## Pravilnik o utvrđivanju kriterija za zoniranje i službeno nadziranje u slučaju sumnje ili potvrđenog slučaja zarazne anemije lososa

### NN 150/2009 (16.12.2009.), Pravilnik o utvrđivanju kriterija za zoniranje i službeno nadziranje u slučaju sumnje ili potvrđenog slučaja zarazne anemije lososa

MINISTARSTVO POLJOPRIVREDE, RIBARSTVA I RURALNOG RAZVOJ

3665

Na temelju članka 17. stavka 3. Zakona o veterinarstvu (»Narodne novine«, broj 41/07, 155/08) ministar poljoprivrede, ribarstva i ruralnog razvoja donosi

PRAVILNIK

O UTVRĐIVANJU KRITERIJA ZA ZONIRANJE I SLUŽBENO NADZIRANJE U SLUČAJU SUMNJE ILI POTVRĐENOG SLUČAJA ZARAZNE ANEMIJE LOSOSA[[1]](#footnote-29081-1)

Članak 1.

(1) Ovim Pravilnikom određuju se:

(a) planovi uzorkovanja i dijagnostičke metode za otkrivanje i potvrdu zarazne anemije lososa

(u daljnjem tekstu: ZAL), i

(b) kriteriji za zoniranje i službeno nadziranje nakon postavljanja sumnje ili potvrde ZAL.

(2) Planovi uzorkovanja, dijagnostičke metode te kriteriji za zoniranje i službeno nadziranje određeni su u Dodatku ovoga Pravilnika.

Članak 2.

Ovaj Pravilnik stupa na snagu osmoga dana od dana objave u »Narodnim novinama«.

Klasa: 011-02/09-01/220

Urbroj: 525-06-1-0596/09-3

Zagreb, 2. prosinca 2009.

Ministar
Petar Čobanković, v. r.

DODATAK

Planovi uzorkovanja i dijagnostičke metode za otkrivanje i potvrdu ZAL te kriteriji za zoniranje i službeno nadziranje u slučaju sumnje ili potvrđenog slučaja ove bolesti

UVOD I POJMOVNIK

Ovaj Dodatak:

a) utvrđuje smjernice i minimalne zahtjeve za planove uzorkovanja, i dijagnostičke metode za otkrivanje i potvrdu prisutnosti ZAL,

b) objedinjuje odredbe i pojmove iz Pravilnika o uvjetima zdravlja životinja koji se primjenjuju na životinje akvakulture i njihove proizvode te sprječavanju i suzbijanju određenih bolesti akvatičnih životinja (»Narodne novine«, broj 42/2008)[[2]](#footnote-29081-2),

c) utvrđuje odredbe za provedbu odgovarajuće dijagnostike, kontrole i nadziranja ZAL u slučaju sumnje ili potvrde ZAL,

d) namijenjen je nadležnim tijelima odgovornim za kontrolu ZAL kao i laboratorijskom osoblju koje provodi dijagnostiku ove bolesti. Naglasak je stavljen na postupke uzorkovanja, načela i primjenu laboratorijskih testova i procjenu rezultata kao i detaljne laboratorijske tehnike. Ukoliko je potrebno, laboratoriji mogu primijeniti modifikacije testova opisanih u ovom Dodatku, ili koristiti različite testove, pod uvjetom da se može dokazati jednaka ili veća osjetljivost i specifičnost.

Kriteriji za uspostavljanje zona i službeno nadziranje u slučaju sumnje ili potvrde ZAL propisani su ovim Dodatkom.

Za potrebe ovoga Dodatka primjenjuju se dodatni pojmovi:

Područje vodenog sliva je cjelokupno područje sliva od izvora vodenog toka do njegovoga ušća ili dio područja sliva od izvora vodenog toka do prirodne ili umjetne zapreke koja sprječava migracije riba preko te zapreke.

Obalno područje je dio obale ili mora ili ušća s preciznim zemljopisnim granicama koje se sastoji od homogenog hidrodinamičkog sustava ili od niza takvih sustava.

Nadležno tijelo je Ministarstvo poljoprivrede, ribarstva i ruralnog razvoja, Uprava za veterinarstvo.

Dio I. ovoga Dodatka propisuje opće uvjete i kriterije za dijagnostiku i potvrđivanje ZAL te kriterije za zoniranje i službeno nadziranje koji se provode u slučaju sumnje ili potvrde ZAL.

Dio II. ovoga Dodatka propisuje inspekciju i uzorkovanje koje se provode u svrhu otkrivanja prisustva ZAL.

Dio III. ovoga Dodatka propisuje metode koje se koriste u svrhu virusološkog istraživanja.

Dio IV. ovoga Dodatka propisuje postupke za pretraživanje uzoraka korištenjem RT-PCR u svrhu utvrđivanja ZAL.

Dio V. ovoga Dodatka opisuje protokol koji se koristi za pretraživanje otisaka bubrega korištenjem IFAT (test indirektne imunoflorescencije) u odnosu na ZAL.

Dio VI. ovoga Dodatka uključuje metodologiju za histologiju.

Dio VII. ovoga Dodatka navodi popis korištenih skraćenica i kratica.

I. KRITERIJI ZA DIJAGNOSTIKU ZAL I ZA USPOSTAVU ZONA, ODREĐENIH KONTROLNIH MJERA I SLUŽBENOG NADZIRANJA.

I.1. Opća načela dijagnostike ZAL

Osnovani razlozi za postavljanje sumnje da je riba inficirana virusom ZAL navedeni su u točki. I.2. ovoga Dijela.

U slučaju kad je na uzgajalištu postavljena sumnja na infekciju sa virusom ZAL nadležno tijelo mora što je moguće prije osigurati službeno istraživanje u svrhu potvrđivanja ili isključivanja ZAL, i to provedbom inspekcijskog i kliničkog pregleda, prikupljanjem i odabirom uzoraka te korištenjem metoda laboratorijskog pretraživanja kako je navedeno u Dijelu III.-VI. ovoga Dodatka. Da bi se službeno potvrdila ZAL mora biti ispunjen bilo koji od tri kriterija navedena u točki I.3. ovoga Dijela.

I.2. Sumnja na ZAL

I.2.1. Sumnja na ZAL mora se postaviti ukoliko je zadovoljen najmanje jedan od sljedećih kriterija:

a) prisustvo postmortalnih promjena karakterističnih za ZAL s ili bez kliničkih znakova bolesti. Postmortalni nalaz ili klinički znakovi bolesti moraju biti u skladu s onima navedenim u važećoj verziji Dijagnostičkog priručnika za bolesti životinja akvakulture Svjetske organizacije za zdravlje životinja (OIE);

b) izolacija i identifikacija virusa ZAL na kulturi stanica iz jednog uzorka bilo koje ribe s uzgajališta kako je opisano u Dijelu III. ovoga Dodatka;

c) osnovani dokaz o prisutnosti virusa ZAL od strane dva neovisna laboratorijska testa kao što su RT-PCR utvrđen u Dijelu IV. ovoga Dodatka i IFAT utvrđen u Dijelu V. ovoga Dodatka;

d) premještanje žive ribe na uzgajalište na kojem postoji osnovani razlog za sumnju da je ZAL bio prisutan u vrijeme premještanja ribe;

e) istraživanjem su utvrđene druge važne epidemiološke poveznice sa ZAL sumnjivim ili zaraženim uzgajalištima.

