Con respecto a la decadencia sufrida por el colegio, se puede afirmar que la falta de recursos económicos causada por el retiro del apoyo político y eclesiástico a la muerte de Carlos I y de Luis de Velasco —sumada a la oposición, a los cambios de objetivos y de administración, y la despoblación estudiantil debido a las enfermedades epidémicas— explica por qué el Colegio de Santa Cruz de Tlatelolco dejó de funcionar como una escuela de educación superior hacia finales del siglo XVI.