Padalecki comenzó a tener interés en la actuación a los 12 años y tras graduarse de la secundaria, se mudó a Los Ángeles, California, donde consiguió contratos y saltó a la fama en el año 2000 con su papel en la serie "Gilmore Girls" y apareciendo en películas como "New York Minute" (2004) y "El vuelo del Fénix" (2004).