Los españoles realizaron nuevas expediciones a través del Chaco hacia el Alto Perú en las décadas siguientes: Martínez de Irala con 250 españoles y 2.500 guaraníes en 1543, y Ñuflo de Chávez con 150 españoles y 1.500 guaraníes en 1556-1558 y con 2.000 o 3.000 indios en 1564.