Микробиология кисломолочных продуктов

- 3 -



Федеральное агентство по образованию Российской Федерации.

Государственное образовательное учреждения Высшего и профессионального образования.

ИРКУТСКИЙ ГОУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ.

Кафедра микробиологии.

Кафедра микробиологии.

                                                                                       Заведующий кафедрой.

__________Б.Н.Огарков.

                                                                                           _____________________

                                                                                              (дата) 





ДИПЛОМНАЯ РАБОТА.

Микробиология кисломолочных продуктов детского питания.





                                                                        РУКОВОДИТЕЛЬ

____________доцент кафедры

			                                                       (подпись) 	микробиологии

кандидат биологических наук

А.П.Макарова





РЕЦЕНЗЕНТ:                                                           СТУДЕНТ:

_______кандидат биологических наук.                 ___________Г.О.Плеханова

(подпись) В.Г.Сурдина                                              (подпись)

____________ _____________

                                                                                           (дата)           (группа)



Работа защищена___________

 Протокол №  ______________

С оценкой_________________











	РЕФЕРАТ.

        Дипломная работа «Микробиология кисломолочных продуктов детского питания» выполнялась на базе кафедры микробиологии биолого-почвенного факультета ИГУ и МУЗ «Детская молочная кухня» г.Иркутска

В работе дан обзор литературы по биологии бифидобактерий и лактобактерий, их значимости для организма человека и использования при производстве кисломолочных продуктов для лечебно-диетического питания.

С 01.04.05. по 29.04.05. проводились микробиологические и физико-химические исследования кисломолочных напитков «Бифилин-М», «Ацидолакт», «Бифилакт», выпускаемых МУЗ «Детская молочная кухня» г.Иркутска.

Исследования микрофлоры продуктов показали, что в «Ацидолакте» и «Бифилин-М» молочнокислые и бифидобактерии находятся в достаточном количестве, посторонние микроорганизмы отсутствуют, что соответствует норме микробиологического контроля. В продукте «Бифилакт» содержание бифидобактерий норме не соответствует (ниже).

 Работа выполнена 53 на  страницах, содержит 10 таблиц,  7 рисунков и    42 литературных источника. 



 





















Содержание.

Введение………………………………………………………………………...…5

Глава 1. Обзор литературы ……………………………………………………....7

Нормальная микрофлора желудочно-кишечного тракта детей и взрослых………………………………………………………………….....7

Характеристика молочнокислых и бифидобактерий, составляющих основу нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта детей и взрослых …………………………………………………………………..11

а) бифидобактерии .………………………………………………………11 

б) лактобактерии …………………………………………………………14

1.3     Лечебно-профилактические молочные продукты для детского питания, приготовленные с использованием молочнокислых и бифидобактерий…..………………………………………………………18

Глава 2. Объекты и методы исследования……………………………………..27

Объекты исследования……………………………………………………27

Методы исследования...…………………………………………………..30

Глава 3. Результаты исследования ……………………………………………..37

3.1 Микробиологические и физико-химические показатели молока используемого для производства детских молочных продуктов……...37

3.2 Морфологические, тинкториальные, культуральные признаки микроорганизмов, используемых для приготовления «Бифилина-М», «Ацидолакта», «Бифилакта»……………………………………………..39

3.3 Микробиологические и физико-химические показатели готовых продуктов  «Бифилина-М», «Ацидолакта», «Бифилакта»……………..43

Выводы…………………………………………………………………………...48

Рекомендации…………………………………………………………………….48

Литература……………………………………………………………………….49





                                                                                                                 ВВЕДЕНИЕ

Организм ребенка грудного возраста отличается высокой лабильностью многих жизненно важных систем и предрасположенностью к развитию патологических состояний различного типа.

В постнатальном периоде, в процессе адаптации к внеутробным условиям существования желудочно-кишечный тракт и его микрофлора в процессе завершающего формирования отличаются как высокой вариабельностью, так и наличием, практически у всех новорожденных детей, явлений транзиторного дисбактериоза.

Кисломолочные продукты давно с успехом используются для лечения детей с дисбактериозами, так как в результате брожения получаемый продукт приобретает способность ингибировать патогенную микрофлору, улучшать всасывание микроэлементов, улучшать переваривание и усвоение питательных веществ. Так протеолитическая и липолитическая активность кисломолочных продуктов изменяет жиры и белки, что повышает их всасывание, снижает вероятность аллергических реакций. Кроме того, данная группа продуктов имеет пониженное содержание лактозы. 

Изучение микробиологии кисломолочных продуктов необходимо для улучшения процесса их производства и контроля.

С целью изучения микробиологии кисломолочных продуктов детского питания были поставлены следующие задачи:

1) Провести микробиологическое и физико-химическое исследование сырого коровьего молока, используемого для производства детских кисломолочных напитков.

2) Исследовать морфологические, тинкториальные и культуральные признаки микроорганизмов заквасок для приготовления «Бифилина-М», «Ацидолакта», «Бифилакта».

3) Определить результаты жизнедеятельности микроорганизмов через оценку готовых продуктов по общепринятым стандартам микробиологического контроля.

Работа выполнена на базе кафедры микробиологии биолого-почвенного факультета ИГУ, в химической и микробиологической лабораториях МУЗ «Детская молочная кухня» г.Иркутска.

Выражаю искреннюю признательность руководителю работы, доценту кафедры микробиологии ИГУ А.П.Макаровой и заведующей МУЗ «Детская молочная кухня» Л.И.Свиточ.

  









































Глава 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Нормальная микрофлора ЖКТ детей и взрослых.

Интересную гипотезу о тонких механизмах формирования микрофлоры тела сформулировал Б.А.Шендеров в 1998 г. По его мнению, подразделение микроорганизмов на «свои» и «чужие» начинается еще в утробе матери. В организм плода через кровь попадают молекулы-антигены бактерий, входящих в состав нормальной микрофлоры различных участков тела матери. Известно, что взрослый организм, как правило, не способен формировать иммунный ответ на те антигены, с которыми сталкивался в период внутриутробного развития. Это явление называют «иммунологическая толерантность». После рождения организм новорожденного не будет стараться защититься от материнских микроорганизмов, и они станут основой для формирования его собственной микрофлоры [25].

К настоящему времени выявлены некоторые общие закономерности заселения желудочно-кишечного тракта человека микроорганизмами. Установлено, что в первые часы и дни в кишечнике новорожденных встречаются преимущественно микрококки, стафилококки, энтерококки и клостридии. Затем появляются энтеробактерии (кишечные палочки), лактобациллы и бифидобактерии. Первые микроорганизмы, обнаруживаемые у новорожденных, не обязательно те, которые доминируют в фекальной и вагинальной флоре матери. Со временем в кишечнике появляются, а затем начинают преобладать неспороносные облигатно-анаэробные бактерии (бифидобактерии, эубактерии, бактероиды, стрептококки, спириллы и др.). Для того чтобы микробная экология пищеварительного тракта новорожденных приблизилась к таковой взрослых требуется несколько лет [27]. Особенно обильна микрофлора нижних отделов пищеварительного тракта, где содержание бактерий достигает 10¹²ˉ¹³ КОЕ на 1г содержимого (разные авторы называют различный суммарный вес микроорганизмов в кишечнике взрослого человека: от 1 до 3 кг ). Здесь обнаружены представители более 500 видов бактерий. Число анаэробных микроорганизмов в этой области здорового взрослого человека в 100-1000 раз выше, чем аэробных бактерий. Такие представители микрофлоры, как энтеробактерии, включая кишечные палочки, стафилококки, грибы и другие аэробы, составляют немногим более 1-4% и рассматриваются как добавочная или случайная микрофлора [25].

Представители нормальной микрофлоры присутствуют в организме человека и животных в виде фиксированных к определенным рецепторам микроколоний, заключенных в биопленку.[27] Биопленка как перчатка покрывает кожу и слизистые открытых окружающей среде полостей здорового человека и животных и состоит помимо микроколоний микроорганизмов из экзополисахаридов различного состава микробного происхождения, а также муцина, продуцируемого бокаловидными клетками слизистых. С функциональной точки зрения, биопленку можно сравнить с плацентой. Если последняя регулирует взаимоотношения плода и организма матери, то биопленка регулирует взаимоотношения между макроорганизмом и окружающей средой. Благодаря наличию в биопленке сложной и разветвленной системы кооперации между многочисленными и разнообразными микробными популяциями, попадающий в организм естественным путем исходный субстрат в результате микробной трансформации превращается через каскад реакций в промежуточный либо конечный продукт с той или иной биологической или фармакологической активностью. Установлено, что нормальная микрофлора и продукты ее метаболической активности участвуют в регуляции газового состава кишечника и других полостей организма хозяина, в метаболизме белков, углеводов, липидов и нуклеиовых кислот, в водно-солевом обмене, в обеспечении колонизационной резистентности, в рециркуляции стероидных соединений и других макромолекул, в детоксикации экзогенных и эндогенных субстратов, обладают морфокинетическим действием, выполняют иммуногенную и мутагенную/антимутагенную функцию, служат источником энергии для клеток хозяина, являются хранилищем и источником генетического материала [27]. Таким образом, Б.А.Шендеров рассматривает биопленку с входящими в нее многочисленными и разнообразными микроорганизмами, как первичную мишень любого попадающего обычным (непарентеральным) путем соединения, как структуру, первой вовлекаемой в процессы распознавания, метаболизации, абсорбции и транслокации как полезных ,так и потенциально вредных агентов. Нормальная микрофлора – тот первичный неспецифичный барьер, лишь после прорыва которого инициируется включение всех последующих неспецифических и специфических иммунных и биохимических механизмов защиты макроорганизма.[25]

Для обозначения состояний характеризующихся нарушениями состава нормальной микрофлоры используют такие термины как «дисбактериоз», «дисбиоз», «микробиологический дисбаланс» и т.д. 

