ゲル電気泳動

ゲル電気泳動。選択されるパーセンテージは、サンプル内で識別またはプローブしたいタンパク質の大きさによって異なる。判明している分子量が小さいほど、使用するパーセンテージは高くなる。ゲルの緩衝系を変更すると、非常に小さい大きさのタンパク質をさらに分離することができる。

1.1. デンプン
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部分加水分解されたデンプンは、タンパク質電気泳動用のもう一つの非毒性媒体になる。そのゲルは、アクリルアミドやアガロースよりもわずかに不透明である。非変性タンパク質を、電荷や大きさに応じて分離することができる。これらは、ナフトールブラックまたはアミドブラック10B染色を用いて可視化される。一般的なデンプンゲルの濃度は5%～10%である。

1. ゲルの状態
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1.1. 変性ゲル
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変性ゲルは、分析対象物の天然構造を破壊して、線型鎖に展開する条件下で実行する。したがって、各高分子の移動度は、その鎖長と質量電荷比にのみ依存する。このように、生体分子構造の二次、三次、四次構造が破壊され、一次構造のみが分析対象となる。

核酸は尿素を含む緩衝液で変性させることが多く、タンパク質はSDS-PAGEプロセスの一環としてドデシル硫酸ナトリウムを使用して変性させることが多い。また、タンパク質を完全に変性させるためには、タンパク質の三次構造や四次構造を安定化させる共有ジスルフィド結合を還元する必要もあり、この方法を還元PAGEという。還元条件は通常、β-メルカプトエタノールやジチオトレイトールの添加によって維持される。タンパク質サンプルでは、還元PAGEが最も一般的なタンパク質のゲル電気泳動の形式である。

RNAの分子量を適切に推定するためには変性条件が必要である。RNAはDNAよりも多くの分子内相互作用を形成でき、その結果、電気泳動移動度が変化することがある。RNAの構造を破壊する変性剤として、尿素、DMSO、グリオキサールがもっともよく使用される。もともとRNA電気泳動の変性には毒性の強い水酸化メチル水銀がよく使われており、サンプルによってはこの方法が選択されることもある。

変性ゲル電気泳動は、DNAおよびRNAのバンドパターンに基づく方法である温度勾配ゲル電気泳動法や変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法で使用される。

1.2. 天然ゲル
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天然ゲルは、分析対象物の天然構造が維持されるように、非変性条件で実行される。これにより、折りたたまれた、あるいは組み立てられた複合体の物理的な大きさが移動度に影響を与え、生体分子構造の4つのレベルすべてを分析することができる。生体サンプルでは、界面活性剤は細胞内の脂質膜を溶かすために必要な範囲でのみ使用する。複合体は、ほとんどの場合、細胞内と同じように結合し、折りたたまれたままである。ただし、1つの欠点は、分子の形状や大きさが移動度にどのように影響するかを予測することが難しいため、複合体がきれいに、または予測どおりに分離しない可能性である。この問題を特定して解決することがQPNC-PAGEの主要な目的である。

変性ゲル法とは異なり、天然ゲル電気泳動は負担のかかる変性剤を使用しない。そのため、分離される分子は、分子量や固有の電荷だけでなく断面積も異なり、全体的な構造の形状に応じて異なる電気泳動力を受けることになる。タンパク質は天然状態のままなので、一般的なタンパク質染色試薬だけでなく、特異的な酵素結合染色でも可視化することができる。

天然ゲル電気泳動の応用としての具体的な実験例には、タンパク質精製時にサンプル中の酵素の存在を確認するために酵素活性を調べることがあげられる。たとえば、タンパク質アルカリホスファターゼの場合、染色液はトリス緩衝液に4-クロロ-2-2メチルベンゼンジアゾニウム塩と3-ホスホ-2-ナフトエ酸-2'-4'-ジメチルアニリンを混合したものである。この染色液は、ゲルを染色するためのキットとして市販されている。タンパク質が存在する場合、反応のメカニズムは以下の順序で行われる。まず、アルカリホスファターゼによる3-ホスホ-2-ナフトエ酸-2'-4'-ジメチルアニリンの脱リン酸化から始まる。リン酸基が放出され、水からアルコール基に置換される。求電子試薬である4-クロロ-2-2メチルベンゼンジアゾニウムがアルコール基を置換し、最終生成物である赤色アゾ染料を形成する。その名前のとおり、これは反応の最終的な可視赤色生成物である。学部でのタンパク質精製の実験では通常、結果を可視化して精製が成功したかどうかを結論づけるために、市販の精製サンプルと隣り合わせてゲルを実行する。

