膜電位感受性色素

膜電位感受性色素  は、光学的に膜電位変化を計測するための色素の総称である。膜電位イメージングに用いられる化学小分子型の分子を指す。

イェール大学の Larry Cohen教授のグループによって開発された。この色素を用いれば、生体標本上の多数の領域から膜電位変化を計測できる。

日本においては、開発者のひとりである東京医科歯科大学の神野耕太郎名誉教授が初めて導入し、自前でフォトダイオード、light guide方式、フォトダイオードアレイを用いた測定機器を開発・改良して測定を開始したことに始まる。当初は、心臓や神経系の機能発生・機能形成の研究に応用され、その後、測定システムが市販されたことにより、一般に用いられるようになっている。開発初期の歴史や測定システムの原理に関しては、以下の文献に詳しく解説されている。
神野耕太郎「ニューロン活動の光学的測定の背景と展開」神経科学レビュー 5: 155-187, 1991.
神野耕太郎、佐藤容子、佐藤勝重、持田啓「膜電位感受性色素をもちいた計測と解析法」日本生理学雑誌 61: 95-134, 1999．
Kamino, K.  Personal recollections: Regarding the pioneer days of optical recording of membrane potential using voltage-sensitive dyes. Neurophotonics 2, 021002.
また、以下の英語本に歴史から最新の研究まで詳しく紹介されている。

Membrane Potential Imaging in the Nervous System and Heart. Eds. Canepari, M., Zecevic, D and Bernus, O. Springer-Verlag, New York, 2015.
Larry Cohen教授の功績に関しては、Neurophotonics誌に、"Pioneers in Neurophotonics: Special Section Honoring Professor Lawrence B. Cohen"と題して特集が組まれている。