Прежде всего необходимо отметить, что дисбактериоз – это не самостоятельное заболевание, а особое состояние организма, встречающееся у больных с самыми разными диагнозами (от нарушений гормонального обмена до кариеса)[28]. В большинстве случаев дисбиотические изменения исчезают вскоре после устранения вызвавшего их фактора и не требуют лечения. Однако у ослабленных больных (особая категория – дети), а также в случаях продолжения действия фактора, послужившего причиной развития дисбиоза, самовосстановления не происходит, появляются клинические симптомы, что требует проведения адекватного лечения. Состав микрофлоры отдельных индивидуумов может варьировать в достаточно широких пределах. При этом у детей, как и у взрослых, состав микрофлоры будет определяться характером питания. Поэтому с помощью правильного питания можно, в определенной степени, влиять на состав кишечной микрофлоры и нормализацию работы желудочно-кишечного тракта.[3] 

Механизмы положительного влияния молочнокислых бактерий и бифидобактерий, содержащихся в кисломолочных продуктах, на организм ребенка следующие [27]:

1) Ингибирование роста потенциально вредных микроорганизмов в результате продукции антимикробных субстанций; конкуренции с ними за рецепторы адгезии и питательные вещества; активации иммунно-компетентных клеток и стимуляции иммунитета.

2) Стимуляции роста представителей индигенной микрофлоры в результате продукции витаминов и других ростостимулирующих факторов; нормализации рН, еН-потенциала; нейтрализации токсинов.

3) Восстановление и оптимизация функционирования биопленки, выстилающей слизистую пищеварительного тракта.

4) Изменение микробного метаболизма, ведущего к повышению или снижению синтеза и активности бактериальных ферментов и, как следствие этого, продукции соответствующих метаболитов (например, ЛЖК, глютамина, аргинина, витаминов, пептидогликанов и т.д.), обладающих способностью местно или после проникновения в кровь и другие биологические жидкости макроорганизма непосредственно вмешиваться в метаболическую активность клеток соответствующих органов и тканей. Модулировать его морфокинетические характеристики, физиологические функции, биохимические и поведенческие реакции.

5) Другие механизмы (прямые эффекты естественных пробиотиков (молочнокислых и бифидобактерий) после их всасывания из пищеварительного тракта на ферментативные и иные клеточные реакции гормональных, нервных, выделительных, иммунных и других органов и тканей).









1.2.Характеристика молочнокислых бактерий и бифидобактерий.

а) Бифидобактерии.

Бифидобактерии составляют основу микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека. В настоящее время род Bifidobacterium включает 32 вида [27]. В табл.1 приведены виды бифидобактерий, наиболее часто обнаруживаемые в пищеварительном тракте.

                                                                                                  Таблица 1. 

Виды бифидобактерий, наиболее часто обнаруживаемые 

           в желудочно-кишечном тракте человека.[27]    



Bifidobacterium bifidum

B.adolescentis

B.animalis

B.boum

B.breve

B.choerinum

B.dentium



Bifidobacterium ericsonii

B.globosum

B.infantis

B.longum

B.pseudolongum

B.suis

B.thermophilum



Впервые эти микроорганизмы были изолированы из фекалий грудных детей учеником И.И. Мечникова французским исследователем Henry Tissier в 1899 году [3]. Эти грамположительные анаэробные, не образующие споры, палочковидные, полиморфные бактерии, нередко с бифрукациями на концах, были названы им Bacillus bifidus communis. В последующем было установлено, что эти микроорганизмы  на 99% составляют флору кишечника здорового грудного ребёнка. И в больших количествах присутствуют в микробиоценозе толстого кишечника взрослых людей.[16] Основываясь на высокой частоте встречаемости этих бактерий в пищеварительных трактах . И.И. Мечников и  Henry Tissier ещё в 1905 году пытались применить препараты из бифидобактерий больным с кишечными дисфункциями.[3]

Проведённая российскими исследователями [16] статистическая обработка данных о видовом составе бифидобактерий у различных возрастных групп населения России показала, что у здорового грудного ребёнка, находящегося на грудном вскармливании, B.Bifidum, B.longum, B.breve, B.infantis, встречаются в соотношении 35%, 42%, 17%, 12%. Штаммы  B.adolescentis обнаруживаются у 1.5% детей отсутствуют в фекальном содержимом. У детей на искусственном вскармливании содержание доминирующих видов бактерий падает до 3-5%, в то время как представители вида B. adolescentis, встречаются в 22% случаев.

У взрослых в толстом кишечнике обнаруживаются преимущественно представители B.Bifidum, B.longum и B.adolescentis. В кишечнике лиц старше 35 лет представители вида B.adolescentis начинают превалировать в бифидофлоре, достигая 60-75% в пожилом возрасте. В кишечном содержимом человека одновременно могут обнаруживаться от 1 до 5 видов биоваров бифидобактерий.

Фруктозо-6-фосфатаза – ключевой фермент в метаболизме углеводов бифидобактериями. Этот фермент расщепляет фруктозо-6-фосфат на ацетил-1-фосфат и эритрозу-4-фосфат. На обнаружении у бактерий фруктозо-6-фосфат фосфокетолазы основан энзиматически-калориметрический метод количественного определения в материале бифидобактерий.[37] Бифидобактерии образуют уксусною и молочную кислоты в молярном отношении 3:2, но не образуют углекислый газ. Оптимум температуры для роста этих бактерий 37-40С, оптимум pH 6.5-7.0. Подавляющее большинство бифидобактерий демонстрируют наличие у них  и - галактозидаз; N-ацетил--глюкозаминидаза, главным образом, обнаруживается у видов бифидобактерий изолируемых от детей грудного возраста. Исследование электрофоретической подвижности -галактозидаз, присутствующий у бифидобактерий позволяет дифференцировать виды между собой.[42]

Для выявления бифидобактерий в биоматериале (кисломолочные продукты) рекомендуется производить высев на специальные селективные среды и модифицированную MRS-среду, содержащую 100 ммоль --Gal. На последней бифидобактерии в анаэробных условиях формируют колонии голубого цвета. Хорошо растут бифидобактерии в присутствии таких редуцирующих агентов, как аскорбиновая кислота, цистеин или тиогликолат. Для своего роста данные микроорганизмы нуждаются в источнике углерода (различные углеводы, бикарбонат или углекислый газ). Напротив, органические кислоты, жирные кислоты и и аминокислоты не могут быть для них источником С. Цистеин или цистин служат необходимым для них источником азота. Обнаружена потребность отдельных штаммов бифидобактерий в аланине, изолейцине, лизине, аргинине и глутаминовой кислоте. Добавление в среду пантотеновой кислоты, биотина, рибофлавина, никотиновой кислоты, парааминобензойной кислоты, пуринов и пиримидинов также требуется для поддержания многих штаммов бифидобактерий, свежевыделенных из кишечного содержимого детей и взрослых.[27]

Именно бифидобактериям принадлежит ведущая роль в поддержании и нормализации микробиоценоза кишечника, сохранении неспецифической резистентности организма, улучшении белкового, витаминного и минерального обмена и др [20].

Антогонистическая активность бифидобактерий связанная с продукцией органических кислот (ацетата и лактата) и бактериоцинов с широким спектром антимикрбного действия (ингибирования роста кишечных палочек, клостридий, сальмонелл, шигелл, листерий, кампилобактеров, вибрионов и др.) так же как и блокирование рецепторов на слизистой кишечника, предотвращающее фиксацию на них потенциально патогенных микроорганизмов в колонизационной резистентности. Снижение количества бифидобактерий (или их даже полное исчезновение) является одним из патогенетических механизмов длительных кишечных инфекций у детей и взрослых . Оно ведёт к нарушению минерального обмена, процессов кишечного всасывания, белкового и жирового обмена, к формированию хронических расстройств пищеварения. Имеются сведения, что бифидобактерии являются «поставщиком» ряда незаменимых аминокислот, в т.ч. триптофана, витаминов, установлена их антиканцерогенная и антимутагенная активность, способность снижать уровень холестерина в крови и т.д.[5,13,26]

Все эти положительные эффекты позволили рассматривать бифидобактерии как одну из основных категорий функционального питания.

б) Лактобациллы.

