Використання олійних рослин для оцінки токсичності нафтозабрудненого ґрунту

Дипломна робота

На тему:

Використання олійних рослин для оцінки токсичності нафтозабрудненого ґрунту




ЗМІСТ



ВСТУП 

1.ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ  

1.1 Проблема нафтового забруднення ґрунту 

1.2 Якість ґрунту як складова стійкості екосистеми

1.3 Оцінка якості ґрунту за допомогою тест-систем 

2. ОБ’ЄКТИ, МЕТОДИ ТА УМОВИ ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕНЬ

2.1 Об’єкт дослідження та його характеристика

2.2 Підготовка матеріалу для дослідження

2.3 Методи досліджень 

2.3.1 Визначення фітотоксичності ґрунту

2.3.2 Визначення тест-показників льону звичайного

2.4 Статистично-математичне опрацювання результатів

3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

3.1 Залежність процесу проростання насіння льону звичайного (Linum usitatissimum L.) від концентрації нафти у ґрунті 

3.2 Морфометричні параметри проростків Linum usitatissimum L. як тест-реакції на дію нафтового забруднення ґрунту 

ВИСНОВКИ

ЛІТЕРАТУРА


ВСТУП



Інформація про стан довкілля отримується за допомогою численних методів контролю, спостереження та оцінки. Об’єктивна та своєчасна інформація формує правильне розуміння проблеми та є основою для прийняття ефективних управлінських рішень щодо покращення стану довкілля. Екологічний моніторинг має на меті збір, оброблення, збереження та аналіз інформації про стан навколишнього природного середовища, прогнозування його змін та розробки науково обґрунтованих рекомендацій для збереження чи покращення стану довкілля (Еколог. право України, 2008). 

Одним із видів забруднення, що чинить тривалий стресовий вплив на екосистему, є нафта. Забруднення ґрунтів нафтою спричиняє як деградацію земель, так і створює небезпеку проникнення полютантів у живильні ланцюги, однією з ланок яких є людина. Нафтопродукти завдяки високій адсорбуючій здатності ґрунту довгий час зберігаються в ньому, змінюючи його фізико-хімічні та біологічні властивості. Природне відновлення ґрунтових екосистем, забруднених нафтою – довготривалий і складний процес (Оборин та ін., 1987). 

Для оптимізації даного процесу необхідне ведення моніторингу нафтогазового комплексу та супутнього забруднення ґрунтів. Важливою складовою екологічно моніторингу є біомоніторинг, який використовує методи біоіндикації та біотестуванння (Самсонов та ін., 2005). Ці методи виступають доповнювальними при проведенні фізико-хімічного аналізу. Оскільки детальний хімічний аналіз нафти та її вмісту в забрудненому ґрунті може надати докладну інформацію про загальну концентрацію полютанта, проте потенційні впливи на екосистеми не можуть бути передбачені, використовуючи тільки дані концентрації. Тому необхідні дослідження через серію біотестів (Cornelis et al., 2001).

Ряд наслідків, що випливають з первісного хімічного забруднення, призводять до того, що стандартні хімічні методи аналізу є недостатніми, щоб повністю оцінити вплив на навколишнє середовище. Обмеженість хімічних методів аналізу полягає у не врахуванні синергізму забруднювачів, абсорбцію ґрунтовими колоїдами та взаємодію із гуміновими кислотами. (Baker,1970; Wang, 1990). У біотестах відображається інтеграція цих ефектів, і тому їх застосування рекомендується для оцінки екологічного ризику забрудненого ґрунту (Keddy, 1995). Крім того, використання таких біологічних методів тестування рекомендується для оцінки ефективності процесів ремедіації грунту. У біотестуванні основним параметром оцінки забруднення виступає не концентрація полютанта, а реакція та відповідь живого організму. Цей метод дозволяє оцінити забруднення по відношенню до біотичних компонентів екосистеми. Біотести наочно продемонстрували, що хімічного аналізу не достатньо для екологічної оцінки забрудненого грунту, особливо, при прогнозуванні впливу складних сумішей сполук, наприклад, таких як нафта (Banks, 2005).

Рослини можна вважати найбільш зручними об’єктами для біомоніторингу ґрунтів. Простота обліку ефектів та інтерпретації результатів, їх чутливість і відтворюваність робить доцільним застосування рослинних тест-систем для діагностування та оцінки токсичності нафтозабруднених ґрунтів. Тому, враховуючи вищесказане, ми працювали над розробкою експрес-методу оцінки токсичності нафтозабрудненого ґрунту за допомогою рослин. Як тест-об’єкт використовували льон звичайний (Linum usitatissimum L.).

Мета роботи – встановлення закономірності „доза-ефект” між концентрацією нафти у ґрунті та чутливими тест-реакціями проростків льону звичайного (Linum usitatissimum L.) для фітооцінки токсичності нафтозабруднених ґрунтів. 

Для досягнення мети були поставлені конкретні завдання:

оцінити фітотоксичність ґрунту, забрудненого різною кількістю нафти за допомогою найбільш чутливих тест-реакцій рослин льону звичайного: енергії проростання, схожості насіння та морфометричних характеристик проростків;

з’ясувати закономірність відношення „доза-ефект” між концентрацією нафти у ґрунті та чутливими тест-показниками L. usitatissimum;

зробити висновки про доцільність використання даних параметрів для оцінки фітотоксичності нафтозабрудненого ґрунту.


1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ



1.1 Проблема нафтового забруднення ґрунту



У межах Карпатського регіону видобувається значна кількість нафти і газу. Бориславське нафтове родовище, що у Львівській області України, – один з найстаріших нафтопромислових центрів світу. У м. Бориславі та його околицях унаслідок довготривалого нафтовидобутку значна частка природних угруповань зазнала дегресивних змін (Цайтлер, 2000). Нафтові родовища міста Борислава розглядаються як об’єкти підвищеного ризику розвитку екологічного лиха.

 Серед компонентів наземних екосистем насамперед забруднені нафтою ґрунти, що опосередковано впливає на ґрунтову мікрофлору, рослинний і тваринний світ. На забруднених нафтою територіях формується специфічний мікроклімат, зумовлений мікрорельєфом, складом субстрату, порушеним водним та зміненим температурним режимами, з’являється специфічний запах. Чорне забарвлення нафтозабруднених ґрунтів призводить до надмірного поглинання сонячної радіації (Андресон та ін., 1980 ). 

