## Pravilnik o analitičkim metodama za jaka alkoholna i alkoholna pića

### NN 138/2005 (23.11.2005.), Pravilnik o analitičkim metodama za jaka alkoholna i alkoholna pića

# MINISTARSTVO POLJOPRIVREDE, ŠUMARSTVA I VODNOGA GOSPODARSTVA

**2599**

Na temelju članka 35. stavka 2. i 3. podstavka
5. Zakona o hrani (»Narodne novine«, br. 117/03,
130/03, 48/04), ministar poljoprivrede, šumarstva i vodnoga gospodarstva,
donosi

## PRAVILNIK

### O ANALITIČKIM METODAMA ZA JAKA ALKOHOLNA I ALKOHOLNA PIĆA

I. OPĆE ODREDBE

Članak 1.

Ovim Pravilnikom propisuju se metode uzimanja
uzoraka i fizikalno-kemijske metode analize jakih alkoholnih i alkoholnih pića
(u daljnjem tekstu: alkoholna pića).

Članak 2.

Odredbe ovog Pravilnika ne primjenjuju se na
piva, vina, voćna vina i druge proizvode od grožđa, vina i voćnih vina i
njihovih proizvoda koji su uređeni posebnim propisima.

Članak 3.

U smislu ovog Pravilnika značenje pojmova je
sljedeće:

1. *»granica
ponovljivosti«* – vrijednost manja ili jednaka apsolutnoj razlici između dva
rezultata ispitivanja dobivena pod uvjetima ponovljivosti (isti analitičar,
isti uređaji, isti laboratorij i kratak vremenski interval) uz vjerojatnost 95
%;

2. *»granica
obnovljivosti«* – vrijednost manja ili jednaka apsolutnoj razlici između dva
rezultata ispitivanja dobivena pod uvjetima obnovljivosti (različiti
analitičari, različiti uređaji i različiti laboratoriji) uz vjerojatnost 95 %;

3. *»točnost«*
– bliskost rezultata mjerenja i prihvaćene referentne vrijednosti.

II. METODE UZIMANJA
UZORKA

Članak 4.

Uzorak alkoholnih pića uzima se:

1. u proizvodnji – iz proizvodnih serija,

2. u prometu – iz ambalažnih jedinica pošiljke.

Članak 5.

Uzorak alkoholnih pića za ispitivanje mora
predstavljati prosječni sastav cjelokupne količine proizvoda od kojeg se uzorak
uzima, u količini koja je potrebna za fizikalno-kemijsku analizu.

Članak 6.

Pod proizvodnom serijom alkoholnih pića, prema
ovom Pravilniku, podrazumijeva se odgovarajuća količina proizvoda iste vrste i
odgovarajućeg volumena.

Pod ambalažnim jedinicama alkoholnih pića
podrazumijevaju se utvrđene količine proizvoda iste vrste pakirane u
pojedinačna ambalažna pakiranja odgovarajućeg volumena, s obveznom oznakom za
identifikaciju.

Članak 7.

Uzorak alkoholnih pića mora sadržavati najmanje
dva primjerka uzeta pojedinačno, i to za analizu i superanalizu,
s tim što oni moraju biti identični po sastavu i jednaki po masi.

Fizička ili pravna osoba od koje se uzorak uzima
ima pravo tražiti još jedan uzorak koji ostaje kod nje.

Članak 8.

Ispitni uzorci alkoholnih pića koji nisu u
originalnom pakiranju pakiraju se u posude koje osiguravaju očuvanje kakvoće do
trenutka analize.

Članak 9.

Broj uzoraka ovisi o veličini proizvodne serije,
a utvrđuje se na temelju Tablice 1.

*Tablica 1.*

|  |  |  |
| --- | --- | --- |
| Alkoholna pića | Količina od koje se uzima uzorak | Broj uzoraka |
| Uzimanje uzoraka u originalnom pakiranju |
| a) broj ambalažnih jedinica | iz pošiljke do 100 ambalažnih jedinica | najmanje 1 |
| b) broj ambalažnih jedinica | iz pošiljke od 100 do 500 ambalažnih jedinica | najmanje 2 |
| c) broj ambalažnih jedinica | za svakih sljedećih 500 ambalažnih jedinica | najmanje 2 |

Uzorak mora biti dostatan za provođenje analize.

Članak 10.

Ako ukupno uzeti uzorci alkoholnih pića iznose
više od dva pojedinačna primjerka – jedinice, formira se jedan uzorak, s tim
što svaki primjerak može biti izdvojen za uzorak.

Članak 11.

Zapisnik o uzimanju uzoraka alkoholnih pića
obavezno sastavlja osoba koja uzima uzorak za ispitivanje i u njega unosi
podatke: mjesto, datum i vrijeme uzimanja uzorka, svrha uzimanja uzorka, vrsta
i količina alkoholnih pića od kojih se uzima uzorak, broj pojedinačno uzetih
uzoraka i količina ukupno uzetog uzorka, oznake za identifikaciju uzoraka i
količina uzorka koji se dostavlja na ispitivanje.

Zapisnik potpisuju osoba koja uzima uzorak i
osoba od koje se uzorak uzima.

III. REFERENTNE
FIZIKALNO-KEMIJSKE METODE ANALIZE

Članak 12.

Za utvrđivanje sukladnosti alkoholnih pića s
propisanim općim zahtjevima kakvoće u svrhu službene kontrole koriste se
sljedeće metode:

I. Određivanje stvarne alkoholne jakosti
izražene volumenom (u daljnjem tekstu: alkoholna jakost) u alkoholnim pićima piknometrijom, elektronskom denzimetrijom
i denzimetrijom uz upotrebu hidrostatske
vage;

II. Određivanje ukupnog suhog ekstrakta gravimetrijskom metodom;

III. Određivanje hlapivih komponenata i metanola
metodom plinske kromatografije;

IV. Određivanje trans-anetola
metodom plinske kromatografije;

V. Određivanje glicirizinske
kiseline metodom tekućinske kromatografije
visoke djelotvornosti;

VI. Određivanje kalkona
metodom tekućinske kromatografije
visoke djelotvornosti;

VII. Određivanje koncentracije žumanjka
fotometrijskom metodom;

VIII. Određivanje hlapive kiselosti;

IX. Određivanje cijanovodične kiseline;

X. Određivanje ukupnih šećera.

Članak 13.

Dozvoljene su i druge analitičke metode pod
uvjetom da su točnost i preciznost (ponovljivost i obnovljivost) metoda
ekvivalentni onima dobivenim primjenom referentnih analitičkih metoda koje su
dane u Prilogu 1.

Članak 14.

Kada nisu dane analitičke metode za određivanje
prisutnosti i količine tvari koje se nalaze u pojedinim alkoholnim pićima, mogu
se koristiti sljedeće metode:

1. analitičke metode koje su potvrđene prema
međunarodno priznatim postupcima;

2. analitičke metode usklađene s preporučenim
standardima Međunarodne organizacije za standardizaciju (ISO);

3. analitičke metode koje su priznate od
Generalne skupštine Međunarodnog ureda za vinogradarstvo i vinarstvo (OIV) i
koje je taj Ured objavio;

4. ako određena metoda nije obuhvaćena točkama
1., 2. ili 3., a u svrhu točnosti, ponovljivosti i obnovljivosti metode, može
se koristiti bilo koja druga prikladna analitička metoda.

Članak 15.

Ovaj Pravilnik stupa na snagu osmog dana od dana
objave u »Narodnim novinama«.

Klasa: 011-02/05-01/61

Urbroj: 525-1-05-1

Zagreb, 11. studenoga 2005.

Ministar

**Petar Čobanković**, v. r.

**PRILOG 1.**

ANALITIČKE METODE
ANALIZEALKOHOLNIH PIĆA

I. ODREĐIVANJE ALKOHOLNE
JAKOSTI U ALKOHOLNIM PIĆIMA

**Uvod**

Referentna metoda uključuje dva dodatka:

Dodatak I: Priprema destilata

Dodatak II: Mjerenje gustoće destilata

**1.
Područje primjene**

Ova metoda je prikladna za određivanje stvarne alkoholne jakosti u alkoholnim
pićima.

**2.
Referentni standardi**

ISO 3696:1987: Voda za upotrebu u analitičkim laboratorijima – Zahtjevi i test
metode.

**3.
Izrazi i definicije**

*3.1.
Referentna temperatura:*

Referentna temperatura za određivanje alkoholne jakosti, gustoće i relativne
gustoće alkoholnih pića je 20°C.

Napomena 1.: Izraz »na t °C« je namijenjen za sva određivanja (gustoće ili
alkoholne jakosti) izražen na temperaturi različitoj od referentne temperature
od 20°C.

*3.2.
Gustoća:*

Gustoća je masa po jedinici volumena alkoholnih pića na 20°C u vakuumu.
Izražava se u kilogramima po kubičnom metru i njezin simbol je r20°C ili r20.

*3.3.
Relativna gustoća:*

Relativna gustoća je omjer, izražen kao decimalni broj, gustoće alkoholnih pića
na 20°C i gustoće vode na istoj temperaturi. Označava se simbolom d20°C/20°Cili d20/20, ili jednostavno d kada ne postoji mogućnost
zabune. Karakteristika koja je mjerena mora biti navedena na certifikatu samo
uz korištenje gore navedenih simbola.

Napomena 2.: Moguće je dobiti relativnu gustoću iz gustoće r20 na 20°C:

           r20 = 998,203 × d20/20
ili d20/20 = r20/998,203

gdje je 998,203 gustoća vode na 20°C.

3.4.      *Stvarna alkoholna jakost*:

Stvarna alkoholna jakost u alkoholnim pićima je jednaka broju litara etilnog
alkohola sadržanog u 100 l mješavine voda-alkohol koja ima istu gustoću kao i
alkohol ili alkoholno piće nakon destilacije. Referentne vrijednosti za
alkoholnu jakost (% vol) na 20°C u odnosu na gustoću na 20°C za različite
mješavine voda-alkohol koje se moraju koristiti su one dane u Prilogu 2.

Opća jednadžba koja se odnosi na alkoholnu jakost i gustoću mješavine
voda-alkohol na danoj temperaturi je dana u Prilogu 3.

Napomena 3.: Za likere i emulzijske likere kod kojih je vrlo teško izmjeriti
točan volumen uzorak se mora prvo izvagati i alkoholna jakost se prvo računa po
masi.

Jednadžba za pretvorbu:

                                          AJM(%mase)× r20(uzorka)

            alkoholna
jakost (% vol) = ———————————

                                                        r20(alkohola)

            gdje
je AJM = alkoholna jakost po masi

ń20 (alkohola) = 789,24 kg/m3

**4.
Princip**

Nakon destilacije, alkoholna jakost u destilatu određuje se piknometrijom,
elektronskom denzimetrijom ili denzimetrijom
uz korištenje hidrostatske vage.

            DODATAK
I: PRIPREMA DESTILATA

**1.
Područje primjene**

Ova metoda je prikladna za pripremu destilata koji se koriste za određivanje
stvarne alkoholne jakosti u alkoholnim pićima.

**2.
Princip**

Alkoholna pića se destiliraju radi odvajanja etilnog alkohola i drugih hlapivih
spojeva iz ekstrakta (tvari koje se ne destiliraju).

**3.
Reagensi**

3.1.      Kuglice za
vrenje

3.2.      Koncentrirana
emulzija protiv pjenjenja (za emulzijske likere)

**4.
Aparatura**

Uobičajena laboratorijska oprema, a posebno:

4.1.      Vodena kupelj
koja može održavati temperaturu između 10 i 15°C.

Vodena kupelj koja može održavati temperaturu na 20°C (± 0,2°C).

4.2.      Odmjerne tikvice klase A, od 100 ml i 200 ml, koje su
umjerene na 0,1 % odnosno na 0,15 %.

4.3.      Aparatura za
destilaciju:

4.3.1.   Opći zahtjevi

Aparatura za destilaciju mora zadovoljavati sljedeće zahtjeve:

– broj spojeva ne smije biti veći od strogo
određenog minimuma koji je potreban da se osigura nepropusnost sustava,

– uključenje uređaja namijenjenog za sprečavanje burnog vrenja (gubitak vrele
tekućine isparavanjem) i radi reguliranja brzine destilacije para bogatih
alkoholom,

– brza i potpuna kondenzacija alkoholnih para,

– skupljanje prvih frakcija destilacije u vodenom mediju.

Izvor topline se mora koristiti uz odgovarajući difuzor
topline da se spriječe sve pirogene reakcije u
ekstraktu.

4.3.2.   Primjer prikladne aparature
za destilaciju je dan na Slici 1. i uključuje sljedeće dijelove:

– tikvica s okruglim dnom od 1 l i spojevima od
brušenog stakla,

– rektifikacijska
kolona visine najmanje 20 cm (npr. Vigreux kolona),

– koljenasti konektor s približno 10 cm dugim
hladilom s ravnim rubom (hladilo tipa West) koji je
postavljen okomito,

– spiralna cijev za hlađenje duga 40 cm,

– ispusna cijev kojom se destilat dovodi do dna
prihvatne graduirane tikvice u kojoj se nalazi mala količina vode.

Napomena: Gore opisana aparatura je namijenjena
za uzorak od najmanje 200 ml. Međutim, manja količina uzorka (100 ml) se može
destilirati uz upotrebu manje tikvice za destilaciju, pod uvjetom da se koristi
stakleni balon za destilaciju ili neki drugi uređaj koji sprečava prelazak
smjese tekućine i pare u hladilo.

**5.
Skladištenje uzoraka za testiranje**

Uzorci se skladište na sobnoj temperaturi prije
analize.

**6.
Postupak**

Uvodna napomena:

Destilacija se također može provoditi prema
postupku koji je objavio IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry, 1968).

6.1.      Provjera
aparature za destilaciju.

Aparatura koja se koristi mora imati sljedeća
svojstva:

Destilacija 200 ml otopine voda-alkohol poznate
koncentracije od približno 50 % vol ne smije uzrokovati gubitak alkohola veći
od 0,1 % vol.

6.2.      Alkoholna
pića čija je alkoholna jakost manja od 50 % vol.

Odmjeri se 200 ml alkoholnog pića u odmjernu tikvicu.

Zabilježi se temperatura te tekućine ili se
održava na standardnoj temperaturi (20°C).

Uzorak se izlije u tikvicu s okruglim dnom
aparature za destilaciju, a odmjerna tikvica se
ispere s tri alikvota od kojih svaki sadrži približno
20 ml destilirane vode. Svaki alikvot vode za
ispiranje doda se sadržaju destilacijske tikvice.

Napomena: To razrjeđenje od 60 ml je dovoljno za
alkoholna pića koja sadrže manje od 250 g suhog ekstrakta po litri. U
protivnom, da bi se spriječila piroliza, volumen vode
za ispiranje mora biti najmanje 70 ml ako je koncentracija suhog ekstrakta 300
g/l, 85 ml za 400 g/l suhog ekstrakta i 100 ml za 500 g/l suhog ekstrakta (neki
voćni i emulzijski likeri). Ti se volumeni podese proporcionalno različitim
volumenima uzorka.

Doda se nekoliko kuglica za vrenje (3.1) (i
sredstvo protiv pjenjenja za emulzijske likere).

Ulije se 20 ml destilirane vode u originalnu odmjernu tikvicu koja će se koristiti za prihvaćanje
destilata. Ta tikvica se zatim mora staviti u hladnu vodenu kupelj (4.1) (10 do
15°C za alkoholna pića s okusom anisa).

Destilira se izbjegavajući burno vrenje i
karbonizaciju, povremeno miješajući sadržaj tikvice, sve dok razina destilata
ne bude nekoliko milimetara ispod kalibracijske oznake odmjerne
tikvice.

Kada temperatura ovog destilata padne za
približno 0,5°C početne temperature tekućine, nadopuni se do oznake
destiliranom vodom i dobro promiješa.

Takav destilat se koristi za određivanje
alkoholne jakosti (Dodatak II).

6.3.      Alkoholna
pića čija je alkoholna jakost veća od 50 % vol.

Odmjeri se 100 ml alkoholnog pića u odmjernu tikvicu od 100 ml i izlije u tikvicu s okruglim
dnom aparature za destilaciju.

Odmjerna tikvica se ispere
nekoliko puta destiliranom vodom i taj sadržaj se dodaje sadržaju destilacijske
tikvice s okruglim dnom. Mora se koristiti dovoljno vode da sadržaj tikvice
dosegne približno 230 ml.

Ulije se 20 ml destilirane vode u odmjernu tikvicu od 200 ml koja će se koristiti za
prihvaćanje destilata. Ta tikvica se zatim mora staviti u hladnu vodenu kupelj
(4.1) (10 do 15°C za alkoholna pića s okusom anisa).

Destilira se, uz povremeno miješanje sadržaja,
sve dok razina destilata ne bude nekoliko milimetara ispod kalibracijske oznake
odmjerne tikvice od 200 ml.

Kada temperatura ovog destilata padne za približno
0,5°C početne temperature tekućine, nadopuni se do oznake destiliranom vodom i
dobro promiješa.

Takav destilat se koristi za određivanje
alkoholne jakosti (Dodatak II).

Napomena: Alkoholna jakost alkoholnih pića je
dva puta jača od alkoholne jakosti destilata.

DODATAK II.

MJERENJE GUSTOĆE
DESTILATA

METODA A: ODREĐIVANJE
STVARNE ALKOHOLNE JAKOSTI U ALKOHOLNIM PIĆIMA – MJERENJE PIKNOMETROM

**A.1.
Princip**

Alkoholna jakost se dobije iz gustoće destilata
izmjerene piknometrijom.

