## Pravilnik o veterinarsko-zdravstvenim uvjetima za stavljanje kopitara u promet

### NN 88/2005 (20.7.2005.), Pravilnik o veterinarsko-zdravstvenim uvjetima za stavljanje kopitara u promet

# MINISTARSTVO POLJOPRIVREDE, ŠUMARSTVA I VODNOGA GOSPODARSTVA

**1749**

Na temelju članka 64. stavka 6. Zakona o
veterinarstvu (»Narodne novine« br. 70/97, 105/01 i
172/03.) ministar poljoprivrede, šumarstva i vodnoga gospodarstva donosi

## PRAVILNIK

### o veterinarsko-zdravstvenim uvjetima za stavljanje kopitara u promet

POGLAVLJE I.OPĆE ODREDBE

Članak 1.

Ovim se Pravilnikom utvrđuju
veterinarsko-zdravstveni uvjeti za stavljanje živih kopitara u unutarnji i
međunarodni promet.

Članak 2.

Za potrebe ovog Pravilnika pojedini pojmovi
imaju sljedeće značenje:

(a) »*gospodarstvo*«
je poljoprivredni ili sportski objekt, staja ili svaki prostor u kojemu se
kopitari drže ili uzgajaju, bez obzira na namjenu;

(b) »*kopitari*«
su divlje ili domaće životinje koje pripadaju vrstama konja (uključujući zebre)
ili magaraca ili njihovi križanci;

(c) »*registrirani
kopitari*« su svi registrirani kopitari koje prati identifikacijski dokument
koji je izdala uzgojna organizacija ili nadležno tijelo države iz koje potječe
životinja, a koje vodi matičnu knjigu ili upisnik za tu pasminu, odnosno
međunarodno udruženje ili organizacija koja se bavi konjima za natjecanje ili
trkaćim konjima;

(d) »*kopitari
za klanje*« su kopitari namijenjeni prijevozu u klaonicu u svrhu klanja,
bilo izravno, bilo preko stočnog sajma ili sabirnog centra;

(e) »*kopitari
za uzgoj i rasplod*« su kopitari koji nisu navedeni u točkama (c) i (d)
ovoga članka;

(f) »*država
slobodna od konjske kuge*« je država u kojoj nije bilo kliničkih, seroloških (kod necijepljenih kopitara) ili epidemioloških
dokaza o konjskoj kugi u prethodne dvije godine i u kojoj se u prethodnih 12
mjeseci nije provodilo cijepljenje protiv te bolesti;

(g) »*bolesti
kopitara koje se obvezno prijavljuju*« su bolesti koje su navedene u Prilogu
A ovoga Pravilnika;

(h) »*ovlašteni
veterinar*« je veterinar kojega je ovlastilo nadležno tijelo za obavljanje
poslova državne uprave;

(i) »*privremeni
boravak*« je status registrirane životinje koja potječe iz države iz koje je
dozvoljen uvoz na područje Republike Hrvatske u razdoblju do 90 dana, a koje
određuje nadležno tijelo, ovisno o zdravstvenoj situaciji u državi podrijetla;

(j) »*nadležno
tijelo*« je Uprava za veterinarstvo Ministarstva poljoprivrede, šumarstva i
vodnoga gospodarstva.

POGLAVLJE II.

UNUTARNJI PROMET
KOPITARA

Članak 3.

1) Nadležno tijelo može odobriti promet
registriranih kopitara na svom području odnosno izvoz kopitara u drugu državu
ako oni ispunjavaju uvjete utvrđene člancima 4. i 5 ovoga Pravilnika.

2) Nadležno tijelo može odobriti izuzeća u vezi
s kretanjem kopitara koji:

– se jašu ili vode, u sportske ili rekreacijske
svrhe,

– sudjeluju u kulturnim ili sličnim događajima
ili aktivnostima,

– se kreću isključivo zbog privremene ispaše ili
rada.

Članak 4.

1) Veterinarsko-zdravstveni pregled kopitara
koji se stavljaju u promet, mora se obaviti u razdoblju od 48 sati prije
njihovog utovara. Kopitari pri pregledu ne smiju pokazivati kliničke znakove
bolesti.

2) Uz posebne uvjete iz stavka 5. ovoga članka,
koji se odnose na bolesti koje se obvezno prijavljuju, ovlašteni veterinar
utvrđuje, na temelju izjave vlasnika ili uzgajivača, da kopitari nisu u
razdoblju od 15 dana prije pregleda bili u doticaju s kopitarima koji boluju
ili su sumnjivi na zarazne bolesti.

3) Kopitari ne smiju biti predviđeni za klanje
radi provođenja mjera za iskorjenjivanje prenosivih ili zaraznih bolesti.