Нафтові виливи утворюють на поверхні ґрунту щільну, в’язку бітумінозну кірку. Забруднення нафтою ґрунтів зумовлює зміни їх фізико-хімічних властивостей. Так, склеювання структурних частинок ґрунту нафтою призводить до значного зростання в’язкості і щільності ґрунтової маси, що погіршує його повітряно-водний режим. Ґрунти, просочені нафтопродуктами, втрачають здатність вбирати і затримувати вологу. У таких ґрунтах створюються анаеробні умови, змінюється окисно-відновний потенціал. Порушується вуглецево-азотний баланс ґрунту: різко зростає співвідношення між вуглецем і азотом за рахунок вуглецю нафти, знижується нітрифікаційна здатність, зменшується вміст нітратного азоту, вільного фосфору, обмінного калію, змінюється вміст поглинутих основ кальцію і магнію. Це погіршує азотний режим ґрунту і порушує кореневе живлення рослин (Оборини и др., 1987). 

Основними механізмами деградації ґрунту при забрудненні нафтою є:

безпосереднє пригнічення біологічних процесів токсичними компонентами; 

зменшення вологоємності ґрунту й заблокування поживних речовин внаслідок гідрофобізації поверхні важкими вуглеводнями; 

диспергація ґрунту одновалентними катіонами супутніх солей. (Мірошниченко, 2005). 

Значне нафтове забруднення ґрунту, що виникає при аварійних викидах, супроводжується гострою токсичною дією нафти на живі організми. У високих концентраціях нафта чинить сильну токсичну дію на всю ґрунтову біоту, однак, період токсичності є порівняно недовготривалим. З часом гострота токсичної дії нафти помітно знижується, а довготривале зниження біологічної продуктивності нафтозабруднених ґрунтів, очевидно, пов’язане із зміною важливих властивостей ґрунтів (Никифорова и др., 1987).

Полікомпонентність нафт та мінливість їх складу обумовлює різнобічність негативної дії на ґрунти (Мірошниченко, 2005). Метанові вуглеводні (алкани) легкої фракції чинять наркотичну та токсичну дію на живі організми, зокрема, на нервову систему, викликаючи її нестійкість. Ці вуглеводні розчинні у воді, тому легко проникають у клітини організмів через мембрани. Парафін не токсичний для живих організмів, бо внаслідок високих температур застигання та розчинності в умовах земної поверхні він переходить у твердий стан, позбавляючи нафту рухомості (Пиковский, 2003;). Навіть невелике підвищення температури різко активує молекулу парафіну, роблячи її здатною до глибоких процесів окиснення 

		Ароматичні вуглеводні – найбільш токсичні компоненти нафти. У концентрації лише 1% у воді вони вбивають всі водні рослини; нафта, що містить 38% ароматичних вуглеводнів, значно пригнічує ріст вищих рослин. Важкі компоненти (смоли, асфальтени тощо) слабо розкладаються ґрунтовою мікрофлорою і обумовлюють стійкі гідрофобні властивості забрудненого ґрунту. Легкі фракції (насамперед, нормальні і розгалужені алкани з довжиною ланцюга до 12-16 атомів вуглецю) високотоксичні для рослин і ґрунтової фауни, легко мігрують у ґрунті, але доступні до розкладу. Гідрофобні властивості, спричинені цими фракціями, поступово зникають протягом 2-3, максимум 5-річного періоду. (Мірошниченко, 2005). 

Спостереження за динамікою фітотоксичності окремих нафтопродуктів виявили суттєву різницю і в самовідновленні родючості ґрунту. За тестового рівня забруднення 10 л/м2 очищення ґрунту від бензину відбувалося за перше півріччя після його надходження, переважно шляхом фізичного випаровування. Час очищення ґрунту від гасу складає близько двох років, провідні механізми – випаровування і біодеградація. Негативна дія мазуту, викликана збільшенням гідрофобності поверхні ґрунтових часточок, триває набагато більше (Мірошниченко, 2005).

Отже, у фітотоксичності нафтового забруднення можна виділити як пряму, так і опосередковану дію. Першу чинять пари легколетючих вуглеводнів у ґрунтовому повітрі, другу – складають погіршення поживного і водно-повітряного режиму та інактивація важливих мікробіологічних процесів (нітрифікація, амоніфікація, целюлозолітична активність) “важкими” компонентами нафти. 



1.2 Якість ґрунту як складова стійкості екосистеми



Сучасна концепція якості ґрунту розвинулася від розуміння різноманітних функцій, які виконує ґрунт в екосистемі. Якість ґрунту визначається як ключова у стійкості екосистеми. На відміну від функцій води та повітря, які прямо пов’язані із здоров’ям людини, функції ґрунту чинять опосередкований вплив (Warkentin, 1995).

Якість ґрунту – це здатність виконувати функції в межах природних чи керованих екосистем, щоб підтримувати біологічну продуктивність рослин і тварин, забезпечувати якість довкілля, сприяти здоров’ю людини (Doran et al., 1996).

Властивості ґрунту, які визначають його якість, можна поділити на постійні (мінеральна складова, гранулометричний склад) та динамічні (вміст гумусу, рН, мікробіота). Саме динамічні компоненти потребують постійного спостереження для відслідковування змін (Carter, 1996).

Визнано, що ґрунти є необхідними для нормального функціонування екосистем, що сприяють здатності системи витримувати несприятливі наслідки таких порушень, як посухи, шкідники, забруднення, експлуатація людиною, включаючи сільське господарство. Стійкість проти деградації та здатність відновитися після порушення є важливими показниками функціонування ґрунту. 

 Екологічний погляд на ґрунт розглядає вплив його функції на інші компоненти екосистеми (наприклад, воду, атмосферне повітря і біту), а також прилеглі до них екосистеми. Таким чином ґрунт змінює хімічний склад опадів і перерозподіляє водуу в навколишньому середовищі, бере участь у підтриманні балансу води і тепла, газів атмосфери і служить в якості резервуара для біорізноманіття та генетичного матеріалу.

