Активность основных карбокмипептидаз в тканях пренатально алкоголизированных крыс

1



2



ПЕНЗЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ В. Г. БЕЛИНСКОГО



На правах рукописи

Мухина Елена Станиславовна









АКТИВНОСТЬ ОСНОВНЫХ КАРБОКСИПЕПТИДАЗ В ТКАНЯХ ПРЕНАТАЛЬНО АЛКОГОЛИЗИРОВАННЫХ КРЫС





03.00.04 – Биохимия



Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор биологических наук профессор Генгин М. Т.









ПЕНЗА 2003


СОДЕРЖАНИЕ



СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ………………………………….……………….…...4

ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………….….……5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………….…...8

1.1. Влияние хронической алкоголизации на организм ……………………...8

1.2. Влияние пренатального хронического воздействия этанола на организм…………………………………………………………………..……..16

1.3. Ферменты обмена регуляторных пептидов …………………………...…21

1.3.1. Биологическая роль пептидаз…………………………….……………..21

1.3.2. Карбоксипептидаза Н…………………………………………………....23

1.3.3. ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза………….……..……………28

1.4. Регуляторные пептиды и ферменты их обмена в онтогенезе…...…..….31

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ………………….37

2.1. Материалы исследования…………………………………………..……...37

2.2. Методы исследования………………………………………………………37

2.2.1. Моделирование хронического потребления этанола………………....37

2.2.2. Метод определения активности ферментов……………………….…..38

2.2.3. Метод проведения теста «открытое поле»…………………….……....39

2.2.4. Статистическая обработка результатов исследования………………....40

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ……………………….……..…41

3.1. Исследование активности основных карбоксипептидаз в тканях крыс разного возраста, испытавших пренатальное воздействие этанола...……….41

3.1.1. Исследование активности карбоксипептидазы Н в тканях пренатально алкоголизированных крыс разного возраста………..……………………….41

3.1.2. Исследование активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях пренатально алкоголизированных крыс разного возраста………….49

3.2. Исследование влияния хронической алкоголизации на активность основных карбоксипептидаз в тканях взрослых крыс, испытавших пренатальное воздействие этанола……………………...……………………..57

3.2.1. Исследование поведения пренатально алкоголизированных животных в тесте «открытое поле»………………………………………………..…………57

3.2.2. Исследование влияния хронической алкоголизации на активность карбоксипептидазы Н в тканях взрослых крыс, испытавших пренатальное воздействие этанола………………………….……………………………..…..61

3.2.3. Исследование влияния хронической алкоголизации на активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях взрослых крыс, испытавших пренатальное воздействие этанола ……………………………..68

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ……………74

ВЫВОДЫ…………………………………….…………………………………..88

ЛИТЕРАТУРА….………………………………………………………………..91


СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ



АДГ – алкогольдегидрогеназа

АКТГ – адренокортикотропный гормон 

АПМЯК – аминопропилмеркаптоянтарная кислота

АПФ – ангиотензинпревращающий фермент

ВИП – вазоактивный интестинальный пептид

ВНД – высшая нервная деятельность

ГАМК – гамма-аминомасляная кислота

ГОМК – гамма-оксимасляная кислота

ГГС – гипоталамо-гипофизарная система

ГГГС – гипоталамо-гипофизарно-гонадная система

ГГНС – гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система

ГПЯК – гуанидинопропилянтарная кислота

ГЭМЯК – гуанидиноэтилмеркаптоянтарная кислота

КП – карбоксипептидаза

КПN – карбоксипептидаза N

КПВ – карбоксипептидаза В

КПН – карбоксипептидаза Н

КРФ – кортикотропин-рилизинг фактор

НАД – никотинамидаденин динуклеотид

НАДФ – никотинамидадениндинуклеотид фосфат

ПОМК – проопиомеланокортин

Р0, Р14, Р28, Р45, Р120 – возраст животных (0, 14, 28, 45 и 120 суток после рождения, соответсвенно)

ФМСФ – фенилметилсульфонилфторид

ФМСФ-КП – фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая карбоксипептидаза

ЦНС – центральная нервная система

ЭДТА – этилдиаминтетраацетат натрия


ВВЕДЕНИЕ



Для современной биологии и медицины имеет особую значимость исследование общих и частных закономерностей развития алкоголизма. Решение указанных вопросов позволит раскрыть патогенетические механизмы этого заболевания и разработать эффективные способы его профилактики и лечения.

Одним из важных аспектов проблемы алкоголизма является исследование нарушений, происходящих в организме потомков алкоголиков, и формирования у них предрасположенности к алкоголизму. При этом вызывают интерес процессы, происходящие в онтогенезе. Известно, что в ходе индивидуального развития организма происходит зависящая от пола перестройка различных функциональных и, особенно, регуляторных систем: нервной и эндокринной [12]. Эта перестройка сопровождается значительными изменениями в функционировании пептидергических систем, например опиоидных, что, несомненно, связано с изменением активности ферментов, участвующих в обмене биологически активных пептидов [1, 25, 52, 55, 76, 212, 278].

Биологически активные пептиды функционируют в качестве гормонов, нейрогормонов, нейромодуляторов, нейромедиаторов [76], вовлекаясь в регуляцию практически всех процессов, протекающих в организме, а также в развитие многих патологических процессов [76, 120]. Известна роль многих регуляторных пептидов, особенно опиоидных пептидов, в патогенезе алкоголизма [7, 13, 18, 62, 69, 120, 128, 272].

Уровень биологически активных пептидов в организме во многом зависит от активности ферментов, участвующих в процессинге их предшественников, модуляции и инактивации [35, 48, 52, 56, 115, 126, 140, 142, 160, 172, 174, 205].

К ферментам, участвующим в метаболизме регуляторных пептидов, относятся, в частности, основные карбоксипептидазы – это экзопептидазы, катализирующие отщепление остатков аргинина и лизина с С-конца пептидов. К ним относятся карбоксипептидаза В (КФ 3. 4. 17.1 ), карбоксипептидаза Н (КФ 3. 4. 17. 10), карбоксипептидаза М (КФ 3. 4. 17. 12), карбоксипептидаза N (КФ 3. 4. 17. 3), лизосомальная карбоксипептидаза В (КФ 3. 4. 17. 2), ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза и некоторые другие.

На настоящий момент возрастные и половые изменения активности ферментов обмена регуляторных пептидов, происходяшие в онтогенезе у потомков алкоголиков не изучены. Также нет данных об изменениях активности этих ферментов у пренатально алкоголизированных особей при последующем воздействии этанола в постнатальном периоде.

Целью нашей работы было изучение роли основных карбоксипептидаз в развитии предрасположенности к формированию алкогольной зависимости у потомков алкоголиков.

При выполнении работы были поставлены следующие задачи:

Исследовать активность карбоксипептидаз Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях пренатально алкоголизированных животных разного возраста.

Исследовать влияние хронической постнатальной алкоголизации на активность основных карбоксипептидаз в тканях взрослых крыс, подвергавшихся и не подвергавшихся воздействию этанола в эмбриональном периоде жизни.

Сравнить влияние алкоголизации на активность КПН и ФМСФ-КП у животных разного пола.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые изучено влияние пренатальной алкоголизации на активность КПН и ФМСФ-КП в тканях самок и самцов крыс. При этом исследована ферментативная активность как у взрослых животных, так в период их полового созревания. Установлена зависимость изменения активности КПН и ФМСФ-КП от пола и возраста животных. Показано половое отличие изменения активности ферментов в тканях пренатально алкоголизированных животных при постнатальной хронической этанольной интоксикации.

Полученные результаты представляют интерес для понимания механизмов функционирования пептидэргических систем и роли основных карбоксипептидаз в норме и при алкоголизме.

Положения, выносимые на защиту:

На основе анализа возрастной динамики, регионального распределения активности карбоксипептидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы и сравнения их с уровнем биологически активных пептидов, обсуждается биохимическая функция данных ферментов.

Пренатальная алкоголизация вызывает изменение активности исследованных ферментов в мозге и периферических тканях животных обоего пола в процессе развития.

Пренатальная алкоголизация модулирует изменение активности КПН и ФМСФ-КП при последующей постнатальной алкоголизации взрослых особей.

Предложена гипотетическая схема одного из возможных механизмов формирования предрасположенности к алкоголизму у пренатально алкоголизированных особей с участием исследованных ферментов.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на 2-ой Всеросийской научно-практической конференции (Волгоград, 2003) и итоговых научных конференциях профессорско-преподавательского состава Пензенского Государственного Педагогического Университета (2002, 2003 г.г.). По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из 6 разделов: введение, обзор литературы по теме диссертации, материалы и методы исследований, результаты, обсуждение, выводы. Работа изложена на 122 страницах, иллюстрирована 16 рисунками и 13 таблицами. Список литература содержит 353 наименования на русском и иностранных языках.


ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ



1.1. Влияние хронической алкоголизации на организм



Эндогенные этанол и ацетальдегид являются одной из важных метаболических систем организма животных и человека, обмен этих веществ – неотъемлемая часть систем поддержания гомеостаза [21, 24, 63, 71, 92, 176, 184, 314, 329].

Экзогенный этанол, поступающий в организм животных и человека, окисляется тремя ферментативными системами: 1) алкогольдегидрогеназой с участием НАД, метаболизирующей 75-90 % поступившего этанола; 2) микросомальной этанолокисляющей системой с участием НАДФ и О2, окисляющей ~ 10 % этанола; 3) каталазой, окисляющей ~ 2 % этанола [78, 81, 82, 89, 336]. 

При хронической алкоголизации происходит изменение активности ферментов окисления этанола, что приводит к нарушению баланса между образованием и утилизацией ацетальдегида, что в свою очередь существенно сдвигает уровень ацетальдегида в крови [14, 24, 58, 97]. 

Важно отметить существование половых генетических отличий активности ферментов, участвующих в метаболизме этанола [15, 22, 105, 107, 197].

Этанол и его метаболиты влияют на белки нервной ткани, печени, крови, сердца и др. тканей [98].Отмечаются зависящие от дозы и длительности воздействия этанола, нарушения белкового синтеза и катаболизма [112]. Эти изменения отличаются в различных отделах мозга и субклеточных структурах [2, 23, 61].

Формирование алкоголизма сопряжено с нарушением ряда физиологических функций, в регуляции которых значительную роль играют эндогенные олигопептиды. Выявлено участие отдельных олигопептидов (окситоцина, вазопрессина, нейротензина, бомбезина, дельта-сон-индуцирующего пептида, холицистокинина, опиоидных пептидов, АКТГ и др.) в развитии толерантности и физической зависимости от этанола, а также в формировании алкогольного абстинентного синдрома. Установлено участие биологически активных пептидов (ангиотензина-ІІ, брадикинина, β-эндорфина, энкефалинов и дельта-сон-индуцирующего пептида) в механизмах формирования и реализации алкогольной мотивации [65]. Так, известно, что хронический этанол усиливает секрецию АКТГ и пролактина и снижает секрецию соматотропного гормона [3, 297], увеличивает экспрессию мРНК КРФ в гипоталамусе [297], увеличивает концентрацию КРФ и АКТГ в ГГС [98]. По другим данным [296] хроническая алкоголизация снижает содержание КРФ в гипоталамусе. Также отмечается повышаение уровеня мРНК препротахикинина в вентральной оболочке, без изменения его в стритуме [260], нарушение синтеза в мозге дельта-сон-индуцирующего пептида [24]. Ацетальдегид стимулирует синтез КРФ и экспрессию мРНК аргинин-вазопрессина в паравентрикулярном ядре гипоталамуса [228].

Особо важно отметить влияние этанола на эндогенную опиоидную систему организма и ее участие в патогенезе алкоголизма. Причастность опиоидных пептидов к реализации эйфорического эффекта, эмоционального восприятия, условнорефлекторной и других форм ВНД с одной стороны, и предположения о реализации через пептидергические нейроны, эпилептиморфных свойств этанола, а также характерных для синдрома алкогольной абстиненции тремора, судорог и галлюцинаций с другой, свидетельствуют о существенной роли опиоидных пептидов в патогенезе алкоголизма [80].

Установлено, что хроническое употребление алкоголя заметно снижает плотность и сродство опиатных рецепторов к своим природным лигандам [79, 133, 135]. Отмечается влияние эстрадиола и прогестерона на этот эффект этанола в гипоталамусе, среднем мозге и коре, что частично объясняет половые отличия алкогольных эффектов [133].

При хронической алкогольной интоксикации снижается содержание некоторых опиоидных пептидов в отделах мозга [9, 18, 24, 84, 146, 348], что является отражением процесса адаптации опиоидной системы к избыточной стимуляции, приводящей к снижению функциональной активности этой системы [9, 18, 84].

Обращает на себя внимание несогласованное снижение уровней разных опиоидных пептидов под действием хронической алкоголизации в разных отделах мозга [9, 18, 24, 84, 146, 348] и данные даже об увеличении концентрации β-эндорфина [98] и экспрессии мРНК ПОМК [228]. Панченко Л. Ф. с соавт. [80] считают, что с такого дисбаланса в опиоидной системе мозга начинается формирование зависимости и толерантности к алкоголю, далее в процесс вовлекаются сопряженные с ней нейромедиаторные и нейромодуляторные системы мозга, что нарушает слаженную работу мозга в целом. Абстинентный синдром усугубляет опиоидный дефицит [125, 198].

Опосредование механизмов действия этанола на организм через нейропептиды подтверждается также данными о влиянии биологически активных пептидов на потребление алкоголя и изменение ими эффектов, вызванных этанолом. Так холецистокинин, бомбезин [235, 233], тиролиберин [234], кортикотропин-рилизинг фактор [120], ангиотензин ІІ, брадикинин, Leu-энкефалин, энкефалиноподобный тетрапептид, дельта-сон-индуцирующий пептид [65], Met-энкефалин [54] снижают потребление алкоголя; вазоактивный интестинальный полипептид, нейропептид Y, галанин, β-эндорфин увеличивают потребление этанола [235]; вещество Р частично нормализует нарушенные этанолом центральные механизмы реакции избегания [60;].

Важным хроническим действием этанола на нейропептиды является изменение активности различных ферментов их обмена [11, 67, 211, 324, 332].

Отмечается увеличение активности КПН в гипофизе [28, 32, 45], гипоталамусе и стриатуме крыс [28, 32]; уменьшение активности АПФ в гипоталамусе и стриатуме [28]. Хроническая алкоголизация и ее отмена увеличивают активность АПФ в гипофизе и стриатуме немурицидных крыс и в гипофизе мурицидных крыс [53]; увеличивают активность КПН в гипофизе, стриатуме и среднем мозге у немурицидных крыс [53]. Исходно различная активность ферментов в мозге для мурицидных и немурицидных крыс выравнивается в процессе потребления этанола и его отмены до уровня, характерного для мурицидных крыс [53]. 

Совместное воздействие этанола и стресса вызывает гиперактивацию КПН в гипоталамусе, стриатуме и среднем мозге крыс [32].

Хроническое воздействие этанола повышает активность КПН в гипофизе и стриатуме предпочитающих воду и предпочитающих этанол крыс и снижает ее в гипоталамусе и таламусе предпочитающих воду крыс; увеличивает карбоксипептидазо-В подобную активность в среднем мозге и стриатуме крыс; увеличивает активность АПФ в гипофизе и стриатуме и снижает в гипоталамусе и таламусе предпочитающих воду крыс [54].

Активность этих ферментов (КПН, АПФ) изменяется в направлении, которое способствует повышению уровня биологически активных пептидов [28].

Хроническая алкоголизация вызывает повышение активности ферментов, участвующих в метаболизме β-эндорфина в среднем и переднем мозге мышей [146], увеличение активности энкефалинконвертазы А в среднем мозге, гипоталамусе и стриатуме крыс [19].

По данным Беляева Н. А. с соавт. [20] хроническая алкоголизация вызывает в коре больших полушарий снижение удельной активности растворимой и мембраносвязанной форм энкефалинконвертазы, а в стриатуме – снижение удельной активности растворимой и увеличение активности мембраносвязанной формы фермента. Привлекает внимание, что, и изменение общей ферментативной активности имеет сходную направленность. Нарушения, происходящие при хронической алкоголизации, могут быть вызваны как снижением способности фермента гидролизовать субстрат, так и совместным изменением каталитических свойств фермента и его содержания в соответствующем биологическом образце. Авторы полагают, что изменение активности фермента происходит из-за нарушения метаболизма фермента, а в случае мембраносвязанной формы фермента, возможно, и изменения липидного состава нейрональных мембран.

Следует подчеркнуть, что максимальное изменение активности энкефалинконвертазы, КПН, АПФ и др. ферментов обмена нейропептидов обнаружены в среднем мозге, гипоталамусе, стриатуме – отделах, имеющих наиболее важное значение для развития толерантности к алкоголю и зависимости от него. Представляется вероятным вовлечение этих ферментов в патогенез алкоголизма. 

Некоторые противоречия данных, касающихся изменения активности ферментов обмена нейропептидов и несогласованность с изменением уровня нейропептидов, в частности, Leu-энкефалинов и Met-энкефалинов в зонах мозга животных и человека, длительно потребляющих этанол, значительно зависят от сроков и формы применявшейся нагрузки этанолом (с пищей, искусственное введение внутрь, добровольное потребление) [12, 54]. Отмечается так же, что количество определяемого пептида является, по сути, интегративной величиной соотношения нейропептидобразующей и нейропептиддеградирующей активности в конкретном нейрональном регионе. Непосредственное определение активности пептидаз, проведенное в единичных исследованиях показывает неоднозначность таких изменений, трактовка которых представляется затруднительной.

При хронической алкоголизации в мембранах клеток происходит уменьшение степени ненасыщенности липидов мембран, увеличение в мембранах содержания холестерина, уменьшение количества мембраносвязанных аминогликанов. Эти физико-химические изменения, не зависящие от тканевой принадлежности клеток (кровь, печень, центральная нервная система), позволяют компенсировать флюидизирующее действие этанола и лежат в основе механизмов развития толерантности клеток к воздействию этанола при его хроническом потреблении [12].

Изменения фазового состояния мембраны оказывают существенное влияние на процессы мембранного транспорта, на системы трансмембранной передачи информации, на активность мембраносвязанных ферментов [51, 91, 252, 265].

Анализ функционального состояния ГГНС у здоровых и страдающих алкоголизмом людей, а также данные, полученные в экспериментах на разных животных под влиянием хронической алкогольной интоксикации, свидетельствуют о выраженном влиянии этанола на разные компоненты этой системы [24, 66].

При хронической алкоголизации наблюдается изменение функционирования ГГНС. Вначале происходит нарушение на уровне гипоталамуса и гипофиза. Это приводит к гиперсекреции АКТГ, который действует на клетки коры надпочечников, стимулируя синтез кортикостероидов [24, 123, 222, 276, 320, 321]. Затем фаза первичного повышения секреции этих гормонов сменяется развитием толерантности, адаптации ГГНС к стимулирующему действию этанола [24, 122, 209, 321]. Причем снижение функционирования ГГНС, наблюдаемое у экспериментальных животных носит возрастозависимый характер [189, 345]. Развитие относительной недостаточности адренокортикальной функции при алкогольной интоксикации обусловлено прямым токсическим действием алкоголя и продуктов его метаболизма на продукцию глюкокортикоидов в надпочечниках и влиянием на процессы биосинтеза и высвобождения АКТГ в гипофизе, а также на нейротрансмиттерные системы, регулирующие синтез и высвобождение кортиколиберина в гипоталамусе [24].

Кроме АКТГ, хроническая алкоголизация влияет и на другие пептиды ГГНС [276, 290, 304].

Хроническая алкоголизация снижает уровень лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов в плазме крови у самок и самцов крыс [298, 305]. У самцов при этом в гипофизе не изменяется концентрация этих гормонов и гонадотропин-рилизинг гормона, но снижается количество пролактина. В семенниках снижается содержание рецепторов лютеинизирующего гормона, повышается содержание рецепторов фолликулостимулирующего гормона и не изменяется содержание рецепторов пролактина и гонадотропин-релизинг гормона [305].

Отмечаются половые отличия в формировании алкогольной зависимости.

В процессе развития экспериментального алкоголизма уровень потребления этанола выше у самок крыс по сравнению с самцами, хотя предпочтение быстрее формируется у самцов [106, 141, 214, 294]. В то же время есть данные о том, что самцы макак пьют больше, чем самки [343]; крысы обоего пола потребляют этанол в одинаковых количествах, но у самок дольше поддерживается предпочтение к этанолу [113]. У самцов мышей выше, чем у самок, чувствительность к хроническому седативному гипнотическому действию этанола [293]. У самок крыс при более медленном развитии зависимости от этанола происходит более быстрое восстановление, чем у самцов [148]. У женщин отмечается более высокий уровень алкоголя в крови, чем у мужчин при приеме одинакового количества этанола [186, 337]. У людей обоего пола уровень потребления алкоголя зависит от генотипа [106, 306, 320] и возраста [306].

Установлено, что у самок животных выше чувствительность к вызванному алкоголем повреждению печени, а также чаще встречается полинейропатия и мозжечковая атаксия, чем у самцов [337].

Во время отмены этанола после его хронического потребления ЦНС самок крыс по сравнению с самцами более восприимчива к повреждению полиаминовых нейронов [288], более чувствительна к антиконвульсантному действию нейростероидов [149], и проявляет больший ответ на острое введение этанола [148]. Однако приводятся данные о меньшей чувствительности самок к отмене этанола, что частично объясняется влиянием эстрогена [215]. Влиянием половых гормонов также можно объяснить и другие факты половых отличий при абстинентном синдроме [216, 217].

Хроническое потребление алкоголя самками изменяет соотношение стадий эстрального цикла, что свидетельствует о нарушении гипоталамических гормональных функций. У самок животных, по сравнению с самцами, отмечаются более выраженные изменения в кинетике этанола и ацетальдегида, что также способствует потреблению высоких доз этанола [4]. При развитии алкоголизма у самцов важна система положительного подкрепления мозга, а у самок – система, метаболизирующая этанол [4]. В частности имеются данные о половых отличиях экспрессии и стимуляции изоферментов АДГ [105, 215], причем в механизм этих отличий вовлекаются андрогены, оказывающие ингибирующее действие, а также прогестерон и эстроген, оказывающие стимулирующее действие [197]; алкоголизация не изменяет активность АДГ печени у животных обоего пола, но с повышением потребления этанола активность обоих изоферментов повышается.

Алкоголь по-разному действует на ГАМК-бензодиазепиновые рецепторы у этанол-зависимых мужчин и женщин [149, 240], но физиологические причины этого не ясны. Известно, что при хронической алкоголизации не изменяются уровни белка субъединиц ГАМК-рецепторов в коре этанол-зависимых самок крыс, в отличие от самцов, у которых эти уровни снижены [149].

У самцов и самок крыс наблюдается модулирующее (снижающее) влияние на предпочтение к этанолу, оказываемое дигидротестостероном и эстрадиолом [113].

Эстадиол и прогестерон влияют на способность этанола изменять кинетические параметры связывания μ-опиоидных рецепторов в отделах мозга (гипоталамусе, среднем мозге и коре), что частично объясняет половые отличия алкогольных эффектов [133].

Таким образом, хроническая алкоголизация является причиной многочисленных нарушений на органном, тканевом, клеточном и молекулярном уровнях. В частности, отмечаются нарушения в функционировании ферментных систем. Для понимания механизмов изменения активности ферментов при алкоголизме и роли этих изменений в формировании алкогольной зависимости интересно сравнить влияние хронической этанольной интоксикации на активность ферментов обмена биологически активных пептидов в тканях интактных и пренатально алкоголизированных крыс. Многочисленные данные о половых отличиях при хронической алкоголизации требуют сравнения изменений активности ферментов при этом у животных разного пола.



1.2. Влияние пренатального хронического  воздействия этанола на организм



Этанол оказывает многостороннее действие на организм не только особей, непосредственно его потребляющих, но и их потомства.

Пренатальная алкоголизация формирует так называемый алкогольный синдром плода или синдром эмбриофетопатии. По современным представлениям – это сумма патологических симптомов, обусловленных аномалиями развития плода и функциональными нарушениями в результате потребления алкоголя матерью во время беременности. Особенно уязвимы те стадии, когда происходит дифференцировка органов и систем плода.

Несмотря на то, что в системе «мать-плод» имеются механизмы, способствующие уменьшению эффекта алкоголизации матери во время беременности на плод [26, 90, 227], этанол проходит через плаценту и плод подвергается алкогольной интоксикации.

В целом, при влиянии алкоголя на потомство выделяют следующие изменения: 1) повышение биологического риска формирования алкоголизма; 2) разнообразные соматические нарушения вплоть до тяжелой органической патологии – алкогольной эмбриофетопатии; 3) нарушение поведения, эмоциональных и психических функций [6, 26, 64, 130].

Высокий риск заболевания алкоголизмом у потомков алкоголиков объясняется изменением функции генома. В частности, могут происходить нарушения в активности систем генов, участвующих в развитии и дифференцировке нервных клеток. Критическим моментом формирования нейрофизиологических механизмов алкогольной зависимости и толерантности может быть влияние на экспрессию «ранних» генов, например гена c-fos – белка, являющегося продуктом экспрессии «раннего» гена, выполняющего роль «третичного мессенджера». В ответ на экстрацеллюлярную стимуляцию изменяется активность других генов, что приводит к долговременным перестройкам в нейронах мозга. Несмотря на то, что фоновый уровень экспрессии гена c-fos в структурах головного мозга одинаков у пренатально алкоголизированных и контрольных животных, постнатальное введение этанола вызывает мощное усиление экспрессии этого гена у потомков алкоголиков крыс в отличие от интактных животных [8].

Божко Г. Х. и Волошин П. В. [238] считают, что нарушение структуры и функции генетического аппарата клеток преимущественно обусловлено действием ацетальдегида. Алкогольная интоксикация вызывает формирование поперечных ковалентных связей между комплементарными нитями ДНК и между хроматиновыми белками, вызывает изменение синтеза гистонов и негистоновых белков, нарушая структуру хроматина.

Несмотря на то, что не выявлен конкретный ген или аллели, ответственные за эффекты алкоголя, исследования показывают зависимость питьевого поведения и риска развития алкоголизма от генов, кодирующих ферменты метаболизма этанола. Отмечаются генетические различия активности этих ферментов [15, 22, 107]. 

Пренатальная алкоголизация вызывает гиперреактивность и изменение обратной связи ГГНС [177, 178, 182, 224, 282]. Это проявляется в однократном и/или длительном повышении уровня АКТГ и/или кортикостерона, в том числе и в ответ на стресс, увеличении чувствительности надпочечников к АКТГ, изменение чувствительности гипофиза к КРФ [182, 282]. Причем этот эффект пренатального влияния этанола зависит от пола животного. У эмбрионально алкоголизированных самцов крыс гипоталамус оказывает больший стимулирующий эффект, и/или гипофиз более чувствителен к веществам, повышающим секрецию АКТГ, по сравнению с пренатально алкоголизированными самками и контрольными животными [182]. Пренатально алкоголизированные самки имеют более высокий уровень тревожности и более высокий уровень кортикостерона, чем пренатально алкоголизированные и контрольные самцы и контрольные самки [280, 281, 291]. У пренатально алкоголизированных самок, но не у самцов дексаметазон вызывает повышение уровней АКТГ и кортикостерона [177]. Aird et. al. [109] предполагают организационное влияние половых гормонов на эти эффекты алкоголя. У пренатально алкоголизированных самок, в отличие от самцов, наблюдается изменение возрастной динамики уровня мРНК КРФ в гипоталамусе по сравнению с контрольными животными. Адреналэктомия матерей, комбинированная с пренатальной алкоголизацией, вызывает изменение возрастной динамики уровня мРНК КРФ и у самцов и у самок.

