Durante el siglo XVI se van adoptando en la Orden diversas medidas disciplinares y legislativas con la intención de dar vida a los deseos de reforma de algunos trinitarios, cuyo ápice se encontrará la reforma de Juan Bautista de la Concepción, que originará la Orden de los Trinitarios Descalzos, primero constituida en provincia autónoma respecto al Ministro General francés y más tarde en una Orden religiosa independiente con su propio gobierno y organización.