1. 歴史
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1.1. B. C. 的背景
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生物学、医学における光学的観察あるいは光学的測定の歴史は古いが、神経系の研究へもかなり早くから導入されている。
・1848年にはすでに F. Ehrenbergが神経線維に2つの異なった屈折率があることを見いだしたことを Francis O. Schmitt  が Physiological Reviews誌に発表した総説に引用している。
・さらに、1865年には、Klebsが神経線維のミエリン鞘の偏光性についての論文を発表している。
・この線に沿った研究は、やや間を置いて、1920〜30年代に F. O. Schmittらによってとりあげられた 。これらの研究は、複屈折や偏光性を測定することによって、神経線維やミエリン鞘の微細構造を調べようとしたものである 。しかしながら、1940年代の後半になると、この方向での研究は途切れてしまっている。これは、電子顕微鏡の開発によって微細構造についての研究法がそちらへ移ったためと思われる。
一方、19世紀の終わりごろには、神経活動と関係づけたもう1つの方向での光学的研究がみられる。
・Hodge は、スズメ、ハト、ツバメの生体染色を施した脊髄神経節を連続的に電気刺激して、刺激前後の神経細胞、細胞核、液胞の形や、さらにそれらの色素  による染まり具合を光学顕微鏡で詳細に観察し比較している。
・同じ時期に、Mann  もまた同様の実験をウサギ、イヌの交感神経節を用いて行い、神経活動に伴って細胞や核の大きさが増大すること、またそれらと Methyl blue や Eosinなどとの親和性が変化することを観察している。これらの研究で注目すべきことは、実験を行うにあたって、彼らが、ニューロン活動の根底にあるエネルギー消費が、何らかの形で神経細胞の形態あるいは神経組織の性状の変化に反映されるはずであるという考えを念頭においていることである。
・さらに生体染色法を用いて、神経活動に伴う神経組織の色素による染まり具合を観察している。
その後、今世紀に入って、神経活動とより密接に関連づけた光学的測定がなされている。
・その先駆的役割を果たしたのは、F. O. Schmittと O. H. Schmitt  である。彼らは、偏光顕微鏡に光電子増倍管を取り付けて、ヤリイカ  の巨大神経線維の電気的興奮に伴う複屈折の変化の測定を初めて試みたが、光学的変化を記録することはできなかった。これは、彼らが用いた当時の装置では感度が不足していたことに起因するもので、彼らも論文の末尾で、この失敗は用いられた測定装値の感度が充分でなかったためであり、もっと性能のよい装置を用いれば記録できるはずであると言及している。
・また、もしカニの歩行脚神経を用いておれば、彼らの感度でも光学的変化は記録できたという可能性については、L. B. Cohen  によって指摘されている。
このSchmittらの研究に続いて神経活動の光学的研究は1950年前後に活発に行われている。その中心となったのは、D. K. Hill, R. D. Keynes, J. M. Tobiasである。
・まず、HillとKeynes  は、不成功に終わったSchmittらの試みをうける形で、カニ  の歩行脚神経幹を電気刺激して引き起こされる神経線維の不透明度  の変化の測定を行った。彼らの実験では、タングステンランプから神経線維を垂直方向に白色光で照射し、スリットを通して、神経線維からの透過光  をフォトセルで直接detectしている。これが、現在われわれが用いている光学測定の原型といえる。彼らはこの実験で、1秒当たり50回の電気刺激を5秒から10秒間続け、それに伴う神経線維のopacityの増大を記録することに成功した。神経刺激に伴う光学的変化の記録としては、これがおそらく最初のものである。
・さらに、Hill  は測定装置に改良を加え、カニ  の歩行脚神経線維を電気刺激  することによって、透過光強度が増大することを見いだした。彼は、細胞外液の浸透圧を変えたときの神経線維の透過光の変化も調べ、その結果と照らし合わせて、測定された光散乱の変化は神経線維の直径が大きくなったことによることを示唆した。
・Hill は同様の実験を、イカ  の単一巨大神経線維でも行い、この場合も、電気刺激によって光散乱が増加することを見いだし、これも神経線維の直径が大きくなったことに起因することを示唆した。そして、直径220μmの神経線維を連続して1万回の電気刺激をおこなったとき引き起こされる直径の変化は、約 0.1 であると見積もっている。
・この結果は、その後、Cohenら  の実験によっても支持され、さらに、Terakawa  の、ひと工夫された方法での追試でも確かめられている。
・J. M. Tobiasら  も神経活動に伴う光散乱変化を測定している。Tobias  は刺激電極の陽極側では光散乱強度は小さくなり、陰極側では大きくなることを示し、それは陽極側での神経線維の収縮、陰極側での膨潤に対応することを示している。なお、この時期における光学的測定についてはTobias  による総括的なレビューにまとめられている。
ところが、1950年代の中ごろから1960年代の終わりごろまで、このような光学的測定はほとんど中断された状態になっている。これは、LingとGerard  に始まる微小電極法の導入により、これを用いた電気生理学的研究が神経生理学の中心となったためであろう。

1.2. 1968年の2つの論文
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Schmittらの実験から28年経った1968年になって、光学的測定にとって新しい時代の幕開けともなった重要な2つの論文が発表された。1つは Cohen, Keynes, Hille による論文、もう1つは TasakiとWatanabeら  の論文である。

Cohen LB, Keynes RD, Hille B : Light scattering and birefringence changes during nerve activity. Nature 218 : 438-441, 1968
Tasaki I, Watanabe A, Sandlin R, et al : Changes in fluorescence, turbidity, and bireflingence associated with nerve excitation. Proc Natl Acad Sci. 61 : 883-888, 1968
・Cohenらはカニの歩行脚神経とヤリイカ  巨大神経線維で、単一の活動電位に伴う光散乱  および複屈折  の変化を記録することに初めて成功した。その変化は、Schmittらが予想したように非常に小さく背景光に対して10-6～10-5 のオーダーで、CAT  を用いて25～200回の掃引を加算することによって記録された。
・一方、TasakiとWatanabeらもまた、ヤリイカ  の巨大神経線維で、活動電位に伴う複屈折変化と神経線維に吸着させたANS  の螢光変化を記録した。
この2論文が現在のニューロン活動の光学的測定の発火点ともなった。
ところで、これら2つの研究は、当初、HodgkinとHuxley  による神経興奮についてのナトリウム説とその現象論的定式化の後をうけて、神経興奮の膜分子レベルでのメカニズムを探る目的で始められたものであった。実際、Tasakiらが用いたANSは、それまでにWeberとLaurence  により、蛋白質の高次構造変化の研究に導入された疎水性プローブである。したがって、得られた光学的シグナルは、興奮に直接関係した膜分子のconformationalな変化を反映したものであることが期待され、その面から興味をもたれたのである。特に、日本ではこの傾向が強く支配した。
しかしながら、Cohenらは、その論文の中で、
「膜電位固定の実験で複屈折変化の時間経過が膜電位変化と同じであり、電流の時間経過とは対応性が見いだされない」
ことを示し、
「複屈折変化が、ほとんど膜電位変化に依存したものである」
ことを指摘している。ここには、すでに「膜電位の光学的測定」の伏腺が見え隠れしている。なお、Cohenら  はシビレエイの発電器官のシナプス前線維を電気刺激して、発電器官の90°方向の光散乱に2相性の変化が現れることを見いだし、これはシナプス伝達を反映した光学的変化であることを示唆している。シナプス機能の光学的測定のはしりである。