Існує кілька підходів до визначення функцій грунту в екосистемі:

Soil Science Society of America (1995): підтримання біологічної продуктивності, різноманітності; регулювання та розподіл води і розчинених потоком речовин; фільтрація, буферизація, іммобілізація і детоксикації органічних і неорганічних речовин; зберігання та включення в колообіг поживних речовин та інших елементів в біосфери Землі.

Blum and Santelises (1994): виробництво біомаси; ґрунт як реактор (фільтри, буфери, перетворює матерію); ґрунт як середовище існування і депо генетичних резервів 

Warkentin (1995):утилізація та рециркуляція органічних матеріалів із вивільненням поживних речовин та енергії; розподіл опадів на поверхні ґрунту; підтримання стабільної структури для протистояння водної та вітрової ерозії; буферизація швидких змін температури і вологості, вмісту хімічних елементів; підтримання різноманітності місць проживання, створюючи широкий спектр розмірів пор та пустот у ґрунті; зберігання та поступове вивільнення поживних речовин і води; розподіл енергії на поверхні ґрунту.

 Ґрунт як одна із фундаментальних абіотичних складових екосистеми є важливим об’єктом екологічного моніторингу. Ця значущість випливає також із взаємозв’язку усіх компонентів екосистеми через кругообіг речовин. При деградації ґрунту негативному впливу піддаються й інші компоненти екосистем. Речовини, які є ґрунті, можуть включатися у трофічні ланцюги, які можуть закінчуватися людиною. Полютанти здатні мігрувати у ґрунтові води, які стають носіями токсичних речовин (Kоrdel, 2001).

Для нормативної оцінки якості ґрунту визначають загальну концентрацію забруднюючих речовин, отриману за допомогою фізико-хімічних методів аналізу. Однак, для вивчення потенційного впливу на екосистему необхідною є оцінка через серію біотестів (Banks, 2005).



1.3 Оцінка якості ґрунту за допомогою тест-систем



Отримати інформацію про рекцію біологічних систем можна за допомогою методів біоіндикації та біотестування. Методи біоіндикації дозволяють отримати дані, що характеризують відгук біоценозів на антропогенний вплив. Характерно, що реакція формується протягом досить тривалого проміжку часу, тому може включати накладання різних чинників, їх коливання та адаптаційні механізми виду-індикатора (Семенов, 1984). Біоіндикатори не можуть миттєво реагувати на зміну екологічних умов, тому що їх індикаторними властивостями є популяційні процеси та процеси угруповання в цілому. Методи біотестування, на відміну від біоіндикації, являють собою характеристику ступеня впливу на біоценози. За допомогою цих методів можна отримати дані про токсичність конкретної проби води, ґрунту, забрудненої хімічними речовинами – антропогенного чи природного походження в даний час. Таким чином, методи біотестування близькі до методів хімічного аналізу. У той же час, на відміну від хімічних методів, вони дозволяють дати реальну оцінку токсичних властивостей води або іншого середовища, обумовлених присутністю комплексу забруднюючих хімічних речовин та їх метаболітів (Саксонов и др., 2007). 

Біотест – дослід, в якому зіставляються реакції певного організму в умовах токсичного забруднення і чистому середовищі (контроль). Під токсичністю розуміють властивість хімічних речовин проявляти пошкоджуючу або летальну дію на живі організми. Речовина, що має токсичну дію, називається токсикантом, а процес впливу токсиканта на організм – токсикація (на екосистему – токсифікація). 

Основним показником в біотестуванні є тест-функція – функціональний показник, що реагує на токсичний вплив і може бути виміряний кількісно за допомогою певного методу. Тест-реакція – кількісний вираз зміни тест-функції (Гідроекологічна токсикологія та біоіндикація забруднень, 1995).

Тест-фукнкціі, що використовуються в якості показників біотестування для різних об'єктів відмінні: для інфузорій, ракоподібних, ембріональних стадій молюсків, риб, комах − виживання (смертність) тест-організмів; для ракоподібних, риб, молюсків − плодючість, поява аномальних відхилень у ранньому ембріональному розвитку організму, ступінь синхронності дроблення яйцеклітин; для культур одноклітинних водоростей та інфузорій − загибель клітин, зміна (приріст чи зменшення) чисельності клітин в культурі, коефіцієнт ділення клітин, середня швидкість росту, добовий приріст кореня та ін ( Брагинский, 1993).

За Н. С. Строгановим (Строганов, 1971), кількісно токсичність речовини для окремого організму визначається як величина, обернена до медіанної летальної концентрації: Т = 1/LC50. Проте LC50 можна визначити тільки для однієї речовини і тільки в експеремкнтальних умовах і для певного виду організму. Проте, усі ці показники токсичності є більш актуальними для гідробіонтів і використовуються для оцінки токсичності вод та ґрунтових витяжок (Гідроекологічна токсикологія та біоіндикація забруднень, 1995).

Методи біотестування широкого використовуються при проведенні гідрологічного моніторингу якості вод. У розвинених країнах при контролі якості води, крім гідрохімічних аналізів, обов'язковим є токсикологічний контроль. Показник „токсичність” як норматив при контролі стічних вод та видачу дозволів на їх скидання в природні водойми застосовується в таких країнах, як Данія, Франція, Германя, Ірландія, Нідерланди, Великобританія, Норвегія, Бельгія, Швеція, Швейцарія, Канада, США, Австралія, Бразилія, Японія (Саксонов и др., 2007).

Існує безліч біологічних показників, за допомогою яких оцінюється стан та якість ґрунтів. Найбільш важливими для цілей ґрунтового моніторингу на промислових об'єктах є інтегральні показники біологічної активності: токсичність, „дихання ”, кількість вільних амінокислот і білків. Інтенсивність дихання ґрунту є виключно варіабельною величиною і залежить від великої кількості факторів (температурного режиму, вологість, стану фітоценозу та ін.) Для оцінки екологічного впливу забруднень необхідно проводити порівняння даних, отриманих на різних ділянках в максимально близьких умовах. Інформативними є й інші показники, наприклад, ферментативна активність. Попадання нафти і нафтопродуктів у ґрунт призводить до трансформаційних змін активності основних ґрунтових ферментів, що впливає на обмін азоту, фосфору, вуглецю і сірки (Киреева, Новоселова и др., 2001). Стійкі зміни в активності деяких ґрунтових ферментів можуть використовуватися як діагностичні показники забруднення ґрунтів нафтою. Для цього зручними об’єктами є ферменти, що об'єднуються під загальною назвою ґрунтові уреази. По-перше, вони менше піддаються впливу інших екологічних факторів і, по-друге, прослідковується чітка залежність їх активності від ступеня забрудненняня ґрунтів (Киреєва и др., 2001). 

