## Pravilnik o provođenju analitičkih metoda i tumačenju rezultata

### NN 2/2005 (4.1.2005.), Pravilnik o provođenju analitičkih metoda i tumačenju rezultata

# MINISTARSTVO POLJOPRIVREDE, ŠUMARSTVA I VODNOGA GOSPODARSTVA

16

Na
temelju članka 78. stavka 3. Zakona o veterinarstvu (»Na­rodne novine« 70/97,
105/01 i 172/03) ministar poljoprivrede, šumarstva i vodnoga gospodarstva
donosi

## PRAVILNIK

### o provoĐenju analitiČkih metoda i tumaČenju rezultata

POGLAVLJE
I.

TEMELJNE
ODREDBE

Članak
1.

Ovim se
Pravilnikom utvrđuju mjere za analitičke metode koje se koriste u ispitivanju
službenih uzoraka koji su uzeti sukladno važećem Pravilniku o mjerama za
monitoring određenih tvari i njihovih rezidua u živim životinjama i proizvodima
životinjskog podrijetla, te određuju zajednički kriteriji za tumačenje
analitičkih rezultata koji su za te uzorke dobiveni u ovlaštenim
laboratorijima.

Definicije

Članak
2.

Za
potrebe ovog Pravilnika pojedini pojmovi imaju sljedeća značenja:

– *Alfa (**a**) pogreška:* vjerojatnost da je ispitani
uzorak stvarno negativan, iako su dobiveni pozitivni rezultati (lažno pozitivni
rezultat).

– *Analit:* tvar koju treba dokazati, identificirati
i/ili kvantificirati i njeni derivati koji se jave tijekom analize.

– *Baždarni (kalibracijski) standard:* mjerno
sredstvo koje predstavlja količinu ispitivane tvari na način da povezuje njenu
vrijednost s referentnom bazom.

– *Beta (ß) pogreška:* vjerojatnost da je
ispitani uzorak stvarno pozitivan, iako su dobiveni negativni mjerni rezultati
(lažno negativni rezultat).

– *Dopuštena količina:* najveća granica rezidua,
najveća razina ili druga najveća tolerancija.

– *Granična koncentracija (količina) analita (CC**a**)* je granica na kojoj i iznad
koje se može zaključiti, uz vjerojatnost *a* po­greške da uzorak ne
udovoljava.

– *Iskorištenje (engl. recovery)*: postotak
stvarne koncentracije tvari izdvojene tijekom analitičkog postupka. Određuje se
tijekom vrednovanja metode, ako potvrđeni referentni materijal nije dostupan.

– *Ispitivanje osposobljenosti:* analiziranje
istog uzorka, pri čemu laboratoriji mogu primijeniti metode po vlastitom
izboru, uz uvjet da se te metode primijene pod uobičajenim uvjetima.
Ispitivanje se mora provesti u skladu s uputama ISO/IEC 43-1 i 43-2 i može
služiti za ocjenu ponovljivosti metoda.

– *Ispitivanje unutar jednog laboratorija
(unutarnje vrednovanje):* analitičko ispitivanje u kojemu jedan laboratorij,
u razli­čitim uvjetima i u opravdano dugim vremenskim intervalima, primjenjuje
jednu metodu za analiziranje istih ili različitih ispitnih uzoraka.

– *Istinitost:* podudarnosti između srednje
vrijednosti dobivene iz velikog niza rezultata ispitivanja i prihvaćene
referentne vrijednosti. Istinitost se obično izražava kao mjerno odstupanje
(engl. bias).

– *Jedinice:* one jedinice koje su opisane u
normi HRN ISO 31.

– *Ko-kromatografija:* podrazumijeva postupak u
kojemu se ekstrakt uzorka, prije kromatografije, dijeli na dva dijela. Jedan
dio se podvrgava kromatografiji kao takav. Drugi dio se miješa s baždarnim
standardom analita koji se ispituje i potom na isti način kromatografira.
Količina dodanog standardnog analita mora biti približna procijenjenoj količini
analita u ekstraktu. Cilj metode je poboljšati identifikaciju analita pri
uporabi kromatografske metode, pogotovo kada nije dostupan prikladni unutarnji
standard.

– *Kriteriji učinkovitosti:* zahtjevi u pogledu
učinkovitosti prema kojima se može ocijeniti da je analitička metoda primjerena
svrsi i da daje pouzdane rezultate.

– *Kvalitativna metoda*: analitička metoda kojom
se tvar identificira na temelju njenih kemijskih, bioloških i fizikalnih
svojstava.

– *Kvantitativna metoda:* analitička metoda
kojom se odre­đuje količina ili maseni udio neke tvari tako da se može izraziti
kao brojčana vrijednost u odgovarajućim jedinicama.

– *Laboratorijski
uzorak:* je uzorak koji je pripremljen za slanje u laboratorij u svrhu
pregleda ili analiziranja.

– *Međulaboratorijsko
ispitivanje:* organiziranje, provedba i ocjena ispitivanja identičnog uzorka
u dva ili više laboratorija prema unaprijed određenim uvjetima, kako bi se
provjerili izvedbeni uvjeti ispitivanja. Ovisno o svrsi, ispitivanje se može
svrstati kao poredbeno ispitivanje ili ispitivanje osposobljenosti.

– *Mjerno
odstupanje* *(engl. bias):* razlika između očekivanog rezultata
ispitivanja i prihvaćene referentne vrijednosti.

– *Najmanja zahtjevana granica učinkovitosti
izvedbe metode* (MRPL): najmanji udio analita u uzorku, koji se mora
dokazati i potvrditi. Služi za usklađivanje izvođenja analitičkih metoda za one
tvari koje ne smiju biti prisutne.

– *Obnovljivost (reproducibilnost):* preciznost
u uvjetima obnovljivosti.

– *Obnovljivost unutar laboratorija
(reproducibilnost):* preciznost dobivena u istom laboratoriju pod propisanim
(unaprijed određenim) uvjetima (npr. metoda, materijal koji se ispituje,
analitičari, okoliš) u opravdanim vremenskim razmacima.

– *Obogaćeni uzorak* je uzorak kojemu je dodana
poznata količina analita koji treba dokazati.

– *Orijentacijska metoda (engl. screening):*
metoda koja se primjenjuje kako bi se dokazala prisutnost neke tvari ili vrste
tvari na razini značajnosti. Ove metode odlikuje sposobnost brze obrade velikog
broja uzoraka i koriste se za pregledavanje velikog broja uzoraka s ciljem
otkrivanja mogućih pozitivnih rezultata.

– *Poduzorak za analizu:* količina materijala
uzetog od uzorka za ispitivanje koji se ispituje ili promatra.

– *Ponovljivost:* preciznost u uvjetima
ponovljivosti.

– *Poredbeno ispitivanje:* analiziranje istog
uzorka istom metodom kako bi se provjerile izvedbene osobitosti metode uklju­čujući
ispitivanje slučajne mjerne pogreške i mjerno odstupanje laboratorija.

– *Potvrdna metoda:* metoda kojom se dobiju
potpuni ili dodatni podaci na temelju kojih je određenu tvar moguće jedno­značno
identificirati i po potrebi kvantificirati, na razini zna­čajnosti.

– *Potvrđeni referentni materijal* (CRM):
materijal kojemu je utvrđen određeni udio analita.

– *Preciznost:* stupanj podudarnosti između rezultata
nezavisnih ispitivanja dobivenih pod unaprijed određenim propisanim uvjetima.
Preciznost se obično izražava kao nepreciznost i računa se kao standardna
devijacija rezultata ispitivanja. Što je manja preciznost, veća je standardna
devijacija.

– *Razina značajnosti:* koncentracija tvari ili
analita u uzorku koja je sukladna s važećim propisima.

– *Referentni materijal:* materijal čija su
jedno ili više svojstava potvrđena vrednovanom metodom, tako da se može
koristiti za baždarenje instrumenta ili potvrdu mjerne metode.

– *Robusnost:* podložnost analitičke metode na
promjene uvjeta ispitivanja u odnosu na različitost vrste uzoraka, analita,
uvjete pohrane, uvjeta okoliša i/ili uvjeta pripreme uzoraka pod kojima se metoda
može primjenjivati onakva kakva jest ili uz utvrđene manje izmjene. Na sve
uvjete ispitivanja koji bi u praksi mogli biti podložni promjenama, a mogu
utjecati na rezultat analize (npr. stabilnost reagensa, sastav uzorka, pH,
temperatura), treba ukazati.

– *Slijepa
proba s reagensom:* podrazumijeva primjenu cjelokupnog analitičkog postupka
bez ispitnog dijela uzorka ili uz jednaku količinu odgovarajućeg otapala
umjesto uzorka.

– *Slijepa
proba s uzorkom:* primjena cijelog analitičkog postupka na poduzorak za
analizu koji je uzet iz uzorka u kojemu nema analita.

–*Specifičnost:* svojstvo metode da se razlikuje analit koji se mjeri od
drugih tvari. Ova značajka ovisi prije svega o opisanoj tehnici mjerenja, ali
može varirati ovisno o vrsti spoja ili matriksu.

– *Sposobnost
dokazivanja* (CCb): najmanji udio tvari koji je moguće metodom dokazati, identificirati
i/ili kvantificirati u uzorku, uz vjerojatnost ß pogreške. U slučaju tvari za
koje nije utvrđena dopuštena količina, sposobnost dokazivanja je najniža koncentracija
koja se može dokazati sa statističkom sigurnošću od 1 – b u kontaminiranom uzorku. U
slučaju tvari za koje je utvrđena dopuštena količina, sposobnost dokazivanja je
koncentracija koja se može dokazati, sa statističkom sigurnošću od 1 – ß, uz
ustanovljenu dopuštenu koncentraciju.

– *Standardni
analit:* analit poznatog i potvrđenog sadržaja i čistoće koji se u analizi
koristi kao referentni.

– *Standardno
dodavanje:* postupak pri kojemu se uzorak za ispitivanje dijeli na dva (ili
više) ispitnih poduzoraka za analizu. Jedan poduzorak se analizira kao takav, a
drugome se prije analize dodaje poznata količina standardnog analita. Količina
standardnog baždarnog analita koja se dodaje mora biti od dva do pet puta veća
od procijenjene količine analita u uzorku. Cilj postupka je odrediti udio
analita u uzorku, uzimajući u obzir iskorištenje *(engl. recovery)*
analitičkog postupka.

– *Točnost:* stupanj podudarnosti između
rezultata ispitivanja i prihvaćene referentne vrijednosti. Utvrđuje se
utvrđivanjem istinitosti i preciznosti.

– *Tvar:* tvar posebnog ili određenog kemijskog
sastava i njeni metaboliti.

– *Učinkovitost:* funkcionalna kvaliteta koja se
može pripisati analitičkoj metodi. To mogu biti: specifičnost, točnost, istinitost,
preciznost, ponovljivost, obnovljivost, iskorištenje (engl. recovery),
sposobnost dokazivanja i robusnost.

– *Unutarnji standard* (IS): podrazumijeva tvar
koja nije sadržana u uzorku, čija su fizikalno-kemijska svojstva što je moguće
sličnija svojstvima analita koji se treba identificirati i koji se dodaje
svakom uzorku i svakom baždarnom standardu.

– *Uvjeti obnovljivosti:* uvjeti pod kojima
različiti analitičari, u različitim laboratorijima koristeći različitu opremu,
dobiju rezultate ispitivanja primjenjujući istu metodu na istovjetnim
ispitivanim uzorcima.

– *Uvjeti
ponovljivosti:* uvjeti pod kojima isti analitičar, ko­risteći istu opremu u
istom laboratoriju, dobije nezavisne rezultate ispitivanja primjenjujući istu
metodu na istovjetnim ispitivanim uzorcima.

– *Uzorak
za ispitivanje:* uzorak pripremljen iz laboratorijskog uzorka od kojega će
se uzimati poduzorci za analizu.

– *Vrednovanje
metode (validacija):* potvrđivanje metode ispi­tivanjem i pribavljanjem
stvarnih dokaza, da su ispunjeni posebni zahtjevi u pogledu specifične
primjene.

Analitičke
metode

Članak
3.

Službeni
uzorci uzimaju se sukladno važećem propisu o kontroli rezidua i analiziraju se
metodama koje:

(a) su
navedene u uputama, po mogućnosti u skladu s normom HRN ISO 78-2;

(b) su
u skladu s Prilogom 1. ovog Pravilnika;

(c) su
validirane sukladno postupcima opisanima u Prilogu 2. ovog Pravilnika;

(d) su
u skladu s najmanjim zahtijevanim granicama učinko­vitosti izvedbe metode
(MRPL).

Kontrola
kvalitete

Članak
4.

Kvaliteta
rezultata analize uzoraka osigurava se praćenjem ispitivanja i/ili rezultata
baždarenja, u skladu s propisanim u normi HRN EN ISO/IEC 17025, poglavlju 5.9.

