Молекулярные механизмы сплайсинга

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ УКРАИНЫ

	МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ АВТОНОМНОЙ РЕСПУБЛИКИ КРЫМ

	ТАВРИЧЕСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. В.И.ВЕРНАДСКОГО

	БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

	Кафедра биохимии

	

	

	

	

	

	

	МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ СПЛАЙСИНГА

	

	

	

	

	

	

	

	

	

	

	

	

	

	

	Симферополь, 2009


СОДЕРЖАНИЕ



СПЛАЙСИНГ РНК

Введение

Сплайсосомные интроны

Альтернативный сплайсинг

Сборка сплайсосомы

СПЛАЙСИНГ БЕЛКОВ

Введение

Структура интеинов

Современные представления о механизме белкового сплайсинга

Эндонуклеазная активность интеинов

Использование интеинов в биотехнологии

Заключение 

Список литературы


Введение



Сплайсинг — созревание информационной РНК (мРНК) у эукариот, в процессе которого путём биохимических реакций с участием РНК и белков из иРНК удаляются участки, не кодирующие белок (интроны) и соединяются друг с другом экзоны. Таким образом предшественник иРНК превращается в зрелую иРНК, с которой считываются (транслируются) белки клетки.

Работа Шарпа и Робертса, опубликованная в 1977 году, показала, что гены высших организмов «рассеяны», то есть хранятся в нескольких различных участках ДНК. Кодирующие отрезки гена перемежаются с некодирующей ДНК, которая не используется при экспрессии белков. «Рассеянная» структура гена была обнаружена, когда аденовирусная мРНК была скрещена с фрагментами моноспирали ДНК, оставшимися после воздействия эндонуклеазы. После такого скрещивания выяснилось, что мРНК-участки этих гибридных молекул мРНК-ДНК содержат 5'- и 3'-концы участков, не обладающие водородными связями. Более длинные отрезки ДНК при гибридизации закольцовывались и образовывали ответвления. Стало ясно, что эти закольцованные участки, содержащие ненужные последовательности, извлекаются из пре-мРНК в результате процесса, который и был назван «сплайсингом». Впоследствии было также выяснено, что рассеянная структура крайне широко распространена у эукариотических генов.

В природе обнаружены несколько вариантов сплайсинга. Какой из них будет проходить в каждом случае зависит от структуры интрона и катализатора, необходимого для реакции.


Сплайсосомные интроны



Сплайсосомные интроны часто находятся в генах, кодирующих белки. Для сплайсинга необходимо наличие специальных 3'- и 5' — последовательностей. Сплайсинг катализируется сплайсосомой — большим комплексом между РНК и белками, состоящим из пяти малых ядерных рибонуклеопротеидов (мяРНП). РНК-составляющая мяРНПов взаимодействует с интроном и, возможно, участвует в катализе. Обнаружены два типа сплайсосом (главная и дополнительная), отличающиеся по входящим в их состав мяРНП.

Главная сплайсосома принимает участие в сплайсинге интронов, содержащих гуанин и урацил (GU) в 5 сайте и аденин и гуанин (AU) в 3 сплайсинг-сайте. Она состоит из мяРНП: U1, U2, U4, U5 и U6.

Сплайсосома — структура, состоящая из молекул РНК и белков и осуществляющая удаление некодирующих последовательностей (интронов) из предшественников мРНК. Этот процесс называется сплайсингом (от 'англ.' splicing — сращивание). Сплайсосому составляют пять малых ядерных рибонуклеопротеинов (мяРНП) и некоторое количество дополнительных белковых факторов.

Содержащиеся в сплайсосоме мяРНП называются U1, U2, U4, U5 и U6. Они участвуют во многих взаимодействиях между молекулами РНК, а также между РНК и белками.

РНК-часть мяРНП богата уридином.

В общем случае сборка сплайсосомы происходит заново для каждой мРНК-предшественника. Молекула пре-мРНК обязательно содержит специфические фрагменты последовательности, распознаваемые во время сборки сплайсосомы. Это 5'-конце, последовательность точки ветвления, полипиримидиновый участок и 3'-конец.