Лактобациллы-  микрофильные грамположительные бактерии, не образующие спор и не продуцирующие каталазу. На основании продукции  углекислоты из глюкозы, потребности в тиамине, ферментации фруктозы до маннита и продукции фруктозодифосфатальдолазы лактобациллы делят на две группы: гомо- и гетероферментативные.

В настоящее время род Lactobacillus объединяет 56 видов, из которых 5 подразделяются на 2 и больше подвидов. На основании нуклеозидной последовательности 16-S и p-РНК лактобациллы подразделяют на 3 филогенетические группы (L.delbrulckii, L.casei-pediococcus, L.leuconostoc), внутри которых наблюдаются широкие вариации ГЦ-пар в ДНК.[11]

У здоровых взрослых людей в содержимом желудка, тощей, подвздошной кишок и фекалий лактобациллы обнаруживаются в количестве равном соответственно 103, 104, 102-5, 106-8, KOЕ lg/г. И они преимущественно представлены видами Lactobacillus acidophilus, L.salivarius, L.casei, L.plantarum и L.brevis, которые образуют всевозможные сочетания.[22]

Анализ формирования комплекса лактобактерий у здоровых детей на протяжении первых трёх месяцев жизни и роли матери в колонизации детей этими микроорганизмами, показал, что у 40% рожениц в первую неделю после родов лактобациллы присутствуют в грудном молоке. У всех женщин эти бактерии обнаруживаются в отделяемом вагинального тракта и фекальном содержимом. Наиболее часто в исследуемых образцах рожениц, в толстом кишечнике детей первых месяцев жизни выявляются L.reuteri, L.cosei/paracasei, L.acidophilus. К трем месяцам жизни у 94% детей лактобациллы постоянно присутствуют в образцах фекалий. Эти данные дали основание сделать заключение, что источниками лактобацилл, колонизирующих пищеварительный тракт новорожденных и детей первых трёх месяцев жизни, являются урогенитальный и желудочно-кишечный тракт матери и грудное молоко.[4]

Главным конечным продуктом метаболизма этих грамположительных неподвижных бактерий является D- и L- молочная кислота. У представителей гетероферментативных видов лактобацилл в качестве конечных продуктов, кроме того, образуется уксусная кислота и углекислый газ. Некоторые штаммы лактобацилл обладают необычайной метаболической активностью (продуцируют α-амилазы, гидролизуют мочевину, разрушают щавелевую кислоту и холестерин, редуцируют нитраты, декарбоксилируют аминокислоты или разрушают амины, разрушают значительные количества экзополисахаридов различной химической природы, нейтрализуют энтеротоксины и т.д.).[25] 

Благодаря продукции органических кислот, перекисей, антибиотиков и бактериоцинов, многие штаммы лактобацилл проявляют выраженную антагонистическую активность, в отношении патогенных и оппортунистических микроорганизмов.[22]

Среди лактобацилл виду lactobacillus acidophilus принадлежит ведущая роль как компоненту закваски для многочисленных лечебных и диетических кисломолочных продуктов.[7]

Первые сведения об использовании ацидофильных бактерий для профилактики и лечения заболеваний человека относиться к 1910 году, когда на рынке появилось ацидофильное молоко. В настоящее время в различных странах мира ацидофильные лактобациллы вводят в монокультуре, либо в комплексе с различными видами бифидобактерий в состав биологически активных препаратов, пищевых добавок и кисломолочных продуктов (как моновидового, так и комплексного состава)

Большое внимание к лактобациллам обусловлено тем, что представители данного рода не участвуют в возникновении каких-либо патологических процессов в организме человека, а, напротив, оказывают позитивное воздействие на здоровье человека.[22]

Ацидофильные лактобациллы широко используются для профилактики и лечения больных с различными видами острых и хронических заболеваний пищеварительного тракта, воспалительными процессами дыхательных путей, бактериальными инфекциями мочеполовой системы.

Представители L.acidophilus применяют так же, как антиоксиданты и средства понижающие липидную пероксидазу и стимулирующие рост других лактобацилл и бифидобактерий. Эти микроорганизмы обладают противоопухолевой активностью и стимулируют различные звенья иммунитета. Достаточно отметить, что оральное назначение   L.acidopilus более чем в 4 раза увеличивает  IgA ответ.[1,19]

Оральная бактериальная терапия ацидофильными лактобацилами предотвращает возникновение у детей диарей, связанных с назначением им антибиотиков (например амоксициллина)[27]

Показано, что многие штаммы ацидофильных бактерий обладают выраженным вирусоцидным действием, благодаря продукции высокоактивной перекиси водорода. В высоких концентрациях L.acidophilus оказывает вирусоцидное действие в отношение вируса иммунодифицита человека.[39]

Лактобациллы обладают выраженной антагонистической активностью и способностью к адгезии, что обуславливает важную роль этих микроорганизмов в поддержании колонизационной резистентности. Недавно на модели гнотобиотических мышей, предварительно получивших дозу лактобацилл, было показано, что эти микроорганизмы предотвращали колонизацию животных Нelicobacter pylori, возбудителя язвенной болезни человека и животных.[38] Имеют хорошо документированные факты, что лактобациллы (в частности lactobacillus GG), обладают выраженной способностью предотвращать обострение язвенного колита вызываемого C.Difficile [40], оказывать выраженный терапевтический эффект при диарее новорожденных, вызванных как бактериальными, так и вирусными патогенами [41]. Входящие в состав биоплёнки, покрывающей слизистые, микроколонии лактобацилл устойчивы к действию животного лизоцима, присутствующего в кишечном содержимом, а также к пищеварительным сокам, желчи и кислотам. Следует отметить, что некоторые лактобацилы сами активно продуцирую лизоцимоподобный фермент.( L.casei, L.fermentum, L.acidophilus)[25]

Антагонистическая активность лактобацилл связана с продуцированием в больших количествах органических кислот (главным образом, молочной), антибиотикосхожих субстанций различного химического состава, спектра и механизма действия (лактоцины), перекиси водорода. Установлен факт выраженного влияния L.acidophilus на иммунную систему организма через стимуляцию миграции моноцитов, активацию фагацитарной активности.[25]

Назначение больным с хроническими заболеваниями пищеварительной системы (гастриты, язвенная болезнь, синдром раздражения толстой кишки, пищевая аллергия и др.) пробиотиков, содержащих лактобациллы, увеличивало содержание sIgA и IgG в желудочном соке секреторного IgA в супернатантах фекалий при стабильных показателях сывороточных IgA и IgG. [12,18]

Иммуностимулирующие действие лактобацилл, в первую очередь связывают с присутствием в их клеточной стенке пептидогликанов и тейхоевых кислот, известных поликлональных индукторов иммуномодуляторов. Исследование противоинфекционной и иммуностимулирующей активности L.plantarum показало, что представители этого вида лактобацилл обладают выраженной способностью в анаэробных условиях образовывать уксусную и молочную кислоту, а также катаболизировать аргинин и генерировать окись азота (NO). NO, образующийся в кишечном тракте за счёт конститутивных ферментов лактобацилл, участвует в таких функциях кишечника, как бактериостаз, секреция мукуса, перистальтика, обеспечение местного иммунитета. Как полагают, способность L.plantarum предотвращать развитие инфекций, вызванных традиционными патогенами, осуществляется преимущественно через механизм образования аргинина и окиси азота, а также предотвращения адгезии посторонних микроорганизмов и образования ими эндотоксина.[26] Основываясь на длительных клинических наблюдениях, рекомендовано назначать продукты функционального питания на основе лактобацилл всем больным на стационарном лечении.[22]

1.3 Кисломолочные продукты для детского и диетического питания, изготовленные с использованием молочнокислых и бифидобактерий.

В России производятся жидкие и пастообразные специализированные кисломолочные продукты, предназначенные для вскармливания и питания как здоровых детей до и старше года (Росток, Бифидолакс, Бифидомикс, Ацидомил, Дюймовочка и т.д. и т.п.), так и предназначенные для детей различного возраста, страдающих или склонных к диареям и другим заболеваниям пищеварительного тракта. Для детей детей разных возрастных групп, страдающих различными проявлениями дисбактериоза, сниженной ферментативной активностью пищеварительного тракта, хроническими поражениями печени, лактазной недостаточностью с лечебно-профилактическими целями рекомендуют использовать неадаптированные кисломолочные продукты на основе кефирных грибов, лактобацилл, пропионовых бактерий, молочных стрептококков: Ацидолакт, Биолакт, Нарине, Малютка, Олиголакт (заквасочные культуры – различные штаммы лактобацилл), Тонус (пропионобактерии и молочнокислый стрептококк ), курунга, кумыс (кумусные дрожжи ), кефир и т.д.[10] Ассортимент кисломолочных продуктов, существующих на данный момент, чрезвычайно широк.

