El bombardero fue evaluado en situación real de combate en la Guerra Civil Española ; cinco Ju 86D-1 de bombardeo con motores mejorados Jumo 205C llegaron a España a comienzos de 1937, pero tras algunas salidas, uno de ellos (codificado como 26-1) fue derribado el 23 de febrero por cazas republicanos, con la pérdida de tres tripulantes muertos, y uno capturado.