Сплайсосома катализирует удаление промежуточных последовательностей и соединение соседних экзонов. Интроны обычно определяются по наличию последовательности GU на 5'-конце и последовательности AG на 3'-конце. 3'-конец может быть также определен по цепочке полипиримидинов различной длины, называемой полипиримидиновым трактом (ППТ). ППТ выполняют функцию связывания факторов с 3'-концом, а также, возможно, связывания факторов с последовательностью точки ветвления (ПТВ). ПТВ, в свою очередь, содержит много аденозина, требуемого для начала сплайсинга.

Группа менее распространенных мяРНП — U11, U12, U4atac и U6atac — входит вместе с U5 в состав малой сплайсосомы, выполняющей сплайсинг редких интронов пре-мРНК, называемых интронами типа U12.





Рис. 1. Один из белков сплайсосомы, присоединённый к участку РНК. 



Разные домены белка выделены различными цветами, РНК - вертикальная молекула в правой части рисунка.


Альтернативный сплайсинг



Альтернативный сплайсинг, во время которого происходит рекомбинация экзонов — главный источник генетического многообразия у эукариот. Переменному сращиванию обычно приписывалась роль причины относительно малого количества генов в геноме человека. Оценка их количества на протяжении многих лет менялась, максимальное же количество прогнозировалось на уровне 100 тысяч. Однако благодаря проекту Human Genome Project (англ. «Геном человека») стало известно, что их количество близко к 30 000. При этом, однако, считается, что почти каждый человеческий ген имеет не менее двух изоформ.

Сущность альтернативного сплайсинга заключается в том, что в результате посттранскрипционного процессинга предшественника мРНК, из которого в результате сплайсинга вырезаются некодирующие последовательности нуклеотидов, соответствующие интронам транскрибированного гена, образуются зрелые мРНК, различающиеся по своей первичной структуре. В результате в разных клетках из одного и того же предшественника получаются молекулы зрелых мРНК, которые объединяют в различных комбинациях последовательности экзонов транскрибированного гена.

Впервые неоднозначность сплайсинга была обнаружена у аденовирусов - крупных вирусов, инфицирующих клетки животных (Ziff E.B., 1980). Геном аденовирусов направляет синтез нескольких очень длинных РНК-транскриптов, каждый из которых содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие целый ряд различных белков. Альтернативные пути сплайсинга приводят к тому, что из совершенно одинаковых первичных транскриптов образуются молекулы мРНК разных типов, имеющие одну и ту же 5'-концевую последовательность (5'-кэп), которая, таким образом, инициирует синтез нескольких разных белков. Правило последовательного смыкания донорных и акцепторных интронных контактов не соблюдается. Остается неясным, как осуществляется контроль альтернативного сплайсинга РНК-транскриптов. Альтернативный процессинг РНК, возможно, имеет определенные преимущества, а именно экономичность: повышение информационной емкости генома в этом случае не сопровождается увеличением его размеров. 

На рис. 2 представлена схема экзонной структуры гена модулятора cAMP-респонсивного элемента человека (CREM) . Во время сперматогенеза происходит переключение с синтеза репрессоров транскрипции CREMальфа , CREMбета и CREMгамма на образование CREMтау , который содержит две дополнительные последовательности, обогащенные Gln (Q1 и Q2), необходимые для транс-активации транскрипции. Более короткий транскрипт, синтез которого инициируется на промоторе P2, процессируется с образованием зрелых мРНК, которые кодируют группу небольших молекул репрессоров (ICER). Инициация синтеза РНК на промоторе P2 активируется под действием ритмических гормональных сигналов эпифиза мозга. 

В результате использования такого механизма одна и та же последовательность нуклеотидов гена может кодировать несколько разных белков. Комбинаторика объединения последовательностей нуклеотидов пре-мРНК в процессе альтернативного сплайсинга может быть очень сложной, поскольку в него вовлекаются интроны и экзоны, а их объединение происходит с использованием различных точек сплайсинга, локализованных в этих последовательностях. Распознавание участков ДНК, в которых находятся точки сплайсинга, участвующие в конкретном акте посттранскрипционного процессинга пре-мРНК, происходит с участием специфических белков в результате белково-нуклеинового взаимодействия.





Рис. 2. Схема формирования активаторов и репрессоров транскрипции, кодируемых геном CREM и образующихся в результате альтернативного сплайсинга. 



