２の３　スクリーニング法（ヨーネ病診断用リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応キット（インターナルコントロールを用いるものに限る。）による方法）による検査の場合
一　ヨーネ菌核酸抽出試薬を用いて、検体の
糞
ふん
便から
糞
ふん
便抽出ＤＮＡ液を作製すること。
二　〇・二ミリリットル容量のＰＣＲ用チューブ又はＰＣＲ用九十六穴プレートを用いて、リアルタイムＰＣＲ反応液（ＤＮＡポリメラーゼ、ウラシル―Ｎ―グリコシラーゼ、リボヌクレアーゼフリー水、インターナルコントロール、プライマーを含むものをいう。以下この号において同じ。）〇・〇四五ミリリットルに一で作製した
糞
ふん
便抽出ＤＮＡ液〇・〇〇五ミリリットルを混合したもの（以下この項において「検体調整液」という。）、リアルタイムＰＣＲ反応液〇・〇四五ミリリットルに指示陽性ＤＮＡ液〇・〇〇五ミリリットルを混合したもの及びリアルタイムＰＣＲ反応液〇・〇四五ミリリットルに指示陰性液〇・〇〇五ミリリットルを混合したものを、それぞれ調整すること。
三　二のチューブ又はプレートをリアルタイムＰＣＲ装置により、四十度の温度で十分間、九十五度で十分間感作した後、九十五度の温度での三十秒間及び六十八度の温度での一分間の感作を四十五回繰り返すこと。
四　三の感作後に、二の検体調整液の蛍光強度が上昇したもののうち、六十度から九十八度までの間で解離曲線解析を行つて検体調整液が陽性解離温度を示した検体を陽性とし、陰性解離温度を示した検体を陰性とすること。
３　リアルタイムＰＣＲ法（ヨーネ病診断用リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応キット（プローブを用いるものに限る。）による方法）による検査の場合
一　ヨーネ菌核酸抽出試薬を用いて、検体の
糞
ふん
便から
糞
ふん
便抽出ＤＮＡ液を作製すること。
二　リアルタイムＰＣＲ反応液（ＤＮＡポリメラーゼ、ウラシル―Ｎ―グリコシラーゼ、インターナルコントロール、プライマー、プローブを含むものをいう。以下この号において同じ。）〇・〇四五ミリリットルに一で作製した
糞
ふん
便抽出ＤＮＡ液〇・〇〇五ミリリットルを混合したもの（以下この項において「検体調整液」という。）、リアルタイムＰＣＲ反応液〇・〇四五ミリリットルに指示陽性ＤＮＡ液〇・〇〇五ミリリットルを混合したもの（以下この項において「指示陽性調整液」という。）及びリアルタイムＰＣＲ反応液〇・〇四五ミリリットルに指示陰性液〇・〇〇五ミリリットルを混合したものを、それぞれ〇・二ミリリットル容量のＰＣＲ用チューブ二本又はＰＣＲ用九十六穴プレートの二穴に〇・〇二五ミリリットルずつ分注すること。
三　二のチューブ又はプレートをリアルタイムＰＣＲ装置により、五十度の温度で二分間、九十五度の温度で十分間感作した後、九十五度の温度での三十秒間及び六十八度の温度での一分間の感作を四十五回繰り返すこと。
四　三の感作後に、二の検体調整液が分注されたチューブ一本又はプレート一穴以上で陽性反応検出用波長の蛍光強度が上昇した検体をＤＮＡ陽性とし、二の検体調整液が分注されたチューブ二本又はプレート二穴で陰性反応検出用波長の蛍光強度が上昇した検体をＤＮＡ陰性とすること。
五　四でＤＮＡ陽性となつた検体について、指示陽性調整液を用いた用量―反応式からヨーネ菌ＤＮＡ濃度を計算し、検体調整液〇・〇二五ミリリットル中のＤＮＡ量が〇・〇〇一ピコグラム以上と判定された検体を陽性とし、それ以外の検体を陰性とすること。
４　ヨーニン検査の場合
一　ヨーニンの注射後四十八時間から七十二時間までの間における腫脹の差を測定すること。
二　注射前における注射部位の皮膚の厚さの測定と注射後における注射部位の皮膚の厚さの測定は、やむをえない事由がある場合のほかは同一人が行うこと。
５　補体結合反応検査の場合
十六時間から二十時間までの間四度から七度までの温度で感作した希釈血清（非働化血清を生理食塩液で五倍、十倍及び二十倍に希釈し、これらに等量の抗原とあらかじめ二単位となるように検定した倍量のモルモット補体を加えたもの）に三パーセントめん羊感作血球液（あらかじめ検定した三単位の溶血素液と三パーセントめん羊血球液を同量混和したもの）を加えて、三十分間三十七度の温度で感作した後の溶血の程度により抗体価を測定すること。
６　ヨーネ病の疑似患畜については、細菌検査（分離培養）又はリアルタイムＰＣＲ法による検査を実施すること。
１　次のいずれかに該当するものは、ヨーネ病の患畜とする。
一　慢性で頑固な水様性下痢、栄養不良、泌乳量の低下等の臨床症状を示し、細菌検査（直接鏡検）で集塊状の抗酸菌が証明されたもの
二　細菌検査（分離培養）において菌分離陽性となつたもの