**A.2.
Reagensi**

Tijekom analize, osim ako nije drugačije
određeno, koriste se samo reagensi potvrđene analitičke kvalitete i voda čiji
stupanj kvalitete je najmanje 3 u skladu s definicijom iz standarda ISO
3696:1987.

A.2.1.  Otopina natrij klorida (2 % m/V)

Za pripremu 1 litre, odvaže se 20 g natrij
klorida i otopi do 1 litre vodom.

**A.3.
Aparatura**

Uobičajena laboratorijska oprema, a posebno:

A.3.1.  Analitička vaga s preciznošću
očitanja od 0,1 mg.

A.3.2.  Termometar, sa spojem od brušenog
stakla, kalibriran na desetinke stupnja od 10 do 30°C. Taj se termometar mora umjeriti ili provjeriti u odnosu na umjereni termometar.

A.3.3.  Piknometar
od Pyrex stakla, čiji kapacitet je približno 100 ml,
opremljen s odvojivim brušenim termometrom (A.3.2.). Piknometar
ima bočnu cijev dužine 25 mm i unutrašnjeg promjera 1 mm (maksimalno) koja
završava konusnim brušenim spojem. Drugi piknometri
kao što je opisano u ISO 3507, npr. od 50 ml mogu se
koristiti ako je prikladno.

A.3.4.  Tara posuda istog vanjskog volumena
(do 1 ml) kao i piknometar i s masom jednakom masi piknometra napunjenog tekućinom gustoće 1,01 (otopina
natrij klorida A.2.1.).

A.3.5.  Toplinski izolirana posuda koja
točno pristaje uz tijelo piknometra.

Napomena 1.: Metoda za određivanje gustoće
alkoholnih pića u vakuumu zahtijeva upotrebu vage s dvije plitice, piknometra i tara posude istog vanjskog volumena kako bi se
poništio utjecaj tlaka zraka u bilo kojem trenutku. Ova jednostavna tehnika
može se primijeniti upotrebom vage s jednom pliticom, pod uvjetom da se tara
posuda izvaže ponovo kako bi se pratile promjene tlaka zraka tijekom vremena.

**A.4.
Postupak**

Uvodne napomene:

Sljedeći postupak je opisan za upotrebu piknometra za određivanje alkoholne jakosti; daje najveću
točnost. Međutim, također je moguće koristiti manji piknometar,
na primjer od 50 ml.

A.4.1.              Umjeravanje
piknometra

Piknometar se umjerava
određivanjem sljedećih parametara:

– tara praznog piknometra,

– volumena piknometra
na 20°C,

– mase piknometra
napunjenog vodom na 20°C.

A.4.1.1.
Umjeravanje upotrebom vage s jednom pliticom:

Odredi se:

– masa čistog, suhog piknometra
(P),

– masa piknometra
napunjenog s vodom na t°C (P1),

– masa tara posude (T0).

A.4.1.1.1.
Izvaže se čisti, suhi piknometar (P).

A.4.1.1.2.
Piknometar se pažljivo napuni destiliranom vodom na
sobnoj temperaturi i namjesti se termometar.

Piknometar se pažljivo obriše i
stavi u toplinski izoliranu posudu. Miješa se okretanjem posude dok očitanje
temperature na termometru ne bude konstantno.

Poravna se nivo vode na vrhu bočne cjevčice.
Pažljivo se očita temperatura t°C i ako je potrebno korigira obzirom na točnost
skale termometra.

Izvaže se piknometar
napunjen vodom (P1).

A.4.1.1.3.
Izvaže se tara posuda (T0).

A.4.1.1.4.
Izračunavanje

– Tara praznog piknometra
= P – m

gdje je m masa zraka u piknometru.

m = 0,0012 × (P1 – P)

Napomena 2.: 0,0012 je gustoća suhog zraka na
20°C kod tlaka od 760 mmHg

– Volumen piknometra
na 20°C:

V20°C = [P1
– (P – m)] × Ft’1

gdje je Ft faktor za temperaturu t°C uzet iz
Tablice 1. Priloga 1. Pravilnika o fizikalno-kemijskim metodama analize mošta,
vina, drugih proizvoda od grožđa i vina te voćnih vina (»Narodne novine« br. 106/04).

V20°C se mora odrediti s točnošću 0,001 ml.

– Masa vode u piknometru
na 20°C:

M20°C = V20°C × 0,998203

gdje je 0,998203 gustoća vode na 20°C.

A.4.1.2.
Metoda za umjeravanje uz upotrebu vage s dvije plitice:

A.4.1.2.1.
Tara posuda se stavi na lijevu pliticu, a čisti, suhi piknometar
s prihvatnim čepom na desnu pliticu. Balansiraju se stavljanjem utega na stranu
piknometra: p grami.

A.4.1.2.2.
Piknometar se pažljivo napuni s destiliranom vodom na
sobnoj temperaturi i namjesti termometar; piknometar
se pažljivo obriše i stavi u toplinski izoliranu posudu; miješa se okretanjem
posude dok očitanje temperature na termometru ne bude konstantno.

Poravna se nivo vode na vrhu bočne cjevčice.
Očisti se bočna cijev, namjesti prihvatni čep; pažljivo se očita temperatura
t°C i ako je potrebno korigira se obzirom na točnost skale termometra.

Izvaže se piknometar
napunjen s vodom, s p’ težinom u gramima koja uspostavlja ravnotežu.

A.4.1.2.3.
Izračunavanje

– Tara praznog piknometra
= p + m

gdje je m masa zraka u piknometru.

m = 0,0012 × (p – p’)

– Volumen piknometra
na 20°C:

V20°C = (p + m – p’) × Ft’1

gdje je Ft faktor za temperaturu t°C uzet iz
Tablice 1. Priloga 1. Pravilnika o fizikalno-kemijskim metodama analize mošta,
vina, drugih proizvoda od grožđa i vina te voćnih vina (»Narodne novine« br.
106/04).

V20°C se mora odrediti s točnošću
0,001 ml.

– Masa vode u piknometru
na 20°C:

M20°C = V20°C × 0,998203

gdje je 0,998203 gustoća vode na 20°C.

A.4.2.  Određivanje alkoholne jakosti test
uzorka

A.4.2.1.
Upotreba vage s jednom pliticom.

A.4.2.1.1.
Izvaže se tara posuda, težina T1.

A.4.2.1.2.
Izvaže se piknometar s pripremljenim destilatom (vidi
Dodatak I), P2 je njegova težina na t°C.

A.4.2.1.3.
Izračunavanje

– dT = T1 – T0

– Masa praznog piknometra
u trenutku mjerenja

= P – m + dT

– Masa tekućine u piknometru
na t°C

= P2 – (P – m + dT)

– Gustoća na t°C u g/ml

– rt°C = [P2
– (P – m + dT)]/V20°C

– Gustoăa na t°C se
izrazi u kilogramima po m3 mnoţenjem rt°C s 1 000, vrijednost
koja je poznata kao rt.

– rt se korigira na 20°C
korištenjem tablice gustoća rt za mješavinu
voda-alkohol koja je dana u Tablici 1. Priloga 2. Pravilnika o
fizikalno-kemijskim metodama analize mošta, vina, drugih proizvoda od grožđa i
vina te voćnih vina (»Narodne novine« br. 106/04).

U vodoravnoj koloni te tablice koja odgovara temperaturi
T u cijelim stupnjevima neposredno ispod t°C, pronađe se najmanja gustoća koja
je veća od rt. Tabelarnu razliku
ispod ove gustoće upotrijebimo za izračun gustoće rt alkoholnih pića pri
temperaturi T u cijelim stupnjevima.

– Korištenjem cijele temperaturne linije,
izračuna se razlika između gustoće r’
iz tablice odmah iznad rt i izračunate gustoće
t. Ta se razlika podjeli s tabelarnom razlikom koja se nalazi desno od gustoće
’. Kvocijent je decimalni omjer alkoholne jakosti, dok se cijeli broj alkoholne
jakosti nalazi na vrhu stupca u kojem se nalazi gustoća r’ (Dt,
alkoholna jakost).

Napomena 4: Alternativno se piknometar
može držati u vodenoj kupelji na 20°C (± 2°C) kada se nadopunjava do oznake.

A.4.2.1.4.
Rezultat

Korištenjem gustoće r20 izračuna se stvarna
alkoholna jakost upotrebom tablica s alkoholnim jakostima koje su niže
navedene:

Tablica koja navodi vrijednost alkoholne jakosti
(% vol) na 20°C kao funkciju gustoće na 20°C mješavine voda-alkohol dana je u
Prilogu 2.

A.4.2.2.
Metoda uz upotrebu vage s jednom pliticom

A.4.2.2.1.
Izvaže se piknometar s pripremljenim destilatom (vidi
dio I), p’’ je masa na t°C.

A.4.2.2.2.
Izračunavanje

                        –
Masa tekućine u piknometru na t°C

                        =
p + m – p’’

                        –
Gustoća na t°C u g/ml

                        rt°C = (p + m – p’’)/V20°C

– Gustoća na t°C se izrazi u kilogramima po m3 i provodi se korekcija temperature u cilju
izračunavanja alkoholne jakosti na 20°C, kao đto je
navedeno ranije kod upotrebe vage s jednom pliticom.

A.5.     Karakteristike
provođenja metode (preciznost)

A.5.1.  Statistički rezultati međulaboratorijskog testiranja

Sljedeći podaci su dobiveni iz međunarodnog
istraživanja provođenja metode koje je provedeno u skladu s međunarodno
dogovorenim postupcima [1] [2].

Godina međulaboratorijskog
testiranja 1997.

Broj
laboratorija                                     20

Broj uzoraka                                            6

|  |  |  |  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Uzorci | A | B | C | D | E | F |
| Broj laboratorija preostalih nakon odbacivanja ekstremnih vrijednosti | 19 | 20 | 17 | 19 | 19 | 17 |
| Broj odbacivanja ekstremnih vrijednosti (laboratorija) | 1 | – | 2 | 1 | 1 | 3 |
| Broj prihvaćenih rezultata | 38 | 40 | 34 | 38 | 38 | 34 |
| Srednja vrijednost (~~x~~) % vol | 23,77 26,51\* | 40,04 | 40,29 | 39,20 42,93\* | 42,24 45,73\* | 57,03 63,03\* |
| Standardna ponovljivost (Sr) % vol | 0,106 | 0,176 | 0,072 | 0,103 | 0,171 | 0,190 |
| Relativna standardna devijacija ponovljivosti (RSDr) (%) | 0,42 | 0,44 | 0,18 | 0,25 | 0,39 | 0,32 |
| Granica ponovljivosti (r) u % vol | 0,30 | 0,49 | 0,20 | 0,29 | 0,48 | 0,53 |
| Standardna devijacija obnovljivosti (SR) % vol | 0,131 | 0,236 | 0,154 | 0,233 | 0,238 | 0,322 |
| Relativna standardna devijacija obnovljivosti (RSDR) (%) | 0,52 | 0,59 | 0,38 | 0,57 | 0,54 | 0,53 |
| Granica obnovljivosti (R) u % vol | 0,37 | 0,66 | 0,43 | 0,65 | 0,67 | 0,90 |
| Vrste uzoraka  A = voćni liker; razina razdiobe (\*).  B = brandy; dvostruke slijepe probe.  C = whisky; dvostruke slijepe probe.  D = grapa; razina razdiobe (\*).  E = akvavit; razina razdiobe (\*).  F = rum; razina razdiobe (\*). | | | | | | |

METODA B: ODREĐIVANJE
STVARNE ALKOHOLNE JAKOSTI U ALKOHOLNIM PIĆIMA – MJERENJE ELEKTRONSKOM
DENZIMETRIJOM (NA OSNOVI REZONANTNE FREKVENCIJSKE OSCILACIJE UZORKA U
OSCILACIJSKOM MODULU)

**B.1.
Princip**

Gustoća tekućine se određuje elektronskim
mjerenjem oscilacija vibrirajuće U-cijevi. Da bi se provelo ovo mjerenje uzorak
se dodaje oscilirajućem sustavu čija je specifična oscilacijska frekvencija
tako modificirana zbog dodane mase.

**B.2.
Reagensi**

Tijekom analize, osim ako nije drugačije
određeno, koriste se samo reagensi potvrđene analitičke kvalitete i voda čiji
stupanj kvalitete je najmanje 3 u skladu s definicijom iz standarda ISO
3696:1987.

B.2.1.  Aceton (CAS 666-52-4) ili apsolutni
alkohol

B.2.2.  Suhi zrak.

**B.3.
Aparatura**

Uobičajena laboratorijska oprema, a posebno:

B.3.1.  Digitalni denzimetar

Elektronski denzimetar
za provođenje takvih mjerenja mora moći izraziti gustoću u g/ml na 5 decimalnih
mjesta.

Napomena 1: Denzimetar
mora biti smješten na savršeno stabilnom stalku koji je izoliran od svih
vibracija.

B.3.2.  Regulacija temperature

Rad denzimetra je
valjan samo ako je mjerni modul spojen s ugrađenim regulatorom temperature koji
može postići stabilnost temperature od ± 0,02°C ili bolju.

Napomena 2: Precizno podešavanje i praćenje
temperature u mjernom modulu su vrlo važni jer pogreška od 0,1°C može dovesti
do varijacije u gustoći od otprilike 0,1 kg/m.

B.3.3.  Šprica za injektiranje uzorka ili
automatski uzorkivač

**B.4.
Postupak**

B.4.1.  Kalibriranje denzimetra

Uređaj mora biti kalibriran u skladu s uputama
proizvođača prilikom prve upotrebe. Nakon toga se mora redovito kalibrirati i
provjeravati u odnosu na referentni standard ili internu laboratorijsku
referentnu otopinu pripremljenu od certificiranog referentnog standarda.

B.4.2.  Određivanje gustoće uzorka

B.4.2.1.
Ako je potrebno, prije mjerenja modul se očisti acetonom ili apsolutnim
alkoholom i osuši suhim zrakom. Ispere se uzorkom.

B.4.2.2.
Uzorak se injektira u modul (korištenjem šprice ili automatskog uzorkivača) tako da je modul potpuno napunjen. Tijekom
postupka punjenja mora se paziti da se potpuno uklone mjehurići zraka. Uzorak
mora biti homogen i ne smije sadržavati krute čestice. Sve suspendirane čestice
trebaju se ukloniti filtracijom prije analize.

B.4.2.3.
Kada se vrijednost očitanja stabilizira, zabilježi se gustoća 20 ili alkoholna
jakost prikazana na denzimetru.

B.4.3.  Rezultat

Kada se koristi gustoća 20, izračuna se stvarna
alkoholna jakost upotrebom tablica s alkoholnim jakostima koje su niže
navedene:

Tablica koja navodi vrijednosti alkoholne
jakosti (% vol) na 20°C kao funkciju gustoće na 20°C mješavine voda-alkohol
dana je u Prilogu 2.

**B.5.
Karakteristike provođenja metode (preciznost)**

B.5.1.  Statistički rezultati međulaboratorijskog testiranja

Sljedeći podaci su dobiveni iz međunarodnog
istraživanja provođenja metode koje je provedeno u skladu s međunarodno
dogovorenim postupcima [1] [2].

Godina međulaboratorijskog
testiranja 1997.

Broj
laboratorija                                     16

Broj uzoraka                                            6

|  |  |  |  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Uzorci | A | B | C | D | E | F |
| Broj laboratorija preostalih nakon odbacivanja ekstremnih vrijednosti | 11 | 13 | 15 | 16 | 14 | 13 |
| Broj odbacivanja ekstremnih vrijednosti (laboratorija) | 2 | 3 | 1 | - | 1 | 2 |
| Broj prihvaćenih rezultata | 22 | 26 | 30 | 32 | 28 | 26 |
| Srednja vrijednost (~~x~~) % vol | 23,81 26,52\* | 40,12 | 40,35 | 39,27 43,10\* | 42,39 45,91\* | 56,99 63,31\* |
| Standardna devijacija ponovljivosti (Sr) % vol | 0,044 | 0,046 | 0,027 | 0,079 | 0,172 | 0,144 |
| Relativna standardna devijacija ponovljivosti (RSDr) (%) | 0,17 | 0,12 | 0,07 | 0,19 | 0,39 | 0,24 |
| Granica ponovljivosti (r) % vol | 0,12 | 0,13 | 0,08 | 0,22 | 0,48 | 0,40 |
| Standardna devijacija obnovljivosti (SR) % vol | 0,054 | 0,069 | 0,083 | 0,141 | 0,197 | 0,205 |
| Relativna standardna devijacija obnovljivosti (RSDR) (%) | 0,21 | 0,17 | 0,21 | 0,34 | 0,45 | 0,34 |
| Granica obnovljivosti (R) % vol | 0,15 | 0,19 | 0,23 | 0,40 | 0,55 | 0,58 |
| Vrste uzoraka  A = voćni liker; razina razdiobe (\*).  B = brandy; dvostruke slijepe probe.  C = whisky; dvostruke slijepe probe.  D = grapa; razina razdiobe (\*).  E = akvavit; razina razdiobe (\*).  F = rum; razina razdiobe (\*). | | | | | | |

METODA C: ODREĐIVANJE
STVARNE ALKOHOLNE JAKOSTI U ALKOHOLNIM PIĆIMA – MJERENJE DENZIMETRIJOM UZ
UPOTREBU HIDROSTATSKE VAGE

C.1.     *Princip*

Alkoholna jakost u alkoholnim pićima može se
mjeriti denzimetrijom uz upotrebu hidrostatske
vage koja se zasniva na Arhimedovom zakonu po kojem svako tijelo uronjeno u
vodu istisne masu vode proporcionalnu masi tog tijela.