I.2.2. Sumnja na ZAL može se isključiti ukoliko se kontinuiranom inspekcijom koja uključuje najmanje jedan klinički pregled mjesečno u razdoblju od šest mjeseci ne otkriju daljnji značajni dokazi prisustva virusa ZAL.

I.3. Potvrda ZAL

Prisutnost ZAL će se potvrditi, ako su ispunjeni kriteriji navedeni u podtočakama a) ili b) ili c) ove točke:

a) Ukoliko su uočeni klinički znakovi i postmortalne promjene karakteristične za ZAL u skladu s onima navedenim u važećoj verziji OIE dijagnostičkog priručnika za bolesti životinja akvakulture, uključujući uginuća, slabost ili promjenjeno ponašanje riba, znakove anemije, ostale postmortalne nalaze i patološke promjene, a virus ZAL je utvrđen s jednom ili više sljedećih metoda:

– izolacija i identifikacija virusa ZAL na kulturi stanica iz barem jednog uzorka bilo koje ribe s uzgajališta kako je opisano u Dijelu III. ovoga Dodatka;

– utvrđivanje virusa ZAL RT-PCR metodom opisanom u Dijelu IV. ovoga Dodatka

– utvrđivanje ZAL u tkivima ili preparatima tkiva korištenjem specifičnih protutijela

za virus ZAL (NPR IFAT na otiscima bubrega utvrđen u Dijelu V. ovoga Dodatka);

b) izolacija i identifikacija virusa ZAL u dva uzorka od jedne ili više riba s uzgajališta testiranih u različito vrijeme korištenjem metoda opisanih u Dijelu III. ovoga Dodatka.

c) izolacija i identifikacija virusa ZAL iz najmanje jednog uzorka od bilo koje ribe na uzgajalištu korištenjem metode utvrđene u Dijelu III. ovoga Dodatka s popratnim dokazom virusa ZAL u preparatima tkiva bilo koje ribe na uzgajalištu korištenjem bilo RT-PCR u skladu s Dijelom IV. ovoga Dodatka ili IFAT u skladu s Dijelom V. ovoga Dodatka.

I.4. Kriteriji za uspostavu i ukidanje zona kontrole i službenog nadziranja nakon postavljanja sumnje i potvrde ZAL

1.4.1. U svrhu uspostave službenog programa nadziranja na temelju rizika, nadležno tijelo mora u okolici uzgajališta gdje je službeno postavljena sumnja ili potvrda infekcije ZAL, uspostaviti odgovarajuću zonu kontrole i zonu nadziranja.

1.4.2. Uspostavljanje zona mora se, za svaki pojedini slučaj, temeljiti na procjeni rizika od daljnjeg širenja bolesti.

U skladu s epidemiološkom situacijom, predmetno područje vodenog sliva ili obalno područje:

– mora biti definirano je kao zona kontrole, ili

– može, kad je riječ o velikom vodenom slivu ili obalnom području, biti podijeljeno na zonu kontrole i zonu nadziranja, po uvjetom da isto ne ugrožava sprečavanje širenja ZAL.

Dodatne zone nadziranja, ukoliko je potrebno, mogu biti uspostavljene izvan područja vodenog sliva ili obalnog područja.

1.4.3. Glavni čimbenici koji se uzimaju u obzir prilikom uspostavljanja gore navedenih zona su oni koji utječu na rizik širenja bolesti na uzgajališta i slobodnoživuću ribu kao što su broj, stopa i proširenost uginuća ribe na uzgajalištu gdje je postavljena sumnja ili potvrđena infekcija virusom ZAL; uzrok uginuća na predmetnom uzgajalištu; udaljenost i gustoća susjednih uzgajališta; kontaktna uzgajališta; vrste ribe prisutne na uzgajalištima; način gospodarenja ribom na zaraženom i susjednim uzgajalištima; hidrodinamički uvjeti i drugi epidemiološki značajni čimbenici prepoznati u okviru epidemiološkog istraživanja provedenog u skladu sa člankom 28., 29., 32., i 34. Pravilnika o uvjetima zdravlja životinja koji se primjenjuju na životinje akvakulture i njihove proizvode te sprječavanju i suzbijanju određenih bolesti akvatičnih životinja (»Narodne novine« 42/2008)[[3]](#footnote-29081-3).

I.4.4. Minimalni kriteriji koji se primjenjuju prilikom uspostavljanja zona

I.4.4.1. Nadležno tijelo uspostavlja zonu kontrole u bližoj okolici uzgajališta na kojem je potvrđena infekcija virusom ZAL, kako slijedi:

– u obalnom području: područje kruga s radijusom koji je jednak najmanje jednom plimnom dosegu ili najmanje 5 kilometara, sa središtem u uzgajalištu gdje je potvrđena zaraza virusom ZAL, ili odgovarajuće područje određeno u skladu s odgovarajućim hidrodinamičkim ili epidemiološkim podatcima, ili

– kopnena područja: cijela vodena površina uzgajališta gdje je potvrđena infekcija virusom ZAL; Nadležno tijelo može na velikim vodenim područjima ograničiti granice zone na dijelove vodene površine osiguravajući da nije ugroženo sprječavanje širenja virusa ZAL.

I.4.4.2. Privremena zona kontrole uspostavlja se u slučaju sumnje na ZAL, temeljem istih kriterija koji se uzimaju u obzir pri uspostavi zone kontrole.

I.4.4.3. Zonu nadziranja izvan zone kontrole u područjima gdje se smatra da je dovoljno provoditi manje intenzivno nadziranje, uspostavlja po potrebi Nadležno tijelo i predstavlja:

– u obalnim područjima: područje koje okružuje zonu kontrole i zonu izmjene plime i oseke, područje koje okružuje zonu kontrole i obuhvaća krug polumjera 10 km od središta zone kontrole ili odgovarajuće područje određeno u skladu s prikladnim hidrodinamičkim ili epidemiološkim podacima, ili

– u kopnenim područjima: ukoliko je potrebno, obuhvaća prošireno područje izvan uspostavljene zone kontrole.

I.5. Mirovanje i ukidanje uspostavljenih zona

I.5.1. Nadležni veterinarski inspektor osigurava da su sva uzgajališta unutar zone kontrole podvrgnuta odgovarajućem periodu mirovanja nakon što se ribnjak isprazni od ribe i prikladno dezinficira.

Trajanje perioda mirovanja na uzgajalištima na kojima je potvrđena infekcija ZAL ne smije biti kraće od šest mjeseci.

Duljinu perioda mirovanja za ostala uzgajališta u zoni kontrole određuje nadležno tijelo na temelju procjene rizika za svaki pojedini slučaj. Kada se isprazne sva uzgajališta u zoni kontrole primjenjuje se sinhronizirano mirovanje u trajanju od najmanje šest tjedana.

