二成分毒素

二成分毒素または二元毒素とは標的細胞に結合するB成分とB成分に結合して細胞内に侵入し毒素活性を示すA成分からなる外毒素である。

1. 防御抗原ファミリー
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炭疽菌の防御抗原と相同性のある5種類の毒素蛋白質が知られている。ディフィシル菌のCDT、ボツリヌス菌のC2毒素、ウェルシュ菌のι毒素、スピロフォルム菌ι毒素様毒素、セレウス菌とバチルス・チューリンゲンシスの昆虫殺虫性蛋白質のそれぞれのB成分が相同性がある。これらを防御抗原ファミリーという。防御抗原ファミリーの二成分毒素のうちクロストリジウム属のディフィシル菌のCDT、ボツリヌス菌のC2毒素、ウェルシュ菌のι毒素、スピロフォルム菌ι毒素様毒素のそれぞれのA成分はADPリボシル化酵素活性をもつ二成分毒素である。防御抗原ファミリーはB成分のみであるがA成分も合わせて記載する。

1.1. 炭疽菌の三成分毒素
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炭疽菌の外毒素は防御抗原、浮腫因子、致死因子の3つが知られている。浮腫因子と致死因子が毒素の本体であるが単独では毒性を持たないA成分で防御抗原がB成分である。3つの毒素が強調してはたらくことから三成分毒素とよばれるが、防御抗原と浮腫因子、防御抗原と致死因子という二成分毒素が2つある。

1.1.1. 炭疽菌の微生物学
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炭疽菌は炭疽の病原菌として1876年にコッホが分離した。この発見によりコッホの4原則が確立した。次いで1881年にパスツールが炭疽菌の弱毒性菌による家畜用炭疽ワクチンの実用化に成功した。コッホの4原則とワクチンの創製は細菌学の歴史においては非常にk重要である。皮膚炭疽の場合、病変部に炭のような痂皮ができる。これが炭疽とよばれる所以である。炭疽菌はその病原性、芽胞の耐久性と培養・運搬・散布の容易さなどから生物兵器として研究されてきた菌のひとつである。

生物兵器としては1950～1960年代にアメリカで兵器化され、イラクや旧ソビエト連邦で保有された。1979年旧ソビエト連邦のスベルドロフスクで陸上生物施設から炭疽菌の芽胞が漏洩し、96人の患者が発生し、少なくとも64人が肺炭疽で死亡した。2001年9月にはアメリカで炭疽菌の芽胞を混ぜた白色粉末郵送による生物テロが起こった。このバイオテロによりアメリカでは10人の患者が発生しそのうち、2名が死亡した。

炭疽菌は主に草食動物に感染する。肉食動物、雑食動物の感染例は少なく、鳥類、爬虫類、魚類の感染は極めて稀である。実験動物ではマウスが最も感受性が高く、次いでウサギ、モルモット、ラットである。炭疽菌は典型的な土壌菌で、環境中で芽胞体として長期間生残し、動物に感染を繰り返す。芽胞体が感染サイクルの中心となっている。芽胞体が生体内に侵入すると、マクロファージ内にすみやかに取り込まれ発芽する。発芽と同時に炭疽菌は増殖し、同時に毒素によるマクロファージの融解が起き、菌体は血流へ放出される。その後、病原因子の盛んな発現を伴いながら炭疽菌は爆発的に増殖し、産出毒素によるサイトカイン産出が誘導され、最終的に生体はショックにより死に至る。感染した動物の血液、体液、死体などが土壌や体表を汚染し、空気に触れると栄養形は再び芽胞体となり、屋外に放出され地表を汚染する。炭疽菌はこのような感染サイクルを繰り返し、炭疽菌汚染地帯を作る。ヒトは炭疽症に罹患した家畜との接触や、炭疽菌の芽胞に汚染された家畜の肉・排泄物などから感染する。ヒトからヒトへの伝染はなく、患者の隔離は必要ない。ヒトでは3つの主な感染経路がある。すなわち、皮膚、呼吸器、消化器を経て感染し、それぞれ皮膚炭疽、肺炭疽、腸炭疽を起こす。

