Una vez anestesiado el lugar de punción, se inserta una aguja con un mandril en su interior (aguja de punción lumbar) entre las vértebras lumbares L3 y L4 (o L4 y L5), lugares escogidos debido a las facilidades anatómicas que posee la columna a ese nivel y a que la médula termina entre L1 y L2 en adultos, y entre L2 y L3 en niños, hasta llegar al canal raquídeo (espacio subdural).