Nadležni veterinarski inspektor može odlučiti o trajanju mirovanja na uzgajalištima u uspostavljenim zonama nadziranja.

I.5.2. Uspostavljene zone kontrole ne mogu biti ukinute i poribljene sve dok sva uzgajališta smještena u uspostavljanim zonama nisu ispražnjena od ribe, prikladno dezinficirana i mirovala u skladu sa podtočkom I.5.1. ove točke. Kada se provede poribljavanje u zonama, zone kontrole prelaze se u zone nadziranja kako je to utvrđeno u podtočki I.4.4.3. točke I.4. ovoga Dijela Dodatka.

I.5.3.Uspostavljene privremene zone kontrole ne mogu biti ukinute sve dok se ne isključi sumnja na ZAL, u skladu sa podtočkom I.2.2. točke I.2. ovoga Dijela Dodatka. U slučaju potvrde ZAL, u skladu sa točkom I.3. ovoga Dijela Dodatka privremena zona kontrole prelazi u zonu kontrole.

I.5.4. Uspostavljene zone nadziranja ne mogu biti ukinute dok ne prođe dvije godine nakon ukidanja zone kontrole.

I.6. Službeno nadziranje nakon postavljanja sumnje ili potvrde ZAL

I.6.1. U odnosu na članke 28., 29., 32., 33., 34., 35., 47. i 54. Pravilnika o uvjetima zdravlja životinja koji se primjenjuju na životinje akvakulture i njihove proizvode te sprječavanju i suzbijanju određenih bolesti akvatičnih životinja (»Narodne novine«, br: 42/2008)[[4]](#footnote-29081-4) a radi utvrđivanja proširenosti i razvoja bolesti nakon postavljanja sumnje ili potvrde ZAL na uzgajalištu, nadležno tijelo mora u svim uzgajalištima smještenim u uspostavljenim zonama provesti program službenog nadziranja temeljenog na procjeni rizika.

I.6.2. U svrhu provedbe službenog programa nadziranja nadležno tijelo mora, ukoliko je potrebno inspekcijom na licu mjesta, identificirati sva uzgajališta u uspostavljenim zonama te napraviti službeni popis vrsta, kategorija i broja riba držanih na uzgajalištima, uključujući podatke o uginućima.

I.6.3. Nastavno na prvi službeni popis, uzgajališta unutar privremeno uspostavljenih zona kontrole koje drže Atlantski losos (Salmo salar) ili bilo koju drugu vrstu navedenu kao prijemčivu na ZAL ili mogućeg nositelja ZAL, u važećoj verziji OIE dijagnostičkog priručnika za bolesti životinja akvakulture, moraju svakih 14 dana dostavljati nadležnom tijelu izvješća o uginućima. O povećanom mortaliteta mora se izvijestiti po danu i kavezu. Nadležno tijelo mora istražiti svako značajno povećanje mortaliteta na uzgajalištu.

Kad je potvrđena sumnja, sva uzgajališta u uspostavljenoj zoni kontrole moraju, jednom tjedno, dostavljati nadležnom tijelu izvješće o dnevnim uginućima, po kavezu.

Uzgajališta u zonama nadziranja moraju, svakih 14 dana, dostavljati nadležnom tijelu izvješće o uginućima.

Nadzor se mora provoditi redovito tijekom godine u uspostavljenim zonama i s učestalošću kako je navedeno u Tablici 1. ovoga Dodatka. Kada klimatski uvjeti u nekom dijelu godine onemogućavaju nadzor, nadležno tijelo može izmijeniti učestalost inspekcijskog nadzora u kriznom planu.

Tablica 1. SLUŽBENI PROGRAM NADZIRANJA

|  |  |  |
| --- | --- | --- |
| Lokacija uzgajališta | Minimalni broj nadzora po godini | Minimalni broj nadzora po godini nakon ukidanja zone kontrole |
| Zona kontrole | 12 |  |
| Zona nadziranja | 6 | 6 |
| Privremena zona kontrole | 6 |  |

Program nadziranja provodi se sve do ukidanja zona.

I.6.4. Nadzori kao i izbor, prikupljanje, priprema i slanje uzoraka provodi se kako je definirano u točkama II.1. do II. 4 Dijela II. ovoga Dodatka. Pretraživanje uzoraka provodi se u skladu sa Dijelovima III. do VI. ovoga Dodatka.

II. INSPEKCIJSKI PREGLED I UZORKOVANJE

II.1. Inspekcijski pregled, odabir i prikupljanje uzoraka na uzgajalištu za koje se sumnja na prisutnost ZAL

II.1.1. Pri redovitim inspekcijskim pregledima koji se obavljaju u okviru programa službenog nadziranja navedenog u točki I.6. Dijela I. ovoga Dodatka i u uzgajalištima za koja se sumnja da su zaražena s ZAL, svi objekti uzgajališta (kavezi, bazeni ili ribnjaci) moraju biti podvrgnuti inspekcijom pregledu kako bi se utvrdila prisutnost uginulih i slabih riba ili riba s neuobičajenim ponašanjem. Kada je moguće, nedavno uginule (još neraspadnute) ribe te slabe ribe ili ribe neuobičajenog ponašanja podvrgavaju se pregledu radi utvrđivanja kliničkih znakova ili postmortem nalaza koji odgovaraju ZAL, kako je opisano u važećoj verziji OIE Dijagnostičkog priručnika za bolesti životinja akvakulture.

II.1.2. Ukoliko se uoče nedavni klinički znakovi koji odgovaraju ZAL, ili ako inspektor ili veterinar ima bilo kakav drugi razlog za sumnju da su ribe možda zaražene, uzima se uzorak od najmanje 10 riba. Ako je to moguće, uzorak moraju sačinjavati nedavno uginule i slabe ribe ili ribe koje pokazuju neuobičajeno ponašanje. Ukoliko nema dovoljno klinički promijenjenih riba, tada se potreban broj riba u uzorku dobiva nadopunjavanjem uzorcima uzetim od zdravih riba odabranih iz kaveza, bazena ili ribnjaka u kojima je najveći broj uginulih riba ili riba koje pokazuju kliničke znakove bolesti.

II.1.3. Ukoliko se uoče nedavno uginule ili slabe ribe ili ribe neuobičajenog ponašanja a klinički znakovi i post mortem nalazi ne odgovaraju ZAL, uzorkovanje nije obvezno, iako inspektor ili veterinar može odlučiti da se takvi uzorci uzmu ukoliko su potrebni za postavljanje diferencijalne dijagnoze.

II.1.4. Kada se sumnja da su slobodno-živuće ribe zaražene ZAL, nadležno tijelo mora osigurati da su odgovarajući uzorci prikupljeni i pregledani primjenom odgovarajućih kliničkih i laboratorijskih metoda navedenih u Dijelu II. do VI. ovoga Dodatka kako bi se isključila ili potvrdila prisutnost ZAL i kako bi se procijenilo da li pojava bolesti predstavlja značajnu prijetnju ribama u uzgajalištima.