В верхней части рисунка изображена схема гена CREM, включающая альтернативные промоторы Р1 и P2, кодоны альтернативной инициации и терминации трансляции, а также экзоны, кодирующие различные домены факторов. Внизу представлены комбинации последовательностей экзонов, объединяющихся в зрелые мРНК, которые кодируют разных представителей групп репрессоров и активаторов транскрипции, а также ICER-белков.



Сборка сплайсосомы



Каноническая модель формирования активной области сплайсосомы представляет собой упорядоченный пошаговый процесс соеднения единиц мяРНП на подложке пре-мРНК. Во время первичного распознавания пре-мРНК происходит связывание мяРНП U1 с 5'-стыком пре-мРНК, а также формирование из других белковых факторов фиксационного комплекса или раннего комплекса (Е-комплекса) для млекопитающих. Фиксационный комплекс — АТФ-независимое образование, удерживающее пре-мРНК для осуществления сплайсинга.

Малый ядерный рибонуклеопротеин U2 связывается с областью ветвления за счет взаимодействия с компонентом Е-комплекса U2АF (вспомогательным фактором мяРНП U2) и, возможно, с U1. В результате АТФ-зависимой реакции U2 образует прочную связь с последовательностью точки ветвления (ПТВ), тем самым формируя комплекс А. Двойная связь между U2 и областью ветвления пре-мРНК вытягивает аденозин из ответвляющейся цепочки. Присутствие же в U2 псевдоуридиновых остатков практически напротив области ветвления приводит к изменению конфигурации связей РНК-РНК во время связывания с U2. Эти изменения структуры, вызванные псевдоуридином, помещает 2'-OH-группу вытянутого аденозина в положение, позволяющее совершить первый шаг сплайсинга.

U4, U5 и U6, соединяющиеся с образованием более крупного тройственного мяРНП, связываются с собираемой сплайсосомой и формируют комплекс В, который после некотороых промежуточных перегруппировок субъединиц превращается в комплекс С — собственно сплайсосому, которая приступает к катализу сплайсинга.

Неясно, каким образом тройственный мяРНП U4-U5-U6 связывается с комплексом А. Этот процесс может опосредоваться взаимодействием между белками, равно как и взаимодействиями между нуклеотидами мяРНК, входящих в состав U2 и U6.

U5 взаимодействует с последовательностями на 5'- и 3'-концах сплайсингового участка за счет инвариантной петли мяРНК, входящей в его состав. Белковые компоненты U5 взаимодействуют с 3'-регионом сплайсингового участка.

После связывания с тройственным мяРНП и перед началом сплайсинга в сплайсосоме происходит множество изменений конфигурации связей РНК-РНК. Эти изменения продолжаются и в уже начавшей работу сплайсосоме. Многие взаимодействия между РНК являются взаимоисключающими, однако до сих пор неясно, что вызывает эти взаимодействия и благодаря чему соблюдается их порядок.

Первое преобразование — это, возможно, смещение U1 с 5’-конца сплайсингового участка и возникновение там связи с U6. Известно, что U1 слабо связан с действующей сплайсосомой, а также является ингибитором для образования связи между U6 и 5'-концом (показано на примере короткой цепочки РНК, содержащей 5'-экзон и 5'-конец сплайсингового участка).

Связывание U2 с ПТВ — еще один пример взаимодействия между РНК, возникающего на месте взаимодействия между РНК и белками. При связывании U2 со сплайсосомой, белок Е-комплекса SF1, связывающийся с участком ветвления, вытесняется, так как наличие U2 исключает его связывание с этим участком. Внутри самого U2 также происходят некоторые взаимоисключающие переконфигурации. Например, в его активной форме, возникает шпилька IIа, а неактивной же форме доминирует взаимодействие между шпилькой и последующим участком цепи.

Неясно, за счет чего U4 отделяется от U6. Считается, что в сборке сплайсосомы участвует несколько хеликаз, которые могут раскручивать РНК в связке U4-U6 и таким образом упрощать формирование связи U2-U6.

Связи между шпильками I и II в мяРНП U4 и U6 разрываются, и освободившийся участок шпильки II U6 сворачивается сам на себя с образованием внутримолекулярной шпильки. После этого потребность в U4 отпадает. Освободившийся участок шпильки I U6 связывается с мяРНК U2 с образованием U2-U6-спирали I. Структура спирали I, однако, взаимоисключающа с 3'-половиной участка внутренней 5’-шпильки мяРНК U2.