Застосування мікроорганізмів для оцінки інтегральної токсичності ґрунту і створення на їх основі комплексної системи чутливих, достовірних і економічних біотестів є перспективним напрямком досліджень. Багато фізіологічних груп ґрунтових мікроорганізмів виявляють чутливість по відношенню до нафтових вуглеводнів. Загальна кількість мікроорганізмів, як правило, досить чітко відображає мікробіологічну активність ґрунту, швидкість розкладання органічних речовин і кругообігу мінеральних елементів. На підставі даного показника можна не тільки судити про ступінь забруднення ґрунту нафтою, а й про потенційну здатність до відновлення, а також про процеси розкладання нафти у природних умовах і при рекультивації забруднених ґрунтів (Киреева и др., 2003). Нафтове забруднення може також сприяти накопиченню в ґрунтів мікроскопічних грибів, які виділяють фітотоксини та викликають захворювання рослин. Безпосередній вплив нафти на рослинний покрив виявляється в тому, що сповільнюється ріст рослин, порушуються функції фотосинтезу і дихання, відзначаються різні морфологічні порушення, сильно страждають коренева система, листя, стебла і репродуктивні органи (Киреева и др., 2003). 

Рослини можна вважати найбільш зручними об’єктами для біомоніторингу ґрунтів, оскільки вони є первинними ланками трофічних ланцюгів, виконують основну роль у поглинанні різноманітних забруднювачів і постійно зазнають їх впливу внаслідок закріплення на субстраті. Простота обліку ефектів та інтерпретації результатів, їх чутливість і відтворюваність робить доцільним застосування рослинних тест-систем для діагностування та оцінки токсичності нафтозабруднених ґрунтів. 

Оперативну інформацію про фітотоксичність забрудненого ґрунту можна отримати, використуючись як тест-об'єкти насіння та проростки рослин. Для коректної постановки досліду на токсичність, насіння для тестування підбирають за розмірами і швидкістю проростання, наприклад: салат (Lactuca sativa L.), просо (Panicum miliaceum L.) редьку (Raphanus L.), червону конюшину (Trifolium pratense L.), пшеницю (Trifolium aestivum L.) (Chaіneau, 1997). В якості тест-функції виступають показники схожості насіння, дружність і час появи сходів, швидкість росту проростків, останній з яких вважається найбільш чутливим. У цьому відношенні рослинні тест-системи мають істотні переваги перед приладами: дешеві, легко відтворюються, швидко розмножуються, мають типову відповідну реакцію на вплив (Гродзинський, 2006)

Для визначення токсичності на вищих трофічних рівнях використовують ґрунтових безхребетних. У природних екосистемах, для комплексного біотестування використовують мікроартроподи. Ґрунтові ногохвістки (колемболи) дуже чутливі до дії органічних речовин, тому їх можна з успіхом застосовувати при визначенні інтегральної токсичності нафтозабруднених ґрунтів (Трублаевич, 1997). Тест-показником може служити відсоток тих особин коллембол, що вижили, тривалість їх життя, поведінкові реакції. При вмісті нафти 1-5% маси ґрунту був виявлений лінійний зв'язок між вмістом забруднювача і величиною тест-показника (Cornelis, 2001).

Цінними біоіндикаторами являются дощові черв’яки (Hund-Rinke et al., 2003). За кількістю дощових черв’яків, їх станом можна судити про ступінь забруднення ґрунтів. Ці тварини мають відповідні тест-реакції, які залежать не лише від тривалості забруднення, але й від дози забруднювача. Існує пряма залежність між концентрацією внесених нафтопродуктів і смертністю дощових черв’яків на забруднених ділянках в перші дні після внесення у ґрунт нафтопродуктів. Переваги дощових червяків як тест-обєктів полягають у чутливості до змін в ґрунті, що пов’язано із особливостями їх життєдіяльності: газообмін через шкіряні покриви, заковтування часточок ґрунту (Козлов, 2002).

Біотестування на дафніях стало широко використовуватися в контролі забруднення вод (Строганов, 1971). Популярність Daphnia magna як тест-обєкта пов’язана з тим, що вона легко розводиться в культурі, досить стійка в штучних умовах, дає цілий комплекс тест-реакцій, та має короткий життєвий цикл, що дозвляє прослідковувати токсичний вплив на наступні покоління (Брагинський, 2000). Біотестування ґрунтів із використанням дафній доцільно проводити лише на водних витяжках для гідрофільних речовин, тому для оцінки токсичності нафтопродуктів цей метод не є ефективним.

Комплексне біотестування, яке включає наступні тест-об'єкти: насіння рослин, мікроорганізми, ґрунтові безхребетні та ферменти можна використовувати як в повному обсязі, так і частково, в залежності від цільового призначення досліджень і ступеня нафтового забруднення ґрунту. Якщо проби з ґрунтовими ногохвістками і активність ферментів дають кількісну характеристику токсичності ґрунту при низькому та середньому ступені забруднення, то мікробіологічні тести зручні для опису стану сильно забруднених високотоксичних ґрунтів (Киреева и др., 2003). Тестування водними організмами, як правило, здійснюється на витяжках із забрудненого грунту, досліджуючи короткострокові періоди впливу. Переваги такого методу полягають у низьких витратах і швидкій відповіді. Проте, з екологічної точки зору, оцінка гострої дії, є менш значущою та репрезентативною. Такі тести можуть бути використані, наприклад, для виявлення потенційного впливу хімічних забруднюючих речовин на функціонування фільтраційного механізму ґрунтів (Keddy, 1995). Довготермінові методи біооцінки, що ґрунтуються на визначенні хронічного впливу, є більш значущим з екологічної точки зору і можуть надати інформацію про можливі наслідки зміни властивостей ґрунту як середовища існування. Тести гострої та хронічної дії відрізняються за тривалістю життя піддослідного організму, тобто періодом впливу. 

