Es en el siglo XVI cuando se llevan a cabo las obras más significativas, la construcción de la iglesia Jerónima, de la que se conserva una interesante portada plateresca en la Casa de Cervantes de Valladolid, el levantamiento del claustro con tres alturas y demás dependencias monacales, completándose el complejo, con la reforma de un palacio, como residencia temporal para los señores de Cuéllar, los Duques de Alburquerque, gozando durante siglos del patronato del monasterio.