## Pravilnik o izmjenama i dopunama Pravilnika o provođenju sustavnog istraživanja i mjera za sprječavanje širenja i suzbijanja prstenaste truleži gomolja krumpira koju prouzrokuje bakterija Clavibacter

### NN 89/2008 (30.7.2008.), Pravilnik o izmjenama i dopunama Pravilnika o provođenju sustavnog istraživanja i mjera za sprječavanje širenja i suzbijanja prstenaste truleži gomolja krumpira koju prouzrokuje bakterija Clavibacter

# MINISTARSTVO POLJOPRIVREDE, RIBARSTVA I RURALNOG RAZVOJA

2844

Na temelju članka 10. stavka 4., članka 11. stavka 5., članka 14. stavka 4. i
članka 50. Zakona o biljnom zdravstvu (»Narodne novine«, br. 75/05), ministar
poljoprivrede, ribarstva i ruralnog razvoja donosi

## PRAVILNIK

### O IZMJENAMA I DOPUNAMA PRAVILNIKA O PROVOĐENJU SUSTAVNOG ISTRAŽIVANJA I MJERA ZA SPRJEČAVANJE ŠIRENJA I SUZBIJANJE PRSTENASTE TRULEŽI GOMOLJA KRUMPIRA KOJU PROUZROKUJE BAKTERIJA CLAVIBACTER MICHIGANENSIS (SMITH) DAVIS ET AL. SSP. SEPEDONICUS (SPIECKERMANN ET KOTHOFF) DAVIS ET AL.

Članak 1.

U Pravilniku o provođenju sustavnog istraživanja i mjera za sprječavanje
širenja i suzbijanje prstenaste truleži gomolja krumpira koju prouzrokuje
bakterija Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus
(Spieckermann et Kothoff) Davis et al. (»Narodne novine« br. 119/06) u članku 1.
briše se točka i dodaju se riječi: »i shema testiranja za dijagnosticiranje,
detekciju i identifikaciju bakterije Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et
al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kothoff) Davis et al..«

Članak 2.

Članak 3. stavak 5. mijenja se i glasi:
»(5) Laboratorijsko testiranje iz stavka 3. i 4. ovoga članka provodi se
sukladno postupku iz Priloga II »SHEMA TESTIRANJA ZA DIJAGNOSTICIRANJE,
DETEKCIJU I IDENTIFIKACIJU BAKTERIJE Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et
al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kothoff) Davis et al.« koji je tiskan uz
ovaj Pravilnik i njegov je sastavni dio (u daljnjem tekstu: propisani
postupak).«

Članak 3.

Prilog tiskan uz Pravilnik o provođenju sustavnog istraživanja i mjera za
sprječavanje širenja i suzbijanje prstenaste truleži gomolja krumpira koju
prouzrokuje bakterija Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp.
sepedonicus (Spieckermann et Kothoff) Davis et al., postaje Prilog I.

Članak 4.

Ovaj Pravilnik stupa na snagu osmog dana od dana objave u »Narodnim
novinama«.
Klasa: 011-02/08-01/18
Urbroj: 525-2-08-1
Zagreb, 16. srpnja 2008.

Ministar poljoprivrede,
ribarstva i ruralnog razvoja
**mr. sc. Božidar Pankretić, v. r.**

PRILOG II.

SHEMA TESTIRANJA ZA DIJAGNOSTICIRANJE, DETEKCIJU I
IDENTIFIKACIJU UZROČNIKA PRSTENASTE TRULEŽI, BAKTERIJE

Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann
et Kotthoff) Davis et al.

PODRUČJE PRIMJENE SHEME TESTIRANJA

Prikazana shema testiranja opisuje različite postupke za:
(i) dijagnosticiranje prstenaste truleži u gomoljima i biljkama krumpira;
(ii) detekciju bakterije Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus u uzorcima
gomolja i biljaka krumpira;
(iii) identifikaciju bakterije Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (C. m.
subsp. sepedonicus).

OPĆA NAČELA

Optimizirani protokoli za pojedine metode, validirani reagensi i pojedinosti
za pripremu materijala za testiranje i kontrolnih materijala navedeni su u
Dodacima. Popis laboratorija koji su sudjelovali u optimizaciji i validaciji
protokola nalazi se u Dodatku 1.
S obzirom da protokoli uključuju detekciju karantenskog organizma i uključivat
će uporabu vijabilnih kultura C. m. subsp. sepedonicus kao kontrolnih
materijala, postupci će se morati izvoditi u primjerenim karantenskim uvjetima s
odgovarajućom opremom za zbrinjavanje otpada te prema uvjetima dozvola koje
izdaju nadležna tijela za biljnu karantenu.
Parametri testiranja moraju osigurati dosljednu i ponovljivu detekciju onih
razina C. m. subsp. sepedonicus prema propisanim pragovima detekcije za pojedine
metode.
Precizna priprema pozitivnih kontrola je nužna.
Testiranje u skladu s potrebnim pragovima detekcije podrazumijeva pravilno
postavljanje, održavanje i kalibriranje opreme, pažljivo pohranjivanje i
rukovanje reagensima te poduzimanje mjera za sprječavanje kontaminacije među
uzorcima, npr. razdvajanje pozitivnih kontrola od uzoraka za testiranje. Moraju
se primijeniti standardi kontrole kvalitete kako bi se izbjegle administrativne
i druge pogreške, posebice pri označavanju uzoraka i vođenju dokumentacije.
Sumnja na zarazu, kao što je navedeno u članku 4. stavku 1. Pravilnika o
provođenju sustavnog istraživanja i mjera za sprječavanje širenja i suzbijanje
prstenaste truleži gomolja krumpira koju prouzrokuje bakterija Clavibacter
michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kothoff)
Davis et al. (u daljnjem tekstu: Pravilnik), podrazumijeva pozitivan rezultat
testa za dijagnosticiranje ili testa provjere provedenog na uzorku kao što je
prikazano u dijagramima toka.
Ako je rezultat prvog testa provjere (IF ili PCR/FISH) pozitivan, tada se sumnja
na zarazu bakterijom C. m. subsp. sepedonicus i mora se provesti drugi test
provjere. Ako je rezultat drugog testa provjere pozitivan, tada je sumnja
potvrđena i testiranje se mora nastaviti prema shemi testiranja. Ako je rezultat
drugog testa provjere negativan, tada se smatra da uzorak nije zaražen
bakterijom C. m. subsp. sepedonicus.
Dakle, pozitivan rezultat IF testa, kao što je navedeno u članku 4. stavku 3.
definiramo kao pozitivno očitanje IF testa koje je potvrđeno drugim testom
provjere (PCR/FISH).
Potvrđena zaraza, kao što je navedeno u članku 5. stavku 2. Pravilnika,
podrazumijeva izolaciju i identifikaciju čiste kulture C. m. subsp. sepedonicus
te potvrdu patogenosti.

1. PRIKAZ DIJAGRAMA TOKA

1.1. Shema za detekciju i dijagnosticiranje uzročnika prstenaste truleži u
gomoljima i biljkama krumpira sa simptomima prstenaste truleži
Postupak testiranja je namijenjen za gomolje i biljke krumpira sa simptomima
tipičnim za ili koji pobuđuju sumnju na prstenastu trulež. Postupak uključuje
brzi test provjere, izolaciju patogena iz zaraženog provodnog tkiva na
dijagnostičkoj hranjivoj podlozi i, u slučaju pozitivnog rezultata,
identifikaciju čiste kulture kao bakterije C. m. subsp. sepedonicus.
![](dodatni/348376.gif)

(1) Opis simptoma naveden je u Dijelu 2.
(2) Prikladni testovi su:
– IF test (Dio 4),
– PCR test (Dio 6),
– FISH test (Dio 5).
(3) Iako je izolacija patogena iz biljnog materijala s tipičnim simptomima
metodom razrjeđivanja i nasađivanja na hranjivu podlogu jednostavna, uzgoj može
biti neuspješan iz uzoraka u naprednom stadiju infekcije. Saprofitske bakterije
koje rastu na oboljelom tkivu mogu prerasti ili inhibirati patogen na hranjivoj
podlozi. Stoga se preporuča korištenje neselektivne i selektivne hranjive
podloge, najbolje MTNA (Odjeljak 8) ili biotest (Odjeljak 7).
(4) Opis tipične morfologije kolonije naveden je u Dijelu 8.
(5) Ako je rezultat izolacije negativan, ali simptomi bolesti su tipični, tada
je potrebno ponoviti postupak izolacije.
(6) Pouzdana identifikacija čiste kulture C. m. subsp. sepedonicus postiže se
provođenjem testova navedenih u Dijelu 9.
(7) Test patogenosti opisan je u Dijelu 10.
1.2. Shema detekcije i identifikacije bakterije Clavibacter michiganensis ssp.
sepedonicus u uzorcima gomolja krumpira bez simptoma
Načelo
Postupak testiratestiraijenjen je za detekciju skrivene zaraze u gomoljima
krumpira. Pozitivan rezultat iz najmanje dva testa provjere, koji se temelje na
različitim biološkim načelima, mora se dopuniti izolacijom patogena, nakon kojeg
slijedi, u slučaju izolacije tipičnih kolonija, potvrda čiste kulture kao C. m.
subsp. sepedonicus. Pozitivan rezultat samo jednog od testova provjere nije
dovoljan da bi se uzorak smatrao vjerojatno zaraženim.
Testovi provjere i izolacija moraju omogućiti prag detekcije 103 do 104
stanica/ml resuspendiranog taloga, uključenog kao pozitivna kontrola u svakoj
seriji testova.
![](dodatni/348377.gif)

