Por su parte el ADN genómico de la célula que se va a utilizar en la construcción de la genoteca es cortado con la misma nucleasa de restricción; los fragmentos de restricción resultantes (entre los que se encuentran los que contienen el ADN que va a ser clonado) se añaden a los plásmidos cortados y se cierran, formando moléculas circulares de ADN recombinante.