กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกน

กล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกน (อังกฤษ: Confocal laser scanning microscope ; Confocal laser scanning microscopy ; CLSM ; LSCM) เป็นกล้องจุลทรรน์แบบโฟกัสร่วมที่ใช้สำหรับงานที่ต้องการภาพความละเอียดสูงและสามารถเลือกชั้นความลึกที่ต้องการเก็บภาพ ซึ่งคุณสมบัติหลักของกล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกนคือ มันมีความสามารถที่จะเก็บภาพเฉพาะบริเวณจุดโฟกัสโดยสามารถเลือกระดับความลึกได้ ซึ่งกระบวนการนี้เรียกว่า การตัดด้วยแสง (อังกฤษ: optical sectioning) การบันทึกภาพของกล้องชนิดนี้เป็นการเก็บสัญญาณแสงจากจุดโฟกัสทีละจุดแล้วนำสัญญาณทั้งหมดมาสร้างเป็นภาพด้วยเครื่องคอมพิวเตอร์ ด้วยกระบวนการดังกล่าวทำให้สามารถสร้างภาพ 3 มิติ ของวัตถุที่ซับซ้อนขึ้นมาได้ โดยสำหรับวัตถุทึบแสงสามารถใช้กล้องชนิดนี้ศึกษาลักษณะของพื้นผิวใด้ ในกรณีที่เป็นวัตถุโปร่งแสงเราสามารถถ่ายภาพโครงสร้างภายในของวัตถุได้โดยใช้กล้องชนิดนี้ ซึ่งภาพที่ได้จะมีคุณภาพดีกว่าใช้กล้องทั่วไป เพราะภาพที่ได้จากระดับวามลึกที่เราต้องการนั้นจะไม่ถูกซ้อนทับโดยภาพที่ระดับความลึกอื่น ในขณะที่ภาพที่ได้จากกล้องจุลทรรศน์แบบธรรมดาจะเป็นภาพของแสงสะท้อนทั้งหมดจากทุกชั้นความลึกที่แสงสามารถทะลุผ่านลงไปได้ หลักการของการถ่ายภาพแบบคอลโฟคอลนั้นได้การจดสิทธิบัตรโดย Marvin Minsky ในปี ค.ศ. 1957 แต่การพัฒนาการของการใช้แสงเลเซอร์นั้นใช้เวลาอีก 30 ปี จึงสามารถนำมาใช้กับกล้องจุลทรรศน์แบบคอลโฟคอล จนกระทั่งในปี ค.ศ. 1980 กล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกนได้กลายเป็นเทคนิคอีกชนิดหนึ่งที่ได้รับความนิยม โดยในปี ค.ศ. 1978 นั้น Thomas Cremer และ Christoph Cremer ได้ออกแบบกระบวนการใช้แสงเลเซอร์ในการสแกนแบบทีละจุดโดยใช้จุดโฟกัสของลำแสงเลเซอร์เพื่อให้ได้ภาพ 3 มิติ โดยกล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมที่ใช้แสงเลเซอร์ในการสแกนและใช้ตัวรับแสงเพื่อสร้างภาพ 3 มิติ ตัวแรกที่ถูกออกแบบนั้นได้ถูกใช้สำหรับถ่ายภาพวัตถุทางชีววิทยาซึ่งถูกเคลือบสารฟลูออเรสเซ็นต์ ในทศวรรตต่อมากล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมทำงานด้วยแสงฟลูออเรสเซ็นได้ถูกพัฒนาอย่างจริงจังโดยกลุ่มนักวิจัย University of Amsterdam และ European Molecular Biology Laboratory (EMBL) และ องกรณ์ซึ่งเป็นหุ้นส่วนทางธุรกิจ การเกิดภาพของกล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกนเริ่มต้นจากลำแสงเลเซอร์ผ่านช่องของแล่งกำเนิดแสงแบบจุดและถูกโฟกัสด้วยเลนส์วัตถุเป็นปริมาตรของจุดโฟกัส (focal volume) ภายในหรือบนพื้นผิวของชิ้นเนื้อตัวอย่าง แสงสะท้อนจากวัตถุถูกสะท้อนกลับมายังเลนส์วัตถุอีกครั้งโดยแสงสะท้อนนี้มีความยาวคลื่นแตกต่างจากแสงที่มาจากแหล่งกำเนิดแสงแบบจุด เมื่อแสงสะท้อนเดินทางมาถึงตัวแยกแสง (beam slitter) โดยตัวแยกแสงนี้มีคุณสมบัติคือจะยอมให้แสงความยาวคลื่นหนึ่งผ่านไปได้แต่จะสะท้อนแสงอีกความยาวคลื่นหนึ่ง โดยแสงที่สามารถผ่านไปได้จะเป็นแสงจากแหล่งกำเนิดแสงแต่แสงที่สะท้อนมาจากวัตถุจะถูกสะท้อนอีกครั้งหนึ่งเพื่อผ่านไปยังรูขนาดเล็กด้านตัวรับแสง ซึ่งรูขนาดเล็กนี้จะทำการกำจัดแสงที่ไม่ได้มาจากจุดโฟกัสทำให้ได้ภาพที่คมชัดกว่ากล้องจุลทรรศน์แบบปกติ และสามารถเก็บภาพเฉพาะชั้นความลึกที่ต้องการเท่านั้น และในที่สุดจะเดินทางไปถึงตัวรับแสงแบบตัวคูณ (Photo Multiplier Tube; PMT) ซึ่งตัวรับแสงแบบตัวคูณจะทำหน้าที่แปลงสัญญาณแสงเป็นสัญญาณไฟฟ้า โดยส่วนมากจะมีตัวกรองแสง (optical filter) ระหว่างรูขนาดเล็กกับตัวรับแสงเพื่อกรองแสงที่ไม่ต้องการออกอีกครั้งหนึ่งเพื่อให้ได้ภาพที่คมชัดขึ้น จากที่กล่าวมาข้างต้นแสงที่ได้รับมาจากวัตถุนั้นเป็นแสงสะท้อนจากปริมาตรของจุดโฟกัส โดยแสงสะท้อนนั้นจะกลายเป็นพิกเซล (pixel) ในภาพที่เป็นผลลัพพ์สุดท้าย โดยความสว่างของภาพจะขึ้นอยู่กับความเข้มของสัญญาณแสงสะท้อน ดังนั้นหากเราต้องการภาพหนึ่งภาพ เราจะต้องทำการสแกนแบบจุดต่อจุดให้ทั่วทั้งบริเวณที่เราต้องการ แล้วนำสัญญาณแสงมาแปลงเป็นแต่ละพิกเซล ในการสแกนลำแสงเลเซอร์ให้ทั่วบริเวณที่เราต้องการภาพนั้น เราใช้กระจกที่สามารถปรับได้เพื่อสะท้อนลำแสงเลเซอร์ไปยังบริเวณที่ต้องการได้ ซึ่งการทำกระจกให้สามารถปรับได้นั้นอาจใช้มอเตอร์มาช่วยเพื่อควบคุมมุมของการสะท้อนของลำแสงเลเซอร์ วิธีการที่ใช้ในการสแกนลำแสงเลเซอร์โดยปกตินั้นเป็นวิธีการที่ตอบสนองช้าและสามารถปรับความเร็วได้ เนื่องจากกล้องจุลทรรศน์จะเก็บแสงเฉพาะที่ปริมาตรของจุดโฟกัสเท่านั้นทำให้ต้องใช้เวลาในการเปิดหน้ากล้องนานกว่ากล้องแบบปกติ ดังนั้นการที่สแกนช้าจะส่งผลดีต่อภาพคือทำให้อัตราส่วนระดับสัญญาณแสงสะท้อนต่อสัญญาณรบกวน (signal-to-noise ratio) สูงขึ้น ส่งผลให้ความคมชัดและความละเอียดของภาพสูงขึ้น การเก็บภาพที่ระดับความลึกต่างๆของวัตถุนั้นทำได้โดยการปรับความสูงของฐานของกล้องจุลทรรศน์หรือปรับระดับความสูงของเลนส์วัตถุเพื่อเปลี่ยนตำแหน่งของจุดโฟกัสให้ต่ำลงหรือสูงขึ้น