(1) Standardna veličina uzoraka je 200 gomolja, iako se postupak može provesti i
na manjim uzorcima ako nije na raspolaganju 200 gomolja.
(2) Metode ekstrakcije i koncentracije patogena opisane su u Dijelu 3.1.
(3) Ako su rezultati najmanje dva testa, koji se temelje na različitim biološkim
načelima, pozitivni, potrebno je provesti izolaciju i potvrdu. Provedite barem
jedan test provjere. Kada je rezultat tog testa negativan, smatra se da je taj
uzorak negativan. U slučaju da je rezultat tog testa pozitivan, potrebno je
provesti drugi ili više testova provjere, koji se temelje na različitim
biološkim načelima, kako bi se potvrdio pozitivan rezultat. Ako su rezultati
drugih ili ostalih testova negativni, smatra se da je taj uzorak negativan.
Daljnji testovi nisu potrebni.
(4) Test imunofluorescencije (IF).
Uvijek koristite poliklonska antitijela za IF provjeru, dodatna monoklonska
antitijela mogu omogućiti veću specifičnost (vidi Dio 4).
(5) PCR test.
Koristite validirane reagense i protokole za PCR (vidi Dio 6).
(6) FISH test.
Koristite validirane reagense i protokole (vidi Dio 5).
(7) Selektivna izolacija.
Korištenje MTNA ili NCP-88 hranjivih podloga i 1/100 razrijeđenja
resuspendiranog taloga je u mnogim slučajevima prikladna metoda za izravnu
izolaciju C. m. subsp. sepedonicus. Tipične kolonije mogu se dobiti 3 do 10 dana
nakon nasađivanja na hranjivu podlogu. Patogen se tada može pročistiti i
identificirati. Kako bi se u cijelosti iskoristile mogućnosti testa, potrebna je
pažljiva priprema jezgre pupka kako bi se izbjegle sekundarne bakterije s
gomolja krumpira, koje na hranjivoj podlozi konkuriraju bakteriji C. m. subsp.
sepedonicus i mogu prerasti patogen. Ako izolacija na hranjivoj podlozi ne
uspije, mora se napraviti iz biljaka koje su korištene u biotestu (vidi Dio 8).
(8) Biotest se koristi za izolaciju bakterije C. m. subsp. sepedonicus iz
ekstrakta selektivnim obogaćivanjem u patlidžanima (Solanum melongena). Test
zahtijeva optimalne uvjete inkubacije kao što je navedeno u ovoj metodi.
Bakterije koje inhibiraju bakteriju C. m. subsp. sepedonicus na MTNA ili NCP-88
hranjivim podlogama najvjerojatnije neće smetati u ovom testu (vidi Dio 7).
(9) Tipična morfologija kolonije opisana je u Dijelu 8.
(10) Uzgoj bakterijske kulture ili biotest mogu biti neuspješni zbog kompeticije
ili inhibicije saprofitnim bakterijama. Ako se testovima provjere dobiju jasno
pozitivni rezultati, a rezultati izolacije su negativni, ponovite testove
izolacije iz istog resuspendiranog taloga ili ponovite uzimanje provodnog tkiva
iz baznog dijela blizu stolona gomolja iz istog uzorka te, ako je potrebno,
testirajte dodatne uzorke.
(11) Pouzdana identifikacija čistih kultura vjerojatnih C. m. subsp. sepedonicus
postiže se provođenjem testova opisanih u Dijelu 9.
(12) Test patogenosti opisan je u Dijelu 10.
1.3. Shema za detekciju i identifikaciju bakterije Clavibacter michiganensis
ssp. sepedonicus u uzorcima biljaka krumpira bez simptoma
![](dodatni/348378.gif)

(1) Za preporučene veličine uzoraka vidi Dio 3.2.
(2) Metode ekstrakcije i koncentriranja patogena opisane su u Dijelu 3.2.
(3) Ako su rezultati najmanje dva testa, koji se temelje na različitim biološkim
načelima, pozitivni, potrebno je provesti izolaciju i potvrdu. Provedite barem
jedan test provjere. Kada je rezultat tog testa negativan, smatra se da je taj
uzorak negativan. U slučaju da je rezultat tog testa pozitivan, potrebno je
provesti drugi ili više testova provjere, koji se temelje na različitim
biološkim načelima, kako bi se potvrdio pozitivan rezultat. Ako su rezultati
drugih ili ostalih testova negativni, smatra se da je taj uzorak negativan.
Daljnji testovi nisu potrebni.
(4) Selektivna izolacija i tipična morfologija kolonije opisani su u Dijelu 8.
(5) IF test opisan je u Dijelu 4.
(6) PCR testovi opisani su u Dijelu 6.
(7) FISH test opisan je u Dijelu 5.
(8) Biotest opisan je u Dijelu 7.
(9) Uzgoj bakterijske kulture ili biotest mogu biti neuspješni zbog kompeticije
ili inhibicije saprofitnim bakterijama. Ako se testovima provjere dobiju jasno
pozitivni rezultati, a rezultati izolacije su negativni, ponovite testove
izolacije i, ako je potrebno, testirajte dodatne uzorke.
(10) Pouzdana identifikacija čistih kultura vjerojatnih C. m. subsp. sepedonicus
postiže se provođenjem testova opisanih u Dijelu 9.
(11) Test patogenosti opisan je u Dijelu 10.

2. VIZUALNI PREGLED ZA OTKRIVANJE SIMPTOMA PRSTENASTE TRULEŽI

2.1. Biljke krumpira
U europskim klimatskim uvjetima simptomi se rijetko pronalaze u polju i to često
tek na kraju sezone. Osim toga, simptomi su često prikriveni ili se mogu
zamijeniti s drugim bolestima, starenjem ili mehaničkim oštećenjima. Stoga
možemo vrlo lako previdjeti simptome prilikom pregleda u polju. Simptomi venuća
vrlo su različiti od onih smeđe truleži; venuće je obično polagano i u početku
ograničeno na rubove listova. Mladi zaraženi listovi često nastavljaju rasti,
iako manje u zaraženim dijelovima, te su listovi neobičnog oblika. Listovi zbog
blokade provodnog tkiva u donjem dijelu stabljike često imaju klorotične,
žuto-narančaste dijelove između lisnih žila. Zaraženi listići, listovi, čak i
stabljike mogu s vremenom odumrijeti. Često su listovi i gomolji samo manje
veličine. Povremeno su biljke zakržljale. Slike u boji različitih simptoma mogu
se pronaći na mrežnoj stranici:
http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/mai.
2.2. Gomolji krumpira
Najraniji simptomi su lagana staklenost ili prozirnost tkiva bez omekšanja oko
provodnog sustava, osobito u blizini pupka gomolja. Provodni prsten na pupku
može biti malo tamnije boje od uobičajene. Prvi lako uočljiv simptom je žućkasta
boja provodnog prstena, a kada se gomolj nježno stisne, iz žila izlaze male
količine sirastog materijala. Taj iscjedak sadrži milijune bakterija. Provodno
tkivo može posmeđiti i simptomi na gomolju u ovom stadiju slični su simptomima
smeđe truleži koju uzrokuje Ralstonia solanacearum. U početku, ti simptomi mogu
biti ograničeni na jedan dio provodnog prstena, ne nužno blizu pupka, i mogu se
postupno proširiti na cijeli prsten. Kako infekcija napreduje, dolazi do
propadanja provodnog tkiva; vanjska i unutarnja kora se mogu razdvojiti. U
naprednim stadijima infekcije, na površini gomolja pojavljuju se pukotine, koje
su često crvenkasto-smeđe po rubovima. Nedavno se u Europi pojavilo nekoliko
slučajeva u kojima je središte gomolja trunulo istovremeno s provodnim prstenom
što je dovelo do sekundarnog napada i unutarnjim stvaranjem šupljina i nekroza.
Sekundarni gljivični ili bakterijski napad može prikriti simptome i može biti
teško, čak nemoguće, razlikovati uznapredovale simptome prstenaste truleži od
drugih truleži gomolja. Mogući su netipični simptomi. Slike u boji različitih
simptoma mogu se pronaći na mrežnoj stranici:
<http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main>.

3. PRIPREMA UZORKA

3.1. Gomolji krumpira
Napomena:
– Standardna veličina uzorka je 200 gomolja po testu. Intenzivnije uzorkovanje
zahtijeva više testova na uzorca uzorcima te veličin broj gomolja u uzorku
dovest će do inhibicije ili će otežati tumačenje rezultata. Međutim, postupak se
može prikladno primijeniti za uzorke s manje od 200 gomolja, kada je na
raspolaganju manje gomolja.
– Validacija svih metoda za detekciju, koje su opisane u daljnjem tekstu,
temelji se na testiranju uzoraka od 200 gomolja.
– ekstrakt krumpira koji je opisan u daljnjem tekstu može se koristiti i za
detekciju uzročnika smeđe truleži krumpira, bakterije Ralstonia solanacearum.
Neobvezna obrada prije pripreme uzorka
Operite gomolje. Upotrijebite prikladna dezinfekcijska sredstva (spojeve klora
kada će se provesti PCR test kako bi se uklonila moguća DNK patogena) i
deterdžente između svakog uzorka. Osušite gomolje na zraku. Postupak pranja je
posebice koristan (ali ne obvezan) za uzorke s previše tla i ako će se provesti
PCR test ili direktna izolacija.
3.1.1. Čistim i dezinficiranim skalpelom ili nožem za povrće uklonite koru na
krajevima pupka gomolja tako da provodno tkivo bude vidljivo. Pažljivo izrežite
malu jezgru provodnog tkiva na kraju pupka pazeći da zahvatite što manje
okolnog, neprovodnog tkiva. (vidi mrežnu stranicu:
http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Napomena:
Odvojite sve gomolje s mogućim simptomima prstenaste truleži i testirajte
posebno.
Ako prilikom odstranjivanja jezgre pupka opazite moguće simptome prstenaste
truleži, gomolj treba vizualno pregledati nakon što se prereže blizu pupka.
Svaki prerezani gomolj s mogućim simptomima treba ostaviti na sobnoj temperaturi
dva dana da suberizira i pohraniti u karantenskim uvjetima (na 4 do 10 °C) sve
dok se ne dovrše svi testovi. Svi gomolji u uzorku (uključujući one sa sumnjivim
simptomima) trebaju se čuvati u skladu s člankom 5. Pravilnika.
3.1.2. Stavite jezgre pupaka u neupotrebljene posude za jednokratnu uporabu koje
se mogu zatvoriti i/ili hermetički zatvoriti (ako su posude već upotrebljavane,
moraju se temeljito očistiti i dezinficirati spojevima klora). Poželjno ih je
odmah obraditi. Ako to nije moguće, čuvajte ih u posudi bez dodatka pufera,
najdulje 72 sata u hladnjaku ili najdulje 24 sata na sobnoj temperaturi. Sušenje
i suberizacija jezgri, kao i rast saprofita tijekom pohrane mogu ometati
detekciju bakterije uzročnika prstenaste truleži.
3.1.3. Obradite jezgre pupaka jednim od sljedećih postupaka:
(a) dodati dovoljnu količinu (oko 40 ml) ekstrakcijskog pufera (Dodatak 3) da
pokrije jezgre pupaka i tresti na rotacijskoj tresilici (50 do 100 okretaja/min)
četiri sata na temperaturi ispod 24 °C ili 16 do 24 sata uz hlađenje,
ili
(b) homogenizirajte jezgre pupaka s dovoljnom količinom (oko 40 ml)
ekstrakcijskog pufera (Dodatak 3), bilo u miješalici (npr. Waring ili Ultra
Thurax) bilo drobljenjem u dobro zatvorenoj vrećici za maceraciju za jednokratnu
uporabu (npr. vrećice Stomacher ili Bioreba od čvrstog politena, 150 mm x 250
mm, sterilizirane zračenjem) koristeći gumeni bat ili prikladnu drobilicu (npr.
Homex).
Napomena:
Ako se uzorci homogeniziraju u miješalici, postoji velika opasnost od njihove
unakrsne kontaminacije. Poduzmite mjere opreza kako biste spriječili nastajanje
aerosola ili razlijevanje tijekom postupka ekstrakcije. Pobrinite se da za svaki
uzorak upotrijebite svježe sterilizirane nožiće i posude miješalice. Ako će se
provesti PCR test, spriječite prijenos DNK na spremnike ili drobilicu. Za PCR
test preporučuje se drobljenje u vrećicama za jednokratnu uporabu i korištenje
epruveta za jednokratnu uporabu.
3.1.4. Odlijte supernatant. Ako je previše mutan, razbistrite ga sporim
centrifugiranjem (na najviše 180 g 10 minuta na temperaturi od 4 do 10 °C) ili
vakuumskom filtracijom (40 do 100 µm), i dodatno isperite filtar ekstrakcijskim
puferom (oko 10 ml) (Dodatak 3).
3.1.5. Koncentrirajte bakterijsku frakciju centrifugiranjem na 7 000 g 15 minuta
(ili 10 000 g 10 minuta) na temperaturi od 4 do 10 °C te odlijte supernatant
pazeći pri tom da se ne pomiješa talog.
3.1.6. Resuspendirajte talog u 1,5 ml pufera za talog (Dodatak 3). Upotrijebite
500 µl za testiranje na C. m. subsp. sepedonicus, 500 µl za Ralstonia
solanacearum i 500 µl kao referentni materijal. Dodajte sterilni glicerol
konačnoj koncentraciji od 10 do 25 % (v/v) 500 µl referentnog alikvota i
preostalom testnom alikvotu, promiješajte i uskladištite na temperaturi od –16
do –24 °C (tjednima) ili na –68 do –86 °C (mjesecima). Testne alikvote čuvajte
na 4 do 10 °C tijekom testiranja.
Ne preporuča se višekratno zamrzavanje i otapanje.
Ako je potreban transport ekstrakta, osigurajte dostavu u prijenosnome hladnjaku
u roku od 24 do 48 sati.
3.1.7. Sve pozitivne kontrole i uzorci C. m. subsp. sepedonicus moraju se
odvojeno pripremiti i obraditi kako bi se izbjegla kontaminacija. To vrijedi za
stakalca za imunofluorescenciju kao i za sve ostale testove.
3.2. Biljke krumpira
Napomena:
Za detekciju latentnih populacija bakterije R. solanacearum preporučuje se
testiranje sastavljenih uzoraka. Postupak se može prikladno primijeniti na
sastavljene uzorke s najviše 200 dijelova stabljika. (Ako se provode sustavna
istraživanja, ona se moraju temeljiti na statistički reprezentativnom uzorku
biljne populacije koja se ispituje).
3.2.1. Čistim dezinficiranim nožem ili vrtlarskim škarama odrežite dio dug 1 do
2 cm s donjeg dijela svake stabljike, odmah iznad površine tla.
Kratko dezinficirajte dijelove stabljika 70 % etanolom i odmah posušite
papirnatim ručnikom.
Stavite dijelove stabljika u zatvorenu sterilnu posudu prema jednom od sljedećih
postupaka:
3.2.2. Obradite dijelove stabljika pomoću jednog od sljedećih postupaka:
(a) prekrijte ih dovoljnom količinom (približno 40 ml) ekstrakcijskog pufera
(Dodatak 3) i tresite na rotacijskoj tresilici (50 do 100 okretaja/min) četiri
sata na temperaturi ispod 24 °C ili 16 do 24 sata uz hlađenje,
ili
(b) odmah obradite drobljenjem u čvrstoj vrećici za maceraciju (npr. Stomacher
ili Bioreba) s odgovarajućom količinom ekstrakcijskog pufera (Dodatak 4)
koristeći gumeni bat ili prikladnu drobilicu (npr. Homex). Ako to nije moguće,
dijelove stabljika čuvajte u hladnjaku najdulje 72 sata ili na sobnoj
temperaturi najdulje 24 sata.
3.2.3. Nakon 15 minuta taloženja, izlijte supernatant.
3.2.4. Dodatno bistrenje ekstrakta ili koncentriranje bakterijske frakcije
obično nije potrebno, ali se može postići filtriranjem i/ili centrifugiranjem
kako je opisano u dijelu 3.1.4 do 3.1.6.
3.2.5. Podijelite čisti ili koncentrirani ekstrakt uzorka na dva jednaka dijela.
Jednu polovicu čuvajte na temperaturi od 4 do 10 °C tijekom testiranja, a drugu
polovicu pohranite s 10-25 % (v/v) sterilnog glicerola na temperaturi od –16 do
–24 °C (tjednima) ili na –68 do
–86 °C (mjesecima) u slučaju da je potrebno daljnje testiranje.