Tumačenje
rezultata

Članak
5.

1)
Rezultat analize smatra se pozitivnim ako je veći od granične koncentracije (količine)
analita (CCa) po potvrdnoj metodi.

2) Ako
je za neku tvar utvrđena dopuštena količina, granična koncentracija (količina)
analita (CCa) je koncentracija iznad koje je moguće, sa statističkom sigurnošću
od 1 – a, odlučiti da je dopuštena količina uistinu premašena.

3) Ako za neku tvar nije utvrđena dopuštena količina,
granična koncentracija (količina) analita (CCa) je najniža razina koncentracije
pri kojoj se metodom može razabrati, sa statis­tičkom sigurnošću od 1 – a da je ispitivani analit
prisutan.

4) Za tvari koje su navedene u grupi A u prilogu
Pravilnika o mjerama za monitoring određenih tvari i njihovih rezidua u živim
životinjama i proizvodima životinjskog podrijetla pogreška može biti 1% ili
niža. Za sve ostale tvari pogreška može biti 5% ili niža.

Članak 6.

Prilozi broj: 1. Kriteriji učinkovitosti, te drugi
zahtjevi i postupci za analitičke metode

2. Vrednovanje metode (validacija)

3. Najmanje zahtijevane granice učinkovitosti izvedbe
metode

4. Kratice

tiskani su u prilogu ovog Pravilnika i čine njegov
sastavni dio.

Članak 7.

Ovaj Pravilnik stupa na snagu osmoga dana od dana
objave u »Narodnim novinama«.

Klasa: 322-1/04-1/663
Urbroj: 525-06-04-01
Zagreb, 27. prosinca 2004.

Ministar
**Petar** **Čobankovi****ć**, v. r.

PRILOG I.

KRITERIJI
UČINKOVITOSTI, TE DRUGI ZAHTJEVI I POSTUPCI ZA ANALITIČKE METODE

1. Kriteriji uČinkovitosti i drugi zahtjevi za
analitiČke metode

Analitičke
metode ili kombinacije metoda koje su drugačije od dolje opisanih mogu se
koristiti kao orijentacijske ili potvrdne metode ako se može dokazati da
ispunjavaju zahtjeve utvrđene ovim Pravilnikom.

1.1. OPĆI ZAHTJEVI

1.1.1. Postupci s uzorcima

Uzorci
se uzimaju u skladu s važećim pravilnikom o kontroli rezidua. Uzorci se
dobivaju, obrađuju i s njima se postupa na način koji pruža najveću mogućnost
dokazivanja tvari. Postupci s uzorcima moraju spriječiti mogućnost slučajne
kontaminacije ili gubitka analita.

1.1.2. Izvođenje ispitivanja

1.1.2.1.
Iskorištenje

Tijekom
analize uzoraka iskorištenje se određuje za svaku seriju uzoraka. Ako je iskorištenje
unutar granica, tada se može koristiti stalni faktor korekcije. U protivnom,
koristi se faktor iskorištenja koji je dobiven za određenu seriju uzoraka, osim
ako se ne primjenjuje specifični faktor iskorištenja analita u uzorku, pri čemu
se za kvantitativno određivanje analita u uzorku primjenjuje postupak
standardnog dodavanja (vidi 2.5) ili unutarnji standard.

1.1.2.2. Specifičnost

Metodom
se mora u eksperimentalnim uvjetima razlikovati analit od drugih tvari. Mora se
navesti procjena te mogućnosti. Pri primjeni metode moraju se izbjegavati sve
predvidljive interferencije. Od najveće je važnosti ispitati interferencije
koje bi mogle uzrokovati svi sastojci matriksa.

1.2. ORIJENTACIJSKE METODE (engl. SCREENING METHODS)

U
skladu s važećim pravilnikom o kontroli rezidua, kao orijentacijske metode
koriste se samo oni analitički postupci za koje se može pokazati na
dokumentirani sljedivi način da su vrednovani i da im je na razini
koncentracije od interesa, postotak lažno negativnih rezultata manji od 5% (ß
pogreška). U slučaju sumnje na pozitivni rezultat, takav se rezultat mora
dokazati potvrdnom metodom.

1.3. POTVRDNE METODE ZA ORGANSKE REZIDUE
I KONTAMINANTE

Potvrdne
metode za organske rezidue i kontaminante daju informacije o kemijskoj
strukturi analita. Dakle, metode koje se temelje isključivo na kromatografskoj
analizi, bez primjene spektrometrijskog dokazivanja, nisu same po sebi
prikladne za primjenu kao potvrdne metode. Međutim, ako jednoj tehnici
nedostaje specifičnost, željena se specifičnost postiže analitičkim postupcima
koji se sastoje od odgovarajućih kombinacija postupaka pročišćavanja,
kromatografskog razdvajanja ili razdvajanja i spektrometrije.

Sljedeće metode, odnosno kombinacije metoda, smatraju
se prikladnima za identifikaciju organskih rezidua ili kontaminanata za
navedene skupine tvari:

if !supportEmptyParas endif

*Tablica
1.* Prikladne potvrdne metode za
organske rezidue i kontaminante

**if !supportEmptyParas endif**

| Mjerni postupak | Tvari: Dodatak I  Pravilnika o mjerama za monitoring tvari i njihovih rezidua u živim životinjama i proizvodima životinjskog podrijetla | Zahtjevi |
| --- | --- | --- |
| LC ili GC uz dokazivanje spektrometrijom masa | skupine A i B | Jedino ako slijede nakon vezanog (on line) ili odvojenog (off line) kromatografskog razdvajanja  if !supportEmptyParas endif  Jedino ako se primjenjuju postupci snimanja cjelokupnog spektra (engl. full scan) ili se koriste barem 3 (grupa B) ili 4 (grupa A) identifikacijske točke za postupak koje ne bilježe cijeli maseni spektar |
| LC ili GC uz dokazivanje IR spektrometrijskom  detekcijom | skupine A i B | Moraju biti zadovoljeni posebni zahtjevi za apsorpciju **(**spektrometriju**)** u IR spektrometriji |
| LC-full-scan DAD | skupina B | Moraju biti zadovoljeni posebni zahtjevi za UV apsorcijsku spektrometriju |
| LC- fluorescencija | skupina B | Jedino za molekule koje pokazuju prirodnu fluorescenciju i molekule koje pokazuju fluorescenciju nakon pretvorbe ili derivatizacije |
| 2-D TLC – full scan UV/VIS | skupina B | Dvodimenzionalna HPTLC i ko-kromatografija su obvezni |
| GC-elektron-apsorpcijska detekcija | skupina B | Jedino ako se primjenjuju dvije kolone različitog polariteta |
| LC-imunogram | skupina B | Jedino ako se primjenjuju najmanje dva različita kromatografska sustava ili druga, nezavisna metoda dokazivanja |
| LC-UV/VIS pojedinačna valna duljina | skupina B | Jedino ako se primjenjuju najmanje dva različita kromatografska sustava ili druga, nezavisna metoda dokazivanja |

if !supportEmptyParas endif

1.3.1.
Zajednički kriteriji izvedbe i zahtjevi

Potvrdne
metode moraju osigurati podatke o kemijskoj strukturi analita. Ako više spojeva
daje isti rezultat, metoda ne može razlikovati te spojeve. Metode koje se
temelje jedino na kromatografskoj analizi, bez primjene spektrometrijskog
dokazivanja, nisu same po sebi prikladne za primjenu kao potvrdne metode.

Ako se
u metodi primjenjuje odgovarajući unutarnji standard, on se dodaje poduzorku za
analizu na početku postupka ekstrakcije. Ovisno o raspoloživosti,
upotrebljavaju se bilo stabilni oblici analita obilježeni izotopom, koji su
posebice prikladni za dokazivanje spektrometrijom masa, bilo spojevi koji su po
svojoj strukturi slični analitu.

Ako se
ne može upotrijebiti odgovarajući unutarnji standard, identifikacija analita
potvrđuje se ko-kromatografijom. U tom slučaju, dobiva se samo jedan pik, pri
čemu visina ili površina pika odgovara količini dodanog analita. Za plinsku
kromatografiju (GC) ili tekućinsku kromatografiju (LC), širina pika na polovici
visine mora biti između 90 – 110% raspona izvorne širine pika, a vremena
zadržavanja moraju biti jednaka uz toleranciju od 5%.

Za
metode tankoslojne kromatografije (TLC) povećava se samo mrlja za koju se
pretpostavlja da je analit. Ne smije se pojaviti nova mrlja i izgled se ne
smije promijeniti.

Referentni
ili obogaćeni materijal koji sadrži poznate koli­čine analita na ili u blizini
dopuštene granice ili granične koncentracije (pozitivni kontrolni uzorak) kao i
negativni kontrolni materijali i slijepe probe s reagensom, trebali bi biti
podvrgnuti cijelom postupku istodobno sa svakom serijom analiziranih uzoraka za
ispitivanje. Redoslijed ubacivanja ekstrakta u analitički instrument je
sljedeći: slijepa proba s reagensom, negativni kontrolni uzorak, uzorak ili
uzorci koji se potvrđuju, negativni kontrolni uzorak i na kraju pozitivni
kontrolni uzorak. Svaka izmjena ovog redoslijeda mora se opravdati.

1.3.2.
Dodatni kriteriji izvedbe i drugi zahtjevi za kvantitativne metode analize

1.3.2.1.
Istinitost kvantitativnih metoda

U
slučaju višekratnih analiza potvrdnog referentnog materijala, odstupanje
prosječnog masenog udjela, koji je eksperimentalno određen i ispravljen
iskorištenjem, od potvrđene vrijednosti mora biti unutar sljedećih granica:

if !supportEmptyParas endif

*Tablica 2.* Najmanja (izraženo kao odstupanje) istinitost kvantitativne metode

**if !supportEmptyParas endif**

|  |  |
| --- | --- |
| Udio mase | Granice |
| <  1 μg/kg | - 50% do + 20% |
| > 1 μg/kg do 10 μg/kg | - 30% do +10% |
| > 10 μg/kg | - 20% do + 10% |

if !supportEmptyParas endif

Ako
potvrđeni referentni materijali (CRM) nisu dostupni, istinitost mjerenja se
može ocijeniti analizom slijepih uzoraka u koje je dodana poznata količina
analita. Podaci korigirani prosječnim iskorištenjem prihvatljivi su jedino ako
su u granicama koje su navedene u Tablici 2.

1.3.2.2.
Preciznost kvantitativne metode

Međulaboratorijski
koeficijent varijacije (CV) za opetovane analize referentnog ili obogaćenog
materijala, u uvjetima obnov­ljivosti, ne smije biti veći od razine izračunate
Horwitzovom jednadžbom. Jednadžba glasi:

CV = 2(1-0,5 log C)

gdje je
C maseni udio izražena kao potencija (eksponent) s bazom 10 (npr. 1 mg/g =10-3). Primjeri su prikazani u
tablici 3.

if !supportEmptyParas endif

*Tablica* *3.* Primjeri koeficijenata varijacije
(CV) obnovljivosti
za kvantitativne
metode kod
određenih masenih udjela analita

**if !supportEmptyParas endif**

|  |  |
| --- | --- |
| Udio Mase | CV obnovljivosti (%) |
| 1 μg/kg | (\*) |
| 10 μg/kg | (\*) |
| 100 μg/kg | 23 |
| 1000 μg/kg | 16 |
| (\*) Za masene  udjele niže od 100 μ/kg Horwitzova jednadžba daje neprihvatljivo visoke vrijednosti. Stoga CV za koncentracije niže od 100 μg/kg moraju biti što je moguće manji. | |

if !supportEmptyParas endif

if !supportEmptyParas endif

Za analize
izvedene pod uvjetima ponovljivosti, unutarlaboratorijski CV (koeficijent
varijacije) obično bi trebao iznositi između jedne polovine i dvije trećine
gornjih vrijednosti navedenih u tablici 3. Za analize izvedene pod
unutarlaboratorijskim uvjetima obnovljivosti unutarlaboratorijski CV ne smije
biti veći od CV obnovljivosti.

Kod
tvari za koje je utvrđena dopuštena količina, metoda mora postići
unutarlaboratorijsku obnovljivost koja nije veća od odgovarajućeg CV
obnovljivosti kod 50 % koncentracije x dopuštena količina.

1.3.3.
Kriteriji učinkovitosti i drugi zahtjevi za dokazivanje spektrometrijom masa

Metode
spektrometrije masa mogu se uzeti u obzir kao potvrdne metode jedino ako
slijede nakon što je provedeno vezano (on-line) ili odvojeno (off-line) kromatografsko
razdvajanje.

