El 29 de agosto de 1563 el territorio de la real audiencia fue ampliado para incluir los territorios entre La Plata y la ciudad del Cuzco inclusive (el Cuzco y parte de estos últimos fueron reintegrados a la Real Audiencia de Lima en 1568 y los remanentes quedaron incorporados a la provincia), a la provincia de Santa Cruz de la Sierra y a la gobernación del Tucumán.