4. IF TEST

Načelo
Uporaba IF testa kao glavnog testa provjere preporuča se zbog njegove dokazane
dosljednosti pri postizanju zahtijevanih pragova detekcije.
Kada se IF test koristi kao glavni test provjere i ako je IF očitanje pozitivno,
mora se provesti PCR test ili FISH test kao drugi test provjere. Kada se IF test
koristi kao drugi test provjere i IF očitanje je pozitivno, potrebno je daljnje
testiranje prema dijagramu toka kako bi se dovršila analiza.
Napomena:
Uvijek koristite poliklonska antitijela kada se IF test koristi kao glavni test
provjere. U slučaju pozitivnog IF očitanja s poliklonskim antitijelima, daljnja
provjera uzorka s monoklonskim antitijelima može omogućiti veću specifičnost,
ali može biti manje osjetljiva.
Upotrijebite antitijela na referentni soj C. m. subsp. sepedonicus. Preporuča se
da se titar odredi za svaku novu seriju antitijela. Titar se definira kao
najveće razrijeđenje kod kojeg dolazi do optimalne reakcije pri testiranju
suspenzije koja sadrži 10⁵ do 09; do 10⁶ stanml homolognog soja C. m. subsp.
sepedonicus uz korištenje fluorescein-izotiocijanat (FITC) konjugiranih
antitijela u skladu s preporukama proizvođača. Nerazrijeđena poliklonska i
monoklonska antitijela trebaju imati IF titar najmanje 1:2000. Tijekom
testiranja treba koristiti radna razrijeđenja antitijela, koja su blizu ili
jednaka titru. Koristite validirana antitijela
(vidi mrežnu stranicu: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Test treba provesti na svježe pripremljenim ekstraktima uzoraka. On se, po
potrebi, može uspješno provesti i na ekstraktima koji su bili pohranjeni na
temperaturi od – 68 do – 86 °C s dodatkom glicerola. Glicerol se može ukloniti
dodavanjem 1 ml pufera za talog (Dodatak 4), ponovnim 15-minutnim
centrifugiranjem na 7000 g i resuspendiranjem u jednakom volumenu pufera za
talog. To je rijetko potrebno, naročito ako su uzorci plamenom fiksirani na
stakalca (vidi 2.2).
Za pozitivnu kontrolu pripremite odvojena stakalca s homolognim sojem ili nekim
drugim referentnim sojem bakterije C. m. subsp. sepedonicus, suspendiranim u
ekstraktu krumpira kako je navedeno u Dodatku 2 te po izboru u puferu.
Kao sličnu kontrolu na istom stakalcu trebalo bi, po mogućnosti, koristiti
prirodno zaraženo tkivo (održavano liofilizacijom ili zamrzavanjem na –16 do –
24 °C).
Za negativnu kontrolu mogu se upotrijebiti alikvoti ekstrakta uzoraka koji su u
ranijem testiranju pokazali negativan rezultat.
Koristite predmetna stakalca sa više jažica, po mogućnosti s 10 jažica promjera
najmanje 6 mm.
Kontrolni materijal testirajte jednako kao i uzorke.
4.1. Pripremite stakalca za testiranje prema jednom od sljedećih postupaka:
(i) Za taloge s relativno malo škroba:
U prvu jažicu pipetom odmjerite standardni volumen (15 µl je dovoljno za jažice
promjera 6 mm – za veće jažice povećajte volumen) razrjeđenja od 1/100
resuspendiranog taloga krumpira. Potom u ostale jažice u istom redu pipetom
odmjerite slični volumen nerazrijeđene suspenzije (1/1) taloga. Drugi se red
može koristiti za duplikat istog ili za drugi uzorak kako je prikazano na Slici
1.
(ii) Za ostale suspenzije taloga:
Pripremite decimalna razrjeđenja (1/10, 1/100) resuspendiranog taloga u puferu
za talog. U jedan red jažica pipetom odmjerite standardni volumen (15 µl je
dovoljno za jažice promjera 6 mm – za veće jažice povećajte volumen)
resuspendiranog taloga i svakog razrjeđenja. Drugi se red može koristiti kao
duplikat istog ili za drugi uzorak kao što je prikazano na Slici 2.
4.2. Ostavite da se kapljice osuše na sobnoj temperaturi ili ih zagrijavajte do
temperature od 40 do 45 °C. Fiksirajte bakterijske stanice na stakalce bilo
zagrijavanjem (15 minuta na 60 °C), provlačenjem kroz plamen, 95 %-tnim etanolom
ili prema posebnim uputama dobavljača antitijela.
Prije daljnjih testiranja, fiksirana se stakalca mogu, po potrebi, kratko
vrijeme (najviše do tri mjeseca) čuvati zamrznuta u suhom spremniku.
4.3. IF postupak:
(i) U skladu s postupkom za pripremu stakalaca za testiranje kako je opisan pod
4.1(i):
Pripremite niz dvostrukih razrjeđenja antitijela u IF puferu. Prva jažica mora
imati 1/2 titra (T/2), a ostale 1/4 titra (T/4), 1/2 titra (T/2), titar (T) i
dvostruki titar (2T).
(ii) U skladu s postupkom za pripremu stakalaca za testiranje kako je opisan pod
4.1(ii):
Pripremite radno razrjeđenje antitijela u IF puferu. Radno razrjeđenje utječe na
specifičnost.
![](dodatni/348379.gif)

4.3.1. Posložite stakalca na navlaženi upijajući papir. Svaku jažicu potpuno
prekrijte razrjeđenjem antitijela. Volumen antitijela koji se stavlja u pojedinu
jažicu mora biti jednak volumenu stavljenog ekstrakta.
Slijedite sljedeći postupak ako nema posebnih uputa dobavljača antitijela:
4.3.2. Inkubirajte stakalca na vlažnom papiru, pokrivena, 30 minuta na sobnoj
temperaturi (18 do 25 °C).
4.3.3. Otresite kapljice sa svakog stakalca i pažljivo ih isperite IF puferom.
Potopite ih 5 minuta u IF pufer-Tween (Dodatak 3) i nakon toga u IF pufer.
Pazite da ne dođe do stvaranja aerosola ili prijenosa kapljica jer bi to moglo
dovesti do unakrsne kontaminacije. Stakalca pažljivo osušite upijajućim papirom.
4.3.4. Posložite stakalca na navlaženi upijajući papir. Jažice prekrijte
razrijeđenim FITC konjugatom koji se koristi za određivanje titra. Volumen
konjugata nanesenog na jažice mora biti jednak volumenu nanesenog antitijela.
4.3.5. Inkubirajte stakalca na vlažnom papiru, pokrivena, 30 minuta na sobnoj
temperaturi (18 do 25 °C).
4.3.6. Otresite kapljice konjugata sa stakalca. Isperite i operite kako je
prethodno opisano (4.3.3).
Pažljivo osušite.
4.3.7. Na svaku jažicu pipetom nanesite 5-10 µl 0,1 M glicerola s fosfatnim
puferom (Dodatak 3) ili sredstvo protiv izbljeđivanja koje je dostupno na
tržištu te stavite pokrovno stakalce.
4.4. Očitavanje IF testa:
4.4.1. Pregledajte pripremljena stakalca pod epifluorescentnim mikroskopom s
odgovarajućim filtrima za ekscitaciju FITC-a, uz uljnu imerziju i povećanje od
500-1000 x. Pregledajte svaku jažicu preko dva međusobno okomita promjera i duž
vanjskog ruba. Za uzorke u kojima je vidljiv mali broj stanica ili ih uopće nema
pregledajte najmanje 40 mikroskopskih vidnih polja.
Najprije pregledajte stakalce s pozitivnom kontrolom. Stanice moraju snažno
fluorescirati i moraju biti potpuno obojene na utvrđenom titru antitijela ili
radnog razrjeđenja. U slučaju da kod obojenosti dođe do odstupanja, IF test se
mora ponoviti (Dio 4).
4.4.2. Pregledajte da li su u jažicama vidljive jasno fluorescirajuće stanice
karakteristične morfologije za bakteriju C. m. subsp. sepedonicus (vidi mrežnu
stranicu: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Intenzitet fluorescencije mora biti jednak ili bolji kao i kod pozitivnog
kontrolnog soja pri jednakom razrjeđenju antitijela. Stanice s nepotpunim
obojenjem ili sa slabom fluorescencijom moraju se zanemariti.
Test se mora ponoviti ako se sumnja na kontaminaciju. Sumnjati se može ako sva
stakalca u seriji pokazuju pozitivne stanice zbog kontaminacije pufera ili ako
su pozitivne stanice pronađene (izvan jažica) na površini stakalca.
4.4.3. Postoji nekoliko problema vezanih uz specifičnost testa
imunofluorescencije. U koncentriranom ekstraktu krumpirovih pupaka ili dijelova
stabljika mogu se nalaziti populacije fluorescirajućih stanica netipične
morfologije i saprofitne bakterije s kojima dolazi do unakrsne reakcije i koje
su po veličini i morfologiji slične bakteriji C. m. subsp. sepedonicus.
4.4.4. U obzir uzmite samo fluorescirajuće stanice tipične veličine i
morfologije u titru ili radnom razrjeđenju antitijela kako je opisan u točki u
4.3.
4.4.5. Tumačenje očitanja IF testa:
(i) Ako nađete jasno fluorescirajuće stanice karakteristične morfologije,
odredite prosječni broj tipičnih stanica po mikroskopskom vidnom polju i
izračunajte broj tipičnih stanica po ml resuspendiranog taloga (Dodatak 4).
Očitanje IF testa je pozitivno za uzorke koji imaju najmanje 5 x 10³ tipičnih
stanica po ml resuspendiranog taloga. Uzorak se smatra potencijalno
kontaminiranim i potrebno je daljnje testiranje.
(ii) Očitanje IF testa je negativno za uzorke koji imaju manje od 5 x 10³
stanica po ml resuspendiranog taloga te se uzorak smatra negativnim. Nije
potrebno daljnje testiranje.

