Leonor de Austria nació en Lovaina, como la hija mayor del archiduque Felipe de Austria, hijo del emperador Maximiliano I de Habsburgo y la duquesa María de Borgoña, y la infanta Juana de Trastámara, hija de los Reyes Católicos, quienes llegarían a suceder en trono de Castilla a la muerte de la reina Isabel en 1504.