II.2. Priprema uzoraka od riba

II.2.1. Uzorci za histološki pregled moraju se prikupiti samo od svježe usmrćenih riba koje pokazuju kliničke znakove ili post mortem nalaze koji su u skladu s prisutnošću bolesti. Od svake pojedine ribe potrebno je uzeti pomoću skalpela uzorak svake vanjske ili unutarnje lezije, a u svakom slučaju uzorke jetre, srednjeg bubrega, srca i slezene, koji se stavljaju u 8 – 10% (vol/vol) puferiranu solnu otopinu formalina. Omjer između fiksira i tkiva mora biti najmanje 20 : 1 kako bi se osiguralo zadovoljavajuće očuvanje tkiva.

II.2.2. Tkiva za virološko pretraživanje uzimaju se od svih uzorkovanih riba. Radi potvrđivanja nalaza, uzimaju se dvojni uzorci. Komadići jetre, prednjeg bubrega, srca i slezene moraju se ukloniti iz ribe korištenjem sterilnog instrumenta i premjestiti u plastične epruvete koje sadrže 9 ml transportne otopine, tj. medij kulture stanica s antibioticima. Kombinacija 12,5 μg ml-1 fungizona, 200 IU ml-1 polimiksina B i 200 μg ml-1 kanamicina je prikladna, ali se mogu upotrijebiti i druge kombinacije s dokazanom učinkovitošću. Tkiva od najviše pet riba mogu se sakupiti u jednu epruvetu koja sadrži transportnu otopinu, što čini jedan skupni uzorak. Težina tkiva u jednom uzorku treba iznositi 1,0 ± 0,5 g.

II.2.3. Za pretraživanje IFAT testom uzimaju se otisci bubrega samo od svježe usmrćenih riba, tj. unutar dva sata od smrti. Komadić srednjeg bubrega uklanja se iz ribe korištenjem sterilnih instrumenata. S tkiva se upijajućim papirom otkloni suvišna krv, a zatim se tkivo višekratno pritišče na predmetno stakalce obloženo poli-L-lizinom. Pojedinačni otisci moraju biti prislonjeni jedan uz drugi, ali se ne smiju preklapati kako bi se dobio kontinuirani jedinstveni sloj stanica. Krv i tkivna tekućina nisu odgovarajući materijal za ovaj test. Treba izbjegavati ostavljanje uzorka bubrega na upijajućem papiru kako bi se 'iscijedio' jer to može rezultirati zgrušavanjem krvi što uzrokuje taloženje velikih količina serumskih proteina na predmetnom stakalcu za testiranje. Otisci se moraju sušiti na zraku, ukoliko ih ne treba odmah fiksirati pohranjuju se na hladno i suho mjesto. Fiksiranje otisaka se mora provesti unutar 72 sata od uzorkovanja ribe. Otisci se nakon sušenja na zraku mogu zamrznuti i pohraniti do mjesec dana na – 20 ° C prije fiksiranja.

II.2.4. Ribe koje pokazuju znakove anemije mogu se omamiti te se od njih mogu odmah uzeti heparinizirani uzorci krvi za hematološki pregled, kao što je mjerenje hematokrita.

II.2.5. Tkivo za RT-PCR uzima se od svih uzorkovanih riba. Upotrebom sterilnog instrumenta uklanja se komad prednjeg ili srednjeg bubrega te se prenosi u cijev mikrocentrifuge koja sadrži 1 ml dokazano učinkovite otopine za očuvanje RNA. Tkivo uzeto od najviše pet riba može se sakupiti u jednu epruvetu koja sadrži otopinu za konzerviranje, što čini jedan skupni uzorak. Težina tkiva u jednom uzorku treba iznositi približno 0,5 g. Kada je riba premala da bi se dobio uzorak potrebne težine, uzimaju se komadi bubrega, srca, slezene, jetre ili piloričnih nastavaka (cekuma), upravo navedenim redoslijedom, dok se ne postigne težina od 0,5 g.

II.3. Otprema uzoraka uzetih od riba

II.3.1. Uzorci krvi i epruvete koje sadrže tkivo riba namijenjeno za virološki pregled ili RT-PCR analizu stavljaju se u izolirane posude (npr. kutije od polistirena s debelim stjenkama) zajedno s dovoljnom količinom leda ili ‘rashladnih blokova’ kako bi se osiguralo rashlađivanje uzoraka tijekom prijevoza u laboratorij. Treba izbjegavati zamrzavanje, a pri dolasku na odredište u kutijama za prijevoz još uvijek mora biti leda ili jedan ili više ‘rashladnih blokova’ koji moraju još uvijek biti djelomično ili potpuno zamrznuti. U izuzetnim okolnostima uzorci za RT-PCR analizu ili za virološki pregled mogu se naglo zamrznuti i transportirati u laboratorij pri temperaturi od – 20 °C ili nižoj.

II.3.2. Predmetna stakalca za IFAT šalju se u spremnicima za predmetna stakalca s dovoljno sredstva za isušivanje kako bi otisci ostali suhi i rashlađeni, kako je gore opisano.

II.3.3. Ako se tkiva šalju u fiksiru za histološki pregled, treba ih slati u zatvorenim epruvetama u ambalaži otpornoj na vanjske utjecaje, kao što su kutije od polistirena s debelim stijenkama.

II.3.4. Osim u slučaju kada su uzorci zamrznuti, virološki pregled mora započeti što je prije moguće a ne kasnije od 72 sata nakon uzimanja uzoraka. Uzorak za dodatnu kontrolnu analizu pohranjuje se po dolasku u laboratorij na temperaturu od – 20 °C ili nižoj.

II.3.5. U laboratorij se mogu dopremiti i cijele ribe ukoliko su tijekom prijevoza ispunjeni temperaturni zahtjevi, kako je opisani u točki II.3.1. Cijela se riba omota u upijajući papir i šalje u plastičnoj vrećici, rashlađena na gore opisani način.

II.3.6. Živa riba može se također poslati, ali samo pod nadzorom nadležne službe.

II.3.7. Za RT-PCR analizu tkiva pohranjenih u RNAlater, ekstrakcija RNA se mora obaviti unutar određenog vremenskog razdoblja ovisno o tome na kojoj su temperaturi uzorci pohranjeni. Ta vremenska razdoblja su sljedeća:

– 37 °C jedan dan

– 25 °C jedan tjedan

– 4 °C jedan mjesec

– -20 °C neograničeno

II.3.8. Pakiranje i označavanje se mora obaviti u skladu s postojećim nacionalnim i međunarodnim propisima za prijevoz.

II.4. Prikupljanje dodatnog dijagnostičkog materijala

Uz suglasnost dijagnostičkog laboratorija, mogu se prikupiti i pripremiti i druga tkiva riba za dodatno ispitivanje.

III. VIROLOŠKO ISPITIVANJE

III.1. Priprema uzoraka

III.1.1. Kada dođe do praktičnih poteškoća koje onemogućavaju inokulaciju stanica unutar roka od 72 sata nakon prikupljanja uzoraka tkiva, prihvatljivo je zamrzavanje tkiva na – 80 °C tijekom 28 dana. Tkivo se prije virološkog ispitivanja smije zamrznuti i odmrznuti samo jedanput.