C.2.     *Reagensi*

Tijekom analize, osim ako nije drugačije
određeno, koriste se samo reagensi potvrđene analitičke kvalitete i voda čiji
stupanj kvalitete je najmanje 3 u skladu s definicijom iz standarda ISO
3696:1987.

C.2.1.  Otopina za čišćenje plovka (natrij hidroksid, 30 % m/V)

Za pripremu 100 ml, odvaže se 30 g natrij hidroksida i nadopuni do oznake 96 % vol etanolom.

C.3.     *Aparatura*

Uobičajena laboratorijska oprema, a posebno:

C.3.1.  Hidrostatska
vaga s jednom pliticom i osjetljivosti 1 mg.

C.3.2.  Plovak volumena najmanje 20 ml,
posebno prilagođen vagi, obješen na niti čiji promjer ne prelazi 0,1 mm.

C.3.3.  Mjerni cilindar s oznakama razine.
Plovak mora biti u mogućnosti potpuno zauzeti volumen cilindra ispod oznake;
kroz površinu tekućine može prolaziti samo nit. Mjerni cilindar mora imati
unutrašnji promjer najmanje 6 mm veći od unutrašnjeg promjera plovka.

C.3.4.  Termometar (ili sonda za mjerenje
temperature) označen u stupnjevima i desetinkama stupnjeva od 10 do 40°C,
kalibriran na 0,05°C.

C.3.5.  Utezi, kalibrirani od strane
priznatog certificiranog tijela.

Napomena 1: Korištenje vage s dvije plitice je
također moguće sukladno međunarodno važećim metodama.

C.4.     *Postupak*

Plovak i mjerni cilindar se moraju čistiti
između svakog mjerenja s destiliranom vodom, osušiti mekanim laboratorijskim
papirom koji ne ostavlja vlakna i isprati otopinom čija gustoća se određuje.
Mjerenje se mora izvršiti čim se postigne stabilnost uređaja kako bi se
ograničio gubitak alkohola isparavanjem.

C.4.1.  Kalibriranje vage

Iako vage obično imaju unutrašnji sustav
kalibriranja, hidrostatska vaga mora imati sposobnost
kalibriranja s utezima koje je umjerilo službeno
certificirano tijelo.

C.4.2.  Kalibriranje plovka

C.4.2.1.
Mjerni cilindar se napuni do oznake redestiliranom
vodom (ili vodom ekvivalentne čistoće, npr. mikrofiltriranom vodom čija provodljivost iznosi 18,2 M/cm)
na temperaturi između 15 i 25°C, ali najbolje na 20°C.

C.4.2.2.
Uroni se plovak i termometar, promiješa, očita gustoća tekućine s uređaja te,
ako je potrebno, ispravi očitana vrijednost tako da bude jednaka vrijednosti
vode pri mjerenju temperature.

C.4.3.  Provjera korištenjem otopine
voda-alkohol

C.4.3.1.
Mjerni cilindar se nadopuni do oznake s mješavinom voda-alkohol poznate
alkoholne jakosti na temperaturi između 15 i 25°C, ali najbolje na 20°C.

C.4.3.2.
Uroni se plovak i termometar, promiješa, očita gustoća tekućine (ili alkoholna
jakost ako je to moguće) s uređaja. Alkoholna jakost, utvrđena na taj način, će
biti jednaka prethodno utvrđenoj alkoholnoj jakosti.

Napomena 2: Ta otopina poznate alkoholne jakosti
također se može koristiti za kalibriranje plovka umjesto redestilirane
vode.

C.4.4.  Mjerenje gustoće destilata (ili
njegove alkoholne jakosti, ako to uređaj omogućava).

C.4.4.1.
Uzorak za testiranje se ulije u mjerni cilindar do graduirane oznake.

C.4.4.2.
Uroni se plovak i termometar, promiješa, očita gustoća tekućine (ili alkoholna
jakost ako je to moguće) s uređaja. Zabilježi se temperatura ako je gustoća
mjerena na t°C (Pt).

C.4.4.3.
Ispravi se Pt na 20 korištenjem tablice s
vrijednostima gustoće T za smjese vode i alkohola koja je dana u Tablici 1.
Priloga 2. Pravilnika o fizikalno-kemijskim metodama analize mošta, vina,
drugih proizvoda od grožđa i vina te voćnih vina (»Narodne novine« br. 106/04).

C.4.5.  Čišćenje plovka i mjernog cilindra

C.4.5.1.
Plovak se uroni u otopinu za čišćenje plovka u mjernom cilindru.

C.4.5.2.
Plovak se ostavi namakati sat vremena uz periodično okretanje.

C.4.5.3.
Ispere se s velikom količinom pitke vode, a nakon toga s destiliranom vodom.

C.4.5.4.
Osuši se s mekanim laboratorijskim papirom koji ne ostavlja vlakna.

Ovaj postupak se provodi prilikom prve upotrebe
plovka, a zatim redovno po potrebi.

C.4.6.  Rezultat

Kada se koristi gustoća 20, izračuna se stvarna
alkoholna jakost upotrebom tablica s alkoholnim jakostima koje su niže navedene:

Tablica koja navodi vrijednosti alkoholne
jakosti (% vol) na 20°C kao funkciju gustoće na 20°C mješavine voda-alkohol
dana je u Prilogu 2.

C.5.     *Karakteristike provođenja metode
(preciznost)*

C.5.1.  Statistički rezultati međulaboratorijskog testiranja

Sljedeći podaci su dobiveni iz međunarodnog
istraživanja provođenja metode koje je provedeno u skladu s međunarodno
dogovorenim postupcima [1] [2].

Godina međulaboratorijskog
testiranja 1997.

Broj
laboratorija                                     12

Broj uzoraka                                            6

|  |  |  |  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Uzorci | A | B | C | D | E | F |
| Broj laboratorija preostalih nakon odbacivanja ekstremnih vrijednosti | 12 | 10 | 11 | 12 | 11 | 9 |
| Broj odbacivanja ekstremnih vrijednosti (laboratorija) | - | 2 | 1 | - | 1 | 2 |
| Broj prihvaćenih rezultata | 24 | 20 | 22 | 24 | 22 | 18 |
| Srednja vrijednost (~~x~~) % vol | 23,80 26,51\* | 40,09 | 40,29 | 39,26 43,09\* | 42,38 45,89\* | 57,16 63,44\* |
| Standardna devijacija ponovljivosti (Sr) % vol | 0,048 | 0,065 | 0,042 | 0,099 | 0,094 | 0,106 |
| Relativna standardna devijacija ponovljivosti (RSDr) (%) | 0,19 | 0,16 | 0,10 | 0,24 | 0,21 | 0,18 |
| Granica ponovljivosti (r) % vol | 0,13 | 0,18 | 0,12 | 0,28 | 0,26 | 0,30 |
| Standardna devijacija obnovljivosti (SR) % vol | 0,060 | 0,076 | 0,073 | 0,118 | 0,103 | 0,125 |
| Relativna standardna devijacija obnovljivosti (RSDR) (%) | 0,24 | 0,19 | 0,18 | 0,29 | 0,23 | 0,21 |
| Granica obnovljivosti (R) % vol | 0,17 | 0,21 | 0,20 | 0,33 | 0,29 | 0,35 |
| Vrste uzoraka  A = voćni liker; razina razdiobe (\*).  B = brandy; dvostruke slijepe probe.  C = whisky; dvostruke slijepe probe.  D = grapa; razina razdiobe (\*).  E = akvavit; razina razdiobe (\*).  F = rum; razina razdiobe (\*). | | | | | | |

![](dodatni/355981.gif)

Slika
1.            APARATURA
ZA DESTILACIJU ZA MJERENJE STVARNE ALKOHOLNE JAKOSTI U ALKOHOLNIM PIĆIMA

1. Tikvica s okruglim dnom od 1 l sa
standardiziranim oblim brušenim spojem;

2. Vigreux rektificirajuća kolona duga 20 cm;

3. West hladilo s
ravnim rubom dugo 10 cm;

4. Spiralna cijev za hlađenje duga 40 cm.

II. ODREĐIVANJE UKUPNOG
SUHOG EKSTRAKTA U ALKOHOLNIM PIĆIMA GRAVIMETRIJOM

**1.
Područje primjene**

Ova metoda primjenjuje se samo za akvavit u kojem je suhi ekstrakt ograničen na 1,5 g na 100
ml kao što je definirano u Pravilniku o jakim alkoholnim i alkoholnim pićima
(»Narodne novine« br. 172/04).

**2.
Referentni standardi**

ISO 3696:1987: Voda za upotrebu u analitičkom
laboratoriju – Zahtjevi i test metode

**3.
Definicija**

Ukupni suhi ekstrakt ili ukupna suha tvar
uključuje sve tvari koje nisu hlapive pod specifičnim fizikalnim uvjetima.

**4.
Princip**

Vaganje ostatka zaostalog nakon isparavanja
alkoholnog pića na kipućoj vodenoj kupelji i sušenje u sušioniku.

**5.
Aparature i pribor**

5.1.      Cilindrična
posuda za isparavanje s ravnim dnom promjera 55 mm.

5.2.      Kipuća vodena
kupelj.

5.3.      Pipeta od 25
ml, klase A.

5.4.      Sušionik.

5.5.      Eksikator.

5.6.      Analitička
vaga s preciznošću od 0,1 mg.

*6.
Uzorkovanje i uzorci*

Uzorci se čuvaju na sobnoj temperaturi prije
analize.

**7.
Postupak**

7.1.      Odpipetira se 25 ml alkoholnog pića koje sadrži manje od 15
g/l suhe tvari u prethodno izvaganu cilindričnu posudu za isparavanje s ravnim
dnom promjera 55 mm. Tijekom prvog sata isparavanja, posuda za isparavanje je
smještena na poklopcu kipuće vodene kupelji tako da tekućina ne vrije jer bi to
moglo dovesti do gubitka uslijed prskanja. Ostavi se još sat vremena u
direktnom kontaktu s parom kipuće vodene kupelji.

7.2.      Sušenje se
završi stavljanjem posude za isparavanje u sušionik
na 105°C ± 3°C dva sata. Posuda za isparavanje se stavi u eksikator
na hlađenje i izvaže se sa sadržajem.

*8.
Izračunavanje*

Masa ostatka pomnožena s 40 jednaka je suhom
ekstraktu u alkoholnom piću i mora se izraziti u g/l na jedno decimalno mjesto.

*9.
Karakteristike provođenja metode (preciznost)*

9.1.      Statistički
rezultati međulaboratorijskog testiranja

Sljedeći podaci su dobiveni iz međunarodnog
istraživanja provođenja metode koje je provedeno u skladu s međunarodno
dogovorenim postupcima [1] [2].

Godina međulaboratorijskog
testiranja 1997.

Broj
laboratorija                                      10

Broj uzoraka                                             4

|  |  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| Uzorci | A | B | C | D |
| Broj laboratorija preostalih nakon odbacivanja ekstremnih vrijednosti | 9 | 9 | 8 | 9 |
| Broj odbacivanja ekstremnih vrijednosti (laboratorija) | 1 | 1 | 2 | - |
| Broj prihvaćenih rezultata | 18 | 18 | 16 | 18 |
| Srednja vrijednost (~~x~~) g/l | 9,0 | 9,1  7,8 | 10,0 9,4 | 11,8 11,1 |
| Standardna devijacija ponovljivosti (Sr) g/l | 0,075 | 0,441 | 0,028 | 0,123 |
| Relativna standardna devijacija ponovljivosti (RSDr) (%) | 0,8 | 5,2 | 0,3 | 1,1 |
| Granica ponovljivosti (r) g/l | 0,2 | 1,2 | 0,1 | 0,3 |
| Standardna devijacija obnovljivosti (SR) g/l | 0,148 | 0,451 | 0,058 | 0,210 |
| Relativna standardna devijacija obnovljivosti (RSDR) (%) | 1,6 | 5,3 | 0,6 | 1,8 |
| Granica obnovljivosti (R) g/l | 0,4 | 1,3 | 0,2 | 0,6 |
| Vrste uzoraka  A = brandy; dvostruke slijepe probe.  B = rum; razine razdiobe.  C = grapa; razine razdiobe.  D = akvavit; razine razdiobe. | | | | |

III. ODREĐIVANJE
HLAPIVIH KOMPONENATA I METANOLA U ALKOHOLNIM PIĆIMA

III.1. OPĆE NAPOMENE

**1.
Definicije**

Pravilnik o jakim alkoholnim i alkoholnim pićima
(»Narodne novine« br. 172/04) određuje minimalne
razine hlapivih spojeva osim etanola i metanola za niz alkoholnih pića. Samo za
ovu skupinu pića, te razine se konvencionalno smatraju jednakima zbroju
koncentracija:

1. hlapivih kiselina izraženih kao octena kiselina;

2. aldehida izraženih kao etanal zbrajanjem etanala (acetaldehida) i frakcije
etanala sadržane u 1,1-dietoksietanu
(acetalu);

3. sljedećih viših alkohola: propan-1-ol, butan-1-ol, butan-2-ol, 2-metilpropan-1-ol, analizirani kao pojedinačni alkohol i 2-metilbutan-1-ol i 3-metilbutan-1-ol,
analizirani kao pojedinačni alkohol ili zbroj dva alkohola;

4. etil acetata.

Sljedeće metode su konvencionalne metode za
mjerenje hlapivih spojeva:

– hlapive kiseline pomoću hlapive kiselosti,

– aldehidi (etanal i acetal), etil acetat i alkoholi pomoću plinske kromatografije (GC).

**2.
Analiza hlapivih spojeva plinskom**

Analiza hlapivih spojeva plinskom kromatografijom, osim spojeva koji su navedeni u prethodnom
tekstu, može se pokazati posebno zanimljivom kao sredstvo za određivanje kako
porijekla sirovine koja se koristi u destilaciji, tako i stvarnih uvjeta
destilacije.

Neka alkoholna pića sadrže druge hlapive
komponente, kao što su aromatski spojevi, koji su karakteristični za sirovine
koje se koriste za dobivanje alkohola, aromu alkoholnih pića i specifičnosti
pripreme alkoholnog pića.

III.2. ODREĐIVANJE
HLAPIVIH SRODNIH SPOJEVA PLINSKOM KROMATOGRAFIJOM: ALDEHIDA, VIŠIH ALKOHOLA,
ETIL ACETATA I METANOLA

**1.
Područje primjene**

Ova metoda je prikladna za određivanje 1,1-dietoksietana (acetala), 2-metilbutan-1-ola (aktivnog amilnog
alkohola), 3-metilbutan-1-ola (izoamilnog
alkohola), metanola (metilnog alkohola), etil etanoata
(etil acetata), butan-1-ola (n-butanola), butan-2-ola
(sekundarnog butanola), 2-metilpropan-1-ola
(izobutil alkohola), propan-1-ola (n-propanola) i etanala (acetaldehida) u alkoholnim pićima upotrebom plinske kromatografije. U ovoj se metodi koristi interni standard,
na primjer pentan-3-ol. Koncentracije analita se
izražavaju u gramima na 100 litara apsolutnog alkohola; alkoholna jakost
alkoholnih pića mora se odrediti prije analize. Alkoholna pića koja se mogu
analizirati primjenom ove metode su whisky, brandy, rum, rakija od grožđa, voćna rakija i lozovača.

**2.
Referentni standardi**

ISO 3696:1987: Voda za upotrebu u analitičkom
laboratoriju – Zahtjevi i test metode

**3.
Definicija**

Srodni spojevi su hlapive tvari koje se zajedno
s etanolom stvaraju tijekom fermentacije, destilacije i zrenja alkoholnih pića.

**4.
Princip**

Srodni spojevi u alkoholnim pićima se određuju
direktnim injektiranjem alkoholnog pića, ili prikladno razrijeđenog alkoholnog
pića, u sustav za plinsku kromatografiju (GC).
Prikladni interni standard treba se dodati alkoholnom piću prije injektiranja.
Srodni spojevi se odvajaju temperaturnim programiranjem na odgovarajućoj koloni
i detektiraju se primjenom plamenoionizacijskog
detektora (FID). Koncentracija svakog srodnog spoja se određuje u odnosu na
interni standard iz faktora odziva detektora, koji se dobiju tijekom kalibriranja
pod istim kromatografskim uvjetima kakvi se
primjenjuju i u analizi alkoholnih pića.

**5.
Reagensi**

Ako nije drugačije navedeno, koriste se samo
reagensi čija čistoća je veća od 97 %, kupljeni od ovlaštenog dobavljača koji
posjeduje ISO certifikat s potvrdom o čistoći, bez drugih srodnih spojeva pri
test razrjeđenju (to se može potvrditi injektiranjem pojedinih standarda
srodnih spojeva pri test razrjeđenju uz kromatografske
uvjete kao pod 6.4.), te voda čija je kvaliteta najmanje 3 u skladu sa standardom
ISO 3696. Acetal i acetaldehid
moraju biti skladišteni na tamnom mjestu i na temperaturi < 5°C, svi drugi
reagensi mogu se skladištiti na sobnoj temperaturi.

5.1.      Apsolutni
etanol (CAS 64-17-5).

5.2.      Metanol (CAS
67-56-1).

5.3.      Propan-1-ol
(CAS 71-23-8).

5.4.      2-metilpropan-1-ol (CAS 78-33-1).

