DNAシークエンシング

DNA 塩基配列決定  とは、DNAを構成するヌクレオチドの結合順序を決定することである。単にシークエンシングやシーケンシングとも呼ばれる。DNAは生物の遺伝情報を担う分子であり、基本的にはATCGの4種類の塩基からなる配列の形で符号化されている。そのため、DNAシークエンシングによりこの塩基の順序を調べることは、遺伝情報を解析する上で基本となる手段である。今日では配列決定はミクロなレベルの生物学の基盤となっているのみならず、分類学や生態学のようなマクロな生物学でも盛んに応用されている。また医学面でも遺伝病や感染症の診断や治療法の開発などに役立っている。

手法としては、1977年に開発されたサンガー法やその改良法が長らく主流であったが、サンガー法とは異る原理に基づく手法も提唱されており、実用化されている。ウォルター・ギルバートとフレデリック・サンガーは、DNAシークエンシングの手法を開発した功績により、1980年のノーベル化学賞を受賞している。

1. 応用先
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DNAシークエンシングは、生物の個々の遺伝子、より大きな遺伝子領域、染色体、またはゲノム全体の配列を決定するために使用される。

またオープンリーディングフレームを介してRNAやタンパク質の塩基配列を間接的に調べる最も効率的な方法でもある。この技術は、医学、科学捜査、人類学、生物学やその他の科学の多くの分野で重要な技術となっている。

1.1. 分子生物学　
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分子生物学の分野ではシークエンシングは、分子生物学においてゲノムとそれが生み出すタンパク質の研究に用いられる。シークエンシングで得られた情報をもとに、研究者は遺伝子の変化、病気や表現型との関連性を明らかにし、薬剤のターゲットとなるものを特定できる。

1.2. 進化生物学　
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進化生物学の分野ではDNAの塩基配列情報は世代間の情報伝達を行う物質であるため、異なる生物同士の関係やどのように進化してきたかの手がかりとなる。 2021年2月、最も古い生物のシークエンシングとして、100万年以上前のマンモスをシークエンシングしたことが報告されている。

1.3. メタゲノミクス　
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メタゲノミクスでは、水、生活排水、汚泥や大気中からろ過したゴミ、生物から採取したスワブサンプルに存在する生物の同定を行う。 特定の環境にどのような生物が存在するかを知ることは、生態学、疫学、微生物学、その他の分野の研究に不可欠である。シークエンシングによって、マイクロバイオームにどのような種類の微生物が存在するかを調査できる。

1.4. ウイルス学　
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ウイルス学で対象とするウイルスは小さすぎて光学顕微鏡で見ることができないため、シークエンシングはウイルスを同定する方法のひとつとなっている。 ウイルスのゲノムはDNAまたはRNAで構成されているが、RNAウイルスは臨床サンプル中での劣化が早いため、シークエンシングは速やかに行う必要がある。 高速でシークエンシングを行えるNGSは、基礎研究や臨床研究におけるウイルスの塩基配列同定に用いられるほか、新興ウイルス感染症の診断、ウイルス病原体の分子疫学、薬剤耐性検査などにも用いられる。GenBankには230万以上ウイルス配列が登録されている。

1990年に発生した鳥インフルエンザでは，ウイルスの塩基配列からインフルエンザの亜型がウズラと家禽の間の再交配によって発生したことが判明した。これを受けて香港では、生きたウズラと家禽を一緒に市場で販売することを禁止する法律が制定された。 ウイルスシークエンシングは、分子時計の手法を用いてウイルスの発生時期を推定するのにも利用されている。

1.5. 医学　
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患者に遺伝性疾患のリスクがあるかどうかを判断するために、遺伝子を調査する方法がある。これは遺伝学的検査の一種だが、遺伝学的検査の中には詳細なDNA配列までは必要としないものもある。 DNAシークエンシングは、バクテリアを特定してより正確な抗生物質治療を可能にし、バクテリアが抗菌剤耐性を生み出すリスクを軽減できると考えられている。

1.6. 科学捜査　
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法医学的な身元確認や父子鑑定には、DNA型鑑定とともにDNA塩基配列を用いることがある。指紋、唾液、毛根などに含まれるDNAを抽出し、塩基配列の特定の特徴的な領域から人物を特定する技術である。

2. 各決定方法
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2.1. DNA断片長による方法
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現在主流となっているのは、塩基依存的にDNA断片を作製し、その長さを比べることで塩基の順序を知る方法である。例えば4種類の塩基に対応してサンプルを1回ずつ切断した結果、右表のような長さの断片ができたとする。この場合、断片長が短い方から並べ直したGTCTGAAACATGATTが、元々のDNAの塩基配列だったということになる。この方法では、どのように「塩基依存的」なDNA断片を作製するかという反応の部分と、どうやってその長さを調べるかという検出の部分に鍵がある。

例: 元の配列 GTCTGAAACATGATT
アデニンで切断した場合[06] GTCTGA - AACATGATT[07] GTCTGAA - ACATGATT[08] GTCTGAAA - CATGATT[10] GTCTGAAACA - TGATT[13] GTCTGAAACATGA - TT
グアニンで切断した場合[01] G - TCTGAAACATGATT[05] GTCTG - AAACATGATT[12] GTCTGAAACATG - ATT
シトシンで切断した場合[03] GTC - TGAAACATGATT[09] GTCTGAAAC - ATGATT
チミンで切断した場合[02] GT - CTGAAACATGATT[04] GTCT - GAAACATGATT[11] GTCTGAAACAT - GATT[14] GTCTGAAACATGAT - T[15] GTCTGAAACATGATT