4) Kopitari se identificiraju na sljedeći način:

– ako se radi o registriranim konjima, pomoću
identifikacijske isprave kojom se naročito potvrđuje sukladnost s člankom 5.
ovog Pravilnika. Ovlašteni veterinar mora poništiti ispravu tijekom razdoblja
zabrana predviđenih stavkom 5. ovoga članka ili člankom 5. ovog Pravilnika.
Ukoliko se životinja zakolje, ispravu je potrebno vratiti tijelu koje ju je
izdalo;

– kopitari za uzgoj i rasplod identificiraju se
u skladu s posebnim propisima.

5) Uz uvjete utvrđene u članku 5. ovog
Pravilnika, kopitari ne smiju dolaziti s gospodarstva na kojem:

(a) sve životinje koje pripadaju vrstama prijemljivim
na bolest nisu zaklane, a razdoblje zabrane za gospodarstvo s kojeg potječu
mora iznositi najmanje:

– šest mjeseci u slučaju kopitara za koje se
sumnja da su oboljeli od durine, računajući od datuma
posljednjeg stvarnog ili mogućeg doticaja s bolesnom životinjom. U slučaju
ždrebadi, zabrana se primjenjuje do trenutka kastracije životinje,

– šest mjeseci u slučaju maleusa
ili encefalomijelitisa konja, računajući od dana
klanja kopitara oboljelih od navedenih bolesti,

– u slučaju infekciozne
anemije kopitara, zabrana mora biti na snazi sve dok se ne zakolju sve zaražene
životinje, a preostale životinje negativno reagiraju na dva Cogginsova
testa izvedena u razmaku od tri mjeseca,

– šest mjeseci u slučaju vezikularnog
stomatitisa,

– mjesec dana od zadnjega zabilježenog slučaja,
ukoliko se radi o bjesnoći,

– 15 dana od zadnjega zabilježenog slučaja,
ukoliko se radi o bedrenici;

(b) su sve životinje koje pripadaju vrstama
osjetljivim na bolest zaklane i prostori dezinficirani. Razdoblje zabrane
iznosi 30 dana računajući od dana na koji su životinje eutanazirane i
neškodljivo uklonjene te prostori dezinficirani, osim u slučaju bedrenice za
koju razdoblje zabrane iznosi 15 dana.

6) Nadležno tijelo može odobriti odstupanje od
mjera zabrane za hipodrome i trkališta.

Članak 5.

1) U slučaju pojave konjske kuge, kako je
navedeno u članku 2. točki (f) ovog Pravilnika, nadležno tijelo može narediti
otpremu kopitara iz onoga dijela područja koje se smatra zaraženim u skladu sa
stavkom 2. ovoga članka, jedino pod uvjetima koji su navedeni u stavku 3. ovoga
članka.

2) (a) Dio područja se smatra zaraženim konjskom
kugom ako:

– klinički, serološki
(kod necijepljenih životinja) ili epidemiološki dokazi ukazuju na prisutnost
konjske kuge u zadnje dvije godine,

– je u posljednjih 12 mjeseci provedeno
cijepljenje protiv konjske kuge.

(b) Dio područja koji se smatra zaraženim
konjskom kugom mora obvezno obuhvaćati sljedeće:

– zaštitnu zonu koja se proteže u krugu promjera
najmanje 100 km oko središta zaraze,

– nadzornu zonu koja se proteže najmanje 50 km
izvan zaštitne zone i u kojoj u posljednjih 12 mjeseci nije provedeno
cijepljenje protiv konjske kuge.

(c) Svi cijepljeni kopitari koji se nalaze u
zaštitnoj zoni moraju biti registrirani i identificirani.

(d) U identifikacijskoj ispravi i/ili svjedodžbi
o zdravstvenom stanju mora biti jasno navedeno cijepljenje.

3) Kopitari se smiju otpremati iz područja
navedenog u stavku 2. točki (b) ovog članka, jedino ako udovoljavaju sljedećim
uvjetima:

(a) mogu se otpremati jedino tijekom određenih
godišnjih razdoblja, ovisno o aktivnosti insekata koji prenose bolest;

(b) na dan pregleda iz članka 4. stavka 1. ovog
Pravilnika ne smiju pokazivati kliničke simptome konjske kuge;

(c) – ukoliko nisu cijepljeni protiv konjske
kuge, moraju biti pretraženi na konjsku kugu imunoenzimnim
testom (ELISA) kako je opisana u Prilogu C ovoga Pravilnika, i to dvokratno u
razmaku od 21 do 30 dana s negativnim rezultatom, pri čemu se drugo
pretraživanje mora obaviti u razdoblju od 10 dana prije otpreme,

– ukoliko su cijepljeni, cijepljenje je
zabranjeno tijekom prethodna dva mjeseca, a životinje moraju biti podvrgnute imunoenzimnom testu (ELISA), kako je opisan u Prilogu C
ovoga Pravilnika i to u razmacima navedenim u točki c), ovoga stavka, koji ne
pokazuje povećanje broja protutijela.