5. FISH TEST

Načelo
Kada se FISH test koristi kao prvi test provjere i ako se njime dobije pozitivan
rezultat, mora se provesti IF test kao drugi obvezni test provjere. Ako se FISH
test koristi kao drugi test provjere i ako se njime dobije pozitivan rezultat,
za postavljanje konačne dijagnoze treba obaviti daljnje testiranje prema
dijagramu.
Napomena:
Koristite validirane oligo-probe specifične za bakteriju C. m. subsp.
sepedonicus (Dodatak 7). Preliminarna tnarna testiranja ovom metodoju omogućiti
ponovljivu detekciju najmanje 10³ do 10⁴ stanica bakterije C. m. subsp.
sepedonicus po ml koje su dodane ekstraktima uzoraka koji su u ranijim
testiranjima bili negativni.
Sljedeći je postupak najbolje provesti na svježe pripremljenim ekstraktima
uzoraka, ali se može uspješno primijeniti i na ekstraktu uzorka koji je bio
pohranjeni s glicerolom na temperaturi od – 16 do – 24 °C ili od – 68 do – 86
°C.
Za negativnu kontrolu upotrijebite alikvote ekstrakta uzoraka koji su u ranijem
testiranju na C. m. subsp. sepedonicus bili negativni.
Za pozitivnu kontrolu pripremite suspenzije koje sadrže 10⁵ do 10⁶ stanica/ml
0,01 M fosfatnog pufera (PB) bakterije C. m. subsp. sepedonicus (npr. soj NCPPB
4053, ili PD 406) iz kulture stare 3 – 5 dana (za pripremu vidi Dodatak 2).
Pripremite odvojena stakalca za pozitivnu kontrolu s homolognim sojem ili nekim
drugim referentnim sojem bakterije C. m. subsp. sepedonicus, suspendiranim u
ekstraktu krumpira, kao što je navedeno u Dodatku 2.
Korištenje eubakterijske oligo-probe obilježene FITC-om omogućuje kontrolu
procesa hibridizacije jer će se obojiti sve eubakterije koje su prisutne u
uzorku.
Kontrolni materijal testirajte jednako kao i uzorke.
5.1. Fiksiranje ekstrakta krumpira
Sljedeći protokol temelji se na Wullings i sur., (1998):
5.1.1. Pripremite otopinu za fiksiranje (vidi Dodatak 7).
5.1.2. Pipetom odmjerite 100 µl svakog ekstrakta uzorka u Eppendorf epruvetu te
centrifugirajte 8 minuta na 7000 g.
5.1.3. Uklonite supernatant i resuspendirajte talog u 500 µl fiksativa
pripremljenog prije najviše 24 sata. Promiješajte na vrtložnoj miješalici i
inkubirajte jedan sat u hladnjaku.
Alternativni fiksativ je 96 % etanol. Pri tome je potrebno resuspendirati talog
iz koraka 5.1.2 u 50 µl 0,01M PB i 50 µl 96 % etanola. Promiješajte na vrtložnoj
miješalici i inkubirajte na 4 °C 30 do 60 minuta.
5.1.4. Centrifugirajte 8 minuta na 7000 g, uklonite supernatant te
resuspendirajte talog u 75 µl 0,01M PB (vidi Dodatak 3).
5.1.5. U jažice čistog stakalca nanesite 16 µl fiksiranih suspenzija kako je
prikazano na Slici 3. Na svako stakalce nanesite nerazrijeđena dva različita
uzorka i upotrijebite 10 µl za pripremanje razrjeđenja 1:100 (u 0,01 M PB).
Preostalu fiksiranu otopinu uzorka (49 µl) možete pohraniti na – 20 °C nakon
dodavanja jednog volumena 96 %-tnog etanola. Ako FISH test trebate ponoviti,
centrifugiranjem uklonite etanol i dodajte jednaki volumen 0,01 PB (promiješati
na vrtložnoj miješalici).
Slika 3. Prikaz stakalca za FISH test
![](dodatni/348380.gif)

5.1.6. Stakalca osušite na zraku (ili u sušioniku na 37 °C) te ih fiksirajte
provlačenjem kroz plamen.
Na ovom se koraku postupak može prekinuti i nastaviti sljedeći dan. Stakalca se
trebaju pohraniti na sobnoj temperaturi u suhom prostoru bez prašine.
5.2. Predhibridizacija i hibridizacija
5.2.1. Pripremite otopinu lizozima koja sadrži 10 mg lizozima (Sigma L–6876) u
10 ml pufera (100 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0). Ta se otopina može
pohraniti, ali se smije samo jednom odmrznuti i otopiti. Dobro prekrijte svaki
uzorak s približno 50 µl otopine lizozima i inkubirajte 10 minuta na sobnoj
temperaturi. Zatim samo jednom umočite objektna stakalca u demineraliziranu vodu
i pažljivo osušite filtar papirom.
Alternativno umjesto lizozima dodajte 50 µl 40 do 400µg ml–1 proteinaze K u
puferu (20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl2, pH 7,4) na svaku jažicu i inkubirajte na 37
°C 30 minuta.
5.2.2. Dehidrirajte stanice uzastopnim jednominutnim uranjanjem u 50 %-tni, 80
%-tni i 90 %-tni etanol. Stakalca postavite na držač i osušite na zraku.
5.2.3. Pripremite vlažnu komoru za inkubaciju tako što ćete dno hermetičke
kutije prekriti upijajućim ili filtar papirom namočenim u 1x hybmix (Dodatak 7).
Kutiju prethodno inkubirajte u hibridizacijskoj pećnici na 55 °C najmanje 10
minuta.
5.2.4. Pripremite 45 µl hibridizacijske otopine po stakalcu (Dodatak 7) i
prethodno inkubirajte pet minuta na 55 °C.
5.2.5. Stavite stakalca na grijaću podlogu na 45 °C i nanesite po 10 µl
hibridizacijske otopine na svaku od četiri jažice.
5.2.6. Stavite dva pokrovna stakalca (24 × 24 mm) na svako stakalce pazeći pri
tom da u jažicama ne ostane zraka. Stavite stakalca u prethodno zagrijanu vlažnu
komoru i hibridizirajte preko noći u pećnici na 55 °C.
5.2.7. Pripremite tri posude sa 1 L ultra čiste vode, 1 L 1x hybmix (334 ml 3x
hybmix i 666 ml ultra čiste vode) i 1 L 1/2x hybmix (167 ml 3x hybmix i 833 ml
ultra čiste vode). Svaku posudu prethodno inkubirajte u vodenoj kupelji na 55
°C.
5.2.8. Skinite pokrovna stakalca, a predmetna stakalca stavite na držač.
5.2.9. Višak probe isperite inkubiranjem 15 minuta na 55 °C u posudi s 1x
hybmixa.
5.2.10. Prenesite držač stakalaca u otopinu za pranje (1/2 x hybmix) i
inkubirajte još 15 minuta.
5.2.11. Stakalca nakratko uronite u ultra čistu vodu te ih stavite na filtar
papir. Višak vlage uklonite tako što ćete površinu lagano pokriti filtar
papirom. U svaku jažicu pipetom nanesite 5 do 10 µl zaštitne otopine protiv
izbljeđivanja (npr. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA ili ekvivalentna)
te cijelo predmetno stakalce pokrijte velikim pokrovnim stakalcem (24 x 60 mm).
5.3. Očitavanje FISH testa
5.3.1. Stakalca odmah pregledajte epifluorescentnim mikroskopom uz uljnu
imerziju, s povećanjem od 630 ili 1000 x. S filtrom prikladnim za
fluorescein-izotiocijanat (FITC), eubakterijske stanice (uključujući većinu gram
negativnih stanica) u uzorku vide se kao fluorescentno zelene. Uporabom filtra
za tetrametilrodamin-5-izotiocijanat stanice bakterije C. m. subsp. sepedonicus,
obojene s Cy 3, vide se kao fluorescentno crvene. Usporedite morfologiju stanice
s morfologijom pozitivnih kontrola. Stanice moraju biti jasno flourescentne i u
cijelosti obojene. Ako dođe do odstupanja u obojenosti, FISH test (Dio 9.4) se
mora ponoviti. Pregledajte svaku jažicu duž dva međusobno okomita promjera i duž
vanjskog ruba. Za uzorke u kojima je vidljiv mali broj stanica ili ih uopće nema
pregledajte najmanje 40 mikroskopskih vidnih polja.
5.3.2. Pregledajte da li su u jažicama vidljive jasno fluorescirajuće stanice
karakteristične morfologije za bakteriju C. m. subsp. sepedonicus (vidi mrežnu
stranicu: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Intenzitet fluorescencije mora biti jednak ili bolji nego na soju pozitivne
kontrole. Stanice koje nisu u potpunosti obojene ili su slabe fluorescencije ne
smiju se uzeti u obzir.
5.3.3. Test se mora ponoviti ako se sumnja na kontaminaciju. Sumnjati se može
ako sva stakalca u seriji pokazuju pozitivne stanice zbog kontaminacije pufera
ili ako su pozitivne stanice pronađene (izvan jažica) na površini stakalca.
5.3.4. Postoji nekoliko problema vezanih uz specifičnost FISH testa. U
koncentriranom ekstraktu krumpirovih pupaka i dijelova stabljika mogu se
pojaviti, iako rjeđe nego kod IF testa, populacije fluorescirajućih stanica
netipiče morfologije i saprofitne bakterije koje su po veličini i morfologiji
slične bakteriji C. m. subsp. sepedonicus.
5.3.5. U obzir uzmite samo fluorescirajuće stanice tipične veličine i
morfologije, vidi 5.3.2.
5.3.6. Tumačenje rezultata testa FISH:
(i) Rezultati FISH testa smatraju se valjanim ako se primjenom FITC filtra opaze
zeleno fluorescirajuće stanice čija je veličina i morfologija tipična za
bakteriju C. m. subsp. sepedonicus i ako se primjenom filtra za rodamin opaze
crveno fluorescirajuće stanice, i to u svim pozitivnim kontrolama i niti jednoj
negativnoj kontroli. Ako se pronađu jasno fluorescirajuće stanice
karakteristične morfologije, odredite prosječni broj tipičnih stanica po
mikroskopskom vidnom polju i izračunajte broj tipičnih stanica po ml
resuspendiranog taloga (Dodatak 4). Uzorci s najmanje 5 x 10³ tipič; tipičnih stanica
po ml resuspen taloga smatraju se potencijalno kontaminiranima. Potrebni
su daljnji testovi. Uzorci s manje od 5 x 10³ tipičnih stanica po ml
resuspendiranog taloga smatraju se negativnima.
(ii) FISH Test je negativan ako se primjenom filtra za rodamin ne uoče snažno
fluorescirajuće crvene stanice čija je veličina i morfologija tipična za
bakteriju C. m. subsp. sepedonicus, pod uvjetom da se primjenom filtra za
rodamin uoče tipične snažno fluorescirajuće crvene stanice u preparatima
pozitivne kontrole.

