Fue creada por real cédula del 20 de noviembre de 1542 para ser erigida en Santiago de los Caballeros de Guatemala, pero fue establecida en otra ciudad, "por orden del Consejo de Indias de 13 de septiembre de 1543, se manda a la audiencia residir en la villa de Valladolid de Comayagua", luego de ser suprimida la Real Audiencia de Panamá.