La ADN ligasa no puede unir dos moléculas de ADN de cadena sencilla (ADN con una sola cadena) ni formar un ADN circular de cadena sencilla sino que su función es sellar las roturas que han tenido lugar en las moléculas de ADN de doble cadena (ADN con dos cadenas enrolladas en forma de doble hélice) en el momento de la separación de la doble hélice.