Генетическая инженерия и биотехнология

Генетическая инженерия и биотехнология 

Вертьянов С. Ю. 

Генетическая инженерия (ГИ) — совокупность методов, позволяющих искусственно переносить генетическую информацию из одного организма в другой с помощью специально созданных генетических конструкций. Одна из задач ГИ — получение организмов с желаемыми свойствами. Основным подходом ГИ является конструирование in vitro (вне организма) рекомбинантных молекул ДНК (искусственно скомбинированных из фрагментов) с заданными наследственными свойствами, поэтому ГИ также называют технологией рекомбинантных ДНК. Организмы, в которые с помощью методов ГИ введены несвойственные им гены, носят название трансгенных.

Основные принципы ГИ

Бурное развитие ГИ началось после 1970 г., когда из клеток бактерий научились выделять рестриктазы — ферменты, защищающие бактерии от бактериофагов. Узнавая в чужеродной ДНК специфичный для каждой рестриктазы сайт (последовательность из 4—6 нуклеотидов), рестриктазы делают в этом сайте разрывы обеих цепей ДНК. В результате чужеродная ДНК оказывается разрезанной на фрагменты и нефункциональной. На сегодня известно около 3500 рестриктаз. Например, рестриктаза Eco RI ("еко-эр-один") из кишечной палочки (Escherichia coli) узнает сайт ГААТТЦ:

В результате ступенчатого разреза образуются фрагменты ДНК с выступающими однонитевыми концами, комплементарными друг другу. Эти концы могут вновь соединяться, поэтому их называют "липкими концами". Если взять ДНК, например, человека и моркови, обработать одной и той же рестриктазой и смешать, то фрагменты ДНК моркови и человека будут соединяться липкими концами. Но такая связь будет непрочной: водородные связи между всего лишь четырьмя парами оснований могут легко разойтись. Слипшиеся фрагменты ДНК можно зафиксировать, если добавить в раствор ДНК-лигазу (второй по значимости фермент ГИ), сшивающую цепи ДНК, разрезанные рестриктазой. В результате получится стабильная рекомбинантная ДНК.

Далее необходимо сохранить и размножить полученные рекомбинантные молекулы. С этой целью их встраивают в специальные конструкции, называемые векторными молекулами ДНК, или векторами. Обычно векторы конструируют из бактериальных плазмид. Типичный вектор включает:

1. Сайт узнавания определенной рестриктазой для встраивания в вектор целевой ДНК.

2. Ген устойчивости к одному из антибиотиков для последующего отбора клеток, получивших рекомбинантный вектор.

3. Промотор, обеспечивающий экспрессию целевой ДНК.

Приведем пример использования вектора для получения штамма кишечной палочки, продуцирующей целевой белок. Для встраивания в вектор смесь фрагментов целевой ДНК (с геном, кодирующим целевой белок) и ДНК вектора обрабатывают сначала одной и той же рестриктазой, затем ДНК-лигазой. В результате образуется рекомбинантный вектор. Для размножения его вводят в клетки кишечной палочки или дрожжей. На поверхности твердой питательной среды с антибиотиком каждая клетка, несущая рекомбинантный вектор, размножается и образует колонию из одинаковых клеток — клон. Каждая клетка-родоначальница клона получила одну молекулу рекомбинантного вектора, которая реплицируется и передается всем клеткам колонии. Поэтому такую процедуру называют молекулярным клонированием.

Первой реакцией научной общественности на создание ГИ-технологии было введение ограничений на эксперименты с рекомбинантными ДНК. Ученые полагали, что объединение генов разных организмов может привести к появлению нового организма с нежелательными или даже опасными свойствами. Прошло несколько лет, и исследователи убедились, что их опасения сильно преувеличены. Микроорганизмы, измененные с помощью генно-инженерных манипуляций, во внешней среде не выдерживают конкуренции, поскольку значительную часть своих ресурсов они затрачивают на синтез целевого белка, в ущерб собственной конкурентоспособности.