(d) najmanje 40 dana prije otpreme moraju
provesti u karantenskom objektu;

(e) tijekom karantene te tijekom prijevoza iz
karantenskog objekta do mjesta otpreme moraju biti zaštićeni od insekata koji
prenose bolest.

POGLAVLJE III.

UVOZ I PROVOZ KOPITARA

Članak 6.

Da bi se mogli uvesti na područje Republike
Hrvatske, kopitari moraju dolaziti iz države ili dijela države iz koje je
odobren uvoz ili provoz.

Članak 7.

1) Kopitari moraju dolaziti iz države:

(a) slobodne od konjske kuge;

(b) u kojoj u zadnje dvije godine nije bilo
pojave venezuelskog encefalomijelitisa
konja (VEE);

(c) u kojoj u zadnjih šest mjeseci nije bilo
pojave durine i maleusa.

2) Nadležno tijelo može:

(a) odlučiti da se odredbe stavka 1. ovog članka
primjenjuju na dio područja države, a ukoliko se zahtjevi vezani za konjsku
kugu primjenjuju na dio područja, moraju biti ispunjene mjere propisane člankom
5. stavcima 2. i 3. ovoga Pravilnika;

(b) zahtijevati dodatna jamstva za egzotične
bolesti.

Članak 8.

1) Prije utovara, kopitari moraju neprekidno
boraviti na području ili dijelu područja države utvrđenog u skladu s člankom 7.
stavkom 2. točkom (a) ovoga Pravilnika, tijekom razdoblja određenog u skladu s
člankom 9. ovoga Pravilnika.

2) Kopitari moraju dolaziti s gospodarstva koje
je pod veterinarskim nadzorom.

Članak 9.

Uvoz ili provoz dozvoljen je ako:

(a) kopitari udovoljavaju
veterinarsko-zdravstvenim uvjetima propisanim za određenu vrstu i kategoriju
kopitara, u skladu sa člancima 4. i 5. ovoga Pravilnika.

(b) se radi o zemlji koja najmanje zadnjih šest
mjeseci nije slobodna od vezikularnog stomatitisa ili virusnog arteritisa,
uz uvjet da kopitari udovoljavaju sljedećim uvjetima:

– moraju dolaziti s gospodarstva na kojemu u
zadnjih šest mjeseci nije bilo pojave vezikularnog stomatitisa i moraju negativno reagirati na serološki test prije otpreme;

– u slučaju pojave virusnog arteritisa,
muška grla kopitara, bez obzira na članak 12. podstavak 2. ovoga Pravilnika,
moraju negativno reagirati na serološki test ili na
test izolacije virusa odnosno drugi priznati test koji jamči da su životinje
slobodne od virusa.

Članak 10.

1) Kopitari moraju biti identificirani u skladu
s člankom 4. stavkom 4. ovoga Pravilnika i mora ih pratiti međunarodna
veterinarsko-zdravstvena svjedodžba koju je izdao nadležni veterinar zemlje izvoznice, koja mora:

(a) biti izdana na dan utovara životinja u svrhu
slanja na odredište ili, ako se radi o registriranim konjima, na zadnji radni
dan prije utovara,

(b) biti napisana na hrvatskom jeziku i jeziku
zemlje izvoznice,

(c) pratiti životinje u izvorniku,

(d) potvrđivati da životinje ispunjavaju
zahtjeve ovoga Pravilnika,

(e) biti napisana na jednom listu papira,

(f) biti izdana za jednog primatelja ili, ako se
radi o životinjama za klanje, za pošiljku, pod uvjetom da su životinje propisno
označene i identificirane.

2) Svjedodžba iz stavka 1. ovog članka izdaje se
na obrascu Priloga B ovoga Pravilnika.

Članak 11.

Odmah po dolasku na odredište, kopitari za klanje
otpremaju se u klaonicu te se u skladu s veterinarsko-zdravstvenim uvjetima,
moraju zaklati u roku 72 sata.

Članak 12.

Nadležno tijelo može odrediti:

– da se uvoz ili provoz iz pojedine države ili
dijela pojedine države ograniči na određene vrste ili kategorije kopitara,

– bez obzira na članak 9. ovoga Pravilnika,
posebne uvjete za privremeni ulazak registriranih kopitara ili kopitara za
posebne namjene ili njihov ponovni ulazak na područje Republike Hrvatske nakon
privremenog izvoza;

– uvjete za promjenu privremenog ulaska u trajni
ulazak.