Проте, лише комплексна оцінка, що враховує вплив на різні види організмів, різних трофічних рівнів може відображати ступінь екотоксичності ґрунту (Cornelis, 2001).


2. ОБ’ЄКТИ, МЕТОДИ ТА УМОВИ ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕНЬ



2.1 Об’єкт дослідження та його характеристика



Льон звичайний ( Linum Usitatissimum L.) − вид рослин з родини льонових Linaceae. Однорічна травяниста рослина. Стебло циліндричне, вгорі гілчасте з ланцетовидними листками. Віночок з п’ятьма пелюстками блакитного кольору. Плід − п’ятигніздна куляста коробочка з десятьма маслянистими насінинами. Цвіте з червня по серпень, насіння достигає у липні (рис. 2.1). Насіння містить слизисті речовини (близько 12 %), пектин, жирну олію (30-40%), складену із гліцеридів лінолевої (35-40%), ліноленової (25-35%) та ), олеїнової (15-20 %), пальмітинової і стеаринової кислот, ціаногеновий глікозид лінамарин (1,5%), ензим лінамаразу, до 20-25% протеїнів, цукри, каротин тощо. Типові біотопи для льону звичайного − це узлісся, пустища, узбіччя доріг, вирощується у культурі. Рослина не вимоглива до умов середовища (Опред. высших растений Украины, 1987).



2.2 Підготовка матеріалу для дослідження



Для визначення фітотоксичності грунту були підготовлені зразки нафтозабрудненого грунту Для досліджень використовували сиру нафту густиною 0,86 г/мл, ґрунт глинистий (середньосуглинковий) з екологічно чистої території. У повітряно-сухий ґрунт вносили нафту за такою схемою:

контроль (ґрунт чистий);

99 г чистого ґрунту + 1 г нафти (1% забруднення);

97,5 г чистого ґрунту + 2,5 г нафти (2,5% забруднення);

95 г чистого ґрунту + 5 г нафти (5% забруднення); 

94 г чистого ґрунту + 6 г нафти (6% забруднення);

92 г чистого ґрунту + 8 г нафти (8% забруднення);

90 г чистого ґрунту + 10 г нафти (10% забруднення);

85 г чистого ґрунту + 15 г нафти (15% забруднення);



2.3 Методи досліджень



2.3.1 Визначення фітотоксичності ґрунту

Наважку ґрунту 20 г поміщали в ступку і зволожували водою приблизно до 75% від повної вологоємкості, добре розтирали цю масу. Потім суспензію переносили в чашки Петрі. При струшуванні чашки утворилося легеньке водяне дзеркальце.

На грунт у чашки висівали насіння льону звичайного (Linum usitatissimum L.) (по 20 штук). Закриті чашки ставили в термостат на при температурі +24°С. Через 3 доби рахували схожість насіння, на 6-ту добу – вимірювали довжину кореня і пагона проростків. 



2.3.2 Визначення тест-показників льону звичайного

Після проростання насіння льону звичайного аналізували наступні тест-показники: індекс схожості (ІС) на 3-тю добу, індекс кореня (ІК) та індекс пагона (ІП) на 6-ту добу, індекс проростання насіння (ІПН) (Teaca, 2008).



, 



де  − к-ть пророслого насіння в досліді,

 − к-ть пророслого насіння в контролі;



,



де  − довжина кореня в досліді, 

 − довжина кореня в контролі;



, 



де  − довжина пагона в досліді, 

 − довжина пагона в контролі;



 



2.4 Статистично-математичне опрацювання результатів

нафтовий забруднення ґрунт льон

Досліди проводили у п’ятикратній повторності. Отримані результати опрацьовували статистично з використанням програмного пакета Microsoft Excel для персональних комп’ютерів. Визначали середнє арифметичне, стандартну похибку. Достовірність різниці між контрольним і дослідними варіантами оцінювали за критерієм Стьюдента; вірогідними вважали різниці, де Р<0,05 (Кучеренко, 2001).




3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ



3.1 Залежність процесу проростання насіння льону звичайного (Linum usitatissimum L.) від концентрації нафти у ґрунті 



Для проростання насіння необхідні певні умови, передусім – вода. Процес проростання насіння розпочинається після адсорбції води крізь мікропіле та насіннєві оболонки завдяки біоколоїдам, якими є білки, крохмаль, геміцелюлоза, пектинові речовини. Набрякання цих речовин створює силу для розриву оболонки. Зародок збільшується у розмірах завдяки росту клітин розтягуванням і поглинанню води. Зародковий корінець виходить унаслідок розриву насінної шкірки і насінину вважають пророслою (Терек, 2007).

Нами встановлено, що залежно від концентрації у ґрунті нафта по-різному впливає на проростання насіння льону звичайного (Linum usitatissimum L.). Криві динаміки проростання насіння в часі ілюструють, що при низьких концентраціях нафти насіння проростає швидше, ніж у контролі (рис. 3.1). На 3-тю добу при забрудненні 1% нафти у ґрунті кількість пророслого насіння на 9% більша, ніж у контролі, при 2,5% нафти – на 15%. При даних концентраціях криві динаміки проростання насіння швидше виходять на плато (кількість пророслого насіння досягає максимального значення на 4-ту добу). У контролі досягнення максимуму схожості спостерігається на 5-ту. Отже, нафта при низьких концентраціях (1%, 2,5%) сприяє виходу насіння із стану спокою та стимулює проростання насіння. 

Це можна пояснити стимулюючою дією нафти при низьких концентраціях (Грищенко, 1982). Встановлено, що стимулюючий ефект мають поліароматичні вуглеводні (ПАВ) як компоненти нафти, зокрема флуорен, антрацен, пірен, хризен. При низьких концентраціях (10 мг/кг). спостерігалося стимулювання росту рослин на ранніх етапах розвитку для таких досліджуваних видів, як пшениця - Triticum vulgare Vill, овес - Avena sativa L., кукурудза - Zea mays L., помідори - Lycopersicon esculentum Miller, квасоля - Phaseolus vulgaris L, соняшник - Helianthus annus L. (Maliszewska-Kordybach, 2000).