5.5.      Prihvatljivi
interni standardi: pentan-3-ol (CAS 584-02-1), pentan-1-ol (CAS 71-41-0), 4-metilpentan-1-ol (CAS 626-89-1) ili metil nonanoat (CAS 1731-84-6).

5.6.      2-metilbutan-1-ol (CAS 137-32-6).

5.7.      3-metilbutan-1-ol (CAS 123-51-3).

5.8.      Etil acetat
(CAS 141-78-6).

5.9.      Butan-1-ol
(CAS 71-36-3).

5.10.    Butan-2-ol (CAS
78-92-2).

5.11.    Acetaldehid
(CAS 75-07-0).

5.12.    Acetal
(CAS 105-57-7).

5.13.    40 % V/V otopina etanola

Za pripremu 400 ml/l otopine etanola, ulije se
400 ml etanola (5.1.) u odmjernu tikvicu od 1 litre,
nadopuni do oznake destiliranom vodom i promiješa.

5.14.    Priprema i skladištenje
standardnih otopina (postupak koji se koristi za validiranu
metodu).

Sve standardne otopine moraju se skladištiti na
< 5°C i pripremati se svježe jednom mjesečno. Mase komponenti i otopina
moraju se zaokružiti na 0,1 mg.

5.14.1. Standardna otopina – A

Otpipetiraju se sljedeći reagensi u odmjernu tikvicu od 100 ml, koja sadrži približno 60 ml
otopine etanola (5.13.) kako bi se smanjilo isparavanje komponenti, nadopuni se
do oznake otopinom etanola i dobro promiješa. Zabilježi se težina tikvice,
svake dodane komponente i ukupna konačna težina sadržaja.

|  |  |
| --- | --- |
| **Komponenta** | **Volumen (ml)** |
| Metanol (5.2.) | 3,0 |
| Propan-1-ol (5.3.) | 3,0 |
| 2-metilpropan-1-ol (5.4.) | 3,0 |
| 2-metilbutan-1-ol (5.6.) | 3,0 |
| 3-metilbutan-1-ol (5.7.) | 3,0 |
| Etil acetat (5.8.) | 3,0 |
| Butan-1-ol (5.9.) | 3,0 |
| Butan-2-ol (5.10.) | 3,0 |
| Acetaldehid (5.11.) | 3,0 |
| Acetal (5.12.) | 3,0 |

Napomena 1: Poželjno je acetal
i acetaldehid dodati na kraju da bi se smanjili
gubici isparavanjem.

5.14.2. Standardna otopina – B

Otpipetira se 3 ml pentan-3-ola
ili drugog odgovarajućeg internog standarda (5.5.) u odmjernu
tikvicu od 100 ml, koja sadrži približno 80 ml otopine etanola (5.13.),
nadopuni se do oznake otopinom etanola i dobro promiješa.

Zabilježi se težina tikvice, težina pentan-3-ola
ili drugog internog standarda i ukupna konačna težina sadržaja.

5.14.3. Standardna otopina – C

Otpipetira se 1 ml otopine A
(5.14.1.) i 1 ml otopine B (5.14.2.) u odmjernu
tikvicu od 100 ml koja sadrži približno 80 ml otopine etanola (5.13.), nadopuni
se do oznake otopinom etanola i dobro promiješa.

Zabilježi se težina tikvice, svake dodane
komponente i ukupna konačna težina sadržaja.

5.14.4. Standardna otopina – D

U cilju da se zadrži analitički kontinuitet,
pripremi se standard za provjeru rada sustava upotrebom prethodno pripremljenog
standarda A (5.14.1.). Otpipetira se 1 ml otopine A u
odmjernu tikvicu od 100 ml koja sadrži približno 80
ml otopine etanola (5.13.), nadopuni se do oznake otopinom etanola i dobro
promiješa.

Zabilježi se težina tikvice, svake dodane
komponente i ukupna konačna težina sadržaja.

5.14.5. Standardna otopina – E

Otpipetira se 10 ml otopine B
(5.14.2.) u odmjernu tikvicu od 100 ml koja sadrži
približno 80 ml otopine etanola (5.13.), nadopuni se do oznake otopinom etanola
i dobro promiješa.

Zabilježi se težina tikvice, svake dodane
komponente i ukupna konačna težina sadržaja.

5.14.6. Otopine standarda koje se koriste za
provjeru linearnosti odziva plamenoionizacijskog
detektora (FID)

U odvojene odmjerne
tikvice od 100 ml koje sadrže približno 80 ml otopine etanola (anola ( otpipetira se 0; 0,1; 0,5; 1,0; 2,0 ml otopine A (5.14.1.)
i 1 ml otopine B (5.14.2.), nadopuni se do oznake otopinom etanola i dobro
promiješa.

Zabilježi se težina tikvice, svake dodane
komponente i ukupna konačna težina sadržaja.

5.14.7. Otopina standarda za provjeru rada
sustava (QC)

Otpipetira se 9 ml standardne otopine
D (5.14.4.) i 1 ml standardne otopine E (5.14.5.) u posudu za vaganje i dobro
promiješa.

Zabilježi se težina tikvice, svake dodane
komponente i ukupna konačna težina sadržaja.

**6.
Aparatura**

6.1.      Uređaj za
mjerenje gustoće i alkoholne jakosti.

6.2.      Analitička
vaga s mogućnošću očitavanja do četiri decimalna mjesta.

6.3.      Temperaturno
programiran plinski kromatograf opremljen plamenoionizacijskim detektorom i integratorom ili drugim
sustavom za obradu podataka koji može mjeriti površine ili visine pikova.

6.4.      Kolona
plinskog kromatografa koja može odvajati analite tako da je najmanja rezolucija između pojedinačnih
komponenti (osim 2-metilbutan-1-ola i 3-metilbutan-1-ola) barem 1,3.

Napomena 2: Sljedeće kolone i uvjeti plinske kromatografije su prikladni primjeri:

1. Predkolona (1 m ×
0,32 mm) spojena na kolonu CP-WAX 57 CB (50 m × 0,32 mm) i debljinom filma od
0,2 m (stabilizirani polietilen glikol),
te zatim kolonu Carbowax 400 (50 m × 0,32 mm) i
debljine filma od 0,2 µm. (Kolone su spojene korištenjem press-fit konektora.)

Plin nositelj i tlak: helij (135 kPa)

Temperatura kolone: 35°C tijekom 17 min.,
35-70°C po 12°C/min., zadržavanje

na 70°C tijekom 25 min.

Temperatura injektora:
150°C

Temperatura detektora: 250°C

Volumen injektiranja: 1 µl, split 20 do 100:1

2. Predkolona (1 m ×
0,32 mm), spojena na kolonu CP-WAX 57 CB (50 m × 0,32 mm) i debljinom filma od
0,2 µm (stabilizirani polietilen glikol).
(Predkolona je spojena korištenjem press-fit konektora.)

Plin nositelj i tlak: helij (65 kPa)

Temperatura kolone: 35°C tijekom 10 min., 35-110
po 5°C/min., 110-190°C po 30°C/min., zadržavanje na 190°C tijekom 2 min.

Temperatura injektora:
260°C

Temperatura detektora: 300°C

Volumen injektiranja: 1 µl, split 55:1

3. Napunjena kolona (5 % CW 20M, Carbopak B) 2 m × 2 mm.

Temperatura kolone: 65°C tijekom 4 min.,
65-140°C po 10°C/min., zadržavanje na 140°C tijekom 5 min., 140-150°C po
5°C/min., zadržavanje na 150°C tijekom 3 min.

Temperatura injektora:
65°C

Temperatura detektora: 200°C

Volumen injektiranja: 1 µl

**7.
Uzorkovanje i uzorci**

7.1.
Laboratorijski uzorak

Po primitku, alkoholna jakost svakog uzorka se
mjeri. (6.1.).

**8.
Postupak (koji se koristi za validiranu metodu)**

8.1.      Dio testa

8.1.1.   Izvaže szvaže sarajuća
zatvorena posuda za vaganje i zabilježi težina.

8.1.2.   Otpipetira
se 9 ml laboratorijskog uzorka u posudu i zabilježi težina (muzorka).

8.1.3.   Doda se 1 ml standardne
otopine E (5.14.5.) i zabilježi težina (mIS).

8.1.4.   Test materijal se dobro
promućka (najmanje 20 puta). Uzorci moraju biti skladišteni na manje od 5°C
prije analize u cilju smanjivanja gubitka hlapljenjem.

8.2.      Slijepa proba

8.2.1.   Upotrebom vage s mogućnošću
očitanja do četiri decimalna mjesta (6.2.), izvaže se zatvorena posuda za
vaganje i zabilježi težina.

8.2.2.   Otpipetira
se 9 ml 400 ml/l otopine etanola (5.13.) u posudu i zabilježi težina.

8.2.3.   Doda se 1 ml standardne
otopine E (5.14.5.) i zabilježi težina.

8.2.4.   Test materijal se dobro
promućka (najmanje 20 puta). Uzorci moraju biti skladišteni na manje od 5°C
prije analize u cilju smanjivanja gubitka hlapljenjem.

8.3.      Uvodni test

Injektira se standardna otopina C (5.14.3.) kako
bi se osiguralo odvajanje svih analita uz minimalnu
rezoluciju od 1,3 (osim 2-metilbutan-1-ola i 3-metilbutan-1-ola).

8.4.      Kalibriranje

Kalibriranje se mora provjeriti upotrebom
sljedećeg postupka. Provjerava se linearnost odziva detektora sukcesivnom
analizom svake otopine standarda za provjeru linearnosti (5.14.6.) koja sadrži
interni standard (IS) u triplikatu. Iz površina pika
integratora ili visina pika za svako injektiranje izračuna se omjer R za svaki
srodni spoj i napravi grafički prikaz R u odnosu na omjer koncentracije srodnog
spoja i internog standarda (IS),C. Treba se dobiti linearna krivulja, s
koeficijentom korelacije od najmanje 0,99.

Površina ili visina pika srodnog spoja

R =  ———————————————

Površina ili visina pika IS

Koncentracija srodnog spoja (µg/g)

C =  ———————————————

         Koncentracija IS (µg/g)

8.5.      Određivanje

Injektira se standardna otopina C (5.14.3.) i 2
otopine standarda za provjeru rada sustava (5.14.7.). Slijede nepoznati uzorci
(pripremljeni u skladu s 8.1. i 8.2.) uz umetanje jednog standarda za provjeru
rada sustava na svakih 10 uzoraka kako bi se osigurala analitička stabilnost. Injektira
se standardna otopina C (5.14.3.) nakon svakih 5 uzoraka.

**9.
Izračunavanje**

Može se koristiti automatizirani sustav za
obradu podataka, pod uvjetom da se podaci mogu provjeriti upotrebom načela
opisanih u dolje navedenoj metodi.

Izmjere se površine ili visine pikova srodnih
spojeva i pikova internog standarda.

9.1.      Računanje
faktora odziva detektora.

Iz kromatograma s
injektiranom standardnom otopinom C (5.14.3.), izračuna se faktor odziva
detektora za svaki srodni spoj primjenom jednadžbe (1).

(1) Faktor odziva detektora =

Površina ili visina pika IS

      ———————————————      ×

Površina ili visina pika srodnog spoja

Koncentracija srodnog spoja (µg/g)

      ———————————————

         Koncentracija IS (µg/g)

Gdje je:

IS = interni standard;

Konc. srodnog spoja =
Koncentracija srodnog spoja u otopini C (5.14.3.);

Konc. IS = Koncentracija
internog standarda u otopini C.

9.1.2.   Analiza uzorka

Primjenom donje jednadžbe (2), izračuna se
koncentracija svakog srodnog spoja u uzorcima.

(2) Koncentracije srodnih spojeva (ěg/g) =

Površina ili visina pika srodnog spoja

 =
———————————————  ×

Površina ili visina pika IS

               mIS(g)

—————— × Konc. IS (µg/g) × RF

muzorka(g)

Gdje je:

muzorka = masa uzorka (8.1.2.);

mIS = masa internog
standarda (8.1.3.);

Konc. IS = Koncentracija
internog standarda u otopini E (5.14.5.);

RF = Faktor odziva detektora izračunat
korištenjem jednadžbe 1.

9.1.3.   Analiza otopine standarda za
provjeru rada sustava

Primjenom donje jednadžbe (3), izračuna se
postotak iskorištenja ciljane vrijednosti za svaki srodni spoj u otopinama
standarda za provjeru rada sustava (5.14.7.).

(3) % iskorištenja uzorka za provjeru rada
sustava =

    Koncentracija
analita u standardu za provjeru rada sustava

 ———————————————————————

                    Koncentracija analita
u otopini D

× 100

Koncentracija analita
u standardu za provjeru rada sustava se izračuna primjenom gore navedene
jednadžbe (1) i (2).

9.2.      Konačni
prikaz rezultata

Rezultati se preračunaju iz g/g u g na 100
litara apsolutnog alkohola za uzorke primjenom jednadžbe (4).

(4) Koncentracija u g na 100 litara apsolutnog
alkohola =

Konc. (µg/g) × r ×10/[jakost (% vol)  1000]

Gdje je:

r
= gustoća u kg/m3.

Rezultati se izraavaju
do 3 značajne znamenke i maksimalno jednog decimalnog mjesta, npr. 11,4 g na 100 l apsolutnog alkohola.

**10.
Osiguranje kakvoće i kontrola (korišteni za validiranu
metodu)**

Primjenom gore navedene jednadžbe (2), izračuna
se koncentracija svakog srodnog spoja u otopinama standarda za provjeru rada
sustava koje su pripremljene kako je opisano od 8.1.1. do 8.1.4. Primjenom jednadžbe
(3), izračuna se postotak iskorištenja ciljane vrijednosti. Ako su analitički
rezultati unutar ± 10 % njihovih teoretskih vrijednosti za svaki srodni spoj,
analiza se može nastaviti. Ako nisu, mora se istražiti uzrok odstupanja te
poduzeti potrebne korektivne mjere.

**11.
Karakteristike provođenja metode (preciznost)**

Statistički rezultati međulaboratorijskog
testiranja: sljedeće tablice daju vrijednosti za sljedeće spojeve: etanal, etil acetat, acetal,
ukupni etanal, metanol, butan-2-ol, propan-1-ol,
butan-1-ol, 2-metil-propan-1-ol, 2-metil-butan-1-ol, 3-metil-butan-1-ol.

Sljedeći podaci su dobiveni iz međunarodnog
istraživanja provođenja metode koje je provedeno u skladu s međunarodno
dogovorenim postupcima.

Godina međulaboratorijskog
testiranja 1997

Broj
laboratorija                                     32

Broj uzoraka                                           5

Analit                                               etanal

|  |  |  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Uzorci | A | B | C | D | E |
| Broj laboratorija preostalih nakon odbacivanja ekstremnih vrijednosti | 28 | 26 | 27 | 27 | 28 |
| Broj odbacivanja ekstremnih vrijednosti (laboratorija) | 2 | 4 | 3 | 3 | 2 |
| Broj prihvaćenih rezultata | 56 | 52 | 54 | 54 | 56 |
| Srednja vrijednost (~~x~~) µg/g | 63,4 | 71,67 | 130,4 | 38,4 13,8(\*) | 28,6 52,2(\*) |
| Standardna devijacija ponovljivosti (Sr) µg/g | 3,3 | 1,9 | 6,8 | 4,1 | 3,6 |
| Relativna standardna devijacija ponovljivosti (RSDr) (%) | 5,2 | 2,6 | 5,2 | 15,8 | 8,9 |
| Granica ponovljivosti (r) µg/g | 9,3 | 5,3 | 19,1 | 11,6 | 10,1 |
| Standardna devijacija obnovljivosti (SR) µg/g | 12 | 14 | 22 | 6,8 | 8,9 |
| Relativna standardna devijacija obnovljivosti (RSDR) (%) | 18,9 | 19,4 | 17,1 | 26,2 | 22,2 |
| Granica obnovljivosti (R) µg/g | 33,5 | 38,9 | 62,4 | 19,1 | 25,1 |
| Vrste uzoraka  A = brandy; dvostruke slijepe probe.  B = kirsch; dvostruke slijepe probe.  C = grapa; dvostruke slijepe probe.  D = whisky; razine razdiobe (\*).  E = rum; razine razdiobe (\*). | | | | | |

Godina međulaboratorijskog
testiranja 1997

Broj laboratorija
                           32

Broj uzoraka                                            5

Analit                                           etil acetat

|  |  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| Uzorci | A | B | C | D |
| Broj laboratorija preostalih nakon odbacivanja ekstremnih vrijednosti | 24 | 24 | 25 | 24 |
| Broj odbacivanja ekstremnih vrijednosti (laboratorija) | 2 | 2 | 1 | 2 |
| Broj prihvaćenih rezultata | 48 | 48 | 50 | 48 |
| Srednja vrijednost (~~x~~) µg/g | 96,8 | 1 046 | 120,3 | 112,5 91,8(\*) |
| Standardna devijacija ponovljivosti (Sr) µg/g | 2,2 | 15 | 2,6 | 2,1 |
| Relativna standardna devijacija ponovljionovljiRSDr) (%) | 2,3 | 1,4 | 2,1 | 2,0 |
| Granica ponovljivosti (r) µg/g | 6,2 | 40,7 | 7,2 | 5,8 |
| Standardna devijacija obnovljivosti (SR) µg/g | 6,4 | 79 | 8,2 | 6,2 |
| Relativna standardna devijacija obnovljivosti (RSDR) (%) | 6,6 | 7,6 | 6,8 | 6,2 |
| Granica obnovljivosti (R) µg/g | 17,9 | 221,9 | 22,9 | 17,5 |
| Vrsta uzorka  A = brandy; dvostruke slijepe probe.  B = kirsch; dvostruke slijepe probe.  C = grapa; dvostruke slijepe probe.  D = whisky; razine razdiobe (\*).  E = rum; razine razdiobe (\*). | | | | |