Članak 13.

Prilozi A, B, i C tiskani su u prilogu ovog
Pravilnika i čine njegov sastavni dio.

Članak 14.

Ovaj Pravilnik stupa na snagu osmoga dana od
dana objave u »Narodnim novinama«.

Klasa: 322-01/05-01/265

Urbroj: 525-6-05-04

Zagreb, 7. lipnja 2005.

Ministar

**Petar Čobanković**, v. r.

PRILOG A

**BOLESTI KOPITARA KOJE SE OBVEZNO PRIJAVLJUJU**

Nadležnom tijelu, u skladu s posebnim propisima,
obvezno se prijavljuju sljedeće bolesti kopitara:

– durina,

– maleus,

– encefalomijelitis
konja (svi tipovi uključujući i VEE),

– infekciozna anemija,

– bjesnoća,

– bedrenica,

– konjska kuga,

– vezikularni stomatitis.

PRILOG B

**MEĐUNARODNA VETERINARSKO--ZDRAVSTVENA SVJEDODŽBA**

Putovnica br.
\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_

Ja, dolje potpisani, potvrđujem a) da
prethodno opisani kopitari ispunjavaju sljedeće uvjete:

1) danas su pregledani i nisu utvrđeni nikakvi
klinički znaci bolesti;

2) nisu namijenjeni klanju u skladu s
nacionalnim programom suzbijanja zaraznih ili prenosivih bolesti;

3) ne dolaze s područja ili dijela područja
države koja je pod zabranom zbog konjske kuge b), ili

– dolaze s područja ili dijela područja države
koja je bila predmet zabrana zbog veterinarsko-zdravstvenih razloga i da su u
karantenskom objektu podvrgnuti, s negativnim rezultatima testova navedenim u
Prilogu C ovoga Pravilnika

\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_između\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_. i
\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_b);

– nisu cijepljeni protiv konjske kuge, ili su
bili cijepljeni protiv konjske kuge dana \_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_\_b) c);

\_\_\_\_\_\_
a) Vrijedi 10 dana.

b)
Obrisati po potrebi.

c)
Datum cijepljenja mora biti upisan u putovnicu.

4) ne potječu s gospodarstva koje je pod
zabranom zbog veterinarsko-zdravstvenih razloga, niti su bili u dodiru s
kopitarima s gospodarstva koje je pod zabranom zbog veterinarsko-zdravstvenih
razloga:

– tijekom šest mjeseci u slučaju kopitara
sumnjivih na durinu, počevši od dana stvarnog ili
mogućeg dodira s bolesnom životinjom. Međutim, kada se radi o pastuhu, zabrana
se primjenjuje dok životinja nije kastrirana,

– tijekom šest mjeseci u slučaju sakagije ili konjskog encefalomijelitisa,
počevši od dana kada su životinje zaražene tim bolestima zaklane,

– u slučaju infekciozne
anemije, do dana kada su zaražene životinje zaklane a preostale životinje su
negativno reagirale nakon podvrgavanja pretrazi Coggins
testom provedenim dva puta u razmaku od tri mjeseca,

– tijekom šest mjeseci u slučaju vezikularnog stomatitisa,

– u slučaju bjesnoće, tijekom jednog mjeseca od
posljednjeg zabilježenog slučaja,

– u slučaju bedrenice, tijekom 15 dana od
posljednjeg zabilježenog slučaja,

– ukoliko su sve vrste životinja osjetljive na
bolest smještene na gospodarstvu zaklane i objekti dezinficirani, razdoblje
zabrane je 30 dana, počevši od dana kada su životinje uništene i objekti
dezinficirani, osim u slučaju bedrenice kada je period zabrane 15 dana.

5) koliko mi je poznato, životinja nije bila u
dodiru s kopitarima oboljelim od neke zarazne ili prenosive bolesti u razdoblju
15 dana prije ove izjave.

6) stanje životinja utvrđeno u trenutku pregleda
dopušta njihov prijevoz na planiranom putovanju u skladu s odredbama važećeg
Pravilnika o zaštiti životinja tijekom prijevoza.

|  |  |  |
| --- | --- | --- |
| Datum | Mjesto | Pečat i potpis ovlaštenog veterinara (1) |
|  |  |  |
| (1) Zvanje i ime velikim tiskanim slovima. | | |

PRILOG C

**DIJAGNOSTIKA KONJSKE KUGE**

Reagensi za dolje opisane imunoenzimne
testove (ELISA) mogu se dobiti u referentnom laboratoriju Europske zajednice ili
OIE-ovim referentnim laboratorijima za dijagnosticiranje konjske kuge.

