Развитие генной инженерии

Министерство сельского хозяйства

Российской федерации

Федеральное государственное образовательное учреждение

Высшего профессионального образования

«АЛТАЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»







Контрольная работа

Студента

По специальности

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ











Выполнил студент 



Проверил(а) 











Барнаул 2009


Вопрос № 1. Ферменты генетической инженерии



Ферменты генетической инженерии – это ферменты, позволяющие проводить различные манипуляции с молекулами ДНК: разрезать в определенных местах, соединять различные по происхождению фрагменты, синтезировать новые, не существующие в природе последовательности, и т.д. Рассмотрим основные ферменты генетической инженерии.

ДНК-полимеразы. Одним из наиболее часто используемых в генетической инженерии ферментов является ДНК-полимераза Ī, выделенная из E.coli или фага Т4. ДНК-полимераза Ī обладает способностью удлинять цепь ДНК в направлении 5́→ 3  ́ путем присоединения комплементарного нуклеотида. Это свойство ДНК-полимераз используется в генной инженерии для построения второй комплементарной цепи: при добавлении фермента к одноцепочной ДНК-матрице в присутствии праймера произойдет ее удвоение. Это свойство используется, например, при создании Кднк-библиотек. ДНК-полимераза применяется также для заполнения «бреши» в цепи ДНК, например, при застраивании фрагментов с выступающими 5 ́- концами. экзонуклеазная активность ДНК-полимераз используется для введения радиоактивной метки во фрагмент ДНК.

Использование специфических термостабильных ДНК-полимераз – Tth- и Taq- полимераз – выделенных из бактерий, живущих в гейзерах, позволило проводить амплификацию – множественную наработку любого фрагмента ДНК методомполимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод ПЦР, в основу которого положена Taq-полимераза, не только упростил некоторые старые методики генной инженерии, но и позволил проводить молекулярное маркирование как отдельных генов, так и целых геномов.

Из некоторых вирусов была выделена специфическая ДНК-полимераза – РНК-зависимая ДНК-полимераза, названная обратнгой транскриптазой, или ревертазой. Ревертазы могут синтезировать комплементарную цепь ДНК на РНК-матрице. С помощью ревертаз можно получать кДНК-ДНК-копии мРНК. кДНК  позволяют изучать строение генов и идентифицировать полноценные копии этих генов в геноме. 

ДНК-лигаза осуществляет одну функцию – соединение фрагментов ДНК путем восстановления фосфодиэфирных связей между соединениями нуклеотидами. Этот процесс называется лигированием. Наиболее часто для лигирования в генной инженерии используют ДНК-лигазу фага Т4. с помощью лигазы Т4 соединяют любые фрагменты ДНК с любыми концами: «липкими» или «тупыми». Это один из наиболее часто использующихся ферментов.

Нуклеазы – это большая группа ферментов, катализирующих реакцию гидролиза молекул нуклеиновых кислот. В результате действия нуклеаз молекула ДНК или РНК распадается на фрагменты или отдельные нуклеотиды. Исходная функция нуклеаз в клетке – деградация ненужных в данный момент жизнедеятельности молекул (например, деградация мРНК после трансляции) и защита от чужеродных молекул нуклеиновых кислот (расщепление фаговой ДНК бактериальными нуклеазами при заражении бактерии фагом).

Нуклеазы по типу их действия можно поделить на группы. Нуклеазы могут  действовать только на молекулы и ДНК, и РНК одновременно (нуклеаза золотистой фасоли). Нуклеазы избирательно могут действовать на одноцепочечную (нуклеаза S1), или двуцепочечную  (экзонуклеаза ĪĪĪ) молекулы ДНК , или на гибридную ДНК – РНК-молекулу (рибонуклеаза Н). 

Кроме того, нуклеазы можно разделить на два типа: на экзонуклеазы и эндонуклеазы.  Экзонуклеазы обычно гидролизуют молекулы с 5 ́- или 3 ́- свободных концов, а эндонуклеазы могут расщеплять внутри последовательности фрагмента или кольцевой молекулы ДНК. 

