Микробиологические методы исследования водоемов

Микробиологические методы исследования водоемов.

Микроорганизмы, обитающие в водной толще, осуществляют процессы минерализации органических веществ, а также взаимопревращения соединений азота, фосфора, железа, марганца и др.

Пробы для микробиологических анализов берут в тех точках и в те же сроки, которые намечены для гидробиологических исследований. Обязательным условием микробиологических анализов является соблюдение стерильности. Поэтому пробу воды отбирают в стерильные бутылки, предварительно вымытые хромовой смесью. Отобранная проба закрывается ватной пробкой с марлевой салфеткой, поверх накладывается салфетка из жесткой бумаги и завязывается ниткой.

Проба воды зачерпывается бутылкой, погружаемой на глубину 5-10 см.

Прямые методы учета микроорганизмов 

При прямом микроскопировании воды количество обнаруживаемых микроорганизмов оказывается небольшим. Поэтому для изучения морфологического разнообразия и оценок их общего числа в единице объема можно провести концентрацию пробы. Для этого используют мембранные фильтры с размерами пор 0,35;0,5;0,23;0,3;0,40 мкм. Перед использованием их кипятят в течение 20-30 минут в дистиллированной воде в закрытом сосуде, в котором их и сохраняют.

Для фильтрации воды используют фильтры Зейтца или иной конструкции. Фильтрацию осуществляют под вакуумом. Перед фильтрацией в воду добавляют акридин-оранж (0,4%) из расчета 0,01% в 0,02 м трисбуфере и выдерживают 3 минуты до полного окрашивания. Объем фильтруемой воды может быть от 10 до 20 мл в зависимости от типа водоема. Мембранный фильтр извлекают из фильтрующего аппарата и подсушивают на фильтровальной бумаге под стеклянным колпаком. После этого помещают на каплю иммерсионного масла на предметном стекле. Вторую каплю масла наносят сверху и прикрывают покровным стеклом. Препарат рассматривают в люминесцентном микроскопе.

При использовании МБР или других люминесцентных микроскопов процедура подготовки пробы для счета иная. После отфильтровывания неокрашенной пробы фильтр подсушивают на фильтровальной бумаге на воздухе. Высушенные фильтры окрашивают карболовым эритрозином (5% эритрозин в 5% карболовой кислоты в 100 г воды) в течение 4-24 часов. Для этого в чашку Петри помещают кружок фильтровальной бумаги и увлажняют краской. На нее нижней строной кладут фильтры и закрывают крышкой. После окрашивания фильтры отмывают, перекладывая их на влажную фильтровальную бумагу до тех пор, пока фильтр будет оставлять на бумаге лишь розового цвета. При этом площадь фильтра должна быть розовой, а края бесцветными. Затем фильтр высушивают при комнатной температуре.

Для подсчета численности микроорганизмов фильтр переносят на предметное стекло в каплю иммерсионного масла (можно использовать 1/4 или 1/2 фильтра). Сверху наносят еще каплю масла и микроскопируют с перемещением сетчатого микрометра. Подсчет ведут в 20 полях зрения. Следует избегать подсчитывать микроорганизмы в близко расположенных полях зрения. В каждом поле зрения должно быть не менее 50 микробов, иначе число полей зрения необходимо увеличить.

Расчет численности бактерий проводится по формуле:

N=Kn/V

где S - число бактерий в 1 мл воды;

K=S/S1

где S - площадь фильтра, мкм2, S1 - площадь, на которой просчитываются клетки, мкм2; n - среднее число бактерий в одном поле зрения; V - объем профильтрованной воды, мл.

Для определения биомассы бактерий необходимо провести измерение размеров клеток. Промеры используются для расчетов объемов клеток, которые приравниваются к подобным геометрическим фигурам (шар, цилиндр, эллипсоид). Для определения среднего размера клеток делают примеры 10 клеток каждой размерной группы (крупные, средние, мелкие). Для поправки на "усыхание" полученный объем умножают на 1,6.