1. KOMPETITIVNI TEST
ELISA ZA OTKRIVANJE PROTUTIJELA ZA VIRUS KONJSKE KUGE (VKK) (PROPISANI TEST)

Kompetitivni ELISA test upotrebljava se za
otkrivanje specifičnih protutijela za VKK u serumu bilo koje vrste kopitara.
Serum zamorca protiv VKK (u daljnjem tekstu ‘antiserum
zamorca’) je poliklonski imuni serum širokog spektra
koji je specifičan i kojim je moguće prepoznati sve poznate serotipove
virusa konjske kuge.

Test se temelji na onemogućavanju vezivanja
antigena VKK i antiseruma zamorca dodavanjem uzorka
ispitivanog seruma ukoliko je pozitivan. Protutijela za VKK u uzorku
ispitivanog seruma pokazuju veći afinitet prema antigenima VKK, te će se
smanjiti vezivanje antiseruma zamorca za iste, što
rezultira smanjenjem očekivane obojenosti (nakon dodavanja enzimom označenih
anti-zamorčevih protutijela i supstrata). Serumi se mogu testirati pri jednom
razrjeđenju od 1: 5 (metoda pretraživanja seruma pri jednom razrjeđenju) ili se
mogu titrirati (metoda titracije
seruma) kako bi se dobile završne točke razrjeđenja.

Vrijednosti inhibicije veće od 50 % mogu se
smatrati pozitivnim.

Dolje opisani protokol ispitivanja primjenjuje
se u Regionalnome referentnom laboratoriju za konjsku kugu u Pirbrightu, u Ujedinjenom Kraljevstvu.

1.1
      **Opis
testa**

*1.1.1          Pripremanje
plitica*

1.1.1.1       Na ELISA plitice nanesite antigen VKK koji
je ekstrahiran iz zaraženih staničnih kultura i razrijeđen u karbonatnom/
bikarbonatnom puferu, pH 9,6. Inkubirajte ELISA
plitice preko noći na 4 °C.

1.1.1.2       Isperite plitice tri puta tako što ćete
puniti i prazniti jažice fosfatnim puferom (PBS), pH 7,2 do 7,4 pH, te ih osušite na
upijajućem papiru.

*1.1.2          Kontrolne
jažice*

1.1.2.1       Titrirajte pozitivne
kontrolne serume u serijama dvostrukog razrjeđenja, od 1: 5 do 1: 640, duž
stupca 1 u blokirajućem puferu (PBS koji sadrži 0,05
% (v/v)Tween-20, 5,0 % (w/v) obranog mlijeka u prahu
(Cadbury’s Marvel TM) i 1 %
(v/v) goveđeg seruma) kako biste dobili konačni volumen od 50 µl po jažici.

1.1.2.2       U jažice A i B u
stupcu 2 dodajte 50 µl negativnog kontrolnog seruma u razrjeđenju od 1: 5 (10
µl seruma + 40 µl blokirajućeg pufera).

1.1.2.3       U jažice C i D u
stupcu 2 dodajte po 100 µl blokirajućeg pufera (slijepa
kontrola).

1.1.2.4       U jažice E, F, G
i H u stupcu 2 dodajte po 50 µl blokirajućeg pufera
(kontrolni serum zamorca).

*1.1.3.         Ispitivanje
seruma pri jednom razrjeđenju*

1.1.3.1       U dvije jažice u
stupcima 3 do 12 dodajte svaki ispitivani serum razrijeđen u blokirajućem puferu u omjeru 1:5 (10 µl seruma + 40 µl blokirajućeg pufera).

ili

*1.1.4          Metoda
titracije seruma*

1.1.4.1       Pripremite serije dvostrukog razrjeđenja
svakog pretraživanog uzorka (1: 5 do 1: 640) u blokirajućem puferu
u osam jažica svakog pojedinog stupca (3 do 12).

potom

1.1.5          U sve jažice na
ELISA plitici, osim u jažice slijepe kontrole,
dodajte po 50 µl antiseruma zamorca, prethodno
razrijeđenog u blokirajućem puferu (sada sve jažice sadrže konačni volumen od 100 µl).

1.1.5.1       Inkubirajte 1 sat na 37 °C na rotacijskoj tresilici.

1.1.5.2       Plitice isperite tri puta te osušite kao
prije.

1.1.5.3       U svaku jažicu
dodajte 50 µl kunićjeg anti-zamorčevog konjugata obilježenog peroksidazom
iz hrena (HRP), prethodno razrijeđenog u blokirajućem puferu.