У пренатально алкоголизированных самцов снижается уровень мРНК ПОМК, а у самок не изменяется. Адреналеэктомия матерей возвращает уровень мРНК ПОМК у самцов к норме, а у самок – снижает [109].

Пренатальное воздействие этанола изменяет действие половых гормонов и влияет на репродуктивную функцию самок и самцов. Подавляется секреция эстрогена у самок крыс [322]; нарушается увеличение количества клеток, экспрессирующих мРНК проэнкефалина в гипоталамусе самок крыс в ответ на введение эстрогена, наблюдаемое в норме [239]; снижается уровень тестостерона у самцов, если он вводится до или во время периода диффференциации гипоталамуса и семенников [265].

Важно отметить, что в пренатальном периоде на развивающийся организм, помимо собственных нейрогормональных факторов и вводимого этанола, оказывают влияние гормоны и нейрогормоны матери и плаценты. Введение этанола в состав жидкого корма с 8-го дня беременности изменяет гормональный статус матери: содержание пролактина почти не изменяется, а тестостерона и прогестерона – повышается [64]. Эти изменения, естественно, отражаются на развитии плода.

Пренатальная алкоголизация, внося глубокие изменения в организм на клеточном, тканевом и органном уровнях, проявляется в изменении поведения. У пренатально алкоголизированных животных отмечается гиперреактивность [309, 299] или снижение двигательной активности [70, 83, 241] с уменьшением общемозговой и гиппокампиальной массы [132, 309] и уменьшением размера таламуса [241]. У самок крыс наблюдается большая исследовательская активность, т. е. более высокий уровень тревожности, чем у самцов, и более высокий уровень кортикостерона [281]. Druse M. J. et. al. [153] отмечают нарушение моторной функции у пренатально алкоголизированных крыс, сопутствующее повышению уровня мРНК проэнкефалина в стриатуме и прилегающих ядрах и аномалии в черном веществе.

Пренатальное воздействие этанола влияет на многие нейрохимические и клеточные компоненты развивающегося мозга. Разные отделы мозга отличаются реакцией на токсичный эффект этанола. В одном и том же отделе разные клеточные популяции тоже проявляют разную чувствительность к этанолу. Этанольная интоксикация в эмбриональном периоде нарушает деление, рост, дифференциацию и миграцию клеток, развитие астроглии и нейронально-глиальное взаимодействие, повреждает нейротрансмитерные системы и/или их рецепторы [190, 269], является причиной гибели нейронов в гиппокампе [226], мозжечке [134], коре [232, 268], в вестибулярном комплексе [154], снижает уровень миелинизации [284]. Она влияет на ДНК, РНК и белковый синтез, снижает уровень митоза, изменяет содержание и распространение некоторых цитоскелетных белков, цитозольных и мембранных гликопротеинов [191, 208]. Пренатальная алкоголизация нарушает содержание различных нейропептидов в отделах мозга, в частности, нейротрофина (фактора роста нервов) и нейропептида Y [114]. Пренатальная интоксикация влияет на ферментативную активность в ЦНС: изменяет посттрансляционную модификацию оксиазотсинтазы-1 и -3, снижая их активность [225], уменьшает активность протеинкиназы С, что является причиной глубоких и длительных дефицитов в клеточных сигнальных механизмах, связанных с синаптической пластичностью и формированием памяти [111], подавляет экспрессию мРНК ферментов катехоламинергической системы [331] и т. д.

Особый интерес, вызывает изменение уровней опиоидов при пренатальной алкоголизации. Пренатальное воздействие этанола избирательно изменяет содержание энкефалинов в разных регионах мозга: повышает уровень проэнкефалина в стриатуме и прилегающих ядрах [153]; снижает количество Met- и Leu-энкефалинов в гипоталамусе без изменения в коре, гиппокампе [69]; увеличивает содержание Met- и Leu-энкефалинов в бледном шаре без изменения их содержания в гипофизе [263]. Такие изменения уровней энкефалинов в мозге, по мнению некоторых авторов [69], формируются в процессе постнатального онтогенеза и обусловлены не прямым действием этанола на систему эндогенных опиоидов, а развивается в результате опосредованных реакций.

Таким образом, можно заключить, что пренатальная алкоголизация оказывает существенное разнообразное влияние на организм. В том числе и на содержание биологически активных пептидов. При этом практически отсутствуют данные о влиянии пренатальной этанольной интоксикации на ферменты обмена этих пептидов, что вызывает интерес для исследования. 


1.3. Ферменты обмена регуляторных пептидов



1.3.1. Биологическая роль пептидаз

В регуляции функций организма, наряду с классическими медиаторами, важная роль принадлежит регуляторным факторам пептидной природы. Регуляторные пептиды широко распространены в различных тканях, в том числе и в нервной. Они принимают участие в нейрохимических механизмах, поддерживающих основные гомеостатические константы организма, формирующих и осуществляющих целенаправленное поведение, а также в процессах, контролирующих эмоциональную сферу, мотивацию, память [5, 10, 75, 93, 104]. Вероятно, именно биологически активным пептидам принадлежит важная роль в интеграции функциональных систем организма, обеспечении их слаженной работы в изменяющихся условиях окружающей среды. Они играют ключевую роль в регуляции иммунологической защиты, в запуске адаптивных защитных реакций при инфекции, повреждении тканей, стрессе, а также в формировании патологических состояний организма, в том числе и алклоголизма [55, 76, 230]. Многие нейропептиды вовлекаются в регуляцию возрастных изменений, в т. ч. и процессов полового созревания [12, 16, 25, 94, 95].

Одним из этапов метаболизма пептидов является ограниченный протеолиз, который играет главную роль, как в процессах их биосинтеза, так и в процессах инактивации. Пептидгидролазы, осуществляющие процессинг и деградацию пептидных регуляторов, обеспечивают функционирование и определенное соотношение их в организме.

Большинство предшественников нейропептидов включают последовательности пептидов, обладающих разной биологической активностью. То, какие именно пептиды будут образовываться из предшественника, зависит от набора протеиназ, действующих на молекулу предшественника, и от соотношения их активностей [185, 242, 261, 352].

Инактивация пептидов также осуществляется путем протеолиза и характеризуется следующими основными особенностями. Во-первых, один и тот же пептид может расщепляться разными пептидазами, а один и тот же фермент может превращать различные пептиды [1, 212]. Во-вторых, в отличие от классических медиаторов, продукты деградации пептидных регуляторов могут обладать собственной биологической активностью, которая может отличаться от активности исходного пептида как количественно, так и качественно [10].

При паракринном действии пептида активность внеклеточных пептидаз определяет время жизни пептида, расстояние, на которое он может продиффундировать, а, следовательно, и спектр мишеней, на которые он действует. Таким образом, при помощи протеиназ осуществляется регуляция физиологических эффектов пептидов на этапе биосинтеза и на этапе инактивации пептидов.

Особенность пептидной регуляции функционального состояния организма состоит в том, что в каждом участке в каждый момент времени должна поддерживаться необходимая концентрация определенных пептидов. Это может быть достигнуто точной и согласованной работой протеиназ, осуществляющих синтез и деградацию пептидов, т. е. поддержанием в головном мозге определенной пространственно-временной мозаики протеолитической активности. При изменении внешних условий, или каком-либо воздействии (например, алкоголизации) эта мозаика определенным образом изменяется, чтобы обеспечить работу функциональных систем организма в новых условиях [59].

В конечной стадии образования активных пептидов из неактивных предшественников и в начальных стадиях их деградации участвуют основные карбоксипептидазы – ферменты, отщепляющие остатки основных аминокислот (аргинина и лизина) с С-конца пептидов. К ним, в частности, относятся карбоксипептидаза Н, и недавно открытая ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза. Им принадлежит важная роль в регуляции уровней активных нейропептидов в организме [35, 40, 41, 43, 47, 48, 56, 101, 102, 131, 136, 151, 160, 172, 174, 200, 204, 292], чем обусловлен интерес к изучению этих ферментов, в том числе и при различных физиологических и патологических процессах, протекающих в организме [29, 30, 32, 39, 45, 49, 50, 52, 53, 54, 139, 140, 144, 175, 187, 196, 210, 213, 236, 237, 243, 253, 273, 283, 300, 303, 308, 311, 335, 336, 339, 340, 341].



1.3.2. Карбоксипептидаза Н



Карбоксипептидаза Н (КПН, энкефалинконвертаза, карбоксипептидаза Е, КФ 3.4.17.10) впервые была выделена и охарактеризована в 1982 г. Fricker L.D. и Snyder S.H. из мозга, гипофиза и хромаффинных гранул надпочечников быка [172].

Карбоксипептидаза Н является гликопротеином с Mr 50000 – 55000, состоит из одной полипептидной цепи. Это тиолзависимый металлофермент, в активном центре которого находится ион Zn2+ [203, 204]. Фермент имеет оптимум рН 5,5-6,0 [151, 188, 205, 312, 350], pI 4,9 [251], ингибируется Cu2+, Hg2+, Cd2+, п-хлормеркурфенилсульфатом, АПМЯК, 2-меркаптометил-3-гуанидилэтилтиопропановой кислотой, ЭДТА и 1,10-фенантролином [37, 151, 174, 200, 204]. Наиболее эффективными ингибиторами являются ГЭМЯК и ГПЯК с Ki 8,8 и 7,5, соответственно [145, 169, 301, 327]. КПН ингибируется Met- и Leu-энкефалинами (Ki 12,0 – 5,5), веществом Р, вазопрессином, окситоцином (при концентрации 2 – 20 мМ), тиреотропин-рилизинг-фактором [202, 287, 302]. Лизин и аргинин являются конкурентными ингибиторами КПН. Ki для аргинина и лизина равны, 4,6±1,3 и 7,6±1,9 [199], соответственно. Бромацетил-D-Arg, необратимый ингибитор КПВ и КПN, также ингибирует и КПН [169]. Ионы цинка, кальция, магния, N-этилмалеимид и ФМСФ не влияют на активность КПН [37, 151]. Фермент активируется ионами Co2+ в зависимости от рН среды в 5-10 раз, ионами Ni2+ – в 2-3 раза [37, 145, 151, 174, 204, 301, 325, 327]. Агрегация, конформационные изменения и мембранная ассоциация КПН зависят от рН среды и концентрации ионов Ca2+ [121, 318]. Уменьшение pH и увеличение концентрации ионов Ca2+ индуцируют агрегацию данного фермента и его ассоциацию с мембранами [121, 318]. Ионы Ca2+ при повышенной температуре дестабилизируют КПН [274].

КПН обладает практически абсолютной специфичностью по отношению к пептидным субстратам с С-концевыми остатками основных аминокислот. Фермент хорошо отщепляет остатки -Lys и -Arg от Arg8-вазопрессин-Gly-Lys-Arg, 125I-Met-энкефалин-Arg, 125I-Met-энкефалин-Lys, гиппурил-L-Arg, Leu-энкефалин-Arg, даларгина, остатки -Lys15-Lys16-Arg17 с С-конца АКТГ1-14 [46, 48, 86, 151, 200, 204, 344], но с очень низким сродством отщепляет остаток гистидина с карбоксильного конца проокситоцина [277, 317].

КПН существует в двух формах: растворимой и мембраносвязанной. Обе формы являются гликопротеинами. Они имеют идентичную субстратную специфичность и чувствительность к групп-специфичным реагентам. Растворимая форма КПН более активна, чем мембраносвязанная. Mr мембранной формы 55 000 – 57 000, Mr растворимой формы 53000 – 57000 [145, 188, 193, 200, 205, 206, 325, 330, 350]. Различия в молекулярной массе мембраносвязанной и растворимой форм КПН, по-видимому, связано с наличием у первой так называемого ”мембранного якоря”. С-концевая область мембраносвязанной КПН (51 аминокислотный остаток) образует амфифильную -спираль, которая и может служить гидрофобным ”мембранным якорем” [166, 270, 338]. В секреторных гранулах КПН связывается с детергент-устойчивыми липидными доменами мембран, богатыми гликосфинголипидами и холестеролом [150]. Такая ассоциация КПН с мембранами является необходимым условием для выполнения сортирующей функции в регулируемом секреторном пути [150]. Растворимая и мембраносвязанная формы КПН вероятно отличаются механизмами, регулирующими их активность [33]. В настоящее время обнаружено несколько видов мембраносвязанной и растворимой форм фермента, отличающихся молекулярной массой, значением pI [37, 145, 286]. Соотношение мембраносвязанной и растворимой форм КПН в разных клетках и тканях отличается [161, 285]. По некоторым данным мембраносвязанная форма может переходить в растворимую при повышении рН [121, 318], при холестероловом истощении мембран [150]. По данным Fricker и Devi [167] в секреторных везикулах мембраносвязанная форма КПН может переходить в растворимую путем протеолитического удаления С-концевой последовательности КПН. Фермент, осуществляющий этот переход, активируется ионами кальция. Вероятно, превращение мембраносвязанной формы в растворимую может регулироваться ионами кальция [274], концентрация которых в клетке изменяется в ответ на различные стимулы, что, в свою очередь, влияет на секрецию нейропептидов [116]. С другой стороны, Parkinson [285, 286] высказывает сомнения относительно возможности перехода мембраносвязанной формы в растворимую посредством С-концевого протеолиза.

Ген КПН клонирован и секвенирован [110, 165, 219, 220, 253, 255, 300, 316]. В последовательности гена КПН присутствуют регуляторные участки, повышающие активность транскрипции [157, 218, 220, 237, 316], однако уровень мРНК препроКПН и нейропептидов коррелирует не всегда [170, 171, 187].

При мутации в гене, кодирующем КПН (единичная точечная мутация Ser202 на Pro), уменьшается эффективность процессинга прогастрина [236, 336], нарушается процессинг проинсулина (и нарушению внутриклеточного фолдинга КП Н) [139, 210, 273, 339, 340], синтеза соматостатина и хромогранина А [196], подавляется процессинг проглюкагона и глюкагон-подобного пептида 1 [175], происходит нарушение внутриклеточного транспорта проопиомеланокортина и гормона роста [311], созревания пронейротензина и промеланоцитстимулирующего гормона [303]. Это приводит к многочисленным эндокринным нарушениям, включая гиперинсулинемию и бесплодие [140, 243, 273]. У человека при диабете (T2DM) синтезируется КПН, кодированная мутантными генами, с измененными свойствами (рН оптимумом, субстратной спечифичностью) [137].

КПН синтезируется в виде неактивного предшественника с Mr 75000, состоящего из 476 аминокислотных остатков [206, 300, 319]. Затем он подвергается С- и N-концевому посттрансляционному процессингу [192, 201, 300].

Активность КПН в мозге и тканях коррелирует с уровнем мРНК КПН [124, 167] и в целом соответствуют распределению биологически активных пептидов и их предшественников [48, 163, 164]. Наиболее высокие уровни мРНК КПН обнаружены в передней и промежуточной долях гипофиза, хромафинных гранулах надпочечников, островках Лангерганса поджелудочной железы [108, 144, 151, 172, 173, 174, 193, 200, 207, 246, 251, 279, 285, 323, 330, 344]. Несколько ниже уровни мРНК КПН обнаружены в задней доле гипофиза, отделах мозга, слюнных железах [174, 246, 250, 285, 323, 330]. Наиболее низкие уровни выявлены в стволовой части головного мозга, спинном мозге, легких, сердце, желудочно-кишечном тракте, печени и почках [248, 249]. Фермент также обнаружен в центральных нейронах миндалины [246]. Тканевое и региональное распределение КПН сходно у разных видов животных и человека [168, 221]. Установлено, что КПН ассоциирована со структурными элементами эндоплазматического ретикулума, комплекса Гольджи и секреторными везикулами, где протекает процессинг предшественников различных биологически активных пептидов [36, 163]. Имеются сведения о том, что эндоплазматический ретикулум и элементы комплекса Гольджи содержат мембранную форма КПН (57000), секреторные гранулы – растворимую форму кпн (54000) и мембранную [192]. В регуляторном секреторном пути КПН выполняет сортирующую функцию [139, 140, 183]. КПН участвует в процессинге многих регуляторных пептидов: опиоидных [35, 48, 56, 172, 174, 200, 204], пептидных гормонов гипофиза, гипоталамуса, желудочно-кишечного тракта, плаценты, фактора роста [35, 151, 200, 204, 292], пептидов, имеющих единого предшественника proSAAS [131, 160], пептидов (включая проэнкефалин, проопиомеланокортин, протахикинины А и В, хромогранин А и В, секретогранин), с образованием более 100 новых пептидов [136] и т. д.

Уровень мРНК КПН и активность фермента в культурах клеток способны изменяться в ответ на внешние воздействия: при смене условий освещенности [308]; под действием фактора роста нервов [144, 187, 237, 283, 335]; раствора KCl [144, 170]; бромкриптина [283]; дексаметазона [39, 300]; кортикотропин-рилизинг-фактора [253, 300]; гидрокортизона [39]. Кратковременная общая ишемия снижает, а длительная повышает активность КПН и уровень ее мРНК в гипоталамусе и коре крыс [213]. Однократный эмоционально-болевой стресс вызывает повышение карбоксипептидазно-Н-подобной активности в гипофизе и сыворотке крыс, длительный – повышение в гипофизе и снижение в сыворотке [45]. Активность КПН через 6 часов введения этанола (в дозе 4 г/кг) повышается в гипофизе и снижается в сыворотке, через 18 часов – повышается в гипофизе и сыворотке [45]. Длительное воздействие эмоционального стресса, этанола и транквилизаторов (диазепама и резерпина) повышает активность КПН в гипофизе, гипоталамусе и стриатуме крыс [341]. В некоторых отделах головного мозга крыс совместное воздействие этанола и стресса вызывает гиперактивацию КПН, причем изменение активности зависит от дозы этанола и вида стрессирующего воздействия [32]. Отмечается различие в региональной активности КПН мозга и периферических тканей у крыс с различным влечением к этанолу [54], и у мурицидных и немурицидных крыс [53]. Отмечается повышение активности КПН у немурицидных крыс при потреблении этанола и его отмене [53]. Таким образом, показано вовлечение КПН в определение агрессивности [52], в ответ на различные стрессирующие воздействия [29, 30, 49, 50, 52], введение гормонов [39] и транквилизаторов [187, 341], предрасположенности к потреблению этанола [54], в развитие физической зависимости от него [17, 44, 53].

Имеются также данные о половых отличиях в активности КПН [101]. Половые гормоны влияют на активность КПН в отделах гипоталамо-гипофизарно-надпочечниково-гонадной системы мышей: активность фермента у контрольных животных у самок выше, чем у самцов; экзогенно вводимые тестостерон и прогестерон по-разному снижают активность КПН в тканях животных разного пола [88].

Вовлечение КПН в формирование алкогольной зависимости [17, 32, 44, 45, 53, 54, 341], его участие в процессинге многих биологически активных пептидов [35, 48, 56, 131, 136, 151, 160, 172, 174, 200, 204, 292] обусловливают интерес к исследованию активности данного фермента и его участия в формировании толерантности к этанолу и предрасположенности к алкоголизму в постнатальном периоде у животных, испытавших пренатальное воздействие этанола.



1.3.3. ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза

Первые упоминания о существовании фермента, отщепляющего аргинин и лизин с С-конца пептидов, но в то же время отличающегося от всех известных металлокарбоксипептидаз, относятся к 1993 году. Более подробные сведения появились в 1995 году [40, 41].

Фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая карбоксипептидаза (ФМСФ-КП) – экзопептидаза, отщепляющая остатки основных аминокислот с С-конца пептидов. В частности, она отщепляет остаток аргинина от дансил-Phe-Leu-Arg [40], Cbz-Gly-Gly-Arg, Met5-энкефалина-Arg6 [47] с образованием, соответственно, дансил-Phe-Leu, Cbz-Gly-Gly, Met5-энкефалина. Дальнейшего расщепления образовавшихся продуктов не происходит. Фермент имеет Mr 100000 – 110000 и проявляет максимальную активность при pH 5,0-6,0 [40]. Фенилметилсульфонилфторид и п-хлоромеркурбензоат полностью ингибируют его. Иодоацетамид снижается карбоксипептидазную активность только на 40%. Другой реагент на SH-группы (N-этилмалеимид), хелатирующий агент ЭДТА и специфический ингибитор КПН ГЭМЯК, а также ионы Co2+ не оказывают влияния на активность фермента. ФМСФ-КП инактивируется при нейтральных и слабощелочных значениях pH, но стабилизируется NaCl [40]. Km для синтетических субстратов дансил-Phe-Leu-Arg и дансил-Phe-Ala-Arg равна 48 и 96 мМ, соответственно. 

ФМСФ-КП по своим физико-химическим свойствам схожа с лизосомальной карбоксипептидазой А (лизосомальная КПА, катепсин А, КФ 3. 4. 16. 1), но отличается от нее субстратной специфичностью и распределением активности в тканях и отделах мозга [127, 147, 195, 256, 257, 262, 289].

Тканевое и региональное распределение ФМСФ-КП имеет некоторые видовые отличия [38, 42, 43, 101, 102], но наибольшая активность у всех исследованных видов животных (ежа европейского, кошки, крысы, мыши) отмечена в надпочечниках и гипофизе [38, 42, 43, 88, 101, 102]. В отделах головного мозга активность ФМСФ-КП ниже, чем в периферических тканях и еще ниже, чем в гипофизе [38, 42, 43, 88]. Предполагается, что разных тканях ФМСФ-ингибируемая КП может быть представлена разными изоферментами. Поэтому выявленные отличия могут быть обусловлены разными соотношениями изоферментов у животных разных видов [43]. В мозге наибольшая активность фермента отмечается в отделах с преобладанием серого вещества (обонятельных луковицах, больших полушариях) или с высоким содержанием нейропептидов (гипоталамусе, стриатуме). 

Обнаружены половые различия в активности ФМСФ-КП [41, 101, 102]. У самок активность фермента во многих тканях выше, чем у самцов [88]. Активность фермента изменяется в период полового созревания. Экзогенные тестостерон и прогестерон вызывают снижение активности ФМСФ-КП [88]. Наиболее существенное изменение активности ФМСФ-КП при введении тестостерона и прогестерона выявлено в гипофизе и половых железах у животных обоего пола. Минимальное влияние половых стероидных гормонов на активность ферментов обнаружено в гипоталамусе.

Имеющиеся данные позволяют сделать предположение о возможном участии ФМСФ-КП в процессинге, а по некоторым данным и в катаболизме [101], предшественников ряда нейропептидов [41, 43, 47, 101, 102].

Для уточнения биологической роли ФМСФ-КП в норме и при патологии интересно исследовать ее активность у пренатальной алкоголизированных животных обоего пола.



1.4. Регуляторные пептиды и ферменты их обмена в онтогенезе



Содержание биологически активных пептидов изменяется в процессе индивидуального развития организма. Эти возрастные изменения отличаются в разных органах, тканях и группах клеток. Причем наблюдается отличие онтогенетической динамики изменения уровней разных пептидов в одной ткани и одного и того же пептида в разных тканях. Несомненно, это связано с различной биологической ролью разных пептидов в пределах одной ткани и вовлечением одного и того же пептида в протекание разных процессов в разных тканях [52, 55, 76]. В онтогенезе существенно изменяются соотношения между уровнем биологически активных пептидов и их предшественников [266], или соотношение между уровнем пептидов, происходящих из одного предшественника [181, 310], что свидетельствует об изменении специфичности процессинга предшественников в ходе индивидуального развития.

мРНК препроэнкефалина в мозге крыс обнаруживается на Е15, сохраняется на этом уровне до Р14, а затем возрастает до уровня взрослых животных [351]. Продукты расщепления проэнкефалина обнаруживаются на ранних стадиях эмбрионального развития в мозге крыс [342]. Met-энкефалин появляется в мозге крыс на Р0, его уровень увеличивается к Р21 и далее медленно возрастает [347]. По другим данным [25, 267], его уровень повышается в гипофизе, снижается в коре головного мозга, гипоталамусе и спинном мозге, не изменяется в гиппокампе и стволе мозга. Leu-энкефалин появляется в гиппокампе крыс на Р4, его содержание увеличивается к Р18, в среднем мозге не изменяется [118].

В надпочечниках крыс в возрасте Р7-Р21 изменяется соотношение предшественник/зрелая форма Met-энкефалина, очевидно за счет изменения процессинга проформы. Это подтверждается и повышением активности КПН, которая вовлекается в его превращение [266]. При этом содержание Met-энкефалина-Arg6-Phe7 снижается в 4 раза, а Met -энкефалина – в 2 раза [266].

Содержание β-эндорфина в отделах мозга (гиппокампе, гипоталамусе, коре), как правило с возрастом снижается, а в гипофизе – увеличивается [25, 267]. Предполагают, что эти изменения связаны с возрастными особенностями формирования гипоталамо-гипофизарной системы.

У детей, подростков и взрослых обоих полов концентрация АКГТ в плазме крови практически одинакова, а концентация β-липотропина и β-эндорфина возрастает в препубертатном периоде и к началу полового созревания достигает величин, характерных для взрослых [181]. Т. к. эти пептиды происходят из единого предшественника – проопиомеланокортина [247], то избирательное изменение их концентрации может происходить только за счет изменения специфичности процессинга или изменения скорости деградации.

Пролактин обнаруживается в передней доле гипофиза крыс с Е17, его уровень не изменяется до Е21, резко увеличивается с Р1 до Р10. В сыворотке крови концентрация пролактина растет с Е17 до Е21 и снижается с Р1 до Р10 [275].

ВИП обнаруживается в мозге крыс на Е17, уровень его достигает минимума к Р20, а затем медленно повышается [254]. В заднем мозге крыс ВИП обнаруживается на Р4, его концентрация достигает максимума к Р18 [119, 159]. Его уровень в слюнных железах, как и вещества Р, волнообразно увеличивается в первые 8 недель развития крыс [158].

Нейропептид Y появляется в коре и подкорковых ядрах крыс на Е19, его уровень увеличивается к Р0 и далее не изменяется [162, 349]. В тазовом сплетении спинного мозга крыс этот пептид обнаруживается на Е18 [328].

Уровень нейротензина в гипоталамусе крыс возрастает от Р0 до Р19 [307].

