Preconizó la división de la octava en doce intervalos y, aunque Pietro Aaron haya sido probablemente quién describió una forma de temperamento mesotónico, es Zarlino quién parece haber sido el primero en hacerlo de manera precisa, explicando en detalle el temperamento a los 2/7 coma en su obra de 1558, "Istitutioni harmoniche".