1.1.5.4       Inkubirajte 1 sat na 37 °C na rotacijskoj tresilici.

1.1.5.5       Plitice isperite tri puta te osušite kao
prije.

*1.1.6          Kromogen*

      Pripremite otopinu kromogena OPD (OPD = orto-fenildiamin) prema uputama proizvođača (0,4 mg/ml u
sterilnoj destiliranoj vodi) neposredno prije uporabe. Dodajte supstrat
(vodikov peroksid = H2O2) kako biste dobili konačnu koncentraciju od 0,05 %
(v/v)(1: 2000 30 %-tne otopine H2O2).

      U svaku jažicu
dodajte 50 µl otopine OPD i ostavite plitice 10 minuta na temperaturi okoline.
Zaustavite reakciju dodajući u svaku jažicu po 50 µl
1M sumporne kiseline (H2SO4).

*1.1.7          Očitavanje
rezultata*

                   Rezultat očitajte spektrofotometrijski
na 492 nm.

**1.2             Izražavanje rezultata**

1.2.1          Koristeći računalni programski paket
ispišite vrijednosti optičke gustoće (OD) te postotak inhibicije (PI) za
pretraživane i kontrolne serume temeljene na srednjoj vrijednosti koja je
zabilježena u četiri jažice s kontrolnim serumom
zamorca.

      Na temelju podataka izraženih kao OD
i PI vrijednosti određuje se je li uspješnost testa bila unutar prihvatljivih
granica. Gornje kontrolne granice (GKG) i donje kontrolne granice (DKG) za
kontrolni serum zamorca nalaze se između OD vrijednosti 1,4 odnosno 0,4. Titar završne točke pozitivne kontrole na temelju 50 % PI
treba biti 1:240 (u rasponu od 1:120 do 1:480).

                   Treba odbaciti svaku pliticu koja ne
ispunjava gore navedene kriterije. Međutim, mogu se prihvatiti negativni
ispitivani uzroci ako je titar pozitivnog kontrolnog
seruma veći od 1:480, a ispitivani uzorci su još uvijek negativni.

      Jažice s
negativnim kontrolnim serumom u duplikatu i jažice za
slijepu kontrolu u duplikatu trebaju doseći PI vrijednosti između + 25 % i – 25
%, odnosno između + 95 % i + 105 %. Ukoliko vrijednosti nisu unutar ovih
granica, ne znači da je plitica neprihvatljiva nego upućuje na to da se razvija
pozadinska boja.

1.2.2          Dijagnostički prag (granična vrijednost)
za pretraživane serume je 50 % (PI 50 %). Uzorci čije su PI vrijednosti veće od
50 % ocjenjuju se kao pozitivni. Uzorci čije su PI vrijednosti manje od 50 %
ocjenjuju se kao negativni.

      Uzorci čije su PI vrijednosti iznad
i ispod praga kod jažica u duplikatu smatraju se
sumnjivim. Ti se uzorci mogu ponovo ispitati testom s jednim razrjeđenjem ili titracijom. Pozitivni se uzorci mogu također titrirati kako bi se utvrdio njihov titar.

*Prikazivanje
rezultata testa s jednim razrjeđenjem*

|  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
|  | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
|  | + kont. | Pretraživani serumi | | | | | | | | | | |
| A | 1:5 | – kont. | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 |
| B | 1:10 | – kont. | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 |
| C | 1:20 | Slijepa kont. |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |
| D | 1:40 | Slijepa kont. |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |
| E | 1:80 | SZ kont. |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |
| F | 1:160 | SZ kont. |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |
| G | 1:320 | SZ kont. | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| H | 1:640 | SZ kont. | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| – kont. = negativna kontrola.  + kont. = pozitivna kontrola.  SZ kont. = kontrolni serum zamorca. | | | | | | | | | | | | |

*Pretraživani
serum*

|  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
|  | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
|  | + kont. | Pretraživani serum | | | | | | | | | | |
| A | 1:5 | –kont. | 1:5 |  |  |  |  |  |  |  |  | 1:5 |
| B | 1:10 | –kont. | 1:10 |  |  |  |  |  |  |  |  | 1:10 |
| C | 1:20 | Slijepa kont. | 1:20 |  |  |  |  |  |  |  |  | 1:20 |
| D | 1:40 | Slijepa kont. | 1:40 |  |  |  |  |  |  |  |  | 1:40 |
| E | 1:80 | SZ kont. | 1:80 |  |  |  |  |  |  |  |  | 1:80 |
| F | 1:160 | SZ kont. | 1:160 |  |  |  |  |  |  |  |  | 1:160 |
| G | 1:320 | SZ kont. | 1:320 |  |  |  |  |  |  |  |  | 1:320 |
| H | 1:640 | SZ kont. | 1:640 |  |  |  |  |  |  |  |  | 1:640 |
| – kont. = negativna kontrola.  + kont. = pozitivna kontrola.  SZ kont. = kontrolni serum zamorca. | | | | | | | | | | | | |

2. INDIREKTNI TEST ELISA
ZA OTKRIVANJE PROTUTIJELA ZA VIRUS KONJSKE KUGE (VKK) (PROPISANI TEST)

Test koji se opisuje u daljnjem tekstu u skladu
je s opisom testa iz poglavlja 2.1.11. OIE-ovog Priručnika o normama za
dijagnostičke testove i cjepiva, četvrto izdanje, 2000.