プロテオミクスやメタロミクスでは、天然ゲル電気泳動が一般的に用いられる。けれども、ネイティブPAGEは、一本鎖高次構造多型分析のように、未知の変異について遺伝子をスキャンするのにも使われる。

2. バッファー
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ゲル電気泳動では、電流を流すイオンを供給し、pHを比較的一定に維持するために、バッファーを使用する。これらのバッファーには、電気を通すために必要なイオンが多く含まれている。蒸留水やベンゼンのようなものにはイオンがほとんど含まれていないので、電気泳動での使用には不向きである。電気泳動では、さまざまな種類のバッファーが使用されている。最も一般的なものは、核酸用のTAE緩衝液、TBE緩衝液である。他にも多くのバッファーが提案されており、たとえば、PubMedではホウ酸リチウムがまれに使われ、等電点ヒスチジン、pK適合グッドバッファーがある。ほとんどの場合、理論的根拠とされているのは、イオン移動度に一致するより低い電流であり、これによりバッファー寿命を長くする。ホウ酸塩の問題点は、ホウ酸塩がRNAに含まれるようなシス型ジオールと重合あるいは相互作用することがある。TAEの緩衝能力は最低であるが、大きなDNAに対して最も優れた分解能を発揮する。これは、より低い電圧と多くの時間を意味するが、より良い結果である。LBは比較的新しく、5 kbp以上のフラグメントの分離には効果がない。ただし導電性が低いため、はるかに高い電圧で使用でき、定型の電気泳動の分析時間が短かくなることを意味する。極めて低い伝導率の媒体を使用した3%アガロースゲルでわずか1塩基対の大きさの違いを分離できた。

ほとんどのSDS-PAGEタンパク質分離は、ゲル内のバンドの鮮明さを大幅に向上させるタンパク質のゲル電気泳動を使用して行われる。不連続ゲルシステムでの電気泳動では、電気泳動の初期段階でイオン勾配が形成され、すべてのタンパク質が単一の鋭いバンドに集中する等速電気泳動と呼ばれるプロセスが起こる。タンパク質の大きさによる分離は、ゲルの下部にある「分離」領域で行われる。この分離ゲルは通常、細孔径が非常に小さいため、タンパク質の電気泳動移動度を決定するふるい分け効果が得られる。

3. 視覚化
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電気泳動が完了した後、ゲル内の分子を染色して可視化することができる。DNAは、臭化エチジウムを用いて可視化することができ、DNAに挿入された臭化エチジウムは紫外線下で蛍光を発する。タンパク質は、銀染色やクマシーブリリアントブルー色素を用いて視覚化することができる。また、他の方法を使用して、ゲル上の混合物の成分の分離を可視化することもできる。分離する分子に放射能が含まれている場合、たとえばDNAシークエンシングのゲルでは、ゲルのオートラジオグラムを記録することができる。多くの場合、Gel Docシステムを使用してゲルの写真を撮ることができる。

4. 下流側工程
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分離後、等電点電気泳動やSDS-PAGEなどの追加の分離方法を用いてもよい。その後、ゲルを物理的に切断し、各部分からタンパク質複合体を別々に抽出する。その後、各抽出物は、ゲル内消化の後、ペプチドマスフィンガープリンティングやde novoペプチドシークエンシングなどによって分析することができる。これにより、複合体中のタンパク質の同一性に関する多くの情報を得ることができる。

5. 用途
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制限酵素消化後のDNA分子の大きさの推定。
PCR産物の分析
サザン法前に制限処理されたゲノムDNAの分離、またはノーザン法前のRNAの分離。ゲル電気泳動は、法化学、分子生物学、遺伝学、微生物学、生化学の分野で使用されている。その結果は、紫外線とゲルイメージング装置でゲルを可視化することで、定量的に分析できる。この画像をコンピュータ制御のカメラで記録し、関心のあるバンドまたはスポットの強度を測定し、同じゲルにロードされた標準物質やマーカーと比較する。測定と分析は、主に専用のソフトウェアで行われる。

実行する分析の種類に応じて、ゲル電気泳動の結果と合わせて他の手法を導入することが多く、分野に応じた幅広い用途を提供する。

5.1. 核酸
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核酸の場合、負電極から正電極への移動の方向は、糖-リン酸主鎖が持つ自然の負電荷によるものである。