上記の切断した配列を短いほうから並べなおし、切断した塩基で読むと元の配列が分かる。[01] G[02] GT[03] GTC[04] GTCT[05] GTCTG[06] GTCTGA[07] GTCTGAA[08] GTCTGAAA[09] GTCTGAAAC[10] GTCTGAAACA[11] GTCTGAAACAT[12] GTCTGAAACATG[13] GTCTGAAACATGA[14] GTCTGAAACATGAT[15] GTCTGAAACATGATT
-[01]G [02]T [03]C [04]T [05]G [06]A [07]A [08]A [09]C [10]A [11]T [12]G [13]A [14]T [15]T

2.1.1. 反応
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2.1.1.1. 酵素法
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これはDNA複製酵素であるDNAポリメラーゼを用いて末端が特定の塩基に対応するDNA断片を合成する方法である。まずプライマーとして配列を読みたい1本鎖DNAの特定の位置に相補的なオリゴヌクレオチドを使うことで、DNA合成の開始点を1ヶ所に決める。そこからDNA合成を始めて、それぞれの塩基に対応する位置で合成が止まる様な反応系を使うことで、塩基特異的なDNA断片が得られる。もともとフレデリック・サンガーが中心になって開発したためサンガー法と呼ばれているが、長年にわたって改良が続けられているため必ずしも明確な表現ではない。ここでは改良されていく一連の方法の総称として用いることにする。

サンガーはまず1975年にプラスマイナス法

と呼ばれるやや複雑な方法を発表した。これは短時間の単なるDNA合成をした後で、4種類のデオキシリボヌクレオチドのうち1種類だけを欠く反応系で合成を再開し、その結果から配列を解読する方法である。最初に普通のDNA合成をしているので、この段階では合成したDNAの長さはランダムになっている。そこからたとえばdATPのみを欠く系で合成を再開すると、必ずアデニンを組み込むべき位置で反応が止まる。したがって得られたDNA断片は様々な長さのものがあるがランダムではなく、アデニンに対応した断片が得られる。同様に、dGTPのみ、dCTPのみ、dTTPのみを欠く系を用いることで、塩基特異的なDNA断片を得ることができる。原理的にはこれだけで配列が読めるはずだが、実際にはうまく読めない部位がでてしまうため、1種類のデオキシリボヌクレオチドだけを加えた系を4つ追加して、全部で8つの反応系の組み合わせで配列を読む煩雑な方法であった。

サンガーらがこれを改良して1977年に発表した方法

が、ジデオキシ法、ないし鎖停止法と呼ばれ広く知られているものである。これは4つの通常のDNA合成系を用意し、そこに低濃度の鎖停止ヌクレオチドを加えて反応させるようにしたものである。ターミネーターは4種のジデオキシヌクレオチド  のうちそれぞれ1種類だけを用いる。DNAポリメラーゼは鋳型配列に対応するデオキシリボヌクレオチドを取り込みながらDNAを合成していくが、ときどき対応するターミネーターを取り込んで反応がそこで止まってしまうことが起きる。結果的に使ったターミネーターの塩基に対応する様々な長さのDNA断片が生じることになる。例えばターミネーターとしてddATPを加えた系では、生じたDNA断片の3'末端の塩基はアデニンになるという具合である。これならば最初に単なるDNA合成をする必要がないし、4つの反応系だけできちんと配列が確定できる。

サンガー法は後にポリメラーゼ連鎖反応  が開発されたことでさらに効率化された。PCRでは2本鎖DNAを高温で変性させてから温度を下げてプライマーを結合させてDNAを合成し、そのあと再び高温で変性させて鋳型DNAを再利用することができる。この発想をサンガー法と組み合わせることで、比較的少ない量の二本鎖DNAから反応を始めることができるようになった。この方法を特にサイクルシークエンス法と呼ぶ。

元々はデオキシリボヌクレオチドに放射性標識しておき、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により断片長に応じて分離して、オートラジオグラフィーにより検出していたが、その後、蛍光標識やキャピラリー電気泳動といった技術を取り込むことで飛躍的に発展した。

サンガー法は酵素反応に依存しているため、PCRと似たような問題点が出ることがある。プライマーによって反応の開始点を決めるので、プライマーの特異性が低いと複数の配列を同時に読むことになり配列を決定できない。これはプライマーを結合させる温度が高くなるように設計することで改善できることがある。また反応系にRNAが混じっているとそれがプライマーとして働いて配列が読めなくなることがある。GC比が高かったり反復配列や二次構造を取りやすい配列があると、そこでDNAポリメラーゼの反応が止まりそれ以降の配列が得られないことがある。これに関しては複製系ではなく翻訳系を用いた同様のシステムで解決することがある。

2.1.1.2. 化学分解法
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アラン・マクサムとウォルター・ギルバートが1977年に報告した

手法で、マクサム－ギルバート法ないしギルバート法と呼ばれる。DNA断片中の特定の塩基を試薬により修飾することで、その部位のリン酸ジエステル結合が切れやすくなることを利用している。試薬の作用条件を調節することでDNA断片1分子あたり平均1ヶ所だけが修飾されるようにすると、特定の塩基で切断された様々な長さのDNA断片を得ることができる。配列を決定したいDNA断片の端を32Pやビオチン、蛍光色素などで標識しておき、フィルムを感光させたり酵素的に色素生成させて検出する方法が一般的である。

元々は以下のような試薬を利用した組み合わせで判別していた。ほかにも様々な塩基特異的な切断反応が考案されている。

ジメチル硫酸プリン塩基