Рис. 3. Схема расположения кодирующих белок (экзоны, синий цвет) и некодирующих белок (интроны (серый) цвет 3' и 5' нетранслируемые области (зелёный) в гене человека CDK4

СПЛАЙСИНГ БЕЛКОВ



Введение



В настоящее время кардинально меняются многие взгляды на основы жизни. Молекулярная биология — не исключение. Например, еще лет 10–15 назад термин «катализ» связывали исключительно с белками, а «сплайсинг» — с нуклеиновыми кислотами (в основном РНК). Однако постепенно стало понятно, что каждый класс макромолекул обладает намного большей функциональностью. Например, в 1982–1983 гг. было показано, что некоторые разновидности РНК, подобно белкам, обладают каталитической активностью (они получили название рибозимов). В последние годы было открыто, что некоторые малые РНК способны регулировать и даже блокировать экспрессию генов. А в 1990 г. было обнаружено явление белкового автосплайсинга — процесса, аналогичного сплайсингу РНК. С этого момента стало ясно, что канонические законы молекулярной биологии, недавно еще казавшиеся абсолютными и незыблемыми, отражают только наиболее общие принципы живого, и должны дополняться, исправляться, а иногда и заново переписываться.

Splice (англ. «сшивать, соединять») — соединение двух отрезков верёвки или каната путём сплетения их концов (морской термин).

Сплайсинг — это процесс дозревания молекул, в результате которого из предшественника удаляется внутренняя часть с последующим лигированием (т. е. образованием ковалентной связи) фланкирующих последовательностей (т. е. тех частей молекулы, что примыкали к концам удалённой внутренней части).

Сплайсинг белков, или белковый сплайсинг - это внутримолекулярный автокаталитический процесс, происходящий в некоторых белках, при котором внутренняя часть белка (под названием интеин) выщепляется из белка-предшественника с последующим лигированием оставшихся частей. На месте сплайсинга в белке-предшественнике находится цистеин или серин, то есть аминокислота с нуклеофильной боковой группой. Известные в настоящее время реакции сплайсинга не требуют экзогенных кофакторов и источников энергии (например, АТФ или ГТФ). Словом «сплайсинг» обозначают обычно сплайсинг пре-мРНК.

Сплайсинг белков был открыт двумя группами исследователей (Анраку и Стивенса) в 1990 г. Обе группы открыли белок VMA1 дрожжей Saccharomyces cerevisiae, предшественник вакуолярной H+-АТФазы. Аминокислотная последовательность N- и С-концов VMA1 на 70% соответствует последовательности вакуолярной H+-АТФазы других организмов, тогда как центральная последовательность на 30% совпадает с дрожжевой нуклеазой НО.

Белковый сплайсинг был открыт при исследовании дрожжевого гена VMA1, кодирующего субъединицу Vma1 вакуолярной ATФазы. Оказалось, что в результате дозревания центральная часть белка удаляется, а фланкирующие ее последовательности лигируются («сшиваются» между собой). При этом для концевых последовательностей дрожжевого гена VMA1 характерна высокая степень гомологии с аналогичными последовательностями других микроорганизмов, тогда как в центральной части она нарушалась. Так стало ясно, что и у белков в некоторых случаях может происходить процесс, аналогичный сплайсингу пре-мРНК. Также как и в автосплайсинге РНК, для сплайсинга белков не требуются ни ферменты, ни кофакторы. По аналогии центральную часть белка (которая самовырезается) назвали интеином (от internal protein), фланкирующие последовательности — N- и С-экстеинами- и С-экстеинами (external protein), а весь процесс — белковым сплайсингом (рис. 1).



Рис. 1. Схематическое строение основных типов интеинов.



А. Классический интеин, содержащий эндонуклеазный домен, Б. Мини-интеин. Консервативные аминокислотные остатки, необходимые для сплайсинга, обозначены однобуквенными аббревиатурами (один остаток с N-конца интеина и триада остатков — на стыке с C-конца и C-экстеина).