Возрастные изменения уровня нейропептидов сильно зависят от пола животных, особенно в период полового созревания. Это связано с тем, что многие биологически активные пептиды вовлекаются в регуляцию уровня половых гормонов и в регуляцию функционирования половой системы [12, 94, 95]. Показано также, что изменение уровней половых гормонов вызывает изменение уровня различных нейропептидов, в том числе β-эндорфина, кортикотропин-подобного пептида, α-меланотропин-стимулирующего гормона, вещества Р [156, 346].

Обнаруженные к настоящему времени возрастные изменения уровня регуляторных пептидов, вероятно, связаны с изменениями в функционировании ферментных систем, участвующих в их синтезе и деградации. 

Активность Tyr-аминопептидазы в коре головного мозга котят с возрастом повышается, а Asp- аминопептидазы – снижается [259].

Активность пироглутамил-пептидазы І снижается с Р9 до Р20 в гипоталамусе, стриатуме, коре и гипофизе крыс [179, 259]. Активность фермента с Р20 до Р25 не изменяется. При этом в гипоталамо-гипофизарной оси наблюдаются достоверные отличия активности фермента у самцов и самок всех исследованных возрастов.

Уровень пролин-иминопептидазы в сыворотке крови детей старше 1 года уменьшается до 20 лет и несколько повышается позже [258]. Половых отличий при этом не обнаружено.

Активность диппептидиламинолпептидазы ІV и аминопептидазы М в мозге и изолированных микрососудах мозга во время снижается во время первых 8 недель постнатального развития. Активность аминопептидазы А снижается к Р14, а затем к 8 неделям возвращается к исходному уровню. При этом обнаружены половые отличия [129, 180].

Активность нейтральной эндопептидазы 24.11 в гипоталамусе крыс повышается с Р0 до Р7 и далее не изменяется, в коре больших полушарий она повышается с Р0 до Р30, а в мозжечке – снижается и далее не изменяется [278].

Активность металлоэндопептидазы 24.15 в коре повышается от Р0 до Р7, к Р90 возвращается к исходному уровню. В гипоталамусе и мозжечке уровень фермента постоянен в периоде Р0-Р30 и снижается к Р90 [278].

Уровень АПФ в стриатонигральном тракте и коре больших полушарий крыс возрастает от Р0 до Р20, а затем несколько снижается [326].

Активность КПН изменяется с возрастом. У эмбрионов крыс мРНК КПН экспрессируется как в нервной (таламус, гипоталамус, средний и продолговатый мозг, кортикальная пластинка и спинной мозг, а также периферические ганглии), так и в других тканях (сердце и первичные хрящи) [353]. В постнатальном периоде активность КПН у крыс обоего пола повышается, причем динамика изменения активности фермента в отделах мозга и периферических тканях различается [41, 142, 278]. Нужно отметить расхождения данных, опубликованных разными авторами, касающихся изменения активности КПН в одних и тех же отделах мозга в постнатальном периоде, что, вероятно, связано с различиями в экспериментальной методике.

Наибольшие различия (в частности, в гипоталамусе) отмечены непосредственно в период полового созревания. Начиная с 90-дневного возраста, достоверные половые различия в активности данного фермента обнаружены лишь в почках и половых железах. Особенно это выражено у 120-дневных крыс [101].

Имеются данные о возрастных изменениях активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в мозге и периферических тканях самцов крыс в период с рождения до 120-дневного возраста [41]. Причем в тканях с наибольшим содержанием данного фермента (гипофизе, семенниках, надпочечниках) отмечается снижение его активности с возрастом. Влияние возраста на активность фермента более выражено в мозге и тканях самцов, чем у самок [41, 101, 102]. Динамика возрастных изменений у животных разного пола в большинстве случаев совпадает.

Таким образом, приведенные сведения указывают на возможность вовлечения ферментов обмена физиологически активных пептидов в регуляцию онтогенетических изменений уровня этоих пептидов, а также в определение их половых различий. И представляется интересным исследование возрастной динамики ферментативной активности (в частности КПН и ФМСФ-КП) у крыс обоего пола, испытавших алкоголизацию в эмбриональном периоде.

* * *

Суммируя все выше изложенное, можно заключить:

В процессе онтогенеза в организме происходят значительные изменения обмена регуляторных пептидов и ферментов их обмена.

Важная роль в обмене пептидов принадлежит основным карбоксипептидазам. Они участвуют в конечной стадии процессинга неактивных предшественников пептидов и в начальных стадиях их инактивации, тем самым, контролируя уровень и соотношение биологически активных пептидов в организме.

Хроническая алкоголизация изменяет уровни и соотношение различных регуляторных пептидов (в первую очередь опиоидных пептидов, выполняющих важную роль в патогенезе алкоголизма) и активность ферментов их обмена.

Пренатальное воздействие этанола изменяет содержание регуляторных пептидов (в том числе и опиоидных) и формирует предрасположенность к развитию алкоголизма.

Все отмеченные изменения зависят от пола.

Представляет интерес сравнительное изучение активности основных карбоксипептидаз в тканях самок и самцов крыс, испытавших эмбриональное воздействие этанола, исследование активности этих ферментов при последующем постнатальном хроническом воздействии этанола. Эти данные могут иметь важное значение для выяснения биологической роли основных карбоксипептидаз в организме при алкоголизме, для понимания механизмов развития возрастных и половых отличий активности ферментов и уровней регуляторных пептидов при этом заболевании, механизмов формирования этанольной зависимости у потомков алкоголиков.


ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ



2.1. Материалы исследования



Опыты проводили на новорожденных, а также в возрасте 14, 28, 45, 120 суток после рождения, самках и самцах белых беспородных крыс. Животных содержали в стандартных условиях вивариума.

Животных декапитировали, извлекали головной мозг, гипофиз, надпочечники и половые железы. Ткани помещали в охлажденный физиологический раствор, очищали от оболочек и кровеносных сосудов, высушивали фильтровальной бумагой. Затем выделяли отделы мозга - гипоталамус и стриатум у всех крыс, а также четверохолмие, гиппокамп и большие полушария у животных в возрасте 120 суток.

Образцы выделенных тканей гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Поттера в 20 мМ натрий ацетатном буфере (рН 5,6), содержащем 50 мМ NaCl, в соотношении 1:100 (вес:объем). Гомогенаты использовали в качестве источников КПН и ФМСФ-КП.

В качестве специфических ингибиторов применяли ФМСФ (”Serva”, США) и ГЭМЯК (“Serva”, США). В качестве субстратов использовали дансил-Phe-Ala-Arg и дансил-Phe-Leu-Arg. Все остальные реактивы были отечественного производства с квалификацией ”ХЧ” и ”ОСЧ”.



2.2. Методы исследования



2.2.1. Моделирование хронического потребления этанола.

Для исследования онтогенетических изменений активности основных карбоксипептидаз при внутриутробном хроническом воздействии этанола использовали две группы животных: пренатально алкоголизированную (Э) и контрольную (К). Животные пренатально алкоголизированной группы являлись потомством самок, получавших в течение всего периода беременности в качестве единственного источника жидкости 12 % раствор этанола, содержащий 5 % сахарозы; контрольной группы – потомством самок, получавших в этот период только 5 % раствор сахарозы.

Кроме того, для исследования активности данных ферментов при последующей постнатальной алкоголизации крыс, подвергнутых влиянию этанола в эмбриональном периоде, взрослых животных каждой группы разделили на две подгруппы: постнатально алкоголизированную и контрольную. Животные постнатально алкоголизированной подгруппы получали в течение 15 суток в качестве единственного источника жидкости 12% раствор этанола, содержащий 5% сахарозы; крысы контрольной подгруппы – 5% раствор сахарозы. Таким образом, было сформировано четыре подгруппы взрослых животных: контрольная (КК), пренатально алкоголизированная (ЭК), постнатально алкоголизированная (КЭ), пренатально и постнатально алкоголизированная (ЭЭ).



2.2.2. Метод определения активности ферментов

Активность ферментов определяли флюорометрическим методом по Fricker L. D., Snyder S. H. [330].

Для определения активности КПН 50 мкл гомогената ткани добавляли к 150 мкл (контрольная проба) натрий-ацетатного буфера или к смеси 140 мкл буфера и 10 мкл 25 мкМ водного раствора ингибитора ГЭМЯК (опытная пробя). При определении активности ФМСФ-КП использовали ту же схему, с той лишь разницей, что в качестве ингибитора использовали 25 мМ спиртовой раствор ФМСФ, который добавляли после смешивания гомогената ткани с буфером.

Пробы преинкубировались 8 мин при 37оС.

Реакцию начинали прибавлением 50 мкл 210 мкМ субстрата – дансил-Phe-Ala-Arg для определения активности КПН или дансил-Phe-Leu-Arg для определения активности ФМСФ-КП (конечная концентрация субстратов в реакционной смеси составляла 42 мкМ). Далее пробы инкубировали 60 мин при 37оС. Реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1 М раствора соляной кислоты. Для экстракции продукта реакции – дансил-Phe-Ala или дансил-Phe-Leu – к пробам приливали 1,5 мл хлороформа и встряхивали в течение 60 с. Для разделения фаз пробы центрифугировали 5 мин при 1000 g. Измерение флюоресценции хлороформной фазы проводили на флюориметре ФМЦ-2 в кювете толщиной 1 см при ex=360 нм и em=530 нм. В качестве стандарта использовали 1 мкМ раствор дансил-Phe-Ala в хлороформе.

Активность ферментов определяли как разность в накоплении продукта реакции в пробах, не содержащих и содержащих ингибитор, и выражали в нмоль дансил-Phe-Ala или дансил-Phe-Leu, образовавшихся за 1 мин инкубации, в пересчете на 1 мг белка.

Содержание белка в пробах определяли по методу Lowry и соавт. [244].



2.2.3. Метод проведения теста «открытое поле»

Взрослых животных в возрасте 120 дней однократно тестировали по методу «открытое поле» [73]. Для этого животных помещали на ярко освещенную площадку (100х100 см), разделенную на квадраты (20х20 см). В течение 5 минут оценивали следующие поведенческие параметры:

количество посещений периферических квадратов;

количество посещений центральных квадратов;

суммарную двигательную активность (общее количество посещении периферических и цетральных квадратов);

суммарную вертикальную активность (количество стоек);

общую активность (суммарную двигательную и вертикальную активность);

Рассчитывали отношение суммарной двигательной к суммарной вертикальной активности.



2.2.4. Статистическая обработка результатов исследования

Экспериментальные данные обрабатывали статистически. Достоверность отличий между средними определяли с использованием t-критерия Стьюдента [68]. Корреляционный и дисперсионный анализы проводили с помощью программы Statgraphics (версия 3.0) (“STSC, Inc.” США) в режимах Simple Correlation, One-Way ANOVA и Multifactor ANOVA. Принадлежность подгрупп животных к разным гомогенным группам оценивали с помощью Multiple range analysis (Statgraphics (версия 3.0) (“STSC, Inc.” США)). Принадлежность возрастных подгрупп к разным гомогенным группам проводили только в случае достоверности критерия Фишера. При этом оценивали количество гомогенных групп, образуемых экспериментальными подгруппами, с уровнем достоверности р<0,05. Баллы подгруппам присваивали на основании их принадлежности к разным гомогенным группам по мере увеличения среднего. При этом минимальный балл получала временная подгруппа с минимальным средним, максимальный балл – временная подгруппа с максимальным средним, а дробный балл (1,5) получали подгруппы, входящие одновременно в две гомогенные группы. На основании присвоенных баллов делали вывод о динамике изменения активности ферментов.


ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ



3.1. Исследование активности основных карбоксипептидаз в тканях крыс разного возраста, испытавших пренатальное воздействие этанола



3.1.1. Исследование активности карбоксипептидазы Н в тканях пренатально алкоголизированных крыс разного возраста

Согласно данным дисперсионного анализа пренатальное воздействие этанола достоверно влияло на активность КПН в стриатуме, надпочечниках и семенниках самцов, в гипоталамусе, стриатуме и надпочечниках самок (табл. 1). 

Табл. 1. Дисперсионный анализ влияния пренатальной алкоголизации на активность КПН в тканях животных разного возраста (значения критерия Фишера FФ).



Ткань

Самцы

Самки



FФ

Гипоталамус

0,16

7,65**

Стриатум

4,75*

4,85*

Гипофиз

1,78

0,00

Надпочечники

9,97**

9,16**

Половые железы

4,31*

1,17



Примечание: здесь и в табл. 2-8, 11, 12: n = 5÷8; достоверность критерия Фишера * – р < 0,05, ** – р < 0,01, *** – р < 0,001.



При этом у самцов наблюдалось достоверное снижение активности КПН в стриатуме в возрасте Р0 и Р14 (рис. 1), в гипофизе в возрасте Р14, в надпочечниках в возрасте Р28 и Р120, в семенниках в Р0 и Р120 (рис. 2) по сравнению с интактными животными. У пренатально алкоголизированных самок наблюдалось достоверное снижение активности КПН в гипоталамусе в Р0, Р14, Р28, в стриатуме в Р14, Р45 (рис. 3), в гипофизе в Р0, в надпочечниках и яичниках в Р0 (рис. 4); увеличение активности в гипоталамусе (рис. 3) и в гипофизе в Р120 (рис. 4). Во всех остальных случаях изменений ферментативной активности не выявлено.

Наиболее существенные изменения активности КПН (40% – 50%) наблюдались в стриатуме, гипофизе, половых железах животных обоего пола и гипоталамусе самок на ранних этапах постнатального развития, а так же в надпочечниках самцов в Р28 и Р120, в семенниках в Р120, в гипофизе самок в Р120 (113%).

По данным дисперсионного анализа активность КПН достоверно зависела от возраста во всех тканях животных, кроме гипоталамуса самок (табл. 3) и семенников самцов алкоголизированных групп, а также гипоталамуса самцов контрольной и алкоголизированной групп (табл. 2).

Табл. 2. Дисперсионный анализ влияния возраста на активность КПН в тканях самцов крыс (значения критерия Фишера FФ, баллы возрастных групп).



Ткань

Контрольные группы

Алкоголизированные группы



FФ

Возрастные группы

FФ

Возрастные группы





n

0

14

28

45

120



n

0

14

28

45

120

Гипоталамус

0,36













1,81













Стриатум

7,90***

2

1

1,5

2

1

1

31,58***

3

1

2

3

2

2

Гипофиз

35,53***

4

1

2,5

4

3

2

11,52***

3

1

1,5

3

2,5

1,5

Надпочечники

12,72***

2

1

1

2

1

1

9,18***

3

3

2,5

2

1,5

1

Семенники 

5,13**

2

1,5

1,5

1

1

2

1,19














Табл. 3. Дисперсионный анализ влияния возраста на активность КПН в тканях самок крыс (значения критерия Фишера FФ, баллы возрастных групп).



Ткань

Контрольные группы

Алкоголизированные группы



FФ

Возрастные группы

FФ

Возрастные группы





n

0

14

28

45

120



n

0

14

28

45

120

Гипоталамус

5,78**

2

1,5

2

1,5

1,5

1

0,04













Стриатум

15,40***

3

1

3

2

2

1,5

11,93***

3

1

2

3

1,5

1,5

Гипофиз

12,54***

2

1

2

2

2

1

8,74***

2

1

2

2

2

2

Надпочечники

33,83***

3

1,5

3

2

1,5

1

8,12***

2

1

2

1,5

1

1

Яичники 

8,37***

3

2,5

3

1,5

1

1,5

12,97***

3

1,5

3

2

1

1,5



В стриатуме интактных самок (рис. 3) активность КПН значительно повышалась от Р0 к Р14, а затем постепенно снижалась к Р120 практически до исходного уровня. При пренатальной алкоголизации активность фермента постепенно повышалась от Р0 к Р28, а затем снижалась к Р45 – Р120 до уровня Р28.

В гипофизе интактных самок (рис. 4) активность КПН повышалась от Р0 к Р14 – Р45, а затем вновь снижалась до исходного уровня. У пренатально алкоголизированных самок активность фермента также повышалась от Р0 к Р14 – Р45, но не уменьшалась к Р120.

У интактных самок в надпочечниках (рис. 4) активность фермента существенно повышалась от Р0 к Р14, а затем постепенно снижалась к Р120 до исходного уровня; в яичниках (рис. 4) активность КПН значительно снижалась от максимального уровня в Р0 – Р14 к Р28 – Р120. У алкоголизированных самок возрастная динамика изменения активности фермента в надпочечниках и яичниках была сходна с интактными крысами.

Таким образом, у пренатально алкоголизированных животных отмечалось нарушение возрастной динамики изменения активности КПН. 

Активность КПН зависела от пола в гипофизе интактных животных, в гипоталамусе и надпочечниках алкоголизированных животных (табл. 4). Ферментативная активность зависела от взаимодействия пола и возраста во всех тканях контрольных животных, кроме надпочечников, а также в гипофизе и надпочечниках алкоголизированных крыс (табл. 4). Влияние пола у алкоголизированных животных меньше зависело от возраста, чем у контрольных.

Табл. 4. Дисперсионный анализ влияния пола и взаимодействия пола и возраста на активность КПН (значения критерия Фишера: FФ1– влияние пола, FФ2 – взаимодействие влияния пола и возраста).



Ткань

Контрольные группы

Алкоголизированные группы



FФ1

FФ2

FФ1

FФ2

Гипоталамус

1,79

2,92*

7,72**

1,16

Стриатум

1,40

4,58**

0,25

0,68

Гипофиз

5,22*

6,82***

0,30

3,35*

Надпочечники

1,34

1,49

6,31*

4,44**

Половые железы 

0,90

3,97**

0,14

0,86



У контрольных самок в гипоталамусе, по сравнению с самцами, активность КПН была выше в Р14, ниже в Р120 и одинаковой в остальные возрастные периоды. У пренатально алкоголизированных самок – ниже в Р28 и не отличалась в других возрастных группах от контрольных самцов (рис. 1, 3).

В стриатуме контрольных самок активность КПН была выше, чем у самцов в Р14 и Р45, но не отличалась у алкоголизированных крыс в течение всего исследуемого периода (рис. 1, 3).


У интактных самок, по сравнению с самцами, активность КПН в гипофизе была одинаковой в Р0, выше в Р14 и ниже в Р28 – Р120; у пренатально алкоголизированных – ниже в Р0 – Р14, не отличалась в Р28 – Р45 и выше в Р120.

В надпочечниках интактных самок ферментативная активность была одинаковой в Р0, Р45 и Р120, выше в Р14 и ниже в Р28 по сравнению с интактными самцами; у алкоголизированных самок – ниже в Р0, выше в Р14 и Р28, одинаковой в Р45 и Р120 (рис. 2, 4).

В яичниках контрольных самок активность исследуемого фермента была ниже в Р45 и Р120 по сравнению с семенниками самцов. У алкоголизированных животных обоего пола активность КПН в половых железах была одинаковой с Р0 по Р120 (рис. 1-2).

Т. е., при внутриутробном воздействии этанола произошло изменение полового соотношения активности КПН. В некоторых случаях (в гипоталамусе в Р14 и Р120, в стриатуме в Р14 и Р45, в гипофизе в Р28 и Р45, в половых железах в Р45 и Р120) активность КПН стала одинаковой у животных разного пола, в других (в гипоталамусе в Р28 и в гипофизе в Р0) у самок активность КПН стала ниже, чем у самцов, а в гипофизе в Р120 и в надпочечниках в Р28 половые отличия сохранились, но соотношение активности стало противоположным.

Таким образом, полученные результаты показывают, что у контрольных животных активность КПН изменялась с возрастом практически во всех тканях. Причем наибольшая ферментативная активность отмечалась у самцов в Р28 во всех тканях (кроме семенников), в семенниках в Р120, а у самок в Р14 во всех тканях. Это согласуется с литературными данными о наиболее существенных изменениях у самок крыс в инфантильном периоде (с Р8 по Р21), у самцов – в ювенильном (с Р21 по Р32) и препубертатном (после Р32) периодах [12]. Это подтверждает ранее высказанное предположение о вовлечение КПН в процесс пубертации и формирование половых отличий [88, 101].

Возрастная динамика активности КПН в отделах мозга отличалась от таковой в периферических тканях. Вероятно, это объясняется вовлечением изучаемого фермента в метаболизм разных пептидов в мозге и в периферических тканях [41, 124, 174].

При влиянии пренатальной алкоголизации наблюдалось нарушение возрастной динамики изменения активности КПН. Причем у самок наиболее существенно она нарушалась в гипоталамусе и стриатуме, а у самцов – в надпочечниках и семенниках. Возможно, пренатальная алкоголизация, изменяя уровень активности КПН – одного из ферментов обмена биологически активных пептидов, у самок нарушала формирование и функционирование отделов ЦНС, а у самцов – периферических звеньев ГГНС и ГГГС [109, 114, 177, 182, 190, 191, 208, 269, 280, 281, 282, 291, 313].

Изменение активности КПН в тканях эмбрионально алкоголизированных животных в разные возрастные периоды происходило преимущественно в сторону снижения. И только в гипофизе и гипоталамусе самок в Р120 активность КПН увеличилась. Причем в гипоталамусе (отделе, играющем важнейшую роль в патогенезе алкоголизма) самок наблюдались отличия практически в течение всего периода онтогенеза. Тогда как у самцов в этом отделе изменения активности КПН с Р0 до Р120 не выявлены.

Внутриутробное воздействие этанола вызвало нарушение половых отличий активности данного фермента, что, вероятно, связано с нарушением процесса пубертации и формирования половых отличий у потомков алкоголиков [109, 138, 177, 239, 264, 265, 271, 280, 281].


3.1.2. Исследование активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях пренатально алкоголизированных крыс разного возраста

Согласно данным дисперсионного анализа пренатальное воздействие этанола достоверно влияло на активность ФМСФ-КП в яичниках самок (табл. 5).

Табл. 5. Дисперсионный анализ влияния пренатальной алкоголизации на активность ФМСФ-КП тканях животных разного возраста (значения критерия Фишера FФ)



Ткань

Самцы

Самки



FФ

Гипоталамус

0,21

2,49

Стриатум

1,99

1,48

Гипофиз

0,61

0,29

Надпочечники

0,04

1,09

Половые железы

0,80

4,85*



При этом у самцов (рис. 5, 6) наблюдалось достоверное снижение активности ФМСФ-КП в стриатуме в Р14 и Р120, в гипофизе и семенниках в Р14.

У пренатально алкоголизированных самок активность ФМСФ-КП была ниже во всех исследованных тканях в Р14 и в яичниках в Р120, и была выше в гипофизе в Р120 (рис. 7, 8) по сравнению с интактными самками. Во всех остальных случаях изменений ферментативной активности не выявлено.

Наиболее существенные изменения активности ФМСФ-КП (23% – 48%) наблюдались в гипофизе, стриатуме, половых железах самцов и во всех тканях самок на ранних этапах постнатального развития, а также в яичниках самок в Р120.

По данным дисперсионного анализа возраст достоверно влиял на ФМСФ-КП во всех отделах и тканях животных обоего пола контрольной и алкоголизированной групп, кроме гипоталамуса и яичников алкоголизированных самок (табл. 6, 7).

Табл. 6. Дисперсионный анализ влияния возраста на активность ФМСФ-КП в тканях самцов крыс (критерий Фишера FФ, баллы возрастных подгрупп).



Ткань

Контрольные группы

Алкоголизированные группы



FФ

Возрастные группы

FФ

Возрастные группы





n

0

14

28

45

120



n

0

14

28

45

120

Гипоталамус

3,32*

2

1,5

2

1,5

1,5

1

4,46**

2

1,5

2

2

1,5

1

Стриатум

9,15***

3

2,5

3

2

1,5

1

4,03*

2

1,5

1,5

2

1,5

1

Гипофиз

7,70***

3

2

3

1,5

2,5

1

7,20***

3

1,5

3

1,5

2,5

1

Надпочечники

5,42**

2

2

2

1

1,5

1

4,05*

2

2

1,5

1,5

1

1

Семенники 

45,70***

4

3

4

2,5

2

1

14,09***

2

2

2,5

2

2

1



При этом наблюдалась следующая возрастная динамика активности ФМСФ-КП. В гипоталамусе самцов активность ФМСФ-КП повышалась к Р14 у интактных и к Р14 – Р28 у алкоголизированных крыс, и значительно снижалась к Р120 у обеих групп (рис. 5).

В стриатуме контрольных самцов активность фермента плавно уменьшалась от максимального значения в Р0 – Р14 к Р120; у алкоголизированных самцов активность ФМСФ-КП была наибольшей в Р28 и наименьшей в Р120 (рис. 5).

В гипофизе контрольных самцов активность ФМСФ-КП повышалась от Р0 до максимального значения к Р14, затем снижалась к Р28, вновь, но в меньшей степени, повышалась к Р45, а к Р120 стала ниже исходного уровня. В гипофизе алкоголизированных самцов динамика изменения ферментативной активности практически не отличалась от интактных животных (рис. 6).

Табл. 7. Дисперсионный анализ влияния возраста на активность ФМСФ-КП в тканях самок крыс (критерий Фишера FФ, баллы возрастных подгрупп).



Ткань

Контрольные группы

Алкоголизированные группы



FФ

Возрастные группы

FФ

Возрастные группы





n

0

14

28

45

120



n

0

14

28

45

120

Гипоталамус

6,91***

3

2

3

2,5

1,5

1

2,32

2

1,5

1,5

2

1,5

1

Стриатум

22,89***

3

1,5

3

2

1,5

1

7,20***

2

1,5

2

2

1,5

1

Гипофиз

32,09***

3

1,5

3

1

2

1

2,80*

2

1,5

2

1,5

1,5

1

Надпочечники

6,08**

2

2

2

1

1,5

1

3,02*

2

2

1,5

1,5

1,5

1

Яичники 

4,52**

3

1

3

1,5

1,5

4

1,34















В надпочечниках интактных и опытных самцов ферментативная активность плавно уменьшалась от Р0 – Р14 к Р28 – Р120 (рис. 6).

В семенниках контрольных самцов активность исследуемого фермента повышалась от Р0 до максимального уровня в Р14, значительно снижалась к Р28 – Р45, а в Р120 стала минимальной. У пренатально алкоголизированных самцов активность ФМСФ-КП незначительно изменялась в Р0 – Р45 и снизилась к Р120 (рис. 6). 

Также как и у самцов, пренатальная алкоголизация вызывала достоверные более или менее существенные нарушения возрастной динамики активности ФМСФ-КП практически во всех тканях самок. Если у контрольных самок возрастная динамика имела пик активности в Р14 во всех тканях, а в надпочечниках еще и в Р0, и яичниках в Р120, то у алкоголизированных самок таких выраженных пиков не было практически нигде. 

В гипоталамусе и стриатуме интактных самок (рис. 7) ферментативная активность увеличивалась от Р0 к Р14 и плавно уменьшалась к Р120. У алкоголизированных самок в этих отделах активность ФМСФ-КП менее значительно изменялась с возрастом на ранних этапах онтогенеза, но была несколько выше в Р28 в гипоталамусе и в Р14 – Р28 в стриатуме по сравнению с другими возрастными группами.