1.3.3.1.
Kromatografsko razdvajanje

Za
GC-MS postupke, separacija plinskom kromatografijom izvodi se primjenom
kapilarnih kolona. Za LC-MS postupke, kromatografsko razdvajanje izvodi se
primjenom odgovarajućih LC kolona. U svakom slučaju, najmanje prihvatljivo
vrijeme zadržavanja analita koji se ispituje mora biti jednako dvostrukom
vremenu zadržavanja koje vrijedi za prazni volumen kolone. Vrijeme zadržavanja
(relativno vrijeme zadržavanja) analita u poduzorku za analizu mora odgovarati
vremenu zadržavanja baždarnog standarda unutar određenog intervala vremena
zadržavanja. Interval vremena zadržavanja mora biti razmjeran sposobnosti
razlučivanja kromatografskog sustava. Omjer između kromatografskog vremena
zadržavanja analita i vremena zadržavanja unutarnjeg standarda, tj. relativno
vrijeme zadržavanja analita, mora odgovarati vremenu zadržavanja baždarne
otopine uz toleranciju od ± 0,5 % za GC i ± 2,5 % za LC.

1.3.3.2.
Dokazivanje spektrometrijom masa

Dokazivanje
spektrometrijom masa mora se provoditi uporabom MS tehnika, kao što je snimanje
cjelokupnih spektara masa (full scan) ili praćenje odabranih iona (SIM), kao i
uporabom MS-MSn tehnika,
kao što je praćenje odabranih reakcija (SRM) ili drugih prikladnih MS ili MS-MSn tehnika u kombinaciji s odgo­varajućim
načinima ionizacije. Kod spektrometrije masa s visokim razlučivanjem (HRMS),
razlučivost mora općenito biti veća od 10000 za cijelo područje snimanja masa
na 10% raz­dvojenosti doline pika.

Snimanje
cjelokupnih spektara (full scan): kad se određi­vanje spektrometrijom masa
provodi snimanjem cjelokupnih spektara, moraju obavezno biti prisutni svi
izmjereni dijag­nostički ioni s relativnim intenzitetom većim od 10% u
referentnom spektru baždarnog standarda (molekularni ion, karak­te­ristične
izvedenice molekularnog iona, karakteristični fragmenti i izotopni ioni).

Praćenje
odabranih iona (SIM): kad se određivanje spektrometrijom masa provodi
fragmentografijom, molekularni ion bi trebao biti jedan od odabranih
dijagnostičkih iona (molekularni ion, karakteristične izvedenice molekularnog
iona, karakteristični fragmenti i svi njihovi izotopni ioni). Odabrani
dijagnostički ioni ne bi smjeli potjecati isključivo od istog dijela molekule.
Omjer signal-šum za svaki dijagnostički ion treba biti (jednak ili veći) ³  3:1.

Snimanje
cjelokupnih spektara (full scan) i praćenje odabranih iona (SIM): relativna
zastupljenost dokazanih iona, izražena kao postotak prema najzastupljenijem
ionu ili najzastupljenijem prijelaznom ionu, mora odgovarati zastupljenosti
baždarnog standarda, bilo iz otopina baždarnog standarda ili obogaćenih
uzoraka, na usporedivim koncentracijama, mjerenim pod istim uvjetima i uz
sljedeće tolerancije:

if !supportEmptyParas endif

*Tablica 4*. Najviše dopuštene tolerancije za relativnu
zastupljenost  iona kod raznih
tehnika  spektrometrije masa

**if !supportEmptyParas endif**

|  |  |  |
| --- | --- | --- |
| Relativna zastupljenost  (% baznog pika) | EI-GC-MS  (relativni) | CI-GC-MS, GC-MSn  LC-MS, LC-MSn  (relativni) |
| > 50 %  > 20 % do 50 %  > 10 % do 20 %  < 10 % | + 10 %  + 15 %  + 20 %  + 50 % | + 20 %  + 25 %  + 30 %  + 50 % |

if !supportEmptyParas endif

if !supportEmptyParas endif

Tumačenje
podataka dobivenih spektrometrijom masa: relativna zastupljenost dijagnostičkih
iona i/ili ionskih parova prekursor/produkt moraju se identificirati
uspoređivanjem spektara ili integriranjem signala pojedinačnih tragova masa. Kad
god se primjenjuje korekcija osnovnog šuma (engl. background), ona se mora
primijeniti podjednako na cijelu seriju (vidi 1.3.1., stavak 4.) i mora biti
jasno naznačena.

 Snimanje cjelokupnih spektara (full scan):
ako se snimanje cjelokupnih spektara bilježi u jednostrukoj spektrometriji
masa, najmanje četiri iona moraju biti prisutni s relativnom zastuplje­nošću
jednakom ili većom od 10 % u odnosu na bazni pik. Molekularni ion se uključuje
ako je prisutan u referentnom spektru s intenzitetom većim ili jednakim od 10%.
Najmanje četiri iona moraju biti unutar najviših dopuštenih tolerancija za
relativnu zastupljenost iona (Tablica 5.) Pretraživanje baza podataka uz pomoć
računala može se primijeniti.

U tom
slučaju, rezultat usporedbe podataka o spektru masa u ispitnom uzorku s onima
iz baždarne otopine mora biti veći od kritičnog faktora podudarnosti. Taj
faktor se određuje tijekom postupka vrednovanja za svaki analit na temelju
spektara za koje su ispunjeni dolje opisani uvjeti.

Moraju
se provjeriti eventualne promjene spektara uzrokovane matriksom i/ili
osobitostima detektora.

Praćenje
odabranih iona (SIM): ako se fragmenti mase mjere drugim tehnikama osim
snimanja cjelokupnih spektara, za tuma­čenje podataka primjenjuje se sustav
identifikacijskih točaka. Za potvrdu tvari koje su navedene u grupi A spojeva
potrebne su najmanje 4 identifikacijske točke. Za potvrdu tvari koje su
navedene u grupi B spojeva potrebne su najmanje 3 identifikacijske točke.
Tablica 5 pokazuje broj identifikacijskih točaka koje pripadaju svakoj
pojedinoj temeljnoj tehnici spektrometrije masa. Da bi identifikacijska točka
potrebna za potvrdu bila kvalificirana i ukupni broj identifikacijskih točaka
mora se izračunati:

(a)
omjer najmanje jednog iona,

(b) svi
odgovarajući izmjereni omjeri iona moraju zadovoljavati navedene zahtjeve,

(c)
mogu se kombinirati najviše tri odvojene tehnike kako bi se postigao najmanji
broj identifikacijskih točaka.

*if !supportEmptyParas endif*

*Tablica 5.* Odnos između različitih vrsta  fragmenata masa i  postignutih identifikacijskih točaka

|  |  |
| --- | --- |
| Tehnika spektrometrije masa | Identifikacijske točke postignute po ionu |
| Spektrometrija masa niskog razlučivanja  MR-MSn prethodni ion (prekursor)  LR- MSn prijelazni  produkti  HRMS  HR- MSn prethodni ion (prekursor)  HR- MSn prijelazni produkti | 1,0  1,0  1,5  2,0  2,0  2,5 |

*if !supportEmptyParas endif*

*Napomene:*

(1)
Svaki ion može se brojiti samo jednom.

(2)
GC-MS uz ionizaciju snopom elektrona smatra se različitom od tehnike GC-MS s
kemijskom ionizacijom.

(3) Da bi
se povećao broj identifikacijskih točaka, mogu se koristiti različiti analiti
jedino ako derivati koriste različite kemijske reakcije.

(4) Za
tvari iz grupe A ako se tijekom analitičkog postupka primjenjuje jedna od ovih
tehnika:

– HPLC
u kombinaciji sa spektrometrijom uz dokazivanje nizom dioda (engl. diode array
detection) uz snimanje cjelokupnog spektra;

– HPLC
u kombinaciji s fluorescencijskim dokazivanjem;

– HPLC
u kombinaciji s imunogramom; dvodimenzionalna tankoslojna kromatografija (TLC)
u kombinaciji sa spektrometrijskom detekcijom.

Ove
tehnike mogu pridonijeti najviše s jednom identifikacijskom točkom, uz uvjet da
su ispunjeni svi zahtjevi koji se primjenjuju za te tehnike.

(5)
Produkti nastali tijekom prijelaza uključuju potomke prve generacije i potomke
druge generacije.

**if !supportEmptyParas endif**

*Tablica 6.* Primjeri broja identifikacijskih točaka koje
se dobivaju za različite tehnike i njihove kombinacije (n=cijeli broj)

**if !supportEmptyParas endif**

| Tehnika/tehnike | Broj iona | Identifikacijske točke |
| --- | --- | --- |
| GC-MS (EI ili CI) | N | n |
| GC-MS (EI i CI) | 2 (EI) + 2 (CI) | 4 |
| GC-MS (EI ili CI) 2 derivata | 2 (derivat A) + 2 (derivat B) | 4 |
| LC-MS | N | n |
| GC-MS-MS | 1 prethodni ion  i 2 potomka prve generacije | 4 |
| LC-MS-MS | 1 prethodni ion  i 2 potomka prve generacije | 4 |
| GC-MS-MS | 2 prethodna iona, svaki s jednim potomkom prve generacije | 5 |
| LC-MS-MS | 2 prethodna iona, svaki s jednim potomkom prve generacije | 5 |
| lc-ms-ms-ms | 1 prethodni ion, 1 potomak prve generacije i 2 potomka druge generacije | 5,5 |
| HRMS | N | 2 n |
| GC-MS i LC-MS | 2 + 2 | 4 |
| GC-MS i HRMS | 2 + 1 | 4 |

if !supportEmptyParas endif

if !supportEmptyParas endif

1.3.4.
Izvedbeni kriteriji i drugi zahtjevi za kromatografiju u kombinaciji s
dokazivanjem u infracrvenom području

Odgovarajući
pikovi: odgovarajući pikovi su maksimumi apsorpcije u infracrvenom spektru
baždarnog standarda ako ispunjavaju sljedeće zahtjeve:

1.3.4.1.
Infracrveno dokazivanje

Apsorpcijski
maksimum: mora biti u rasponu valnog broja 4000-500 cm-1.

Intenzitet apsorpcije ne smije biti manji od:

(a) specifične molarne apsorbancije od 40 u odnosu na
baznu liniju pika, ili od

(b) relativne apsorbancije od 12,5 % od apsorbancije
najintenzivnijeg pika u području 4000-500 cm-1

ako su oba mjerena u odnosu na nultu apsorbanciju, i
5 % od apsorbancije najintenzivnijeg vrha u području 4000-500 cm-1 ako su oba mjerena u odnosu
na baznu liniju pika.

Napomena: Iako bi se s teoretske točke gledišta mogla
dati prednost odgovarajućim pikovima određenim prema točki (a), u praksi je
lakše odrediti pikove prema točki (b).

Određuje se broj pikova u infracrvenom spektru
analita čije frekvencije odgovaraju odgovarajućem piku u spektru baždarnog
standarda, uz toleranciju od ± 1 cm-1.

1.3.4.2.
Tumačenje podataka o infracrvenom spektru

Apsorpcija
mora biti prisutna u svim područjima spektra analita koja se slažu s
odgovarajućim pikom u referentnom spektru baždarnog standarda. Potrebno je
najmanje šest odgovarajućih pikova u infracrvenom spektru baždarnog standarda.
Ako ima manje od šest odgovarajućih pikova, razmatrani spektar se ne može
koristiti kao referentni spektar. Rezultat ispitivanja sličnosti odnosno
postotak odgovarajućih pikova pronađenih u infracrvenom spektru analita, mora
biti najmanje 50. Ako za odgovarajući pik ne postoji točno poklapanje,
odgovarajuće područje spektra analita mora odgovarati prisutnosti pika za
usporedbu. Postupak se može primijeniti jedino na pikove apsorpcije u spektru
uzorka čiji je intenzitet najmanje trostruk u odnosu na šum između jednog i
drugog vrha.

1.3.5.
Izvedbeni kriteriji i drugi zahtjevi za određivanje analita uporabom LC uz
druge tehnike dokazivanja

1.3.5.1.
Kromatografsko razdvajanje

Uvijek
treba koristiti unutarnji standard ako je u tu svrhu dostupna primjerena tvar.
Prednost u primjeni imaju srodni spojevi s vremenom zadržavanja blizu analita.
Vrijeme zadržavanja analita mora biti u dopuštenim granicama prema
odgovarajućem baždarnom standardu uz iste uvjete ispitivanja. Najmanje
prihvatljivo vrijeme zadržavanja za analit mora biti dvostruko veće od vremena
zadržavanja koje odgovara praznom volumenu kolone. Omjer između vremena
zadržavanja analita i vremena zadržavanja unutarnjeg standarda, tj. relativno
vrijeme zadržavanja analita, mora biti jednako vremenu zadržavanja baždarnog
standarda u odgo­vara­jućem matriksu, uz toleranciju od ± 2,5 %.