1.3. 膜電位感受性色素の探索
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複屈折と光散乱変化の膜電位依存性成分を検討したCohenら  はイカ巨大神経線維の膜電位固定法の実験によりANSとTNS  の螢光変化と膜電位との関係も詳しく調べた。その結果、ANS, TNSの螢光変化も、
「コンダクタンスの増大に対する構造的基礎を与えるものでなく、膜電位の変化によって引き起こされた膜構造の二次的変化についての情報を与えているに過ぎない」
と示唆した 。これは興奮のメカニズムと関係する膜分子のconformationの変化を反映しているとするTasakiら  の主張とは対立するもので、両グループ間で激しい論争が引き起こされた。Cohenのグループはさらにいろいろな色素について調べたが、結局、コンダクタンスの変化を反映するような色素を見いだすことはできず、観測された螢光変化はすべて膜電位を直接コピーしているだけであるという結果のみが得られたのである。

これらの実験の過程で、特にMerocyanine 540がイカ巨大神経線維の活動電位に伴って静止電位に対して 10-4 のオーダーという極めて大きな螢光変化を示すことが見いだされた。さらに、この色素で、螢光だけでなく、活動電位に伴って吸光変化もまた大きく変化することが示された 。
このような一連の実験結果から、
「膜電位に感受性を持つ色素  を膜電位のプローブ として膜電位を光学的に測定する方法」
のアイデアがはっきりとした形となり、Cohenの研究室で、まず、ポテンシャル・プローブとしてできるだけすぐれた膜電位感受性色素の探索が始められたのである。ここに至るまでのいきさつについてはCohen , Cohen and DeWeer , Cohen and Salzberg  による総説に詳しく述べられている。
色素のスクリーニングが始められたとき、色素の化学構造とか物理化学的性状と膜電位感受性色素との相関性はもとより、どのような、そして、どれくらいの色素が膜電位に感受性を示すのか、皆目わからなかった。そこで、Cohenらは、ありとあらゆる色素を枚挙的に網羅してスクリーニングテストするという方法をとった。ヤリイカの巨大神経線維をいろいろな色素で染色し、それに膜電位固定を行い、それに伴う吸光、螢光の変化を測定して、膜電位変化に対する感受性がテストされた。そして、得られたデータから色素の構造と膜電位感受性との相関性を類推しながら、新しい色素を試行錯誤的にデザインし、それを合成して、ヤリイカの神経線維でテストを繰り返し、そこから得られた結果に基づいて、さらに新しい色素を合成していくという方法で進められた 。
新しい色素の合成は A. S. Waggonerの研究室と日本感光色素研究所の協力を得てなされた。1,000種類以上の色素がスクリーニングテストにかけられ、まずmerocyanine-rhodanine系 , merocyanine-oxazolone系  色素が選び出された。その際、色素の選定基準としては、