В гипофизе интактных самок (рис. 8) активность данного фермента существенно изменялась в период с рождения до Р120. При этом отмечалось два пика активности – наибольший в Р14, и меньше – в Р45. В гипофизе алкоголизированных самок активность ФМСФ-КП незначительно изменялась с возрастом, с несколько большим уровнем активности в Р14.

В надпочечниках контольных и алкоголизированных самок активность ФМСФ-КП была наибольшей в Р0 – Р14 и наименьшей в Р28 и Р120 у интактных крыс, и наибольшей в Р0 и наименьшей в Р120 у алкоголизированных крыс (рис. 8).

В яичниках интактных самок активность ФМСФ-КП была минимальной в Р0, Р28 и Р45, значительно возрастала в Р14 и еще больше в Р120 (рис. 8).

Пол и взаимодействие пола и возраста достоверно влияли на активность ФМСФ-КП в половых железах интактных и алкоголизированных животных, а также в гипофизе интактных крыс (табл. 8).

У контрольных животных активность ФМСФ-КП была достоверно выше у самок, чем у самцов в стриатуме и гипофизе в Р14 и Р45, а также в половых железах в Р28-120. При алкоголизации в эмбриональном периоде, активность ФМСФ-КП в стриатуме и гипофизе в Р14 и Р45 выравнялась у животных разного пола, а в гипофизе в Р120 и половых железах в Р0 она стала выше у самок, чем у самцов. При снижении активности ФМСФ-КП в яичниках в Р120, она все равно осталась выше (в 10 раз), чем в семенниках (рис. 5-8).

Табл. 8. Дисперсионный анализ влияния пола и взаимодействия влияния пола и возраста на активность ФМСФ-КП (значения критерия Фишера: FФ1– влияние пола, FФ2 – взаимодействие влияния пола и возраста).



Ткань

Контрольные группы

Алкоголизированные группы



FФ1

FФ2

FФ1

FФ2

Гипоталамус

0,85

0,12

0,45

0,31

Стриатум

3,28

4,18

3,43

0,63

Гипофиз

5,00*

3,25*

2,67

0,45

Надпочечники

0,14

0,11

0,81

0,44

Половые железы 

62,30***

12,47***

40,72***

7,85***



Таким образом, максимальные значения активности ФМСФ-КП у контрольных животных обоего пола отмечались во всех тканях на ранних этапах постнатального развития (в основном в Р14, иногда в Р0-Р14), а также в яичниках самок в Р120. Это, вероятно, свидетельствует о том, что, ФМСФ-КП наиболее активно вовлекается в обмен регуляторных пептидов на ранних этапах постнатального развития и в яичниках в Р120. Наиболее существенные изменения активности ФМСФ-КП при пренатальной алкоголизации наблюдались в эти же возрастные периоды. Это, очевидно, отражает нарушение процесса развития и полового созревания потомков алкоголиков [109,138, 177, 239, 264, 265, 271, 280, 281].

У пренатально алкоголизированных животных отмечалось нарушение возрастной динамики изменения активности ФМСФ-КП. Причем у самцов она существенно изменялась в стриатуме и семенниках, а у самок – во всех тканях, кроме надпочечников. Возможно, пренатальная алкоголизация, изменяя уровень активности ФМСФ-КП, нарушала формирование и функционирование пептидергических систем в этих тканях.

В железах внутренней секреции крыс обоего пола активность ФМСФ-КП, как правило, была в несколько раз выше, чем в отделах мозга. Вероятно, это объясняется тем, что в периферических отделах ГГНС и ГГГС исследуемому ферменту принадлежит более значимая функция в обмене биологически активных пептидов, чем в отделах ЦНС. 

При достоверном влиянии пола и взаимодействия пола и возраста, пренатальная алкоголизация явилась причиной того, что в гипофизе и стриатуме в Р14 и Р45 активность ФМСФ-КП стала практически одинаковой у животных разного пола, тогда как в норме ферментативная активность у самок была выше, чем у самцов. В яичниках и семенниках половое соотношение активности ФМСФ-КП в Р28 – Р120 сохранилось (у самок выше, чем у самцов), но в Р0 в половых железах и в Р120 в гипофизе стала выше у самок, чем у самцов.

Наиболее существенные изменения половых отличий активности ФМСФ-КП на разных стадиях развития у пренатально алкоголизированных животных отмечены в гипофизе – эндокринной железе, играющей важнейшую роль в гормональной регуляции всего организма [12, 95], что, вероятно, является одной из причин нарушения развития потомков алкоголиков.



3.2. Исследование влияния хронической алкоголизации
на активность основных карбоксипептидаз в тканях взрослых крыс, испытавших пренатальное воздействие этанола



Для понимания механизмов влияния пренатальной алкоголизации на формирование предрасположенности к развитию алкоголизма у человека и животных представляет интерес исследование активности ферменов обмена регуляторных пептидов, в том числе и опиоидных пептидов, в отделах мозга и периферических тканях взрослых крыс, перенесших внутриутробную алкоголизацию, при последующем хроническом воздействии этанола. Немаловажным также является вопрос о половых отличиях при этом.



3.2.1. Исследование поведения пренатально алкоголизированных животных в тесте «открытое поле»

Методика «открытого поля», внедренная в практику лабораторных исследований Hall C.S. в 1934 г. [194], позволяет количественно оценить моторную активность крыс и мышей по двум основным компонентам: вертикальному – стойки и горизонтальному – локомоции. Регистрация отдельных форм поведения (заход в центр, неподвижность, количество болюсов и т. д.) при всей трудности интерпритации может дать весьма точную первичную характеристику состояния животного (страх, возбуждение, навязчивое поведение, снижение или повышение ориентировочной реакции и т. д.) [194]. Количество локомоций и стоек широко варьирует у разных животных, но обычно прослеживается определенная структура, характеризующая двигательное поведение группы животных в целом. В частности, такую информацию несет вычисляемое соотношение между двигательной (локомоции) и вертикальной (стойки) активностью [194].

Несмотря на некоторую несогласованность опубликованных данных об изменении поведения животных, подвергнутых алкоголизации в эмбриональном периоде [70, 83, 153, 241, 281, 299, 309], нас при проведении эксперимента интересовало наличие таких изменений, влияние на них последующей алкоголизации и половые отличия при этом. 

У контрольных животных не было выявлено половых отличий исследованных поведенческих параметров (табл. 9, 10).


Табл. 9. Параметры поведения в тесте «открытое поле» взрослых самцов крыс.



Параметры поведения

КК

ЭК

КЭ

ЭЭ

Кол-во посещений периферических квадратов

19,8±9,9

38,5±15,4**

38,4±18,2*

13,3±10,8ХХХ

Кол-во посещений центральных квадратов

2,17±2,4

5,3±3,5*

3,9±3,4

0,3±0,4* ХХХ

Суммарная двигательная активность

23,0±11,0

42,3±15,9**

46,6±26,5*

13,8±11,3ХХХ

Суммарная вертикальная активность

14,8±6,6

19,0±4,0

12,1±5,4

9,3±4,4* ХХХ

Суммарная двигательная и вертикальная активность

37,8±17,6

61,3±18**

58,8±20,2*

23,0±13,5* ХХХ

Соотношение суммарная двигательная: суммарная вертикальная активность

2:1

2:1

4:1

1,5:1



Здесь и в табл. 10: КК – параметры поведения контрольных подгрупп животных, ЭК – пренатально алкоголизированных подгрупп, КЭ – постнатально алкоголизированных подгрупп, ЭЭ – пренатально и постнатально алкоголизированных подгрупп; M ± m; n = 12; достоверность отличий * – р < 0,05; * * – р < 0,01, ; * * * – р < 0,001 относительно контроля; Х Х Х – р < 0,001 относительно ЭК, + – р < 0,05; + + – р < 0,01, + + + – р < 0,001 относительно самцов.



У пренатально алкоголизированных животных обоего пола отмечено увеличение подвижности (табл. 9, 10). Причем у самок все параметры увеличились в большей степени (в 2-3 раза), чем у самцов (в 2 раза). Суммарная двигательная активность увеличилась в основном за счет увеличения частоты посещений периферических квадратов. У самок в отличие от самцов, также увеличилось количество вертикальных стоек, являющихся показателем исследовательской активности и/или страха.


Табл. 10. Параметры поведения в тесте открытого поля взрослых самок крыс.



Параметры поведения

КК

ЭК

КЭ

ЭЭ

Кол-во посещений периферических квадратов

23,7±9,6

62,2±10,2*** +++

20,0±13,8

61,0±41,4* ++

Кол-во посещений центральных квадратов

2,8±2,6

8,3±3,1*** +

2,0±2,4

11,0±11,2* ++

Суммарная двигательная активность

26,3±9,6

68,1±9,7*** +++

20,9±14,6+

62,2±42,2* ++

Суммарная вертикальная активность

13,5±4,1

22,6±3,4*** +

11,4±7,4

21,3±11,6++

Суммарная двигательная и вертикальная активность

39,8±11,7

90,7±8,8*** +++

32,3±21,9+

83,5±53,6* ++

Соотношение суммарная двигательная: суммарная вертикальная активность

2:1

3:1

2:1

2:1



Соотношение «суммарная двигательная активность:суммарная вертикальная активность», которая у контрольных животных была 2:1, мало изменилась у самцов (табл. 9), а у самок стала 3:1 (табл. 10).

Постатальное воздействие этанола на животных, не подвергавшихся пренатальной алкоголизации, не влияло на поведение самок. У самцов же произошли изменения, аналогичны тем, которые были отмечены у пренатально алкоголизированных животных. Соотношения суммарных активностей были у самцов – 4:1 (табл. 9), у самок – 2:1 (табл. 10).

Последующая алкоголизация животных, подвергавшихся воздействию этанола во внутриутробном периоде, также по-разному повлияла на поведение самцов и самок (табл. 9, 10). У самцов подвижность резко снижалась и по некоторым показателям стала достоверно ниже не только пренатально алкоголизированных, но и интактных самцов. Соотношение двух видов активности у самцов стало 1,5;1 (табл. 9). Подвижность самок, а, следовательно, и соотношение суммарных двигательной и вертикальной активностей, была такой же, как и у самок, подвергавшихся только пренатальной алкоголизации. Суммарная вертикальная активность – показатель реакции страха или исследовательской активности [72, 74] – вернулась практически к норме. 

Результаты теста отразили то, что пренатальная алкоголизация усугубляла нарушение поведенческих реакций у взрослых самцов при хроническом воздействии этанола. На самок пренатальная алкоголизация такого эффекта не оказывала.



3.2.2. Исследование влияния хронической алкоголизации на активность карбоксипептидазы Н в тканях взрослых крыс, испытавших пренатальное воздействие этанола



В табл. 11 и на рис. 9-12 представлены результаты исследования активности КПН при пренатальной, постнатальной и обоих вместе видах алкоголизации крыс обоего пола.

Пол достоверно влиял на активность КПН в гипофизе, гипоталамусе, гиппокампе, четверохолмие и половых железах (табл. 11). У интактных самок в этих тканях активность фермента была достоверно ниже, чем у самцов.

Согласно данным дисперсионного анализа пренатальная алкоголизация влияла на активность КПН во всех отделах, кроме стриатума и гиппокампа (табл. 11). В четверохолмие, надпочечниках и семенниках самцов, испытавших внутриутробное воздействие этанола, активность КПН была ниже, чем у контрольных самцов (рис. 9, 10). У пренатально алкоголизированных самок в гипоталамусе и гипофизе активность была выше, а в четверохолмие ниже, чем у контрольных самок (рис. 11, 12).

Взаимодействие пренатальной алкоголизации и пола влияло на активность исследованного фермента в гипофизе, стриатуме и половых железах (табл. 11).

Пренатальная алкоголизация вызывала изменение активности КПН в разных тканях у самцов и самок: у самцов в четверохолмие, надпочечниках и семенниках; у самок в гипоталамусе, четверохолмие и гипофизе. Причем у самцов активность КПН снижалась во всех указанных отделах, а у самок повышалась в гипоталамусе и гипофизе и снижалась в четверохолмие.

При этом наблюдалось выравнивание ферментативной активности у животных разного пола в гипоталамусе, четверохолмие и половых железах, а в гипофизе самок активность КПН стала выше, чем у самцов.

Постнатальная алкоголизация влияла на активность КПН во всех тканях, кроме больших полушарий и гипофиза. Взаимодействие влияния постнатальной алкоголизации и пола на активность КПН было отмечено в гипоталамусе, четверохолмие, гипофизе и половых железах (табл. 11).

Табл. 11. Дисперсионный анализ влияния пола, пренатальной алкоголизации, постнатальной алкоголизации и их взаимодействия на активность КПН в тканях взрослых животных.



Ткань

FФ1

FФ2

FФ3

FФ4

FФ5

FФ6

Гипоталамус

31,53***

5,04*

1,66

15,76***

3,60*

0,81

Стриатум

2,33

0,24

7,05*

21,14***

2,99

7,61**

Гиппокамп

10,46**

0,19

2,21

12,09**

2,34

0,06

Четверохолмие

3,73*

8,67**

0,05

3,28*

3,86*

1,70

Большие полушария

0,16

14,10***

0,75

0,49

0,10

2,02

Гипофиз

5,14*

3,34*

12,2**

0,07

3,36*

2,88

Надпочечники

0,11

11,26

2,64

6,78*

3,05

3,95*

Половые железы 

7,92*

4,58*

4,50*

6,24*

19,78*

0,15



Примечание: здесь и в табл. 12 значения критерия Фишера: FФ1 – влияние пола, FФ2 – влияние пренатальной алкоголизации, FФ3 – влияние взаимодействия пренатальной алкоголизации и пола, FФ4 –влияние постнатальной алкоголизации, FФ5 – влияние взаимодейстия постнатальной алкоголизации и пола, FФ6 – влияние взаимодействия пренатальной и постнатальной алкоголизации.

У постнатально алкоголизированных самцов наблюдалось увеличение ферментативной активности в гипоталамусе и снижение в четверохолмии и семенниках по сравнению с контролем (рис. 9, 10). У постнатально алкоголизированных самок активность КПН была выше, чем у интактных самок, в гиппокампе, четверохолмии, гипофизе и яичниках (рис. 11, 12).

Таким образом, постнатальтная алкоголизация вызывала изменение активности КПН в разных тканях у животных разного пола: у самцов в гипоталамусе, четверохолмии и семенниках; у самок в гиппокампе, четверохолмии, гипофизе и яичниках. Причем у самок активность КПН повышалась во всех указанных отделах, а у самцов повышалась в гипоталамусе и снижалась в четверохолмии и семенниках.

При этом в гипофизе, гиппокампе, четверохолмии и половых железах постнатально алкоголизированных крыс, в отличие от контрольных, произошло выравнивание ферментативной активности у животных разного пола. В остальных тканях половое соотношение активности КПН осталось таким же, как у интактных подгрупп.

При сочетании пренатальной и постнатальной алкоголизации у самцов активность КПН в стриатуме и гиппокампе была выше, а в гипофизе и семенниках ниже, чем у самцов всех других подгрупп (КК, ЭК, КЭ). В гипоталамусе ЭЭ самцов активность фермента была выше по сравнению с контрольными и пренатально алкоголизированными самцами, но не отличалась от постнатально алкоголизированных. В четверохолмие и надпочечниках ЭЭ самцов активность КПН была выше, чем у пренатально алкоголизированных самцов, но не отличалась от контрольных и постнатально алкоголизированных. В больших полушариях самцов, подвергнутых пренатальной и постнатальной интоксикации, активность фермента была ниже по сравнению с контрольными и постнатально алкоголизированными самцами, но не отличалась от пренатально алкоголизированных (рис. 9, 10).

По сравнению с самками интактной подгруппы у ЭЭ самок активность КПН была выше в гипоталамусе, гиппокампе, гипофизе, яичниках и ниже в больших полушариях. По сравнению с пренатально алкоголизированными самками у самок ЭЭ подгруппы ферментативная активность была выше в стриатуме, гиппокампе, четверохолмии и яичниках. По сравнению с постнатально алкоголизированными самками у самок ЭЭ подгруппы активность исследуемого фермента была выше в гипоталамусе и ниже в четверохолми. В остальных слу чаях отличия ферментативной активности в тканях самок ЭЭ подгруппы от самок других подгрупп не наблюдались (рис. 11, 12).

У ЭЭ самок активность КПН была ниже в стриатуме, гиппокампе, четверохолмии и выше в гипофизе, яичниках по сравнению с самцами ЭЭ подгруппы.




Причем, в отличие от контроля половое различие ферментативной активности в гипоталамусе исчезло, в стриатуме появилось. В гипофизе и половых железах половое соотношение активности КПН стало противоположным по сравнению с интактными животными.

Таким образом, сочетание пренатальной и постнатальной алкоголизации вызвало по сравнению с контролем изменение активности КПН в большем количестве исследованных тканей, чем каждый из них в отдельности. Причем у эмбрионально алкоголизированных самцов действие постнатальной алкоголизации вызывало в большинстве исследованных тканей более существенные изменения ферментативной активности, чем каждый из этих видов интоксикации в отдельности. Постнатальная интоксикация эмбрионально алкоголизированных самок, напротив, приводила в большинстве тканей к меньшим или таким же изменениям активности КПН по сравнению с контролем, к каким приводило только постнатальное воздействие этанола. Т. е., пренатальная алкоголизация самок не являлась причиной большего влияния последующей постнатальной алкоголизации, что наблюдалось у самцов. Возможно, это свидетельствует о том, что пептидергические системы пренатально алкоголизированных самок, в отличие от самцов, более устойчивы к последующей этанольной интоксикации.



3.2.3. Исследование влияния хронической алкоголизации на активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях взрослых крыс, испытавших пренатальное воздействие этанола

В табл. 12 и на рис. 13-16 представлены результаты исследования активности ФМСФ-КП при отдельном и совместном влиянии пренатальной и постнатальной и алкоголизации на крыс обоего пола.

По данным дисперсионного анализа (табл. 12) пол достоверно влиял на активность ФМСФ-КП в четверохолмие, больших полушариях и половых железах. Пренатальное воздействие этанола достоверно влияло на активность ФМСФ-КП в гипофизе и половых железах. Взаимодействие влияния пола и пренатальной алкоголизации на активность фермента обнаружено в гиппокампе и половых железах.

При пренатальной алкоголизации у самцов не выявлены изменения активности ФМСФ-КП по сравнению с контрольной подгруппой (рис. 13, 14). У самок отмечено повышение активности в гиппокампе и гипофизе и снижение в яичниках по сравнению с интактными самками (рис. 15, 16). 

У интактных самок активность ФМСФ-КП в стриатуме и половых железах была выше, чем у самцов. У пренатально алкоголизированных самок активность фермента была выше, чем у самцов, в больших полушариях, гипофизе и яичниках (рис. 13-16).

Постнатальное воздействие этанола влияло на активность ФМСФ-КП в гипоталамусе, стриатуме, больших полушариях, гипофизе и надпочечниках (табл. 12). При этом у самцов активность ФМСФ-КП была снижена по сравнению с контролем в четверохолмие и всех исследованных железах и имела тенденцию к снижению в остальных тканях (рис. 13-14). У самок активность ФМСФ-КП была снижена по сравнению с контролем в стриатуме, больших полушариях и всех исследованных железах (рис. 15-16).

Активность исследуемого фермента достоверно зависела от взаимодействия пола и постнатальной алкоголизации в гиппокампе и четверохолмие (табл. 12). У постнатально алкоголизированных самок активность ФМСФ-КП была выше, чем у КЭ самцов, в четверохолмие и половых железах (рис. 13-14).

По данным дисперсионного анализа ферментативную активность зависела от взаимодействия пренатальной и постнатальной алкоголизации в гипоталамусе (табл. 12).


Табл. 12. Дисперсионный анализ зависимости активности ФМСФ-КП от пола, пренатальной алкоголизации, постнатальной алкоголизации и их взаимодействия в тканях взрослых животных. 



Ткань

FФ1

FФ2

FФ3

FФ4

FФ5

FФ6

Гипоталамус

0,81

1,38

0,03

12,82**

2,44

3,77*

Стриатум

3,34

0,12

1,16

9,88**

0,03

0,20

Гиппокамп

0,003

2,71

7,96**

0,63

6,08*

2,48

Четверохолмие

7,38*

3,49

0,02

0,94

5,46*

0,04

Большие полушария

5,67*

0,13

1,66

13,03***

0,001

0,51

Гипофиз

2,85

4,49*

1,20

31,92***

2,93

2,23

Надпочечники

0,09

0,09

0,14

6,89*

2,40

1,06

Половые

железы 

103,15***

6,06*

5,62*

2,44

1,69

4,23



У ЭЭ самцов по сравнению с контрольными самцами ферментативная активность была снижена во всех тканях, кроме стриатума. По сравнению с пренатально алкоголизированными самцами она была снижена во всех тканях, кроме четверохолмия и гипофиза. По сравнению с постнатально алкоголизированными самцами у ЭЭ самцов ферментативная активность была снижена в гипоталамусе, гиппокампе, семенниках, увеличена в гипофизе и не отличалась в остальных тканях (рис. 13-14).

У ЭЭ самок по сравнению с контролем ферментативная активность была ниже в больших полушариях и гипофизе и выше в гиппокампе; по сравнению с пренатально алкоголизированными самками активность исследуемого фермента была ниже в больших полушариях и гипофизе; по сравнению с постнатально алкоголизированными самками – выше в гипофизе (рис. 15-16).

У ЭЭ самок во всех тканях, кроме четверохолмия и гипофиза, активность ФМСФ-КП стала выше, чем у ЭЭ самцов (рис. 13-16).

Таким образом, пренатальная алкоголизация по-разному влияла на активность фермента в разных тканях: активность увеличивалась в гиппокампе и гипофизе, снижалась в яичниках и не изменялась в остальных тканях. Это, вероятно, отражает дезинтегрирующее действие этанола на пептидергические системы, что проявляется, например, в избирательном изменении содержания опиоидных пептидов в разных тканях [69, 153, 263]. Причем, пренатальная алкоголизация по-разному влияла на активность ФМСФ-КП у самцов и самок: активность не изменялась у самцов, но изменялась у самок. Возможно, пренатальное воздействие этанола более существенно изменяет белковый обмен у самок.

Постнатальная алкоголизация снижала активность фермента во многих тканях животных обоего пола. Это согласуется с литературными данными о снижении скорости белкового обмена в различных органах и системах при хронической этанольной интоксикации [2, 23, 61, 98, 112]. Также, многие авторы отмечают снижение содержания опиоидных пептидов в отделах мозга [9, 18, 24, 84, 146, 348], что, по их мнению, является отражением процесса адаптации опиоидной системы к избыточной стимуляции, приводящей к снижению функциональной активности этой системы [9, 18, 84].

Но влияние хронической постнатальной алкогольной интоксикации на активность ФМСФ-КП отличалось в разных отделах мозга. Активность фермента достоверно снижалась или имела тенденцию к снижению в стриатуме и больших полушариях животных обоего пола и в четверохолмие самцов по сравнению с нормой. В остальных отделах активность не изменялась. Вероятно, это связано с несогласованным снижением уровней разных нейропептидов [9, 18, 24, 84, 146, 348,] и даже увеличением концентрации некоторых из них [98] под действием хронической алкоголизации в разных отделах мозга. Панченко Л. Ф. с соавт. [80] считают, что с такого дисбаланса в опиоидной системе мозга начинается формирование зависимости и толерантности к алкоголю, далее в процесс вовлекаются сопряженные с ней нейромедиаторные и нейромодуляторные системы мозга, что нарушает слаженную работу мозга в целом.

У самцов совместное действие пренатальной и постнатальной алкоголизации вызывали в большинстве исследованных тканей более существенные изменения ферментативной активности, чем каждый из этих видов интоксикации в отдельности. У самок пренатальная алкоголизация в большинстве тканей не приводила к усугублению изменений активности исследуемого фермента при последующем воздействии этанола. Это, возможно, может быть признаком меньшей восприимчивости пептидергических систем у эмбрионально алкоголизированных самок к воздействию этанола в постнальном периоде.

Совместное действие пренатальной и постнатальной алкоголизации, по-разному влияя на самцов и самок, вызывало появление половых отличий активности ФМСФ-КП в большинстве тканей, по сравнению с нормой и каждым видом интоксикации в отдельности.


ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ



Несмотря на разностороннее активное изучение проблем алкоголизма, биохимические механизмы многих нарушений, возникающих при этом, остаются мало понятны. Одним из основных направлений является исследование нарушений, возникающих у потомства алкоголиков. В настоящее время не вызывает сомнений, что хроническое потребление алкоголя матерью во время беременности пагубно отражается на всех системах организма, в том числе и на нейрогуморальной [3, 6]. При этом возможны два пути вредного влияния длительной алкогольной интоксикации:

непосредственное токсическое воздействие в результате перехода этанола через плаценту [26];

воздействие, опосредованное изменениями, возникающими под влиянием алкоголя в организме матери (нарушением нейроэндокринной регуляции, сдвигами метаболических процессов) [143, 227].

Одним из компонентов нейрогуморальной системы является пептидергическая система. Ее функционирование в значительной мере определяется пептид-гидролазами, к которым относятся КПН и ФМСФ-ингибируемая КП. Как известно, употребление алкоголя во время беременности, приводящее к эмбрио-фетогенезу, проявляется и на протяжении постнатального развития потомства [26, 64, 69, 70, 130, 138, 143]. Поэтому вызывает интерес рассмотрение постнатальных онтогенетических изменений активности пептид-гидролаз в организме эмбрионально алкоголизированных особей.

У интактных животных наибольшая активность КПН обнаруживается в тканях с высоким уровнем нейропептидов [103], а именно в гипофизе, в гипоталамусе и четверохолмие. Во многих тканях активность этого фермента достоверно ниже у самок, чем у самцов. Полученные нами данные согласуются с мнением о вовлечении КПН в процессинг регуляторных пептидов [163, 229, 344, 350]. Возможно, у животных разного пола КПН либо вовлекается в процессинг разных пептидов, в частности в ГГГС, либо различается доля ее участия в этом процессе.

Наибольшая активность ФМСФ-КП отмечена в гипофизе, надпочечниках и яичниках (рис. 6). В мозге распределение ФМСФ-КП хорошо коррелирует с интенсивностью обмена белка (наиболее высокая в больших полушариях), но не совпадает с распределением нейропептидов [38, 42, 43, 88, 103].

Обнаружено следующее соотношение активности ферментов в тканях интактных взрослых животных и в процессе их развития: КПН ≥ ФМСФ-КП в отделах мозга и гипофизе крыс обоего пола, а также семенниках взрослых животных. В надпочечниках животных обоего пола и яичниках активность ФМСФ-КП >> КПН.

Особенности тканевого и регионального распределния КПН и ФМСФ-КП и отличия их активности в одних и тех же отделах и тканях, вероятно, объясняются, также, некоторыми отличиями в их субстратной специфичности [40, 169, 174, 330].

Активность КПН и ФМСФ-КП у контрольных крыс изменяется с возрастом практически во всех отделах и тканях (рис. 1-8). Дисперсионный анализ показал достоверное влияние возраста во многих случаях (табл. 2, 3, 6, 7).