III.1.2. Svaki uzorak (skupni uzorak tkiva u transportnoj otopini) mora se potpuno homogenizirati upotrebom aparata 'stomacher', mješalice ili mužara i drobilice, centrifugiranjem pri 2 000 do 4 000 x g 15 minuta na temperaturi od 0 do 6 °C, nakon čega se supernatant filtrira (0,45 μm) i inkubira s jednakim volumenom odgovarajuće razrijeđenih skupnih antiseruma protiv autohtonih serotipova virusa zarazne nekroze gušterače (ZNG). Titar antiseruma mora biti najmanje 1 : 2 000 pri testu neutralizacije plaka 50%. Mješavina se inkubira jedan sat pri temperaturi od 15 °C. To predstavlja inokulat.

Tretiranje svih inokulata antiserumom za virusa ZNG (virus koji se u nekim dijelovima Europe pojavljuje u 50% ribljih uzoraka) ima za cilj sprječavanje razvoja citopatogenog učinka (CPU) uzrokovanog razvojem virusa ZNG u inokuliranim staničnim kulturama. Time se skraćuje trajanje virološkog ispitivanja te se smanjuje broj slučajeva u kojima bi se pojava CPU morala smatrati kao moguća pokazatelj virusa ZAL.

Kada uzorci dolaze iz proizvodnih jedinica za koje se smatra da u njima nema ZNG, može se izostaviti tretiranje inokulata antiserumom za virus ZNG.

III.2. Inokulacija staničnih kultura

III.2.1. Stanice SHK-1 (pasaža 80 ili manje) ili stanice TO uzgajaju se u mediju L-15 koji sadrži 5% fetalni goveđi serum, 2% (v/v) 200 mM L-glutamin i 0,08% (v/v) 50 mM 2-merkaptoetanol, na pliticama s 12 ili 24 jažice. Mogu se upotrijebiti i druge stanične linije s dokazanom djelotvornošću i osjetljivošću za izolaciju virusa ZAL, uvažavajući varijabilnost sojeva i sposobnosti različitih sojeva da se umnožavaju u različitim staničnim linijama. Suspenzija organa tretirana antiserumom inokulira se u mlade stanične kulture u fazi aktivnog rasta kako bi se dobio konačno razrijeđeni tkivni materijal u hranljivoj podlozi u omjeru od 1 : 1 000. Za svaku suspenziju organa dodaje se 40 µl inokulata u jednu jažicu koja sadrži 2 ml hranljive podloge. Kako bi se smanjio rizik od unakrsne kontaminacije preporučuje se da se upotrebljavaju posebne plitice s 12 ili 24 jažice za uzorke iz različitih ribogojilišta.

III.2.2. Jedna plitica se ostavlja neinokulirana da bi služila kao negativna kontrola. Odvojena plitica se inoklulira referentnim izolatom virusa ZAL kao pozitivna kontrola, na sljedeći način. Sto µl standardnog pripravka virusa ZAL (minimalni titar 107 TCID50 ml-1) inokulira se u prvu jažicu i dobro promiješa. Određeni dio materijala iz prve jažice prenosi se u drugu jažicu da bi se dobila otopina s omjerom 1 : 10 i dobro se promiješa. Ovaj se postupak ponavlja kroz cijelu pliticu da bi se dobilo šest deseterostrukih razrjeđenja. Standardni virus ZAL se može pohraniti na – 80 °C najmanje dvije godine, ali kada se jednom odmrzne mora se upotrijebiti u roku od tri dana. Napomena: treba paziti da ne dođe do unakrsne kontaminacije testne plitice s pozitivnim kontrolnim materijalom. Kako bi se izbjegao ovaj rizik, pozitivne kontrole se pripremaju i njima se rukuje odvojeno od testne plitice.

III.2.3. Uzorci se inkubiraju pri 14 ± 2 °C kroz razdoblje do 15 dana.

III.3. Mikroskopiranje

Stanične kulture se dva puta mikroskopski pregledavaju na pojavu CPU-a, između petog i sedmog i između 12. i 14. dana nakon inokulacije. Ako bilo koji skupni uzorak pokaže CPU, mora se odmah započeti s postupcima identifikacije virusa u skladu s točkom III.6.ovoga Dijela Dodatka. Ako se do 14 dana ne zapazi CPU, izvodi se test hemadsorpcije u skladu s točkom III.4. ovoga Dijela Dodatka.

III.4. Hemadsorpcija

Umnožavanje virusa ZAL u staničnim kulturama ne rezultira uvijek CPU-om. Stoga se svaka jažica podvrgava testu hemadsorpcije, kako je dolje opisano, ili se alternativno svaka rupica podvrgava IF testu, kako je opisano u točki III.6.1. ovoga Dijela Dodatka.

III.4.1. Hranljiva podloga stanične kulture uklanja se iz svake jažice, uključujući one koje se koriste za pozitivnu i negativnu kontrolu, te se stavljaju u obilježene sterilne epruvete. Petsto µl 0,2% (v/v) suspenzije ispranih crvenih krvnih zrnaca kunića ili konja, ili 0,05 % (v/v) suspenzije ispranih crvenih krvnih zrnaca kalifornijske pastrve ili atlantskog lososa dodaje se u svaku jažicu i inkubira 45 minuta na sobnoj temperaturi. Crvena krvna zrnca se odstrane i svaka se jažica dva puta ispere medijem L-15. Svaka se jažica mikroskopski pregleda.

III.4.2. Postojanje nakupina stanica crvenih krvnih zrnaca pričvršćenih uz površinu SHK-1 ili TO stanica ukazuje na vjerojatnu zarazu ortomiksovirusom. Ako je test hemadsorpcije pozitivan, treba odmah izvesti test identifikacije virusa u skladu s točkom III.6. ovoga Dijela Dodatka karakterističnih znakova navedenih bolesti.

III.5. Subkultiviranje ili pasaža

III.5.1. Subkuktiviranje se izvodi između 13. i 15. dana. Dvjesto dvadeset pet µl supernatanta kulture dodaje se u jažice koje sadrže svježe stanice SHK-1 u fazi aktivnog rasta, na ploči s 12 jažica, te se do 18 dana inkubira na temperaturi od 14 ± 2 °C. Stanična kultura se dva puta mikroskopski pregleda na pojavu CPU-a, i to između petog i sedmog i između 14. i 18. dana nakon inokulacije. Ako bilo koji skupni uzorak pokaže CPU, treba odmah izvesti test identifikacije virusa u skladu s točkom III.6. ovoga Dijela Dodatka. Ako se između 14. i 18. dana ne zapazi CPU, treba izvesti test hemadsorpcije u skladu s točkom III.4. ovoga Dijela Dodatka.

III.5.2. Ako se tijekom prvih sedam dana inkubacije pojavi citotoksičnost, u toj fazi treba obaviti subkultivaciju i stanice treba inkubirati 14 do 18 dana, nakon čega se ponovno provodi subkultivacija i daljnje inkubiranje tijekom 14 do 18 dana. Ako se citotoksičnost pojavi nakon sedam dana, subkultivacija se obavlja jedanput, a stanice se inkubiraju na način da se postigne ukupno 28 do 36 dana inkubacije od prvobitne inokulacije.