У концентраціях 5%, 6% та 8% нафта значно пригнічує процес проростання насіння. Кількість пророслого насіння на 3-тю добу при 5% нафтового забруднення зменшується на 32%, а при 6% – на 34% щодо контролю. Криві динаміки проростання досягають свого плато, як і в контролі, на 5-ту добу. При забрудненні 8% насіння починає проростати лише на 4-ту добу, а плато настає на 6-ту добу. При нафтовому забрудненні 10% насіння проростає на 6-ту добу. Отже, при високих ступенях нафтового забруднення швидкість проростання насіння гальмується, що зумовлено високою токсичністю нафти. Таким чином, швидкість проростання насіння залежить від концентрації токсиканта, що буде враховано при розробці методу фітооцінки токсичності нафтозабруднених ґрунтів. 





Рис. 3.1. Часова динаміка проростання насіння льону звичайного (Linum usitatissimum L.) при різних концентраціях нафти у ґрунті 



Нафта як токсикант негативно впливає на проростання насіння, зменшуючи схожість. Нами встановлено, що індекс схожості на 6-ту добу при низьких та середніх концентраціях нафти (1 – 8%) залишається близьким до контролю. На проміжку 0—8% крива індексу схожості іде майже горизонтально і наближається до плато, що відображає слабку залежність між концентрацією нафти у ґрунті та ІС в цих межах (див. рис. 3.2). При концентрації 10% ІС становить 28%, що свідчить про високу токсичність нафтозабрудненого ґрунту. При вищих концентраціях індекс схожості наближається до нуля. Зменшення схожості можна пояснити здатністю насіння адсорбувати нафту, яка в свою чергу змінює розвиток метаболічних реакцій, в результаті чого насінина не проростає (Baker, 1970). 

Отже, для ІС при вмісті нафти 1%, 2,5%, 5%, 6% та 8% спостерігається незначне відхилення від контролю, тоді як при вищих концентраціях відбувається різке зменшення кількості пророслого насіння. Показовими є фото дослідних рослин (рис. 3.3).





Рис. 3.2. Індекс схожості насіння льону звичайного (Linum usitatissimum L.) за дії різних концентрацій нафти у ґрунті 



Отримані нами результати свідчать, що динаміка проростання та схожість насіння льону звичайного (Linum usitatissimum L.) є чутливими та інформативними тест-реакціями для оцінки токсичності нафтового забруднення ґрунту. Такі тест-реакції є перспективними для проведення фітооцінки нафтозабрудненого грунту, на їх основі можна розробляти методичні рекомендації для фітоіндикації нафтозабруднених територій.



3.2 Морфометричні параметри проростків Linum usitatissimum L. як тест-реакції на дію нафтового забруднення ґрунту 



Зручними об’єктами для біоіндикації забруднювачів є проростки рослин (Гродзинський, 2006; Горова, 2005). Нафта впливає на всі етапи онтогенезу рослин, серед яких найбільш чутливими є проростки. При дослідженні фітотоксичності нафти було показано, що нафтове забруднення значно інгібує ріст і розвиток рослин (Киреева, 2007). 

Як морфометричний показник ми вимірювали довжину коренів та пагонів проростків та визначали індекс кореня (ІК) льону звичайного. Було встановлено, що за дії нафти відбувається інгібування росту кореня. Індекс кореня при вмісті нафти 1%, 2,5%, 5%, 6% зменшується відповідно на 70, 66, 63, 61% щодо контролю (рис. 3.3.). ІК при цьому слабо змінюється, утворюючи пологе плато. А при вищих концентраціях відбувається подальше зменшення ІК: при 8% – на 80%, при 10% - на 94%. Пригнічення росту кореня зумовлене токсичністю нафти, яка через водний розчин взаємодіє із проростками (Linder at al, 1990). Схожість насіння ілюструє прямий вплив нафти, тоді як довжина проростків є реакцією на опосередкований вплив водорозчинних нафтопродуктів. Це свідчить про високу чутливість досліджуваної тест-реакції та лінійну залежність кривої „доза-ефект”.

Отже, ІК чутливо реагує на токсичність нафти. Прямолінійна залежність між індексом кореня та концентрацією нафти у ґрунті спостерігається на проміжку 6–10% забруднювача. Це дозволяє використовувати ІК при проводити діагностиці вмісту нафти у ґрунті в цьому інтервалі.




Рис 3.3. Індекс кореня льону звичайного (Linum usitatissimum L.) за дії нафти у ґрунті 



Ми також аналізували таку тест-реакцію, як індекс пагона (ІП). Даний параметр вважається менш чутливим, оскільки пагін безпосередньо не контактує із забруднювачем. А токсичний вплив буде зумовлений міграцією токсикантів від кореня до пагона та створеною концентрацією летких нафтопродуктів у чашці Петрі (Wong, 1999). 

Індекс пагона поступово зменшується із зростанням вмісту нафти у ґрунті (рис. 3.4.). При слабкому забрудненні нафтою, концентрація 1 та 2,5%, ІП становить відповідно 55 та 52 % щодо контролю. Нафта у кількості 5% виявляє більш токсичну дію, про що свідчить зменшення ІП до 21%. При концентрації токсиканта 6% індекс пагона становить 16,3%, при 8% – 12,8%, при 10% пагін не розвивається. Показовими є фото дослідних рослин (рис. 3.6).

Отже, ІП чутливо реагує на вміст нафти у ґрунті. Із зростанням концентрації нафти від 1% індекс пагона поступово зменшується і при 10% забруднення наближається до нуля. Це свідчить про доцільність використання даної тест-реакції при проведенні фітооцінки токсичності нафтозабруднених ґрунтів. 




Рис. 3.4. Індекс пагона льону звичайного (Linum usitatissimum L.) за дії нафти у ґрунті



Параметр, який об’єднує ІС, ІК та ІП, є індекс проростання насіння (ІПН). Очевидно, даний показник мав би бути найбільш достовірним та інформативним, оскільки інтегрує найтиповіші тест-реакції досліджуваного об’єкта. Отриманий індекс проростання дійсно найповніше відображав ступінь токсичності нафти (див. рис.3.9). Так при концентрації нафти 1% ІПН зменшується до 14,3%, при 2,5% – до 24,5% (рис. 3.5.). Вже при низьких концентраціях нафти фіксується значне відхилення щодо контролю. При послідовному зростанні вмісту нафти до 5%, 6%, 8%, 10% ІПН становить відповідно 11,1%, 9,2%, 2,6%, 1,4%. 