Сырьё и основные материалы, используемые при производстве детских и лечебно-профилактических продуктов на молочной основе в условиях молочных кухонь и специализированных участков, должны быть разрешены к применению органами Госсанэпиднадзора РФ. Качество сырья и основных материалов должно соответствовать требованиям действующей нормативной документации и СанПиН 2.3.2.560-96 «Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов». [29]

Закваски для кисломолочных продуктов приготовляют с использованием:

Закваски бактериальной сухой или жидкой ОСТ 49-113-77;

Бактериального концентрата сухого ТУ 49-560-79, ТУ 49-559-79, ТУ 49-350-76;

Штаммов молочнокислых бактерий и дрожжей;

Кефирных грибков ОСТ 49-56-73;

Сухих кефирных грибков ТУ 49-389-77. [6]

Стандартные виды продукции:

Адаптированные продукты для питания детей с первых месяцев жизни (стерилизованные и кисломолочные):

Стерилизованная смесь «Малютка»;

Ацидофильная смесь «Малютка»;

Кисломолочная смесь «Бифилин».

Продукты прикорма для питания детей с шести месяцев. (стерилизованные, кисломолочные, пастообразные):

Молоко детское стерилизованное витаминизированное;

Кефир детский;

Ацидолакт;

Биолакт;

Творог ДМ.

Лечебно-профилактические продукты:

Ацидолакт соевый;

Молочный продукт «нефролакт».

Указанный ассортимент может быть дополнен другими молочными продуктами детского питания, вырабатываемыми в соответствии с нормативной документацией, утверждённой в установленном порядке, в зависимости от потребностей детей конкретного региона.[29] 

Ниже приведено описание некоторых кисломолочных продуктов, рекомендованных для детского и лечебно-профилактического  питания, для производства которых используется молочнокислые бактерии и бифидобактерии.

Ацидолакт [33]:лечебно-профилактический молочнокислый напиток. Производиться из цельного коровьего молока, подвергнутого высокотемпературной обработке и сквашенного закваской приготовленной на специально подобранных штампах ацидофильной палочки и термофильного стрептококка. Содержит: легко усвояемые белки, незаменимые аминокислоты, комплекс витаминов, минеральные вещества, ферменты и др.

Рекомендован:

Для лечения, профилактики острых кишечных инфекций, таких как дизентерия, сальмонеллез, брюшной тиф и др.

При заболеваниях, возбудителями которых является стафилококк: ангина, дерматиты и др.

При длительном лечении антибиотиками, группе часто и длительно болеющих.

При соматических заболеваниях: сепсис, пневмония, гипотрофия, рахит, холецистит и др.

При хронических инфекционных заболеваниях кишечника: хронический колит, энтероколит и т.п.

 «Супролакт».[33]Приспособлен к пищеварения и обмена веществ детей, хорошо усваивается детьми, как первого-второго года жизни, так и более старшего возраста, страдающих различными видами пищевой аллергии. Этот продукт является полноценным заменителем молочных продуктов и может использоваться так же в питании здоровых детей, как для целей прикорма, так и продуктов общего стола. По сравнению с продуктами на основе экстракта из соевых бобов, «Супролакт» совершенно безопасен и обладает более высокой пищевой ценностью и усвояемостью. По сравнению с молоком, продукт обогащен витаминами (А,D) и минеральными веществами, в том числе йодом и железом, что важно для профилактики железодефицитной анемии.

Продукт вырабатывается из сухого компонента «Супро Плюс ЛФ», произведенного на основе изолированного соевого белка и добавлением закваски термофильного стрептококка и ацидофильной палочки. Белковый компонент легко переваривается в желудочно-кишечном тракте ребенка, не вызывает аллергической реакции, обеспечивает нормальный рост и развитие. 



Кисломолочный бифидумбактерин [6], разработанный исследователями МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского. продукт готовят из цельного или обезжиренного коровьего молока с применением в качестве заквасочной культуры В.longum B379M или B.bifidum 791 или ЛВА-3. Указанные штаммы обладают высокой антагонистической активностью в отношении шигелл, сальмонелл, энтеропатогенных кишечных палочек, золотистого стафилококка, протеев и других патогенных и условнопатогенных микроорганизмов. Кроме того, эти культуры способны активно развиваться в молоке.

При клинических испытаниях на переносимость и антагонистическую активность указанные штаммы бифидобактерий показали свою безвредность, отсутствие на их введение каких-либо отрицательных реакций у детей и взрослых и нормализующее на микробную экологию кишечника действие.

          При внесении в молоко одновременно двух штаммов бифидобактерий в Восточно-Сибирском технологическом институте был изготовлен кисломолочный продукт, получивший название Бифисанус.[6] Кисломолочный бифидумбактерин и Бифисанус являются высокоэффективными лечебно-профилактическими продуктами питания с широким спектром показаний к применению, совпадающим с таковым для бифидумбактерина сухого.

В 1989 году распоряжением МЗ РФ кисломолочный бифидумбактерин было предложено производить на всех молочных кухнях России. Назначение продуктов на основе указанных выше производственных культур детям, находящимся на искусственном или смешанном вскармливании улучшало общее состояние ребенка, способствовало исчезновению  патологических проявлений со стороны желудочно-кишечного тракта, хорошей среднесуточной прибавке массы тела, повышению усвояемости белка, нормализации соотношения анаэробных и аэробных представителей микрофлоры кишечника.[24]

Одним из родоначальников группы отечественных кисломолочных продуктов, приготовленных на комплексной закваске бифидо- и лактобактерий, является выпущенный в середине 80-х годов на рынок России молочный Бифилакт.[7,15] Его готовят на коровьем молоке с использованием смеси фармокопейных штаммов В.longum B379M или B.bifidum 1 с  L.plantarum 8 PA-3, L.fermentum 90 TC-4. Технология изготовления Бифилакта включает в себя выращивание в течение 22 ч. в молоке при 37°С бифидобактерий, а затем внесение в полуфабрикат закваски лактобактерий. После дополнительного совместного культивирования получают готовый кисломолочный продукт с хорошим вкусом и консистенцией, содержащий в 1г. не менее 108 КОЕ бифидобактерий и лактобацилл. Кислотность Бифилакта около 80о Т. содержание белка и углеводов в полученном продукте несколько меньше чем в исходном молоке, за счет воздействия на молочные белки и углеводы бактериальных ферментов. По витаминному составу молочный Бифилакт отличается от исходного сырья лишь повышенным содержанием витамина А. Аминокислотный анализ этого продукта выявил достоверное увеличение в нем лизина, валина, изолейцина и фенилаланина. Содержание ненасыщенных жирных кислот в молочном Бифилакте было на 12% выше по сравнению с исходным молоком, при этом отмечалось нарастание в нем такой незаменимой полиненасыщенной жирной  кислоты, как линолевая. Применение Бифилакта роженицам сразу после родов по 200 мл и смазывание сосков перед каждым прикладыванием ребенка к груди выявило высокую эффективность этого продукта для раннего формирования бифидо- и лактофлоры новорожденных. Так на четвертый день после использования Бифилакта бифидо- и лактобактерии обнаруживались у 100% детей в количестве 6-10 lg КОЕ/г фекалий, в то время как у новорожденных контрольной группы ( без Бифилакта ) бифидобактерии и лактобациллы в эти же сроки выявлялись лишь соответственно у 63,3% и 53,3% обследованных.[15]

Адаптированные смеси серии АГУ. Сотрудники института Питания АМН совместно с заводом детских молочных продуктов г.Москвы и некоторыми другими предприятиями разработали и внедрили жидкие и адаптированные смеси «АГУ» для смешанного и искусственного вскармливания детей от рождения до года. Вариантом АГУ является смесь ферментированная бифидобактериями, лактобациллами и термофильным стрептококком, кислотность смеси не превышает 50-55ºТ, а содержание бифидобактерий и лактобацилл находится в пределах 106-7 КОЕ/мл. Заквасочная смесь имеет зарубежное происхождение.[21]

Адаптированная жидкая кисломолочная смесь Антошка-Л. Продукт разработан в НИИ детского питания РАСХН и адаптирован для питания детей первого года жизни, страдающих теми или иными формами дисбактериоза толстого кишечника. В его состав входят живые бифидобактерии, молочнокислые бактерии, лизоцим и витамины групп 

В и РР. Содержание лактобацилл на два порядка выше, чем уровень бифидобактерий. В исследованиях на детях первого года жизни ( от 4,5 до 10,5 месяцев ) показано, что назначение Антошки-Л в качестве заменителя смеси для вскармливания ( суточное количество до 300-500 мл ) оказывало на детей с неврологическими расстройствами и дисбактериозом отчетливый благоприятный эффект даже на фоне назначения этим детям антибиотиков (ампиокса, ампициллина, линкомицина ) .[9] 

Бивит. В научно-инновационном центре ОАО «Русский йогурт» в 1996г. сконструирован и прошел широкое клиническое испытание отечественный кисломолочный продукт функционального питания на основе медицински значимых штаммов бифидобактерий и лактобацилл (комплексная закваска из смеси  штаммов B.longum и/или B.bifidum и L.acidophilus человеческого происхождения ). Использование Бивита в рационе питания около пяти тысяч детей в возрасте от 6 месяцев до 14 лет с теми или иными нарушениями со стороны психоневрологического статуса, сердечно-сосудистой, пищеварительной и других систем, находящихся на больничном или санаторном лечении, показало, что его включение в питание детей оказывало позитивный клинический эффект, улучшало состояние здоровья, способствовало лучшей переносимости специфического лечения, предотвращало или резко снижало частоту внутрибольничных и кишечных инфекций. Оценка антигенности молочного белкового компонента Бивита показала, что содержание в нем β-лактоглобулина и α-лактальбумина, сывороточного альбумина и одной из фракций казеина ( Кз1) значительно снижено, а антиген АG4 полностью отсутствует. Что, вероятно происходит из-за высокотемпературной обработки молока и ферментативной активности микроорганизмов. Частичная замена коровьего молока на соевую основу перед добавлением заквасочных культур еще более снижало в Бивите содержание основных антигенных фракций. В настоящее время серия кисломолочных продуктов Бивит включает в себя более 10 наименований. [14].

