El 19 de octubre de 1505, a los 18 años de edad, se casó por poderes con Fernando II de Aragón, de 53 años, viudo de Isabel la Católica desde hacía casi un año, a través del II Tratado de Blois, celebrándose las velaciones de dicho matrimonio en la localidad palentina de Dueñas el 18 de marzo de 1506 en el palacio de los condes de Buendía, propiedad de su primo Juan de Acuña, III conde de Buendía.