Структура интеинов



Условно интеины можно поделить на две большие группы — классические интеины и мини-интеины. Классический интеин состоит из двух доменов — сплайсингового домена, который как раз и катализирует вырезание интеина из белка-хозяина и последующее его сшивание (так сказать, «заметает следы»), и центрального эндонуклеазного домена (который может разрезать ДНК по определенным сайтам), обеспечивающего так называемый «хоуминг» интеина. Хоуминг — настолько интересный процесс, что подробнее мы его рассмотрим ниже. В двух словах скажем только, что он (хоуминг) отвечает за распространение гена интеина (что даже больше похоже на размножение, если б этот термин можно было применить к отдельному белку). Мини-интеины не имеют центрального эндонуклеазного домена и хоумингом не занимаются.

Эндонуклеазный и сплайсинговый регионы образуют в молекуле интеина два пространственно разделенных домена. Сплайсинговый домен образуется N- и С-концевыми частями интеина. Он имеет характерную подковообразную форму. Концы интеина жёстко зафиксированы друг напротив друга в пространстве, и по сути формируют активный центр (АЦ), очень похожий на АЦ трипсина или любой другой сериновой протеазы. Оба конца интеина, по которым происходит разрезание, находятся около АЦ (рис. 2).





Рис. 2. Пространственная структура интеина (мини-интеин Mxe GyrA).



Сближенные концы интеина обозначены квадратом. Изображение получено из PDB-структуры 1AM2.



Современные представления о механизме белкового сплайсинга



Многими исследователями было показано, что белковый сплайсинг является аутокаталитическим процессом и для своего осуществления не требует присутствия ферментов или кофакторов. Однако определить точный механизм сплайсинга белков долгое время не удавалось — процесс происходит очень быстро, и обычными методами обнаружить промежуточные соединения не представлялось возможным. Главная проблема заключалась в том, что интеин в составе белка нельзя было даже выделить — сплайсинг проходил сразу после синтеза белка, и пока клетки собирались и лизировались — следов уже не оставалось. Решить эту задачу удалось группе Ф. Перлер (Francine Perler) довольно очевидным (как это теперь представляется) способом. Они изменяли ряд консервативных аминокислотных остатков в интеинах методом направленного мутагенеза. Как только мутации касались активного центра интеина — белковый сплайсинг блокировался на разных этапах, и в среде накапливались промежуточные продукты реакции. Например, изменение С-конца интеина вызывало накопление «разветвлённых» белков, у которых было... два N-конца. Исследование этих необычных белков и позволило предложить механизм белкового сплайсинга (см. рис. 3).





Рис. 3. Механизм белкового сплайсинга.



Событием, запускающим белковый сплайсинг, является автокаталитический N–O или N–S-сдвиг (первый аминокислотный остаток на N-конце интеина Ser или Cys, соответственно) на N-концевом сайте сплайсинга (шаг 1). В результате образуется высокореакционная эфирная или тиоэфирная связь. 

С точки зрения химии, N–O/N–S-сдвиг не является энергетически выгодным процессом, поскольку в результате реакции происходит разрыв амидной (пептидной) связи и образуется высокоэнергетическая эфирная/тиоэфирная связь. Поэтому этот процесс должен катализироваться. Действительно, протекание реакции разрыва пептидной связи на N-конце облегчается как минимум двумя факторами. Во-первых, процесс катализируется самим сплайсинговым доменом интеина. Во-вторых, на эффективность N-концевого расщепления определенное влияние оказывают экстеины. Показано, что у некоторых интеинов пептидная связь, связывающая N-экстеин и первую аминокислоту интеина, находится в редкой и не характерной для белков цис-конформации. Поскольку такая связь энергетически невыгодна, ее наличие провоцирует протекание N–О или N–S сдвига, т. е. инициирует сплайсинг. 

На втором этапе белкового сплайсинга происходит нуклеофильная атака образовавшейся эфирной связи OH- или SH-группой первого остатка С-экстеина. В результате происходит реакция трансэтерификации, т. е. перенос Н-концевого экстеина на боковую группу первого остатка С-экстеина (шаг 2). В результате образуется разветвленное промежуточное соединение (те самые белки с двумя N-концами, с помощью изучения которых был и предложен данный механизм сплайсинга). Такая перестановка приводит к смещению зарядов, что в свою очередь, индуцирует циклизацию боковой цепи Asn на С-конце интеина (шаг 3). 

Циклизация боковой группы Asn приводит к разрыву пептидной связи между интеином и С-экстеином — разветвленная структура распадается на свободный интеин и лигированные экстеины, связанные друг с другом эфирной связью (шаг 3). Последний шаг сплайсинга белка происходит спонтанно (шаги 4а и 4б).