Рестриктазы. Отдельную группу, особенно с утилитарной точки зрения ее применения в генной инжененрии, представляют специфические эндонуклеазы – рестриктазы.

В основе метода, позволившего непосредственно приступить к манипуляциям с генами, лежит открытие ферментов, названных рестрикционными эндонуклеазами (рестриктазами). Еще в 1953г. было обнаружено, что ДНК определенного штамма E. Coli, введенная в клетки другого штамма (например, ДНК штамма В в клетки штамма С), не проявляет, как правило, генетической активности, так как быстро расщепляется на фрагменты ДНК-специфическими ферментами – рестриктазами. К настоящему времени из разных микроорганизмов выделено более тысячи различных рестриктаз. В генетической инженерии наиболее широко используются коло 200.

Рестриктазы предщставляют собой особый класс эндонуклеаз, которые гидролизуют ДНК строго по определенным специфическим последовательностям, называются сайтами рестрикции.каждая из рестриктаз узнает свой свой сайт рестрикции и разрезает ДНК либо внутри последовательности сайта рестрикции, либо в непосредственной близости от него. Таким образом, при действии конкретной рестриктазы одна и та же последовательность ДНК будет всегда образовывать одинаковый набор фрагментов. Обозначение рестриктаз складывается из начальных букв латинского названия вида бактерий, из которого был выделен фермент, и дополнительного обозначения, так как из бактерий одного вида может быть выделено несколько различных рестриктаз: Eschrichia coli – EcoR I. EcoRV. Haemophilus influenzae – Hinf I. Streptomices albus – Sal I. Thermus aquaticus – Taq I.

Рестриктазы делятся на несколько типов по характеру расщепления нуклеотидной последовательности. Рестриктазы Ī ТИПА УЗНАЮТ САЙТ РЕСТРИКЦИИ, НО РАСЩЕПЛЯЮТ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ДНК на произвольном расстоянии (от нскольких десятков до нескольких тысяч пар нуклеотидов) от сайта узнавания. Такие рестриктазы невозможно использовать для решения генно-инженерных задач. Рестриктазы ĪĪĪ типа похожи на рестриктазы  Ī типа, они гидролизуют ДНК на на рвсстоянии 20 – 35 н.п. от сайтов узнавания и также довольно редко используются в практических целях.

Ферменты, используемые для получения рекомбинантных молекул, - рестриктазы ĪĪ типа. Основной характеристикой таких рестриктаз является то, что у них сайты узнавания и места рестрикции совпадают. Обычно рестриктаза ĪĪ типа узнает определенную последовательность на ДНК и гидролизует ее внутри последовательности сайта рестрикции. Сайты рестрикции рестриктаз ĪĪ типа представлены симметричными при поаороте на 180 градусов последовательностями – палиндромами:

5 GAATTC 3

3 CTTAAG 5 сайт рестрикции рестриктазы EcoR Ī  

5 TAGA 3

3 ATCT 5 сайт рестрикции рестриктазы Taq Ī

Рестриктазы ĪĪ типа делятся на несколько классов в зависимости от раразмера сайта рестрикции и длины получаемых фрагментов ДНК:

	мелкощепящие – сайт рестрикции которых представлен четырьмя нуклеотидными парами;

среднещепящие – сайт рестрикции – 6 – 8 н.п.;

крупнощепящие – сайт рестрикции – 10 – 14 н.п.

Рестриктазы ĪĪ типа можно отнести к двум группам по тому , как они расщепляют последовательность ДНК. Одни вносят разрывы по оси симметрии узнаваемой последовательности, а другие – со сдвигом, с образованием «ступеньки». В первом случае образуются так называемые «тупые» концы, а во втором – «липкие»,т.е. фрагменты имеют на своих концах однонитевые взаимно комплементарные участки.