1.3.5.2.
UV/VIS dokazivanje uz snimanje spektra u cijelom području

Izvedbeni
zahtjevi za metode tekućinske kromatografije moraju u potpunosti biti
ispunjeni.

Apsorpcijski
maksimumi u spektru analita moraju biti na istim valnim duljinama kao i oni
baždarnog standarda uz toleranciju koja ovisi o razlučivosti sustava
dokazivanja. Za dokazivanje pomoću niza dioda, tolerancija je obično unutar ± 2
nm. Za one dijelove dvaju spektara čija je relativna apsorbancija jednaka ili
veća od 10 %, spektar analita iznad 220 nm ne smije se vidljivo razlikovati od
spektra baždarnog standarda. Ovaj je zahtjev zadovoljen kada su, prvo, prisutni
isti maksimumi i, drugo, kada razlika između dva spektra ni u jednoj od
promatranih točaka nije veća od 10 % od absorbancije baždarnog standarda. U
slučaju računalnog pretraživanja i uspoređivanja spektara ispitnih uzoraka s
onima iz baždarne otopine, rezultat usporedbe mora biti veći od kritičnog
faktora podudarnosti. Taj faktor se određuje tijekom postupka vrednovanja za
svaki analit, na temelju spektara za koje su ispunjeni gore opisani uvjeti.
Moraju se provjeriti eventualne promjene spektara uzrokovane matriksom i/ili
osobitostima detektora.

1.3.5.3.
Izvedbeni zahtjevi za fluorometrijsko dokazivanje

Izvedbeni
zahtjevi za metode tekućinske kromatografije u potpunosti moraju biti
ispunjeni.

Ovo se odnosi na molekule koje pokazuju prirodnu
fluorescenciju i molekule koje pokazuju fluorescenciju nakon pretvorbe ili
derivatizacije. Valne duljine podražaja i emisije, u kombinaciji s
kromatografskim uvjetima, moraju se odabrati tako da se pojava
interferencijskih komponenata u ekstraktima slijepog uzorka svede na najmanju
moguću mjeru.

Najbliži maksimum pika u kromatogramu mora biti
odvojen od utvrđenog pika analita za najmanje jednu punu širinu pika izmjerenu
na 10 % od maksimalne visine pika analita.

1.3.5.4.
Izvedbeni zahtjevi za određivanje analita pomoću LC imunograma

LC
imunogram se ne može sam za sebe koristiti kao potvrdna metoda.

Odgovarajući kriteriji za metode tekućinske
kromatografije moraju u potpunosti biti ispunjeni.

Unaprijed utvrđeni parametri kontrole kvalitete, npr.
nespe­cifično vezivanje, relativno vezivanje kontrolnih uzoraka, vrijednost
apsorbancije slijepog uzorka, moraju biti unutar granica dobivenih tijekom
vrednovanja probe.

Imunogram se mora sastojati od najmanje pet frakcija.

Svaka frakcija mora biti manja od polovice širine
pika.

Frakcija s najvećim udjelom analita mora biti ista za
uzorak koji se ispituje, za pozitivni kontrolni uzorak i standard.

1.3.5.5.
Određivanje analita tekućinskom kromatografijom (LC) uz UV/VIS dokazivanje
(jedna valna duljina)

Tekućinska
kromatografija (LC) uz dokazivanje u UV/VIS području (jedna valna duljina) ne
može se sama za sebe koristiti kao potvrdna metoda.

Najbliži
maksimum pika u kromatogramu mora biti odvojen od utvrđenog pika analita za
najmanje jednu punu širinu pika izmjerenu na 10 % od maksimalne visine pika
analita.

1.3.6.
Izvedbeni kriteriji i drugi zahtjevi za određivanje analita uporabom 2-D TLC uz
spektrometrijsko UV/VIS dokazivanje sa snimanjem cijelog spektra

Dvodimenzionalna
tankoslojna kromatografija visoke djelo­tvornosti (HPTLC) i ko-kromatografija
su obavezni.

Rf vrijednosti analita moraju se podudarati s Rf
vrijednostima standarda uz toleranciju od ± 5%.

Izgled analita ne smije se razlikovati od izgleda
standarda.

Kod mrlja iste boje, središte najbliže mrlje mora
biti odvo­jeno od središta mrlje analita za najmanje polovicu zbroja promjera
mrlja.

Spektar analita ne smije se vizualno razlikovati od
spektra standarda, kao što je opisano za UV/VIS detekciju uz snimanje cijelog
spektra.

U slučaju računalnog pretraživanja baza podataka i
uspore­đivanja, usporedba podataka o spektru u uzorku za ispitivanje s onima
baždarne otopine mora biti veća od kritičnog faktora podudarnosti. Taj faktor
se određuje tijekom postupka validacije za svaki analit na temelju spektara za
koje su ispunjeni gore opisani uvjeti. Mora se provjeriti varijabilnost spektara
uzrokovana matricom i funkcioniranje detektora.

1.3.7.
Izvedbeni kriteriji i zahtjevi za određivanje analita plinskom kromatografijom
uz elektronapsorpcijsko dokazivanje (ECD)

Uvijek
treba koristiti unutarnji standard kada je u tu svrhu dostupna primjerena tvar.

To bi prvenstveno trebao biti srodni spoj čije je
vrijeme zadržavanja blizu vremena zadržavanja analita. Vrijeme zadržavanja
analita mora biti u dopuštenim granicama prema odgo­varajućem baždarnom
standardu uz iste uvjete ispitivanja. Minimalno prihvatljivo vrijeme
zadržavanja za analit mora biti jednako dvostrukom vremenu zadržavanja koje
odgovara praznom volumenu kolone. Omjer između vremena zadržavanja analita i
vremena zadržavanja unutarnjeg standarda, tj. relativno vrijeme zadržavanja analita,
mora biti jednako vremenu zadržavanja baždarnog standarda u odgovarajućem
matriksu, uz toleranciju od ± 0,5 %. Najbliži maksimum pika u kromatogramu mora
biti odvojen od utvrđenog pika analita za najmanje jednu punu širinu pika
izmjerenu na 10 % od maksimalne visine pika analita. Za dobivanje dodatnih
podataka može se primijeniti ko-kromatografija.

1.4.
POTVRDNE METODE ZA KEMIJSKE ELEMENTE

Potvrdne
metode analize kemijskih elemenata moraju se temeljiti na principu
nedvosmislene identifikacije i točne i precizne kvantifikacije, uz pomoć
fizikalno-kemijskih svojstava koji su jedinstveni za dotični element na razini
koncentracije od interesa (npr. karakteristična valna duljina emitiranog ili
apsorbiranog zračenja, atomska masa).

Sljedeće metode ili kombinacije metoda smatraju se
prikladnim za identifikaciju kemijskih elemenata.

if !supportEmptyParas endif

*Tablica* *7.* Prikladne potvrdne metode  za kemijske elemente

|  |  |
| --- | --- |
| Tehnika | Mjereni pokazatelj |
| Diferencijalna pulsna voltametrija | Električni signal |
| Atomska apsorpcijska spektrometrija | if !supportEmptyParas endif |
| Plamena | Duljina vala apsorpcije |
| Tehnika tvorbe hidrida | Duljina vala apsorpcije |
| Tehnika hladnih para | Duljina vala apsorpcije |
| Elektrotoplinska atomizacija (grafitna peć) | Duljina vala apsorpcije |
| Atomska emisijska spektrometrija  Induktivno spregnuta plazma | if !supportEmptyParas endif  Duljina vala emisije |
| Spektrometrija masa  Induktivno spregnuta plazma | if !supportEmptyParas endif  Omjer mase i naboja |

if !supportEmptyParas endif

1.4.1.
Zajednički kriteriji izvedbe i drugi zahtjevi za potvrdne metode

Referentni
uzorak ili obogaćeni uzorak koji sadrži poznatu količinu analita na ili u
blizini dopuštene granice ili granične koncentracije (pozitivni kontrolni
uzorak) kao i negativni kontrolni materijali i slijepe probe s reagensom
trebali bi biti podvrgnuti cijelom postupku istodobno sa svakom serijom
ispitivanih uzoraka. Preporučeni redoslijed ubacivanja ekstrakta u analitički
instrument je sljedeći: slijepa proba s reagensom, negativni kontrolni uzorak,
uzorak koji se ispituje, negativni kontrolni uzorak i na kraju pozitivni
kontrolni uzorak. Svaka izmjena ovog redoslijeda mora se opravdati.

Općenito, kod većine analitičkih postupaka nužna je
potpuna razgradnja (digestija) organskog matriksa kako bi se dobila otopina
prije određivanja analita. To se može postići primjenom postupaka mikrovalne
mineralizacije, koji rizik od gubitka i/ili kontaminacije ispitivanog analita
svode na najmanju mjeru. Mora se upotrijebiti dekontaminirano teflonsko posuđe
dobre kvalitete. Za primjenu drugih postupaka vlažne ili suhe digestije, moraju
postojati dokumentirani dokazi koji isključuju moguću pojavu gubitka ili
kontaminacije. Kao alternativa za digestiju, u određenim okolnostima se mogu
primijeniti postupci razdvajanja (npr. eks­trakcija) u cilju odvajanja analita
od sastojaka matriksa i/ili u cilju koncentriranja analita prije uvođenja u
analitički uređaj.

Što se tiče baždarenja, bilo pomoću potvrđenog
standarnog materijala ili postupkom standardnog dodavanja, mora se paziti da se
ne prekorači radno područje utvrđeno za analizu. Baždarni standardi se moraju
obavezno pripremiti u otopini koja se, što je moguće više, podudara sa sastavom
otopine uzorka. Ako to zahtijevaju specifične analitičke okolnosti, primjenjuje
se i korekcija nespecifičnog signala (engl. background korekcija).

1.4.2.
Dodatni kriteriji učinkovitosti i drugi zahtjevi za kvantitativne analitičke
metode

1.4.2.1.
Istinitost kvantitativnih metoda

Kod
višekratnog analiziranja ovjerenog referentnog materijala za kemijske elemente,
odstupanje eksperimentalno utvrđene srednje vrijednosti udjela analita od
ovjerene vrijednosti, ne smije biti izvan granice od ± 10 %. Ako ne postoje
takvi ovjereni referentni materijali, prihvatljivo je da se istinitost mjerenja
ocijeni odre­đivanjem poznate količine elementa dodane u nepoznati uzorak koji
se ispituje, uz izračun iskorištenja. Skreće se pozornost na činjenicu da, za
razliku od analita, dodana količina elementa nije kemijski vezana u ispitivanom
matriksu te da stoga tako dobiveni rezultati imaju manju valjanost od rezultata
dobivenih uporabom ovjerenog referentnog materijala. Podaci o iskorištenju
prihvatljivi su jedino ako je njihova vrijednost unutar ± 10 % ciljne
vrijednosti.

1.4.2.2.
Preciznost kvantitativnih metoda

Međulaboratorijski
koeficijent varijacije (CV) za opetovane analize referentnog ili obogaćenog
materijala, u uvjetima obnovljivosti, ne smije biti veći od sljedećih
vrijednosti:

**if !supportEmptyParas endif**

*Tablica 8.* CV za kvantitativne metode kod određenih
raspona udjela  mase elementa

**if !supportEmptyParas endif**

|  |  |
| --- | --- |
| Udio mase | CV (%) |
| > 10 μg/kg do 100 μg/kg | 20 |
| > 100 μg/kg do 1000 μg/kg | 15 |
| > 1000 μg/kg | 10 |

if !supportEmptyParas endif

1.4.3.
Specifični zahtjevi za diferencijalnu pulsnu voltametriju (DPASV)

Od
najveće je važnosti da organska tvar u uzorcima bude potpuno raščinjena prije DPASV
određivanja. Na voltamogramu se ne smije vidjeti niti jedan široki signal
nastao zbog prisutnosti organske tvari. Anorganski sastojci matriksa mogu
utjecati na visinu pikova pri DPASV postupku. Stoga se kvantifikacija mora
obaviti metodom standardnog dodavanja. Primjerci tipičnih voltamograma otopine
uzorka moraju biti dostavljeni uz metodu.

1.4.4.
Specifični zahtjevi za atomsku apsorpcijsku spektrometriju (AAS)

Ova se
tehnika u osnovi koristi za određivanje jednog elementa i stoga zahtijeva da
eksperimentalni parametri budu optimalno podešeni za određeni element koji se
kvantificira. Kad je god to moguće, rezultati se moraju provjeriti kvalitativno
i kvantitativno uz pomoć alternativnih apsorpcijskih linija (idealno je da se
odaberu dvije različite valne duljine). Baždarni standard se priprema u otopini
matriksa čiji je sastav što je moguće sličniji sastavu otopine ispitivanog
uzorka (npr. koncentracija kiselina ili sastav modifikatora). Kako bi se
vrijednosti slijepe probe svele na najmanju moguću mjeru, svi reagensi moraju
biti najvećeg mogućeg stupnja čistoće. Ovisno o načinu uparavanja i/ili
atomizacije uzorka, mogu se razlikovati različiti tipovi atomske apsorpcijske
spektrometrije.