Согласно имеющимся литературным данным [12], в процессе пубертации наиболее существенные изменения отмечаются у самок крыс в инфантильном периоде (с Р8 по Р21), а у самцов – в ювенильном (с Р21 по Р32) и перипубертатном (после Р32) периодах. В отмеченные возрастные периоды происходит формирование важнейших органов и систем.

В этих же периодах была отмечена наибольшая активность исследованных нами ферментов. Так, у интактных самцов наибольшая активность КПН отмечалась Р120 в семенниках и в Р28 в остальных тканях (рис. 1, 2, табл. 2), у самок – в Р14 во всех тканях (рис. 3, 4, табл. 3). У интактных животных обоего пола наибольшая активность ФМСФ-КП отмечалась во всех тканях в Р14, а также в надпочечниках в Р0 и в яичниках в Р120 (рис. 5-8, табл. 6, 7).

Отличие полового созревания у самок и самцов в значительной степени обусловлено разным содержанием половых гормонов, регуляторных пептидов, в частности гипоталамических факторов, регулирующих половую функцию [12]. Этим можно объяснить результаты нашего исследования, показывающие различие в активности изучаемых ферментов (КПН и ФМСФ-КП) между интактными самками и самцами, как в мозге, так и в периферических тканях. Причем наибольшие (при достоверном влиянии пола) половые отличия активности КПН у интактных животных отмечены в гипофизе, надпочечниках, половых железах, ФМСФ-КП – в гипофизе и половых железах.

Результаты нашего эксперимента отметили сходство активности КПН и ФМСФ-КП в гипофизе, отделах мозга и их возрастной динамики в отделах мозга взрослых интактных животных. В надпочечниках и половых железах активность КПН отличалась от ФМСФ-КП. Возрастная динамика активности обоих ферментов в отделах мозга отличалась от периферических тканей и различалась между семенниками и яичниками. В надпочечниках и половых железах возрастная динамика активности КПН отличалась от ФМСФ-КП. 

Согласно данным корреляционного анализа (табл. 13), в отделах мозга животных обоего пола разного возраста отмечена высокая положительная корреляция активности КПН и ФМСФ-КП. В гипофизе, надпочечниках и половых железах корреляции между ними нет.

Вероятно, все это объясняется тем, что КПН и ФМСФ-КП выполняют сходные функции в отделах мозга и разные – в периферических тканях:

в отделах мозга у особей обоего пола (но особенно у самок) КПН и ФМСФ-КП примерно в одинаковой степени вовлекаются в процессинг пропептидов;

в периферических тканях (яичниках и надпочечниках) ФМСФ-КП, в отличие от КПН, играет более существенную роль в процессинге регуляторных пептидов;

Табл. 13. Коэффициенты корреляции между активностью КПН и ФМСФ-КП в тканях самцов и самок в процессе индивидуального развития (достоверность корреляции * – р < 0,05; * * – р < 0,01; * * * – р < 0,001).



Отделы

Коэффициенты корреляции

Гипофиз 

0,23

Гипоталамус

0,74***

Стриатум

0,70***

Надпочечники

0,06

Половые железы

-0,04



в периферических тканях ФМСФ-КП также участвует в катаболизме белка.

в процессинге гипофизарных пептидов у самцов участвует преимущественно КПН;

При влиянии пренатальной алкоголизации наблюдается нарушение возрастной динамики изменения активности КПН и ФМСФ-КП во многих тканях животных разного пола. Так, если у интактных животных пики уровней ферментативной активности совпадали с периодами формирования важнейших органов и систем [12], то у эмбрионально алкоголизированных такой зависимости, как правило, не наблюдалось. Причем значительные изменения активности ферментов обнаружены у животных обоего пола в Р0. Это, вероятно, связано с эффектом абстинентного синдрома, возникающего у самого новорожденного и у его матери, что также отражается на его состоянии [64, 130]. В последующих периодах такие значительные изменения ферментативной активности отмечались реже, возможно, из-за развивающихся компенсаторных метаболических механизмов [231]. В норме в процессе индивидуального развития организма отмечается изменение содержания различных биологически активных пептидов как в мозге, так и в периферических тканях [25, 52, 55, 76, 101, 118, 119, 158, 159, 162, 181, 247, 254, 266, 267, 275, 307, 310, 328, 342, 347, 349, 351]. При этом в разные возрастные периоды происходят существенные изменения соотношений между уровнями активных пептидов и их предшественников [266], или соотношений между уровнями пептидов, происходящих из одного предшественника [181, 310]. Что, по мнению авторов, свидетельствует об изменении специфичности процессинга предшественников в ходе индивидуального развития. Также высказывается мнение [353], что возрастные изменения уровней регуляторных пептидов связаны с изменениями в функционировани и ферментных систем, участвующих в их синтезе и деградации [129, 179, 180, 258, 259, 278, 326], в том числе и ФМСФ-КП [100]. Пренатальная алкоголизация проявляется в разных возрастных периодах в изменении уровней таких важных в патогенезе алкоголизма пептидов, как опиоидных пептидов в отделах мозга [69, 153, 263]. Имеются также разрозненные данные о нарушении содержания и функционирования других биологически активных веществ в разные возрастные периоды у пренатально алкоголизированных особей [6, 26, 64, 130, 265]. Очевидно, что изменение возрастной динамики активности КПН и ФМСФ-КП у эмбрионально алкоголизированных особей отражает один из механизмов опосредованного нарушения содержания активных пептидов во время важнейших пубертатных периодов и, следовательно, нарушение развития организма, отмечающегося у потомков алкоголиков [6, 26, 64, 130]. 

Достоверное изменение активности КПН и ФМСФ-КП во всех исследованных тканях у крыс обоего пола разного возраста, подвергнутых пренатальной алкоголизации, происходит преимущественно в сторону снижения. Исключение составляет активность КПН у самок в гипофизе и гипоталамусе и ФМСФ-КП в гипофизе в возрасте Р120, где активность ферментов увеличивается по сравнению с интактными животными.

Сниженная активность исследованных ферментов, возможно, является одной из причин отмечанного у наследственно предрасположенных к алкоголизму животных меньшего содержания Met-энкефалина и β-эндорфина [76]. Установлено, что введение таким животным этанола повышает уровень данных опиоидов [76]. Предполагают, что сниженные уровни некоторых эндогенных опиоидов обуславливают влечение к этанолу, как фактору, ведущему к образованию в мозге опиоидов, т. е. к нормализации гуморальных систем вознаграждения. С этим согласуются феномены снятия абстиненции и некоторого снижения влечения к алкоголю при введении извне опиоидных нейропептидов, а также некоторых ингибиторов протеолитического распада опиоидных пептидов в организме [76].

Увеличение активности КПН в гипофизе и гипоталамусе и ФМСФ-КП в гипофизе взрослых самок крыс, очевидно, аналогично реакции организма на стресс. Многие авторы относят алкоголизацию к стрессирующим факторам и отмечают сходство биохимических изменений при алкогольной интоксикации и классических видах стресса (иммобилизационном, эмоционально-болевом, звуковом и т. д.) [27, 31, 32, 45, 99, 128, 295, 341]. При этих воздействиях наблюдается увеличение содержания биологически активных пептидов в гипофизе и гипоталамусе: АКТГ, β-эндорфина, рилизинг-факторов, энкефалинов, вещества Р и т. д. [3, 80, 98, 228, 296, 297]. Они вызывают каскад биохимических реакций, подготавливающих организм к воздействию стрессорного фактора [32, 85, 99]. Вероятно, повышение активности КПН в гипофизе и гипоталамусе и ФМСФ-КП в гипофизе взрослых самок крыс связано с увеличением синтеза указанных стресс-пептидов. Это также подтверждается тем, что КРФ, увеличивающих секрецию АКТГ и β-эндорфин-подобных пептидов, увеличивает и синтез мРНК препрокарбоксипептидазы Н [300]. Интересно, что в процессе развития (Р0 – Р45) не отмечено увеличения ферментативной активности в указанных (гипофиз и гипоталамус) или других тканях пренатально алкоголизированных животных. Вероятно, увеличение активности ферментов, носящее адаптационный характер, стало возможным только после сформированности всех органов, систем и метаболических процессов организма.

Наблюдающееся в некоторых тканях при пренатальной этанольной интоксикации различное и/или разнонаправленное изменение активности КПН и ФМСФ-КП, или изменение активности только одного из ферментов, может быть одной из причин нарушения соотношения уровня разных регуляторных пептидов в этих отделах. В частности, имеются данными об избирательном изменении содержания энкефалинов в разных регионах мозга при пренатальном воздействии этанола: снижении количества Met- и Leu-энкефалинов в гипоталамусе без изменения в коре и гиппокампе [69], увеличении количества Met- и Leu-энкефалинов в бледном шаре без изменения в гипофизе [13, 24, 57, 69, 263]. Известно, также о разном содержании энкефалинов в мозге предрасположенных к алкоголизму животных: снижено содержания Met-энкефалина и повышено – Leu-энкефалина [24, 76].

Увеличение активности КПН у самок в гипофизе и гипоталамусе и ФМСФ-КП в гипофизе и достоверное снижение (или тенденция к снижению) активности в половых железах и надпочечниках, возможно, связано (или является одной из причин) с изменением функционирования ГГГС и ГГНС. При пренатальной алкоголизации в этих системах отмечается нарушение обратной связи [177, 178, 182, 224, 282].

В норме наблюдаются половые отличия активности изучаемых ферментов и в мозге и в периферических тканях. Пренатальная алкоголизация, зачастую по-разному изменяя активность этих ферментов, приводит к нарушению этого соотношения. В гипофизе же алкоголизированных самок в возрасте Р120 активность КПН и ФМСФ-КП даже выше, чем у самцов, тогда как у контрольных животных, наоборот. Известно, что пренатальное воздействие этанола нарушает репродуктивную функцию, изменяет содержание половых гормонов и нейропептидов, регулирующих их секрецию [239, 265, 322, 335]. Известно, также, что активность КПН и ФМСФ-КП зависит от половых гормонов [88, 101]. Таким образом, зависящее от пола изменение активности ферментов у пренатально алкоголизированных особей и изменение их соотношения у самок и самцов, вероятно, отражает один из механизмов нарушения развития и функционирования половой системы.

Приведенные данные, полученные в нашем эксперименте, об изменении активности КПН и ФМСФ-КП и о нарушении их возрастной динамики при пренатальной алкоголизации, вероятно, свидетельствует об участии этих ферментов в патогенезе алкоголизма, и отражают нарушение обмена регуляторных пептидов. Нарушения проявляются как у взрослых животных, так и на отдельных возрастных этапах, когда происходит развитие важнейших органов и систем.

При последующей хронической алкоголизации взрослых животных обоего пола, перенесших воздействие этанола в эмбриональном периоде, отмечается изменение активности КПН в большем количестве исследованных тканей, чем у животных, подвергнутых только пренатальной или только постнатальной интоксикации. 

У самцов совместное действие пренатальной и постнатальной алкоголизации вызывали в большинстве исследованных тканей более существенные изменения активности обоих ферментов, чем каждый из этих видов интоксикации в отдельности. У самок пренатальная алкоголизация в большинстве тканей не приводила к усугублению изменений активности КПН и ФМСФ-КП при последующем воздействии этанола. Это, возможно, может быть признаком меньшей восприимчивости пептидергических систем эмбрионально алкоголизированных самок к воздействию этанола в постнальном периоде.

Половые отличия изменения активности ферментов обмена регуляторных пептидов при алкоголизации согласуется с данными теста открытого поля (табл. 7). Наибольший уровень поведенческой активности отмечается у ЭК и ЭЭ самок. У самцов ЭК и КЭ подгрупп величина всех или некоторых показателей активности тоже повышена по сравнению с интактными животными, но в меньшей степени. У самцов ЭЭ подгруппы поведенческая активность ниже по сравнению с самцами и самками всех других подгрупп. Т. е, что пренатальная алкоголизация усугубила нарушение поведенческих реакций у взрослых самцов при хроническом воздействии этанола, а на самок такого эффекта не оказала.

Совместное действие пренатальной и постнатальной алкоголизации вызывало появление половых отличий активности ФМСФ-КП в большинстве тканей, по сравнению с нормой и каждым видом интоксикации в отдельности.

В литературе описываются половые отличия алкогольных эффектов на молекулярном, клеточном, тканевом и органном уровнях [87, 105, 106, 113, 133, 141, 148, 149, 155, 186, 214, 215, 197, 240, 288, 293, 294, 305, 337, 343]. Согласно нашим данным, воздействие этанола по-разному влияет на активность основных карбоксипептидаз в тканях самцов и самок: в некоторых отделах мозга активность КПН у самок выше, чем у самцов, а ФМСФ-КП, наоборот; в периферических тканях чаще активность КПН и ФМСФ-КП выше у самок, чем у самцов. Эти данные, вероятно, отражают роль изучаемых ферментов в формировании полового диморфизма и различие влияния этанола на особей разного пола. Причем это отличие проявляется не только при пренатальной или постнатальной интоксикации, но в большей степени при постнатальной алкоголизации внутриутробно алкоголизированных животных.

Согласно полученным данным, хроническая алкоголизация изменяет в тканях соотношение активностей КПН/ФМСФ-КП, что согласуется с данными бо изменении соотношений регуляторных пептидов при влиянии этанола [3, 9, 18, 24, 80, 84, 98, 146, 228, 276, 297, 348]. Причем, если пренатальная алкоголизация нарушает соотношение активности изучаемых ферментов в некоторых тканях самцов и во всех исследованных тканях самок, то постнатальная алкоголизация этих животных вызывает изменение соотношения активностей ферментов практически во всех тканях животных обоего пола и в большинстве случаев сильнее, чем только пренатальная алкоголизация.

Таким образом, пренатальная алкоголизация приводит к тому, что активность изучаемых ферментов обмена регуляторных пептидов (КПН и ФМСФ-КП) не только оказывается измененной у взрослых животных, но и влияет на их реакцию при последующем хроническом воздействии этанола в постнатальном периоде. Причем эта реакция отличается у самок и самцов.

Механизмы регуляции основных карбоксипептидаз мало изучены. Но уже общепринято, что пренатальное воздействие этанола вызывает нарушение структуры и функционирования генетического аппарата клеток [8, 21, 238]. В случае КПН имеются литературные данные, позволяющие обсуждать эти механизмы. В структуре гена КПН обнаружены многочисленные тканеспецифичные регуляторные участки, влияющие на уровень экспрессии гена фермента [157, 218, 220, 237, 316]. Представляется вероятным, что активность КПН при пренатальном воздействии этанола регулируется на уровне экспрессии гена. Подтверждением этого можно считать отсутствие влияния этанола на активность КПН in vitro [20], а также отсутствие данных о реальных механизмах регуляции активности зрелой формы фермента in vivo [34, 167, 187, 218, 219] и на уровне процессинга препроформы КПН [34]. Обнаружена аналогичная генетическая регуляция активности других ферментов, в частности, ферментов обмена самого этанола [8, 15, 22, 107, 238], ферментов катехоламинергической системы [331]. Такой же механизм регуляции можно предположить и для ФМСФ-КП.

Можно предположить, что воздействие пренатальной алкоголизации может проявляться и на уровне экспрессии генов разных форм ферментов. КПН представлена в виде растворимой и мембраносвязанной форм [33, 37, 44, 49, 121, 145, 150, 161, 166, 167, 188, 193, 200, 205, 206, 270, 285, 286, 318, 325, 330, 338, 350]. Активность указанных форм отличается [44, 49, 145, 188, 193, 200, 205, 206, 325, 330, 350]. Отличается и соотношение этих форм в норме в разных тканях. Например, в β-клетках поджелудочной железы, хромафинных клетках надпочечников и гипофизе преобладает растворимая форма, а в мозге – мембраносвязанная [161, 285]. Для ФМСФ-КП также известны изоформы, отличающиеся региональным распределением [38, 42, 43, 88, 101, 102]. В структуре ДНК обнаружен участок, кодирующий последовательность 15-20 гидрофобных аминокислот с N-конца КПН [219, 220, 253, 255, 300]. Считается, что именно этой последовательностью мембраносвязанная форма этого фермента отличается от растворимой формы и при ее помощи связывается с мембраной [166, 270, 338]. Возможно, при нарушении экспрессии разных форм КПН и ФМСФ-КП происходит изменение содержания указанных форм и их соотношение.

Кроме того, можно предположить механизм воздействия эмбриональной аклоголизации на активность указанных форм через изменение состояния мембран. Пренатальная алкоголизация изменяет содержание и распространение плазменных и мембранных гликопротеинов [191, 208]. Очевидно, что это влияет на строение мембран и, как следствие, на функционирование мембраносвязанных ферментов. Аналогичное воздействие уже считается доказанным при влиянии острого, хронического этанола и/или стресса на активность КПН. Так, этанол (в разных дозах) и иммобилизационный стресс при индивидуальном и совместном воздействии вызывают различные изменения активности растворимой и мембраносвязанной КПН в гипофизе, гипоталамусе, среднем мозге, стриатуме, гиппокампе и сером веществе крыс [33]; хроническое потребление этанола вызывает снижение активности растворимой и мембраносвязанной форм КПН в коре больших полушарий, снижение активности растворимой и повышение мембраносвязанной форм в стриатуме [17]. Возможно, пренатальное воздействие этанола также по-разному изменяет активность растворимой и мембраносвязанной формы изучаемых ферментов.

Кроме приведенных наиболее вероятных механизмов воздействия пренатальной алкоголизации на активность изучаемых ферментов можно обсудить существование и иных способов регуляции их активности. Так, в случае КПН в литературе обсуждается зависимость ее активности от продуктов реакции – физиологически активных пептидов. Пренатальная алкоголизация, изменяя уровень регуляторных пептидов (АКТГ, КРФ, опиоидов, ПОМК и т. д.) [64, 69, 114, 153, 177, 182, 263, 282], возможно, тем самым, влияет на активность КПН. Для ФМСФ-КП нет данных о такой зависимости.

Для КПН и ФМСФ-КП известна зависимость их активности от половых гормонов [41, 88, 101, 102]. Пренатальная алкоголизация влияет на содержание этих гормонов [239, 265, 322], что, возможно, отражает один из способов воздействия на активность этих ферментов.

Можно предположить регуляцию активности ферментов изменением конформации молекулы, приводящим к изменению сродства к субстрату. В частности, это можно предположить для КПН. Отсутствие различий в значениях Кm растворимой и мембраносвязанной форм этого фермента предполагает, что такое изменение не связано с превращением мембраносвязанной формы в растворимую [188, 193, 200, 205, 206, 325, 330]. Ацетальдегид – продукт окисления этанола – благодаря наличию чрезвычайно реакционноспособного карбонила взаимодействует с аминогруппами аминокислот, входящими в состав полипептидов, модифицируя белки, что влечет за собой изменение функций молекул и структур клетки, в которые они входят. Существенно, что связывание ацетальдегида характеризуется отсутствием специфичности, так как осуществляется в результате неферментных реакций [21]. Известно, что ацетальдегид модифицирует белки сыворотки крови, белки и фосфолипиды клеточных мембран, нарушает биогенез ферментных систем мембран и сыворотки крови, приводит к образованию межмолекулярных сшивок, вызывает деградацию некоторых высокомолекулярных белковых структур [21, 96, 117, 152, 223, 245]. Также, ацетальдегид неблагоприятно влияет на основные процессы посттрансляционной модификации белков: ацелирование, фосфорилирование, метилирование, из-за чего извращаются регуляторные эффекты гормонов и нейромедиаторов [77]. Возможно, этанол, вводимый во внутриутробный период, приводит к нарушению структуры, а, значит, и свойств, исследованных нами ферментов.

Обобщая результаты нашего эксперимента и литературные данные, можно заключить, что КПН и ФМСФ-КП участвуют в патогенезе алкоголизма и в формировании зависимости у потомства алкоголиков.

Соответствие полученных нами данных об изменениях активности ферментов с литературными данными об изменениях уровней нейропептидов и белковом обмене при изученных воздействиях позволяет предположить возможность использования определения активности этих ферментов для исследования изменений метаболизма регуляторных пептидов при физиологических и патологических состояниях организма. Это может иметь важное значение для медицины, так как позволит, контролируя активность ферментов, влиять на биосинтез биологически активных пептидов.

С учетом влияния пренатальной алкоголизации на активность изучаемых ферментов в процессе развития животных, при последующем хроническом воздействии этанола в постнатальном периоде, и отличия изменений ферментативной активности при указанных воздействиях на самок и самцов, предложена гипотетическая схема одного из возможных механизмов формирования предрасположенности к алкоголизму у пренатально алкоголизированных особей с участием исследованных ферментов.




Пренатальное воздействие этанола

Нарушение экспрессии генов КПН и ФМСФ-КП?

Иные механизмы воздействия?



Изменение активности КПН и ФМСФ-КП
в мозге и периферических тканях в процессе развития

Нарушение формирования и функционирования пептидергических систем

Зависящее от пола изменение активности КПН и ФМСФ-КП при постнатальном хроническом воздействии этанола на взрослых особей

Зависящее от пола модулирующее влияние постнатального воздействия этанола на изменение уровня опиоидных пептидов

Предрасположенность к развитию алкоголизма






ВЫВОДЫ



У интактных животных наибольшая активность карбоксипептидазы Н обнаруживается в тканях с высоким уровнем нейропептидов, а именно в гипофизе, гипоталамусе и четверохолмии, что свидетельствует о вовлечении этого фермента в процессинг регуляторных пептидов. Во многих тканях активность этого фермента достоверно ниже у самок, чем у самцов.

Наибольшая активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы отмечается в гипофизе, надпочечниках и яичниках контрольных крыс. В мозге распределение ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы хорошо коррелирует с интенсивностью обмена белка (наиболее высокая в больших полушариях), но не совпадает с распределением нейропептидов. Активность данного фермента меньше зависит от пола и взаимодействия пола и возраста, чем активность карбоксипептидазы Н. При наличии достоверной зависимости влияния пола и взаимодействия пола и возраста активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы выше у самок, чем у самцов.

В отделах мозга и гипофизе интактных крыс обоего пола в процессе их развития и во взрослом состоянии, а также семенниках взрослых животных активность карбоксипептидазы Н больше или равна ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы. В надпочечниках животных обоего пола и яичниках активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы существенно выше, чем карбоксипептидазы Н.

Активность карбоксипептидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы у контрольных крыс изменяется с возрастом практически во всех отделах и тканях. Причем наибольшая активность обоих ферментов отмечается, в основном, у самцов в ювенильном и перипубертатном периодах, а у самок – в инфантильном периоде.

Возрастная динамика активности обоих ферментов у интактных животных различается в отделах мозга и периферических тканях, а также в семенниках и яичниках. В надпочечниках и половых железах возрастная динамика активности карбоксипептидазы Н отличается от ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы.

В отделах мозга животных обоего пола разного возраста отмечается высокая положительная корреляция активности карбоксипептидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы. В гипофизе, надпочечниках и половых железах корреляции между ними нет.

	Пренатальная алкоголизация влияет на активность карбоксипептидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях крыс. Причем в случае карбоксипептидазы Н это влияние более выражено, чем в случае ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы, как в период полового созревания, так и у взрослых животных.

	У пренатально алкоголизированных животных обоего пола разного возраста активность карбоксипептиддазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы во многих тканях ниже, чем в норме. Исключение составляет активность карбоксипептидазы Н в гипофизе и гипоталамусе и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в гипофизе у взрослых самок, где ферментативная активность выше по сравнению с контролем. 

	Пренатальное воздействие этанола нарушает возрастную динамику активности карбоксипептидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в большинстве тканей крыс обоего пола. У эмбрионально алкоголизированных животных ферментативная активность меньше зависит от возраста, чем у интактных. Очевидно, изменение возрастной динамики активности исследованных ферментов у эмбрионально алкоголизированных особей отражает один из механизмов опосредованного нарушения содержания активных пептидов во время важнейших пубертатных периодов и, следовательно, нарушение развития организма, отмечающегося у потомков алкоголиков. 

При пренатальной алкоголизации изменяются половые отличия активности исследованных карбоксипептидаз в некоторых тканях животных разного возраста. При этом ферментативная активность, особенно в случае карбоксипептидазы Н, меньше зависит от пола по сравнению с контрольными группами.

В некоторых тканях при пренатальной этанольной интоксикации наблюдается различное и/или разнонаправленное изменение активности карбоксипептидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы, или изменение активности только одного из ферментов. Это может быть одной из причин отмечающегося нарушения соотношения уровня разных регуляторных пептидов.

У самцов совместное действие пренатальной и постнатальной алкоголизации вызывает в большинстве исследованных тканей более существенные изменения активности карбоксипептидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы, чем каждый из этих видов интоксикации в отдельности.

У самок пренатальная алкоголизация в большинстве тканей не усиливает изменение активности обоих ферментов при последующем постнатальном воздействии этанола.

Совместное действие пренатальной и постнатальной алкоголизации вызывает появление половых отличий активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в большинстве тканей, по сравнению с нормой и с каждым видом интоксикации в отдельности.

С учетом влияния пренатальной алкоголизации на активность изучаемых ферментов в процессе развития животных, при последующем хроническом воздействии этанола в постнатальном периоде, и отличия изменений ферментативной активности при указанных воздействиях на самок и самцов, предложена гипотетическая схема одного из возможных механизмов формирования предрасположенности к алкоголизму у пренатально алкоголизированных особей с участием исследованных ферментов. 


ЛИТЕРАТУРА



Азарян А.В. Пептидгидролазы нервной системы и их биологические функции – Ереван, Айастан, 1989, – 208 с.

Актушина Г. А., Лютикова Т. М. // Структурные основы и регуляция компресаторно – приспособительных реакций. – Омск, 1986. – с. 28.

Алиев Н. А. Нейрогормоны и алкоголизм. // Пат. Физиол. Экспер. Терапия. – 1989. – 5, №5. – С. 85-90.

	Андронова Л. М. Биологический механизм и фармакотерапия экспериментального алкоголизма в зависимости от половых отличий: Автореф. дис… док. мед наук. – М., 1989. 36 с.

Анохин И.К. Биология и нейрофизиология условного рефлекса. – М.: Медицина, 1968. – 547 с.

Анохина И.П. Нейро-гуморальные основы влияния алкоголя на потомство // Тез. докл. ХV съезда Всесоюз. физиол. общ-ва им. И.П.Павлова. – Л., 1987. – С. 298-300.

Анохина И.П., Балашов А.М., Коган Б.М., Панченко Л.Ф. Роль опиатной системы в механизмах формирования алкогольной зависимости // Вопр. нарк. – 1989. № 3. – С. 3–1.

Анохина И.П., Векшина Н.Л., Кузнецова М.Н,, Овчинникова Л.Н., Станишевская А.В., Христолюбова Н.А., Шамакина И.Ю. Некоторые биологические механизмы врожденной предрасположенности к алкоголизму // Физиол. жур. им И.М. Сеченова. – 1992. – 78, № 12. – С. 30-38.

Анохина М. П. Роль опиатной системы в механизмах формирования алкогольной зависимости. // Вопр. наркол. – 1989. №3. – С. 3-11.