信号対雑音比  が大きい、
背景光に対する光学的変化ができるだけ大きい、
神経線維に対する薬理的、光化学的毒性ができるだけ小さいか無視できる、
色素の退色時間ができるだけ長いということと、
膜電位変化に対する応答時間が短いということがあげられた。色素の毒性や光化学的影響は光学的測定で深刻な問題であり、これについては、膜電位固定したときの内向き電流、いわゆるNa電流が減衰する時間を調べることによって厳しくテストされた。その結果、Merocyanine 540は大きなシグナルが得られるにもかかわらず、光化学的毒性が大きいことから , 膜電位測定用のプローブとして適していないと判定された。しかし、この色素が見いだされたことが膜電位に高感受性をもつmerocyanine-rhodanine系やmerocyanine-oxazolone系色素の合成につながったのである。その後も、主として、Grinvaldの研究室で、Rina Hildesheimにより色素の合成が続けられ、merocyanine系色素に加えて、現在用いられているoxonol系、styryl系色素が選びだされた 。色素についてはまだ改良すべき多くが残されており、その探索は現在も続けられている。

2. 性質
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2.1. 色素の分類
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膜電位感受性色素は、膜電位変化に対する応答時間に応じて、fast-response dyesとslow-response dyesの2つに分類される 。また、slow-response dyesをdistributing dyesと呼ぶこともある。。研究の初めの段階では、merocyanine系がfast-response dyesに、cyanine系、oxonol系がslow-response dyesに属し、前者は局在化した陰性電荷をもち、後者は非局在性の陽性電荷をもつと単純に定義づけられたが 、その後、新しい膜電位感受性色素の開発合成に伴って、この概念には修正が加えられた。

fast-response dyes : これにはmerocyanine系に加えて、oxonol系、styryl系のいくつかの色素が属する。膜電位変化に対する応答時間は5.0μ秒以下でかなり短く、活動電位を充分にモニターすることができる。merocyanine系、oxonol系は吸光変化が大きく、styryl系は螢光変化が大きい。なお、これに属する色素は膜に対して非透過性である。 slow-response dyes : 膜電位に対する応答時間が秒のオーダーで比較的長く、cyanine系色素とoxonol系のいくつかがこれに属する。活動電位のような迅速な膜電位変化をモニターするのには適していないが、ゆっくりした膜電位変化の測定に用いられている。これに属する色素は膜に対して透過性を示す。神経系ではシナプトソームやシナプス小胞での膜電位測定に用いられている 。

2.2. 膜電位の対応性
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吸光および螢光シグナルの大きさは通常、おのおのの背景光、すなわち静止電位での螢光強度および吸光度 との変化分 との比、すなわちfractional changeで表す。実際には、吸光変化は入射光に対し前方方向での透過光の変化として推定されることになる。したがって、透過光の増大は吸光の減少に、透過光の減少は吸光の増大に対応する。
光学的シグナルは電極を用いて記録される活動電位とほとんど同じ時間経過と同じ形状を示す。このことだけからも、光学的変化が活動電位をよくコピーしていることがわかるが、膜電位と光学的変化の直接的な対応関係は、ヤリイカ巨大神経線維での膜電位固定法を用いた実験によって詳細に検討された 。膜電位感受性色素で染色したヤリイカ巨大神経線維を膜電位固定して、膜電位、膜電流、吸光、および螢光を同時記録すると、光学的変化は膜電位を脱分極、過分極側いずれに固定した場合でもみられ、変化の方向は逆であるが、変化の大きさは等しく対称性を示す。しかしながら、先にもふれたように、膜電流との対応性は全くみられず、光学的変化が過分電極側への膜電位変化に対しても脱分極の場合と同じように現れることが、光学的変化はコンダクタンスの変化には依存せず、興奮のメカニズムとは関係がないということの根拠になった。
また、膜に対して非透過性の色素であるfast-response dyesでは神経線維の外側から染色した場合と内側から染色した場合とでは、吸光あるいは螢光変化の方向は逆になる 。この場合も脱分極側、過分極側への電位変化に対する吸光、螢光の変化の方向の対称性はくずれない。
膜電位をいろいろなレベルに固定し、これに合わせて、測定された吸光、螢光の変化を膜電位に対してプロットすると、静止電位から±100mVぐらいの範囲では光学的変化と膜電位は近似的に直腺関係で対応づけられる。Tasakiら  はTNSを用いた実験ではこのような直接関係は脱分極側ではくずれると報告したが、その後の実験では , 直線関係が得られている。また、このような光学変化と膜電位間の直接関係はイカ神経線維以外でも確かめられた 。