Бифилайф.  Изготавливается на основе молока с использованием смеси штаммов ( B.longum, B.bifidum, B.adolescentis, B.infantis, B.breve ). Клинические испытания Бифилайфа показали, что его применение способствует более быстрому клиническому улучшению при заболеваниях желудочно-кишечного тракта, у больных с онкологией, поражениями печени, мочеполовой системы, с раневой инфекцией.[3] Данных о соотношении всех штаммов в готовом продукте после совместного культивирования одновременно всех используемых в этом продукте стартерных культур нами не найдено.

Бифидокефиры. В России в последние годы в больших количествах реализуется кефир, обогащенный бифидобактериями (биокефир, бифидокефир, бифидок ). Обогащенный бифидобактериями кефир можно рассматривать как вариант продукта функционального питания, т.к. его применение сопровождается улучшением микрофлоры пищеварительного тракта, способствует увеличению в кишечнике биологически активных соединений ( витаминов, ферментов, антибиотических субстанций ), приводит к детоксикации токсинов и метаболитов, улучшает обменные процессы в организме человека, укорачивает время интоксикации и длительность диарейного синдрома у детей с острыми кишечными инфекциями.[17] Бифидокефиры производятся в нашей стране путем внесения в готовый кефир лиофильно высушенных бактерий.[27]

По мнению специалистов из НИИ детского питания РАСХН [2], в ближайшей перспективе разработка новых видов кисломолочных продуктов для детского питания будет идти по следующим направлениям: 

- производство традиционных кисломолочных продуктов, обогащенных такими белковыми компонентами, как концентраты сывороточных белков, протеинов, обезжиренного молока или яичного белка;

- производство продуктов повышенной биологической ценности за счет введения в них комплекса витаминов и минеральных веществ;

- производство продуктов с улучшенными органолептическими показателями.

Б.А.Шендеров [27] дополняет данный список включением в детские кисломолочные смеси адаптированных к определенному детскому возрасту пробиотических культур бифидобактерий, лактобацилл, а также бифидогенных факторов на основе фруктоолигосахаридов. 

    

 







  

   

             



 

    









	



















Глава 2. Объект и методы исследования.

2.1. Объекты исследования.

Объектами исследования являются кисломолочные продукты, предназначенные для детского лечебно профилактического питания: Бифилин-М [34], Ацидолакт [36], Бифилакт [35].

Бифилин-М. (ТУ 10-02-02-789-202-95.) Вырабатываемый квашиванием цельного пастеризованного молока закваской состоящей из бифидобактерий.

Продукт производится по следующей технологической схеме (рис.1).



Приемка молока



Стерилизация молока

Приготовление закваски B.longum

Пастеризация молока

Охлаждение до 37+1С

.



Заквашивание



Перемешивание



Сквашивание 16-18 час.



Перемешивание, охлаждение до 6С

Розлив



Выдержка 12 час. При t=4С.



Реализация.



                                                                                                                             Рис.1. Технологическая схема производства Бифилина-М.

Ацидолакт. (ОСТ 10-194-96.) Кисломолочный питьевой продукт, вырабатываемый сквашиванием цельного пастеризованного молока закваской состоящей из молочнокислых бактерий вида str.thermophilus, L.acidophilus. Продукт изготавливается по следующей схеме (рис.2). 





Приёмка молока

Пастеризация молока

Охлаждение молока до 40С

Заквашивание

Стерилизация молока

Приготовление пересадочной закваски str.thermophilus

Приготовление производственной закваски L.acidoph

Приготовление производственной закваски str.thermophilus 

Перемешивание 

Сквашивание 4 час.

Охлаждение до 6С

Розлив

Хранение (не более 12 час.) (дозревание)

Реализация



Рис.2. Технологическая схема производства Ацидолакта.



Бифилакт. (ТУ БГ-003-00-98) Кисломолочный продукт, вырабатываемый сквашиванием цельного пастеризованного молока симбиотической закваской, состоящей из молочнокислых и бифидобактерий. Продукт изготавливается по следующей схеме (рис.3).





Приемка молока

Стерилизация молока

Пастеризация молока

Приготовление пересадочной закваски  str.thermaphilus

Приготовление производственной закваски L.acidophilus 

Приготовление производственной закваски B.longum

Приготовление производственной закваски str.thermaphilus



Охлаждение до 38С

Заквашивание

Перемешивание

Сквашивание 3 час.

Охлаждение до 6С.

Розлив

Хранение (≤12 час.) (дозревание)

Реализация 

Рис.3. Технологическая схема производства Бифилакта.



2.2 Методы исследования.

Контроль производства кисломолочных продуктов на МУЗ «Детская молочная кухня» включает ежедневную оценку сырого, стерилизованного, пастеризованного молока и готовых напитков по микробиологическим и физико-химическим параметрам [30,31,32]. 

	Контроль сырья готовой продукции (определение общего количества бактерий, определение бактерий группы кишечных палочек, промотор микроскопических препаратов) проводится по ГОСТ 9225-84. Наличие ингибирующих веществ по ГОСТ 23454-79.

	а) Методопределения редуктазы с резазурином.

	Сущность метода.

	Метод основан на восстановлении резазурина окислительно-восстановительными ферментами, выделяемыми в молоко микроорганизмами. По продолжительности изменении окраски резазурина оценивают бактериальную обсеменённость молока.

	Проведение анализа.

	Пробу с резазурином следует проводить не ранее. Чем через 2ч после доения.

	В пробирку наливают по 1см3  рабочего раствора резазурина и по 10см3  иссладуемого молока, закрывают резиновыми пробками и смешивают путем медленного трехкратного перевёртывания пробирок. Пробирки помещают в редуктазник с температурой воды 37+1С.

	При отсутствии редуктазника можно использовать водяную баню, помещённую в термостат с температурой 37+1С.

	Вода в редуктазнике или в водяной бане после погружения пробирок с молоком должна доходить до уровня жидкости в пробирке или быть немного выше, температуру её поддерживают в течении всего времени определения 37+1С. 

	Пробирки с молоком и резазурином на пртяжении анализа должны быть  защищены от света прямых солнечных лучей (редуктазник должен быть плотно закрыт крышкой).

	Время погружения пробирок в редуктазник считают началом анализа.

	Показания снимают через 20 минут и 1час, после снятия показаний через 20 минут пробирки с обесцвеченным молоком удаляют из редуктазника.

	Появление окрашивания молока в этих пробирках при встряхивании не учитывают.

	По истечении 1час оставшиеся пробирки вынимают из редуктазника, осторожно переворачивают.

	Обработка результатов.

	В зависимости от продолжительности обесцвечивания или изменения цвета молоко относится к одному из четырёх классов в соответствии с таблицей 2.

	Таблица 2.

	

	Класс

	Оценка качества молока

	Продолжительность изменения цвета

	Окраска молока

	Ориентировочное количество бактерий в 1см3 молока

	1.

	Хорошее

	Через 1 час

	Серо-сиреневая до сиреневой со слабым серым оттенком

	До 500 тыс.

	2.

	Удовлет.

	Через 1 час

	Сиреневая с розовым оттенком или ярко-розовая

	От 500 тыс. до 4 млн.

	3.

	Плохое

	Через 1 час

	Бледно-розовая или белая

	От 4 млн. до 20 млн.

	4.

	Очень плохое

	Через 20 минут

	белая

	От 20 млн. и более

	

	

	б) определение общего количества бактерий (ГОСТ 9225-84).

	Сущность метода.

	Метод основан на подсчёте колоний мезофильных аэробных и факультативно-аэробных микроорганизмов, вырастающих на плотно питательном агаре при (30+1)С в течение 72ч.

	Проведение анализа.

	Выбор разведений для посева.

	Количество засеваемого продукта устанавливают с учётом наиболее вероятного микробного обсеменения.

	Посев.

	Для определения общего количества бактерий выбирают те разведения, при посевах которых на чашке вырастает не менее 30 и не более 300 колоний. Из каждой пробы делают посев на две-три чашки. Каждое из разведений должно быть засеяно в количестве 1см3  в одну чашку Петри с заранее маркированной крышкой и залито (14+1) см3 расплавленной и охлажденной до температуры 40-50 С питательной средой для определения общего количества бактерий по ГОСТ 9225-84.

	Допускается посев исследуемого продукта на чашке Петри из одного и того же разведения в количестве 1 и 0,1см3. Сразу после заливки агара содержимое чашки Петри тщательно перемешивают путём лёгкого вращательного покачивания для равномерного распределения посевного материала.