Інтегрування тест-показники дозволить суттєво збільшити діагностичну продуктивність тест-системи. 




Рис. 3.5. Індекс проростання насіння льону звичайного (Linum usitatissimum L.)




ВИСНОВКИ



На основі отриманих даних можна зробити наступні висновки:

Встановлено, що нафта при низьких концентраціях (1%, 2,5%) сприяє виходу насіння із стану спокою та стимулює проростання насіння Linum usitatissimum L, при високих (5%, 6% та 8%, 10%) – пригнічує

Індекс схожості різкщ зменшення при високих концентраціях нафти у грунті (10%).

Отримані нами результати свідчать, що динаміка проростання та схожість насіння льону звичайного (Linum usitatissimum L.) є чутливими та інформативними тест-реакціями для оцінки токсичності нафтового забруднення ґрунту. Такі тест-реакції є перспективними для проведення фітооцінки нафтозабрудненого грунту, на їх основі можна розробляти методичні рекомендації для фітоіндикації нафтозабруднених територій.

Встановлено прямолінійну залежність між індексом кореня та концентрацією нафти у ґрунті на проміжку 6–10% забруднювача.

Встановлено лінійну залежність між індексом пагона L. usitatissimum та вмістом нафти у ґрунті: 

Індекс проростання насіння – найбільш достовірний та інформативний параметр, який збільшує ефективність та чутливість тест-системи.

Досліджувані тест-реакції льону звичайного (Linum usitatissimum L.) доцільно використовувати при оціненні фітотоксичності нафтозабруд- неного ґрунту, на їх основі можна розробляти методичні рекомендації для фітоіндикації нафтозабруднених територій. 


ЛІТЕРАТУРА



Андресон Р.К., Мукатанов А.Х., Бойко Т.Ф. Экологические последствия загрязнения почв нефтью // Экология. – 1980. – №6. – С. 21-25.

Брагинський Л. П. Методологические аспекты токсикологического биотестирования на Daphnia magna Str. и других ветвистоусых ракообразних (критический обзор) // Гидробиол. журн. − 2000.− Т.36, №5. − С.50

Гідроекологічна токсикологія та біоіндикація забруднень / За ред. Олексіва І. Г., Брагінського Л. П. − Львів: Світ, 1995− 440с.

Горова А. І.,Скворцова Т. М., Клімкіна І. І, Павличенко, А. В., Бучавий Ю. В. Цитогенетичний моніторинг довкілля та здоровя людини // Вісн. Укр. Тов-ва генетиків і селекціонерів. – 2005. – Т. 3, №1-2. – С. 36-47.

Грищенко О.М. Ботанические аномалии как поисково-разведочный критерий нефтегазоносности // Экология. – 1982. - № 1. - С. 18-22. 

Гродзинський Д.М., Шиліна Ю.В., Куцоконь Н.К., Михєєв О.М., Гуща М.І., Коломієць О.Д., Фалінська Т.П., Овсяннікова Л.Г., Кутлахмедов Ю.О., Пчеловська С.В. Застосування рослинних тест-систем для оцінки комбінованої дії факторів різної природи. – К.: Фітосоціоцентр, 2006. - 60 с.

Гродзинский А.М. и др. Прямые методы биотестирования почвы и метаболитов микроорганизмов // Аллелопатия и продуктивность растений: Сб.науч.тр. АН УССР. - К.: Наук. думка, 1990. – С. 121-124. 

 Екологічне право України. Академічний курс: Підручник. / За заг. Ред. Ю. С. Шемчушенка. − К.: Юридична думка, 2008. − С. 195. 

Изменение численности и поведенческих реакций дождевых червей Lumbricus rubellus Hoffmeister в условиях загрязнения почв нефтьюНаучно-исследовательский институт биологии и биофизики при Томском государственном университете 634050 Томск, просп. Ленина, Сибирский экологический журнал, 2004, № 4, с. 463-466

Израэль Ю.А., Гасилина Н.К., Ровинский Ф.Я. Система наблюдений и контроля загрязнений природной среды в СССР // Метеорология и гидрология, – 1978. – № 10. – С. 5-12 

Козлов К.С. Дождевые черви – биоиндикационный тест почв загрязненных нефтью // Материалы докладов межрегиональной научно-технической конф. «Научная сессия ТУСУР». – Томск, 2002. Ч.3. – С. 136-138.

Киреева Н.А., Кабиров Т. Р., Дубовик И. Е. Комплексное биотестирование нефтезагрезньонних почв // Екология. – 2007. – №5..

Киреева Н.А. Фитотоксичность антропогенно-загрязненных почв / Н.А. Киреева, Г.Г. Кузяхметов, А.М.Мифтахова, В.В.Водопьянов. – Уфа Гилем, 2003.

Кучеренко М.Є. Бабенюк Ю.Д., Войціцький В.М. Сучасні методи біохімічних досліджень. – К.: Укрсоціоцентр, 2001. – 424 с. .

Никифорова Е.М., Солнцева Н.П., Кабанова Н.В. Геохимическая трансформация дерново-подзолистых почв под воздействием нефти // Влияние промышленных предприятий на окружающую среду. - М.: Наука, 1987. - С. 241-253.

Оборин А.А., Калачникова И. Г., Масливец Т.А. и др. Нефтяное загрязнение почв и способы рекультивации // Влияние промышленных предприятий на окружающую среду. – М.: Наука, 1987. – С. 284-290.

Определитель высших растений Украины // Под ред. Д.Н. Доброчае- ва, М.И.Котова, и др. – К.: Наук. думка, 1987. – 548 с.

Пиковский Ю.И., Геннадиев А.Н., Чернянский С.С., Сахаров Г.Н. Проблема диагностики и нормирования загрязнения почв нефтью и нефтепродуктами // Почвоведение. - 2003. - №9. - С. 1132-1140.

Саксонов М. Н., Абалаков А. Д., Данько Л. В., Бархатова О. А., Балаян А. Э., Стом Д. И. Экологический моніторинг нефтегазовой отрасли.Физико-химические и биологические методы: учеб. пособие. – Иркутск: Иркут. ун-т, 2005. – 114 с.