皮膚炭疽炭疽症例の95%以上は皮膚炭疽である。汚染されたウールや毛皮などの取り扱い中に、露出部の手、腕、頭などの創傷から菌または芽胞が侵入して、2～3日の潜伏期をおいて、かゆみのある皮膚丘疹、次いで水疱となる。その中心部は壊死し、乾燥して黒い痂皮ができ、その周囲には浮腫と皮下出血による赤紫色の水疱を伴う。無痛性であり悪性膿疱とよばれる。重症例では敗血症や髄膜炎を起こし死に至る。未治療の死亡率は20%である。

肺炭疽肺炭疽、または吸入炭疽は獣医師、牧畜業者、毛皮取り扱い者などが芽胞を含む塵肺を吸入して起こる。芽胞は肺胞に達し、肺胞のマクロファージに貪食され気管支粘膜下、および縦隔のリンパ節に運ばれ、リンパ節腫脹を起こす。菌はマクロファージの食胞体内で栄養型となって増殖し、莢膜を作り、少なくとも3種類の毒を産出して細胞を破壊し、栄養型の炭疽菌を周囲に広げる。1～6日の潜伏期をおいて、発熱、筋肉痛、頭痛、空咳、軽度の胸部不快感などのかぜ様症状で始まり、急速に進行して、高熱、呼吸困難、喘鳴、チアノーゼ、ショック、髄膜炎を引き起こす。急性呼吸切迫症状が24～36時間続くと、どのような治療によっても95～100%が死亡する。ワクチンが推奨されて西ヨーロッパでは職業病としての肺炭疽は激減している。肺に吸入された菌は速やかに縦隔リンパ節に移動して出血性縦隔炎を起こし、菌は肺にはほとんどとどまらない。そのため胸部X線像からは肺炎は認められない。縦隔炎による縦隔の拡大像が診断上重要で、主病変が肺ではないので吸入炭疽と呼んだほうが適切である。

腸炭疽腸炭疽は罹患動物の肉に含まれている芽胞を摂取して起こる。悪心、食欲不振、嘔吐を初発症状として、次いで発熱、腹痛、血性嘔吐、重症の下痢を伴い、20～60%という高い致死率を示す。

1.1.2. 防御抗原とその他の病原因子
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炭疽菌の病原因子は莢膜形成能と毒素産出能である。莢膜形成能は90kbのプラスミドpXO2に支配されており、莢膜は抗食菌因子としてはたらく。このプラスミドは40度の高温で培養すると脱落しやすく、菌が弱毒化する。毒素は3種類が知られている。動物に一過性の神経・心臓血管機能障害を起こす防御抗原、浮腫形成と致死作用を示す浮腫因子、致死因子である。これらの毒素遺伝子はいずれも約180kbのプラスミドpXO1上にある。浮腫因子と致死因子が毒素の本体であるが単独では毒性を持たない酵素成分で防御抗原が結合成分である。3つの毒素が強調してはたらくことから三成分毒素とよばれるが、防御抗原と浮腫因子、防御抗原と致死因子という二成分毒素が2つある。防御抗原防御抗原はプラスミドpXO1上のpag遺伝子にコードされる。成熟タンパク質は735アミノ酸からなる。菌より分泌された防御抗原は細胞の炭疽菌毒素受容体に結合する。ATRはI型膜タンパク質の一種でフォンウィレブランド因子Aドメインを細胞外に持っており、このドメインに防御抗原が直接結合する。受容体に結合した防御抗原は細胞表面のフーリンなどのプロテアーゼによって19kDa断片と63kDa断片に切断される。PA63は七量体を形成し、ポア前駆体が構築される。このポア前駆体に浮腫因子または致死因子が結合するとこれらの毒素が細胞内に取り込まれる。