	Выращивание.

	После застывания агара чашки Петри перивёртывают крышками вниз и ставят в таком виде в термостат с температурой (30+1) С на 72ч.

	

	Обработка результатов.

	Количество выросших колоний подсчитывают на каждой чашке, поместив её вверх дном на тёмном фоне, пользуясь лупой с увеличением в 4-10 раз. Каждую подсчитанную колонию отмечают на дне чашке чернилами. При подсчёте колоний рекомендуется пользоваться счётчиками.

	При большом числе колоний и равномерном их распределении дно чашки Петри делят на четыре и более одинаковых секторов , подсчитывают число колоний на двух-трёх секторах (но не менее чем на 1/3 поверхности чашки), находят среднее арифметическое число колоний и умножают на общее количество секторов всей чашки. Таким образом, находят общее количество колоний, выросших на одной чашке.

		Общее количество бактерий в 1см3 или 1г продукта (Х) в единицах вычисляют по формуле:

		Х=n10m

		Где n –количество колоний, подсчитанных на чашку Петри; m –число десятикратных разведений.

		За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое, полученное по всем чашкам.

		в) Определение бактерий группы кишечных палочек (БГКП)

		Сущность метода.

		 Метод основан на способности бактерий группы кишечных палочек (бесспоровые, грамотрицательные, факультативно-анаэробные бактерии) сбраживать в питательной среде лактозу при температуре 37+1С в течение 24ч с образованием кислоты и газа (БККП).

		В настоящее время БГКП относятся представители родов эшерихий, цитробактер, клебсиелла, серация.

		По 1см3  соответствующих разведений продукта засевают в пробирки с 5см3   среды Кесслер.

		Выращивание.

		Пробирки с посевами помещают в термостат при 37+1С на 18-24ч Просматривают пробирки с посевами и определяют наличие бактерий группы кишечных палочек по газообразованию. При отсутствии газообразования через 18-24ч продукт считается не загрязнённым бактериями группы кишечных палочек.

		

		г) Метод микрокопирования.

		Сущность метода. 

		Метод основан на просмотре окрашенных препаратов под микроскопом для ориентировочной характеристики микрофлоры молочных продуктов.

		Проведение анализа.

		Для приготовления препарата на чистое предметное стекло наносят петлёй небольшую каплю исследуемого материала и распределяют на площади около 1см2. При исследовании творога и творожных изделий, а также агаровой культуры на стекло наносят каплю воды. Затем вводят в неё петлёй продукт, тщательно перемешивают и растирают на площади 1см2. Препарат высушивают при комнатной температуре, фиксируют на пламени горелки и красят метиловым голубым или раствором карболового кристаллического фиолетового. 

		д) Определение количества клеток ацидофильных бактерий.

		В стерильную чашку Петри вносят 1 см3  соответствующего разведения исследуемого продукта и заливают охлажденной до 40-45С стерильной средой с гидролизованным молоком и мелом. Среду готовят в соотношении к 100 см3  гидролизованного молока 2% мела и агару. Сразу после заливки среды в чашку Петри, чашку тщательно перемешивают путем легкого вращательного покачивания для равномерного распределения посевного материала. после того, как среда застынет, чашки переворачивают крышками вниз и ставят в термостат с температурой 37С на 72 ч.

		е) Метод определения массовой доли жира, % по ГОСТ 58-67-69.

		В чистый молочный жиромер, наливают 10 см3  серной кислоты (=1811-1820кг/см3) и, осторожно, чтобы жидкости не смешивались, добавляют пипеткой 10,77 см3 молока. Затем добавляют 1 см3 изоамилового спирта. Жиромер закрывают пробкой, перемешивают и центрифугируют в течение 5 минут. После выдержки в водяной бане и центрифугирования, регулируя столбик жира движением резиновой пробки, производят отсчет жира. 

		ж) Метод определения кислотности.

		В коническую колбу вместимостью 150-200 см3, отмеривают пипеткой 10 см3 молока, прибавляют 20 см3 дистиллированной воды и три капли фенолфталеина. Смесь тщательно перемешивают и титруют раствором гидроокиси натрия (NaOH) до появления слабо-розового окрашивания, не исчезающего в течении одной минуты.

		Кислотность молока в градусах Тернера равна обьему NаОН , затраченному на нейтрализацию 10 см3 молока, умноженному на 10.

		з) Метод определения бифидобактерий.

		Сущность метода.

		Метод основан на способности бифидобактерий вырастать в питательных средах, разлитых высоким столбиком в пробирках, при температуре 37+1°С с образованием колоний в течение 2-5 суток.

		Проведение анализа.

		Перед употреблением среду для учета бифидобактерий следует разогреть в кипящей бане в течение 3-5 минут.

		При определении бифидобактерий в смешанных с молочнокислыми бактериями культурах перед расплавлением в среду вносят стерильный раствор неомицина. После расплавления пробирки охлаждают в водяной бане до температуры 45+2°С. Приготовляют ряд разведений продукта (до 9).

		Затем из трех-четырех последних разведений продукта в растворе хлористого натрия берут по 1 см3 и вносят 2 параллельные ряда пробирок со средой и тщательно перемешивают пипеткой, следя, чтобы в среду не попал воздух.

		Посевы выдерживают в термостате при температуре 37+2°С в течение 2-3 суток, в случае определения бифидобактерий в смешанных с молочно кислыми бактериями культурах- 3-5 суток.

		Обработка результатов. Подсчёт количества клеток бифидобактерий в 1г продукта производят путем умножения числа выросших колоний на соответствующие разведение. За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое результатов, полученных в двух параллельных посевах.

		Для определения истинного количества бифидобактерий в среде  с неомицином результат следует удвоить.

		

		

		

		

		

		

		

		

		

		

		

		

		

		

		

		

		

		

		

		

		Глава 3. Результаты исследования.

3.1. Микробиологические и физико-химические показатели молока, используемого для производства детских кисломолочных продуктов. (Бифилин-М, Ацидолакт, Бифилакт)

В качестве сырья для производства кисломолочных напитков МУЗ «Детская молочная кухня» г.Иркутска использует молоко сырое коровье, соответствующее ГОСТ Р 52054-2003, 1 сорта, с массовой долей жира 3.5%, поставляемое ОПХ  «Пивовариха». Сырое молоко анализируется по ряду параметров в соответствии с нормативной документацией (табл.3). Показатели заготовляемого молока приведены в таблице 4.

В целом, молоко, поставляемое ОПХ «Пивовариха» удовлетворяет ГОСТ. Отрицательный момент заключается в присутствии слабого кормового привкуса, что снижает вкусовые качества готового продукта.

                                                                                   

                                                                                                       Таблица 3.

Параметры оценки сырого молока .

Параметры

Нормативный документ

Органолептика

ГОСТ 28283-89

Наличие соды

ГОСТ 24065-80

Соматические клетки     

ГОСТ 23453-90

Чистота

ГОСТ 8218-89

Бактериальная обсемененность

ГОСТ 9225-84

Температура

ГОСТ 26754-85

Жир

ГОСТ 30648.1-99

Кислотность

ГОСТ 30648.4-99

Плотность

ГОСТ 3625-84









Таблица 4.

Показатели сырого молока, предназначенного для производства детских кисломолочных напитков.

Дата отбора проб

Показатели



Органолептика

Наличие соды

Кол-во соматич. Кл. в 1 см3

Чистота фильтра

Бактер. Обсемен.

tC

Жир %

Кисл-сть Т

Плотность г/см3

11.04.05

Кормовой привкус.

-

До 500 тыс.

1

1

10С

3.6

17

1027.

12.04.05

Кормовой привкус.

-

До 500 тыс.

1

1

9С

3.5

18

1027.0

13.04.05

Кормовой привкус.

-

До 500 тыс.

1

1

9С

3.5

17

1027.3

14.04.05

Кормовой привкус.

-

До 500 тыс.

1

1

10С

3.5

17

1027.0

15.04.05

Кормовой привкус.

-

До 500 тыс.

1

1

9С

3.5

17

1027.2

18.04.05

Кормовой привкус.

-

До 500 тыс.

1

1

9С

3.5

17

1027.6

19.04.05

Кормовой привкус.

-

До 500 тыс.

1

1

9С

3.5

16

1027.0

20.04.05

Кормовой привкус.

-

До 500 тыс.

1

1

9С

3.6

16

1026.6

21.04.05

Кормовой привкус.

-

До 500 тыс.

1

1

9С

3.5

17

1027.1

22.04.05

Кормовой привкус.

-

До 500 тыс.

1

1

9С

3.5

18

1027.0









3.2. Морфологические, тинкториальные и культуральные признаки микроорганизмов, используемых для приготовления Бифилина-М, Ацидолакта, Бифилакта.

  В качестве закваски для производства кисломолочного напитка «Бифилин-М» используется концентрат бифидобактерий жидкий, приготовленный из чистых культур бифидобактерий штамм В379М, который не подвергался генным модификациям (ТУ 9220-001-02069473-02). Поставки осуществляет ВСГТУ г.Улан-Удэ. Физико-химические и микробиологические показатели приведены в таблице 5. 