III.5.3. Ukoliko se u primarnoj kulturi pojavi bakterijska kontaminacija, treba ponovno pripremiti test upotrebom homogenata tkiva pohranjenog na – 80 °C. Prije inokulacije, homogenat tkiva se centrifugira pri 4 000 x g kroz 30 minuta na temperaturi 0 do 6 °C, i supernatant se filtrira kroz 0,22 µm. Ukoliko se bakterijska kontaminacija pojavi tijekom faze subkultivacije, supernatant se filtrira kroz 0,22 µm, inokulira u svježe stanice i inkubira daljnjih 14 do 18 dana.

III.6. Testovi identifikacije virusa

Ako se u bilo kojoj fazi opaze dokazi CPU-a, ili ako je test hemadsorpcije pozitivan, obavlja se identifikacija virusa. Metode izbora za identifikaciju virusa ZAL su IF utvrđene podtočkom III.6.1. ovoga Dijela Dodatka i RT-PCR utvrđene u Dijelu IV. ovoga Dodatka. Ako se smatra da mogu biti prisutni i drugi virusi, preporučuje se izvođenje dodatnih testova za identifikaciju virusa. Ako ti testovi ne omoguće konačnu identifikaciju virusa u roku od tjedan dana, supernatant se mora dostaviti nacionalnom referentnom laboratoriju ili referentnom laboratoriju Zajednice za bolesti riba radi hitne identifikacije.

III.6.1. IF

III.6.1.1. Stanice SHK-1 (pasaža 80 ili manje) ili stanice TO uzgajaju se u mediju L-15 koji sadrži 5% fetalnog goveđeg seruma, 2% (v/v) 200 mM L-glutamina i 0,08% (v/v) 50 mM 2-merkaptoetanola, na pločama s 24 ili 96 jažica, i upotrebljavaju se pri konfluenciji većoj od 50%. Mogu se upotrijebiti i druge stanične linije i hranljive podloge s dokazanom djelotvornošću. Dvjesto dvadeset pet µl supernatanta kulture, za koju se smatra da je zaražena virusom, dodaje se u svaku od dviju jažica, pomiješa se i 225 µl prenosi u dvije sljedeće jažice, pri razrjeđenju 1:5. Dvije dodatne jažice ostavljaju se neinokulirane i služe kao kontrola. Za uzorke iz različitih ribogojilišta koriste se posebne ploče kao i kontrole virusa. Za kontrolu virusa koristi se referentni izolat virusa ZAL.

III.6.1.2. Ploče se inkubiraju na 14 ± 2 °C i mikroskopski pregledavaju tijekom sedam dana. Kada se zapazi rani CPU ili se u roku od sedam dana CPU uopće ne zapazi, sljedeći korak je fiksiranje. U ovoj se fazi jažice ispiru PBS-om i fiksiraju inkubiranjem s 80% acetonom na sobnoj temperaturi tijekom 20 minuta. Ploče se suše na zraku i odmah obilježavaju, ili se pohranjuju na temperaturi od 0 do 6 °C ne više od 24 sata prije obilježavanja.

III.6.1.3. Umnožene jažice se obilježavaju monoklonskim protutijelom 3H6F8 za virus ZAL ili drugim monoklonskim protutijelom koje ima dokazane učinkovitosti i specifičnosti, razrijeđeni u PBS-u i inkubiranih 30 minuta pri temperaturi od 37 ± 4 °C. Monoklonsko protutijelo se odstranjuje, a ploče se ispiru tri puta 0.05% otopinom Tween 20 u PBS-u. U svaku jažicu se dodaje protu-mišji IgG FITC konjugat razrijeđen u PBS-u, te se inkubira 30 minuta pri temperaturi od 37 ± 4 °C. Opaska: Svaki laboratorij optimizira razrjeđenje različitih serija monoklonskih protutijela i konjugata FITC-a. Antitijelo se odstranjuje a ploče se tri puta ispiru 0.05% otopinom Tween 20 u PBS-u.

III.6.1.4. Jažice treba odmah pregledati upotrebom invertiranog mikroskopa podešenog za fluorescentnu mikroskopiju s prikladnim filterom za ekscitaciju FITC-a. Test se smatra pozitivnim ukoliko se opaze fluorescentne stanice. Da bi test bio valjan, rezultati pozitivne kontrole moraju biti pozitivni, a rezultati negativne kontrole negativni.

IV. PREGLED UZORAKA METODOM RT-PCR

IV.1. Ovim odjeljkom opisani su postupci koji su potrebni za amplifikaciju dijela segmenta 8 genoma virusa ZAL pomoću metode PCR, što se može izvoditi na tkivu ribe ili na virusu ZAL u kulturi.

IV.1.1. Ekstrakcija RNA

(a) Iz svakog uzorka se odstranjuje RNAlater. U svaku epruvetu se dodaje 1 ml dH2O obrađene DEPC-om, te se epruvete centrifugiraju pet minuta pri 13 000 okretaja u minuti na 0 do 6 °C.

(b) Iz svakog uzorka se uklanja supernatant te se svakom uzorku i kontrolnoj epruveti koja sadrži prikladan kontrolni materijal (400 µl dH2O ili homogenat bubrega riba koje nemaju specificirani uzročnik bolesti) dodaje 800 µl TRIzola (Invitrogen), ili nekog drugog reagensa za koji je dokazano da ima jednaku ili veću učinkovitost. Ako je potrebno, tkivo se cijepa ponovljenim pipetiranjem. Epruvete se inkubiraju pet minuta na sobnoj temperaturi. Svakoj epruveti se doda 160 µl kloroforma te se epruvete tri minute snažno tresu, a zatim petnaest minuta centrifugiraju pri 13 000 okretaja u minuti na 0 do 6 °C.

(c) Gornji vodeni sloj se uklanja i stavlja u označenu cjevčicu mikrocentrifuge zapremine 1,5 ml koja sadrži 500 µl izopropanola te se zatim epruvete 10 minuta inkubiraju na sobnoj temperaturi, nakon čega se 15 minuta centrifugiraju pri 6 500 okretaja u minuti na 0 do 6 °C.

(d) Odstrani se supernatant i talogu RNA se doda 1 ml 75% etanola. Epruvete se zatim pet minuta centrifugiraju pri 6 500 okretaja u minuti na 0 do 6 °C.

(e) Odstranjuje se supernatant i epruvete se oko tri minute ostavljaju otvorene kako bi ishlapio preostali etanol. Dodaje se 15 µl dH2O obrađene DEPC-om kako bi se talog ponovno suspendirao te se po potrebi kratko vrtložno protrese.

(f) Za izračunavanje koncentracije RNA i čistoće uzorka koristi se spektrofotometar. Optička gustoća se mjeri pri 260 i 280 nm.