Образование при расщеплении рестриктазами фрагментов с «липкими» концами:



5 G ↓ AATTC 3         5 C ↓ CGG 3

EcoR Ī 3 CTTAA ↑ G 5 Hpa ĪĪ 3 GGC ↑ C 5

Образование при расщеплении рестриктазами фрагментов с «тупыми» концами:



TA ↓ GA 3            5 GTT ↓ AAC 3

Taq Ī 3 AT ↑ CT 5 Hinc Ī 3 CAA ↑ TTG 5 



Фрагменты ДНК,имеющие одинаковые «липкие» концы, могут соединяться друг с другом с помощью ДНК-лигазы, при этом сайт рестрикции восстанавливается. Фрагменты с «липкими» концами более удобны для создания рекомбинантных ДНК, так как ДНК-лигаза обеспечивает беспрепятственное соединение фрагментов.

Ферментативная активность рестриктаз измеряется в единицах активности. Это такое количество фермента, которое необходимо для полного гидролиза за один час 1 мкг ДНК фага λ при оптимальных условиях. оптимальные условия рестрикции для каждой рестриктазы являются индивидуальными и зависят от рН, ионной силы, присутствия определенных ионов, температуры проведения реакции. Рестриктазы являются основными ферментами, используемыми в генетической инженерии.



Вопрос № 2. Методы получения химер



Успешна пересадка эмбрионов может быть осуществленатолько между самками одного вида. Пересадка эмбрионов, например, овцам и козам и наоборот сопровождается их приживляемостью, но не завершается рождением потомства. Во всех случаях межвидовых беременностей непосредственной причиной абортов является нарушение функции плаценты, по-видимому, за счет иммунологической реакции материнского организма на инородные антигены плода. Эта несовместимость может быть преодолена получением химерных эмбрионов с помощью микрохирургии..

Сначала были получены химерные животные путем объединения бластомеров из эмбрионов одного вида. С этой целью получали сложные химерные эмбрионы овец объединением 2-, 4-, 8-клеточных эмбрионов. Каждый сложный объединенный эмбрион состоял из равного числа бластомеров эмбрионов от 2 – 8 родителей. При этом общее число клеток колебалось от четырех- до восьмикратного увеличения нормального числа клеток. Эмбрионы вводили в агар и переносили в лигатированные яйцеводы овец для развития до стадии ранней бластоцисты. Нормально развивающиеся бластоцисты пересаживали реципиентам и получили живых ягнят, большинство из которых оказались химерными по данным анализа крови и внешним признакам.

Получены химерные овцы путем инъекции внутренней клеточной массы, выделенной иммунохирургическим путем из эмбрионов доноров в бластоцисты эмбрионов реципиентов. Зону пеллюциду у бластоцист доноров удаляли инкубированием  в 0,5%-ной проназе и пептированием.

Для восстановления их функции после обработки проназой эмбрионы культивировали в течение 3 ч. Затем эмбрионы без прозрачной оболочки культивировали в течение 1 ч в антисыворотке к клеткам печени овцы, три раза отмывали и помещали в раствор (1:4) сыворотки крови морской свинки на 1 ч. Лизированные клетки трофобласта удаляли пипетированием, а изолированную внутреннюю клеточную массу вводили проколом инъекционной пипетки через зону пеллюциду в трофобласт бластоцисты реципиента. После пересадки этих бластоцист получены химерные ягнята как по рпизнакам групп крови, так и повнешним признакам.

Получены химеры и у крупного рогатого скота (Г. Брем и др., 1985) соединением половинок 5 – 6,5-дневных эмбрионов. Пять из семи телят, полученных после нехирургической пересадки агрегированных эмбрионов, не имели признаков химеризма. Один теленок был химерой двух пород – бурой швицкой и голштинофризской. Однако масть бурой швицкой породы доминировала. Анализ крови этого теленка показал присутствие групп крови только от родителей голштинофризской породы. Другой теленок был химерой неопределенного происхождения.