Согласно принятой на сегодня теории, белковый сплайсинг состоит из серии последовательных перестановок. Детальными исследованиями этих перестановок занимается российский ученый Старокадомский. Но самое удивительное, что помимо цис-сплайсинга (т. е. автокаталитического удаления интеина из белка-предшественника), у многих организмов обнаружено явление транс-сплайсинга. На пальцах это можно объяснить так: у двух белков на соответствующих концах есть по половинке интеина (назовем их интеин-подобные домены, ИПД), которые, соединяясь по типу «ключ-замок», образуют вполне функциональный интеин. А этот образованный интеин вырезает сам себя, сшивая два белка в единое целое. То есть, в результате транс-сплайсинга происходит сшивание двух белков, кодируемых двумя различными генами (рис. 4). И это не лабораторная экзотика: по такому механизму, например, происходит образование белка DnaE (одна из субъединиц ДНК-полимеразы) у Synechocystis sp.





Рис. 4. Механизм транс-сплайсинга.





Рис. 5. Предполагаемый механизм сплайсинга белков

а, б - альтернативные механизмы инициации сплайсинга, N, C - N- и C- концевые экстеины белков-предшественников



Эндонуклеазная активность интеинов



Следующей удивительной особенностью интеинов (правда, не всех) является их эндонуклеазная активность. Интеин обеспечивает (с определенными ограничениями) распространение своего гена в геноме клетки. Такой процесс, как мы уже говорили, и называется хоумингом интеинов. Другими словами, интеин-белок может амплифицировать (множить) количество своих генов в клетке. Также за счет этого свойства он может обеспечивать передачу интеинового гена другим особям данного вида или передавать другим видам (т. н. горизонтальный и вертикальный перенос соответственно). Причем эволюционный анализ распространения разных интеинов (а их открыто больше 1000, причем и у прокариот, и у низших эукариот) свидетельствует, что интеины распространяются довольно активно, и притом, оказавшись в разных видах, могут мутировать и менять последовательность. В общем, интеины в данном случае ведут себя подобно транспозонам или даже примитивным вирусам (если такое в принципе можно сказать про белки). Хотя... ряд вирусов также несет в себе интеины. Например открытый недавно гигантский Мими-вирус имеет интеин (APMV Pol) в гене ДНК-полимеразы.

Механизм хоуминга схематически показан на рис. 6. На самом деле, хоуминг — это не такая уж экзотика. Хоуминг-эндонуклеазы были известны еще до открытия интеинов. Это большой класс сайт-специфических ДНКаз, которые часто кодируются мобильными генетическими элементами.

Хоуминг интересен в первую очередь тем, что обеспечивает так называемый «горизонтальный» перенос гена — т. е. перенос последовательности в гомологичные области других видов. Осуществляется это, вероятнее всего, вирусами. Действительно, интеины чаще всего встречаются в белках, вовлечённых в метаболизм нуклеиновых кислот (полимеразы, лигазы, гиразы, хеликазы, белки репарации ДНК и т. п.). А ведь это те белки, которые присутствуют у вирусов и фагов! В общих чертах механизм горизонтального переноса можно описать так: дополнительные копии ДНК, которые появляются во время формирования новых вирусов, могут узнаваться как мишень для хоуминга. Интеин катализирует перенос своей последовательности в вирусную ДНК. Таким образом ген попадет в вирус, а вирус во время следующей инфекции может внести его в геном другого, близкого вида. Так гены интеинов могут путешествовать по видам. Однако тут стоит отметить, что распространяются они только между одноклеточными организмами — у многоклеточных они пока не найдены. Зато обнаружено несколько семейств ферментов и молекул, активирующихся по механизмам, похожим на белковый сплайсинг. Произошли ли они от предков интеинов или возникли самостоятельно — пока что неизвестно.





Рис. 6. Принципиальный механизм хоуминга интеинов.



Интеин катализирует двухцепочный разрыв в аллеле(-) в точке интеиновой вставки. При этом образуется 3’-выступающий конец длиной 4 нуклеотида («липкий» конец). Далее клеточными ферментами проводится репарация двухцепочечного разрыва с использованием в качестве матрицы аллельной ДНК, содержащей последовательность интеина. Это обеспечивает его перенос в аллель(-). Поскольку исходной аллелью может быть и плазмидная, и вирусная ДНК, таким способом может обеспечиваться и горизонтальный перенос, что позволяет интеинам распространяться и сохраняться (или даже «выживать», если б такой термин можно было применить к полипептиду). Однако на самом деле процесс хоуминга происходит довольно редко в силу ряда обстоятельств.