Ашмарин И.П., Каменская М.А. Нейропептиды в симпатической передаче // Итоги Н. и Т. (ВИНИТИ. Сер. Физиология человека и животных). – 1988. – 34, 184 с.

Бабаян Э. А., Гонопольский М. Х. Наркология. – М.: Медицина, 1987 – 335 с.

Бабичев В.Н. Нейроэндокринный контроль процессов пубертации // Усп. совр. биол. – 1994. – 114, № 3. – С. 330-344.

Балаклаавский А.И., Маслова И.В., Петренко С.В., Суриков П.М. Содержание энкефалинов и циклических нуклеотидов в структурах мозга крыс в различные стадии формирования и развития алкогольной зависимости // 1986. № 3. – С. 291–295.

Балаклевский А. И., Гесина Л. В., Гурло И. Б. и др. Механизмы повышения содержания продуктов перекисного окисления липидов и активности каталазы в плазме крови больных хроническим алкоголизмом, тканях животных при экспериментальном алкоголизме и лечебного действия апоморфина тетурама. Обоснование мембранотропной терапии алкоголизма. // Респуб. межвед. науч. работа. Алкогольная интоксикация и зависимость. Механизмы развития, диагностика, лечение: – Минск: «Беларусь», – 1988. – С. 116-144.

Бардиша Л. Р., Сатановская В. И. Метаболическая адаптация к алкоголю у крыс, различающихся по предпочтению этанола воде // Вопр. мед. химии – 1999. № 2 – С. 45-48.

Бейрд Д.Т. Яичник // Гормональная регуляция размножения у млекопитающих. – М.: Мир, 1987, – С. 118-144.

Беляев Н. А., Генгин М. , Годына С. В., Калихевич В. Н., Панченко Л. Ф. Активность энкефалинконвертазы в отделах мозга крыс при алкогольной интоксикации // Вопр. мед. химии. 1988. 34, № 4. – С. 118-122.

Беляев Н.А., Балакирева Н.Н., Брусов О.С., Панченко Л.Ф. Влияние этанола на энкефалинергическую опиоидную систему мозга крыс // Биохимия – 1984. – 49, № 9. – С. 1425–1430.

Беляев Н.А., Брусов О.С., Панченко Л.Ф. Влияние хронического потребления алкоголя на активность энкефалиназы А в стриатуме, гиппокампе и среднем мозге крыс // Вопр. мед. химии – 1983. – 29, № 1. – С. 102–110.

Беляев Н.А., Генгин М.Т., Годына С.В., Калихевич В.Н., Панченко Л.Ф. Активность энкефалинконвертазы в отделах мозга крыс при алкогольной интоксикации // Вопр. мед. хим. – 1988. № 4. – С. 118–120.

Божко Г. Х., Волошин П. В. Действие этанола на белки тканей и сыворотки крови человека и животных. // Усп. совр. биол. – 1989. – 108, № 1 (4). – С. 52-65.

Бородкин Ю. С., Усатенко М. С., Петрова П. А. Фармакология – клинике. // Сборник научных трудов под ред. Ю. С. Бородкина, – 1988. – С. 44-45.

Бородкин Ю. С., Усатенко М. С., Разумовская Н. И. // Алкоголизм и наследственность. – Л: 1987. – с. 52.

Буров Ю.В., Ведерникова К.М. Нейрохимия и фармакология алкоголизма. // М. Мед. – 1985. 240 с.

Бурчинский С. Г., Фролькис М.В. Нейропептиды при старении // Нейрохимия. – 1987. – 6, № 2, – С. 269-281.

Бутова О.А. Функциональное состояние гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы потомства при воздействии алкоголем на организм матери: Автореф. дис….канд. мед. наук. – М., 1985. –22 с.

Венедиктова Н.Н., Борисова И.П., Орехов С.Н. Является ли этанол стрессогенным фактором для крыс со сформированной алкогольной мотивацией? 1989. № 4. – С. 456–458.

Вернигора А. Н., Генгии М. Т., Щетинина Н. В., Никишин И. И. Сравнение длительного воздействия этанола, транквилизаторов и эмоционального стресса на активность некоторых ферментов метаболизма нейропептидов. // Научно-практическая конфер. – СПб, 1996. – С. 26-30.

Вернигора А. Н., Генгин М. , Макарова В. В. Влияние стрессовых факторов на активность карбоксипептидазы Н в отделах головного мозга крыс // Укр. биохим. журн. – 1992. – 64. № 2. – С. 45-49. Н124.

Вернигора А. Н., Генгин М. , Никишин Н. Н. Об участии некоторых ферментов обмена нейропептидов в механизмах эмоционального стресса // Физиол. журн. – 1995. – 81. № 5. – С. 103-112.

Вернигора А.Н. Исследование роли ферментов обмена нейропептидов в механизмах эмоционального стресса и формирования зависимости от этанола.

Вернигора А.Н., Генгин М.Т. Влияние этанола на активность карбоксипептидазы Н в гипофизе и некоторых отделах головного мозга крыс при различных стрессирующих воздействиях // Физиол. жур. им. Сеченова – 1993. – 79, № 3. С 34–37. ХЭ208,

Вернигора А.Н., Генгин М.Т. Влияние этанола на активность растворимой и мембрано-связанной карбоксипептидазы Н в отделах головного мозга крыс при иммобилизационном стрессе. // Вопр. мед. химии. – 1994. – 40. № 1. – С. 54-56.

Вернигора А.Н., Генгин М.Т. Механизмы регуляции активности и биологическая роль карбоксипептидазы Н – фермента процессинга нейропептидов // Биохимия. – 1995. –60, № 12. – С. 1491-1497.

Вернигора А.Н., Генгин М.Т. Протеолитические ферменты: субклеточная локализация, свойства и участие в обмене нейропептидов // Биохимия – 1996. – 61, № 5. – С. 771-785.

Вернигора А.Н., Генгин М.Т. Субклеточная локализация карбоксипептидазы Н в сером веществе головного мозга кошки // Укр. Биохим. журнал.-1992. –64, № 2. – С. 45-49.

Вернигора А.Н., Генгин М.Т., Никишин Н. Н. Очистка и физико-химические свойства растворимой карбоксипептидизы Н из серого вещества головного мозга кошки // Биохимия. – 1992. – 57, № 11. – С. 1712-1719.

Вернигора А.Н., Генгин М.Т., Салдаев Д.А., Щетинина Н.В. Распределение активности фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы в нервной ткани котов // Нейрохимия – 1997. – 14, № 4. – С. 423-425.

Вернигора А.Н., Никишин Н.Н., Генгин М.Т. Влияние глюкортикоидов на активность растворимой и мембраносвязанной форм карбоксипептидазы Н in vivo // Укр. биохим. журн. – 1995. – 67, № 6. – С. 93-98.

Вернигора А.Н., Никишин Н.Н., Генгин М.Т. Частичная характеристика фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы из головного мозга кошки // Биохимия – 1995. – 60, № 11. – С.1860-1866.

Вернигора А.Н., Щетинина Н.В., Генгин М.Т. Исследование активности основных (отщепляющих остатки аргинина и лизина) карбоксипептидаз у крыс разного возраста // Биохимия – 1996. – 61, № 10. – С. 1848-1856.

Вернигора А.Н., Щетинина Н.В., Генгин М.Т. Распределение активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях и отделах головного мозга ежа европейского (Erinaceus europaeus) // Укр. биохим. журн. – 1996. – 68, № 5. – С.118-121.

Вернигора А.Н., Щетинина Н.В., Салдаев Д.А., Генгин М.Т. Распределение активности основных карбоксипептидаз в тканях лабораторных животных разных видов // Ж. эволюц. биохим. физиол. – 2002. – 38, № 1. – С. 25-27.

Генгин М. Вернигора А. Н. Влияние этанола на активность карбоксипептидазы Н в мозге крыс // Укр. биохим. журн. – 1993. – 65. № 1. – С. 100-103.

Генгин М. Т., Вернигора А. Н. Влияние эмоционально-болевого стресса и этанола на карбоксипептидазо-Н-подобную активность в гипофизе и сыворотке крови крыс. // Вопр. мед. химии. – 1994. – 40, №1. – С. 52-54.

Генгин М.Т. Особенности структурно-функциональной организации и физико-химические свойства нелизосомальных пептидгидролаз мозга животных: Автореф. дис. … док. биол. наук. – Пенза, 2002. – 35 с.

Генгин М.Т., Вернигора А.Н. Новая карбоксипептидаза процессинга энкефалинов нервной ткани животных // Укр. биохим. журн. – 1989. – 61, № 3. – С.62-66.

Генгин М.Т., Вернигора А.Н. Ферменты процессинга опиоидных пептидов и методы определения их активности // Укр. биохим. журн. – 1994. – 66, № 2. – С.3-17.

Генгин М.Т., Вернигора А.Н., Никишин Н.Н. Влияние эмоционально-болевого стресса на активность КПН - фермента процессинга нейропептидов головного мозга крыс // Физиол. ж. – 1994. – 80, № 3. – С.23-27.

Генгин М.Т., Вернигора А.Н., Никишин Н.Н., Керимов В.Ю. Эффект эмоционального стресса на активность карбоксипептидазы Н в отделах головного мозга крыс с различной к нему устойчивостью // Вопр. мед. химии. – 1995. – 41, № 4. – С.8-9.

Генкина О.Н., Курелла Б. Некоторые нейрофизиологические аспекты действия алкоголя на центральную нервную систему // Вопр. наркол. – 1988. № 4. – С. 38–40.

Гомазков О. А. Функциональная биохимия регуляторных пептидов. – М.: Наука. 1993, 160 с. 

Гомазков О. А., Панфилов А. Д., Комиссарова Н. В., Ростовцев А. П. Влияние длительного потребления этанола на физиологическое состояние и изменения активности пептидаз мозга у мурицидных (агрессивных) крыс // Журн. высш. нервн. деятельности. – 1992. – 42. № 4. – С. 771-778.

Гомазков О. А., Панфилов А. Д., Ростовцев А. П., Комиссарова Н. В., Фомин В. В., Григорьянц О.О. Региональная активность энкефалин- и ангиотензин II - образующих пептидаз мозга и периферических тканей у крыс с различным влечением к этанолу. // Вопр. мед. химии. – 1991. – 37, №4. – С. 33-37.

Гомазков О.А. Энзимологические основы физиологического действия регуляторных пептидов // Биологические науки. – 1986, № 2. – С. 13-23.

Григорьянц О.О., Гомазков О.А. Энкефалинобразующие ферменты // Вопр. мед. химии. – 1986. – 32, № 3. – С. 15-20.

Громова Е.А., Бобкова Н.В., Плакхинас Л.А., Дейгин В.И., Ярова Е.П., Михалева И.И. Роль моноаминергических систем мозга в противоалкогольном действии динорфина и пептида дельта–сна // Физиол. жур. им. Сеченова – 1989. – 75, № 5. – С. 633–636.

Груздева К. Н., Высогорский Р. Е., Купор В. Г. Ферменты окисления этанола и его метаболитов при оСтрой алкогольной интоксикации и иммобилизационном стрессе // Вопросы наркологии. – 1991. № 4. – С. 2-4.

Гурин В.Н., Сандахов Д.Б., Гурин А.В. Активность протеина головного мозга и мобильных эндогенных ингибиторов протеолиза как фактор формирования функционального состояния организма // Физиология человека. – 1999. – 25, № 1, – С. 71-77.

Зилов В.Г., Рогачева С.К., Иванова Л.И. Повышение устойчивости реакции избегания к этанолу на фоне вещества // Бюлл. эксп. биол. мед. – 1991. № 3. – С. 281–284.

Казакова П. Б., Хохрина Н. Т. // Ж. Невропат. Психиатрии им. С. С. Корсакова. – 1986. – 88, №7. – С. 1033-1036.

Келешева Л.Ф., Судаков К.В. Олигопептиды в механизмах алкогольной мотивации. Новые подходы к изучению алкоголизма, наркоманий и токсикоманий // Международный симпозиум – Гагра, 28–30 марта. 1989. – С. 6-7.

Керменгольц Б.М. Основные биохимические механизмы влияния экзогенного этанола на обмен веществ в организме человека // Сборник научных трудов. Этанол и его метаболизм в высших организмах. Якутск. 1990. – С. 106–125.

Кирющенков А.П. Алкогольный синдром плода // Алкоголизм и наследственность / Мат-лы межд. симпозиума. – М., 1987. – С. 79-83.

Клешева Л. Ф., Судаков К. В. Олигопептиды в механизмах алкогольной мативации. // Новые подходы к лечению алкоголизма, наркоманий и таксикоманий (тез. докл). Междун. симпоз. – Гагра, 1989. – С. 65-66.

	Колупаев Г. Н., Яковлев В. А. Гормональные нарушения при хронической интоксикации алкоголем. // Ж. Невропат. Псих. им. Корсакова. – 1984. – 11. – С. 1712-1714.

Кузин А. М. Структурно – метаболическая теория в радиобиологии. М.: Наука, 1986. – 285 с.

Лакин Г.Ф. Биометрия. – М.: Высш. шк., 1990. – 352 с.

Майзелис М.Я., Заблудовский А.Л. Содержание энкефалинов в отделах головного мозга крыс, перенесших внутриутробное воздействие этанола // Бюл. Эксп. Биол. Мед. – 1986. – № 3. – С. 311-312. ПЭ87,

Майзелис М.Я., Заблудовский А.Л., Шихов С.Н. Особенности поведения и белкового обмена в мозге второго поколения животных, получавших этанол во время беременности // Ж. Невропат психиат. –1989. – 89, № 2. – С. 112-117.

Майский А. И., Ведерникова Н. Н., Чистяков В. В., Макин В. В. Биологические основы наркоманий. – М.: Мед., 1982,. – 256 с.

Маркель А.Л., К оценке основных характеристик поведения крыс в тесте «открытое поле» // Ж. высш. нервн. деят. – 1981. – ХХХI, № 2. – С. 301-307.

Маркель А.Л., Хусаинов Р.А. Метод комплексной регистрации поведенческих и вегетативных реакций у крыс при проведении теста «открытого поля» // Ж. высш. нервн. деят. – 1976. – 26, № 6. – С. 1314.

Маркель А.Н., Галактионов Ю.К., Ефимов В.М. Факторный анализ поведения крыс в тесте открытого поля // Ж. высш. нервн. деят. – 1988. – ХХХVIII, № 5. – С. 855-863.

Медведев В.И., Миролюбов А.В. Проблема управления функциональным состоянием // Физиология человека. – 1984. – 10, № 5. – С. 761.

Нейрохимия / Под. ред. Ашмарина И.П., Стукалова П.В. М.: Издательство Института Биомедицинской химии РАМН. – 1996. 470 с.

Островский Ю. М., Cатановская В. И., Садовник М. Н. Биологический компонент в генезе алкоголизма. – Минск: Наука и техника, 1986, – 95 с.

Островский Ю. М., Сатановская В. И., Островский С. Ю. и др. Метаболические предпосылки и последствия потребления алкоголя. – Минск: Наука и техника, 1988. 264 с.

Панченко Л. Ф., Беляев И. А. Энкефалинергическая опиоидная система и этанол: патогенетическое обоснование новых направлений поиска средств лечения алкоголизма. // Современные проблемы нейропсихофармакологии, принципы патогенетического лечения больных нервными и психическими расстройствами (Тез.докл.). – М, 1984. – С. 147-150.

Панченко Л. Ф., Брусов О. С., Беляев И. А. Иследования механизма действия этанола на активность энкефалиазы А мозга крыс. // Биол. экспер. биол. и мед. – 1984. – 47. – С. 691-692.

Панченко Л. Ф., Пильмиярова Ф. Н., Радомская В. М. Этанол и атеросклероз. – М.: Медицина, 1987. 128 с.

Панченко Л.Ф., Пирожков С. В., Антоненков В. Д. Пероксисомальная ферментативная система окисления этанола. // Биологические и медицинские аспекты алкоголизма: Матер. межд. симпоз. /под ред. акад. АМИ СССР П. В. Морозова / М. – 1984. – С. 137-144.

Попова Э.Н. Ультраструктура нейронов сенсомотороной коры у потомства крыс, получавших алкоголь во время беременности // Архив Анат. Гистол. Эмбриол. – 1988. – № 3. – С. 5-8.

Пятницкая И. Н. Злоупотребление алкоголем и начальная стадия алкоголизма. – М.: Медицина, 1988. – 288 с.

Раевский К.С., Айраксинен М.М., Майский А.И. Влияние этанола на уровень дофамина и его метаболитов в мозге крыс с различной устойчивостью к стрессу // Бюлл. эксп. биол. мед. – 1990. № 4. – С. 362–365.

Ростовцев А. В., Григорьянц О. О., Гомазков О. А. Субстраты для исследования энкефалинобразующей карбоксипептидазы в мозге и надпочечниках крысы // Вопр. мед. химии. 1988. 34. – 1. С. 126-129.

Салдаев Д.А. Активность основных карбоксипептидаз в тканях мышей при введении тестостерона и прогестерона: Автореф. дис. … канд. биол. наук. – СПб., 2001. – 20 с.

Салдаев Д.А. Активность основных карбоксипептидаз в тканях мышей при введении тестостерона и прогестерона: Автореф. дис. … канд. биол. наук. – СПб., 2001. – 20 с.

Сатановская О.А. Окисление этанола // Вопр. мед. химии – 1991. – 114, №5. – С. 573-580.

Скосырева А.М., Балика Ю.Д., Картамышева В.Е. Влияние этилового алкоголя на развитие эмбриона в эксперименте // Акушерство и гинекология. – 1981. – № 1. –С. 38-40.

	Сторожок С. А., Панченко Л. Ф., Филиппович Ю. Д., Глушков В. С. Изменения физико-химических свойств биологических мембран при развитии толерантности к этанолу. // Вопр. мед. химии. – 2001. №2. – С. 23-28.

Сторожок С.А. Содержание гидроперекисей в липидах, активность супероксидисмутазы и глюкозо–6–фофсатдегидрогеназы эритроцитов при алкогольной интоксикации // Вопр. мед. химии – 1983. – 29, № 6. – С. 31–34.

Судаков К.В. Геном и олигопептиды в системных механизмах обучения // Третьи Павловские чтения, Рязань. – 1989. – С. 3.

Сухоруков В.С., Тарабрин С. Б. Роль пролактила в регуляции функций мужской гонады // Усп. совр. биол. – 1993. – 113, № 3. – С. 366-376.

Тинников А.А. Роль гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы в регуляции полового развития // Усп. совр. биол. – 1990. – 110, № 3(6). – С. 419-428.

Троицкий Г. В., Багдасарян С. Н. // Вопр. мед. химии – 1987, – 33, №2,. – С. 38-42.

Усатенко М. C., Петрова М. А., Матвеева М. М. и др. Динамика активности ферментов – маркеров системного употребления алкоголя в крови больных алкоголизмом // Вопр. наркологии. – 1991. №4. – С. 9-12.

Хоха А. М. Угнетение этанолом биосинтеза половых гормонов и гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система // Вопр. мед. химии – 1994. – 114, №5. – С. 573-580.

Чиркова С.К., Войт И.С. Влияние алкоголя на развитие острых эмоционально–стрессорных состояний у обезьян // Жур. высш. нервн. деят. – 1990. – 40, № 3. – С. 585–587.

Щетинина Н.В. Активность основных карбоксипептидаз в тканях и отделах мозга крыс в онтогенезе: Автореф. дис….канд. биол. наук. – СПб., 1997 – 20 с.

Щетинина Н.В., Вернигора А.Н., Генгин М.Т. Активность основных карбоксипептидаз у крыс разного пола // Укр. биохим. журн. – 1997. – 70, № 3. – С. 110-113.

Щетинина Н.В., Вернигора А.Н., Генгин М.Т., Фирстова Н.В. Тканевое и региональное распределение активности фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы и других карбоксипептидаз у крыс // Укр. биохим. журн. – 1997. – 70, № 3. – С. 23-28.

Эндорфины: Пер. с англ. / Под ред. Э.Коста, М. Трабукки. Перевод Панова М.А.; Под ред. В.Б.Розена – М.: Мир, 1981. – 368 с.

Янский Л., Выбирал С. , Романовский А.А., Гурин В.Н Механизм влияния нейропептидов на терморегуляцию // Нейропептиды и терморегуляция / Под ред. В.Н. Гурина, Минск. – 1990. – С. 9.

Aasmoe L., Aarbakke J. Sex dependent induction of alcohol–dehydrogenase activity in rats // Biochem. Pharmacol. – 1999. – 57, N 9. – P. 1067–1072.

Adams N., Oldham T.D., Briscoe J.T., Hannah J.A., Blizard D.A. Ethanol preference in maudsley and RXNRA recombinant inbred strains of rat // Alcohol – 2001. – 24, N 1. – P. 25-34.

Agarwal D. P., Goedde H. W. Aldehyddehydrohenazes of human: genetiсs reason a different sens: tiveness to alсohol // Genet. Biol. Alсoholism. – 1990. – С. 253-261.

Aguilardiosdado M., Parkinson D., Corbett J. A., Kwon G., Marshall C. A., Gingerich R. L., Santiago J. V., Mcdaniel M. L. Potential autoantigens in IDDM – expression of carboxypeptidase H and insulin but not glutamatedecarboxylase on the beta-cellsurface // Diabetes. – 1994. – 43, N 3. – P. 418-425.

Aird F., Halasz I., Redei E. Ontogeny of hypothalamic corticotropin–releasing factor and anterior pituitary proopiomelanocortin expression in male and female offspring of alcohol exposed and adrenalectomized dams // Alcohol. Clin. Exp. Res. – 1997. – 21, N 9. – P. 1560–1566.

Alcalde L., Tonacchera M., Costagliola S., Jaraquemada D., Pujol Borrell R., Ludgate M. Cloning of candidate autoantigen carboxypeptidase H from a human islet library: sequence identity with human brain CPH // J. Autoimmunity. – 1996. – 9, N 4. – P. 525-528.

Allan A.M., Weeber E.J., Savage D.D., Caldwell K.K. Effects of prenatal ethanol exposure on phospholipase C– beta–1 and phospholipase A(2) in hippocampus and medial frontal cortex of adult rat offspring // Alcohol. Clin. Exp. Res. – 1997. – 21, N 8. – P. 1534–1541.

Alling C., Gustavsson L., Hansson E., Ronnback L. Lipids and fatty acids in membranes from astroglial cells cultured in ethanol-containing media. // Drug. Alсohol. Depend. – 1986. – 18, N 2. – P. 115-126.

Almeida O.F.X., Shoaib M., Deicke J., Fischer D., Darwish M.H., Patchev V.K., Gender differences in ethanol preference and ingestion in rats – the role of the gonadal–steroid environment // J. Clin. Invest. – 1998. – 101, N 12. – P. 2677–2685.

Angelucci F., Fiore M., Cozzari C., Aloe L. Prenatal ethanol effects on NGF level, NPY and chat immunoreactivity in mouse entorhinal cortex – a preliminary–study // Neurotoxicol. Teratol. – 1999. – 21, N 4. – P. 415–425.

Azaryan A.V., Hook V.Y.H. Unique cleavage specificity of prohormone thiol protease related to proenkephalin processing // FEBS Lett. – 1994. – 341, N 2-3. – P. 197-202.

Bader M.F., Simon J.P., Sontag J.M,. Langley K., Aunis D. Role of calcium in secretion and synthesis in bovine adrenal chromaffin cells // Adv. Exp. Med. Biol. – 1990. – 269. – P. 93-97.

Barry R. E., McGivan J.D. Acetaldehyde alone may initiate hepatocellular damage in acute alcoholic liver disease // Gut. – 1985. – 26, N 10. – P. 1065-1069.

Bayon A., Shoemaker W.S., Bloom F.E., Mauss A., Guillemin R. Perinatal development of the endorphin and enkephalincontaining systems in the rat brain // Brain Res. – 1979. – 179. – P. 93-101.

Beinfeld M.C., Korchak D.M., Nilaver G., O’Dorisio T.M. The development of motilin, cholecystokinin and vasoactive intestinal polypeptide in the forebrain and hindbrain of the rat, as determined by radioimmuno assay // Der. Brain. Res. – 1983. – 10. – P. 146-150.

Bell S. M.,·Reynolds J. G., Thiele T. T., Gan J., Figlewicz D. P., Woods S. C. Effects of third intracerebroventricular injections of corticotropin–releasing factor (CRF) on ethanol drinking and food intake // Psychopharmacology – 1998. V. 139. – P. 128–135.

Bellparikh L. C., Eipper B. A., Mains R. E. Response of an integral granule membrane protein to changes in pH. // J. Biol. Chem. – 2001. – 276, N 32. P. 29854-29863.

Beresford T., Arciniegas D., Rojas D., Sheeder J., Teale P., Aasal R., Sandberg E., Reite M. Hippocampal to pituitary volume ratio: a specific measure of reciprocal neuroendocrine alterations in alcohol dependence // J. Stud. Alcohol. – 1999. – 60, N 5. – P. 586-588.

Bidder M., Weizman R., Fares F., Grel I., Gavish M. Chronic ethanol consumption and withdrawal affects mitochondrial benzodiazepine receptors in rat brain and peripheral organs // Biochem. Pharmacol. – 1992. – 44, N 7. – P. 1335-1339.

Birch N.P., Rodriguez C., Dixon J.E., Mezey E. Distribution of carboxypeptidase H messenger RNA in rat brain using in situ hybridization histochemistry: implications for neuropeptide biosynthesis // Brain Res. Mol. Brain Res. – 1990. – 7, N 1. – P. 53-59.

Blum H. Alсohol and сentral nervous system peptides. // Supst. Alсohol Aсt. Misuse. – 1983. – 4, N 2-3. – P. 73-78.

Bommer M, Nikolarakis K, Noble E.P, Herz A. In vivo modulation of rat hypothalamic opioid peptide content by intracerebroventricular injection of guanidinoethylmercaptosuccinic acid (GEMSA) possible physiological role of enkephalin convertase // Brain Res. – 1989. – 492, N 1/2. – P. 305-313.

Bonten E.J, Galjart N.J, Willemsen R, Usmany M, Vlak JM, d'Azzo A. Lysosomal protective protein/cathepsin A. Role of the "linker" domain in catalytic activation // Biol Chem. – 1995. – 270, N 44. – P. 26441-26445.

Boyadjieva N., Meadows G., Sarkar D. Effects of ethanol consumption on ß–endorphin levels and natural killer cell activity in rats // Ann. New York Acad. Sci. – 1999. N. 885. – P. 383–386.

Brust P., Bech A., Kretzschmar R., Bergmann R. Developmental changes of enzymes involved in peptide degradation in isolated rat brain microvessels // Peptides. – 1994. – 15, № 6. – P. 1085-1088.

Burd L., Martsolf J.T. Fetal alcohol syndrome variability // Physiol. Behav. – 1989. – 46, N 1. – P. 39-43.