6. PCR TEST

Načela
Kada se PCR test koristi kao glavni test provjere i rezultat je pozitivan, mora
se provesti IF test izolacija kao drugi obvezni test provjere. Kada se PCR test
koristi kao drugi test provjere i rezultat je pozitivan, za postavljanje konačne
dijagnoze potrebno je daljnje testiranje prema dijagramu.
Korištenje ove metode kao glavnog testa provjere preporučuje se samo ako ste
stručno osposobljeni.
Napomena:
Preliminarno testiranje ovom metodom treba omogućiti ponovljivu detekciju 10³ do
10⁴ stanica bakterije C. m. subsp. sepedonicus po ml, koje su dodane ekstraktima
uzoraka koji su u prethodnim testiranjima dali negativni rezultat. Kako bi se
postigao najveći stupanj osjetljivosti i specifičnosti u svim laboratorijima,
mogu biti potrebni pokusi za optimizaciju metode.
Koristite validirane reagense i protokole za PCR. Poželjno je odabrati metodu s
internom kontrolom.
Poduzmite odgovarajuće mjere opreza kako biste izbjegli kontaminaciju uzorka
ciljnom DNK. Da bi se spriječila kontaminacija ciljnom DNK, PCR test trebali bi
obavljati iskusni stručnjaci, u specijaliziranim laboratorijima za molekularnu
biologiju.
Negativne kontrole (za ekstrakciju DNK i PCR postupak) treba uvijek obraditi kao
zadnje uzorke u postupku kako bi se vidjelo je li došlo do prijenosa DNK.
U PCR test treba uključiti sljedeće negativne kontrole:
– ekstrakt uzorka koji je u ranijem testiranju na C. m. subsp. sepedonicus bio
negativan,
– pufer korišten za ekstrakciju bakterije i DNK iz uzorka,
– reakcijsku smjesu za PCR.
Treba uključiti sljedeće pozitivne kontrole:
– alikvote resuspendiranih taloga u koje je dodana bakterija C. m. subsp.
sepedonicus (za pripremu vidi Dodatak 2),
– suspenziju u vodi od 10⁶ stanica po ml C. m. subsp. sepedonicus virulentnog
izolata (npr. NCPPB 2140 ili NCPPB 4053),
– ako je moguće, u PCR testu upotrijebite i DNK ekstrahiranu iz pozitivnih
kontrolnih uzoraka.
Da bi se izbjegla moguća kontaminacija, pozitivne kontrole pripremite prostorno
odvojeno od uzoraka za testiranje.
Ekstrakti uzoraka moraju sadržavati što je moguće manje tla. Ako namjeravate
primjenjivati PCR protokole, u nekim bi slučajevima, stoga, bilo preporučljivo
oprati gomolje prije pripreme ekstrakta.
6.1. Metode pročišćavanja DNK
Koristite uzorke za pozitivnu i negativnu kontrolu kako je gore opisano.
Pripremite kontrolni materijal na jednaki način kao i uzorke.
Postoje različite metode za pročišćavanje ciljne DNK iz kompleksnih uzoraka,
kojima se uklanjaju inhibitori PCR reakcije i drugih enzimskih reakcija te se u
ekstraktu uzorka koncentrira ciljna DNK.
Sljedeća je metoda optimizirana za korištenje s validiranom PCR metodom koja je
navedena u Dodatku 6.
6.1.(a) Metoda prema Pastriku (2000)
1. Pipetom odmjerite 220 µl pufera za lizu [100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH
8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)] u Eppendorf epruvetu od 1,5 ml.
2. Dodajte 100 µl ekstrakta uzorka i stavite u blok za zagrijavanje ili vodenu
kupelj na 95 °C 10 minuta.
3. Stavite epruvetu na led na pet minuta.
4. Dodajte 80 µl osnovne otopine lizozima (50 mg lizozima po ml u 10 mM Tris
HCl, pH 8,0) i inkubirajte na 37 °C 30 minuta.
5. Dodajte 220 µl Easy DNA® otopine A (Invitrogen), dobro promiješajte na
vrtložnoj miješalici i inkubirajte na 65 °C 30 minuta.
6. Dodajte 100 µl Easy DNA® otopine B (Invitrogen), snažno miješajte na
vrtložnoj miješalici sve dok precipitat ne bude slobodno kružio po epruveti i
dok uzorak ne bude jednoliko viskozan.
7. Dodajte 500 µl kloroforma te miješajte na vrtložnoj miješalici dok se
viskoznost ne smanji i smjesa postane homogena.
8. Centrifugirajte na 15 000 g 20 minuta na 4 °C da se odijele faze i stvori
interfaza.
9. Prenesite gornju fazu u novu Eppendorfovu epruvetu.
10. Dodajte 1 ml 100 % etanola (–20 °C), kratko promiješajte na vrtložnoj
miješalici i inkubirajte na ledu 10 minuta.
11. Centrifugirajte na 15 000 g 20 minuta na 4 °C te uklonite etanol.
12. Dodajte 500 µl 80 % etanola (–20 °C) i promiješajte okretanjem epruvete.
13. Centrifugirajte na 15 000 g 10 minuta na 4 °C, sačuvajte talog, a etanol
uklonite.
14. Ostavite talog da se suši na zraku ili u vakuumskoj centrifugi (DNA speed
vac).
15. Resuspendirajte talog u 100 µl sterilne ultra čiste vode i ostavite na
sobnoj temperaturi najmanje 20 minuta.
16. Pohranite na –20 °C sve dok nije potreban za PCR.
17. Centrifugiranjem izdvojite mogući bijeli precipitat te za PCR upotrijebite 5
µl supernatanta koji sadrži DNK.
6.1.(b) Druge metode
Mogu se primijeniti druge metode za ekstrakciju DNK (npr. Qiagen DNeasy Plant
Kit) ako su dokazano jednako učinkovite u pročišćavanju DNK iz kontrolnih
uzoraka koji sadrže 10³ do 10⁴ patogenih stanica po ml.
6.2. PCR
6.2.1. Pripremite kalupe za testiranje i kontrolu za PCR prema validiranim
protokolima (Dodatak 6). Pripremite jedno decimalno razrjeđenje ekstrakta DNK iz
uzorka (1:10 u ultra čistoj vodi).
6.2.2. U nekontaminiranom prostoru pripremite odgovarajuću reakcijsku smjesu za
PCR prema objavljenim protokolima (Dodatak 6). Validirani protokol za multipleks
PCR uključuje unutarnju kontrolu.
6.2.3. Dodajte 5 µl ekstrakta DNK na 25 µl reakcijske smjese u sterilne epruvete
za PCR.
6.2.4. Uključite i uzorak za negativnu kontrolu koji sadrži samo reakcijsku
smjesu za PCR te, umjesto uzorka, dodajte isti izvor ultra čiste vode koji je
korišten za pripremu reakcijske smjese za PCR.
6.2.5. Stavite epruvete u uređaj za PCR (thermal cycler) koji je korišten u
preliminarnom testiranju te pokrenite optimizirani PCR program (Dodatak 6).
6.3. Analiza PCR produkata
6.3.1. Elektroforezom u agaroznom gelu razdvojite umnožene PCR produkte.
Najmanje 12 µl reakcijske smjese umnožene DNK iz svakog uzorka, pomiješane s 3
µl pufera za nanošenje (Dodatak 6), nanesite u 2,0 %-tni (w/v) agarozni gel u
tris-acetat EDTA puferu (TAE) (Dodatak 6), uz napon od 5 do 8 V po cm.
Upotrijebite odgovarajući DNK standard, npr. 100 bp ljestvicu.
6.3.2. Obojite elektroforetske pruge DNK u gelu etidijevim bromidom (0,5 mg/l)
30 do 45 minuta poduzimajući pri tomu odgovarajuće mjere opreza za rad s ovim
mutagenom.
6.3.3. Obojeni gel pregledajte na kratkovalnom UV transiluminatoru (npr. λ = 302
nm) i tražite umnožene fragmente očekivane dužine (Dodatak 6) te ih
dokumentirajte.
6.3.4. Za svaki novi nalaz/slučaj provjerite autentičnost umnoženog PCR produkta
analizom restrikcijskim enzimima preostale umnožene DNK uzorka i to inkubacijom
pri optimalnoj temperaturi i u optimalnom vremenu s odgovarajućim enzimom i
puferom (vidi Dodatak 6). Pocijepane fragmente razdvojite elektroforezom u
agaroznom gelu kako je gore navedeno te nakon bojenja etidijevim bromidom na UV
transilumintoru promatrajte karakteristični restrikcijski obrazac i usporedite
ga s pozitivnom kontrolom prije i poslije cijepanja.
Tumačenje rezultata PCR testa:
PCR test je negativan ako u testiranom uzorku nije vidljiv PCR produkt očekivane
dužine koji je specifičan za bakteriju C. m. subsp. sepedonicus, ali je vidljiv
u svim pozitivnim kontrolnim uzorcima (kod multipleks PCR-a s početnicama za
unutarnju kontrolu koje su specifične za biljku domaćina: u testiranom se uzorku
mora umnožiti drugi prodgi produkt PCR-a očekivane veličine
PCR test je pozitivan ako je vidljiv PCR produkt koji je specifičan za bakteriju
C. m. subsp. sepedonicus i koji je očekivane dužine i restrikcijskog obrasca,
pod uvjetom da nije umnožen u nijednom uzorku negativne kontrole. Pouzdanu
potvrdu pozitivnog rezultata možete dobiti i ponavljanjem testa s drugim parom
početnica (Dio 9.3).
Napomena:
Može se sumnjati da je došlo do inhibicije PCR reakcije ako se iz uzorka
pozitivne kontrole koji sadrži C. m. subsp. sepedonicus u vodi dobije očekivani
produkt, a iz pozitivnih kontrola s C. m. subsp. sepedonicus u ekstraktu
krumpira dobiju negativni rezultati. U multipleks PCR protokolima s unutarnjim
kontrolama, inhibicija reakcije je indicirana ako nije dobiven niti jedan od dva
produkta.
Ako se iz jedne ili više negativnih kontrola dobije očekivani produkt, može se
sumnjati da je došlo do kontaminacije.