Учет микроорганизмов с применением питательных сред 

Выделение микроорганизмов и их учет производится высевом проб в жидкие и агаризированные питательные среды. Посевы способом вливания или рассевом на поверхности. В первом случае в чашку вносят 0,1 см3 пробы воды и заливают теплым агаром круговыми вращениями чашки по столу. При рассеве по поверхности агара шпателем, равномерно распределяя ее. Высевы дублируют 2-3 раза. Засеянные чашки выдерживают в термостате при температуре 30-35 С. После прорастания колоний производят их подсчет. Время инкубации для учета разных групп микроорганизмов оказывается разным. 

Учет сапрофитных бактерий 

Для учета используют питательный агар (МПА). Готовят его на мясном бульоне, добавляя на 1 л 10 г пептана, 5г NaCl и 20г агар-агара. Посевы делаются таким образом, чтобы на чашке росло не меньше 40 и не больше 100 колоний бактерий.

Учет олиготрофных бактерий 

В качестве питательной среды используется агаризированная вода из водоема. В среду вносят агар для получения 1,5-2% раствора. Учет производится после 1-10 дней инкубации заселенных чашек при температуре 30 С.

Для оценки роли бактериопланктона в деструкции органических веществ в водоеме следует определить интенсивность дыхания бактериального сообщества. Проба воды отфильтровывается от фито- и зоопланктона через "предварительный" (№ 6) фильтр и помещается в две темные кислородные склянки; для определения суммарного потребления кислорода бактериопланктоном, параллельно с этим в склянки наливают нефильтрованную воду. Все склянки помещают в водоем и экспонируют в течении суток. В начале и в конце суток во всех склянках учитывается численность бактерий и рассчитывается их средняя величина за время опыта в фильтрованной и не фильтрованной воде. По разности содержания кислорода в фильтрованной воде в конце и начале опыта определяют количество кислорода, потребленного бактерио-планктоном за время. 

На основании этого рассчитывается потребление кислорода одной бактериальной клеткой за единицу времени. По формуле Бьюккенена и Фульмера.

Использование микробов для оценки качества вод

Чаще всего для оценки качества вод используется так называемое микробное число. Это число клеток аэробных сапрофитных организмов в 1 мл воды. В водопроводной воде согласно ГОСТу микробное число не должно превышать 100. В чистых водоемах число сапрофитов может исчисляться десятками или сотнями, а в загрязненных и грязных водоемов этот показатель достигает сотен тысяч и миллионов.

Помимо микробного числа для оценки степени загрязненности водоемов используются данные по видовому составу микроорганизмов.

С позиции санитарной гидробиологии оценка качества воды проводится с целью определения ее санитарно-эпидемиологической опасности или безопасности для здоровья человека. Вода играет важную роль в передаче возбудителей многих инфекций, главным образом кишечных. Прямое количественное определение возбудителей всех инфекций для контроля за качеством воды неосуществимо в связи с многообразием их видов и трудоемкостью анализа. В практической санитарной микробиологии поэтому прибегают к косвенным методам, позволяющим определить потенциальную возможность заражений водоемов патогенными микроорганизмами. Для этого служит число бактерий кишечной палочки, они являются постоянными обитателями кишечника человека и животных, постоянно и в большом количестве выделяются во внешнюю среду. Наличие коли-форм в воде говорит о ее фекальном загрязнении, а их число позволяет судить о степени этого загрязнения.

В случае оценки качества воды в водоемах без существенного загрязнения высевается 1 мл воды, при анализе сточной или загрязненной природной воды производя посев предварительно разбавленной пробы. Анализ водопроводной воды или чистой природной воды проводят после предварительного концентрирования воды на мембранных фильтрах.

Результат выражают в виде коли-индекса числа бактерий в 1 л воды. Иногда делают пересчет, определяя коли-титр - наименьший объем воды (в мл), содержащий одну кишечную палочку. Коли-титр = 1000/коли-индекс.