Bures E. J., Courchesne P. L., Douglass J., Chen K., Davis M. T., Jones M. T., Jones M. D., Mcginley M. D., Robinson J. H., Spahr C. S., Sun J. L., Wahl R. C., Patterson S. D. Identification of incompletely processed potential carboxypeptidase-E substrates from Cpefat/Cpefat mice. // Proteomics. – 2001. – 1, N 1. P. 79-92.

Butters N.S., Gibson M.A.S., Reynolds J.N., Brien J.F. Effects of chronic prenatal ethanol exposure on hippocampal glutamate release in the postnatal guinea pig // Alcohol – 2000. – 21, N 1. – P. 1–9.

Carter A., Soliman.M.R.I. Estradiol and progesterone alter ethanol induced effects on μ–opioid receptors in specific brain regions of ovariectomized rats // Life Sci. – 1997. – 62, N 2. – P. 93–101.

Castoldi A.F., Barni S., Randine G., Costa L.G., Manzo L. Ethanol selectively interferes with the trophic action of NMDA and carbachol on cultured cerebellar granule neurons undergoing apoptosis // Develop. Brain Res – 1998. – 111, N 2. – P. 279–289.

Charness M. F. Ethanol and opioid reсeptor signalling // Experientia. – 1989. – 45, N 5. – P. 418-428.

Che F. Y., Yan L., Li H., Mzhavia N., Devi L. A., Fricker L. D., Identification of peptides from brain and pituitary of Cpe(Fat)/Cpe(Fat) mice. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 2001. – 98, N 17. P. 9971-9976.

Chen H. Jawahar S., Qian Y. M., Duong Q. Y., Chan G. Y., Parker A., Meyer J. M., Moore K. J., Chayen S., Gross D. J., Glaser B., Permutt M. A., Fricker L. D. Missense polymorphism in the human carboxypeptlidase-E gene alters enzymatic activity. .// Hum. Mutat. – 2001. – 18, N 2. P. 120-131.

Conway S., Ling S.Y., Leidy J.W., Blaine K., Holtzman T., Effect of fetal ethanol exposure on the in vitro release of growth hormone, somatostatin and growth hormone – releasing factor induced by clonidine and growth hormone feedback in male and female rats // Alcohol. Clin. Exp. Res. – 1997. – 21, N 5. – P. 826–839.

Cool D.R., Loh Y.P. Carboxypeptidase E is a sorting receptor for prohormones – binding and kinetic studies // Mol. Cell. Endocrinol. – 1998. – 139, N 1-2, P. 7-13.

Cool D.R., Normant E., Shen F.S., Chen H.C., Pannell L., Zhang Y., Loh Y.P. Carboxypeptidase E is a regulated secretory pathway sorting receptor: genetic obliteration leads to endocrine disorders in Cpe(Fat) mice // Cell. – 1997. – 88, N 1, P. 73-83.

Crippens D., White M.L., George M.A., Jaworski J.N., Brunner L.J., Lancaster F.E., Gonzales R.A. Gender differences in blood levels, but not brain levels, of ethanol in rats // Alcohol. Clin. Exp. Res. – 1999. – 23, N 3. – P. 414–420.

Dakes M.J., Davis T.P. The ontogeny of enzymes involved in posttranslational processing and metabolism of neuropeptides // Dev. Brain Res. – 1994. – 80, N 1-2, P. 127-136.

Daniel M.A., Evans M.A. Quantitative comparison of maternal ethanol and maternal tertiary butanol diet on postnatal development // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 1982. – 222, N 2. – P. 294-300.

Das B., Sablan E.L., Kilbourne E.J., Fricker L.D. Regulation of carboxypeptidase E by membrane depolarization in PC12 pheochromocythoma cells: comparison with the mRNA’s encording other peptide and catecholamine’s biosynthetic enzymes // Neurochem. – 1992. – 59, N 6. – P. 2263-2270.

Davidson H.W., Hutton J.C. The insulin-secretory-granule carboxypeptidase H: Purification and demonstration of involvement in proinsulin processing // Biochem. J. – 1987. – 245, N 2. – P. 575-582.

Davis T. P., Gulling-Berglund A. S., Gillespie T. S., Smith T. L. Ethanol treatment alters ß-endorphin metabolism by purified synaptosomal plasma membranes. // Peptides. – 1987. – 8, N 3. – P. 467-472.

Demmer W., Brand K. Carboxypeptidase activity in synaptic vesicles isolated from striatum and cortex of calf brain // Arch. Biochem. Biophys. – 1985. – 239, N 2. – P. 375-378.

Devaud L.L., Chadda R., Sex–differences in rats in the development of and recovery from ethanol dependence assessed by changes in seizure susceptibility // Alcohol. Clin. Exp. Res. – 2001. – 25, N 11. – P. 1689–1696.

Devaud L.L., Fritschy J.M., Morrow A.L. Influence of gender on chronic ethanol induced alterations in GABA(A) receptors in rats // Brain Res. – 1998. – 796, N 1–2. – P. 222–230.

Dhanvantari S., Loh Y. P. Lipid raft association of carboxypeptidase E is necessary for its function as a regulated secretory pathway sorting receptor. // J. Biol. Chem. –2000. – 275, N 38. P. 29887-29893.

Dochetry K., Hutton J.C. Carboxypeptidase activity in the insulin secretory granule // FEBS Lett. – 1983. – 162, N 1. – P. 137-141.

Dronou A., Lucas D., Powell L.W. // Clin. Chem. – 1985. – 31, N 9. – P. 1543-1546.

Druse M.J., Hao H.L., Eriksen J.L. In utero ethanol exposure increases proenkephalin, a precursor of a neuropeptide that Is inhibitory to neuronal growth // Alcohol. Clin. Exp. Res. – 1999. – 23, N 9. – P. 1519–1527.

Du X.P., Hamre K.M. Increased cell death in the developing vestibulocochlear – ganglion complex of the mouse after prenatal ethanol exposure // Teratology – 2001. – 64, N 6. – P. 301–310.

Dufouil C., Ducimetiere P., Alperovitch A., Sex–differences in the association between alcohol consumption and cognitive performance // Amer. J Epidemol. – 1997. – 146, N 5. – P. 405–412.

Dulka J.G., Maler L., Ellis W. Androgen-induced changes in electrocommunicatory behavior are correlated with changes in substance P-like immunoreactivity in the brain of the electric fish Apteronotus leptorhynchus // J. Neurosci. – 1995. – 15, № 3 (Pt.1). – P. 1879-1890.

Eipper B.A, Green C.B, Mains R.E. Expression of prohormone processing enzymes in neuroendocrine and non neuroendocrine cells // Monogr. Natl. Cancer. Inst. – 1992. – 13, P. 163-168.

Ekstrom J., Ekman R., Hakanson R., Luts A., Sundler F. Developmental studies on vasoactive intestinal peptide, substance P and caleifonin generelated peptide in salivary glands of postnatal rats // Acta Physiol. Scand. – 1994. – 151, № 1. – P. 107-115.

Emson P.C., Gilbert R.F.T., Lorer I., Fakrenkrung J., Sundler F., Schaffalitzky de Muckadell O.B. Development of vasoactive intestinal polypeptide (VIP) containing neurons in the rat brain // Brain Res. – 1979. – 177. – P. 437-444.

Feng Y., Reznik S. E., Fricker L. D. Distribution of proSAAS derived peptides in rat neuroendocrine tissues. // Neurosci. – 2001. – 105, N 2. P. 469-478.

Fiedorek F.T Jr, Parkinson D. Carboxypeptidase H processing and secretion in rat clonal beta cell lines // Endocrinology. – 1992. – 131, N 3. – P. 1054-1062

Foster G.A., Schultzbeng M. Immunohistochemical analysis of the ontogeny of neuropeptide Y immunoreactive neurons in foctal rat brain // Int. J.Dev.Neurosci. – 1994. – 2. – P. 387-407.

Fricker L.D. Carboxypeptidase E // Ann. Rev. Physiol. – 1988. – 50. – P. 309-321.

Fricker L.D. Neuropeptide biosynthesis: focus on carboxypeptidase processing enzyme // Trends Neurosci. – 1985. – 8, № 5. Р. 210-214.

Fricker L.D., Adelman J.P., Douglass J., Thompson R.C, von Strandmann R.P, Hutton J AD. Isolation and sequence analysis of cDNA for rat carboxypeptidase E [EC 3.4.17.10], a neuropeptide processing enzyme // Mol. Endocrinol. – 1989. – 3, N 4. – P. 666-673.

Fricker L.D., Das B., Angeletti R.H. Identification of the pH dependent membrane anchor of carboxypeptidase E (EC 3.4.17.10) // J. Biol. Chem. – 1990. – 265, N 5. – P. 2476-2282.

Fricker L.D., Devi L. Posttranslational processing of carboxypeptidase E, a neuropeptide processing enzyme, in AtT 20 cells and bovine pituitary secretory granules // J. Neurochem. – 1993. – 61, N 4. – P. 1404-1415.

Fricker L.D., Herbert E. Comparison of a carboxypeptidase E-like enzyme in human, bovine, mouse, Xenopus, shark and Aplysia neural tissue // Brain Res. – 1988. – 453, N 1-2. – P. 281-286.

Fricker L.D., Plummer T.H., Snyder S.H. Enkephalin convertase: potent, selective and irreversible inhibitors // Biochem. and Biophys. Res. Commun. – 1983. – 11, N 3. – P. 994-1000.

Fricker L.D., Reaves B.J., Das B., Dannies P.S. Comparison of the regulation of carboxypeptidase E and prolactin in GH4C1 cells, a rat pituitary cell line. // Neuroendocrinology. – 1990. – 51, N 6. – P. 658-663.

Fricker L.D., Rigual R. J., Diliberto E. J. Jr., Viveros O. H. Reflex spanchnic nerve stimulation increases levels of carboxypeptidase-E mRNA and enzymatic activity in the rat adrenal medulla // J. Neurochem. – 1990. – 55, N 2. – P. 461-467.

Fricker L.D., Snyder S.H. Enkephalin convertase: purification and charasterization of a specific enkephalin-synthesizing carboxypeptidase localized to adrenall chromaffin granules // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1982. – 79. – P. 3886-3890.

Fricker L.D., Snyder S.H. Purification and characterization of enkephalin convertase, an enkephaline-synthesizing carboxypeptidase // J. Biol. Chem. – 1983. – 79. P. 33886-3890.

Fricker L.D., Supattapone S., Snyder S.H. Enkephalin convertase: a specific enkephalin synthesing carboxypeptidase in adrenal chromaffin granules, brain and pituitary gland // Life Sci. – 1982. – 31. – P. 1841-1844.

Friishansen L., Lacourse K. A., Samuelson L. C., Holst J. J. Attenuated processing of proglucagon and glucagon-like peptide-1 in carboxypeptidase E deficient mice. // J. Endocrinol. – 2001. – 169, N 3. P. 595-602.

Friksen S.P., Kulkarni A.B. Methanol in normal human breath // Science – 1963. – 141. – P. 639–640.

Gabriel K.I., Yu W., Ellis L., Weinberg J. Postnatal handling does not attenuate hypothalamic– pituitary–adrenal hyperresponsiveness after prenatal ethanol exposure // Alcohol. Clin. Exp. Res. – 2000. – 24, N 10. – P. 1566–1574.

Gabriel K.I., Weinberg J. Effects of prenatal ethanol exposure and postnatal handling on conditioned taste–aversion // Neurotoxicol. Teratol. – 2001. – 23, N 2. – P. 167–176.

Gandarias J.M., Irazusta J., Fernandez D., Silio M., Casis L. Membrane-bound pyroglutamyl-arylamidase activity during the first postnatal month in several rat brain areas // Int. J. Dev. Biol. – 1994. – 38, № 1. – P. 127-129.

Gandarias J.M., Ramirez M., Zulaica J., Casis L. Aminopeptidase (arylamidase) activity in discrete areas of the rat brain: Sex differences // Horm. Metab. Res. – 1989. – 5, № 21. – P. 285-286.

Genazzani A.R., Faechinetti F., Petraglia F., Pintor C., Bagnoli F., Puggioni R., Corda R. Correlations betneen plasma levels of opioid peptides and adrenal androgens in prepuberty and puberty // J. Steroid. Biochem. – 1983. – 19, № 1. – P. 891-895.

Glavas M.M., Hofmann C.E., Yu W.K., Weinberg J. Effects of prenatal ethanol exposure on hypothalamic–pituitary–adrenal regulation after adrenalectomy and corticosterone replacement // Alcohol. Clin. Exp. Res. – 2001. – 25, N 6. – P. 890–897.

Glombik M. M., Kromer A., Salm T., Huttner W. B., Gerdes H. H. The disulfide-bonded loop of chromogranin-B mediates membrane-binding and directs sorting from the trans-Golgi network to secretory granules. // EMBO J. – 1999. – 18. 4. P. 1059-1070.

Goldstein D. B., Chim Y. H. Interaktion of ethanol with biological membranes. // Fed. Proc. – 1981. – 40, N 7. – P. 2073-2076.

Gorenstein C., Snyder S., Tmo distinct enkephalinases solupilizabion, partial purification and separation from angiotensin converting enzyme // Life. Sci. – 1979. – 25. – P. 2065.

Graham K., Wilsnack R., Dawson D., Vogeltanz N. Should alcohol consumption measures be adjusted for gender differences // Addiction – 1998. – 93, N 8. – P. 1137–1147.

Grigoriants O., Devi L., Fricker L.D. Dopamine antagonist haloperidol increases carboxypeptidase E mRNA in rat neurointermediate pituitary but not in various other rat tissues // Mol. Brain Res. – 1993. – 19. – P. 161-164.

Grimwood B.G., Plummer T.H. Jr., Tarentino A.L. Carboxypeptidase H. A regulatory peptide-processing enzyme produced by human hepatoma Hep G2 cells // J. Tiolog. Chem. – 1989. – 264, N 26. – P. 15662-15667.

Guaza C., Borrell S. Modifications in adrenal hormones response to ethanol by prior ethanol dependence // Pharmacol. Biochem. Behav. – 1985. – 22, N 3. – P. 357-360.

Guerri C. Neuroanatomical and neurophysiological mechanisms involved in central nervous system dysfunctions induced by prenatal alcohol exposure // Alcohol. Clin. Exp. Res. – 1998. – 22, N 2. – P. 304–312.

Guerri C., Renaupiqueras J. Alcohol, astroglia, and brain development // Mol. Neurobiol. – 1997. – 15, N 1. – P. 65–81.

Guest P.C., Arden S.D., Rutherford N.G., Hutton J.C. The posttranslational processing and intracellular sorting of carboxypeptidase H in the islets of Langerhans // Mol. Cell. Endocrinol. – 1995. – 113, N 1, P. 99-108.

Guest P.C., Ravazzola M., Davidson H.W., Orci L., Hutton J.C. Molecular heterogeneity and cellular localization of carboxypeptidase H in the islets of Langerhans // Endocrinology. – 1991. – 129, N 2. – P. 734-740.

Hall C.S. Emotional behavior in the rat. The relationship between emotionality and ambulatory activity // J. Copm. Physiol. Psychol. – 1936. – 22. – P. 345-352.

Hanna W.L., Turbov J.M., Jackman H.L., Tan Fulong, Froelich C.J. Dominant chymotrypsin-like esterase activity in human lymphocyte granules is mediated by the serine carboxypeptidase called cathepsin A-like protective protein // Immunol. – 1994. – 153, N 10, – P. 4663-4672.

Hansen L. F., Rehfeld J. F. Impaired feedback of gastric functions in carboxypeptidase E deficient mice // Biochem. and Biophysic. Res. Comm. – 2000. – 267, N 2. P. 638-642.

Harada S., Tachiyashiki K., Imaizumi K. Effect of sex–hormones on rat–liver cytosolic alcohol dehydrogenase activity // J Nutr. Sci. Vitaminol. – 1998, – 44, N 5, P. 625–639.

Hitсhison W. D., Gianoulakis С., Kalant H. Effeсt of ethanol withdrawal on ß – endorphin levels in rat brain and pituitary. // Pharm. Bioсhem. Behav. – 1988. – 30, N 4. – P. 933-939.

Hook V.Y. Arginine and lysine product inhibition of bovine adrenomedullary carboxypeptidase H, a prohormone processing enzyme // Life Sci. – 1990. – 47, N 13. – P. 1135-1139.

Hook V.Y. Carboxypeptidase B-like activity for the processing of enkephalin precursors in the membrane component of bovine adrenomedullary chromaffin granules // Neuropeptides. – 1984. – 4, N 2. – P. 117-126.

Hook V.Y., Affolter H.U., Palkovits M. Carboxypeptidase H in the hypothalamo neurohypophysial system: evidence for processing and activation of a prohormone processing enzyme during axonal transport // J. Neurosci. – 1990. – 10, N 10. – P. 3219-3226.

Hook V.Y., LaGamma E.F. Product inhibition of carboxypeptidase H // J. Biol. Chem. – 1987. – 262, N 26. – P. 12583-12588.

Hook V.Y., Lee E.E. Two peptidases that convert 125J-Lys-Arg-(Met)-enkephalin and 125J-enkephalin-Arg6, respectively, to 125J-(Met)-enkephalin in bovine adrenal medullary chromaffin granules // FEBS Lett. – 1984. – 172, N 2. – P. 212-218.

Hook V.Y., Loh Y.P. Carboxypeptidase B-like convertasing enzyme activity in secretory granules of rat pituitary // Cell Biol. – 1984. – 81. – P. 2776-2780.

Hook V.Y., Mezey E., Fricker L.D., Pruss R.M., Siegel R.E., Brownstein M.J. Immunochemical characterization of carboxypeptidase B-like peptide-hormone-processing enzymes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1982. – 82. – P. 4745-4749.

Hook V.Y.H., Affolter H.U. Identification of zymogen and mature forms of human carboxypeptidase H. A processing enzyme for the synthesis of peptide hormones // FEBS Lett. – 1988. – 238, N 2. – P. 338-342.

Hook V.Y.H., Eiden L. E. Two peptidases that convert 125J-Lys-Arg-(Met)-enkephalin and 125J-enkephalin-Arg6, respectively, to 125J-(Met)-enkephalin in bovine adrenal medullary chromaffin granules // FEBS Let. – 1984. – 172, N 2. – P. 212-218.

Hughes P.D., Kim Y.N., Randall P.K., Leslie S.W. Effect of prenatal ethanol exposure on the developmental profile of the NMDA receptor subunits in rat forebrain and hippocampus // Alcohol. Clin. Exp. Res. – 1998. – 22, N 6. – P. 1255–1261.

Inder W.J., Joyce P.R., Ellis M.J., Evans M.J., Livesey J.H., Donald R.A The effects of alcoholism on the hypothalamic-pituitary-adrenal axis: interaction with endogenous opioid peptides // Clin. Endocrinol. – 1995. – 43, N 3. – P. 283-290.

Irminger J.C., Verchere C.B., Meyer K., Halban P.A. Proinsulin targeting to the regulated pathway is not impaired in carboxypeptidase E deficient Cpe(Fat)/Cpe(Fat) mice // J. Biol. Chem. – 1997. – 272, N 44, P. 27532-27534.

Isenberg K.T., Bora P.S., Zhou Xia, Wu Xiaolin, Moore B. W., Lange L. G. Nonoxidative ethanol metabolism: expression of fatty aсid ethyl ester synthase-III in сultured neural сells. // Bioсhem. Biophys. Res. Сommun. – 1992. – 185, N 3. – P. 938-943.

Iversen I., Turner A. Neuropeptides and their peptidases: functional consideration // Neurochem. Intern. – 1987. – 12. – P. 383-387.

Jin K. L., Graham S. H., Nagayama T., Goldsmith P. C., Greenberg D. A., Zhou A., Simon R. P. Altered expression of the neuropeptide processing enzyme carboxypeptidase-E in the rat brain after global ischemia. // J. Cerebr. Blood Flow Metabol. – 2001. – 21. N 12. P. 1422-1429.

Juarez J., Detomasi E.,B. Sex differences in alcohol drinking patterns during forced and voluntary consumption in rats // Alcohol – 1999. – 19, N 1. – P. 15–22.

Jung M.E., Wallis C.J., Gatch M.B., Lal H. Sex differences in the pentylenetetrazol–like stimulus– induced by ethanol withdrawal // J Pharmacol. Exp. Ther. – 1999. – 291, N 2. – P. 576–582.

Jung M.E., Wallis C.J., Gatch M.B., Lal H. Sex–differences in nicotine substitution to a pentylenetetrazol discriminative stimulus during ethanol withdrawal in rats // Psychopharmacology – 2000. – 149, N 3. – P. 235–240.

Jung M.E., Wallis C.J., Gatch M.B., Lal H. Sex–differences in the discriminative stimulus effects of M–chlorophenylpiperazine and ethanol withdrawal // Psychopharmacology – 2000. – 149, N 2. – P. 170–175.

Jung Y.K., Fricker L. D. Expression of the carboxypeptidase-E gene – characterization of the initiator-binding proteins // Biochimie. – 1994. – 76. N 3-4. – P. 336-345.

Jung Y.K., Kunczt C.J., Pearson R.K., Dixon J.E., Fricker L.D. Structural characterization of the rat carboxypeptidase-E gene. // Mol. Endocrinol. – 1991. – 5, N 9. – P. 1257-1268.

Jung Y.K., Kunczt C.J., Pearson R.K., Fricker L.D., Dixon J.E. Expression of the rat carboxypeptidase-E gene in neuroendocrine and nonneuroendocrine cell lines // Mol. Endocrinol. – 1992. – 6, N 12. – P. 2027-2037.

Juvvadi S., Fan X.M., Nagle G.T., Fricker L.D. Characterization of aplysia carboxypeptidase E // FEBS Lett. – 1997. – 408, N 2, P. 195-200.

Keith L.D., Crabbe J.C., Robertson L.M., Young E.R. Ethanol dependence and the pituitary adrenal axis in mice. II. Temporal analysis of dependence and withdrawal // Life Sci. – 1983. – 33, N 19. – P. 1889-1897.

Kenney W. C. Formation of Schiff base adduct between acetaldehyde and rat liver microsomal phosphatidylethanolamine. // Alcohol. Clin. Exp. Res. – 1984. – 8, N 6. – P. 551-555.

Kim C.K., Yu W., Edin G., Ellis L., Osborn J.A., Weinberg J. Chronic intermittent stress does not differentially alter brain corticosteroid receptor densities in rats prenatally exposed to ethanol // Psychoneuroendocrinology – 1999. – 24, N 6. – P. 585–611.

Kimura K.A., Chiu J., Reynolds J.N., Brien J.F. Effect of chronic prenatal ethanol exposure on nitric oxide synthase–I and synthase–III proteins in the hippocampus of the near term fetal guinea pig // Neurotoxicol. Teratol. – 1999. – 21, N 3. – P. 251–259.

Kimura K.A., Reynolds J.N., Brien J.F. Ethanol neurobehavioral teratogenesis and the role of the hippocampal glutamate–N–methyl–D–aspartate receptor – nitric oxide synthase system // Neurotoxicol. Teratol. – 2000. – 22, N 5. – P. 607–616.

King J.C., Fabro S. Alcohol counsumption and cigarette smoking: effect on pregnancy // Clin. Obstet. Gynecol. – 1983. – 26. – P. 437-448.

Kinoshita, Jessop/

Klein R. S., Das B., Fricker L. D. Secretion of carboxypeptidase E from cultured astrocytes and from AtT-20 cell, a neuroendocrine cell line: implications for neuropeptide biosynthesis // J. Neurochim. – 1992. – 58. N 6. – P. 2011-2018.

Kluger M.J. Fever: vole of pyrogens and cryagens // Physiol. Rev. – 1991. – 71. – P. 93.

Krahl S.E., Berman R.F., Hannigan J.H. Electrophysiology of hippocampal Ca1 neurons after prenatal ethanol exposure // Alcohol – 1999. – 17, N 2. – P. 125–131.

Kuhn P.E., Miller M.W. Expression of p53 and Alz–50 immunoreactivity in rat cortex – effect of prenatal exposure to ethanol // Exp. Neurol. – 1998. – 154, N 2. – P. 418–429.

Kulkosky P.J., Allison C.T., Allison T.G., Marquez L.M., Mattson B.J. Interaction of CCK and 8–Oh–Dpat in the satiation of alcohol intake // Alcohol – 1998. – 16, N 4. – P. 305–309.

Kulkosky P. J., Allison C. T., Mattson B. J. Thyrotropin releasing hormone decreases alcohol intake and preference in rats. //Alcohol. – 2000. – 20, N 1. – P. 87-91.

Kulkosky P. J., Clayborne Y. J., Sandoval S. L. Cholecystokinin and bombesin inhibit ethanol and food intake in rats selectively bred for ethanol sensitivity. // Alcohol. Clin. Exp. Res. – 1993. – 17, N 3. – P. 545-551.

Lacourse K.A., Friishansen L., Rehfeld J.F., Samuelson L.C. Disturbed progastrin processing in carboxypeptidase E deficient fat mice // FEBS Lett. – 1997. – 416, N 1. – P. 45-50.

Laslop A., Tschernitz C. Effects of nerve growth factor on the biosynthesis of chromogranin A and B, secretogranin II and carboxypeptidase H in rat PC12 cells // Neuroscience. -1992. – 49, N 2. – P. 443-450.

Li T.K. Pharmacogenetics of responses to alcohol and genes that influence alcohol drinking. // J. Stud. Alcohol. – 2000. – 61, N 1. – P. 5-12.

Li Y., McGivern R.F., Nagahara A.H., Handa R.J Alterations in the estrogen sensitivity of hypothalamic proenkephalin mRNA expression with age and prenatal exposure to alcohol // Molecular Brain Research – 1997. – 47, N 1–2. – P. 215–222.

Lingfordhughes A.R., Acton P.D., Gacinovic S., Boddington S.J.A., Costa D.C., Pilowsky L.S., Ell P.J., Marshall E.J., Kerwin R.W. Levels of gamma–aminobutyric acid–benzodiazepine receptors in abstinent, alcohol–dependent women – preliminary findings from an I–123 lomazenil single– photon–emission–tomography study // Alcohol. Clin. Exp. Res. – 2000. – 24, N 9. – P. 1449–145.

Livy D.J., Maier S.E., West J.R. Fetal alcohol exposure and temporal vulnerability – effects of binge like alcohol exposure on the ventrolateral nucleus of the thalamus // Alcohol. Clin. Exp. Res. – 2001. – 25, N 5. – P. 774–780.

Loh Y.P., Brownstein M.J., Gainer H. Proteolysis in neuropeptide processing and ofker neurol functions // Ann.Rev.Neurosci. – 1984. – 7. – P. 183-185.

Loh Y.P., Snell C.R., Cool D.R. Receptor mediated targeting of hormones to secretory granules, role of carboxypeptidase E // Trends Endocrinol. Met. – 1997. – 8, N 4, P. 130-137.

Lowry O.H., Rosebrought N.J., Farr A.G., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. – 1951. – 193, N 1. – P. 265-275.