Семенов С.М., Филиппова Л.М. Прогнозирование состояния биоты в системе экологического мониторинга // Комплексный глобальный мониторинг загрязнения окружающей природной среды. Труды II Международного симпозиума. – Л.: Гидрометеоиздат, 1982,. – С. 364-370 Гидрометеоиздат, 1976. – С. 181-191

Cтроганов Н. С. Методика определения токсичности водной среды / Н.С. Строганов // Методики биологических исследований по водной токсикологии. / Под ред. Строганова Н. С. – М.: Наука, 1971. – С. 14-60.

Терек О.І. Ріст рослин : навч. посібник / О.І. Терек. – Львів : Видавничий центр ЛНУ ім. Івана Франка, 2007. – 247 с. 

Трублаевич Ж.М. Оценка токсичности почв с помощью лабораторной культуры коллембол / Ж.М. Трублаевич Ж.М., Е.Н. Семенова // Экология, 1997. – №5.

Химия нефти / Под ред. З. И. Сюняева. - Л.: Химия. – 1984. - С. 5-25.

Цайтлер М.Й. Видовий склад угруповань, що формуються як результат заростання територій, забруднених нафтопродуктами // Мат. першої наук. конф. молод. учен. „Наукові основи збереження біотичної різноманітності”. – Львів: Ліга-Прес. – 2000. – Вип. 1. - С. 101-105.

Цайтлер М.Й. Відновлення рослинного покриву і зміни структури ценопопуляцій трав’яних рослин на нафтозабруднених територіях Бориславського нафтового родовища: Автореф. дис… канд. біол. наук: 03.00.16 / Дніпропетровськ, 2001. – 16 с. 

Цайтлер М.Й. Екологічні наслідки довготривалого нафтовидобутку на Бориславському нафтовому родовищі // Праці НТШ. (Екологічні проблеми Львівщини). – Львів, 2000. – №7. - С. 84-90.

Baker, J. M. The effect of oils on plants // Environ. Polut. − 1970. −1:27 – P. 44.

	Banks M. K. and Schultz K. E. Comparison of plants for germination toxicity tests in petroleum contaminated soil // Water, Air, and Soil Pollution.−2005. −167: 211– P. 219 

	Carter M.R. Concepts Of Soil Quality // Soil Quality is in the Hands of the Land Manager. – 1996 – P. 5-10/

Chaıneau, C.H., Morel, J.L., Oudot, J. Phytotoxicity and plant uptake of fuel oil Hydrocarbons// Journal of Environmental Quality. − 1997.−Vol.26. − P. 1478-1483.

Cornelis A.M., Eline E. Van Der Hoke, S. Bouwens, B. Rusch, R. Kronenburg, and G. Stokman. The use of acute and chronic bioassays to determine the ecological risk and bioremediation efficiency of oil-polluted soils // Environmental Toxicology and Chemistry. – 2001. –Vol. 20, No. 7. –P. 1438–1449.

Doran J.W., Sarrantonio M., Liebig M. Soil health and sustainability // Advances in Agronomy. – 1996 – Vol. 56. – P. 1–54.

Henner, P., Schiavon, M., Druelle, V., Lichtfouse, E. Phytotoxicity of ancient gas work soils. Effect of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) on plant germination //Organic Geochemistry. −1999. −Vol.30. −P.963-969.

Hund-Rinke K., Achazі R., Rоmbke J., Warnecke D. Avoidance test with Eisenia fetida as indicator for the habitat function of soils: results of a laboratory comparison test // J Soils & Sediments– 2003 12).– Vol. (1) 7 – Р. 77.

Karlen, D.L., Mausbach, M.J., Doran, J.W., Cline, R.G., Harris, R.F., Schuman, G.E.,. Soil quality: a concept, deﬁnition, and framework for evaluation // Soil Sci. Soc. Am. J. – 1997 – Vol. 61 – P. 4–10.

Keddy C. J., Greene J.C., Bonnell M. A.. Review of whole organism bioassays: Soil, freshwater sediment and freshwater assessment in Canada // Ecotoxicol Environ Saf – 1995 – Vol. 30 – P. 251.

Kоrdel W., Rоmbke J. Requirements on physical, chemical and biological testing methods for estimating the quality of soils and soil substrates // J. Soils'& Sediments – 2001 – Vol. (2) 98. – P. 98.

Linder, G., Greene, J. C., Ratsch, H., Nwosu, J., Smith, S., and Wiborn, D. (). Seed germination and root elongation toxicity tests in hazardous waste site evaluation. In Plants for Toxicity Assessment: Second Volume.– 1990 – pp. 177-187. 

Pedrozo, M.F.M.; Barbosa, E.M.; Corseuil, H.X.; Schneider, M.R.; Linhares, M.M.. Ecotoxicologia e avaliaçao de risco do petróleo: Centro de Recursos Ambientais. – 2002 –246p 

Pezeshki, S. R.; Hester, W.; Lin, Q.; Nyman, J. A.. The effects of oil spill and clean-up on dominant US Gulf coast marsh macrophytes: a review // Environ. Poll. –2000 –. v. 108, 129-139 p.

Smith, M. J.; Flowers, T. H.; Duncab, H. J.; Alder, J.. Effects of polycyclic aromatic hydrocarbons on germination and subsequent growth of grasses and legumes in freshly contaminated soil with aged PAHs residues // Environ. Poll. – 2006 – Vol. 141, № 519 – P. 25.

Stom D.I. Effect of Individua Phenolic Compounds and their Mixtures on Liminous Bacterial. // Acta hydrochimikal et hydrobiologica Part 1-4 / Ed. By D.I. Stom, T.A. Geel, A.E. Balayan – Part 1-4 – 1986. – Vol. 14, № 4. – P. 332-337.

Teaca C. A., Bodirlau R., Toxicity assay assessment // Bioresourses − 2008 − Vol.3 (4) − P. 1130-1145.

Wang X., Bartha R. Effects of bioremediation on residues, activity and toxicity in soil contaminated by fuel spills // Soil Biochem. – 1990. – Vol. 22. – P.501–505.

Wang, W. and J.M. Williams. Screening and biomonitoring of industrial effluents using phytotoxicity tests // Environ. Toxicol. Chem. – 1988 – Vol. 7. –P. 645-652.