Godina međulaboratorijskog
testiranja 1997

Broj
laboratorija                                     32

Broj uzoraka                                            5

Analit                                               acetal

|  |  |  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Uzorci | A | B | C | D | E |
| Broj laboratorija preostalih nakon odbacivanja ekstremnih vrijednosti |  |

20

 21 | 22 | 17 | 21 |
| Broj odbacivanja ekstremnih vrijednosti (laboratorija) | 4 | 3 | 2 | 4 | 3 |
| Broj prihvaćenih rezultata | 40 | 42 | 44 | 34 | 42 |
| Srednja vrijednost (~~x~~) µg/g | 35,04 | 36,46 | 68,5 | 20,36 6,60(\*) | 15,1 28,3(\*) |
| Standardna devijacija ponovljivosti (Sr) µg/g | 0,58 | 0,84 | 1,6 | 0,82 | 1,9 |
| Relativna standardna devijacija ponovljivosti (RSDr) (%) | 1,7 | 2,3 | 2,3 | 6,1 | 8,7 |
| Granica ponovljivosti (r) µg/g | 1,6 | 2,4 | 4,4 | 2,3 | 5,3 |
| Standardna devijacija obnovljivosti (SR) µg/g | 4,2 | 4,4 | 8,9 | 1,4 | 3,1 |
| Relativna standardna devijacija obnovljivosti (RSDR) (%) | 12,1 | 12,0 | 13,0 | 10,7 | 14,2 |
| Granica obnovljivosti (R) µg/g | 11,8 | 12,2 | 25,0 | 4,0 | 8,7 |
| Vrsta uzorka  A = brandy; dvostruke slijepe probe.  B = kirsch; dvostruke slijepe probe.  C = grapa; dvostruke slijepe probe.  D = whisky; razine razdiobe (\*).  E = rum; razine razdiobe (\*). | | | | | |

Godina međulaboratorijskog
testiranja 1997

Broj
laboratorija                                     32

Broj uzoraka                                            5

Analit                                      ukupni etanal

|  |  |  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Uzorci | A | B | C | D | E |
| Broj laboratorija preostalih nakon odbacivanja ekstremnih vrijednosti | 23 | 19 | 22 | 21 | 22 |
| Broj odbacivanja ekstremnih vrijednosti (laboratorija) | 1 | 5 | 2 | 3 | 2 |
| Broj prihvaćenih rezultata | 46 | 38 | 44 | 42 | 44 |
| Srednja vrijednost (~~x~~) µg/g | 76,5 |  | 85,3 | 156,5 | 45,4 15,8(\*) | 32,7 61,8(\*) |
| Standardna devijacija ponovljivosti (Sr) µg/g | 3,5 | 1,3 | 6,5 | 4,4 | 3,6 |
| Relativna standardna devijacija ponovljivosti (RSDr) (%) | 4,6 | 1,5 | 4,2 | 14,2 | 7,6 |
| Granica ponovljivosti (r) µg/g | 9,8 | 3,5 | 18,3 | 12,2 | 10,0 |
| Standardna devijacija obnovljivosti (SR) µg/g | 13 | 15 | 24,1 | 7,3 | 9,0 |
| Relativna standardna devijacija obnovljivosti (RSDR) (%) | 16,4 | 17,5 | 15,4 | 23,7 | 19,1 |
| Granica obnovljivosti (R) µg/g | 35,2 | 41,8 | 67,4 | 20,3 | 25,2 |
| Vrsta uzorka  A = brandy; dvostruke slijepe probe.  B = kirsch; dvostruke slijepe probe.  C = grapa; dvostruke slijepe probe.  D = whisky; razine razdiobe (\*).  E = rum; razine razdiobe (\*). | | | | | |

Godina međulaboratorijskog
testiranja 1997

Broj
laboratorija                                     32

Broj uzoraka                                            5

Analit                                              metanol

|  |  |  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Uzorci | A | B | C | D | E |
| Broj laboratorija preostalih nakon odbacivanja ekstremnih vrijednosti | 26 | 27 | 27 | 28 | 25 |
| Broj odbacivanja ekstremnih vrijednosti (laboratorija) | 4 | 3 | 3 | 1 | 4 |
| Broj prihvaćenih rezultata | 52 | 54 | 54 | 56 | 50 |
| Srednja vrijednost (~~x~~) µg/g | 319,8 | 2 245 | 1 326 | 83,0 61,5(\*) | 18,6 28,9(\*) |
| Standardna devijacija ponovljivosti (Sr) µg/g | 4,4 | 27 | 22 | 1,5 | 1,3 |
| Relativna standardna devijacija ponovljivosti (RSDr) (%) | 1,4 | 1,2 | 1,7 | 2,1 | 5,6 |
| Granica ponovljivosti (r) µg/g | 12,3 | 74,4 | 62,5 | 4,3 | 3,8 |
| Standardna devijacija obnovljivosti (SR) µg/g | 13 | 99 | 60 | 4,5 | 2,8 |
| Relativna standardna devijacija obnovljivosti (RSDR) (%) | 3,9 | 4,4 | 4,6 | 6,2 | 11,8 |
| Granica obnovljivosti (R) µg/g | 35,2 | 278,3 | 169,1 | 12,5 | 7,9 |
| Vrsta uzorka  A = brandy; dvostruke slijepe probe.  B = kirsch; dvostruke slijepe probe.  C = grapa; dvostruke slijepe probe.  D = whisky; razine razdiobe (\*).  E = rum; razine razdiobe (\*). | | | | | |

Godina međulaboratorijskog
testiranja 1997

Broj
laboratorija                                      32

Broj uzoraka                                             4

Analit                                         butan-2-ol

|  |  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| Uzorci | A | B | C | E |
| Broj laboratorija preostalih nakon odbacivanja ekstremnih vrijednosti | 21 | 27 | 29 | 22 |
| Broj odbacivanja ekstremnih vrijednosti (laboratorija) | 4 | 3 | 1 | 3 |
| Broj prihvaćenih rezultata | 42 | 54 | 58 | 44 |
| Srednja vrijednost (~~x~~) µg/g | 5,88 | 250,2 | 27,57 | 5,83 14,12(\*) |
| Standardna devijacija ponovljivosti (Sr) µg/g | 0,40 | 2,2 |

0,87

 0,64 |
| Relativna standardna devijacija ponovljivosti (RSDr) (%) | 6,8 | 0,9 | 3,2 | 6,4 |
| Granica ponovljivosti (r) µg/g | 1,1 | 6,1 | 2,5 | 1,8 |
| Standardna devijacija obnovljivosti (SR) µg/g | 0,89 | 13 | 3,2 | 0,87 |
| Relativna standardna devijacija obnovljivosti (RSDR) (%) | 15,2 | 5,1 | 11,5 | 8,7 |
| Granica obnovljivosti (R) µg/g | 2,5 | 35,5 | 8,9 | 2,4 |
| Vrsta uzorka  A = brandy; dvostruke slijepe probe.  B = kirsch; dvostruke slijepe probe.  C = grapa; dvostruke slijepe probe.  E = rum; razine razdiobe (\*). | | | | |

Godina međulaboratorijskog
testiranja 1997

Broj
laboratorija                                     32

Broj uzoraka                                            5

Analit                                      propan-1-ol

|  |  |  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Uzorci | A | B | C | D | E |
| Broj laboratorija preostalih nakon odbacivanja ekstremnih vrijednosti | 29 | 27 | 27 | 29 | 29 |
| Broj odbacivanja ekstremnih vrijednosti (laboratorija) | 2 | 4 | 3 | 2 | 2 |
| Broj prihvaćenih rezultata | 58 | 54 | 54 | 58 | 58 |
| Srednja vrijednost (~~x~~) µg/g | 86,4 | 3 541 | 159,1 | 272,1 229,3(\*) | 177,1 222,1(\*) |
| Standardna devijacija ponovljivosti (Sr) µg/g | 3,0 | 24 | 3,6 | 2,3 | 3,3 |
| Relativna standardna devijacija ponovljivosti (RSDr) (%) | 3,4 | 0,7 | 2,3 | 0,9 | 1,6 |
| Granica ponovljivosti (r) µg/g | 8,3 | 68,5 | 10,0 | 6,4 | 9,1 |
| Standardna devijacija obnovljivosti (SR) µg/g | 5,3 | 150 | 6,5 | 9,0 | 8,1 |
| Relativna standardna devijacija obnovljivosti (RSDR) (%) | 6,1 | 4,1 | 4,1 | 3,6 | 4,1 |
| Granica obnovljivosti (R) µg/g | 14,8 | 407,2 | 18,2 | 25,2 | 22,7 |
| Vrsta uzorka  A = brandy; dvostruke slijepe probe.  B = kirsch; dvostruke slijepe probe.  C = grapa; dvostruke slijepe probe.  D = whisky; razine razdiobe (\*).  E = rum; razine razdiobe (\*). | | | | | |

Godina međulaboratorijskog
testiranja 1997

Broj
laboratorija                                     32

Broj uzoraka                                            3

Analit                                         butan-1-ol

|  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- |
| Uzorci | A | B | C |
| Broj laboratorija preoja preonakon odbacivanja ekstremnih vrijednosti | 20 | 22 | 22 |
| Broj odbacivanja ekstremnih vrijednosti (laboratorija) | 4 | 4 | 6 |
| Broj prihvaćenih rezultata | 40 | 44 | 44 |
| Srednja vrijednost (~~x~~) µg/g | 3,79 | 5,57 | 7,54 |
| Standardna devijacija ponovljivosti (Sr) µg/g | 0,43 | 0,20 | 0,43 |
| Relativna standardna devijacija ponovljivosti (RSDr) (%) | 11,2 | 3,6 | 5,6 |
| Granica ponovljivosti (r) µg/g | 1,1 | 0,6 | 1,2 |
| Standardna devijacija obnovljivosti (SR) µg/g | 0,59 | 0,55 | 0,82 |
| Relativna standardna devijacija obnovljivosti (RSDR) (%) | 15,7 | 9,8 | 10,8 |
| Granica obnovljivosti (R) µg/g | 1,7 | 1,5 | 2,3 |
| Vrsta uzorka  A = brandy; dvostruke slijepe probe.  B = kirsch; dvostruke slijepe probe.  C = grapa; dvostruke slijepe probe (\*). | | | |

Godina međulaboratorijskog
testiranja 1997

Broj
laboratorija                                     32

Broj uzoraka                                           5

Analit                            2-metilpropan-1-ol

|  |  |  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Uzorci | A | B | C | D | E |
| Broj laboratorija preostalih nakon odbacivanja ekstremnih vrijednosti | 28 | 31 | 30 | 26 | 25 |
| Broj odbacivanja ekstremnih vrijednosti (laboratorija) | 3 | 0 | 1 | 5 | 6 |
| Broj prihvaćenih rezultata | 56 | 62 | 60 | 52 | 50 |
| Srednja vrijednost (~~x~~) µg/g | 174,2 | 111,7 | 185,0 | 291,0 246,8(\*) | 115,99 133,87(\*) |
| Standardna devijacija ponovljivosti (Sr) µg/g | 2,3 | 1,6 | 2,5 | 1,8 | 0,74 |
| Relativna standardna devijacija ponovljivosti (RSDr) (%) | 1,3 | 1,4 | 1,3 | 0,7 | 0,6 |
| Granica ponovljivosti (r) µg/g | 6,4 | 4,5 | 6,9 | 5,0 | 2,1 |
| Standardna devijacija obnovljivosti (SR) µg/g | 8,9 | 8,9 | 9,7 | 6,0 | 6,2 |
| Relativna standardna devijacija obnovljivosti (RSDR) (%) | 5,1 | 8,0 | 5,2 | 2,2 | 5,0 |
| Granica obnovljivosti (R) µg/g | 24,9 | 24,9 | 27,2 | 16,9 | 17,4 |
| Vrsta uzorka  A = brandy; dvostruke slijepe probe.  B = kirsch; dvostruke slijepe probe.  C = grapa; dvostruke slijepe probe.  D = whisky; razine razdiobe (\*).  E = rum; razine razdiobe (\*). | | | | | |

Godina međulaboratorijskog
testiranja 1997

Broj
laboratorija                                     32

Broj uzoraka                                            5

Analit                              2-metil-butan-1-ol

|  |  |  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Uzorci | A | B | C | D | E |
| Broj laboratorija preostalih nakon odbacivanja ekstremnih vrijednosti | 25 | 26 | 25 | 27 | 25 |
| Broj odbacivanja ekstremnih vrijednosti (laboratorija) | 3 | 2 | 3 | 1 | 2 |
| Broj prihvaćenih rezultata | 50 | 52 | 50 | 54 | 50 |
| Srednja vrijednost (~~x~~) µg/g | 113,0 | 48,3 | 91,6 | 72,1 45,2(\*) | 39,5 61,5(\*) |
| Standardna devijacija ponovljivosti (Sr) µg/g | 2,1 | 1,5 | 1,7 | 2,3 | 2,3 |
| Relativna standardna devijacija ponovljivosti (RSDr) (%) | 1,9 | 3,1 | 1,8 | 3,9 | 4,5 |
| Granica ponovljivosti (r) µg/g | 6,0 | 4,2 | 4,7 | 6,4 | 6,3 |
| Standardna devijacija obnovljivosti (S) µg/g | 7,4 | 3,8 | 6,6 | 4,7 | 4,5 |
| Relativna standardna devijacija obnovljivosti (RSDR) (%) | 6,6 | 7,9 | 7,2 | 8,1 | 8,8 |
| Granica obnovljivosti (R) µg/g | 20,8 | 10,7 | 18,4 | 13,3 | 12,5 |
| Vrsta uzorka  A = brandy; dvostruke slijepe probe.  B = kirsch; dvostruke slijepe probe.  C = grapa; dvostruke slijepe probe.  D = whisky; razine razdiobe (\*).  E = rum; razine razdiobe (\*). | | | | | |

Godina međulaboratorijskog
testiranja 1997

Broj
laboratorija                                     32

Broj uzoraka                                            5

Analit                              3-metil-butan-1-ol

|  |  |  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Uzorci | A | B | C | D | E |
| Broj laboratorija preostalih nakon odbacivanja ekstremnih vrijednosti | 23 | 23 | 24 | 27 | 21 |
| Broj odbacivanja ekstremnih vrijednosti (laboratorija) | 5 | 5 | 4 | 1 | 6 |
| Broj prihvaćenih rezultata | 46 | 46 | 48 | 54 | 42 |
| Srednja vrijednost (~~x~~) µg/g | 459,4 | 242,7 | 288,4 | 142,2 120,4(\*) | 212,3 245,6(\*) |
| Standardna devijacija ponovljivosti (Sr) µg/g | 5,0 | 2,4 | 3,4 | 2,4 | 3,2 |
| Relativna standardna devijacija ponovljivosti (RSDr) (%) | 1,1 | 1,0 | 1,2 | 1,8 | 1,4 |
| Granica ponovljivosti (r) µg/g | 13,9 | 6,6 | 9,6 | 6,6 | 9,1 |
| Standardna devijacija obnovljivosti (SR) µg/g | 29,8 | 13 | 21 | 8,5 | 6,7 |
| Relativna standardna devijacija obnovljivosti (RSDR) (%) | 6,5 | 5,2 | 7,3 | 6,5 | 2,9 |
| Granica obnovljivosti (R) µg/g | 83,4 | 35,4 | 58,8 | 23,8 | 18,7 |
| Vrsta uzorka  A = brandy; dvostruke slijepe probe.  B = kirsch; dvostruke slijepe probe.  C = grapa; dvostruke slijepe probe.  D = whisky; razine razdiobe (\*).  E = rum; razine razdiobe (\*). | | | | | |

IV. ANETOL. ODREĐIVANJE
TRANS-ANETOLA PLINSKOM KROMATOGRAFIJOM U ALKOHOLNIM PIĆIMA

**1.
Područje primjene**

Ova metoda je prikladna za određivanje trans-anetola u alkoholnim pićima s aromom anisa primjenom
plinske kromatografije.

**2.
Referentni standardi**

ISO 3696:1987: Voda za upotrebu u analitičkim
laboratorijima – Zahtjevi i test metode.

**3.
Princip**

Koncentracija trans-anetola
u alkoholnim pićima se određuje plinskom kromatografijom
(GC). Ista količina internog standarda, npr. 4-alilanizola (estragola) kada estragol nije prirodno prisutan u uzorku, dodaje se test
uzorku i referentnoj otopini trans-anetola poznate
koncentracije te se oba razrijede pomoću 45 %-tne
otopine etanola i injektiraju direktno u GC sustav. Prije pripreme uzorka i
analize likera koji sadrže velike količine šećera potrebna je ekstrakcija.

**4.
Reagensi**

Tijekom analize koriste se samo reagensi čija
čistoća je najmanje 98 %. Mora se koristiti voda čiji stupanj kakvoće je
najmanje 3 prema definiciji standarda ISO 3696.

Referentne kemikalije se trebaju čuvati na
hladnom mjestu (na 4°C), bez prisutnosti svjetlosti, u aluminijskim posudama
ili u bočicama za reagense od obojenog (jantarnog) stakla. Zatvarači trebaju
imati aluminijsku brtvu. Trans-anetol je neophodno
rastopiti prije upotrebe, ali u ovom slučaju njegova temperatura ne smije nikad
prijeći 35°C.