Достижения ГИ

С развитием ГИ ученые получили возможность синтезировать, выделять, комбинировать и перемещать гены и любые другие фрагменты ДНК. ГИ внесла революционный вклад в развитие многих биологических дисциплин: молекулярной биологии, микробиологии, вирусологии, цитологии, эмбриологии, медицинской генетики и генетики человека. Появилась ранее недоступная возможность изучения молекулярной организации геномов (в том числе высших эукариот), что привело к возникновению геномики — раздела генетики, изучающего структурную организацию и функционирование геномов.

ГИ-методы позволили реализовать программы секвенирования (определения полных нуклеотидных последовательностей ДНК) геномов многих организмов. Уже секвенированы ДНК сотен видов бактерий, дрожжей, плазмодия, риса, кукурузы, картофеля, дрозофилы, мыши; завершена международная программа "Геном человека".

Для чего же нужно секвенирование геномов? Одна из основных задач — выяснить строение генома и его работу как единого целого. Полная нуклеотидная последовательность — это предварительная карта генома организма. В первоначальном виде это просто длинная последовательность нуклеотидов, ни о чем не говорящая. Для того чтобы с ней можно было работать, в ней выявляют гены, регуляторные элементы, мобильные элементы и другие последовательности ДНК, функция которых еще не известна. Для медицинской генетики важно нанести на нуклеотидную карту гены, ответственные за различные болезни, чтобы разрабатывать методы молекулярной диагностики, искать способы лечения и предотвращения заболеваний. На карту человека уже нанесены многие гены наследственных заболеваний.

Генная терапия наследственных заболеваний человека. Развитие этой перспективной области стало возможным после секвенирования генома человека. Генная терапия включает следующие этапы:

1. Получение клеток от больного (в генной терапии разрешено использовать только соматические клетки человека).

2. Введение в клетки лечебного гена для исправления генетического дефекта.

3. Отбор и размножение "исправленных" клеток.

4. Введение "исправленных" клеток в организм пациента.

Впервые успешно применить генную терапию удалось в 1990 г. Четырехлетней девочке, страдающей тяжелым иммунодефицитом (дефект фермента аденозиндезаминазы), были введены собственные лимфоциты со встроенным нормальным геном аденозиндезаминазы. Лечебный эффект сохранялся в течение нескольких месяцев, после чего процедуру пришлось регулярно повторять, поскольку исправленные клетки, как и другие клетки организма, имеют ограниченный срок жизни. В настоящее время генную терапию используют для лечения более десятка наследственных заболеваний, в т. ч. гемофилии, талассемии, муковисцидоза.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Для получения целевой ДНК в достаточных для работы количествах в ГИ широко используется метод ПЦР, разработанный в 1985 г. Метод позволяет размножить в миллионы раз любой участок ДНК размером до 5 тысяч пар нуклеотидов (см. с. 142). Первым практическим использованием ПЦР была разработка тест-системы для диагностики серповидноклеточной анемии (нарушенные участки ДНК размножали до обнаружимых при электрофорезе количеств). С помощью ПЦР получают фрагменты ДНК для клонирования, секвенируют целевые ДНК, выявляют патогенные вирусы или бактерии, а также наследственные заболевания и аномалии. В судебной медицине ПЦР используют для идентификации личности, для установления родственных связей. В настоящее время метод ПЦР стал обыденной процедурой, повседневно используемой в тысячах лабораторий.

Таким образом, разработка методов ГИ и ПЦР привела к бурному прогрессу в биологии, но самые глубокие преобразования произошли в биотехнологии.

Биотехнология — отрасль науки, занимающаяся промышленным использованием биологических процессов и живых организмов для производства лекарств и вакцин, сельскохозяйственных и потребительских продуктов.