二本鎖DNAフラグメントは本来長い棒のように振るまうので、ゲル内での移動はその大きさに比例し、環状フラグメントの場合はその断面回転半径に比例する。ただし、プラスミドのような環状DNAは複数のバンドを示すことがあり、移動速度は、弛緩しているか高次コイルであるかによって異なる。一本鎖のDNAやRNAは、複雑な形状の分子に折りたたまれ、その三次構造に基づいて複雑な挙動でゲル内を移動する傾向がある。そこで、水酸化ナトリウムやホルムアミドなどの水素結合を破壊する薬剤を用いて核酸を変性させ、再び長尺の棒として振るまえるようにする。

大きなDNAまたはRNAのゲル電気泳動は、通常、アガロースゲル電気泳動によって行われる。ポリアクリルアミド製のDNAシークエンシングゲルの例は、サンガー法の「鎖切断法」を参照のこと。核酸またはフラグメントのリガンド相互作用による特性評価は、移動度シフトアフィニティー電気泳動によって行うことができる。

RNAサンプルを電気泳動することで、ゲノムDNAの混入や、RNAの分解を確認することができる。真核生物のRNAは、28sおよび18s rRNAの明瞭なバンドを示し、28sバンドは18sバンドの約2倍の強度を示す。分解したRNAは、バンドが鮮明ではなく、外観が不鮮明で、強度比は2:1未満である。

5.2. タンパク質
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タンパク質は核酸とは異なり、電荷が変化したり、形状が複雑のため、サンプルに負から正の起電力を印加しても、ポリアクリルアミドゲルへの移動速度が一様でないか、またはすべて移動しない場合がある。そのため、タンパク質は通常、ドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤の存在下で変性され、タンパク質は負電荷で覆われる。一般的に、結合するSDSの量はタンパク質の大きさに比例するので、その結果、変性したタンパク質は全体的に負の電荷を持ち、すべてのタンパク質が同様の電荷対質量比を持つようになる。変性したタンパク質は複雑な三次構造を持たず、長い棒のように振るまうので、結果として得られたSDSで覆われたタンパク質がゲル内を移動する速度は、その大きさにのみ相対的であり、電荷や形状には関連しない。

タンパク質の分析には、通常、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動、天然ゲル電気泳動、QPNC-PAGE、または二次元電気泳動が用いられる。

リガンド相互作用による特性評価は、エレクトロブロッティング、アガロースでのアフィニティー電気泳動、またはキャピラリー電気泳動を使用し、結合定数 の推定やレクチン結合によるグリカン含有量などの構造的特徴を決定することができる。

5.3. ナノ粒子
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ゲル電気泳動の新たな用途として、金属または金属酸化物のナノ粒子の大きさ、形状、表面化学的に関して、分離したり特徴評価することがあげられる。その目的は、より均質なサンプルを得ることであり、これをさらなる製品/プロセスに使用することができる。ゲル内でのナノ粒子の分離では、メッシュサイズに対する粒子径が重要なパラメータであり、粒子径メッシュサイズの無制限メカニズムと、粒子径がメッシュサイズに近い制限メカニズムの2つの移行メカニズムが確認された。

6. 歴史
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1930s - ゲル電気泳動にショ糖を使用した最初の報告
1955 - デンプンゲルの導入、並の分離
1959 - アクリルアミドゲルの導入。ディスク電気泳動。細孔径や安定性などのパラメータの正確な制御
1966 - 寒天ゲルの最初の使用
1969 - 変性剤の導入、特にSDSによるタンパク質サブユニットの分離
1970 - T4ファージの28成分をスタッキングゲルとSDSで分離
1972 – 臭化エチジウム染色を施したアガロースゲル
1975 - 2次元ゲル - 等電点電気泳動の後、SDSゲル電気泳動
1977 - シークエンシングでゲル使用
1983 - パルスフィールドゲル電気泳動で大きなDNA分子の分離が可能になる
1983 - キャピラリー電気泳動の導入
2004 - アクリルアミドゲルの重合時間を標準化し、天然タンパク質をきれいに、かつ予測可能に分離できるミラン・ビアによる電気泳動に関する1959年に出版された本には1800年代からの文献を引用されている。しかし、オリヴァー・スミティーズは多大な貢献をしている。ビアは次のように述べている。『スミティーズの方法は、… その独自の分離力のために、幅広い用途が見いだされている』。文脈から考えると、ビアはスミティーズの方法が改良されていると明らかに示唆している。

7. 参照項目
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電気泳動移動度シフトアッセイ 
ゲル抽出
等電点電気泳動 
パルスフィールドゲル電気泳動
Nonlinear frictiophoresis
二次元電気泳動
SDD-AGE
高速並列タンパク質分解

8. 脚注
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9. 外部リンク
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[1] - ユタ大学遺伝子科学ラーニングセンターより
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