4.1.      Etanol 96 %
vol. (CAS 64-17-5)

4.2.      1-metoksi-4-(1-propenil) benzen;
(trans-anetol) (CAS 4180-23-8)

4.3.      4-alilanizol, (estragol) (CAS
140-67-0), preporučeni interni standard (IS)

4.4.      Etanol 45 %
vol.

Doda se 560 g destilirane vode u 378 g etanola
96 % vol.

4.5.      Priprema
standardnih otopina

Sve standardne otopine trebaju se čuvati na
sobnoj temperaturi (15 do 35°C), udaljene od svjetlosti u aluminijskim posudama
ili u bočicama za reagense od obojenog (jantarnog) stakla. Poželjno je da
zatvarači imaju aluminijsku brtvu.

Trans-anetol i 4-alilanizol su praktički netopivi u vodi, pa je stoga
potrebno otopiti trans-anetol i 4-alilanizol
u 96 %-tnom etanolu (4.1.) prije dodatka 45 %-tnog etanola (4.4.).

Matične otopine moraju se pripremati svježe
svaki tjedan.

4.5.1.   Standardna otopina A

Matična otopina trans-anetola
(koncentracije: 2 g/l)

Izvaže se 40 mg trans-anetola
(4.2.) u odmjernu tikvicu od 20 ml (ili 400 mg u 200
ml, itd.). Doda se nešto 96 %-tnog
etanola (4.1.) i nadopuni do oznake s 45 % vol etanolom (4.4.) te dobro
promiješa.

4.5.2.   Interna standardna otopina B

Matičnu otopinu internog standarda, npr. estragola (koncentracije: 2
g/l)

Izvaže se 40 mg estragola
(4.3.) u odmjernu tikvicu od 20 ml (400 mg u 200 ml, itd.). Doda se nešto 96 % vol etanola (4.1.), nadopuni do
oznake 45 % vol etanolom (4.4.) te dobro promiješa.

4.5.3.   Otopine koje se koriste za
provjeru linearnosti odziva plamenoionizacijskog
detektora (FID)

Linearnost odziva plamenoionizacijskog
detektora mora se provjeriti za analizu uzimajući u obzir raspon koncentracija
trans-anetola u alkoholnim pićima od 0 g/l do 2,5
g/l. U postupku analize, nepoznati uzorci alkoholnih pića koji se moraju
analizirati razrijede se 10 puta (8.3.). Za uvjete analize opisane u metodi,
matične otopine koje odgovaraju koncentracijama 0; 0,05; 0,10; 0,15; 0,20 i
0,25 g/l trans-anetola u uzorcima koji se analiziraju
su pripremljeni na sljedeći način: uzme se 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 i 2,5 ml matične
otopine A (4.5.1.) i otpipetira u odvojene odmjerne tikvice od 20 ml; u svaku tikvicu se otpipetira po 2 ml interne standardne otopine B (4.5.2.),
nadopuni do oznake s 45 % vol etanolom (4.4.) te dobro promiješa.

Slijepe probe (8.4.) se koriste kao otopine s 0
g/l.

4.5.4.   Standardna otopina C

Uzme se 2 ml standardne otopine A (4.5.1.) i otpipetira u odmjernu tikvicu od
20 ml, tada se doda 2 ml interne standardne otopine B (4.5.2.) i nadopuni do
oznake s 45 % vol etanolom (4.4.) te dobro promiješa.

**5.
Aparatura**

5.1.      Plinski kromatograf opremljen s kapilarnom kolonom i plamenoionizacijskim detektorom (FID) i integratorom ili
drugim sustavom za obradu podataka koji može mjeriti visinu ili površinu pikova
te automatskim uzorkivačem ili potrebnom opremom za
ručno injektiranje uzorka.

5.2.      Split/splitless injektor

5.3.      Kapilarna kolona,
na primjer:

Dužina: 50 m

Unutarnji promjer: 0,32 mm

Debljina filma: 0,2 µm

Stacionarna faza: FFAP – modificirani TPA polietilen glikol umreženi
porozni polimer.

5.4.      Uobičajena
laboratorijska oprema: baždareno laboratorijsko posuđe, analitička vaga
(preciznost: ± 0,1 mg).

**6.
Kromatografski uvjeti**

Vrsta kolone i dimenzije te uvjeti plinske kromatografije moraju biti takvi da se anetol
i interni standard odvajaju jedan od drugog i od bilo kojih interferirajućih
tvari. Tipični uvjeti za kolonu koja je dana kao primjer pod 5.3., su:

6.1.      Plin
nositelj: analitički helij

6.2.      Brzina
protoka: 2 ml/min

6.3.      Temperatura injektora: 250°C

6.4.      Temperatura
detektora: 250°C

6.5.      Temperaturni
uvjeti termostatiranog prostora: izotermalni,
180°C, trajanje analize 10 min

6.6.      Volumen
injektiranja: 1 l, split 1:40.

**7.
Uzorci**

Uzorci se trebaju čuvati na sobnoj temperaturi,
udaljeni od svjetlosti i hladnoće.

**8.
Postupak**

8.1.      Pretraživanje
uzorka na estragol

Da bi se osiguralo da estragol
nije prirodno prisutan u uzorku, treba se provesti slijepa proba bez dodatka
bilo kojeg internog standarda. Ako je estragol
prirodno prisutan u uzorku tada se mora odabrati drugi interni standard (na
primjer mentol).

Otpipetira se 2 ml uzorka u odmjernu tikvicu od 20 ml i nadopuni do oznake s 45 % vol
etanolom (4.4.) te dobro promiješa.

8.2.      Priprema
nepoznatih uzoraka

Otpipetira se 2 ml uzorka u odmjernu tikvicu od 20 ml, zatim se doda 2 ml interne
standardne otopine B (4.5.2.) i nadopuni do oznake s 45 % vol etanolom (4.4.)
te dobro promiješa.

8.3.      Slijepa proba

Otpipetira se 2 ml interne
standardne otopine B (4.5.2.) u odmjernu tikvicu od
20 ml i nadopuni do oznake s 45 % vol etanolom (4.4.) te dobro promiješa.

8.4.      Test
linearnosti

Prije početka analize, linearnost odziva plamenoionizacijskog detektora mora se provjeriti
sukcesivnom analizom u triplikatu svake standardne
otopine za provjeru linearnosti (4.5.3.).

Iz površine ili visine pika integratora za svako
se injektiranje napravi grafički prikaz koncentracija njihove matične otopine u
g/l u odnosu na omjer R za svaku.

R = visina ili površina pika trans-anetola podijeljena s visinom ili površinom pika estragola.

Mora se dobiti linearna krivulja.

8.5.      Određivanje

Injektira se slijepa proba (8.3.), zatim
standardna otopina C (4.5.4.), zatim jedna od otopina standarda za provjeru
linearnosti (4.5.3.) koje će djelovati kao uzorak za provjeru rada sustava
(može se odabrati s obzirom na vjerojatnu koncentraciju trans-anetola u nepoznatom uzorku), zatim pet nepoznatih uzoraka
(8.2.); umetne se uzorak za provjeru linearnosti (provjeru rada sustava) nakon
svakog petog nepoznatog uzorka da se osigura analitička stabilnost.

**9.
Izračunavanje faktora odziva detektora**

Izmjere se ili površine pikova (korištenjem
integratora ili drugog sustava za obradu podataka) ili visine pikova (ručna
integracija) za pikove trans-anetola ili internog
standarda.

9.1.      Izračunavanje
faktora odziva detektora (RF)

Faktor odziva detektora se izračunava na
sljedeći način:

RFi = (Ci/površina
ili visinai) \* (površina ili visinaIS/CIS)

Gdje je:

Ci= koncentracija trans-anetola u standardnoj otopini A (4.5.1.)

CIS = koncentracija internog
standarda u standardnoj otopini B (4.5.2.)

Površinai = površina (ili visina)
pika trans-anetola

PovršinaIS = površina (ili visina)
pika internog standarda

RFi se računa iz pet
uzoraka otopine C (4.5.4.).

9.2.      Analiza
linearnosti odziva detektora test otopinom

Injektiraju se test otopine za provjeru
linearnosti odziva detektora (4.5.3.).

9.3.      Analiza
uzorka

Injektira se nepoznata otopina uzorka (8.2.).

**10.
Izračunavanje rezultata**

Formula za izračunavanje koncentracije trans-anetola je sljedeća:

ci = CIS \* (površina ili visinai/površina ili visinaIS) \* RFi

Gdje je:

ci = nepoznata koncentracija trans-anetola

CIS = koncentracija internog
standarda u nepoznatoj otopini (4.5.2.)

Površina ili visinaii= površina ili visina pika trans-anetola

Površina ili visinaIS
= površina ili visina pika internog standarda

RFi= koeficijent odziva
detektora (izračunat kao u 9.1.)

Koncentracija trans-anetola
se izražava u gramima po litri s jednim decimalnim mjestom.

**11.
Osiguranje kakvoće i kontrola**

Kromatogrami moraju biti takvi da su
anetol i interni standard odvojeni jedan od drugog i
od bilo kojih interferirajućih tvari. Vrijednost RFi
se izračunava iz rezultata za pet injektiranja otopine C (4.5.4.). Ako je
koeficijent varijacije [CV % = (standardna devijacija/srednja vrijednost) \*
100)] unutar plus ili minus 1 %, prosječna vrijednost RFi
je prihvatljiva.

Gornji račun se mora koristiti za izračunavanje
koncentracije trans-anetola u uzorku izabranom za
provjeru rada sustava iz otopina za kontrolu linearnosti (4.5.3.).

Ako je srednja vrijednost izračunatih rezultata
iz analize otopine za kontrolu linearnosti izabrane za provjeru rada sustava
internog uzorka (IQC) unutar plus ili minus 2,5 % njihove teoretske
vrijednosti, tada rezultati za nepoznate uzorke mogu biti prihvaćeni.

**12.
Tretiranje uzorka alkoholnih pića koja sadrže velike količine šećera i uzorka
likera prije analize plinskim kromatografijom (GC)**

Ekstrakcija alkohola iz alkoholnih pića koja
sadrže velike količine šećera, da bi se mogla odrediti koncentracija trans-anetola primjenom plinske kromatografije.

12.1.    Princip

Uzme se alikvot uzorka
likera i doda se interni standard, u koncentraciji koja je slična koncentraciji
analita (trans-anetola) u
likeru. Tome se dodaje natrij fosfat dodekahidrat i
bezvodni amonij sulfat. Dobivena mješavina se dobro
promućka i ohladi, nastaju dva sloja, a gornji alkoholni sloj se odvoji. Uzme
se alikvot tog alkoholnog sloja i razrijedi s 45 %
otopinom etanola (4.4.). (Napomena: Interni standard se ne dodaje u ovoj fazi
jer je već dodan.). Dobivena otopina se analizira plinskom kromatografijom.

12.2.    Reagensi

Tijekom ekstrakcije koriste se reagensi čija je
čistoća veća od 99 %.

12.2.1. Amonij sulfat,
bezvodni, (CAS 7783-20-2).

12.2.2. Natrij fosfat dibazični
dodekahidrat, (Na2HPO4 × 12 H2O),
(CAS 10039-32-4).

12.3.    Aparatura

Konusne tikvice, tikvice za odjeljivanje,
hladnjak.

12.4.    Postupak

12.4.1. Pretraživanje uzoraka na estragol

Da bi se osiguralo da estragol
nije prirodno prisutan u uzorku, treba se provesti ekstrakcija (12.6.2.) i
analiza slijepe probe bez dodatka bilo kojeg internog standarda. Ako je estragol prirodno prisutan u uzorku tada se mora odabrati
drugi interni standard.

12.4.2. Ekstrakcija

Otpipetira se 5 ml 96 %-tnog etanola (4.1.) u konusnu tikvicu, odvaže se 50 mg
internog standarda (4.3.) u istu tikvicu, i doda 50 ml uzorka. Zatim se doda 12
g amonij sulfata, bezvodnog (12.2.1.), i 8,6 g dibazičnog natrij fosfata, dodekahidrata
(12.2.2.). Konusna tikvica se začepi.

Tikvica se mućka najmanje 30 minuta. Može se
koristiti mehanički uređaj za mućkanje, ali ne i magnetska poluga za miješanje
obložena teflonom jer teflon
apsorbira neke analite. Treba uočiti da se dodane
soli neće potpuno otopiti.

Začepljena tikvica se stavi u hladnjak (T <
5°C) najmanje dva sata.

Nakon tog vremena, trebaju postojati dva
odvojena tekuća sloja i kruti ostatak. Alkoholni sloj treba biti bistar; ako
nije stavi se ponovno u hladnjak dok se ne postigne jasno odvajanje slojeva.

Kada je ada je ni sloj bistar, pažljivo se uzme alikvot (npr. 10 ml), bez diranja
vodenog sloja, stavi se u bočicu s jantarnim staklom i zatvori sigurnosnim
zatvaračem.

12.4.3. Priprema ekstrahiranog
uzorka za analizu

Pusti se da ekstrakt (12.4.2.) postigne sobnu
temperaturu.

Uzme se 2 ml alkoholnog sloja temperiranog ekstrahiranog uzorka i otpipetira
u odmjernu tikvicu od 20 ml, nadopuni se do oznake s
45 %-tnim etanolom (4.4.) te dobro promiješa.

12.5.    Određivanje

Slijedi se postupak opisan pod 8.5.

12.6.    Izračunavanje rezultata

Za izračunavanje rezultata se koristi sljedeća
formula:

Ci = (mIS/V)
\* (površinai/površinaIS)
\* RFi

Gdje je:

mIS = masa internog
standarda (4.3.) uzetog (12.4.2.) (u miligramima)

V = volumen nepoznatog uzorka (50 ml)

RFi = faktor odziva
detektora (9.1.)

Površinai = površina pika trans-anetola

PovršinaIS = površina pika internog
standarda

Rezultati se izražavaju u gramima po litri s
jednim decimalnim mjestom.

12.7.    Kontrola i osiguranje
kakvoće

Slijedi se postupak naveden gore pod 11.

**13.
Karakteristike provođenja metode (preciznost)**

Statistički rezultati međulaboratorijskog
testiranja:

sljedeće tablice daju vrijednosti za anetol.

Sljedeći podaci su dobiveni iz međunarodnog
istraživanja provođenja metode koje je provedeno u skladu s međunarodno
dogovorenim postupcima.

Godina međulaboratorijskog
testiranja 1998

Broj
laboratorija                                      16

Broj uzoraka                                           10

Analit                                                  anetol

Pastis:

|  |  |  |  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Uzorci | A | B | C | D | E | F |
| Broj laboratorija preostalih nakon odbacivanja ekstremnih vrijednosti | 15 | 15 | 15 | 13 | 16 | 16 |
| Broj odbacivanja ekstremnih vrijednosti (laboratorija) | 1 | 1 | 1 | 3 | - | - |
| Broj prihvaćenih rezultata | 30 | 30 | 30 | 26 | 16 | 16 |
| Srednja vrijednost (~~x~~) g/l | 1,477 | 1,955 | 1,940 | 1,833 | 1,741 | 1,754 |
| Standardna devijacija ponovljivosti (Sr) g/l | 0,022 | 0,033 | 0,034 | 0,017 | - | - |
| Relativna standardna devijacija ponovljivosti (RSDr) (%) | 1,5 | 1,7 | 1,8 | 0,9 | - | - |
| Granica ponovljivosti (r) g/l | 0,062 | 0,093 | 0,096 | 0,047 | - | - |
| Standardna devijacija obnovljivosti (SR) g/l | 0,034 | 0,045 | 0,063 | 0,037 | 0,058 | 0,042 |
| Relativna standardna devijacija obnovljivosti (RSDR) (%) | 2,3 | 2,3 | 3,2 | 2,0 | 3,3 | 2,4 |
| Granica obnovljivosti (R) g/l | 0,094 | 0,125 | 0,176 | 0,103 | 0,163 | 0,119 |
| Vrste uzoraka  A = pastis; dvostruke slijepe probe.  B = pastis; dvostruke slijepe probe.  C = pastis; dvostruke slijepe probe.  D = pastis; dvostruke slijepe probe.  E = pastis; jedno ponavljanje.  F = pastis; jedno ponavljanje. | | | | | | |

Druga pića s okusom anisa:

|  |  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| Uzorci | G | H | I | J |
| Broj laboratorija preostalih nakon odbacivanja ekstremnih vrijednosti | 16 | 14 | 14 | 14 |
| Broj odbacivanja ekstremnih vrijednosti (laboratorija) | - | 2 | 1 | 1 |
| Broj prihvaćenih rezultata | 32 | 28 | 28 | 28 |
| Srednja vrijednost (~~x~~) g/l | 0,778  0,530(\*) | 1,742 | 0,351 | 0,599 |
| Standardna devijacija ponovljivosti (Sr) g/l | 0,020 | 0,012 | 0,013 | 0,014 |
| Relativna standardna devijacija ponovljivosti (RSDr) (%) | 3,1 | 0,7 | 3,8 | 2,3 |
| Granica ponovljivosti (r) g/l | 0,056 | 0,033 | 0,038 | 0,038 |
| Standardna devijacija obnovljivosti (SR) g/l | 0,031 | 0,029 | 0,021 | 0,030 |
| Relativna standardna devijacija obnovljivosti (RSDR) (%) | 4,8 | 1,6 | 5,9 | 5,0 |
| Granica obnovljivosti (R) g/l | 0,088 | 0,080 | 0,058 | 0,084 |
| Vrste uzorka  G = ouzo; razine razdiobe (\*).  H = anis; dvostruke slijepe probe.  I = liker s okusom anisa; ponavljanje.  J = liker s okusom anisa; ponavljanje. | | | | |

V. GLICIRIZINSKA
KISELINA. ODREĐIVANJE GLICIRIZINSKE KISELINE PRIMJENOM TEKUĆINSKE
KROMATOGRAFIJE VISOKE DJELOTVORNOSTI

**1.
Područje primjene**

Ova metoda je prikladna za određivanje glicirizinske kiseline u alkoholnim pićima s aromom anisa
primjenom tekućinske kromatografije
visoke djelotvornosti (HPLC).