X線による三次元構造解析から防御抗原は平べったくひょろりとした構造で4つのドメインからなり、β構造が多く、ヘリックス構造が少ないと推定された。Domain1は1～258番目までのアミノ酸から成る領域である。酵素成分である浮腫因子や致死因子との相互作用に関わる。162～174領域内にあるループ構造によりさらに2つにわけられる。このループ内にはトリプシンやフーリンなどのプロテアーゼで切断される164～167番目のアミノ酸配列があり、PA63を産出するための構造を有する。Domain2は259～487番目のアミノ酸から成る領域である。Domain2はPA63による七量体の中心を形成する。膜侵入領域である。Domain3は488～595番目のアミノ酸からなる領域である。最も小さなドメインでオリゴマー形成にかかわると予想されるが機能がよくわかっていない。Domain4は596～735番目のアミノ酸からなる領域でレセプター結合部位である。

浮腫因子浮腫因子はPA63の七量体でありポア前駆体に結合することで細胞内に取り込まれる。エンドソームの酸性化によりポア前駆体はエンドソーム膜に入り込み、膜に孔が形成される。浮腫因子はこの孔を通って宿主細胞室内に侵入する。浮腫因子はADPリボシル化酵素活性をもつ。

致死因子致死因子はPA63の七量体でありポア前駆体に結合することで細胞内に取り込まれる。エンドソームの酸性化によりポア前駆体はエンドソーム膜に入り込み、膜に孔が形成される。致死因子はこの孔を通って宿主細胞室内に侵入する。致死因子はメタロプロテアーゼ活性をもつ。最終的に組織の出血・壊死を起こす。

1.2. ディフィシル菌のCDT
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クロストリジウム・ディフィシルは偽膜性腸炎、クロストリジウム・ディフィシル腸炎の原因菌として知られている。その病原性には毒素Aと毒素Bが関与することが知られている。ディフィシル菌のBI/NAP1/027型がもつ二成分毒素としてCDTが知られている。A成分がCDTaでB成分がCDTbである。CDTbはウェルシュ菌ι毒素のIbやボツリヌス菌のC2毒素のC2 IIなど他のADPリボシル化酵素活性をもつ二成分毒素のB成分と36%程度の相同性をもつ。ドメイン1が酵素成分との結合、ドメイン2が膜侵入領域、ドメイン3がオリゴマー形成、ドメイン4が細胞への結合へ関与している。ドメイン4はウェルシュ菌のι毒素とスピロフォルム菌ι毒素様毒素とは相同性があるがボツリヌス菌のC2毒素とは相同性がない。

ディフィシル菌のCDT region上にコードされている。BI/NAP1/027型ではtcdCの欠損があるために菌自体が毒素の産出をコントロールできずtoxin Aの産出量が16倍、toxin Bの産出量が23倍に亢進している。このためCDT自体の病原性に関しては不明な点が多い。

CDTの受容体はウエルシュ菌のι毒素と同様にLSRである。LSRは肝臓、小腸、大腸、肺、腎臓、副腎、精巣、卵巣を含む多くの組織で高発現している。ILDR2とILDR3はLSRと30%ほどの相同性をもつがこれらがCDTの受容体であるかは疑わしい。また、LSR以外にCD44も受容体である可能性が示されている。