Показана высокая эффективность получения химер крупного рогатого скота объединением морул без зоны пеллюциды. Авторы получили химеры крупного рогатого скота с «двойной мускулатурой». В этих исследованиях показано, что передача химерам родительского типа имеет случайный характер, т.е. потомство может развиваться из клеток, происходящих или от любого эмбриона, или от сочетания эмбрионов. Половина всех химер представляет собой интерес. 

Наиболее показательно получение химер от объединенных частей эмбрионов разных видов, например, овцы и козы.

Исследования С.В. Фехилли и др. (1984) показали, что  бластомеры овцы и козы, заключенные в агар и помещенные на 4 – 5 сут в лигатированный яйцевод овцы, могут формировать комбинированные бластоцисты. Эти бластоцисты жизнеспособны и могут развиваться до рождения нормального потомства. В первом опыте в результате объединения по одному бластомеру из 4-клеточных эмбрионов овцы и козы получено 17 бластоцист, пересадка которых завершилась получением семи потомков. Все потомки были похожи в основном на ягнят, но у трех из них руно имело поперечные валики и лоскуты волос, резко контрастирующие с плотно вьющейся шерстью. 

химеры фермент нуклеаз

Вопрос № 3. Выписать и дать объяснения терминам встретившимся при написании контрольной работы



Бактериофаги (фаги) – вирусы, инфицирующие бактерии.

Библиотека генома – набор клонированных фрагментов ДНК, содержащий весь геном. 

Брешь (пробел) в ДНК – отсутствие одного или нескольких нуклеотидов в цепи ДНК.

Гаплоид – ядро, клетка, организм, характеризующиеся одинарным набором хромосом, представляющим половину полного набора, свойственного данному виду организмов (символ n).

Ген – единичная структура генетической информации, участок хромосомы (молекулы ДНК), кодирующий структуру одной или нескольких полипептидных цепей, или молекул РНК, или определенную регуляторную функцию.

Генная инженерия – совокупность приемов, методов и технологий, в том числе технологий получения рекомбинантных рибонуклеиновых и дезоксирибонуклеиновых кислот, по выделению генов из организма, осуществлению манипуляций с ними и введению их в другие организмы.

Диплоид  - ядро, клетка, организм, характеризующиеся двойным набором гомологичных хромосом, представленных числом, характерным для данного вида (символ 2n).

ДНК – молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты, состоящей из нуклеотидов (аденин, гуанин, цитозин, тимин), дезоксирибозы и остатков фосфорной кислоты.

Комплементарная цепь – одна из цепей ДНК, используемая в качестве матрицы для синтеза РНК и соответствующая ей по взаимодействию пар нуклеотидов.

Лигирование – образование фосфодиэфирной связи между двумя основаниями одной цепи ДНК, разделенным разрывом. Этот термин употребляют также в случае соединения тупых концов и при образовании связи в РНК.

Липкий конец – свободный одноцепочечный конец двуцепочечной ДНК,комплементарной одноцепочечному концу, принадлежащему этой же или другой молекуле ДНК.

Промотор – участок гена, ответственный за начало его транскрипции.

РНК – молекула рибонуклеиновой кислоты, в состав которой входят нуклеотиды (аденин, гуанин, цитозин, урацил), рибоза и остатки фосфорной кислоты.

Самка – реципиент – самка в половые пути которой вводятся яйцеклетки или эмбрионы для дальнейшего вынашивания (синонимы: приемная мать, ложнобеременная самка).

Хромосомы  - генетические структурные образования ядра клетки, состоящие  из ДНК и белков. В хромосомах заключена наследственная информация организма.

АТТ – Сайты – участки фаговой и бактериальной хромосом, рекомбинация между которыми приводит к интеграции или исключению фага.

СААТ – участок консервативной последовательности, расположенный примерно на расстоянии 75 пар оснований перед стартовой точкой в транскрипционных единицах эукариот.

G-Белки – регуляторные белки, активирующие фермент, синтезирующий вторичный посредник.


СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ



В.С. Шевелуха, Е.А. Калашникова, Е.С. Веронин «СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ» - М.: высш. Шк., 2003 год.







2