**2.
Referentni standardi**

ISO 3696:1987: Voda za upotrebu u analitičkom laboratoriju
– Zahtjevi i test metode

**3.
Princip**

Koncentracija glicirizinske
kiseline se određuje primjenom tekućinske kromatografije visoke djelotvornosti (HPLC) s UV
detekcijom. Standardna otopina i test uzorak se filtriraju i odvojeno
injektiraju direktno u sustav HPLC.

**4.
Reagensi**

Tijekom analize, koriste se samo reagensi za
HPLC, apsolutni etanol i voda čiji stupanj kvalitete mora biti 3 prema
definiciji standarda ISO 3696.

4.1.      Etanol 96 %
vol (CAS 64-17-5).

4.2.      Amonij glicirizinat, C42H62O16.NH3 (amonijeva sol glicirizinske kiseline)

(Molekularna težina: 839,98) (CAS 53956-04-0):
čistoće najmanje 90 %

(Molekularna težina: glicirizinska
kiselina 822,94).

4.3.      Ledena octena
kiselina, CH3COOH, (CAS 64-19-7).

4.4.      Metanol,
CH3OH (CAS 67-56-1).

4.5.      Etanol 50 %
vol.

Za 1000 ml na 20°C:

– 96 % vol. Etanol (4.1.): 521 ml

– Voda (2.0.): 511 ml.

4.6.      Pripr; PriprC
otopina za eluaciju

4.6.1.   Otapalo za eluaciju A (primjer)

80 dijelova (po volumenu) vode (2.0.)

20 dijelova (po volumenu) octene kiseline
(4.3.).

Otapalo za eluaciju se
otplinjava u trajanju od pet minuta.

Napomena: Ako voda koja se koristi nije mikrofiltrirana, preporučuje se filtrirati pripremljeno
otapalo za eluaciju na filtru za organska otapala s
veličinom pora koja je manja ili jednaka 0,45 µm.

4.6.2.   Otapalo za eluaciju B

Metanol (4.4.).

4.7.      Priprema
standardnih otopina

Sve standardne otopine moraju biti svježe
pripremljene nakon dva mjeseca.

4.7.1.   Referentna otopina C

Izvaže se s preciznošću 0,1 mg, 25 mg amonij glicirizinata (4.2.) u odmjernu tikvicu od 100 ml. Doda se nešto 50 % vol etanola
(4.5.) i otopi amonij glicirizinat.
Kada se otopi nadopuni se do oznake s 50 % vol etanolom (4.5.).

Filtrira se kroz filtar za organska otapala.

4.7.2.   Standardne otopine koje se
koriste za provjeru linearnosti odziva detektora

1,0 g/l matične otopine se pripremi vaganjem, s
preciznošću 0,1 mg, 100 mg amonij glicirizinata
u odmjernu tikvicu od 100 ml. Doda se nešto 50 % vol
etanola (4.5.) i otopi amonij glicirizinat.
Kada se otopi nadopuni se do oznake 50 % vol etanolom (4.5.).

Pipetiranjem se pripreme najmanje
četiri druge otopine koje sadrže 0,05; 0,10; 0,25 i 0,50 g/l amonij glicirizinata odnosno 5,
10, 25 i 50 ml 0,1 g/l matične otopine u odvojene odmjerne
tikvice od 100 ml. Zatim se nadopuni do oznake s 50 % vol etanolom te dobro
promiješa.

Sve otopine se filtriraju kroz filtar za
organska otapala.

**5.
Aparatura**

5.1.      Sustav za
odjeljivanje

5.1.1.   Tekućinski
kromatograf visoke djelotvornosti.

5.1.2.   Sustav pumpi koji omogućuje
postizanje i zadržavanje konstantne ili programirane brzine protoka s visokom
preciznošću.

5.1.3.   UV spektrofotometrijski
sustav detekcije: mora biti postavljen na 254 nm.

5.1.4.   Sustav za otplinjavanje
otapala.

5.2.      Računalni
integrator ili uređaj za snimanje čiji rad je kompatibilan s ostatkom sustava.

5.3.      Kolona
(primjer):

Materijal: nehrđajući čelik ili staklo

Unutarnji promjer: 4 do 5 mm

Duljina: 100 do 250 mm

Stacionarna faza: umreženi silicij s (poželjno sferičnom) oktadecilnom
funkcionalnom grupom (C18), maksimalne veličine čestica: 5 µm.

5.4.
Laboratorijska oprema

5.4.1.   Analitička vaga s preciznošću
0,1 mg

5.4.2.   Odmjerno
posuđe stupnja A

5.4.3.   Mikromembranska
filtracija pogodna za male volumene.

**6.
Kromatografski uvjeti**

6.1.
Karakteristike  (primjer):

– brzina protoka: 1 ml/minuti,

– otapalo A = 30 %,

– otapalo B = 70 %.

6.2.      Detekcija:

– UV = 254 nm

**7.
Postupak**

7.1.      Priprema
uzorka alkoholnog pića

Filtrira se, ako je potrebno, kroz filtar za
organska otapala (promjer pora: 0,45 ěm).

7.2.      Određivanje

Kada se kromatografski
uvjeti stabiliziraju,

– injektira se 20 µl referentne otopine C
(4.7.1.),

– injektira se 20 µl otopine uzorka,

– usporede se dva kromatograma.
Identificiraju se pikovi glicirizinske kiseline na
osnovi njihovih vremena zadravanja. Izmjere se
njihove povrine (ili visine) i izrauna
se koncentracija u g/l na dva decimalna mjesta primjenom sljedee
jednadbe:

                    h × P × 823

c = C × ————————

                    H × 100 × 840

gdje je:

c = koncentracija u gramima po litri glicirizinske kiseline u alkoholnom piću koje se analizira

C = koncentracija u gramima po litri amonij glicirizinata u
referentnoj otopini

h = površina (ili visina) pika glicirizinske kiseline u alkoholnom piću koje se analizira

H = površina (ili visina) pika glicirizinske kiseline u referentnoj otopini

P = čistoća referentnog amonij
glicirizinata (u %)

823 = masa jednog mola glicirizinske
kiseline

840 = masa jednog mola amonij
glicirizinata.

**8.
Karakteristike provođenja metode (preciznost)**

Statistički rezultati međulaboratorijskog
testiranja:

sljedeća tablica daje vrijednosti za glicirizinsku kiselinu.

Sljedeći podaci su dobiveni iz međunarodnog
istraživanja provođenja metode koje je provedeno u skladu s međunarodno
dogovorenim postupcima.

Godina međulaboratorijskog
testiranja 1998

Broj
laboratorija                                      16

Broj uzoraka                                             5

Analit                              glicirizinska
kiselina

|  |  |  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Uzorci | A | B | C | D | E |
| Broj laboratorija preostalih nakon odbacivanja ekstremnih vrijednosti | 13 | 14 | 15 | 16 | 16 |
| Broj odbacivanja ekstremnih vrijednosti (laboratorija) | 3 | 2 | 1 | - | - |
| Broj prihvaćenih rezultata | 26 | 28 | 30 | 32 | 32 |
| Srednja vrijednost (~~x~~) g/l | 0,046 | 0,092 (\*)0,099 | 0,089 | 0,249 | 0,493 |
| Standardna devijacija ponovljivosti (Sr) g/l | 0,001 | 0,001 | 0,001 | 0,002 | 0,003 |
| Relativna standardna devijacija ponovljivosti (RSDr) (%) | 1,5 | 1,3 | 0,7 | 1,0 | 0,6 |
| Granica ponovljivosti (r) g/l | 0,002 | 0,004 | 0,002 | 0,007 | 0,009 |
| Standardna devijacija obnovljivosti (SR) g/l | 0,004 | 0,007 | 0,004 | 0,006 | 0,013 |
| Relativna standardna devijacija obnovljivosti (RSDR) (%) | 8,6 | 7,2 | 4,0 | 2,5 | 2,7 |
| Granica obnovljivosti (R) g/l | 0,011 | 0,019 | 0,010 | 0,018 | 0,037 |
| Vrsta uzorka  A = pastis; dvostruke slijepe probe.  B = pastis; razine razdiobe (\*).  C = pastis; dvostruke slijepe probe.  D = pastis; dvostruke slijepe probe.  E = pastis; dvostruke slijepe probe. | | | | | |

VI. KALKONI. METODA
TEKUĆINSKE KROMATOGRAFIJE VISOKE DJELOTVORNOSTI ZA PROVJERU PRISUSTVA KALKONA U
PASTISU

**1.
Područje primjene**

Ova metoda je prikladna za određivanje
prisutnosti kalkona u alkoholnim pićima s okusom
anisa. Kalkoni su prirodne boje iz porodice flavonoida koje su prisutne u slatkom korijenu (Glycyrrhiza glabra).

**2.
Referentni standardi**

ISO 3696:1987, Voda za upotrebu u analitičkom
laboratoriju – Zahtjevi i test metode

**3.
Princip**

Pripremi se referentna otopina ekstrakta slatkog
korijena. Prisutnost ili odsutnost kalkona se
određuje primjenom tekućinske kromatografije
visoke djelotvornosti (HPLC) s UV detekcijom.

**4.&n"'>4.&nsp
Reagensi**

Tijekom analize koriste se samo reagensi za
HPLC. Etanol mora biti 96 % vol. Treba se koristiti samo voda stupnja kvalitete
3 u skladu s definicijom standarda ISO 3696.

4.1.      Etanol 96 %
vol. (CAS 64-17-5)

4.2.      Acetonitril, CH3CN, (CAS 75-05-8)

4.3.      Referentna
tvar: *Glycyrrhiza* *glabra*:
slatki korijen

Grubo mljeveni slatki korijen (*Glycyrrhiza* *glabra*).
Prosječne dimenzije štapićastih čestica: dužina: 10 do 15 mm, debljina: 1 do 3
mm.

4.4.      Natrij
acetat, CH3COONa, (CAS 127-09-3)

4.5.      Ledena octena
kiselina, CH3COOH, (CAS 64-19-7)

4.6.      Priprema
otopina

4.6.1.   Etanol 50 % vol

Za 1000 ml na 20°C:

– 96 % vol etanol (4.1.): 521 ml,

– Voda (2.0.): 511 ml.

4.6.2.   Otapalo A: acetonitril

Acetonitril (4.2.) HPLC analitičke
čistoće.

Otplinjava se.

4.6.3.   Otapalo B: 0,1 M pufer otopina natrij acetata, pH = 4,66.

U odmjernu tikvicu od
1000 ml izvaže se 8,203 g natrij acetata (4.4.), doda se 6,005 g ledene octene
kiseline (4.5.) i nadopuni do oznake s vodom (2).

**5.
Priprema referentnog standarda iz** *Glycyrrhiza* *glabra* **(4.3.)**

5.1.      Izvaže se 10
g mljevenog slatkog korijena (*Glycyrrhiza* *glabra*) (4.3.) i stavi u destilacijsku tikvicu s
okruglim dnom

– doda se 100 ml 50 % vol etanola (4.6.1.),

– refluksira se sat vremena,

– filtrira se,

– filtrat se odloži za kasniju upotrebu.

5.2.      S filtra se
skine ekstrakt slatkog korijena

– stavi se u destilacijsku tikvicu s okruglim dnom,

– doda se 100 ml 50 % vol etanola (4.6.1.),

– refluksira se sat vremena,

– filtrira se. Filtrat se odloži za kasniju upotrebu.

5.3.      Ekstrakcija
slatkog korijena se mora provesti tri puta za redom.

5.4.      Spoje se tri
filtrata.

5.5.      Na
rotacijskom isparivaču se ispari faza otapala (iz
5.4.).

5.6.      Zaostali
ekstrakt (iz 5.5.) se pomiješa s 100 ml 50 % vol etanola (4.6.1.).

**6.
Aparatura**

6.1.      Sustav za
odjeljivanje.

6.1.1.   Tekućinski
kromatograf visoke djelotvornosti.

6.1.2.   Sustav za pumpanje koji može
postići i održati konstantnu ili programiranu brzinu protoka pri visokom tlaku.

6.1.3.   Sustav detekcije UV/vidljivim
spektrofotometrom koji može biti postavljen na 254 i
370 nm.

6.1.4.   Sustav za otplinjavanje
otapala:

6.1.5.   Termostatirani
prostor s kolonom temperiran na 40 ± 0,1°C.

6.2.      Računalni
integrator ili uređaj za bilježenje čiji rad je kompatibilan s ostatkom sustava
za odjeljivanje.

6.3.      Kolona

Materijal: nehrđajući čelik ili staklo

Unutarnji promjer: 4 do 5 mm

Stacionarna faza: umreženi silicij s oktadecilnom
funkcionalnom grupom (C18), Veličine čestica: najviše 5 µm (umrežena faza).

6.4.      Uobičajena
laboratorijska oprema, uključujući:

6.4.1.   Analitička vaga, (preciznost:
± 0,1 mg);

6.4.2.   Aparatura za destilaciju s
povratnim hladilom koji se sastoji od, na primjer:

– tikvice s okruglim dnom od 250 ml sa standardnim spojem od brušenog stakla,

– 30 cm dugog povratnog hladila, i

– izvora topline (bilo kakva pirogena reakcija koja
uključuje ekstrakt mora se izbjeći uporabom prikladnog sustava).

6.4.3.   Rotacijski uređaj za
isparavanje.

6.4.4.   Pribor za filtriranje (tj. Buchnerov lijevak).

6.5.      Kromatografski uvjeti (primjer).

6.5.1.   Karakteristike eluacije otapala A (4.6.2.) i B (4.6.3.):

– pomak s gradijenta 20/80 (V/V) na 50/50 (V/V)
za 15 minuta,

– pomak s gradijenta 50/50 (V/V) na 75/25 (V/V)
za pet minuta,

– jednaka jakost na 75/25 (V/V) za pet minuta,

– stabilizacija kolone između injektiranja,

– jednaka jakost na 20/80 (V/V) za pet minuta.

6.5.2.   Brzina protoka: 1 ml/minuti.

6.5.3.   Podešavanje UV detektora:

Detektor mora biti postavljen na 370 nm za
detekciju prisustva kalkona
i zatim na 254 nm za detekciju glicirizinske
kiseline.

Napomena: Promjena valne duljine (s 370 na 254
nm) mora biti provedena 30 sekundi prije početka pika eluacije
glicirizinske kiseline.

**7.
Postupak**

7.1.      Priprema
uzorka alkoholnog pića

Filtrira se kroz filtar za organska otapala
(promjer pora: 0,45 ěm).

7.2.      Priprema
rezidualnog ekstrakta slatkog korijena (5.6.)

Prije analize se napravi razrjeđenje jedan
naprema deset s 50 % vol etanolom (4.6.m (4.6.pan>

**7.3.
Određivanje**

7.3.1.   Injektira se 20 ěl pripremljenog ekstrakta slatkog korijena (7.2.). Analiza
se provodi primjenom kromatografskih uvjeta koji su
gore opisani (6.5.).

7.3.2.   Injektira se 20 ěl uzorka (7.1.) (uzorak alkoholnog pia
s okusom anisa). Analiza se provodi primjenom kromatografskih
uvjeta koji su gore opisani (6.5.).

7.3.3.   Usporede se dva kromatograma. Mora postojati velika slinost
izmeu dva kromatograma u
zoni izlaza kalkona (tijekom detekcije na 370 nm pod
uvjetima analize koji su gore opisani) (vidi Sliku 2.).

**8.
Karakteristični kromatogram za pastis**

![](dodatni/355982.gif)

*Slika 2*.:
KROMATOGRAM DOBIVEN GORE OPISANOM METODOM, PRIKAZUJE PRISUSTVO KALKONA U
»PASTISU«. PIKOVI 1 DO 8 SU KALKONI, A PIK 9 JE GLICIRIZINSKA KISELINA

**9.
Karakteristike provođenja metode (preciznost)**

Rezultati međulaboratorijskog
testiranja:

sljedeća tablica daje rezultate za potvrđivanje
prisutnosti ili odsutnosti kalkona u pastisu i alkoholnim pićima s okusom anisa.

Sljedeći podaci su dobiveni iz međunarodnog
istraživanja provođenja metode koje je provedeno u skladu s međunarodno
dogovorenim postupcima.