Использование интеинов в биотехнологии



На мой взгляд, интеины являются одним из наиболее удачных и перспективных инструментов в биотехнологии белков и протеомных исследованиях. Мы коротко рассмотрим основные из методов, а также самые экзотические из них — например, создание белков-«колечек» или способ контроля размножения генно-модифицированных растений.



Очистка рекомбинантных белков



После открытия феномена белкового сплайсинга внимание исследователей сразу привлек факт самодостаточности интеина и точности его самовырезания. Т.е., если пришить интеин на уровне гена к интересующему нас белку (белок-Х), то теоретически мы сможем экспрессировать слитый белок (интеин–белок-Х), который при определенных условиях разрежется (интеин + белок-Х). Если же вставить интеин между двумя белками (белок-Х–интеин–белок-Y), то в результате можно получить сшитый двойной белок (белок-Х–белок-Y). Логичным является вопрос: а можно ли использовать для этих целей искусственный интеин с аффинной меткой (*–интеин)? Это бы позволило очистить полученный продукт (*–интеин–белок-Х), а потом отделить от белка-Х его метку (*–интеин). В результате мы получили бы целевой белок без каких-либо дополнительных модификаций. В целом интеин-опосредованная очистка предлагает все преимущества аффинной хроматографии (быстрая и эффективная очистка меченного белка), позволяя обойти главный недостаток этого метода — необходимость точного и стопроцентного отщепления аффинной метки от уже чистого препарата.

Тщательное исследование показало, что это действительно возможно. Сейчас созданы несколько систем на основе разных интеинов, которые несут His-tag, хитин-связывающий домен бактерий (CBD) и другие классические аффинные метки. Ряд из них уже коммерчески доступены (например системы IMPACT, IMPACT-СН, TWIN-IMPACT фирмы NEB). Аналогичные системы создаются и в России. Потенциал таких технологий огромен — в первую очередь потому, что позволяет упростить очистку рекомбинантного белка до одного этапа (против 4–5 этапов на ионно-обменных носителях, какие используются в многих фармацевтических производствах) и не требует изменений самого целевого белка (обязательных при использовании традиционных аффинных меток, которые внедряются в сам белок).



Использование белкового сплайсинга для создания биосенсоров



После открытия того, что с помощью интеина можно биологически приемлемо сшить два разных белка, начались работы по созданию нового типа биосенсоров. Главной проблемой в этой области является сложность иммобилизации сенсорного белка на поверхности (т. е. покрытие им поверхности сенсора так, чтобы белок не утратил работоспособности). С помощью интеинов можно «сшивать» между собой два разных белка, один из которых может служить молекулярным якорем, связываясь с нужной поверхностью, а второй — самим сенсором. Так, например, с помощью такой технологии удалось сшить мальтоза-связывающий белок (МВР) и Т4 ДНК-лигазу. В результате активность Т4-лигазы сохранилась, а пришитый МВР позволяет её закрепить или очистить на поверхности биосенсора. Другая технология — протеомный микроанализ (protein microarray) — требует создания матриц, на которых были бы ковалентно пришиты определённые белки-маркёры. Проблема заключается в том, что, с точки зрения технологичности (т.е. простоты хранения, транспортировки и использования), белки должны быть пришиты ковалентно. При этом они, естественно, не должны терять активности (что проблематично, поскольку на твёрдых поверхностях белки часто слипаются и инактивируются) и не содержать примесей (которые могут искажать результаты). Поэтому интеины как посредники, которые могут нативно сшивать целевой белок с любой поверхностью, модифицированную каким-то образом (например, покрытую недорогим серосодержащим полимером), являются весьма ценным инструментом. Первые работы в этой области уже дали довольно хорошие результаты. Эти работы позволяют надеяться, что в ближайшем будущем мы получим мощный инструмент для анализа белок-белковых взаимодействий и картирования протеома организма — ведь это, как известно, следующая глобальная задача после картирования генома.