1.3. ボツリヌス菌のC2毒素
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ボツリヌス菌は土壌や河川、湖畔に存在するクロストリジウム属の細菌である。神経毒であるボツリヌス毒素で知られている。ボツリヌス毒素はコリン作動性末梢神経に作用し、アセチルコリンの遊離を阻害することにより麻痺を引き起こしボツリヌス症を起こす。ボツリヌス毒素の抗原性に基づいてA～Hの8型に分類されている。ヒトのボツリヌス症の原因となるのはA、B、E、FでありアメリカではA型、ヨーロッパの大半ではB型、北ヨーロッパの一部と日本ではE型が多い。C型とD型は反芻動物のボツリヌス症の原因となる。抗原には違いがあるがボツリヌス毒素は薬理学的には同一である。破傷風のテタノスパスミンと同様に菌体内で産出された毒素は死菌の自己融解によって培養液中に放出される。ボツリヌス毒素は分子量約150kDaであり種々のサイズの無毒成分と結合した複合体の形で産出される。複合体毒素は分子量の違いによってLL毒素、L毒素。M毒素にわけられる。無毒成分は胃を通過するときに毒素を胃液から保護し、小腸からの吸収効率を高める働きをする。分子量約150kDaのボツリヌス毒素は蛋白質分解酵素によりN末端より約50kDaのところに切れ目が入ることにより活性化される。分子量約150kDaのボツリヌス毒素は1本鎖で合成された後、重鎖と軽鎖とがジスルフィド結合した2本鎖タンパクとして存在する。ボツリヌス毒素は主として重鎖のC末端側を使って神経細胞膜に結合し、細胞内へ取り込まれたあと重鎖のN末端側が軽鎖を細胞質内に移行させ、細胞質内を移動した軽鎖が酵素として基質に作用する。これによって神経伝達物質放出を阻害する。運動神経終末においてはアセチルコリン放出が阻害されることで神経筋伝達が失われ筋の麻痺が生じる。

ボツリヌス毒素のC型毒素はC1、C2、C3型に分類され、他の毒素型のボツリヌス毒素と同じ作用機序を示すのはC1毒素だけである。そのためC2毒素やC3毒素はボツリヌス毒素ではない。C2毒素はボツリヌスC型およびD型が産出する毒素である。C2毒素ではC2 IがA成分でありC2 IIがB成分である。ボツリヌス神経毒素とは構造および生物活性が全く異なる。C2毒素は水鳥の腸炎の原因として知られているが、それ以外の生物でも肺や消化管での血管透過性亢進などの毒性が知られている。ウェルシュ菌のι毒素は非筋肉のβ/γアクチンだけではなく骨格筋のアクチンも修飾するがC2毒素は骨格筋のアクチンは修飾しない。トリプシンによってC2 IIは活性型のC2 IIaとなりオリゴマーを形成する。細胞膜上の受容体に結合しC2 Iと複合体を形成しエンドサイトーシスの機序で細胞内に取り込まれる。エンドソーム内のpHが下がることでC2 IIaオリゴマーがpore形成をしてC2 Iが細胞質内に遊離しアクチンをADPリボシル化する。C2 IIはウェルシュ菌のι毒素のB成分であるIbと全体では39.0%相同性がある。Ibと同様に4つのドメイン構造からなる。ドメイン1が酵素成分との結合、ドメイン2が膜侵入領域、ドメイン3がオリゴマー形成、ドメイン4が細胞への結合へ関与している。ドメイン4はウェルシュ菌のι毒素と1次構造の相同性がない。そのため異なる受容体に作用すると考えられている。

C2 IIが結合する受容体はNアセチルガラクトサミンやNアセチルグリコサミン、Lフコース、ガラクトースやマンノースといった糖鎖の結合したグルコプロテインと考えられている。C2 IIは多くの種の多くの細胞にエンドサイトーシスされる。しかしRK14という糖転移酵素であるGlcNAc-T Iが欠損した細胞には取り込まれないことが知られている。

1.4. ウェルシュ菌のイオタ毒素
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ウェルシュ菌はクロストリジウム属に属する嫌気性桿菌である。河川、下水、海、土壌中など自然界に広く分布している。ヒトを含む動物の腸内細菌叢における主要な構成菌であることが多い。少なくとも12種類の毒素を作り、α, β, ε, ιの4種の主要毒素の産生性によりA, B, C, D, E型の5つの型に分類される。E型ウェルシュ菌はα毒素とι毒素の2種類の毒素を主に産出する。ι毒素は独立した2種類の蛋白質からなる二成分毒素である。stilesとWlikinsはイオタ毒素を精製し、毒素は互いに結合や相互作用がなく、Ia成分とIb成分からなる二成分毒素で、両者の共存下で毒素作用を示すことを報告した。イオタ毒素はボツリヌスC2毒素や炭疽菌毒素やスピロフォルム菌イオタ毒素様毒素などと同じADPリボシル化毒素型ファミリーに属する。

