Hay varias advertencias al usar microscopía de dos fotones: Los lásers de pulso generalmente son mucho más costosos, el microscopio requiere una óptica especial para soportar los intensos pulsos, el espectro de absorción de dos fotones de una molécula puede variar significativamente de sus contrapartes de un fotón, y las longitudes de onda mayores de 1400 nm pueden ser significativamente absorbidas por el agua en el tejido vivo.