三　リアルタイムＰＣＲ法による反応が陽性となつたもの
四　方法の欄の５の検査によりヨーネ病にかかつている疑いがあると診断できるもの
２　次のいずれかに該当するものは、ヨーネ病の疑似患畜とする。
一　ヨーニンの反応で腫脹の差が二ミリメートル以上であるもの
二　補体結合反応法による抗体価が五倍希釈血清以上であるもの
３　１及び２に該当しないものは、ヨーネ病の患畜又は疑似患畜でないものとする。
伝達性海綿状脳症
１　エライザ法による検査
２　ウエスタンブロット法による検査及び免疫組織化学的検査
エライザ法による検査の反応が陰性でない場合に実施する。
３　エライザ法による検査、ウエスタンブロット法による検査及び免疫組織化学的検査以外の検査
一　疫学的検査
二　臨床検査
１　エライザ法（サンドイッチ酵素抗体法（牛海綿状脳症診断用酵素抗体反応キットを使用して行うものに限る。）による方法）による検査の場合
一　緩衝液で所定の倍数に希釈した延髄の
閂
かんぬき
部を含む脳乳剤とプロテイナーゼＫを混合し、十分間三十七度の温度で保温した後、濃縮し、五分間百度の温度で処理すること。
二　抗プリオン蛋白質抗体を固相化した検査用プレート（以下「ＴＳＥ診断プレート」という。）に一により調整した被検検体を緩衝液で所定の倍数に希釈し、当該検体を分注した後、密封し、七十五分間三十七度の温度で感作した上、洗浄液で洗浄すること。
三　二により処理したＴＳＥ診断プレートに酵素標識抗体液（使用する直前に調整したもの）を分注した後、密封し、一時間四度の温度で感作すること。
四　三により感作したＴＳＥ診断プレートを洗浄液で洗浄し、これに基質溶液（使用する直前に調整したもの）を分注した後、遮光して三十分間室温で感作し、反応停止液を分注し、所定の波長で測定した吸光度値により判定すること。
五　吸光度値が陰性対照の平均吸光度値に所定の値を加えた値（以下この項、第三項及び第四項において「カットオフ値」という。）の九十パーセント以上であるものを再検査することとし、カットオフ値の九十パーセント未満であるものを陰性とすること。
六　五により再検査することとなった検体のサンプルについてＴＳＥ診断プレートの二穴を利用して再検査を実施し、二穴のうちいずれかの吸光度値がカットオフ値の九十パーセント以上であるものを陽性とし、二穴ともカットオフ値の九十パーセント未満であるものを陰性とすること。
２　エライザ法（サンドイッチ酵素抗体法（アビジン―ビオチンカップリング法）による方法）による検査の場合
一　プレートにプロテイナーゼＫが分注された緩衝液で所定の倍数に希釈した延髄の
閂
かんぬき
部を含む脳乳剤を分注した後、密封し、十二分間から十六分間までの間十七度から二十七度までの温度で振とうした後、二十八分間から三十二分間までの間四十度から四十四度までの温度で振とうし、当該プレートに消化停止薬を分注すること。
二　一により調整した被検検体を密封し、二十八分間から三十二分間までの間十七度から二十七度までの温度で振とうした後、ストレプトアビジンを固相化した検査用プレート（以下「ストレプトアビジン固相プレート」という。）に当該検体を分注すること。
三　二により処理したストレプトアビジン固相プレートに検出用溶液を分注した後、密封し、五十五分間から六十五分間までの間十七度から二十七度までの温度で振とうすること。
四　三により処理したストレプトアビジン固相プレートを洗浄液で洗浄し、これに基質溶液を分注した後、密封し、八分間から十二分間までの間十七度から二十七度までの温度で振とうし、反応停止液を分注し、所定の波長で測定した吸光度値により判定すること。
五　吸光度値が、陰性対照の中央値に所定の値を乗じて得た値に所定の値を加えた値（以下この項において「カットオフ値」という。）以上であるものを再検査することとし、カットオフ値未満であるものを陰性とすること。
六　五により再検査することとなった検体のサンプルについてストレプトアビジン固相プレートの二穴を利用して再検査を実施し、二穴のうちいずれかの吸光度値がカットオフ値以上であるものを陽性とし、二穴ともカットオフ値未満であるものを陰性とすること。
３　エライザ法（サンドイッチ酵素抗体法（ワンステップ測定法）による方法）による検査の場合
一　緩衝液で所定の倍数に希釈した延髄の
閂
かんぬき
部を含む脳乳剤をデオキシリボヌクレアーゼⅠ及びコラゲナーゼで処理し、プロテイナーゼＫと混合し、三十分間三十七度の温度で保温した後、濃縮し、五分間百度の温度で処理すること。
二　ＴＳＥ診断プレートに一により調整した被検検体を緩衝液で所定の倍数に希釈し、当該検体を分注すること。
三　二により処理したＴＳＥ診断プレートに酵素標識抗体液を分注した後、密封し、一時間三十七度の温度で感作すること。