เมื่อเราได้ภาพ 2 มิติ ที่ระดับความลึกต่างๆแล้ว เมื่อเรานำภาพต่างๆมาประกอบกันโดนเรียงเป็บชั้นๆเราจะได้ภาพโครงสร้างแบบ 3 มิติ กล้องจุลทรรน์แบบโฟกัสร่วมนี้มีความสามารถในการตัดทางแสง (optical sectioning) ซึ่งทำให้ไม่จำเป็นที่จะต้องทำลายตัวอย่างเพื่อทำการศึกษาโครงสร้างภายใน และทำให้ลดระยะและการวางแผนสำหรับการทดสอบต่างๆ รวมทั้งทำให้ภาพถ่ายมีความละเอียดเพิ่มขึ้น ชิ้นเนื้อตัวอย่างในงานชีววิทยานั้นปกติจะถูกย้อมด้วยสีย้อมของฟลูออเรสเซ็นต์ (fluorescent dye) สำหรับการสังเกตเฉพาะสิ่งที่ต้องการเท่านั้น อย่างไรก็ตามในความเป็นจริงความเข้มข้นของสีย้อมอาจถูกทำให้น้อยลงเพื่อลดการรบกวนในระบบ ดังนั้นกล้องหรือเครื่องมือวัดบางชนิดสามารถจับแสงฟลูออเรสเซ็นต์ได้เพียงโมเลกุลเดียว ดังนั้นจึงมีการใช้ transgenic techniques เพื่อที่จะสร้างโมเลกุลแบบฟลูออเรสเซ็นต์เสมือน (fluorescent chimeric molecules)ขึ้นมา เช่นการนำเอา Green Fluorescent Protein (GFP) มารวมกับโปรตีนชนิดที่เราสนใจในการสังเกตในงานชีววิทยา กล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกนใช้เทคนิดในการสแกนชนิดเดียวกันกับกล้อง Scanning Electron Microscope (SEM) ซึ่งเป็นการสแกนแบบแรสเตอร์ (raster scanning) คือ สเแกนเป็นแบบเส้นแนวนอนทีละเส้นหลายๆเส้นจนกระทั่งได้ภาพ 2 มิติ กล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกนนั้นมีข้อดีกว่ากล้อง Atomic Force Microscope (AFM) และ Scanning Tunneling Microscope (STM) คือไม่จำเป็นต้องใช้ปลายแหลมสำหรับทดสอบ(probe) ที่ต้องลอยเหนือชิ้นเนื้อในระดับนาโนเมตรในขณะที่กล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกนมีระยะห่างระหว่างชิ้นเนื้อกับเลนส์วัตถุ (working distance) ในระดับไมโครเมตรหรือมิลลิเมตร ซึ่งทำให้มีพื้นที่ในการใช้งานได้มากกว่า กล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกนนั้นใช้แหล่งกำเนิดแสงเลเซอร์แบบจุดแล้วโกัสลำแสงเลเซอร์ไปยังชิ้นเนื้อตัวอย่าง ดังนั้นปริมาตรในการสแกนและความเข้มของแสงสะท้อนในการสแกนแต่ละจุดนั้นขึ้นอยู่กับขนาดของจุดโฟกัส (spot size) ของระบบแสง เพราะว่าจุดโฟกัสที่เกิขึ้นจริงไม่ใช่จุดที่มีขนาดเล็กมากเช่นในอุดมคติ แต่มีขนาดแบบ 3 มิติในรูปแบบของการกระจายแสง ในกล้องจุลทรรศน์แบบนั้นขนาดของจุดโฟกัสขึ้นอยู่กับ Numerical Aperture (N.A.) ของเลนส์วัตถุและความยาวคลื่นของแสงเลเซอร์ที่นำมาใช้ อย่างไรกล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกนนั้นสามารถกำจัดรูปแบบการเบี่ยงเบนลำแสงลำดับสูงๆลำแสง (higher order of difdfraction pattern) ที่มีผลต่อภาพได้ โดยการลดขนาดของรูรับแสงลง อย่างเช่นถ้าเราลดขนาดของรูรับแสงลงเหลือ 1 Airy unit จะทำให้แสงที่ผ่านมายังตัวรับแสงเป็นรูปแบบการเบี่ยงเบนลำแสงลำดับแรก (first order of difraction pattern) เท่านั้น ทำให้ภาพมีความคมชัดสูงขึ้นโดยแลกกับแสงที่มีความเข้มลดลงเพียงเล็กน้อยเท่านั้น ในการถ่ายภาพฟลูออเรสเซ็นต์ข้อจำกัดเพียงอย่างเดียวคืออัตราส่วนระดับสัญญาณต่อสัญญาณรบกวน (signal to noise ratio) เพราะว่าแสงที่ผ่านเข้ามายังตัวรับแสงน้อย แต่ก็ยังมีวิธีการแก้ไขปัญหานี้อยู่คือ ใช้ตัวรับแสงที่มีความไวสูง หรือเพิ่มความเข้มของแหล่งกำเนิดแสง แต่การเพิ่มความเข้มของแหล่งกำเนิดแสงอาจทำให้อายุของการสะท้อนแสงของสีย้อมฟลูออเรสเซ็นหมดลงเร็ว หรืออาจทำลายชิ้นเนื้อได้ กล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกนถูกใช้งานอย่างกว้างขวางในระเบียบการทำงานทางชีววิทยา ตั้งแต่ชีววิทยาระดับเซลล์, ยีน หรือ ชีววิทยาระดับไมโคร รวมทั้งการพัฒนาระบบชีววิทยา การแพทย์ระดับคลีนิค กล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกนถูกใช้ในการวินิจฉัยโรคภัยต่างๆ โดยเฉพาะถูกใช้ในการถ่ายภาพและวิเคราะห์คุณภาพ รวมทั้งยังถูกใช้ในการระบุตำแหน่งและระบุลักษณะของเชื้อโรคต่างๆ ทำให้สามารถวินิจฉัยได้รวดเร็วขึ้นและสามารถทราบได้แม้จะเป็นในระยะเริ่มแรกก็ตาม เพื่อที่จะได้บำบัดรักษาได้ทันท่วงที ทั้งนี้ยังมีการค้นคว้าเพื่อนำกล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกนไปใช้เป็น endoscope เพื่อใช้ตรวจภายในร่างกาย นอกจากนี้การนำเอาระบบไฟฟ้าเครื่องกลจุลภาคมาใช้ร่วมกับ endoscope ที่ใช้หลักการแบบเดียวกับกล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกนนั้นเป็นการเพิ่มความสามารถให้กล้อง endoscope ให้มีขนาดเล็กลงและมีความเร็วในการบันทึกภาพสูงขึ้นด้วย อุตสาหกรรมเภสัชกรรมได้นำกล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกนไปใช้สำหรับการตรวจสอบการผลิตแผ่นฟิล์มขนาดบางเพื่อตรวจสอบว่าการกระจายตัวของยานั้นเป็นไปตามต้องการหรือไม่ กล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกนยังมีการนำไปใช้ในการอ่านข้อมูลในระบบการเก็บข้อมูลโดยใช้แสงแบบ 3 มิติ (3D optical data storage)