Químicamente, la reacción implica la oxidación del carbonilo del gliceraldehído-3-fosfato hasta un carboxilo, lo que es exergónico en condiciones estándar; en la reacción "in vivo", en la que se aprovecha esta energía para generar un compuesto de alta energía, en cambio, la reacción es ligeramente endergónica, pues parte de esta energía queda almacenada en un grupo acil-fosfato, o anhídrido de ácido carboxílico-fosfórico, que posee una energía libre estándar de hidrólisis de ΔG = -49,4 kJ/mol.