Sin embargo, la presencia en 1564 de un nutrido contingente de hugonotes franceses, que alzaron un fuerte en la desembocadura del río San Juan, supuso una seria amenaza que llevó a España a la decisión de establecer una presencia militar permanente en el área.El 28 de agosto de 1565, Pedro Menéndez de Avilés funda la ciudad de San Agustín (Florida).