Биотехнологические процессы люди использовали издревле, занимаясь хлебопечением, виноделием, пивоварением, приготовлением кисломолочных продуктов. Сущность этих процессов была выявлена лишь в XIX в. после научных открытий Л. Пастера. Работы ученого послужили развитию различных производств с использованием микроорганизмов.

В конце 1970-х гг. на стыке традиционной биотехнологии и ГИ возникла молекулярная биотехнология. В ее основе лежит процедура переноса генов из одного организма в другой посредством методов ГИ с целью создания принципиально нового продукта или промышленного производства уже известного продукта. Первая фирма, производящая лекарственные соединения с помощью методов ГИ, была создана в 1976 году.

Производство лекарственных препаратов

Микроорганизмы после введения соответствующих генов становятся продуцентами ценных для медицины белков. В биореакторах на специальных питательных средах выращивают бактерии; грибы; дрожжи, продуцирующие антибиотики; ферменты; гормоны; витамины и другие биологически активные соединения. Например, клетки кишечной палочки служат биологическими фабриками по производству человеческого инсулина. До 1982 г. инсулин получали весьма трудоемким способом из поджелудочной железы свиней и обеспечивали только 10 % больных сахарным диабетом. С 1982 г. этой работой "занимается" кишечная палочка и обеспечивает инсулином десятки миллионов больных по всему свету (в том числе и тех, у кого аллергия на животный инсулин). Кишечная палочка производит человеческий гормон роста соматотропин (ранее его получали из трупного материала).

Противовирусный препарат интерферон в организме человека вырабатывается в крайне незначительных количествах. После выявления аминокислотной последовательности интерферона ген был искусственно синтезирован и встроен в вектор, затем вектор ввели в клетки бактерии и получили штамм-продуцент интерферона.

Производство генно-инженерных вакцин

Традиционные вакцины изготавливаются из вирусов, инактивированных нагреванием или химическим воздействием. Иногда вирус остается жизнеспособным и может при вакцинации вызвать заболевание. Применение ГИ-вакцин не имеет такого недостатка. Например, создан продуцент белка поверхностной капсулы вируса гепатита. Этот белок достаточен для выработки в организме человека иммунитета против вируса гепатита, и такая вакцинация не в вызовет инфекцию. В настоящее время активно ведутся генно-инженерные разработки вакцины против СПИДа.

Производство ГИ-микроорганизмов, способных расти на несвойственных для них средах, открывает ряд новых возможностей. Такие микроорганизмы используют для биологической очистки окружающей среды (в т.ч. от нефти и нефтепродуктов). На отходах производства нефтепродуктов, гидролизатах древесины, на метаноле, этаноле, метане успешно культивируют дрожжи. Использование их в качестве кормового белка (дрожжи содержат до 60 % белка) позволяет получать дополнительно до 1 млн т мяса в год. Ведутся работы по созданию микроорганизмов, производящих ацетон, спирт и другие горючие материалы на отходах сельского хозяйства, лесной и деревообрабатывающей промышленности, а также на сточных водах. В будущем, при истощении ресурсов нефти, этот путь получения горючих веществ может оказаться весьма актуальным. Созданы установки, в которых бактерии перерабатывают навоз в биогаз. Из 1 т навоза получают 500 м3 биогаза, что эквивалентно 350 л бензина.

Биотехнология растений

Получены формы растений с ускоренным ростом, большей массой плодов, увеличенной продолжительностью хранения плодов; устойчивые к гербицидам, к патогенным вирусам и грибам, к вредным насекомым, а также к засухе и засоленности почв. Растения продуцируют для человека вакцины, фармакологические белки и антитела. Например, внедрение гена биосинтеза каротина в геном риса позволило вывести "золотой" рис, богатый этим ценным для человека провитамином.