Таблица 5.

Физико-химические и микробиологические показатели бактериального концентрата бифидобактерий, используемые для производства Бифилина-М.

Энергия кисло—тообразования

(в час.)

Объём молока на 1 порцию бак.концентрат. (в литрах)

Количество клеток (К.О.Е.) в 1 см3 готового продукта.

Температура сквашивания С

10

200

1*1011

37+2С.



Микроскопия закваски показала наличие Гр+ слегка изогнутых и прямых тонких палочек, неподвижных, отдельных и в цепочках.(рис.4)

















Рис.4. Микроскопический препарат закваски для приготовления Бифилина-М.

В качестве закваски для производства кисломолочного напитка «Ацидолакт» используются молочнокислые бактерии вида str.thermophilus и L.acidophilus. Бактериальные закваски поставляются ГУП «ВНИМИ-Сибирь» РАСХ г. Омска. Физико-химическая и микробиологическая характеристика бак.препаратов приведены в таблице 6.

Таблица 6.

Физико-химические и микробиологические показатели бактериальных заквасок для производства «Ацидолакта». 

Вид бак. закваски

ТУ

Продолжит-сть восстановления сухой закваски  (час.)

Энергия кислотообразования вторичной закваски (час.)

Количество К.О.Е. в 1г. Бак. препарата.

Термофильный Стрептококк  вязкий.

ТУ 10-02-02-789-65-91.

20

6

1.1*109

Палочка Ацидофильная, вязкая.

ТУ 10-02-02-789-65-91.

20

8

1.1*109



Микроскопия закваски str.thermophilus показала наличие кокков, собранных в цепочки разной длины.(рис.5)

Микроскопия закваски L.acidophilus показала наличие клеток Гр+, палочковиднои формы. Палочки прямые, крупные, одиночные и в цепочках. (рис.6)



















Рис.5. Микроскопический препарат Str.termophilus, используемый для производства «Ацидолакта».















Рис.6. Микроскопический препарат L.acidophilus, используемый для производства «Ацидолакта».



          Микроскопия производственной закваски, полученной путём восстановления бактериального концентрата бифидобактерий и восстановления сухих заквасок str.thermophilus и L.acidophilus на стерилизованном молоке показала ту же микроскопическую картину, что и в сухих заквасках.

Кроме микрокопирования закваски исследовались на присутствие бактерий группы кишечной палочки, характер сгустка, органолептику. Результаты приведены в таблице 7.







Таблица 7.

Санитарно-гигеинические и органолептические показатели заквасок для производства Бифилина-М и Ацидолакта.

Название закваски и количество исследований проб.

БГКП

Сгусток

Органические показатели



B.longum (10)



-

Нежный, колющийся.

Вкус кислый

L.acidophilus (10)

-

Плотный, колющийся, однородный (иногда небольшое отделение сыворотки)

Вкус резкий (острый)

str.thermophilus (10)

-



Плотный, консистенция вязкая.



Вкус кислый, мягкий.



Для производства кисломолочного напитка Бифилакт используются те же закваски, что и для производства Ацидолакта, Бифилина-М, т.е. B.longum, Str.thermophilus, L.acidophilus. Картина исследования та же.

Результаты исследования заквасок (сухих и восстановленных) для приготовления кисломолочных напитков Бифилин-М, Ацидолакт, Бифилакт показали полное соответствие требованиям, предъявляемым к закваскам для производства кисломолочных продуктов для детского лечебно-профилактического питания.





3.3. Микробиологические и физико-химические показатели готовых продуктов Бифилина-М, Ацидолакт, Бифилакт.

Исследование молочнокислых готовых продуктов для детского питания Бифилин-М, Ацидолакт, Бифилакт проводилось по следующей схеме (рис.7).



Определение жира (%).

Определение кислотности.

Микроскопия

Определение количества бифидобактерий (для «Бифилин-М» «Бифилакт».

Определение количества молочнокислых бактерий (для «Ацидолакт», «Бифилакт»).

Проверка наличия БГКП.

Готовый продукт.

Органолептические показатели.



































Рис.7. Схема исследования готовых кисломолочных продуктов «Бифилин-М», «Ацидолакт», «Бифилакт».







		Исследование микробиологические и физико-химические характеристики готовых реализации кисломолочных напитков Бифилин-М, Ацидолакт, Бифилакт. Результаты исследования напитков отражены в таблицах 8,9,10.

	

	

	

	

	

	Таблица 8.

	Физико-химические и микробиологические показатели кисломолочного напитка «Бифилин-М».

	Дата реализации

	Жирность %

	Кислотность оТ

	БГКП

	Количество бифидобактерий в 1 см3.

11.04.05

	3.5

	50

	-

	

12.04.05

3.5

	53

	-

	

13.04.05

3.5

	50

	-

	109

14.04.05

3.5

	50

	-

	

15.04.05

3.5

	48

	-

	

18.04.05

3.5

	46

	-

	

19.04.05

	3.4

	48

	-

	

20.04.05

3.5

	50

	-

	109

21.04.05

3.5

	51

	-

	

22.04.05

3.5

	50

	-

	

	

	Кислотность продукта Бифилин-М ниже нормы (75-900Т), что, однако не ухудшает его вкусовых качеств. Массовая доля жира выше установленной техническими условиями (3.3%), что происходит из-за того, что продукт готовится на основе цельного, не нормализованного молока. По своему бактериальному составу (количество бифидобактерий, отсутствие БГКП) готовый продукт соответствует требованиям микробиологического контроля.

	Микроскопия препарата готового к реализации Бифилина-М показывает наличие Гр+ тонких, прямых и слегка изогнутых палочек, (это характерно для бифидобактерий; в данном случае форма меняется в зависимости от качества молока).

	Вкус нежный, кисломолочный, консистенция нежная, сгусток нарушенный, т.к. продукт перед разливом перемешивается.

	

	

	

	Таблица 9.

	Физико-химические и микробиологические показатели готового к реализации кисломолочного напитка « Ацидолакт».

	Дата реализации

	Жирность %

	Кислотность 0Т

	БГКП

	Количество молочнокислых бактерий в 1 см3.

11.04.05

	3.5

	49

	-

	

12.04.05

3.5

	52

	-

	

13.04.05

3.5

	53

	-

	

14.04.05

3.5

	51

	-

	

15.04.05

3.5

	52

	-

	108

18.04.05

3.5

	52

	-

	

19.04.05

	3.4

	58

	-

	

20.04.05

3.5

	49

	-

	1010

21.04.05

3.5

	50

	-

	

22.04.05

3.5

	52

	-

	

	

	Кислотность готового продукта Ацидолакт ниже рекомендуемой       (65 0Т-70 0Т). Жир выше установленного. Количество молочнокислых бактерий в 1 см3 готового продукта и отсутствие посторонней микрофлоры соответствует норме.

	Микроскопический препарат кисломолочного напитка Ацидолакт показывает наличие Гр+ прямых неподвижных палочек и цепочек кокков.

	Вкус продукта мягкий кисломолочный, характерный. Консистенция вязкая, сгусток нарушенный.

	

	

	

	Таблица 10.

	Физико-химические и микробиологические показатели готового к реализации кисломолочного напитка «Бифилакт».

	Дата реализации

	Жирность %

	Кислотность 0Т

	БГКП

	Количество молочнокислых бактерий в 1 см3.

	Количество бифидобактерий

11.04.05

3.5

	57

	-

	

	

12.04.05

3.5

	61

	-

	

	

13.04.05

3.5

	56

	-

	

	

14.04.05

3.5

	61

	-

	109

	-

15.04.05

3.5

	56

	-

	

	

	16.04.05

3.5

	56

	-

	

	

	17.04.05

3.5

	50

	-

	

	

18.04.05

3.5

	58

	-

	

	

19.04.05

	3.4

	68

	-

	108

	104

20.04.05

3.5

	61

	-

	

	

21.04.05

3.5

	56

	-

	

	

22.04.05

3.5

	58

	-

	

	

	

	Кислотность готового продукта Бифилакт ниже рекомендуемой (700Т). Жир выше, чем установлено (3.2%). Количество молочнокислых бактерий и отсутствие посторонней микрофлоры соответствует норме.

	Следует отметить очень небольшое количество, либо полное отсутствие бифидобактерий в продукте, что нарушает ТУ. Данное обстоятельство следует связать с нарушением технологического процесса или антагонистическим воздействием ацидофильной палочки на бифидобактерии.

	Микроскопический препарат напитка Бифилакт показывает наличие Гр+ прямых палочек, и кокковидных клеток, соединённых в цепочки.

	Вкус продукта лёгкий кисломолочный. Консистенция вязкая, сгусток нарушенный.

	

	

	

	

	

	

	

	

	

	

	

	

	

	

	

	

	

	

	

	

	

	

	

	

	

	

	Выводы.

	1. Молоко поставляемое ОПХ «Пивовариха», на МУЗ «Детская молочная кухня» соответствует требованиям, предъявляемым к сырью для производства детских кисломолочных продуктов, за исключением органолептического показателя: у молока имеется слабый кормовой привкус.