Rekombinantni protein VP7 koristio se kao antigen za otkrivanje protutijela
usmjerenih protiv virusa konjske kuge, uz visoki indeks osjetljivosti i
specifičnosti. Njegove prednosti su i u tome što je stabilan i nije infektivan.

**2.1             Opis testa**

*2.1.1          Čvrsta
faza*

2.1.1.1       Na ELISA plitice nanesite VKK-4 VP7 razrijeđen u karbonatnom/ bikarbonatnom puferu, pH 9,6. Inkubirajte plitice preko noći na 4 °C.

2.1.1.2       Plitice isperite pet puta destiliranom
vodom koja sadrži 0,01 % (v/v) Tween 20 (otopina za
ispiranje).

      Lagano pritisnite plitice na
upijajući materijal (staničevinu ili celuloznu vatu) kako bi se odstranili
ostaci otopine za ispiranje.

2.1.1.3       Plitice blokirajte stavljajući u svaku jažicu 200 µl fosfatnog pufera (PBS)+
5 % (w/v) obranog mlijeka (Nestlé Dry
Skim Milk TM) i ostavite 1
sat na 37 °C.

2.1.1.4       Uklonite blokirajuću otopinu i lagano
pritisnite plitice na upijajući materijal.

*2.1.2          Uzorci
za pretraživanje*

2.1.2.1       Uzorci seruma koji se pretražuju te pozitivni
i negativni kontrolni serumi razrjeđuju se 1:25 u PBS + 5 % (w/v) obranog
mlijeka + 0,05 % (v/v)Tween 20, 100 µl po jažici. Inkubirajte 1 sat na 37 °C.

      Za titraciju
pripremite serije dvostrukog razrjeđenja od 1:25 (100 µl po jažici),
koristeći jedan stupac plitice za svaki serum, te isto učinite s pozitivnim i
negativnim kontrolama. Inkubirajte 1 sat na 37 °C.

2.1.2.2       Isperite plitice kako je opisano pod
2.1.1.2.

*2.1.3          Konjugat*

2.1.3.1       U svaku jažicu
stavite po 100 µl anti-konjskih gamaglobulina konjugiranih peroksidazom
iz hrena (HRP), razrijeđenih u PBS-u + 5 % mlijeka + 0,05 % Tween
20, pH 7,2. Inkubirajte 1 sat na 37 °C.

2.1.3.2       Isperite plitice kako je opisano pod
2.1.1.2.

*2.1.4          Kromogen/Supstrat*

2.1.4.1       U svaku jažicu
dodajte 200 µl otopine kromogena/supstrata (10 ml
80,6 mM DMAB (dimetilaminobenzaldehid)+ 10 ml 1,56 mM
MBTH (3-metil-2-benzo -tiazolin
hidrazon hidroklorid)+ 5 µl
H2O2)

      Razvijanje boje zaustavite
dodavanjem 50 µl 3N H2SO4 nakon približno 5 do 10 minuta (prije nego se počne
bojiti negativna kontrola).

      Mogu se upotrebljavati i drugi kromogeni kao što su ABTS (2,2’-azino-bis
-[3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska
kiselina]), TMB (tetrametil benzidin),
ili OPD (orto-fenildiamin).

2.1.4.2       Plitice očitajte na 600 nm (ili 620 nm).

**2.2             Tumačenje rezultata**

2.2.1          Izračunajte graničnu vrijednost tako što
ćete vrijednosti negativne kontrole dodati 0,6 (0,6 je standardna devijacija
dobivena sa skupinom od 30 negativnih seruma).

2.2.2          Pretraživani uzorci koji daju vrijednosti
apsorbancije niže od granične vrijednosti smatraju se
negativnim.

2.2.3          Pretraživani uzorci koji daju vrijednosti apsorbancije veće od granične vrijednosti + 0,15 smatraju
se pozitivnim.

2.2.4          Pretraživani uzorci koji daju vrijednosti apsorbancije između pozitivnih i negativnih sumnjivi su te
se mora primijeniti dodatna metoda kako bi se rezultat potvrdio.