1.4.4.1.
Specifični zahtjevi za plamenu atomsku apsorpcijsku spektrometriju

Uređaj
mora biti optimalno podešen za svaki element. Posebice se mora provjeriti
sastav plina i brzina protoka. Kako bi se izbjegle interferencije uzrokovane
nespecifičnom apsorpcijom, mora se kao korektor koristiti izvor energije s
kontinuiranim spektrom. U slučaju nepoznatih matriksa, mora se provjeriti da li
je potrebna korekcija nespecifične apsorpcije (background korekcija).

1.4.4.2.
Specifični zahtjevi za atomsku apsorpcijsku spektrometriju s grafitnom peći

Kontaminacija
u laboratoriju često utječe na točnost pri radu sa grafitnom peći na razinama
ultra tragova. Stoga se pri radu s uzorkom i standardom moraju upotrebljavati
reagensi visoke čistoće, deionizirana voda i posuđe od inertne plastike.
Instrument se mora optimalno podesiti za svaki element. Moraju se posebice
provjeriti uvjeti prethodne obrade uzorka, atomizacije (temperatura, vrijeme) i
modifikacija matriksa.

Rad pod izotermnim uvjetima atomizacije (npr.
poprečna zagrijana grafitna cijev s ugrađenom Lžvovom platformom) sma­njuje utjecaj
matriksa pri atomizaciji analita. Kombinacija mo­difikacije matriksa i
Zeemanove korekcije nespecifične apsorp­cije, dopušta kvantifikaciju pomoću
baždarne krivulje koja se temelji na mjerenju vodene otopine standarda.

1.4.5.
Specifični zahtjevi za atomsku apsorpcijsku spektrometriju uz tvorbu hidrida

Organski
spojevi koji sadrže elemente kao što su arsen, bizmut, germanij, olovo,
antimon, selen, kositar i telurij mogu biti vrlo stabilni i mogu zahtijevati
oksidacijsku razgradnju, kako bi se dobile točne vrijednosti ukupnog sadržaja
elementa. Stoga se preporučuje mikrovalno razaranje ili visokotlačno
spaljivanje uz oštre oksidacijske uvjete. Najveća se pažnja mora posvetiti
potpunom i reproducibilnom prijetvoru elemenata u njihove hidride.

Tvorba arsenova hidrida u otopini solne kiseline s
NaBH4 ovisi o oksidacijskom
stupnju arsena (As III: brza tvorba, As V: dugotrajniji prijelaz). Kako bi se
izbjegao gubitak osjetljivosti u određivanju As V pomoću protočno-injekcijske
tehnike, koji je posljedica kratkog vremena reakcije u tom sustavu, As V se
mora reducirati na As III nakon oksidacijske razgradnje. U tu svrhu je
prikladan kalijev jodid/askorbinska kiselina ili cistein. Na isti način se mora
postupati sa slijepim probama, baždarnim otopinama i otopinama uzorka. Rad sa
serijama uzoraka omogućuje, ne dovodeći u pitanje točnost, određivanje obje
vrste arsena. Radi sporije reakcije AS V sa NaBH4, baždarenje se provodi
integracijom površina ispod pikova. Uređaj mora biti optimalno podešen. Protok
plina, kojim se hidrid prenosi u atomizator, posebno je važan i mora se
kontrolirati.

1.4.6.
Specifični zahtjevi za atomsku apsorpcijsku spektrometriju metodom hladnih para

Tehnika
hladnih para se upotrebljava jedino u slučaju žive. Zbog gubitaka elementarne
žive uzrokovanih isparavanjem i adsorpcijom, potrebna je posebna pozornost
tijekom cijelog postupka. Mora se pozorno izbjegavati kontaminacija reagensom
ili iz okoliša.

Organski
spojevi koji sadrže živu zahtijevaju oksidacijsku razgradnju, kako bi se
odredio ukupni sadržaj žive u uzorku. Za razgradnju se upotrebljavaju zatvoreni
sustavi s mikrovalnim razaranjem ili visokotlačnim spaljivanjem. Oprema koja je
došla u doticaj sa živom mora se posebno pomno očistiti.

Uporaba
protočno-injekcijske tehnike pruža određene prednosti. Za niže vrijednosti
granične koncentracije preporučuje se adsorpcija elementarne žive na adsorbens
od zlata/platine i potom toplinsko otpuštanje. Doticaj adsorbensa ili radnog
dijela uređaja s vlagom smeta mjerenju i mora se izbjegavati.

1.4.7.
Specifični zahtjevi za atomsku emisijsku spektrometriju s induktivno spregnutom
plazmom (ICP-AES)

Atomska
emisijska spektrometrija s induktivno spregnutom plazmom je metoda koja
omogućuje istodobno mjerenje više različitih elemenata. Da bi se primijenila
metoda ICP-AES, u uzorcima se najprije mora razgraditi organska tvar. U tu se
svrhu primjenjuju zatvoreni sustavi mikrovalnog razaranja ili visoko­tlačnog
spaljivanja. Da bi ICP-AES analiza bila učinkovita, od ključne su važnosti
baždarenje uređaja i odabir elementa odnosno valne duljine. U slučaju linearnih
baždarnih krivulja, obično je dovoljno izmjeriti samo četiri koncentracije
baždarne otopine, jer su baždarne krivulje kod ICP-AES postupka uglavnom
linearne duž četiri do šest redova veličina koncentracije. Baždarenje ICP-AES
sustava uglavnom se obavlja standardom koji sadrži više elemenata, a koji se
priprema u otopini sa istom koncentracijom kiseline kao i mjerna otopina. Radi
linearnosti baždarne krivulje treba provjeriti koncentracije elemenata.

Odabir valnih duljina za mjerenje emisije analita
mora biti sukladan koncentracijama elemenata koji se određuju. Ako je
koncentracija analita izvan djelatnog raspona jedne emisijske linije, mora se
primijeniti druga emisijska linija. Najprije se bira najosjetljivija emisijska
linija (bez smetnji), potom manje osjetljiva linija. Kod analize na granici
detekcije, ili u blizini te granice, obično je najbolje odabrati
najosjetljiviju liniju za dotični analit. Spektralne i pozadinske
interferencije predstavljaju najveće poteškoće kod ICP-AES postupka. Moguće
interferencije su npr, jednostavni pozadinski pomak, kosi pozadinski pomak,
izravno spektralno preklapanje i složeni pozadinski pomak. Svaka ova smetnja
ima vlastiti uzrok i lijekove. Interferencije se ispravljaju, a radni parametri
optimiziraju, ovisno o matriksima. Neke se smetnje mogu izbjeći razrjeđivanjem
ili prilagodbom matriksa. Sa svakom serijom ispitivanih uzoraka, na isti način
kao i uzorci, mora se obraditi i referentni i obogaćeni materijal koji sadrži poznate
količine jednog ili više analita. Za provjeru eventualnog pomaka, standard se
mora ubacivati, primjerice, nakon 10 uzoraka. Svi reagensi i plazma plin moraju
biti najveće moguće čistoće.

1.4.8.
Posebni zahtjevi za spektrometriju masa s induktivno spregnutom plazmom
(ICP-MS)

Određivanje
elemenata u tragovima prosječne atomske mase, kao što su krom, bakar i nikal
može biti podložno jakim smetnjama od drugih izobarnih ili/i višeatomskih iona.
To se može spriječiti jedino ako je snaga razlučivanja najmanje 7000-8000.
Poteškoće vezane za postupke spektrometrije masa uključuju instrumentalni
pomak, utjecaj matriksa i interferencije molekulskih iona (m/z < 80). Da bi
se ispravio instrumentalni pomak i učinci matriksa treba pripremiti više
unutarnjih standarda koji pokrivaju isti maseni raspon kao i elementi koji se
ispituju.

Prije
mjerenja postupkom ICP-MS, nužna je potpuna razgradnja organske tvari u
uzorcima. Kao i kod atomske apsorpcijske spektrometrije (AAS), hlapljivi
elementi, npr. jod, moraju se nakon razaranja u zatvorenim posudama prevesti u
stabilno oksidacijsko stanje. Najjače smetnje uzrokovane su kombinacijama
molekulskih iona s argonom (plazma plin), vodikom, ugljikom, dušikom i kisikom
(podrijetlom iz kiselina za otapanje, iz atmosfere, ili kao nečistoće plazmenog
plina) s matriksom. Kako bi se izbjegle interferencije, nužno je potpuno
raščinjivanje, korekcija osnovnog šuma te odgovarajući odabir analitičkih masa
i ponekad manja količina analita i posljedično viša granica detekcije te odabir
kiselina za otapanje, npr. dušične kiseline.

Da bi se odredili elementi, interferencije se moraju
isključiti odgovarajućim odabirom specifičnih analitičkih masa, uklju­čujući
provjeru omjera izotopa. Za svako mjerenje se mora, upotrebom unutarnjih
standarda, provjeriti odziv instrumenta na Fano faktore.

PRILOG II.

2.
VREDNOVANJE METODE (VALIDACIJA)

Vrednovanjem
se mora pokazati da analitička metoda udovoljava kriterijima koji se odnose na
odgovarajuće značajke učinkovitosti.

Različiti
ciljevi kontrole zahtijevaju različite kategorije metoda. Sljedeća tablica
pokazuje koje se značajke izvedbe provjeravaju za svaku vrstu metode.

**if !supportEmptyParas endif**

*Tablica
9*. Klasifikacija analitičkih
metoda prema značajkama izvedbe koje se moraju odrediti

**if !supportEmptyParas endif**

|  |  |  |  |  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| if !supportEmptyParas endif | if !supportEmptyParas endif | Sposobnost detekcije  CCβ | if !supportEmptyParas endif  Granična koncentracija (količina) analita CCα  if !supportEmptyParas endif | Istinitost/  iskorištenje | Preciznost | if !supportEmptyParas endif  Selektivnost/specifičnost | if !supportEmptyParas endif  Primjenjivost/  robusnost/  stabilnost |
| Kvalitativne metode | S | + | - | - | - | + | + |
| C | + | + | - | - | + | + |
| Kvantitativne metode | S | + | - | - | + | + | + |
| C | + | + | + | + | + | + |
| S=Orijentacijska (engl.screening) metoda; C= potvrdna metoda; += određivanje je obvezno | | | | | | | |

if !supportEmptyParas endif

if !supportEmptyParas endif

2.1.
POSTUPCI VREDNOVANJA

U ovom poglavlju
su navedeni primjeri i/ili upućivanja za postupke vrednovanja analitičkih
metoda. Mogu se primijeniti i drugi postupci kako bi se pokazalo da analitička
metoda udovoljava kriterijima učinkovitosti, uz uvjet da pružaju istu razinu i
kvalitetu informacija.

Vrednovanje
se, također, može obaviti provođenjem međulaboratorijskog ispitivanja prema
Codex-u Alimentarius-u, ISO-u ili IUPAC-u, ili prema alternativnim metodama kao
što su ispitivanja u jednom laboratoriju odnosno unutarnje vrednovanje. Ovaj se
dio usredotočuje na studije unutar jednog laboratorija (unutarnje vrednovanje)
uz modularni postupak. Ovaj se postupak sastoji od:

1.  skupa zajedničkih značajki učinkovitosti koje su neovisne o
primijenjenom modelu vrednovanja i

2.  specifičnijih postupaka ovisnih o modelu, kao što je opisano u
tablici 10.

**if !supportEmptyParas endif**

*Tablica 10.*Izvedbeni parametri neovisnog
modela i ovisnog modela

if !supportEmptyParas endif

|  |  |  |
| --- | --- | --- |
| Vrednovanje | | |
| Izvedbeni parametri neovisnog  modela | Izvedbeni parametri ovisnog modela | |
| Zajedničke značajke učinkovitosti (2.1.1.) | Uobičajen postupak (2.1.2.) vrednovanja | Unutarnji postupak vrednovanja (2.1.3.) |
| Specifičnost  Istinitost  Robusnost: manje promjene  Stabilnost | Iskorištenje  Ponovljivost  Unutarlaboratorijska obnovljivost  Obnovljivost  Granična koncentracija (količina) analita (CCα)  Sposobnost dokazivanja (CCβ)  Baždarna krivulja  Robusnost: veće promjene | Iskorištenje  Ponovljivost  Unutarlaboratorijska obnovljivost  Obnovljivost  Granična koncentracija (količina) analita (CCα)  Sposobnost dokazivanja (CCβ)  Baždarna krivulja  Robusnost |

if !supportEmptyParas endif

2.1.1.
Značajke učinkovitosti neovisne o modelu

Bez
obzira koji se postupak vrednovanja primjenjuje, moraju se odrediti sljedeće značajke
učinkovitosti. Da bi se smanjio opseg posla, može se primijeniti pažljivo
osmišljeni i statistički utemeljeni postupak u kojemu će se kombinirati
ispitivanja obavljena u cilju određivanja različitih parametara.