(g) RNA koja će se koristiti odmah (isti dan), može se privremeno pohraniti na 0 do 6 °C. RNA koja se neće odmah koristiti pohranjuje se na – 80 °C.

IV.1.2. RT

(a) Dva µl RNA se razrjeđuju u dH2O obrađenoj DEPC-om u epruveti mikrocentrifuge od 1,5 ml. Kada je koncentracija RNA uzorka premala da bi se u RT reakciji omogučilo korištenje 2 µg, koristi se najveća moguća količina RNA. Razrijeđena RNA se inkubira 10 minuta na 55 do 60 °C.

(b) Potom se epruvete koje sadrže RNA stavljaju na led, te se dodaju RT reagensi da bi se dobile konačne sljedeće koncentracije: 1 x pufer, 1 mM dNTP, 100 ng nasumičnih heksamera, 20 U RNase inhibitora i 200 U MMLV-RT u ukupnom volumenu od 20 µl.

(c) Epruvete se jedan sat inkubiraju na 37 °C.

(d) cDNA se pohranjuje pri temperaturi od 0 do 6 °C dok je potrebno te se što je prije moguće koristi u PCR-u.

IV.1.3. PCR

(a) Pet µl cDNA se dodaje u 45 µl PCR mješavine da bi se dobile sljedeće konačne koncentracije: 1 x pufer, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM svakog dNTP, 25 pmol svake starter-molekule i 1U Taq polimeraze. Starter molekule su ISA+ (5'-GGC-TAT-CTA-CCA-TGA-ACG-AAT-C-3') (početna starter-molekula) i ISA- (5'-GCC-AAG-TGT-AAG-TAG-CAC-TCC-3') (reverzna starter-molekula). Negativne kontrole za ekstrakciju, RT i PCR koraci moraju se uključiti.

(b) Epruvete se stavljaju na pet minuta u termocikler programiran na 94 °C, nakon čega slijedi 35 ciklusa na 94 °C jednu minutu, na 55 °C jednu minutu i na 72 °C jednu minutu, s konačnom inkubacijom na 72 °C u trajanju od pet minuta.

(c) Rezultati PCR-a se ocjenjuju nakon elektroforeze upotrebom 2% agaroznog gela obojenog etidijevim bromidom, uključujući markere veličine duž uzoraka i negativne kontrole iz faza RT-a i PCR-a. Smatra se da je jedan produkt PCR-a od 155 bp indikativan za prisutnost RNA virusa ZAL. Za uzorke koji sadrže jedan dodatan produkt od 310 bp, također se smatra da sadrže RNA virusa ZAL. Uzorci koji daju više produkata PCR-a, uključujući najmanje jedan od približno 155 bp, mogu sadržavati RNA virus ZAL. Oni se mogu dalje istraživati upotrebom DNA probe ili sekvencioniranjem nukleotida.

IV.1.4. Potvrđivanje izolacije virusa ZAL u kulturi tkiva pomoću PCR-a

Ako se u SHK-1 stanicama tijekom virološkog pregleda uzoraka tkiva pojavi potpuni CPU, iz jažice treba odstraniti 400 µl supernatanta i staviti je u sterilnu epruvetu veličine 1,5 ml. Iz ovoga se uzorka ekstrahira RNA, kako je utvrđeno u točki III.1. Dijela III. ovoga Dodatka, te se izvodi RT-PCR. Ukoliko se upotrebljavaju kulture bez potpunog CPU, uklanja se supernatant, stanice se sastružu s površine jažice ili bočice i stave se u sterilnu epruvetu od 1,5 ml radi ekstrahiranja RNA i provođenja RT-PCR.

IV.1.5. Potvrđivanje produkata PCR-a pomoću DNA probe

(a) Specifičnost produkta PCR-a od 155 bp ocjenjuje se sondiranjem pomoću oligonukleotida koji se hibridizira na području produkta PCR-a unutar starter-molekula. Produkti PCR-a se podvrgavaju elektroforezi u 1% agaroznom gelu uključujući markere veličine duž uzoraka te pozitivnu kontrolu i negativne kontrole iz faza RT-a i PCR-a.

(b) DNA se podvrgava Southern blot analizi prenošenjem na membranu, te se označeni oligonukleotid (5'-CGGGAGTTGATCAGACATGCACTGA AGGTG-3’) inkubira s membranom nakon odgovarajućih postupaka pred-hibridizacije.

(c) Nepovezane i nespecifično povezane probe ispiru se s membrane, te se povezane probe vizualiziraju.

(d) Probe povezane s fragmentom od 155 bp (i 310 bp, ako je prisutan) predstavljaju dokaz za specifičnost PCR-a i pokazuju da je u uzorku prisutna RNA virusa ZAL.

IV.1.6. Nukleotidno sekvencioniranje produkata PCR-a

Specifičnost PCR-a se može ocijeniti pregledom nukleotidnog slijeda produkta PCR-a od 155 bp.

(a) Produkt PCR-a se očisti od agaroznog gela ili otopine.

(b) Fragment se sekvencionira upotrebom istih starter-molekula koje su upotrijebljene u PCR-u ili vektorskih starter-molekula ukoliko su bile klonirane u vektoru prije sekvencioniranja.

(c) Nukleotidna sekvenca se uspoređuje s onom za segment 8 virusa ZAL koji je dostupan u EMBL bazi podataka nukleotidnog sekvencioniranja (pristupni brojevi su Y10404, AJ012285, AJ242016).

(d) Prisutnost slijeda koji odgovara onom za segment 8 virusa ZAL predstavlja dokaz da uzorak sadrži RNA virus ZAL.

V. PRETRAŽIVANJE OTISAKA BUBREGA METODOM IFAT

V.1. Za pretraživanje otisaka bubrega metodom IFAT uspostavljen je sljedeći protokol

V.2. Priprema i bojanje otisaka

V.2.1. Predmetnice se tri minute fiksiraju u acetonu ili metanolu/acetonu (1 : 1) i zatim osuše na zraku. Prije bojenja pregleda se svaka predmetnica i odgovarajuća područja se zaokruže pomoću olovke ImmEdgeTM ili na sličan način, te se ostavi da se osuši na zraku. Predmetnice se zatim stave u otopinu za blokiranje (6% obrano mlijeko u PBS-u koji sadrži 0.2% Tween 20), te se 30 minuta inkubiraju na sobnoj temperaturi uz lagano protresanje. Svako takvo stakalce se osuši i spremi vodoravno u kutiju za predmetnice koja sadrži vlažnu maramicu za održavanje vlažne atmosfere.

