Juan de Padilla nació en el seno de una familia hidalga toledana el 10 de noviembre de 1490, hijo de Pedro López de Padilla, regidor de Toledo, y su mujer Mencía Dávalos, sobrino por tanto también de Gutierre de Padilla, comendador mayor de Calatrava, y Diego López de Padilla, mariscal de Castilla.