1985 -  82B: 191-195.

Ferranti R., Da Silva M., Kowaltowski A. Mitochondrial ATP-sensitive K+ channel opening decreases reactive oxygen species generation. // FEBS Lett., 2003 - 536(1-3): 51-5.

Fikret E., Guido M., Gassanov N. et al. Testosterone induces cytoprotection by activating ATP-sensitive K+ channel in the cardiac mitochondrial inner membrane.// Circulation, 2004 - 110(19): 3100-3107.

Flohe L. et al. Redox regulation of NF-kappa B activation//Free rad biol med –1997 – vol 22 – p 1115 –1126.

Forbes R.A., Steenberger C., Murphy E. Diazoxide-induced cardioprotection requires signaling through a redox-sensitive mechanism.// Circ. Res. – 2001 -  88: 802-809.

Garlid K.D., Paucek P., Yarov-Yarovoy V. et al. Cardioprotective effect of diazoxide and its interaction with mitochondrial ATP-sensitive K+ channels: possible mechanism of cardioprotection.// Circ. Res.- 1997 - 81: 1072-1082.

Garlid K. Unmasking the mitochondrial K/H exchanger: tetraethylammonium-induced K+ loss.// Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1979 - 87(3): 842-7.

Garlid K.D., Beavis A.D. Evidence for the existence of an inner membrane anion channel in mitochondria.// Biochеm. Biophys. Acta – 1986 - 273: 13578-13582.

Garlid K. Peter Mitchell, 1920-1992.// J Bioenerg. Biomembr.- 1992 - 24(5): 515-6.

Garlid K.D., Paucek P. The mitochondrial potassium cycle.// IUBMB Life.-2001- 52: 153-158.

Graven, K. K., L. H. Zimmerman, E. W. Dickson, G. L. Weinhouse, and H. W. Farber. Endothelial cell hypoxia associated proteins are cell and stress specific.// J. Cell. Physiol.- 1993 - 157: р. 544-554

Grigoriev S., Skarga Y.Y., Mironova G.D., Marinov B.S. Regulation of mitochondrial KATP channel by redox agents.// Biochim. Biophys. Acta., 1999 - 1410(1): 91-96.

Grover G., Garlid K. ATP-sensitive potassium channels: a review of their cardioprotective pharmacology.// J.Mol.Cell Cardiol., 2000 - 32: 677-695.

Inoue I., Nagase H., Kishi K. & Higuti T. ATP-sensitive K+ channel in the mitochondrial inner membrane.// Nature - 1991 - 352: 244-247.

Kaplan-Bresler A. Metmyoglobin oxidation during electro transport reactions in mitochondria. // J.Gen.Physiol. -  1965 - 48: 685-98.

Kondrashova M., Mironova G. Oxygen requirements for ADP phosphorylation under conditions of cyanide block.// Biokhimia, 1971 - 36(4): 864-865.

Korshunov S., Skulachev V., Starkov A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria.// FEBS Letters 416  - 1997 – р. 15-18.

Krenz M., Oldenburg O., Wimpee H. et al. Opening of ATP-sensitive potassium channels causes generation of free radicals in vascular smooth muscle cells.// Basic Res. Cardiol. – 2002 -  97: 365-373.

Lacza Z., Snipes J., Kis B., Szabo C., Grover G., Busija D. Investigation of the subunit composition and the pharmacology of the mitochondrial ATP-dependent K+ channel in the brain.// Brain Res. – 2003 - 994: 27-36.

Li X.Q., Hegazy M.G., Mahdi F. et al. Purification of f reconstitutively active K+/H+ antiporter from rat liver mitochondria.// J. Biol. Chem. -  1990 - 265: 15361-15322.

Liaudet L., Soriano F., Szabo C. Biology of nitric oxide signaling. // Crit.Care Med – 2000 - 28: N37-N52.

Lu Ch., Halvorsen S. Channel activators regulate ATP-sensitive potassium channel (KIR6.1) expression in chick cardiomyocytes.// FEBS Lett. – 1997 - 412: 119-125.

Matsushita S, Fanburg B. Pyrimidine nucleotide synthesis in the normal and hypertrophying rat heart. Relative importance of the de novo and “salvage” pathways.// Circ. Res. – 1970 -  27: 415-28.

Maulic N., Goswami S., Galang N., Das D. Differential regulation of Bcl-2, AP-1 and NF-kappaB on cardiomyocyte apoptosis during myocardial ischemic stress adaptation.//FEBS Lett. – 1999 – vol. 443 p. 331-336

Mironova G., Negoda A., Marinov B., Paucek P., Costa A., Grigoriev S., Skarga Yu., Garlid K. Functional distinctions between the mitochondrial ATP-dependent K+ channel (mito KATP) and its inward rectifier subunit (mitoKIR).// JBC - 2004 - 279(31): 32562-32568. 