В природе существует бактерия Bacillus thuringiensis, вырабатывающая эндотоксин белковой природы, действующий на насекомых. Ген, кодирующий этот токсин, был выделен и встроен в ДНК картофеля. Такой картофель личинки колорадского жука в пищу употреблять не могут. Аналогичным образом удалось получить устойчивые к сельскохозяйственным вредителям трансгенные формы хлопка, кукурузы, томатов и рапса. После внедрения в геном винограда гена морозоустойчивости от дикорастущей капусты брокколи трансгенный виноград стал морозоустойчивым. Эта процедура заняла всего год. Обычно на выведение новых сортов винограда уходит 25—35 лет.

Существенные посевные площади заняты под трансгенные растения в США (68 % мировых посевов трансгенных культур), Аргентине (22 %), Канаде (6 %) и Китае (3 %). В основном выращивают трансгенную сою (62 %), кукурузу (24 %), хлопок (9 %) и рапс (4 %).

Большое значение в сельском хозяйстве имеет производство незаменимых аминокислот, не синтезирующихся в организмах животных. В традиционных кормах их недостаточно, поэтому приходится увеличивать количество пищи. Добавление в пищу 1 т синтезированной микробиологическим путем аминокислоты лизин экономит десятки тонн кормов.

Биотехнология животных

Получение трансгенных животных начинают с создания генетических конструкций, в которых целевой ген находится под контролем промотора, активного в определенной ткани организма, например в клетках молочной железы. Такую конструкцию вводят в оплодотворенную яйцеклетку и помещают животным для вынашивания. Выход здоровых животных пока невелик (менее 1 % эмбрионов), но ученые продолжают исследования. Получены трансгенные коровы, овцы, козы, свиньи, птицы, рыбы.

От 20 трансгенных коров можно получить до 100 кг целевого белка в год. Именно столько белка, применяемого для предотвращения тромбов в кровеносных сосудах, требуется человечеству ежегодно. Для получения необходимого людям белка-фактора свертывания крови (его применяют для повышения свертываемости крови у больных гемофилией) достаточно одной трансгенной коровы.

Актуально создание пород домашних животных, устойчивых к паразитам, бактериальным и вирусным инфекциям. Встраивая гены устойчивости к наиболее распространенным заболеваниям, можно значительно сэкономить на вакцинах и сыворотках (до 20 % от стоимости конечного продукта).

Трансгенных млекопитающих используют в качестве модельных систем для поиска способов лечения наследственных заболеваний человека. На мышах отрабатывают методы борьбы со СПИДом, муковисцидозом, болезнью Альтцгеймера, на кроликах — с онкологическими заболеваниями.

Выводы

В результате применения биотехнологии появились бактерии, растения, животные, которые являются естественными биореакторами. Они продуцируют новые или измененные генные продукты, которые не могут быть созданы традиционными методами скрещивания, мутагенеза и селекции. Кроме того, молекулярная биотехнология дает принципиально новые методы диагностики и лечения различных заболеваний. Однако в ряде случаев рекламируемые перспективы оказываются преувеличенными и не всегда соответствуют реальным возможностям биотехнологии.

Сорта, полученные методами классической селекции, менее впечатляющи, но имеют свои достоинства, они более устойчивы и надежны в использовании. Если классическая селекция остается в естественных природных рамках, то современные технологии, оперируя на уровне клеток, хромосом и отдельных генов, выходят за пределы природных закономерностей. Эти методы используют природные компоненты (клетки, гены и т. д.), но комбинируют их произвольно. Возможные побочные эффекты во многих случаях трудно предсказуемы. Необходимы длительные эксперименты на животных и растениях и серьезные исследования. Известно негативное отношение СМИ и широких слоев общественности в разных странах к продукции молекулярной биотехнологии — генно-модифицированным (ГМ) продуктам. Вместе с тем становится все более понятным, что использование методов ГИ — один из возможных путей обеспечения продуктами питания стремительно возрастающего населения планеты. Для определения возможных границ использования методов ГИ важно разобраться и в нравственных аспектах вторжения человека в мир Божий.