3. BLOKIRAJUĆI TEST
ELISA ZA OTKRIVANJE PROTUTIJELA ZA VIRUS KONJSKE KUGE (VKK) (PROPISANI TEST)

Blokirajući test ELISA namijenjen je otkrivanju
specifičnih protutijela za VKK u serumima svih vrsta prijemljivih na bolest. VP7 je glavni, antigenski, virusni protein VKK-a, i sačuvan
je u devet serotipova. Budući da je monoklonsko protutijelo (Mpt)
usmjereno i protiv VP7, test pruža visoku razinu osjetljivosti i specifičnosti.

Nadalje, rekombinantni
VP7 antigen je potpuno neškodljiv te stoga jamči
visoki stupanj sigurnosti.

Test se temelji na prekidanju reakcije između rekombinantnog VP7, kao antigena vezanog na ELISA pliticu,
i konjugiranog Mpt specifičnog za VP7. Protutijela u
pretraživanim serumima blokirat će reakciju između antigena Mpt,
što će dovesto do smanjenja obojenja.

Test koji se opisuje u daljnjem tekstu izvodi se
u Referentnom laboratoriju Europske zajednice za konjsku kugu u Algeteu u Španjolskoj.

**3.1**             **Opis testa**

*3.1.1          ELISA
plitice*

3.1.1.1       Na ELISA plitice nanesite rekombinantni VKK-4 VP7
razrijeđen u karbonatnom/ bikarbonatnom puferu, pH
9,6. Inkubirajte ELISA plitice preko noći na 4 °C.

3.1.1.2       Plitice isperite pet puta fosfatnim puferom (PBS) koji sadrži 0,05% (v/v)Tween
20 (PBST).

3.1.1.3.      Stabilizirajte plitice stabilizirajućom
otopinom (kako bi se omogućilo dugotrajno čuvanje na 4 °C bez gubitka aktivnosti)
te ih osušite na upijajućem materijalu.

*3.1.2          Pretraživani
uzorci i kontrole*

3.1.2.1       Za pregled: pretraživane serume i kontrole
izravno na plitici razrijedite 1:10 u PBST-u kako biste u svakoj jažici dobili konačni volumen od 100 µl. Inkubirajte 1 sat
na 37 °C.

3.1.2.2       Za titraciju:
pripremite seriju dvostrukog razrjeđenja pretraživanih seruma i pozitivnih
kontrola (100 µl/jažica) od 1:10 do 1:1280 u osam jažica.

      Negativna se kontrola testira pri
razrjeđenju 1:10.

*3.1.3          Konjugat*

      U svaku jažicu
dodajte 50 µl prethodno razrijeđenih Mpt (monoklonska protutijela specifična za VP7)
konjugiranih peroksidazom iz hrena te lagano
promiješajte kako biste osigurali homogenost. Inkubirajte 30 minuta na 37 °C.

*3.1.4          Plitice
pet puta isperite PBST-om te osušite kao ranije.*

*3.1.5
Kromogen/Supstrat*

      U svaku jažicu
dodajte 100 µl otopine kromogena/supstrata (1 ml ABTS
(2,2’-azino-bis -[3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kiselina]) 5 mg/ml + 9 ml supstratnog pufera (0,1 M fosfat-citratni pufer s pH 4 koji sadrži 0,03 % H2O2] te inkubirajte 10
minuta na sobnoj temperaturi.

                   Razvijanje boje se zaustavlja tako da se
u svaku jažicu doda 100 µl 2 %-nog
(w/v) SDS-a (natrij dodecil sulfat).

*3.1.6          Očitavanje
rezultata*

      Rezultate očitajte pri 405 nm u
ELISA čitaču.

**3.2             Tumačenje rezultata**

*3.2.1          Validacija
testa*

      Test je valjan ako je optička
gustoća (OD) negativne kontrole (NK) veća od 1,0 i ako je OD pozitivne kontrole
(PK) manji od 0,2.

*3.2.2          Izračunavanje
granične vrijednosti*

      Pozitivna granična vrijednost = NK –
((NK – PK)x 0,3)

      Negativna granična vrijednost = NK –
((NK – PK)x 0,2)

      NK je optička gustoća negativne kontrole,
a PK je optička gustoća pozitivne kontrole.

*3.2.3          Tumačenje
rezultata.*

      Uzroke kod kojih je OD manji od
pozitivne granične vrijednosti treba smatrati pozitivnim na protutijela za VKK.

      Uzorke kod kojih je OD veći od
negativne granične vrijednosti treba smatrati negativnim na protutijela za VKK.

      Uzroke kod kojih je OD između te
dvije vrijednosti treba smatrati sumnjivim te bi se kod tih životinja trebalo
ponovo obaviti uzorkovanje nakon dva do tri tjedna.

Pravilnik, NN 88/2005-1749