7. BIOTEST

Napomena:
Preliminarno testiranje ovom metodom treba omogućiti ponovljivu detekciju 10³ do
10⁴ jedinica koje stvaraju kolonije (CFU) bakterije C. m. subsp. sepedonicus po
ml, a koje su dodane ekstraktima uzoraka koji su u ranijem testiranju bili
negativni (za pripremu vidi Dodatak 2).
Najveća osjetljivost detekcije može se očekivati ako se koriste svježe
pripremljeni ekstrakti uzoraka te optimalni uvjeti rasta. Međutim, ova se metoda
može uspješno primijeniti i s ekstraktima koji su bili pohranjeni s glicerolom
na temperaturi od – 68 do – 86 °C.
Neke sorte patlidžana su odlične kao selektivni medij za obogaćivanje za rast C.
m. subsp. sepedonicus, čak i kad nema simptoma, a ujedno su i odlične kao
domaćini za test potvrde.
Uvjeti rasta trebaju biti optimalni kako bi se smanjio rizik od lažno negativnih
rezultata.
Za detalje o uzgoju vidi Dodatak 8.
7.1. Na patlidžane rasporedite sav preostali alikvot resuspendiranog taloga
ostavljen za testiranje iz dijela 3.1.6 ili 3.2.5 jednom od metoda koje su
navedene niže u tekstu (7.3 ili 7.4). Koristite samo biljke u stadiju dva do tri
prava lista, do potpune razvijenosti trećeg pravog lista. Kako bi se u
potpunosti iskoristio resuspendirani talog te osigurala učinkovita inokulacija,
za postupke navedene niže u tekstu bit će potrebno 15 do 25 biljaka patlidžana
po jednom uzorku.
7.2. Nemojte zalijevati patlidžane jedan do dva dana prije inokulacije kako bi
se smanjio turgor.
7.3. Inokulacija zarezivanjem
7.3.1. Držeći biljku među prstima, pipetom nanesite kapljicu (oko 5-10 µl)
resuspendiranog taloga na stabljiku između supki i prvog lista.
7.3.2. Sterilnim skalpelom napravite dijagonalni rez, dug oko 1 cm i dubok oko
2/3 debljine stabljike, počevši od nanešene kapljice resuspendiranog taloga.
7.3.3. Čvrsto zatvorite rez sterilnim vazelinom iz štrcaljke.
7.4. Inokulacija injekcijom
Inokulirajte stabljike patlidžana neposredno iznad supki injekcijom s potkožnom
iglom (najmanje 23G). Uzorak rasporedite na testne patlidžane.
7.5. Za pozitivnu kontrolu, inokulirajte 5 biljaka suspenzijom u vodi od 10⁵ do
10⁶ stanica po ml poznate kulture C. m. subsp. sepedonicus i, kada je moguće,
ekstraktom prirodno zaraženih tkiva gomolja (vidi Dio 4) istom metodom
inokulacije (7.3 ili 7.4).
7.6. Za negativnu kontrolu, inokulirajte 5 biljaka sterilnim puferom za talog
istom metodom inokulacije (7.3 ili 7.4).
7.7. Uzgajajte biljke u karantenskim prostorijama do četiri tjedna na 18 do 24
°C, uz dovoljnu količinu svjetla i visoku vlagu (70 do 80 %) i primjereno
zalijevajte kako bi spriječili nakupljanje vode ili uvenuće zbog nedostatka
vode. Stanice C. m. subsp. sepedonicus ugibaju na temperaturama iznad 30 °C, a
optimalna temperatura je 21 °C. Kako bi izbjegli unakrsnu kontaminaciju, biljke
pozitivne i negativne kontrole uzgajajte na jasno odvojenim stolovima u
stakleniku ili policama u komori za rast ili, u slučaju da je prostor ograničen,
pobrinite se da su strogo odvojene između pojedinih postupaka. Ako se biljke za
različite uzorke moraju uzgajati blizu jedna drugoj, razdvojite ih prikladnim
zaslonima. Kod prihrane, zalijevanja, pregledavanja i svakog drugog postupka s
biljkama dobro pazite da ne dođe do unakrsne kontaminacije. Od ključne je
važnosti da u staklenicima i komorama za uzgoj ne bude nikakvih insekata jer oni
mogu prenijeti bakteriju s uzorka na uzorak.
7.8. Nakon jednog tjedna redovito provjeravajte pojavu simptoma. Prebrojite
biljke koje pokazuju simptome. C. m. subsp. sepedonicus uzrokuje venuće lišća
kod patlidžana koje može početi kao uvenulost rubova ili između žila listova.
Uvenulo tkivo može u početku izgledati tamnozeleno ili prošarano, ali postaje
blijedo prije nego što postane nekrotično. Uvenulost između lisnih žila često
izgleda masno, kao da su natopljeni vodom. Nekrotično tkivo često ima
svjetložuti rub. Biljke ne ugibaju uvijek; što je razdoblje prije nego što se
simptomi razviju duže, to je veća mogućnost preživljavanja. Biljke mogu prerasti
zarazu. Mlade biljke patlidžana mnogo su osjetljivije na niske populacije C. m.
subsp. sepedonicus nego starije biljke; zbog toga se koriste biljke u ili
neposredno prije faze tri prava lista.
Uvenuće može biti uzrokovano populacijama drugih bakterija ili gljivica koje su
prisutne u ekstraktu tkiva gomolja. To su: Ralstonia solanacearum, Erwinia
carotovora subsp. carotovora i E. carotovora subsp. atroseptica, Erwinia
chrysanthemi, Phoma exigua var. foveata, kao i velike populacije saprofitskih
bakterija. Posebice Erwinia chrysanthemi može uzrokovati simptome na listovima i
venuće koje je vrlo slično simptomima C. m. subsp. sepedonicus. Jedina razlika
je crnjenje stabljika u slučaju infekcija bakterijom Erwinia chrysanthemi. Druga
venuća mogu se razlikovati od onih koje uzrokuje C. m. subsp. sepedonicus zato
što cijeli listovi ili cijele biljke vrlo brzo venu. Može se pripremiti i
bojenje po Gramu: time će se razlučiti C. m. subsp. sepedonicus od Erwinia spp.
7.9. Čim primijetite simptome kod patlidžana, potrebno je izvršiti ponovnu
izolaciju, koristeći dijelove uvenulog tkiva lišća ili tkiva stabljike (vidi
3.1.3 za maceraciju tkiva). Površinski dezinficirajte lišće i stabljike
patlidžana tako da ih obrišete 70 %-tnim etanolom. Provedite IF ili PCR test na
soku patlidžana i izolirajte na prikladnoj (selektivnoj) hranjivoj podlozi (vidi
Dio 8). Može se pripremiti i bojenje po Gramu (Dodatak 9). Identificirajte
pročišćene kulture vjerojatne C. m. subsp. sepedonicus i potvrdite patogenost
(vidi Dio 9 i 10).
7.10. U određenim okolnostima, osobito kad uvjeti za rast nisu optimalni, moguće
je da C. m. subsp. sepedonicus postoji kao latentna infekcija u patlidžanima čak
i nakon razdoblja inkubacije do 4 tjedna. Ako se simptomi ne primijete nakon 4
tjedna, provedite IF/PCR test na sastavljenom uzorku dijelova stabljike od 1 cm
svake testne biljke, uzetih iznad mjesta inokulacije. Ako je test pozitivan,
potrebno je provesti ponovnu izolaciju na prikladnoj (selektivnoj) hranjivoj
podlozi, prema postupku iz Dijela 8. Identificirajte pročišćene kulture
vjerojatne C. m. subsp. sepedonicus i potvrdite patogenost (vidi Dio 9 i 10).
Tumačenje rezultata biotesta.
Rezultati biotesta su valjani ako biljke pozitivne kontrole pokazuju tipične
simptome, ako se iz tih biljaka može ponovo izdvojiti bakterija, i ako se na
negativnim kontrolama ne pronađu nikakvi simptomi.
Biotest je negativan ako testne biljke nisu zaražene bakterijom C. m. subsp.
sepedonicus, pod uvjetom da je bakterija C. m. subsp. sepedonicus detektirana u
pozitivnim kontrolama.
Biotest je pozitivan ako su testne biljke zaražene bakterijom C. m. subsp.
sepedonicus.