2.1.1.1.
Specifičnost

Za
analitičke metode je važna sposobnost razlučivanja između analita i njima
srodnih tvari (izomera, metabolita, produkata razgradnje, endogenih tvari,
sastojaka matriksa, itd.). Nužno je provesti dva postupka kako bi se provjerile
interferencije.

Stoga
se odabiru tvari koje bi mogle izazvati interferencije i analiziraju se slijepi
uzorci za dokazivanje prisutnosti mogućih interferencija i procijenjuje se
njihov učinak:

–
odabere se niz kemijski srodnih spojeva (metabolita, derivata, itd.) ili drugih
tvari koje bi mogle interferirati sa spojem koji se dokazuje u uzorku;

–
analizira se odgovarajući broj reprezentativnih slijepih uzoraka (n ³ 20) i provjere
interferencije (signali, pikovi, tragovi iona) u području u kojemu očekujemo
otpuštanje dokazivanog analita;

– osim
toga, reprezentativni slijepi uzorci moraju se obogatiti do odgovarajuće
koncentracije tvarima koje bi mogle ometati identifikaciju i/ili kvantifikaciju
analita.

Nakon
analize, ispita se:

– je li
prisutnost mogla dovesti do pogrešne identifikacije,

– je li
prisutnost jedne ili više interferencija otežala identifikaciju dokazivanog
analita, ili

–
postoji li značajni utjecaj na kvantifikaciju.

2.1.1.2.
Istinitost

U ovome
se stavku opisuje određivanje istinitosti (jedne komponente točnosti). Istinitost
se može utvrditi jedino pomoću potvrđenog referentnog materijala (CRM). Kad god
je na raspolaganju potvrđeni referentni materijal, isti se mora upotrijebiti.
Postupak je podrobno opisan u normi HRN ISO 5725-4. U nastavku navodimo
primjer:

– analizira se šest replika potvrđenog referentnog
materijala, u skladu s uputama za izvođenje ispitivanja koja vrijede za
određenu metodu,

– odredi se koncentracija analita koji je prisutan u
svakom uzorku replika,

– izračuna se srednja vrijednost, standardna devijacija
i koeficijent varijacije (%) za te koncentracije,

– izračuna se istinitost podjelom dokazane srednje
vrijednosti s potvrđenom vrijednošću (mjerenom kao koncentracija) i množenjem
sa 100, da bi se rezultat izrazio u postotku.

Istinitost (%) = srednja vrijednost dokazane
koncentracije korigirana iskorištenjem x 100/ potvrđena vrijednost

Ako ne postoji potvrđeni referentni materijal,
umjesto istinitosti može se odrediti iskorištenje.

2.1.1.3.
Primjenjivost/robusnost (manje promjene)

Ova
provjera podrazumijeva namjerno uvođenje manjih razumnih varijacija od strane
laboratorija i promatranje njihovih posljedica.

Prije
samog ispitivanja mora se izvršiti odabir čimbenika koji sudjeluju u pripremnoj
obradi, pročišćavanju i analizi uzoraka, a koji bi mogli utjecati na rezultate
mjerenja. Ti čimbenici mogu uključivati analitičara, izvor i starost reagensa,
otapala, standarde i ekstrakte uzoraka, brzinu zagrijavanja, temperaturu, pH
vrijednost, kao i mnoge druge čimbenike koji se mogu javiti u laboratoriju. Ove
bi čimbenike trebalo modificirati po redu veličine koji odgovara odstupanjima
do kojih obično dolazi između laboratorija.

–
odrede se čimbenici koji bi mogli utjecati na rezultate,

–
neznatno se promijeni svaki faktor,

– test
robusnosti provodi se prema Youdenovom postupku. (U ovoj se fazi mogu
primijeniti i druge priznate metode. Međutim, Youdenov postupak svodi potrebno
vrijeme i napor na minimum). Youdenov postupak je frakcionirani faktorski
model. Uzajamna djelovanja među različitim faktorima ne mogu se dokazati,

– ako
se otkrije da neki faktor značajno utječe na rezultate mjerenja, provode se
daljnja ispitivanja kako bi se odredile granice prihvatljivosti tog faktora,

– u
protokolu izvođenja metode trebaju biti jasno navedeni faktori koji značajno
utječu na rezultate.

Osnovna
ideja nije u tomu da se ispituje jedna po jedna promjena, već nekoliko promjena
odjednom. Kao primjer neka A, B, C, D, E, F, G označujući nominalne vrijednosti
za sedam različitih faktora koji bi, u slučaju da se njihove nominalne
vrijednosti neznatno promijene, mogli utjecati na rezultate. Označimo njihove
alternativne vrijednosti odgovarajućim malim slovima a, b, c, d, e, f, g. Time
dobivamo 27odnosno
128 mogućih različitih kombinacija.

Moguće
je odabrati podskup od osam kombinacija kod kojih postoji ravnoteža između
malih i velikih slova (Tablica 11). Mora se odabrati osam kombinacija koje će
sadržavati odabrane faktore (A-G). Rezultat odabranih kombinacija pokazan je u
Tablici 11 kao S-Z.

**if !supportEmptyParas endif**

*Tablica 11.*Plan ispitivanja za ispitivanje robusnosti (manje promjene)

**if !supportEmptyParas endif**

|  |  |  |  |  |  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Vrijednost faktora F | Kombinacije | | | | | | | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| if !supportEmptyParas endif  if !supportEmptyParas endif  A/a  B/b  C/c  D/D  E/e  F/f  G/g | A  B  C  D  E  F  G | A  B  c  D  e  f  g | A  b  C  d  E  f  g | A  b  c  d  e  F  G | a  B  C  d  e  F  g | a  B  c  d  E  f  G | a  b  C  D  e  f  G | a  b  c  D  E  F  g |
| Opaženi rezultat R | S | T | U | V | W | X | Y | Z |
| Za izračunavanje, vidi primjere ispitivanja robusnosti pod točkom 2.3. | | | | | | | | |

if !supportEmptyParas endif

if !supportEmptyParas endif

2.1.1.4.
Stabilnost

Zapaženo
je da nedovoljna stabilnost analita ili sastojaka matriksa u uzorku tijekom
pohrane ili analize može dovesti do značajnih odstupanja u konačnom rezultatu
analize. Osim toga, trebalo bi provjeriti stabilnost baždarnog standarda u
otopini. Stabilnost analita u različitim uvjetima pohrane obično je dobro
poznata. Praćenje uvjeta pohrane sastavni je dio uobičajenog sustava
ovlašćivanja laboratorija. Ako stabilnost nije poznata, može se odrediti prema
primjerima navedenim u daljnjem tekstu.

Stabilnost analita u otopini:

– pripremiti svježe temeljne otopine jednog ili više
analita (stock) i razrijediti ih prema uputama za ispitivanje, kako bi dobili
dovoljno alikvota (npr. 40) svake odabrane koncentracije (otprilike na razini
najmanje zahtijevane granice učinkovitosti izvedbe metode za tvari za koje nije
utvrđena dopuštena količina, odnosno oko dopuštene granice za ostale tvari).
Pripremiti otopinu analita koji je upotrijebljen za obogaćivanje kao i onoga
koji će se upotrijebiti u konačnoj otopini za analizu, te bilo koju drugu
značajnu otopinu (npr. derivatizirani standardi),

– izmjeriti udio analita u svježe pripremljenoj
otopini prema uputama za ispitivanje,

– rasporediti odgovarajuće volumene u prikladno
laboratorijsko posuđe, označiti i pohraniti prema sljedećoj shemi:

**if !supportEmptyParas endif**

*Tablica* *12.*Shema za
određivanje stabilnosti analita u
otopini

**if !supportEmptyParas endif**

|  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- |
| if !supportEmptyParas endif | – 20˚C | + 4˚C | + 20˚C |
| Tama  Svjetlo | 10 alikvota | 10 alikvota | 10 alikvota  10 alikvota |

if !supportEmptyParas endif

if !supportEmptyParas endif

– vrijeme
pohrane može iznositi jedan, dva, tri i četiri tjedna, ili po potrebi dulje,
npr. dok se ne primijete prve pojave degradacije tijekom identifikacije i/ili
kvantifikacije. Mora se zabilježiti maksimalno vrijeme pohrane i optimalni
uvjeti pohrane,

– koncentraciju analita u
svakom alikvotu treba izračunati uzimajući kao 100%-tnu vrijednost otopinu koja
je svježe pripremljena u trenutku analize.

                                   C1 x 100

Preostali
analit (%) = —————

                                      Csvježa

C1 = trenutačna koncentracija

Csvježa = koncentracija svježe
otopine

Stabilnost
analita u matriksu

– kad
god je moguće, treba upotrijebiti prirodno kontaminirane uzorke. Ako prirodno
kontaminirani materijal nije na raspolaganju, treba upotrijebiti matriks
obogaćen s analitom,

– ako je na raspolaganju prirodno kontaminirani
materijal, koncentraciju u materijalu treba odrediti dok je materijal još
svjež. Ostali alikvoti materijala mogu se uzeti nakon 1, 2, 4 i 20 tjedana te treba
izmjeriti koncentracije. Tkivo bi trebalo pohraniti na temperaturi od najmanje
minus 20°C ili, po potrebi, nižoj,

– ako prirodno kontaminirani materijal nije na
raspolaganju, uzeti materijal koji ne sadrži analit i homogenizirati ga.
Podijeliti materijal u pet alikvota. Obogatiti svaki alikvot s analitom, koji
bi trebao biti pripremljen u maloj količini vodene otopine. Odmah analizirati
jedan alikvot. Ostale alikvote pohraniti na temperaturi od najmanje minus 20°C
ili, po potrebi, nižoj, te ih analizirati nakon 1, 2, 4 i 20 tjedana.

2.1.1.5.
Baždarna krivulja

Kad se
baždarne krivulje primjenjuju u svrhu kvantifikacije:

– pri
njihovoj izradi treba upotrijebiti najmanje pet razina (uključujući nultu),

– treba
opisati operativni raspon krivulje,

– treba
opisati matematičku formulu krivulje i primjerenost podataka krivulji,

– treba
opisati raspone prihvatljivosti parametara krivulje.

Ako je
potrebno serijsko baždarenje na temelju standardne otopine, treba naznačiti
prihvatljive raspone parametara baždarne krivulje, koji mogu varirati od serije
do serije.

2.1.2.
Uobičajeni postupak vrednovanja (validacije)

Izračunavanje
parametara u skladu s uobičajenim metodama zahtijeva izvođenje nekoliko
pojedinačnih ispitivanja. Mora se odrediti svaka značajka učinkovitosti za
svaku veću promjenu (vidi »robusnost«). Metodama za ispitivanje više analita
moguće je istodobno analizirati nekoliko analita, uz uvjet da su prethodno
isključene interferencije koje bi mogle biti značajne. Na isti način se može
odrediti nekoliko značajki učinkovitosti. Dakle, da bi se smanjila količina
posla, preporučljivo je kombinirati ispitivanja u što je moguće većoj mjeri
(npr. ponovljivost i unutarlaboratorijsku obnovljivost sa specifičnošću i
analizom negativnog slijepog uzorka kako bi se odredila CCa i provjerila specifičnost.

2.1.2.1.
Iskorištenje (engl. recovery)

Ako ne
postoji potvrdni referentni materijal, iskorištenje se mora odrediti
ispitivanjem, uporabom obogaćenog matriksa, primjenjujući sljedeće postupke:

–
odabrati 18 alikvota kontrolnog uzorka i podijeliti ih u tri skupine po šest
alikvota, pa svakoj skupini dodati analita u količini koja je 1, 1,5 i 2 puta
veća od najmanje zahtijevane granice učinkovitosti izvedbe metode, odnosno koja
je 0,5, 1 i 1,5 puta veća od dopuštene količine,

–
analizirati uzorke i izračunati koncentraciju u svakom uzorku,

– uz
pomoć donje jednadžbe izračunati iskorištenje za svaki uzorak,

–
izračunati srednje iskorištenje i CV iz šest rezultata u svakoj skupini,

                                      100 x izmjereni
udio

– %
iskorištenja i = ————————————

                                       razina
obogaćenja

Uobičajena
metoda za određivanje iskorištenja inačica je metode standardnog dodavanja koja
je opisana pod točkom 2.5 ako:

– se
uzorak smatra kontrolnim uzorkom, umjesto uzorkom za analizu,

– se
smatra da su konačni maseni udio1 i iskorištenje2 slični za oba poduzorka,

–
uzorci za ispitivanje imaju iste mase, a ekstrakti poduzoraka za analizu iste
volumene,

–
količina baždarnog standarda koja je dodana drugom (obogaćenom) poduzorku za
analizu iznosi xADD. (xADD = rA.VA)

– x1 je izmjerena vrijednost za
slijepi uzorak, a x2
izmjerena vrijednost drugog (obogaćenog) poduzorka,

100 (x2 – x1)

– dakle,
iskorištenje % = ———————

xADD

Ako
bilo koji od gore navedenih uvjeta nije (ili se pretpostavlja da nije)
ispunjen, onda se mora primijeniti cijeli postupak određivanja iskorištenja
pomoću standardnog dodavanja, kao što je opisano pod točkom 2.5.

