Aprendió el guaraní y, empezando por la isla de Martín García, intervino en varias expediciones de exploración y en la conversión de numerosos indígenas; cuando murió el Adelantado Ortiz de Zárate en 1576 y fue reemplazado interinamente por Diego de Mendieta, dejó este cargo, al parecer porque entre Mendieta y Martín del Barco existía cierta tirantez nacida de viejas rencillas o malentendidos (le procesaron como conspirador el primer año de gobierno rioplatense de Mendieta, en 1576).