2.3. 波長スペクトル
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膜電位依存性の色素の吸光や螢光の変化は、通常、可視波長で観測され、色素の種類により特有の波長スペクトルを示す。
・一般的に螢光色素は膜と結合することにより、その螢光強度の増強がみられ、色素によっては長波長側へシフトするものもある。
・吸光の場合は、色素自体の吸光スペクトルと膜電位依存性の吸光変化のスペクトルは必ずしも一致しない。
・さらに、これらの波長依存性は、神経細胞とか筋細胞というような膜の種類、あるいは両棲類や哺乳類などの用いる生物の種によっても違いがみられる 。Merocyanine-oxazolone系色素  の吸光スペクトルがヤリイカの神経線維と心筋では異なることを見いだされている。
このようなスペクトルの性状は膜の構成要素の微細な違いを反映しているものと考えられる。

2.4. メカニズム
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膜電位感受性色素の光学的変化のメカニズムについての研究は、生理学的研究と直結するものではないが、よりすぐれたポテンシャル・プローブとしての色素をデザインして、開発、合成するという面から重要である。そのメカニズムについては、すでにRossら , TasakiとWarashina , WaggonerとGrinvald  およびDragstenとWebb  によって論じられてきてはいるが、まだ完全に解明されているわけではない。
活動電位のような迅速な電位変化をモニターする、いわゆるfast-response dyesについては、可能性の大きい仮説として、現在、次の2つが提出されている。

その1つは、A. S. Waggoner  により提出されたもので、細胞膜に吸着した色素分子は、モノマー ダイマーの平衡状態にあり、静止電位の状態ではこの平衡はダイマーの方向へ傾いている。膜が脱分極状態となると、平衡はモノマーの方向へ移る。これに続いて色素の発色団  は双極子のようにふるまって回転し、その配列を変える。これに伴って色素の吸光スペクトルの移動や螢光の変化が引き起こされると考えるのである。実際、merocyanine-rhodanine系色素で染色したイカ巨大神経線維の実験で、神経線維の軸に対して垂直偏光で入射した場合と平行偏光で入射した場合とでは吸光変化のスペクトルに大きな違いがみられる 。これは色素の発色団の回転と再配列の可能性を示唆している。Merocyanine-rhodanine系色素を用いた実験でも、ローダニン核についたアルキル基の長さと吸光変化との間に関係があること、分子吸光係数の大きい色素が膜電位依存性の吸光変化も大きいという結果が得られている 。
もう1つは、Loew  によって提出されたもので、electrochromism effect, すなわち色素の発色団における電荷移動  によって説明しようとするものである。これは主として、styryl系色素について考察が進められている。膜に吸着した色素で、膜をはさんで電場がない場合、励起光によって発色団の荷電状態に変化が引き起こされ、放射光によってその荷電状態は可逆的に変化する。膜に電場がかかったとき、すなわち、電位差があると、それは荷電の移動を阻止するように働くため、荷電移動を引き起こすためには余分な励起光あるいは放射光を必要とすることになる。Loewのグループ  は、このメカニズムに基づいて、より高感度の膜電位感受性をデザインすることを試みている。このようなelectrochromism effectによる光学的な変化は0.1μ 秒以下の時間内に起こるはずである。ところが、merocyanine系での膜電位変化に対する応答時間は2.0-5.0μ秒ぐらいであり、electrochromismによる電荷移動の仮定をそのままmerocyanine系に適用することは難しい。さらに色素開発の発展に伴い、上記以外のメカニズムに基づく様々な膜電位感受性色素が登場している。膜電位イメージングに詳細されている。

3. 膜電位感受性色素の具体例
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これまで、様々な膜電位感受性色素が開発されてきた。以下はその具体例である。

【参考】

　　 Recent review: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1367593116300795

　　 Historical overview: https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-319-17641-3_1#Sec35

　　 List: http://square.umin.ac.jp/optical/optical/dye.html

3.1. DiO/DPAペア
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DiO/DPAペアは、FRETに基づく膜電位感受性色素の一種である 。

まず、蛍光分子DiOと、クエンチャーであるDPAを細胞へ同時に導入する。DPAはアニオンであるため、膜電位に応答して細胞膜の内膜・外膜間を移動する。DiOと内外膜を移動するDPAの距離によってFRET効率が変化し、膜電位がDiOの蛍光強度へ反映される。

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