\_\_\_\_\_\_\_\_
 1 Konačni maseni udio (yield):
onaj maseni udio analita iz uzorka koji je prisutan u konačnom ekstraktu.

2 Iskorištenje (ovdje): maseni udio analita dodan
uzorku, a koji je prisutan u konačnom ekstraktu. U ostatku ovog dokumenta
pretpostavlja se da su konačni maseni udio i iskorištenje isti, pa se stoga
upotrebljava jedino izraz »iskorištenje«.

2.1.2.2.
Ponovljivost

Pripremiti
određeni broj uzoraka identičnih matriksa, kojima je dodan analit tako da se
dobiju koncentracije koje iznose 1, 1,5 i 2 puta veće od najmanje zahtijevane
granice učinkovitosti izvedbe metode odnosno 0,5, 1 i 1,5 puta veće od
dopuštene količine.

– za
svaku razinu analita, analizu treba obaviti s najmanje šest replika,

–
analizirati uzorke,

–
izračunati koncentraciju dokazanu u svakom uzorku,

–
pronaći srednju koncentraciju, standardnu devijaciju i koeficijent varijacije
(%) obogaćenih uzoraka,

–
ponoviti ove korake još najmanje dva puta,

–
izračunati ukupne srednje koncentracije i koeficijente varijacije za obogaćene
uzorke.

2.1.2.3.
Unutarlaboratorijska obnovljivost (reproducibilnost)

Pripremiti
određeni broj uzoraka za analizu (identičnih ili različitih matriksa), kojima
je dodan analit ili više analita, tako da se dobiju koncentracije 1, 1,5 i 2
puta veće od granične koncentracije učinkovitosti metode odnosno 0,5, 1 i 1,5
puta veće od dopuštene količine.

– za svaku razinu koncentracije, analizu treba
obaviti s najmanje šest ponavljanja,

– ponoviti ove korake još najmanje dva puta, s
različitim analitičarima i u različitim uvjetima okoliša, npr. s različitim
serijama reagensa, otapala, itd., pri različitim sobnim temperaturama, s
različitim instrumentima, itd., ako je moguće,

– analizirati uzorke,

– izračunati koncentraciju u svakom uzorku,

– izračunati srednju koncentraciju, standardnu
devijaciju i koeficijent varijacije (%) obogaćenih uzoraka.

2.1.2.4.
Obnovljivost (reproducibilnost)

Ako se
mora provjeriti obnovljivost (reproducibilnost), laboratoriji bi trebali
sudjelovati u međulaboratorijskim usporedbenim ispitivanjima prema normi HRN
ISO 5725-2.

2.1.2.5.
Granična koncentracija (količina) analita (CCa)

U
slučaju tvari za koje nije utvrđena dopuštena količina, CCa utvrđuje se:

–
postupkom s baždarnom krivuljom prema normi HRN ISO 11843 (ovdje nazvana kao
kritična vrijednost net varijable stanja). U tom slučaju, koristi se slijepi
uzorak koji se obogaćuje na razinu MRPL ili iznad nje, u jednakim razmacima.
Analizirati uzorke. Nakon identifikacije, grafički prikazati odnos signala i
dodane koncentracije. CCa jednaka je pripadajućoj koncentraciji u točki sjecišta s ordinatom y
uvećana za 2,33 standardne devijacije unutarlaboratorijske obnovljivosti. Ovo
je primjenjivo jedino za kvantitativna ispitivanja (a = 1 %),

– ili
analizom najmanje 20 slijepih uzoraka po matriksu, kako bi izračunali omjer
signal-šum u vremenskom intervalu u kojemu se očekuje analit. Kao CCa može se uzeti trostruka
vrijednost omjera signal-šum. Ovo je primjenjivo i za kvantitativna i
kvalitativna ispitivanja.

U
slučaju tvari za koje je utvrđena dopuštena količina, CCa utvrđuje se:

–
postupkom s baždarnom krivuljom prema normi HRN ISO 11843 (ovdje nazvana
kritična vrijednost net varijable stanja). U tom slučaju, koristi se slijepi
uzorak koji se obogaćuje oko dopuštene količine, u jednakim razmacima.
Analizirati uzorke. Nakon identifikacije, grafički prikazati odnos signala i
dodane koncentracije. CCa jednaka je koncentraciji na dopuštenoj granici uvećanoj za 1,64
standardne devijacije unutarlaboratorijske obnovljivosti (a = 5 %).

– ili
analizom najmanje 20 slijepih uzoraka po matriksu, obogaćenih jednim ili više
analita na razinu dopuštene granice. Granica odlučivanja jednaka je
koncentraciji na dopuštenoj granici uvećanoj za 1,64 odgovarajuće standardne
devijacije (a = 5 %).

2.1.2.6.
Sposobnost dokazivanja (CCß)

U
slučaju tvari za koje nije propisana granična koncentracija, CCß utvrđuje se:

–
postupkom s baždarnom krivuljom prema normi HRN ISO 11843 (ovdje nazvana kao
najmanja određena vrijednost net varijable stanja). U tom slučaju, koristi se reprezentativni
slijepi uzorak koji je obogaćen na razinu ili ispod najmanje zahtijevane
granice učinkovitosti izvedbe metode u jednakim razmacima. Analizirati uzorke.
Nakon identifikacije, grafički prikazati odnos signala i dodane količine
analita.

CCb jednaka je odgovarajućoj CCa uvećanoj za 1,64 standardne devijacije
unutarlaboratorijske obnovljivosti za razinu srednje vrijednosti CCa (ß = 5 %).

– analizom najmanje 20 slijepih uzoraka po matriksu,
obogaćenih s jednim ili više analita na razinu granične koncentracije
(količine) analita CCa. Analizirati uzorke i identificirati analite. Sposobnost dokazivanja
jednaka je vrijednosti CCa uvećane za 1,64 standardne devijacije unutarlaboratorijske
obnovljivosti za izmjereni udio (ß = 5 %),

– ako ne postoje kvantitativni rezultati, sposobnost
dokazivanja se može odrediti analizom slijepog uzorka koji je obogaćen na ili
iznad CCa. U tom slučaju, sposobnost dokazivanja metode jednaka je razini
koncentracije kod koje ima samo 5 % ili manje lažno negativnih rezultata. Stoga
je potrebno obaviti najmanje 20 ispitivanja za najmanje jednu razinu
koncentracije, kako bi se osigurala pouzdana osnova za ovo određivanje.

U slučaju tvari za koje je utvrđena dopuštena
količina, CCß utvrđuje se:

– postupkom s baždarnom krivuljom prema normi HRN ISO
11843 (ovdje nazvana kao najmanja određena vrijednost net varijable stanja). U
tom slučaju, koristi se reprezentativni slijepi uzorak koji se obogaćuje
analitom oko dopuštene granice u jednakim razmacima. Analizirati uzorke i
identificirati analit ili analite. Izračunati standardnu devijaciju srednjeg
udjela izmjerenog na razini granične koncentracije (količine) analita CCa. Granica dokazivanja jednaka
je odgovarajućoj graničnoj koncentraciji uvećanoj za 1,64 standardne devijacije
unutarlaboratorijske obno­v­­ljivosti (ß = 5 %),

– ili
analizom najmanje 20 slijepih uzoraka po matriksu, obogaćenih jednim ili više
analita na razini granične koncentracije analita CCa. Sposobnost dokazivanja
jednaka je vrijednosti CCa uvećanoj za 1,64 odgovarajuće standardne devijacije (ß = 5 %).

Vidi,
točku 2.2.

2.1.2.7.
Robusnost (značajne promjene)

Analitičku
metodu bi trebalo ispitati pod različitim eksperimentalnim uvjetima koji
uključuju npr. različite vrste, različite matrikse ili različite uvjete uzorkovanja.
Uvedene promjene moraju biti značajne. Značaj tih promjena može se procijeniti
npr. Youdenovim postupkom. Za sve veće promjene za koje se pokazalo da značajno
utječu na provedbu ispitivanja trebalo bi odrediti svaku značajku
učinkovitosti.

2.1.3.
Vrednovanje prema alternativnim modelima

Ako se
primjenjuju alternativni postupci vrednovanja, u protokolu izvođenja validacije
potrebno je utvrditi temeljni model i strategiju s odgovarajućim preduvjetima,
pretpostavkama i formulama ili barem na njih uputiti. U daljnjem tekstu se
navodi primjer alternativne metode. Primjenjuje li se npr. model unutarnjeg
vrednovanja, značajke učinkovitosti se utvrđuju na način koji omogućava
vrednovanje značajnih promjena unutar istog postupka vrednovanja. To zahtijeva
izradu plana ispitivanja u svrhu vrednovanja.

2.1.3.1.
Plan ispitivanja

Plan
ispitivanja mora biti napravljen tako da uzme u obzir broj različitih
životinjskih vrsta i različitih čimbenika koji se ispituju. Stoga se kao prvi
korak u cijelom postupku vrednovanja razmatraju populacijski uzorci koji će se
u budućnosti analizirati u laboratoriju, kako bi se odabrale najvažnije vrste i
oni čimbenici koji bi mogli utjecati na rezultate mjerenja. Nakon toga, odabire
se raspon koncentracije koji je prilagođen svrsi u skladu s razinom
značajnosti.

Primjer:

– pomoću metode koja se vrednuje moguće je istodobno
ispitati nekoliko analita,

– utvrđene su dvije varijacije vodećeg čimbenika (A i
B). Vodeći čimbenici su osnova na kojoj se kombiniraju razine čimbenika. Ti
vodeći čimbenici mogu uključivati čimbenike kao što su vrsta uzorka ili
matriks. U ovom primjeru je vodeći čimbenik promijenjen na dvije razine, tj.
razmatrane su dvije različite vrste (A i B). Općenito, moguće je promijeniti
vodeće čimbenike na više od dvije razine, čime se samo povećava broj analiza
koje treba obaviti,

–
odabrane čimbenike treba promijeniti na dvije razine (označene kao + ili –).

if !supportEmptyParas endif

*Tablica 13.* Primjeri čimbenika koji se smatraju značajnima za postupak vrednovanja

**if !supportEmptyParas endif**

|  |  |
| --- | --- |
| if !supportEmptyParas endif  if !supportEmptyParas endif  Spol životinje  Pasmina  Uvjeti transporta  Uvjeti čuvanja/skladištenja  Svježina uzorka  Uvjeti tova  Različiti operatori s različitim iskustvom | (čimbenik 1)  (čimbenik 2)  (čimbenik 3)  (čimbenik 4)  (čimbenik 5)  (čimbenik 6)  (čimbenik 7) |

**if !supportEmptyParas endif**

*Tablica 14*. Mogući plan ispitivanja za gornji
primjer

if !supportEmptyParas endif

| Vrsta | Čimbenik 1 | Čimbenik 2 | | Čimbenik 3 | Čimbenik 4 | Čimbenik 5 | Čimbenik 6 | Čimbenik 7 | Uzorak br. |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| A | + | + | | + | + | - | + | - | 1 |
| A | + | + | | - | - | + | - | - | 2 |
| A | + | - | | + | - | - | - | + | 3 |
| A | + | - | | - | + | + | + | + | 4 |
| A | - | + | | + | - | + | + | + | 5 |
| A | - | + | | - | + | - | - | + | 6 |
| A | - | - | | + | + | + | - | - | 7 |
| A | - | - | | - | - | - | + | - | 8 |
| B | + | + | + | | + | + | - | + | 9 |
| B | + | + | - | | - | - | + | + | 10 |
| B | + | - | + | | - | + | + | - | 11 |
| B | + | - | - | | + | - | - | - | 12 |
| B | - | + | + | | - | - | - | - | 13 |
| B | - | + | - | | + | + | + | - | 14 |
| B | - | - | + | | + | - | + | + | 15 |
| B | - | - | - | | - | + | - | + | 16 |
if !supportMisalignedColumns|  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |
endif

if !supportEmptyParas endif

S
obzirom da se svaki uzorak (svaka kombinacija razine čimbenika) mora pomiješati
s četiri različite koncentracije oko razine značajnosti, a za svaku razinu se
mora analizirati jedan slijepi uzorak, za cijeli postupak vrednovanja mora se
obaviti
5 x 16 = 80 analiza.