Mironova G.D., Skarga Yu.Yu., Grigoriev S.M., Negoda A.E., Kolomytkin O.V., Marinov B.S. Reconstitution of the mitochondrial ATP-dependent potassium channel into bilayer lipid membrane.// J. Bioenerg. Biomembr. – 1999 - 31(2): 157-161.

Mitchel P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemiosmotic type of mechanism.// Nature – 1961- 191: 144-148.

Nakae Y., Kwok W.M., Bosnjak Z.J., Jiang M.T. Isoflurane activates rat mitochondrial ATP-sensitive K+ channels reconstituted in lipid bilayers.// J. Physiol. Heart Circ. Physiol. – 2003 - 284: 1865-1871.

Noma А. ATP-regulated K+ channels in cardiac muscle.// Nature – 1983 - 305: 147-148.

Notsu T., Ohhashi K., Tanaka I., Ishikawa H., Niho T., Fukutake K., Mizota M. 5-Hydroxydecanoate inhibits ATP-sensitive K+ channel currents in guinea-pig single ventricular myocytes.// Eur. J. Pharmacol.- 1992 - 220: 35 - 41.

Ohnishi S.T., Ohnishi T., Muranaka S. et al. A possible site of superoxide generation in the complex I segment of rat heart mitochondria.// J. Bioenerg. Biomembr. – 2005 - 37 (1): 1-15.

Ohno-Shasaku T., Kubota T., Yamaguchi J. et al.  Reciprocal effects on Ca2+ and Mg-ATP on the “run-down” of the K+ channels in the opossum kidney cells.// Pflugers Arch.- 1989 - 413: 562-564.

Oldenburg O., Cohen M.F., Downey J.M. Mitochondrial KATP channels in preconditioning.// J Mol. Cell. Cardiol. – 2003 - 35: 569-575.

O’Rourke B. Evidence for mitochondrial K+ channels and their role in cardioprotection.// Circ.Res. – 2004 - 94: 420-432.

Paradies G., Petrosillo D., Pistolese M. et al. Decrease in mitochondrial complex I activity in ischemic/reperfused rat heart: involvement of reactive oxygen species and cardiolipin.// Circ. Res. – 2004 - 94: 53-59.

Paucek P., Mironova G., Mahdi F., Beavis F., Woldegiorgis G., Garlid K.D. Reconstruction and partial purification of the glibenclamide-sensitive, ATP-sensitive K+ channel from rat liver and beef heart mitochondria.// J. Biol. Chem.- 1992. -  267(36): 26062-26069.

Raha S., Robinson B. Mitochondria oxygen free radicals and apoptosis// American Journal of Medical genetics - 2001- V.106 p. 62-70.

Rajesh K., Sasaguri S., Zhitian Z. et al. Second window of ischemic preconditioning regulates mitochondrial permeability transition pore by enhancing Bcl-2 expression.// Cardiovasc. Res. – 2003 -  59: 297-307.

Rottenberg H., Solomon A.K. Energy linked K+ uptake in mitochondria.// Biochem. Biophys Res. – 1965 - 20: 85-92.

Sasaki N., Sato T., Ohler A., O’Rourke B., Marban E. Activation of mitochondrial ATP-dependent potassium channels by nitric oxide.// Circulation – 2000 - 101: 439-445.

Sato T, Sasaki N, O’Rourke B, Marbán E. Nicorandil, a potent cardioprotective agent, acts by opening mitochondrial ATP-dependent potassium channel.// J. Am. Coll. Cardiol. – 2000 - 35: 514–518.

Schild L.R.T., Reiser M., Horn T.F., Wolf G. et al. Nitric oxide produced in rat liver mitochondria causes oxidative stress and impairment of respiration after transient hypoxia.// FASEB J. – 2003 - 17: 2194-2201.

Sheffer I. A century of mitochondrial research: achievements and perspectives// Mitochondrion – 2001 – V. 1 N.1 p. 3-31.

Tsai C., Su S., Chou T., Lee T. Differential effects of sarcolemmal and mitochondrial KATP channels activated by 17-estradiol on reperfusion arrhythmias and infarct sizes in canine hearts.// J. Pharmacol. Exper. Therap. – 2002 - 301: 234-240.

Tucker S.J., Gribble F.M., Zhao C., Trapp S. and Ashcroft F.M. Truncation of Kir6.2 produces ATP-sensitive K+ channels in the absence of the sulphonylurea receptor.// Nature – 1997 – 387, p. 179-183.

Ungemach F.R. Free radicals liver injury.// Proc. Int. Meet., (Turin, June 27-29, 1985) - Oxford, Washington DC, - 1985. – P 127-134

Zhang D., Chen Y., Campbell W., Zou A., Gross G., Li P. Characteristics and suproxide-induced activation of reconstituted myocardial mitochondrial ATP-sensitive potassium channel.// Circ. Res. – 2001 - 89: 1177-1173.

Zhu H., Dong J., Zhu W., Ding H., Zhou Z. ATP-dependent potassium channels involved in cardiac protection induced by intermittent hypoxia against ischemia/reperfusion injury. // Life Sci. – 2003 - 73: 1275-1287.