イオタ毒素遺伝子はE型ウェルシュ菌のプラスミドDNAからクローニングされた。Ia遺伝子、Ib遺伝子の順に並び、同じ方向で転写され両者の間に存在する短い非コード領域が243b.p存在する。その塩基配列から推定されるIaのアミノ酸配列よりIaは454残基で発現する。N末側の41残基のシグナルペプチドが外れて、413残基の分子量47,605の蛋白質として産出される。このプロトキシンからN末端の13残基のプロペプチドがはずれ活性体は400残基である。Ibは876残基で発現され、N末側の39残基のシグナルペプチドがはずれ、836残基から成るプロトキシンとして菌体外に放出される。プロトキシンはタンパク分解酵素の作用で211残基のプロペプチドがはずれ664残基のアミノ酸からなる分子量74,147の成熟タンパクとなることが知られている。Iaの推定アミノ酸配列と他の蛋白質の配列を比較すると、スピロフォルム菌が産出するι毒素様毒素の酵素成分であるSaとは約80%と高いアミノ酸相同性を示す。さらに同じADPリボシル化毒素ファミリーの酵素成分セレウス菌とバチルス・チューリンゲンシスのVIP2の配列とは32%の相同性が認められ、C2毒素のC2 Iとは10%の相同性である。百日咳毒素、大腸菌易熱性エンテロトキシン、コレラ毒素、ボツリヌスC2毒素、ボツリヌスC3毒素、セレウス菌殺虫毒素といった種々のADPリボシル化酵素のアミノ酸配列には芳香族アミノ酸-Arg、芳香族アミノ酸-疎水性アミノ酸-Ser-Thr-Ser-疎水性アミノ酸、Glu/Gln-x-Gluの配列はよく保存されている。この部位はNAD+の結合や触媒活性に関与する共通モチーフと考えられている。さらにADPリボシル化毒素の中で立体構造が明らかになっているジフテリア毒素やコレラ毒素などと比較するとアミノ酸配列に相同性は認められないがADPリボシル化活性に寄与する触媒cavityの構造は著しく類似している。コレラ毒素、百日咳毒素、ジフテリア毒素はA-B毒素として知られている。

イオタ毒素は致死、皮膚壊死活性、細胞毒性などの作用がある。ι毒素はIaとIbの両方の投与で致死作用を示す。すなわちマウスにIa、Ibの静注をするとマウスは死亡する。マウスのいずれかの成分を静注し、120分後に他方の成分を静注しても致死活性が認められる。一方、Iaを投与後、抗Ia抗体、その後Ibを投与すると致死活性は阻害されるが、Ibを投与して、抗Ib抗体、次にIaを投与しても致死活性は阻害されない。モルモット皮膚壊死活性は、Ibを皮下に投与後、Iaを腹腔内投与しても認められるが、この逆の投与は活性を示さない。これらのことから生体内における毒素の作用はIbが特異的な受容体に結合することによって開始することが報告された。かつては、二成分毒素は単独では生物活性は示さないと考えられていたが、IbがVero細胞においてモノマーで細胞膜に結合後、7量体のオリゴマーを形成し、ラフトに集積後Kイオン遊離を誘導すること、さらにIb単独でエンドサイトーシスを誘導して細胞内に進入することが明らかになった。細胞膜上で7量体のオリゴマーを形成し、細胞からカリウムイオンの遊離作用を示すが細胞死は引き起こさない。Iaは筋肉、または非筋肉のGアクチンのArg残基をADPリボシル化する。一方、同じ二成分毒素でADPリボシル化毒素でもあるボツリヌスC2毒素のC2 Iは非筋肉のGアクチンのみをADPリボシル化する。Iaは基質特異性が広いのが特徴である。ADPリボシル化活性はNAD+をニコチンアミドとADP-リボースに水解するNAD+グリコハイドロラーゼ(NADase）