La conquista definitiva se efectuó tras fundar los hugonotes franceses una colonia en la costa atlántica (Fort Caroline) en 1564, la cual, abandonada poco después, se restauró por orden del almirante Coligny, aun teniendo noticias la reina de Francia por su hija, Isabel de Valois, que el esposo de ésta, Felipe II, no consentiría la presencia de herejes en sus territorios.