Циклизация ферментов



Такое трудно даже представить. Однако это осуществлено — белок «скрутили в баранку» без начала, без конца. Для этого был использован феномен транс-сплайсинга, только интеин-подобные N- и С- домены находились не в разных белках, а на разных концах одного белка. Методика, с помощью которой возможно циклизировать белки, получила название SICLOPPS (Split Intein-mediated Circular Ligation Of Peptide and ProteinS). Кстати, закольцованный таким способом фермент (со сложным названием дегидрофолатредуктаза), после этого не только не потерял своей активности, но даже наоборот — стал менее чувствительным к изменению температуры среды. А в промышленности, где из-за больших объемов температуру реакции контролировать намного сложнее, такие катализаторы будут очень востребованы.



Экспрессия токсичных для клетки продуктов



Часто эукариотические белки, экспрессируемые в клетках прокариот, убивают организм-продуцент. Это явление называется токсичностью. Из-за неё ряд практически важных белков (например, протеазы) в достаточных количествах наработать в бактериях не удается. Использование систем экспрессии на основе интеинов может решить эту проблему. Токсичные для клетки белки можно нарабатывать в виде неактивных химерных предшественников, слитых с интеинами. Последние нарушают структуру продукта и не дают ему активироваться. После наработки такие химерные белки очищаются и активируются путем индукции самоудаления интеина из их структуры.


Заключение



До сегодняшнего дня считается, что сплайсинг в живых клетках протекает непосредственно после трансляции. Это относится и к цис- и к транс-вариантам. Вероятно последним требуется какое то время для встречи и объединения ИПДоменов. Но в литературе отсутствуют данные о том, что в какой-либо клетке наблюдался пул белков с и без интеина - интеины обнаруживаются только после секвенирования генома. 

В биотехнологии ситуация другая - в большинстве случаев именно требуются интеины, активностью которых можно было бы управлять. Это достигается заменой либо первого цистеина, либо последнего аспарагина на аланин. Кроме того, часто замена природных экстеинов на биотехнологические продукты уже тормозит активность интеина. Соответственно в обоих случаях мы можем выделить интеин-содержащий конструкт и потом активировать сплайсинг - чаще всего добавлением тиольных агентов, которые исполняют роль цистеина или серина.

Сплайсинг нуклеиновых кислот является одним из мощнейших способов быстрой перетасовки наследственной информации, что в некоторых случаях помогает живым организмам быстро приспособиться к изменившимся условиям. Поэтому его обнаружение у белков еще раз подтвердило универсальный для всего живого принцип «разумной бережливости» — удачные процессы, характерные для одних типов молекул, часто обнаруживаются и у других (в данном случае — и у нуклеиновых кислот, и у белков).

Механизмы белкового сплайсинга до сих пор до конца не изучены. И особенно это относится к возможным функциям интеинов в клетке. О том, что дают интеины клеткам, что с ними происходит после сплайсинга, как часто происходит явление сплайсинга или хоуминга — до сих пор не известно. Это дает широкое поле для исследований. Однако бесспорно одно — явление белкового сплайсинга дает еще бульшую гибкость и приспособляемость организмам, поскольку позволяет уже пост-трансляционно изменять продукт гена (или генов). Мы видим, что к известным, и без того изощрённым и многогранным, механизмам живой клетки добавляется еще один. И по всей вероятности — далеко не последний. 


Список литературы



1.http://ru.wikipedia.org/wiki/Сплайсинг

2.http://ru.wikipedia.org/wiki/Сплайсосома#.D0.A1.D0.BF.D0.BB.D0.B0.D0.B9.D1.81.D0.B8.D0.BD.D0.B3_.D0.A0.D0.9D.D0.9A 

3.http://ru.wikipedia.org/wiki/Сплайсинг_белков

4.Старокадомский П.Л. Теория и механизм сплайсинга//Молекулярная биология, Москва, 2007

5. Сплайсинг белков на сервере «Биология человека» (в интернете); 

6. Старокадомский П. Л. Белковый сплайсинг // Молекулярная биология (Москва), 2007, том 41, № 2, c. 314–330. (в интернете); 

7. Старокадомский П. Л. Белковый сплайсинг // Укр. биох. журн., 2005, № 4, с. 14–29; 

8. Сайт «биомолекула»: «Геном человека: как это было и как это будет»; 

9. Сайт «биомолекула»: «Белки против РНК: кто первым придумал сплайсинг?»