Luсas D., Penneс Y., Menez J. F., Floch H. H., Menn G. Le. Acetaldehyde adducts with serum proteins are not responsible for decreased drug binding in alcoholic patients. // Drug Alс. Depend. – 1986. – 17, N 1. – P. 67-71.

Lynch D.R., Braas K.M., Hutton J.C., Snyder S.H. Carboxypeptidase E (CPE) immunocytochemical localization in the rat central nervous system and pituitary gland // J. Neurosci. – 1990. – 10. – N 5. – P. 1592-1599.

Lynch D.R., Snyder S.M. Neuropeptides: multiple forms, metabolic pathnays and receptors // Ann. Rev. Biochem. – 1986. – 55. – P. 773-799.

Lynch D.R., Venable J.C., Snyder S.H. Enkephalin convertase in the heart: similar disposition to atrial natriuretic factor // Endocrinology. – 1988. – 122, N 6. – P. 2683-2691.

Lynch D.R., Venable J.C., Strittmatter S.M., Snyder S.H. Enkephalin convertase: charasterization and localization using [3H]guanidinoethyl-mercaptosuccinic acid // Biochimie. – 1988. – 70, N 1. – P. 57-64.

MacCumber M.W., Snyder S.H., Ross C.A. Carboxypeptidase E (enkephalin convertase): mRNA distribution in rat brain by in situ hybridization // J. Neurosci. – 1990. – 10, N 8. – P. 2850-2860.

Mackin R.B., Noe B.D. Charasterization of an islet carboxypeptidase B involved in prohormone processing // Endocrinology. – 1987. – 120, N 2. – P. 457-468.

Maier S.E., West J.R. Regional differences in cell loss associated with binge– like alcohol exposure during the first 2 trimesters equivalent in the rat // Alcohol – 2001. – 23, N 1. – P. 49–57.

Mains R.E., Eipper B.A. Secretion and regulation of two biosyntetic enzyme activities, peptidyl-glycine -amidating monooxygenase and a carboxypeptidase, by mouse pituitary corticotropic tumor cells // Endocrinology. – 1984. – 115, N 5. – P. 1683-1690.

Maletti M., Besson J., Bataille D., Laburthe M., Rosselin M. Ontogenesis and immunoreactive forms of vasoactive intestinal peptide in rat brain // Acfa Endocrinol. – 1980. – 93, № 4. – P. 479-487.

Manser E., Fernandez D., Loo L., Goh P.Y., Monfries C., Hall C., Lim L. Human carboxypeptidase E., Isolation and characterization of the cDNA, sequence conservation, expression and processing in vitro // Biochem. J. 1990. – 267, N 2. – P. 517-525.

Marks N., Berg N., Benuck M., Lo E.S., Novachenko H., Seyfried C. Prodynorphin processing by rat CNS fractions and purified enzyme: formation of dynorphin A 1-8 by sulfhydryl activated carboxypeptidase and peptidyl dipeptidase // Neurochem. Intern. – 1987. – 10, N 4. – P. 413-422.

Marks N., Grynbaum A., Benuck M. On the sequential cleavage of myelin basic protein by cathepsin A and D // J. Neurochem. – 1976. N 27. – P. 765-768.

Marks N., Stern F., Lajtha A. Changes in proteolytic enzymes and proteins during maturation of the brain // Brain Res. – 1975. – 86, № 2. – P. 307-322.

Martinez-Millan L., De Gandaries J.M., Irazusta J., Echevarria E., Casis L. Developmental changes of amino peptidase activity in the cortex of the cat hrain // Int. J. Dev. Neurosci. – 1993. – 11, № 1. – P. 11-15.

Mathieu-Kia A. M., Resson M. J. Repeatet administration of сoсaine, niсotine and ethanol: effeсts on preprodynorphin, preprotaсhykinin H and preproenkephalin mRNA expression in the dorsal and the ventral striatum of the rat // Moleс. Brain Res. – 1998. – 54. – P. 141-151.

Matsas R., Kenny A.S., Turner A.J. An immunohistochemical study of endopeptidase 24.11 (enkephalinase) in the pig nervous system // Neuroscience. – 1986. – 18, № 4. – P. 991-996.

McDonald J.K., Schwabe C. Intracellular exopeptidase // Proteinases in mammalian cells and tissues / Barrett A.J. (ed.). Amsterdam: Elsevier/North Holland Biomedical Press - 1977. – P. 311-391.

McGivern R.F., Clancy A.N., Mousa S., Couri D., Noble E.P. Prenatal alcohol exposure alters enkephalin levels, without affecting ethanol preference // Life Sci. – 1984. – 34, N 6. – P. 585-589.

McGivern R.F., Ervin M.G., Mcgeary J., Somes C., Handa R.J. Prenatal ethanol exposure induces a sexually dimorphic effect on daily water–consumption in prepubertal and adult rats // Alcohol. Clin. Exp. Res. – 1998. – 22, N 4. – P. 868–875.

McGivern R.F., Handa R.J., Raum W.J. Ethanol exposure during the last week of gestation in the rat – inhibition of the prenatal testosterone surge in males without long–term alterations in sex behavior // Neurotoxicol. Teratol. – 1998. – 20, N 4. – P. 483–490.

McMillian M.K., Hudson P.M., Lec D.Y., Thai L., Hung G.H., Hong J.S. Developmental changes . in rat adrenal enkephalin premrsor: peptide ratio // Brain. Res. Dev. Brain. Res. – 1993. – 71, № 1. – P. 75-80.

Meunier J.-C. The opioid peptides and their receptors // Biochimie. – 1986. – 68. – P. 1153-1158.

Mihalick S.M., Crandall J.E., Langlois J.C., Krienke J.D., Dube W.V. Prenatal ethanol exposure, generalized learning impairment, and medial prefrontal cortical deficits in rats // Neurotoxicol. Teratol. – 2001. – 23, N 5. – P. 453–462.

Miller M.W. A longitudinal study of the effects of prenatal ethanol exposure on neuronal acquisition and death in the principal sensory nucleus of the trigeminal nerve – interaction with changes induced by transection of the infraorbital nerve // J Neurocytol – 1999. – 28, N 12. – P. 999–1015.

Mitra A., Song L.X., Fricker L.D. The C-terminal region of carboxypeptidase E is involved in membrane-binding and intracellular routing in AtT-20 cells // J. Biol. Chem. – 1994. – 269, N 31. – P. 19876-19881.

Moore D.B., Ruygrok A.C., Walker D.W., Heaton M.B. Effects of prenatal ethanol exposure on parvalbumin expressing GABAergic neurons in the adult rat medial septum // Alcohol. Clin. Exp. Res. – 1997. – 21, N 5. – P. 849–856.

Mourik J., Raeven P., Steur K., Addink A.D.F. Anatrobic metabolism of red skeletsl muscle of goldfish, Carassius auratus (L). Mitochondrial produced acetaldehyde as anaerobic electron acceptor // FEBS Lett. – 1982. – 137, N 1. Р. 111–114.

Naggert J.K., Fricker L.D., Varlamov O., Nishina P.M., Rouille Y., Steiner D.F., Carroll R.J., Paigen B.J., Leiter E.H. Hyperproinsulinaemia in obese fat/fat mice associated with a carboxypeptidase E mutation which reduces enzyme activity // Nature Genetics. – 1995. – 10, N 2. – P. 135-142.

Nalamachu S.R., Song L.X., Fricker L.D. Regulation of carboxypeptidase E – effect of Ca2+ on enzyme-activity and stability // J. Biol. Chem. – 1994. – 269, N 15. – P. 11192-11195.

Nemeskeri A., Acs Z., Toth B.E. Prolactin-synthesiring and prolactin-releasing activity of fetal andeurly postnatal rat piluitaries: in vivo and in vitro studies using RIA, reverse hemolytic plaque assay and immunocytochemistry. // Neuroendocrinology. – 1995. – 61. – P. 687-694.

Nolan C.J., Bestervelt L.L., Mousigian C.A., Maimansomsuk P., Cai Y., Piper W.N. Chronic ethanol consumption depresses hypothalamic-pituitary-adrenal function in aged rats // Life Sci. – 1991. – 49, N 25. P. 1923-1928.

Norenberg U., Richter D. Processing of the oxytocin precursor: isolation of an exopeptidase from neurosecretory granules of bovine pituitaries // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1988. – 156, N 2. – P. 898-904.

Oakes M. G., Davis T. P. The ontogeny of enzymes involved in post-translational processing and metabolism of neuropeptides. // Dev. Brain Res. – 1994. – 80. N 1-2. P. 127-136.

Orskov C., Buhl T., Rabenhoj L., Kofod H., Holst J. J. Carboxypeptidase-B-like processing of the C-terminus of glucagon-like peptide-2 in pig and human small intestine // FEBS Lett. – 1989. – 247, N 2. P. 193-196.

Osborn J.A., Kim C.K., Steiger J., Weinberg J. Prenatal ethanol exposure differentially alters behavior in males and females on the elevated plus–maze // Alcohol. Clin. Exp. Res. – 1998. – 22, N 3. – P. 685–696.

Osborn J.A., Yu C., Gabriel K., Weinberg J. Fetal ethanol effects on benzodiazepine sensitivity measured by behavior on the elevated plus–maze // Pharmacol. Biochem. Behav. – 1998. – 60, N 3. – P. 625–633.

Osborn J.A., Yu C., Stelzl G.E., Weinberg J. Effects of fetal ethanol exposure on pituitary–adrenalsSensitivity to secretagogues // Alcohol. Clin. Exp. Res. – 2000. – 24, N 7. – P. 1110–1119.

Oyarce A.M., Hand T.A., Mains R.E., Eipper B.A. Dopaminergic regulation of secretory granule associated proteins in rat intermediate pituitary // J. Neurochem. – 1996. – 67, N 1. – P. 229-241.

Ozer E., Sarioglu S., Gure A. Effects of prenatal ethanol exposure on neuronal migration, neuronogenesis and brain myelination in the mice brain // Clin. Neuropatol. – 2000. – 19, N 1. – P. 21–25.

Parkinson D. Carboxypeptidase H in bovine pituitary gland: soluble forms are not processed at the C-terminus // Mol. Cell. Endocrinol. – 1992. – 86, N 3. – P. 221-233.

Parkinson D. Two soluble forms of bovine carboxypeptidase H have different NH2-terminal sequences // J. Biol. Chem. – 1990. – 265, N 28. – P. 17101-17105.

Perloff M.D., Kream RM., Beinfeld M.C. Reduced levels of substance P in the brains of Cpe(Fat)/Cpe(Fat) Mice // Peptides. – 1998. – 19, N 6, P. 1115-1117.

Prendergast M.A., Harris B.R., Blanchard J.A., Mayer S., Gibson D.A., Littleton J.M. In–vitro effects of ethanol withdrawal and spermidine on viability of hippocampus from male and female rat // Alcohol. Clin. Exp. Res. – 2000. – 24, N 12. – P. 1855–1861.

Pshezhetsky A.V., Potier M. Direct affinity purification and supramolecular organization of human lysosomal cathepsin A // Arch. Biochem. Biophys. – 1994. – 313, N 1. – P. 64-70.

Rasmussen D.D., Boldt B.M., Bryant C.A., Mitton D.R., Larsen S.A., Wilkinson C.W. Chronic daily ethanol and withdrawal: 1. Long-term changes in the hypothalamo-pituitary-adrenal axis // Alcohol. Clin. Exp. Res. – 2000. – 24, N 12. – P. 1836-1849.

Revskoy S., Halasz I., Redei E. Corticotropin–releasing hormone and proopiomelanocortin gene expression Is altered selectively in the male rat fetal thymus by maternal alcohol consumption // Endocrinology – 1997. – 138, N 1. – P. 389–396.

Reznik S. E., Salafia C. M., Lage J. M., Fricker L. D. Immunohistochemical localization of carboxypeptidase-E and carboxypeptidase-D in the human placenta and umbilical-cord // J. Histochem.and Cytochem. – 1998. – 46, N 12. P. 1359-1367.

Rikke B.A., Simpson V.J., Montoliu L., Johnson T.E. No effect of albinism on sedative–hypnotic sensitivity to ethanol and anesthetics // Alcohol. Clin. Exp. Res. – 2001. – 25, N 2. – P. 171–176.

Rintala J., Jaatinen P., Lu W., Sarviharju M., Eriksson C.J.P., Laippala P., Kiianmaa K., Hervonen A. Effects of lifelong ethanol consumption on erebellar layer volumes in AA and ANA rats // Alcohol. Clin. Exp. Res. – 1997. – 21, N 2. – P. 311–317.

Rivier C. Female rats release more corticosterone than males in response to alcohol: influence of circulating sex steroids and possible consequences for blood alcohol levels. // Alcohol. Clin. Exp. Res. – 1993. – 17. N. 4. – P. 854–859.

Rivier C., Bruhn T., Vale W. Effect of ethanol on the hypothalamic–pituitary–adrenal axis in the rat: role of corticotropin–releasing factor (CRF) // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 1984. – 229, N 1. – P. 127–131.

Rivier C., Imaki T., Vale W. Prolonged exposure to alсohol: effeсt on сRF mRNA levels, and CRF – and stress-induсed ACTH seсretion in the rat // Brain Res. – 1990. – 520, N 1-2. – P. 1-5.

Rivier C., Rivest S., Vale W. Alcohol-induced inhibition of LH secretion in intact and gonadectomized male and female rats: possible mechanisms // Alcohol. Clin. Exp. Res. – 1992. – 16, N 5. - P. 935-941.

Rockman C.E., Markert L.E., Delrizzo M. Effects of prenatal ethanol exposure on ethanol-induced locomotor activity in rat // Alcohol. – 1989. – 6, N 5. – P. 353-356.

Rodriguez C., Brayton K.A., Brownstein M., Dixon J.E. Rat preprocarboxypeptidase H. Cloning, characterization, and sequence of the cDNA and regulation of the mRNA by corticotropin releasing factor // J. Biol. Chem. – 1989. – 264, N 10. – P. 5988-5995.

Rossier, J., Barres, E., Hutton, J.C., Ricknell, R.J. Radiometric assay for carboxypeptidase H (EC 3.4.17.10) and other carboxypeptidase B-like enzymes // Anal. Biochem. – 1989. – 178, N 1. – P. 27-31.

Rouille Y., Chauvet J., Acher R. Partial conversion of vasopressinyl-Gly-Lys-Arg into pharmacologically active vasopressin through secretory granule carboxypeptidase E and alpha-amidating processing enzymes // Biochem. Int. – 1992. – 26, N 4. – P.739-746.

Rovere C., Viale A., Nahon J., Kitabgi P. Impaired processing of brain proneurotensin and promelanin concentrating hormone in obese fat/fat mice // Endocrinology. – 1996. – 137, N 7. – P. 2954-2958.

Roy A., Mittal N., Zhang H., Pandey S. C. Modulation of cellular expression of glucocorticoid receptor and glucocorticoid response element-DNA dinding in rat brain during alcohol drinking and withdrawal // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 2002. – 301, N 2, – P. 774-784. ХЭ364

Salonen I., Huhtaniemi I. Effects of chronic ethanol diet on pituitary-testicular function of the rat // Biol. Reprod. –1990. – 42. P. 55-62.

Sarviharju M., Jaatinen P., Hyytia P., Hervonen A., Kiianmaa K. Effects of lifelong ethanol consumption on drinking behavior and motor impairment of alcohol–preferring AA and alcohol–avoiding ANA rats // Alcohol – 2001. – 23, N 3. – P. 157–166.

Scarceriaux V., Pelaprat D., Lhiaubet A.M., Schimptf R.M., Tramu G., Rostene W. Developmental pattern of neurofensin content in rat hypothalamic neurons culbured in serum free medium-comparison with in vivo data // Dev. Brain Res. – 1994. – 81, № 1. – P. 128-130.

Schlamp C.L., Nickells R.W. Light and dark cause a shift in the spatial expression of a neuropeptide processing enzyme in the rat retina // J. Neurosci. – 1996. – 16, N 7. – P. 2164-2171.

Schneider M.L., Moore C.F., Kraemer G.W. Moderate alcohol during pregnancy – learning and behavior in adolescent Rhesus–Monkeys // Alcohol. Clin. Exp. Res. – 2001. – 25, N 9. – P. 1383–1392.

Seizinger B.R., Brinn C., Herr A. Evidence for a differential postnatal development of proenkephalin B (prodynorphin) – derived opieid peptides in the rat hypothalamus // Endocrinology. – 1984. – 115, № 3. – P. 926-935.

Shen F.S., Loh Y.P. Intracellular Misrouting and Abnormal Secretion of Adrenocorticotropin and Growth Hormone in Cpe (Fat) Mice Associated with a Carboxypeptidase E Mutation // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1997. – 94, N 10. – P. 5314-5319.

Silva W.I., Benitez K., Ocasio J., Martinez L., Rosario N. Neuropeptide like immunoreactivities and carboxypeptide H activity associated with bovine brain clathrin coated vesicles // Neuropeptides. –1995. – 28, N 6, P. 341-349.

Sinha P., Halasz I., Choi J.F., Mcgivern R.F., Redei E. Maternal adrenalectomy eliminates a surge of plasma dehydroepiandrosterone in the mother and attenuates the prenatal testosterone surge in the male fetus // Endocrinology – 1997. – 138, N 11. – P. 4792–4797.

Skutohness C.D., Holroyde C.P., Nyers R.N. et al. Acetat in normal human blood // J. Clin. Invest. – 1979. – 64. – P. 708–713.

Sluyter F., Hof M., Ellenbroek B.A., Degen S.B., Cools A.R. Genetic, sex, and early environmental–effects on the voluntary alcohol – intake in Wistar rats // Pharmacol. Biochem. Behav. – 2000. – 67, N 4. – P. 801–808.

Smith D.R., Pallen C.J., Murphy D., Lim L. Pituitary-specific transcriptional initiation sites of the rat carboxypeptidase-H gene and the influence of thyroid hormone status // Mol. Endocrinol. – 1992. – 6, N 5. – P. 713-722.

Smyth D.G., Maruthainar K., Darby N.J., Fricker L.D. Catalysis of slow C terminal processing reactions by carboxypeptidase H // J. Neurochem. – 1989. – 53, N 2. – P. 489-493.

Song L.X, Fricker L.D. Calcium and pH dependent aggregation of carboxypeptidase E // J. Biol. Chem. – 1995. – 270, N 14. – P. 7963-7967.

Song L.X., Fricker L.D. The pro region is not required for the expression or intracellular routeing of carboxypeptidase E // Biochemical Journal. – 1997. – 323, N 4. – P. 265-271.

Spencer R.L., McEwen B.S. Impaired adaptation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis to chronic ethanol stress in aged rats // Neuroendocrinol. – 1997. – 65, N 5. – P. 353-359.

	Spenсer R. L., MсEwen B. S. Adaptation of the hypothalamiс- pituitary-adrenal axis to сhroniс ethanol stress. // Neuroendoсrinology. – 1990. – 52, N 5. – P. 481-489.

Srivastava V.K., Hiney J.K., Dearth R.K., Les Dees W. Chronic effects of prepubertal ethanol administration on steroidogenic acute regulatory protein in the rat ovary.// Alcohol. Clin. Exp. Res. – 2002. – 26, N 1. – P. 107–113.

Stack G., Fricker L.D., Snyder S.H. A sensitive radiometric assay for enkephalin convertase and for carboxypeptidase B-like enzymes // Life Sci. – 1984. – 34. – P. 113-121.

Stege T. E. Induсtion of aсetaldehyde lipid peroxidation in hepatiс сell. // Reс. Commun. Chem. Phatal. Pharmaсol. – 1982. – 36, N 2. – P. 287-297.

Stone T.E., Li J.P., Bernasconi P. Purification and Characterization of the Manduca Sexta Neuropeptide Processing Enzyme Carboxypeptidase E // Arch. Insect Biochem. Phisiol. – 1994. – 27, N 3, P. 193-203.

Strittmatter S.M., Lynch D.R., Skyder S.H. Differential ontogeny of rat brain peptidases: prenatal expression of enkephalin convertase and postnatal development of angiotensin converting enzyme // Dev. Brain. Res. – 1986. – 29, № 2. – P. 207-215.

Strittmatter S.M., Lynch D.R., Snyder S.H. (3H)guanidinoethyl-mercaptosuccinic acid binding to tissue homogenates. Selective labeling of enkephalin convertase // J. Biol. Chem. – 1984. – 259, N 19. – P. 11812-11817.

Sullivan K.A., Traurig H.H., Papka R.E. Ontogeny of neurotransmitter system in the paracervical ganglion and uterine cervix of the rat // Anat. Rec. – 1994. – 240, № 3. – P. 377-386.

Summers M. L., Gidley M. S., Sanders S. K. Aсetaldehydeenkephalins: eluсidation of the struсture of the aсetaldehyde adduсts of methionine-enkephalin and leuсine- enkephalin. // FEBS. – 1980. – 111, N 2. – P. 307-310.

Supattapone S., Fricker L.D., Snyder S.H. Purification and characterization of a membrane-bound enkephalin-forming carboxypeptidase, “enkephalin convertase” // Neurochem. – 1984. – 42, N 4. – P. 1017-1023.

Szot P., White S.S., Veith R.C., Rasmussen D.D. Reduced gene expression for dopamine biosynthesis and transport in midbrain neurons of adult male rats exposed prenatally to ethanol // Alcohol. Clin. Exp. Res. – 1999. – 23, N 10. – P. 1643–1649.

Tabakoff B., Hoffman P. L., Litjequist S. Effeсts of ethanol on the aсtivity of brain enzymes. // Enzyme. – 1987. – 37, N 1-2. – P. 70-86.

Taylor A.N., Branch B.J., Day J.R., Lu J.K.H. Alcohol effects progesterone, testosterone and prolactin secretionin pragnant rats // 31th Congr. Physiol. Sci. – Helsinki, 1989. – P. 538-540.

Tesсhke R., Hasumura V., Lieber Сh. S. Hepatiс ethanol metabolism: respeсtive roles of alсohol dehydrogenate, the miсrosomal ethanol-oxidizing system and сatalase. // Arсh. Bioсhem. – 1976. – 175. – P. 635-643.

Tschernitz C, Laslop A, Eiter C, Kroesen S, Winkler H. Biosynthesis of large dense core vesicles in PC12 cells: effects of depolarization and second messengers on the mRNA levels of their constituets // Brain. Res. Mol. Brain Res. – 1995. – 31, N 1-2. – P. 131-140.

Udupi V., Gomez P., Song L.X., Varlamov O., Reed J.T., Leiter E.H., Fricker L.D., Greeley G.H. Effect of carboxypeptidase E deficiency on progastrin processing and gastrin messenger ribonucleic acid expression in mice with the fat mutation // Endocrinology. – 1997. – 138, N 5, P. 1959-1963.

	Van Thiel D. H., Tarter R. E., Rosenblum E., Gavaler J. S. Ethanol, its metabolism and gonadal effeсts: does sex make a defferenсe? // Adv. Alсohol. Subst. Abuse. – 1988. – 7, N 3-4. – P. 131-169.

Varlamov O., Fricker L.D. The C terminal region of carboxypeptidase E involved in membrane binding is distinct from the region involved with intracellular routing // J. Biol. Chem. – 1996. – 271, N 11. – P. 6077-6083.

Varlamov O., Fricker L.D., Furukawa H., Steiner D.F., Langley S.H., Leiter E.H. Beta cell lines derived from trans genic Cpe(Fat)/Cpe(Fat) mice are defective in carboxypeptidase E and proinsulin processing // Endocrinology. – 1997. – 138, N 11, P. 4883-4892.

Varlamov O., Leiter E.H., Fricker L. Induced and spontaneous mutations at Ser202 of carboxypeptidase E. Effect on enzyme expression, activity, and intracellular routing // J. Biol. Chem. – 1996. – 271, N 24. – P. 13981-13986.

Vernigora A.N., Gengin M.T., Shtchetinina N.V., Nikishin N.N. Comparision of long-term effect of ethanol, tranquillizers and emotional stress on activity of some neuropeptide metabolism enzyme // Neurochemistry and pharmacology of drug addiction and alcoholism: Proc. Int. Conf. (S.-Petersburg, 1996). – S.-Petersburg: Inst. of the Human Brain, 1996. – P. 70.

Vida M.I.R., Kleid M.C., Ase A., Finkielman S., Nahmond V.E., Vindrola O. Synenkephalin processing in embryonic rat brain // Dev. Brain. Res. – 1994. – 77, № 2. – P. 151-156.

Vivian J.A., Green H.L., Young J.E., Majerksy L.S., Thomas B.W., Shively C.A., Tobin J.R., Nader M.A., Grant K.A. Induction and maintenance of ethanol self–administration in cynomolgus monkeys (Macaca–Fascicularis) – long–term characterization of sex and individual–differences // Alcohol. Clin. Exp. Res. – 2001. – 25, N 8. – P. 1087–1097.

Wallace E.F., Evans C.J., Jurik, S.M., Mettord I.N., Barchas J.D. Carboxypeptidase B activity from adrenal medulla - is it involved in the processing of proenkephalin. // Life Sci. – 1982. – 31, N 16-17. – P. 1793-1796.

Wand G.S., Dobs A.S. Alterations in the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in actively drinking alcoholics // J. Clin. Endocrinol. Metabol. –1991. – 72. – P. 1290-1295.

Wardlaw S.L. Regulation of -endorphin, corticotropin – like intermediate lobe hypothalamus by testosterone // Endocrinology. – 1986. – 119, № 1. – P. 19-24.

Weisman B.A., Azov R., Sarne Y. Ontogenesis of enkephalin and humoral andorphin in the rat brain // Neurochem. Int. – 1983. – 5, № 1. – P. 113-116.

Wilkinson с. M., сrabbe J. с., Keith L. D., Kendall J. W., Dorsa D. M. Influenсe of ethanol dependenсe on regional brain сontent of ß –endorphin in the mouse. // Brain Res. – 1986. – 378, N 1. – P. 107-114.

Woodkams P.L., Allen Y.S., McGovern J., Allen J.M., Bloom S.R., Balars R., Polrak J.M. Immunohistochemical analysis of early ontogeny of the neuropeptide Y system in rat brain // Neurosci. – 1985. – 15. – P. 173-202.

Yajima R., Chikuma T., Kato T. A rapid anterograde axonal transport of carboxypeptidase H in rat sciatic nerves // J. Neurochem. – 1994. – 63, N 3, P. 997-1002.

Zagon I.S., Isayama T., Melaughlin P.J. Preproenkepkalin messenger RNA expression in the developing and adult rat brain // Mol. Brain Res. – 1994. – 21, № 1-2. – P. 85-98.

Zamir N., Weber E., Palkovits M., Brownstein M., Differential processing of prodynorphin and proenkephalin in specific regions of the rat brain // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1984. – 81. – P. 6886-6889.

Zheng M., Streck R.D., Scott R.E.M., Seidah N.G., Pintar J.E. The developmental expression in rat of proteases furin, Pc 1,Pc 2, and carboxypeptidase E-implications for carly maturation of proteolytic processing capacity // J.Nourosci. – 1994. – 14, № 8. – P. 4656-4673.