Godina međulaboratorijskog
testiranja 1998

Broj
laboratorija                                     14

Broj uzoraka                                          11

Analit                                               kalkoni

|  |  |  |  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Uzorci | A | B | C | D | E | F |
| Broj labroj laboratoristalih nakon odbacivanja ekstremnih vrijednosti | 14 | 14 | 14 | 14 | 14 | 13 |
| Broj odbacivanja ekstremnih vrijednosti (laboratorija) | - | - | - | - | - | 1(\*) |
| Broj prihvaćenih rezultata | 28 | 14 | 14 | style='font-size:11.0pt'>28 | 28 | 26 |
| Broj rezultata za prisutnost kalkona | 28 | 14 | 14 | 0 | 28 | 0 |
| Broj rezultata za odsutnost kalkona | 0 | 0 | 0 | 28 | 0 | 26 |
| Postotak točnih rezultata (%) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| (\*) Nedosljedni rezultati između dva duplikata koji se pripisuju pogrešci kod uzorkovanja | | | | | | |

|  |  |  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Uzorci | G | H | I | J | K |
| Broj laboratorija preostalih nakon odbacivanja ekstremnih vrijednosti | 14 | 14 | 14 | 14 | 14 |
| Broj odbacivanja ekstremnih vrijednosti (laboratorija) | - | - | - | - | - |
| Broj prihvaćenih rezultata | 28 | 14 | 14 | 28 | 28 |
| Broj rezultata za prisutnost kalkona | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
|th=183 valign=top style='width:137.55pt;border:solid black 1.0pt;
border-top:none;mso-border-top-alt:solid black .25pt;mso-border-alt:solid black .25pt;
padding:2.85pt 2.85pt 2.85pt 2.85pt;height:2.95pt'>

Broj rezultata za odsutnost kalkona

 28 | 14 | 14 | 28 | 28 |
| Postotak točnih rezultata (%) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |

Vrsta uzoraka:

A = pastis; dvostruke
slijepe probe.

B = pastis; jedan
uzorak.

C = pastis; jedan
uzorak.

D = »pastis« (koji ne
sadrži kalkone); dvostruke slijepe probe.

E = »pastis« (koji ne
sadrži kalkone); dvostruke slijepe probe.

F = liker s okusom anisa (koji ne sadrži kalkone); dvostruke slijepe probe.

G = liker s okusom anisa (koji ne sadrži kalkone); dvostruke slijepe probe.

H = ouzo (koji ne
sadrži kalkone); jedan uzorak.

I = ouzo (koji ne
sadrži kalkone): jedan uzorak.

J = anis (koji ne sadrži kalkone);
dvostruke slijepe probe.

K = »pastis« (koji ne
sadrži kalkone); dvostruke slijepe probe.

VII. ŽUMANJAK.
ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE ŽUMANJKA U ALKOHOLNIM PIĆIMA – FOTOMETRIJSKA METODA

**1.
Područje primjene**

Ova metoda je prikladna za određivanje
koncentracije žumanjka u rasponu od 40 do 250 g/l u likeru od jaja i likeru s
jajima.

**2.
Referentni standardi**

ISO 3696:1897 Voda za upotrebu u analitičkom
laboratoriju – Zahtjevi i test metode.

**3.
Princip**

Fosforni spojevi topivi u etanolu koji su
pronađeni u žumanjku se ekstrahiraju i analiziraju fotometrijski kao kompleks
fosfornog molibdata.

**4.
Reagensi**

4.1.      Redestilirana voda

4.2.      Dijatomejska zemlja

4.3.      Etanol 96 %
vol (CAS 64-17-5)

4.4.      15 %-tna otopina magnezij acetata (CAS 16674-78-5)

4.5.      10 %-tna sumporna kiselina (CAS 7664-93-9)

4.6.      1 N sumporne
kiselina

4.7.      0,16 g/l kalij dihidrogen fosfata (CAS 778-77-0), otopina KH2PO4

4.8.      Reagens za
određivanje fosfata:

Otopi se 20 g amonij molibdata (CAS 12054-85-2), (NH4)6Mo7O24
× 4 H2O u 400 ml vode na 50°C;

Otopi se, u drugoj posudi, 1 g amonij vanadata (CAS 7803-55-6),
NH4VO3, u 300 ml vruće vode, ostavi se da se ohladi, i
zatim doda 140 ml koncentrirane nitratne kiseline
(CAS 7697-37-2). Ohlađene otopine se spoje u odmjernu
tikvicu od 1000 ml i nadopuni do oznake.

**5.
Aparatura**

5.1.      Konusna
tikvica od 100 ml

5.2.      Ultrazvučna
kupelj (ili magnetski mješač)

5.3.      Odmjerna tikvica od 100 ml

5.4.      Vodena kupelj
na 20°C

5.5.      Filtar (Whatman br. 4 ili ekvivalentni)

5.6.      Porculanski
(ili platinasti) lončić

5.7.      Kipuća vodena
kupelj

5.8.      Zagrijana
električna ploča s regulacijom

5.9.      Mufolna peć

5.10.    Odmjerna
tikvica od 50 ml

5.11.    Odmjerna
tikvica od 20 ml

5.12.    Spektrofotometar
podešen na 420 nm

5.13.    Kiveta
od 1 cm.

**6.
Uzorci**

Prije analize uzorci se skladište na sobnoj
temperaturi.

**oman"'>7.
Postupak**

7.1.      Priprema
uzorka

7.1.1.   Odvaže se 10 g uzorka u
konusnu tikvicu od 100 ml (5.1.).

7.1.2.   Postepeno se dodaje 70 ml
etanola (4.3.) u malim količinama, promućka se nakon svakog dodavanja, i stavi
u ultrazvučnu kupelj (5.2.) na 15 minuta (ili se promiješa s magnetskim
mješačem (5.2.) 10 minuta na sobnoj temperaturi).

7.1.3.   Sadržaj se iz konusne tikvice
prebaci u odmjernu tikvicu od 100 ml (5.3.) uz
ispiranje etanolom (4.3.). Do kalibracijske oznake se nadopuni etanolom (4.3.)
i tikvica se stavi u vodenu kupelj na 20°C (5.4.). Podesi se do kalibracijske
oznake na 20°C.

7.1.4.   Doda se mala količina dijatomejske zemlje (4.2.) i filtrira (5.5.), uz
odbacivanje prvih 20 ml.

7.1.5.   25 ml filtrata se prebaci u
porculanski (ili platinasti) lončić (5.6.). Filtrat
se zatim mora koncentrirati polaganim isparavanjem u kipućoj vodenoj kupelji
(5.7.), uz dodatak 5 ml 15 %-tne otopine magnezij
acetata (4.4.).

7.1.6.   Lončići se stave na zagrijanu
električnu ploču s regulacijom (5.8.) i zagrijavaju se dok se ne dobije suha
tvar.

7.1.7.   Ostatak se spali do
užarenosti na 600°C u mufolnoj peći (5.9.) dok pepeo
ne pobijeli, najmanje 1,5 sati, ali se može ostaviti i preko noći.

7.1.8.   Uzme se pepeo s 10 ml 10 %-tne sumporne kiseline (4.5.) i prebaci se uz ispiranje
destiliranom vodom u odmjernu tikvicu od 50 ml
(5.10.), nadopuni se do oznake destiliranom vodom na sobnoj temperaturi (4.1.).
5 ml alikvota te otopine pepela koristi se za
pripremu otopine uzorka za analizu fosfata fotometrijom.

7.2.      Analiza
fosfata fotometrijom

7.2.1.   Komparativna otopina

7.2.1.1.
Stavi se 10 ml 10 %-tne sumporne kiseline (4.5.) u odmjernu tikvicu od 50 ml (5.10.) i nadopuni do oznake
destiliranom vodom (4.1.).

7.2.1.2.
U 5 ml alikvota te otopine (7.2.1.1.) koja se nalazi
u odmjernoj tikvici od 20 ml (5.11.), doda se 1 ml 1
N sumporne kiseline (4.6.) i 2 ml reagensa fosfata (4.8.) i nadopuni do oznake
od 20 ml destiliranom vodom (4.1.).

7.2.1.3.
Začepi se labavo umetnutim čepom, promućka, i zagrijava u kipućoj vodenoj
kupelji (5.7.) 10 minuta, zatim se hladi u vodenoj kupelji na 20°C (5.4.) 20
minuta.

7.2.1.4.
Napuni se kiveta od 1 cm (5.13.) s tom komparativnom
otopinom.

7.2.2.   Otopina uzorka

7.2.2.1.
U 5 ml alikvota otopine pepela (7.1.8.) koja se
nalazi u odmjernoj tikvici od 20 ml (5.11.), doda se
1 ml 1 N sumporne kiseline (4.6.) i 2 ml reagensa fosfata (4.8.) i nadopuni do
oznake od 20 ml destiliranom vodom (4.1.).

7.2.2.2.
Začepi se labavo umetnutim čepom, promućka, i zagrijava u kipućoj vodenoj
kupelji (5.7.) 10 minuta, zatim se hladi u vodenoj kupelji na 20°C (5.4.) 20
minuta.

7.2.2.3.
Žuta otopina koja se dobije se odmah analizira spektrofotometrijski
(5.12.) u kiveti od 1 cm (5.13.) na 420 nm u odnosu
na komparativnu otopinu (7.2.1.4.).

7.2.3.   Kalibracijska krivulja

7.2.3.1.
Da bi se konstruirala kalibracijska krivulja, doda se po 2 ml alikvota reagensa fosfata (4.8.) u odmjerne
tikvice od 20 ml (5.11.) od kojih svaka sadrži po 1 ml 1 N sumporne kiseline
(4.6.) i 0, 2, 4, 6, 8 i 10 ml otopine kalij dihidrogen
fosfata (4.7.) i nadopuni do oznake od 20 ml s destiliranom vodom (4.1.).

7.2.3.2.
Začepi se labavo umetnutim čepom, promućka, i zagrijava u kipućoj vodenoj
kupelji (5.7.) 10 minuta, zatim se hladi u vodenoj kupelji na 20°C (5.4.) 20
minuta i analizira spektrofotometrijski u kiveti od 1 cm (5.13.) na 420 nm u odnosu na komparativnu
otopinu (7.2.1.4.).

7.2.3.3.
Konstruiranje kalibracijske krivulje:

|  |  |  |  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Otopina dihidrogen fosfata (ml) | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |
| P2O5 (mg) | 0 | 0,167 | 0,334 | 0,501 | 0,668 | 0,835 |

**8.
Izražavanje rezultata**

Sadržaj žumanjka u g/l se izračuna iz sljedeće
formule:

                                                   110 × gustoću

g/l žumanjka = mg P2O5
×  ——————————

E/40

gdje je:

110 = faktor konverzije za ukupni P2O5
u g u 100 g žumanjka

mg P2O5 = vrijednost
utvrđena iz kalibracijske krivulje

gustoća = masa po jedinici volumena (g/ml)
likera na bazi jaja na 20°C

E = težina likera na bazi jaja u g

40 = faktor razrjeđenja zđenja za 5 ml class=SpellE>alikvota otopine pepela.

**9.
Karakteristike provođenja metode (preciznost)**

Statistički rezultati međulaboratorijskog
testiranja:

sljedeća tablica daje vrijednosti za žumanjak.

Sljedeći podaci su dobiveni iz međunarodnog
istraživanja provođenja metode koje je provedeno u skladu s međunarodno
dogovorenim postupcima.

Godina međulaboratorijskog
testiranja 1998

Broj
laboratorija                                      24

Broj uzoraka                                            5

Analit                                          žumanjak

|  |  |  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Uzorci | A | B | C | D | E |
| Broj laboratorija preostalih nakon odbacivanja ekstremnih vrijednosti | 19 | 20 | 22 | 20 | 22 |
| Broj odbacivanja ekstremnih vrijednosti (laboratorija) | ass=T-98bezuvl align=center style='text-align:center'>3 | 4 | 2 | 4 | 2 |
| Broj prihvaćenih rezultata | 38 | 40 | 44 | 40 | 44 |
| Srednja vrijednost (~~x~~) | 147,3 | 241,1 | 227,4 | 51,9(\*) 72,8(\*) | 191,1 |
| Standardna devijacija ponovljivosti (Sr) g/l | 2,44 | 4,24 | 3,93 | 1,83 | 3,25 |
| Relativna standardna devijacija ponovljivosti (RSDr) (%) | 1,7 | 1,8 | 1,8 | 2,9 | 1,7 |
| Granica ponovljivosti (r) g/l | 6,8 | 11,9 | 11,0 | 5,1 | 9,1 |
| Standardna devijacija obnovljivosti (SR) g/l | 5,01 | 6,06 | 6,66 | 3,42 | 6,87 |
| Relativna standardna devijacija obnovljivosti (RSDR) (%) | 3,4 | 2,5 | 2,9 | 5,5 | 3,6 |
| Granica obnovljivosti (R) g/l | 14,0 | 17,0 | 18,7 | 9,6 | 19,2 |
| Vrste uzoraka  A = advocaat; dvostruke slijepe probe.  B = advocaat; dvost slijepe probe.  C = advocaat; dvostruke slijepe probe.  D = advocaat (razrijeđeni); razine razdiobe (\*).  E = advocaat; dvostruke slijepe probe. | | | | | |

**PRILOG 2.**

*Tablica*: GUSTOĆA KAO
FUNKCIJA TEMPERATURE I ALKOHOLNE JAKOSTI IZRAŽENE VOLUMENOM

r
= r (t, q)

interval: 1°C; 1 % vol

temperatura: od – 20°C do + 40°C

Simboli i mjerne jedinice:

r
= gustoa (kg/m3)

q = alkoholna jakost izraena
volumenom (% vol)

t = temperatura (°C)

**![](dodatni/355983.gif)
![](dodatni/355984.gif)
![](dodatni/355985.gif)
![](dodatni/355986.gif)
![](dodatni/355987.gif)
![](dodatni/355988.gif)
![](dodatni/355989.gif)
![](dodatni/355990.gif)
![](dodatni/355991.gif)
![](dodatni/355992.gif)
![](dodatni/355993.gif)
![](dodatni/355994.gif)**

**PRILOG 3.**

FORMULA PO KOJOJ SU IZRAČUNATE
VRIJEDNOSTI KOJE SE NALAZE U TABLICI ALKOHOLNIH JAKOSTI MJEŠAVINEETANOL-VODA

Gustoća (r)
u kilogramima po metru kubnom (kg/m3) mjeđavine etanol-voda na temperaturi t u °C je odreena formulom koja je ispod navedena kao funkcija:

– alkoholne jakosti po teţini
(p) izraţena kao decimalni broj (1),

– temperature (t) u °C (EIPT 68),

– brojčanih koeficijenata koji su navedeni u
tablici.

(1) = npr. za
alkoholnu jakost od 12 % po težini, p = 0,12.

Formula vrijedi za temperature između – 20°C i +
40°C.

![](dodatni/355995.gif)

Gdje je: n = 5; m1
= 11; m2 = 10; m3
= 9; m4 = 4; m5
= 2.

Brojčani koeficijenti u formuli:

|  |  |  |  |  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| k | Ak    kg/m³ | Bk | C1,k    kg/(m³ × °C) | C2,k    kg/(m³ × °C²) | C3,k    kg/(m³ × °C³) | C4,k    kg/(m³ × °C4) | C5,k    kg/(m³ × °C5) |
| 1 | 9,982012300 × 10² | -2,0618513 × 10-1 kg/(m³ × °C) | 1,693443461530087 × 10-1 | -1,193013005057010 × 10-2 | -6,802995733503803 × 10-4 | 4,075376675622027 × 10-6 | -2,788074354782409 × 10-8 |
| 2 | -1,929769496 × 10² | -5,2682542 × 10-3 kg/(m³ × °C²) | -1,046914743455169 × 101 | 2,517399633803461 × 10-1 | 1,876837790289664 × 10-2 | -8,763058573471110 × 10-6 | 1,345612883493354 × 10-8 |
| 3 | 3,891238958 × 10² | 3,6130013 × 10-5 kg/(m³ × °C³) | 7,196353469546523 × 101 | -2,170575700536993 | -2,002561813734156 × 10-1 | 6,515031360099368 × 10-6 |  |
| 4 | -1,668103923 × 10³ | -3,8957702 × 10-7 kg/(m³ × °C4) | -7,047478054272792 × 10² | 1,353034988843029 × 101 | 1,022992966719220 | -1,515784836987210 × 10-6 |  |
| 5 | 1,352215441 × 104 | 7,1693540 × 10-9 kg/(m³ × °C5) | 3,924090430035045 × 10³ | -5,029988758547014 × 101 | -2,895696483903638 |  |  |
| 6 | -8,829278388 × 104 | -9,9739231 × 10-11 kg/(m³ × class=SpellE>C6) | -1,210164659068747 × 104 | 1,096355666577570 × 10² | 4,810060584300675 |  |  |
| 7 | 3,062874042 × 105 |  | 2,248646550400788 × 104 | -1,422753946421155 × 10² | -4,672147440794683 |  |  |
| 8 | -6,138381234 × 105 |  | -2,605562982188164 × 104 | 1,080435942856230 × 102 | 2,458043105903461 |  |  |
| 9 | 7,470172998 × 105 |  | 1,852373922069467 × 104 | -4,414153236817392 × 101 | -5,411227621436812 × 10-1 |  |  |
| 10 | -5,478461354 × 105 |  | -7,420201433430137 × 10³ | 7,442971530188783 |  |  |  |
| 11 | 2,234460334 × 105 |  | 1,285617841998974 × 10³ |  |  |  |  |
| 12 | -3,903285426 × 104 |  |  |  |  |  |  |

if !supportLists(1)     endif= npr. za
alkoholnu jakost od 12 % po težini, p = 0,12.

Pravilnik, NN 138/2005-2599
Opći uvjeti korištenjaZaštita privatnosti[Pristup podatcima](/data_access_hr.aspx)[ELI](/about_eli_hr.aspx)

©2026. g. Narodne novine d.d.

, izrada [Novena d.o.o.](http://novena.hr/)