V.2.2. Svaki otisak se prelije otopinom monoklonskog protutijela 3H6F8 za virus ZAL (ili drugog protutijela dokazane specifičnosti i učinkovitosti), nakon čega se kutija s predmetnicom zatvori i 60 minuta inkubira na sobnoj temperaturi uz protresanje. Protutijelo se obično razrjeđuje u omjeru 1 : 10 do 1 : 100 u 1% obranom mlijeku, ali se stvarni omjer razrjeđenja mora odrediti za svaku pojedinačnu seriju. Predmetnice se ispiru tri puta po dvije minute u PBS-u koji sadrži 0,1% Tween 20. Svaki se otisak prekriva otopinom koja sadrži FITC kozji protu-mišji konjugat razrijeđen u omjeru 1 : 1 000 u 1% obranom mlijeku i 60 minuta inkubiraju u vlažnom okolišu na sobnoj temperaturi. Predmetnice se ispiru tri puta po dvije minute u PBS-u koji sadrži 0,1% Tween 20. Svako stakalce se prekriva otopinom CITIFLUORTM (500 µl CITIFLUORTM pomiješano s 1,5 ml 0,1% (v/v) Tween 20 u PBS-u) ili drugim prikladnim zaštitnim medijem tijekom 10 minuta. Stakalca se ispiru tri puta u PBS-u koji sadrži 0,1% Tween 20. Ako je potrebno dvostruko bojenje, svaki se otisak može prekriti propidijevim jodidom (0.01 mg/ml) u PBS-u koji sadrži 0,1% Tween 20 i inkubirati tri minute na sobnoj temperaturi. Stakalca se ispiru tri puta po dvije minute u PBS-u koji sadrži 0,1% Tween 20. Stakalca se osuše i stave u CITIFLUORTM ili drugi odgovarajući medij. Prije mikroskopskog pregleda, stakalca se pohrane na tamno mjesto pri temperaturi od 4 °C.

V.3. Pretraživanje upotrebom fluorescentne mikroskopije

Svako se stakalce pretraži mikroskopom prikladnim za epi-fluorescentno osvjetljenje, upotrebom odgovarajućeg filtra koji pobuđuje FITC na emitiranje karakteristične zelene fluorescencije. Sva polja unutar područja označenog pomoću olovke ImmEdgeTM pretražuju se pod objektivima x10 i x20, a sumnjiva područja (ona koja pokazuju zelenu fluorescenciju) dodatno se pretražuju pod objektivom x40 i fazno/fluorescentnim osvjetljenjem kako bi bili sigurni da je fluorescentna obojenost povezana sa stanicama. Fazne koordinate sumnjivih područja treba zabilježiti radi kasnijeg potvrđivanja prirode fluorescencije koje obavlja drugi ispitivač. Nakon pregleda koji obavi prvi ispitivač, stakalca koja su pozitivna ili sumnjiva ponovno pretražuje drugi ispitivač i potvrđuje rezultate.

V.4. Kontrole

V.4.1. Za svaku seriju stakalaca obojenih za IFAT, moraju biti uključena tri tipa kontrole:

– otisak bubrega od nezaraženog atlantskog lososa (negativna kontrola),

– nezaražena stanična kultura SHK-1 ili druga prijemljiva stanična kultura (negativna kontrola),

– stanična kultura SHK-1 ili druga prijemljiva stanična kultura zaražena virusom ZAL (pozitivna kontrola).

V.4.2. Ukoliko je dostupno kao dodatna pozitivna kontrola, preporučuje se otisak bubrega od atlantskog lososa zaraženog virusom ZAL.

V.4.3. Ako se s bilo kojom od negativnih kontrola dobije pozitivan rezultat, test se smatra nevaljalim za sva stakalca u toj seriji. Ako se za sva stakalca u seriji, uključujući pozitivne kontrole, dobije negativan rezultat, test se smatra nevaljalim za sva stakalca u toj seriji. U slučaju kada nevaljale kontrole obezvrijede cijelu seriju stakalaca, ta se stakalca moraju uništiti te se izvodi ponovno testiranje upotrebom dupliciranih otisaka.

V.5. Pretraživanje drugih tkiva

Ova se tehnika može primijeniti na druga tkiva ribe, kao što su jetra, slezena i srce, pod uvjetom da se na stakalce može prenijeti dovoljna količina endotelnih stanica, leukocita ili limfocita. Postupak bojenja ostaje isti za sva tkiva, iako je kod nekih tkiva bolje izostaviti bojenje propidijevim jodidom, očekujući da će se tipovi stanica prisutni u otisku identificirati faznim osvjetljenjem.

VI. HISTOLOGIJA

Djelići preparirani parafinom režu se na veličinu od 5 μm i boje upotrebom hematoksilina i eozina. Histološke promjene povezane s ZAL opisane su u trenutno važećem izdanju OIE Dijagnostičkog priručnika za bolesti životinja akvakulture.

VII. AKRONIMI I KRATICE

|  |  |
| --- | --- |
| cDNA | komplementarna deoksiribonukleinska kiselina |
| CPU | citopatogeni učinak |
| DEPC | dietilpirokarbonat |
| dNTP | deoksinukleotid trifosfat |
| FITC | fluorescin izotiocianat |
| IF | imunofluorescencija |
| IFAT | test neizravne imunofluorescencije |
| OIE | svjetska organizacija za zdravlje životinja |
| ZNG(V) | zarazna nekroza gušterače (virus) |
| ZAL(V) | zarazna anemija lososa (virus) |
| PBS | solna otopina s fosfatnim puferom |
| RNA | ribonukleinska kiselina |
| RT-(PCR) | reverzna traskriptaza (lančana reakcija polimeraze) |
| SHK-1 | stanice iz prednjeg bubrega lososa |
| TCID50 | infektivna doza kulture tkiva pri 50 % ciljnog učinka |

[[1](#footnote-29081-1-backlink)] Ovim Pravilnikom preuzimaju se odredbe Odluke Komisije 2003/466/EZ od 13. lipnja 2003. godine kojom se utvrđuju kriteriji za određivanje zona i službeni nadzor u slučaju pojave sumnje ili potvrđenih slučajeva zarazne anemije lososa

[[2](#footnote-29081-2-backlink)] Pravilnikom o uvjetima zdravlja životinja koji se primjenjuju na životinje akvakulture i njihove proizvode te sprječavanju i suzbijanju određenih bolesti akvatičnih životinja („Narodne novine“, broj 42/2008) preuzete su odredbe Direktive Vijeća 2006/88/EZ od 24. listopada 2006. o veterinarsko- zdravstvenim uvjetima za životinje i proizvode akvakulture, te o sprječavanju i suzbijanju određenih bolesti vodenih organizama.

[[3](#footnote-29081-3-backlink)] Člancima 28., 29., 32. i 34. Pravilnika o uvjetima zdravlja životinja koji se primjenjuju na životinje akvakulture i njihove proizvode te sprječavanju i suzbijanju određenih bolesti akvatičnih životinja (»Narodne novine«, broj 42/2008) preuzete su odredbe članaka 28., 29., 32. i 34. Direktive Vijeća 2006/88.

[[4](#footnote-29081-4-backlink)] Članke 28., 29., 32., 33., 34., 35., 47. i 54. Pravilnika o uvjetima zdravlja životinja koji se primjenjuju na životinje akvakulture i njihove proizvode te sprječavanju i suzbijanju određenih bolesti akvatičnih životinja (»Narodne novine«, br. 42/2008) preuzete su odredbe članaka 28., 29., 32., 33., 34., 35., 47. i 54. Direktive Vijeća 2006/88.

Pravilnik, NN 150/2009-3665