Na temelju ovih 80 rezultata mjerenja moguće je
izračunati sljedeće:

Iskorištenje

– ponovljivost po razini koncentracije (Sir),

– unutarlaboratorijska obnovljivost po razini
koncentracije (Sir),

– granična koncentracija (količina) analita (CCa),

– sposobnost dokazivanja (CCß),

– krivulja djelotvornosti (postotak ß-pogreške u
odnosu na koncentraciju (vidi točku 2.1.3.2.),

– robusnost u odnosu na značajne promjene; robusnost
u odnosu na manje promjene može se odrediti prema točki 2.1.1.3.,

– 16 baždarnih krivulja vezanih za uzorke,

– jedna ukupna baždarna krivulja,

– interval očekivanja sveobuhvatne baždarne krivulje,

– devijacije uzrokovane matriksom (Smat),

– devijacije uzrokovane procesom analize (Srun),

– utjecaj pojedinačnih čimbenika na rezultate
mjerenja.

Ove značajke učinkovitosti omogućuju iscrpnu ocjenu
učinkovitosti metode, s obzirom da se ne ispituje utjecaj samo pojedinačnih
čimbenika, nego i odgovarajuća kombinacija tih čimbenika. Uz pomoć ovakvog
plana ispitivanja moguće je odrediti hoće li se neki od odabranih čimbenika
isključiti iz ukupne baždarne krivulje zbog značajnog odstupanja od standardnih
devijacija ostalih čimbenika.

2.1.3.2.
Krivulja djelotvornosti

Krivulja
djelotvornosti pruža informacije o sposobnosti dokazivanja metode unutar
odabranog raspona koncentracije. Upućuje na rizik od ß-pogreške pri primjeni
ispitivane metode. Krivulja djelotvornosti omogućuje izračun sposobnosti
dokazivanja za odgovarajuće kategorije metoda (probiranje, potvrda) ili tipove
metoda (kvalitativna ili kvantitativna) za određenu ß-pogrešku (npr. 5%).

*if !supportEmptyParas endif*

*Slika 1.* Krivulja
djelotvornosti

![]()

Koncentracija

if !supportEmptyParas endif

Slika
1. prikazuje primjer grafičkog prikaza sposobnosti dokazivanja (CCß) analitičke
metode. Kod ovdje prikazane metode postoji stalni rizik od donošenja pogrešne
odluke od 5% kod koncentracije od 0,50 mg/kg. Kod koncentracije od 0,55 m/kg rizik od lažno negativnog
rezultata opada na 1%.

2.1.3.3.
Obnovljivost

Utvrđivanje
obnovljivosti metode putem unutarlaboratorijskog ispitivanja (interna
validacija) zahtjeva opetovana sudjelovanja u ispitivanjima osposobljenosti u
skladu s uputama ISO/IEC 43-1 i 43-2.

Laboratoriji
mogu primjenjivati metode po vlastitom izboru, uz uvjet da se te metode
primjenjuju pod rutinskim uvjetima. Standardna devijacija laboratorija može se
upotrijebiti za ocjenu obnovljivosti metode.

2.2.
GRAFIČKI PRIKAZ RAZLIČITIH
ANALITIČKIH GRANICA

*Slika 2.* Tvari za koje nije utvrĐena dopuŠtena koliČina

![]()

Odgovor

if !supportEmptyParas endif

XS           srednja vrijednost rezultata kontaminiranog uzorka

SB standardna devijacija slijepog uzorka (utvrđena u uvjetima
unutarlaboratorijske obnovljivosti)

SS standardna devijacija kontaminiranog uzorka (utvrđena u uvjetima
unutarlaboratorijske obnovljivosti)

apostotak lažno pozitivnih rezultata

ß             postotak lažno negativnih rezultata

CCa       odgovor s određenom a-pogreškom i ß-pogreškom od 50%

CCß        odgovor s vrlo malom a-pogreškom i ß-pogreškom

*if !supportEmptyParas endif*

*Slika 3.* Tvari za koje je utvrĐena
dopuŠtena koliČina

![]()

Koncentracija

XB           srednja »koncentracija« slijepog uzorka

XPL srednja koncentracija uzorka koji sadrži analit na dopuštenoj granici

XS           srednja koncentracija kontaminiranog uzorka

SPL          standardna devijacija uzorka koji sadrži analit na
dopuštenoj granici (utvrđena u uvjetima međula­boratorijske obnovljivosti)

SS           standardna devijacija kontaminiranog uzorka (utvrđena u
uvjetima međulaboratorijske obnovljivosti)

a             postotak lažno pozitivnih rezultata

ß             postotak lažno negativnih rezultata

CCa       odgovor s određenom a-pogreškom i ß-pogreškom od 50%

CCß        odgovor s vrlo malom a-pogreškom i određenom ß-pogreškom

if !supportEmptyParas endif

2.3.
PRIMJER IZRAČUNA KOD ISPITIVANJA ROBUSNOSTI U ODNOSU NA MANJE PROMJENE PREMA
YOUDENOVOJ METODI

Usporedba prosjeka (A)

AA= S(Ai)/4

AB= S(Bi)/4

AC= S(Ci)/4

AD= S(Di)/4

AE= S(Ei)/4

AF= S(Fi)/4

AG= S(Gi)/4

Aa = S(ai)/4

Ab = S(bi)/4

Ac = S(ci)/4

Ad = S(di)/4

Ae = S(ei)/4

Af = S(fi)/4

Ag = S(gi)/4

Usporedite
prosjeke velikih slova (AA
do AG) s prosjecima njima pripadajućih
malih slova (Aa do Ag). Ako čimbenik ima neki učinak, razlika će biti značajno
veća nego razlika kod drugih čimbenika.

Razlike/varijacije
koje skoro sigurno postoje između laboratorija ne bi smjele utjecati na robusnu
metodu.

Ako
nema značajne razlike, sedam razlika su najrealnija mjera slučajne pogreške.

Razlike (Di)                                 Kvadrati razlika (Di2)

Da = A – a = S(Ai) – S(ai)           Da2 =
vrijednost a

Db = B – b = S(Bi) – S(bi)          Db2 =
vrijednost b

Dc = C – c = S(Ci) – S(ci)           Dc2 =
vrijednost b

Dd = D – d = S(Di) – S(di)          Dd2 =
vrijednost b

De = E – e = S(Ei) – S(ei)            De2 =
vrijednost b

Df = F – f = S(Fi) – S(fi)              Df2 =
vrijednost b

Dg = G – g = S(Gi) – S(gi)          Dg2 =
vrijednost b

*Standardna
devijacija razlika D**i* *(S**Di**)*

SDi = Ö2xS(Di2/7)

Ako je
vrijednost SDiznačajno
veća od standardne devijacije metode izvedene pod unutarlaboratorijskim
uvjetima obnovljivosti (vidi gore), neizbježan je zaključak da svi čimbenici
zajedno utječu na rezultat, čak i ako svaki pojedini čimbenik ne pokazuje
značajni utjecaj, te da metoda nije dovoljno robusna u odnosu na odabrane
modifikacije.

2.4.
PRIMJER IZRAČUNA ZA UNUTARNJI POSTUPAK VREDNOVANJA

Primjeri
i izračuni za protokol unutarnjeg vrednovanja kako su opisani u poglavlju o
vrednovanju prema alternativnim modelima (2.1.3.).

2.5.
PRIMJERI ZA METODU STANDARDNOG DODAVANJA

Uzorak
za ispitivanje s T udjelom analita podijeli se na dva poduzorka 1 i 2, čije su
mase m1 odnosno m2. Poduzorku 2 doda se Volumen
VA otopine koncentracije analita
rA. Postupcima ekstrakcije i
pročišćavanja koji su propisani metodom, dobivena su dva ekstrakta poduzoraka,
volumena V1 odnosno V2. Pretpostavlja se da je
iskorištenje analita rc. Oba ekstrakta se ispituju metodom mjerenja
osjetljivosti b i daju analitički odgovor x1 odnosno x2.

Ako se pretpostavi da su rc i b isti za analit u
izvornom uzorku i u obogaćenom uzorku, onda se udio T može izračunati kao:

          x1´V1 ´rA ´VA

T =
—————————–——

         (x2´V2´m1 - x1´V1 ´m2)

Ovom se
metodom može odrediti iskorištenje rc. Potom, osim gore opisanog ispitivanja,
dijelu ekstrakta poduzorka 1 (volumena V3) dodaje se poznata količina rB ´VB analita te se testira.
Analitička reakcija je x1, a
iskorištenje je:

rc = x2 ´V1 ´V2 ´rB ´VB/[x3 ´V1 ´V3(T ´m2.5pt'>+rA´VA ) - x2.V2 ´ T ´m1(V3-VB)]

Osim
toga, može se izračunati osjetljivost b, kao:

b= x1.V1/rc.T.m1

Opisani
su svi uvjeti primjene i detalji.

PRILOG III

Analitičke
metode koje se primjenjuju za dokazivanje sljedećih tvari moraju zadovoljiti
najmanje zahtijevane granice učinkovitosti izvedbe metode navedene u tablici
15:

if !supportEmptyParas endif

*Tablica 15.*Najmanje zahtjevane granice učinkovitosti
izvedbe metode

**if !supportEmptyParas endif**

|  |  |  |
| --- | --- | --- |
| Tvar i/ili metaboliti | Matriks | MRPL |
| Kloramfenikol | Meso  Jaja  Mlijeko  Urin  Proizvodi akvakulture  Med | 0,3 μg/kg |
| Medroxyprogesteron acetat | Svinjska bubrežna mast | 1 μg/kg |
| Metaboliti nitrofurana:  – furazolidone  – furaltadone  – nitrofurantoin  – nitrofurazone | Meso peradi  Proizvodi akvakulture | 1 μg/kg za sve |
| Malahitno zelenilo i leukomalahitno zelenilo | Proizvodi akvakulture  if !supportEmptyParas endif | 2 μg/kg |

if !supportEmptyParas endif

PRILOG IV

*KRATICE*

AAS          (engl. Atomic absorption spectrometry) atomska apsorpcijska
spektrometrija

AES           (engl. Atomic emission spectrometry) atomska emisijska
spektrometrija

AOAC-I    (engl. Association of
Official Analytical Chemists INTERNATIONAL) Međunarodno udruženje službenih
analitičkih kemičara

B                (engl. bound
fraction (immunoassays)) vezana frakcija (imunotest)

CI              (engl. chemical
ionisation) kemijska ionizacija

CRM         (engl. Certified
reference material) potvrdni referentni materijal

CV             (engl. coefficient
of variation) koeficijent varijacije

2D TLC     (engl. two dimensional thin
layer chromatography) dvodimenzionalna tankoslojna kromatografija

DAD          (engl. diode array
detection) dokazivanje nizom dioda

DPASV     (engl. diferential pulse
anodic stripping voltametry) diferencijalna pulsna voltametrija s anodnim
otapanjem

ECD          (engl. electron
capture detection) elektronapsorpcijska detekcija

EI               (engl. electronic impact ionisation) elektronska
ionizacija

GC             (engl. gas
chromatography) plinska kromatografija

HPLC        (engl. high performance
liquid chromatography) tekućinska kromatografija visoke djelotvornosti

HPTLC      (engl. high performance
thin layer chromatography) tankoslojna kromatografija visoke djelotvornosti
(učin­kovitosti)

HRMS       (engl. high resolution
mass spectrometry) spektrometrija masa visoke razlučivosti

ICP-AES   (engl. inductively coupled
plasma-mass spectrometry) atomska emisijska spektrometrija s induktivno
spregnutom plazmom

ICP-MS     (engl. inductively
coupled plasma-atomic emission spectrometry) spektrometrija masa s induktivno
spregnutom plazmom

IR              (engl. infrared)
infracrveni

ISO            International
Standard Organisation, Međunarodna organizacija za norme

LC             (engl. liquid
chromatography) tekućinska kromatografija

LR(MS)     (engl. low resolution
(mass spectrometry) (masena spektrometrija) niske razlučivosti

MRPL        (engl. Minimum required
performance limit) najmanja zahtjevana granica učinkovitosti izvedbe metode

MS            (engl. mass
spectrometry) spektrometrija masa

n eksponent – broj generacija
iona izvedenih iz prekursora

m/z             (engl. mass/charge
ratio) omjer masa/naboj

Rf               (engl. relative migration
to the solvent front) relativna migracija prema fronti otapala (TLC)

RSDL        (engl. relative
standard deviation of the laboratory) relativna standardna devijacija
laboratorija

SIM           (engl. selected ion
monitoring) praćenje odabranih iona

TLC           (engl. thin layer
chromatography) tankoslojna kromatografija

UV             (engl. ultraviolet
light) ultraljubičasto zračenje

VIS            (engl.
visible light) vidljivo zračenje

Pravilnik, NN 2/2005-16