No obstante, hay tres reacciones de la glucólisis que son prácticamente irreversibles in vivo y que no pueden utilizarse en la gluconeogénesis: la conversión de glucosa 6-fosfato por la hexoquinasa, la fosforilación de la fructosa 6-fosfato a fructosa 1,6-bifosfato por la fosfofructoquinasa-1 y la conversión del fosfoenolpiruvato a piruvato por la piruvato quinasa.