	2. Восстановленные закваски для приготовления кисломолочных напитков «Бифилин-М», «Ацидолакт», «Бифилакт» полностью соответствуют требованиям инструкции по приготовлению и применению заквасок для кисломолочных продуктов на предприятиях молочной промышленности. (М.81)

	3. Микрофлора напитка «Бифилин-М» соответствует ТУ 10-02-02-789-202-95 по приготовлению лечебно-профилактического бифидопродукта «Бифилин-М».

	 Микрофлора напитка «Ацидолакт» соответствует ОСТ 10-194-96.

	Микрофлора напитка «Бифилакт» не соответствует ТУ БГ-003-00-98: количество бифидобактерий значительно ниже нормы. 

	

	Рекомендации.

	1) Так как технология обработки сырого молока в условиях детской молочной кухни не позволяет устранить кормовой привкус, а обращение непосредственно к руководителям ОПХ «Пивовариха» и в городскую администрацию результатов не принесли, предлагаю пересмотреть пункты договора о поставке сырья и заключить соглашение еще с одним хозяйством на приемку молока : в качестве запасного варианта или полной замены поставщика.

	2) Для соблюдения всех стадий процесса производства «Бифилакта», считаю необходимым увеличение персонала (не одна, а две санитарки), чтобы работники имели возможность вовремя подготовить оборудование к приемке молока.     

	

Литература.



1. Абрамова-Оболенская Н.И., Прохорова И.И. и др. Коррекционная активность ацидофильных лактобактерий при дисбактериозах кишечника у рабочих молочной промышленности и производства антибиотиков.// в кн. Антибиотики и колонизационная резистентность. М., 1990, в.ХΙХ. с.160-166.

2. Андросова Н.Л., Никонова Н.К., Барышенкова Е.П. Разработка новых видов кисломолочных продуктов для детского питания.// Мат. 1-го Всерос. Конгресса «Питание детей ХХΙ век ». М.,2000, с.143.

3. Бойцов А.Г., Лифляндский В.Г. Как победить дисбактериоз у детей и взрослых. М., изд. Олма-Пресс, 2002.

4. Бочков И.А. Особенности формирования аутомикрофлоры у новорожденных детей в раннем неонатальном периоде. Дисс. докт. мед. наук. М., 1998.

5. Гончарова Г.И. Бифидофлора человека и необходимость ее оптимизации.- В кн. Бифидобактерии и их использование в клинике, медицинской промышленности и сельском хозяйстве. ( ред. Никитин ). М., 1986. с 10-17.

6.  Груздева Т.А. Бифидосодержащие биологически активные добавки к детскому питанию и состояние микрофлоры при их применении / Автореф. дисс. канд. биол. наук. М., 1990.

7. Зимина В.С. и др. Технология приготовления кисломолочных продуктов лечебного питания на основе комплексных заквасок из лакто- и бифидобактерий. М., 1986. 

8. Коршунов В.М. Проблема регуляции микрофлоры кишечника  //    Ж. микробиол. 1995. №3  с. 48-53 .

9. Кузнецова Г.Г. К оценке эффективности коррекции дисбактериозов.// Тез.конф. «Дисбактериозы и эубиотики». М., 26-28 марта 1996. с.17.

10. Ладодо К.С., Боровик Т.Э., Рославцева Е.А. Использование продуктов-пробиотиков в лечебном питании детей // Мат. Всерос. конференции «Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека». М., 21-23 апреля 1999. с. 56-57.

11. Лихачева А.Ю., Бондаренко В.М. Современное состояние вопроса о номенклатуре и таксономии бактерий рода Lactobacillus // Тез.конф. «Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека». М., 21-23 апреля 1999. с.30-31.

12. Лыкова Е.А., Бондаренко В.М., Изачик Ю.А. и др. Коррекция пробиотиками микроэкологических и иммунных нарушений при гастродуоденальной патологии у детей // Ж. Микробиол. 1996. №2. с.88-91.

13. Лянная А.М., Интизаров М.М., Донских Е.Е. Биологические и экологические особенности рода Bifidobacterium.- В кн.: Бифидобактерии и их использование в клинике, медицинской промышленности и сельском хозяйстве (ред. Никитин). М.,1986. С.32-38.

14. Манвелова М.А., Турсункулова С.Ф., Саранцев А.Н. и др. Оценка эффективности бифидосодержащего продукта БИВИТ в комплексной терапии.// Тез.конф.  «Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека». М., 21-23 апреля 1999. С.32.

15. Манвелова М.А., Плясунова Н.Г., Чешева В.В. Лечебно-диетические кисломолочные продукты питания.- В кн.: Медицинские аспекты микробной экологии (ред. Б.А.Шендеров). М.,1992. т.6. С. 17-20.

16. Молокеев А.В., Криницина Э.В., Ильина Р.М. Рецептуростроение комплексных эубиотиков, адекватных возрастному микробиоценозу человека.// Тез.конф. «Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека». М., 21-23 апреля 1999. С. 34-35.

17. Мурашева А.О., Новокшонов А.А., Учайкин И.Ф. Эффективность бифидокефира для лечения острых кишечных инфекций и коррекции дисбиоза у детей. // Ж. Микробиол. 1994 №6 С.108-110.

18. Поспелова В.В., Шабанская М.А., Морозова Л.В. Биологическая характеристика некоторых производственных и свежевыделенных штаммов лактобацилл.- В кн. Медицинские аспекты микробной экологии (ред.Шендеров Б.А.).М., 1992. Вып.6. С.54-57.

19. Поспелова В.В., Манвелова М.А., РахимоваН.Г. и др. Ацидофильные лактобактерии и их значение в системе средств, регулирующих бактериоценоз. – В кн.: Медицинские аспекты микробной экологии (ред. Шендеров Б.А.). М., 1991. С. 175-182.

20. Рахимова Н.Г., Ханина Г.И. и др. Биопрепараты, нормализующие микрофлору кишечника: итоги двадцатилетних исследований по проблеме.- В кн.: Антибиотики и колонизационная резистентность.(ред. Шендеров).М., 1990.

21. Тимакова Г.А. Кисломолочные продукты в структуре детского питания // Мат. Всерос.конференции «Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека». М., 21-23 апреля 1999 . С. 52-53.

22. Тюрин М.В. Антибиотикорезистентность и антагонистическая активность лактобацилл // Дисс.канд.мед.наук. М., 1990. 146с.

23) Учайкин В.Ф., Новокшонов А.А., Соколова Н.В. Современные подходы к лечению острых кишечных инфекций у детей // Педиатрия, 1996. №3. С. 49-54.

24. Шаманова Г.П. и др. Способ получения сухого кисломолочного продукта.//Авт. Свид. № 1285644. С.1986.

25. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание.Т.1. М., Изд. Грантъ, 1998.

26. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание.Т.2. М., Изд. Грантъ, 1998.

27. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание.Т.3. М., Изд. Грантъ, 1998.

28. Питание детей грудного и раннего возраста . Сборник статей. М., ООО «Нью Информ». 2002.

29. Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов. СанПин 2.3.2560-96.- М., Госсанэпиднормирование РФ, 1997.

30. ГОСТ 9225-84. Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа.

31. Инструкция по микробиологическому контролю производства на предприятиях молочной промышленности.- М.: Госагропром СССР, 1988.

32. Производство молока и молочных продуктов. Санитарные правила и нормы.- М.: Госкомсанэпиднадзор России, 1996.

33. Технологическая инструкция по приготовлению продуктов на молочных кухнях и специализированных участках. Министерство здравоохранения РФ. М., 1998.

34. ТУ 10-02-02-789-202-95 по приготовлению лечебно-профилактического кисломолочного продукта «Бифилин-М».

35. ТУ БГ-003- 00-98 по приготовлению лечебно-профилактического кисломолочного продукта «Бифилакт».

36. ОСТ 10-194-96 по приготовлению лечебно-профилактического кисломолочного продукта «Ацидолакт».

37. Bibiloni R. et al An enzymatic-colorimetric assay for the quantification of Bifidobacterium // J. Food protection, 2000, №3 322-326.

38. Kabir A.M. et al. Prevention of Helicobacter pylori infection by lactobacilli in a gnotobiotic murine model // Gut, 1997, v.41, 49-55.

39. Klebanoff S.J., R.W.Coombs. Viricidal effect of Lactobacillus acidophilus on human immunodeficiency virus type 1 : possible role in heterosexual transmission // J. Exp. Med. 1991, v.174, №1, 289-292.

40. Rolfe R.D. The role of probiotic cultures in the control of gastrointestinal health.// J. Nutrition, 2000,v.130, (2S Suppl), 396-402 .

41. Saxelin M., Ahokas M., S.Salminen. Dose Response of the faecal Colonisation of Lactobacillus Strain GG administered in two different Formulations // Micrib. Ecol. Health. Dis., 1993, v.6, 119-122.

42. Tannock G.W. Identification of lactobacilli and bifidobacteria // In : Probiotics : a critical review (ed Tannock ), Wymondham ( United Kingdom), Horizont Scientific press., 1999, 45-56.