8. IZOLACIJA C. m. subsp. sepedonicus

Napomena:
Dijagnoza se može potvrditi samo ako se C. m. subsp. sepedonicus izolira i zatim
identificira (vidi Dio 9), te ako se potvrdi patogenost (Dio 10). Iako je C. m. C. m.
subsp. sepedonicus zahtjevnizam, može se izolirati iz simptomatskog
tkiva.
Međutim, mogu ga prerasti brzo rastuće saprofitske bakterije te su stoga
izolacije izravno iz ekstrakta tkiva gomolja ili stabljike teške (Dio 3.1.6 ili
3.2.5). Selektivnom hranjivom podlogom i prikladno razrijeđenom otopinom
resuspendiranog taloga iz jezgre pupka ili stabljika krumpira moguća je izravna
izolacija C. m. subsp. sepedonicus.
Izolacije je potrebno izvršiti iz svih gomolja ili dijelova stabljike krumpira
sa simptomima te iz testnih patlidžana kod kojih nisu primijećeni simptomi ali
je IF/PCR test iz sastavljenog uzorka bio pozitivan (vidi Dio 7.10). Maceriranje
stabljika patlidžana treba se, prema potrebi, provoditi kao što je navedeno u
Dijelu 3.1.3.
Za pozitivne kontrole, pripremite decimalna razrijeđenja suspenzije 10⁶ cfu po
ml C. m. subsp. sepedonicus (npr. NCPPB 4053 ili PD 406). Kako bi izbjegli svaku
mogućnost kontaminacije, pripremite pozitivne kontrole potpuno odvojeno od
uzoraka koji se testiraju.
Za svaku svježe pripremljenu seriju selektivne hranjive podloge potrebno je
provjeriti njezinu prikladnost za rast patogena prije nego što se upotrijebi za
testiranje rutinskih uzoraka.
Testirajte kontrolni materijal na isti način kao i uzorak ili uzorke.
8.1. Uzgoj na selektivnoj hranjivoj podlozi
8.1.1. Iz 100 µl alikvota iz uzorka resuspendiranog taloga krumpira ili biljnog
soka patlidžana pripremite decimalna razrijeđenja u puferu za talog (Dodatak 3).
8.1.2. Izolacija iz nerazrijeđenog resuspendiranog taloga krumpira obično ne
uspije zbog teškog uzgoja C. m. subsp. sepedonicus i kompeticije saprofita. S
obzirom da je bakterija obično prisutna u visokim populacijama u zaraženom
tkivu, saprofiti se obično mogu odstraniti razrjeđivanjem, dok patogen ostaje.
Stoga se preporuča razmazati 100 µl iz svakog uzorka (kod upotrebe petrijevih
zdjelica promjera 90 mm – prilagodite količinu za petrijeve zdjelice drugih
veličina), 1/100 do 1/10 000 razrijeđene suspenzije na hranjivu podlogu MTNA ili
na NCP-88 (Dodatak 5), tehnikom razmaza.
Napomena:
Alternativna strategija je da razmažete početni alikvot po 100 µl
resuspendiranog taloga krumpira na prvu podlogu, a zatim istim štapićem
napravite razmaz na drugu podlogu, pri čemu na drugu podlogu nanosite ostatke
ekstrakta s prve podloge. Na kraju to ponovite s trećom podlogom, čime dobivate
sličan efekt razrjeđenja.
8.1.3. Inkubirajte podloge u mraku na 21 do 23 °C.
8.1.4. Prva provjera podloga i procjena kolonija sličnih C. m. subsp.
sepedonicus, u usporedbi s kontrolnim podlogama, je nakon 3 dana, a daljnje
procjene nakon 5, 7, te eventualno 10 dana.
8.2. Pročišćavanje sumnjivih kolonija
Napomena:
Kolonije slične C. m. subsp. sepedonicus treba precijepiti na hranjivu podlogu
YGM ako će se koristiti za inokulaciju patlidžana i/ili daljnju identifikaciju;
to se treba učiniti prije nego podloge postanu previše zaraštene, odnosno
najbolje nakon tri do pet dana.
8.2.1. Razmažite kolonije slične C. m. subsp. sepedonicus na jednu od sljedećih
hranjivih podloga: (sastavi su navedeni u Dodatku 5):
hranjivi agar s dodatkom dekstroze (koristi se samo za precjepljivanje)
agar s dodatkom kvasca, peptona i glukoze,
agar s dodatkom ekstrakta kvasca i mineralnih soli.
Inkubirajte na 21 °C do 24 °C do 10 dana.
C. m. subsp. sepedonicus sporo raste, obično stvara kremaste, kupolaste kolonije
sa šiljatim vrhom unutar 10 dana. Fotografije tipičnih kolonija C. m. subsp.
sepedonicus (vidi mrežnu stranicu:
http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
8.2.2. Ponovno razmažite kako bi postigli čistoću.
Stopa rasta se poboljšavaju precjepljivanjem. Tipične kolonije su
kremasto-bijele ili poput bjelokosti, ponekad žute, zaokružene, glatke,
povišene, konveksno-kupolaste, sluzavo-tekuće, s cijelim rubovima i obično 1 do
3 mm u promjeru.
Jednostavno bojenje po Gramu (Dodatak 9) može pomoći pri odabiru kolonija za
daljnje testiranje.
8.2.3. Identificirajte vjerojatne kulture (vidi Dio 9) i provedite test
patogenosti (vidi Dio 10).

9. IDENTIFIKACIJA

Identificirajte čiste kulture vjerojatnih izolata C. m. subsp. sepedonicus
uporabom najmanje dva od sljedećih testova koja se temelje na različitim
biološkim načelima.
Prema potrebi, uključite poznate referentne sojeve za svaki test.
9.1. Nutritivni i enzimatski testovi za identifikaciju
Odredite sljedeća fenotipska svojstva koja su univerzalno prisutna ili odsutna
kod bakterije C. m. subsp. sepedonicus, prema metodama iz Lelliott i Stead
(1987.), Klement i sur. (1990.), Schaad (2001.), nepoznati autor (1987.).
Sve se hranjive podloge trebaju inkubirati na 21 °C i pregledati nakon šest
dana. Ako ne dođe do rasta, inkubirajte do 20 dana.
U sve testove treba uključiti poznatu kontrolu C. m. subsp. sepedonicus.
Nutritivni i fiziološki testovi trebaju se provesti koristeći kulture s
hranjivog agara. Morfološke usporedbe trebaju se napraviti iz kultura na
hranjivom agaru s dodatkom dekstroze.

|  |  |
| --- | --- |
| *Testovi* | *Očekivani rezultati* |
| Test oksidacije/fermentacije (O/F) | inertan ili slabo oksidativan |
| Aktivnost oksidaze | – |
|width="171" valign="top" style="width: 128.55pt; height: 3.0pt; border-left: 1.0pt solid black; border-right: 1.0pt solid black; border-top: medium none; border-bottom: 1.0pt solid black; padding-left: 2.25pt; padding-right: 2.25pt; padding-top: 2.85pt; padding-bottom: 2.85pt">

Rast na 37 °C

– |

| Aktivnost ureaze | – |
| Hidroliza eskulina | + |
| Hidroliza škroba | – ili slaba |
| Tolerancija 7% otopine NaCl | – |
| Stvaranje indola | – |
| Aktivnost katalaze | + |
| Stvaranje H2S | – |
| Iskorištavanje citrata | – |
| Likvefikacija želatine | – |
| Kiselina iz glicerola | – |
| Kiselina iz laktoze | – ili slaba |
| Kiselina iz ramnoze | – |
| Kiselina iz salicina | – |
| Bojenje po Gramu (Dodatak 9) | + |

9.2. IF test
(a) Pripremite suspenziju od približno 10⁶ stanica po ml u IF puferu (Dodatak
3).
(b) Pripremite dvostruka razrjeđenja otopine prikladnog seruma.
(c) Primijenite IF postupak (Dio 4).
(d) IF test je pozitivan ako je IF titar kulture jednak titru pozitivne
kontrole.
9.3. PCR test
(a) Pripremite suspenziju od približno 10⁶ stanica po ml u ultra čistoj vodi.
(b) Zagrijte 100 µl stanične suspenzije u zatvorenim epruvetama u bloku za
zagrijavanje ili vreloj vodenoj kupelji četiri minute na 100 °C. Prema potrebi,
dodavanje svježe pripremljenog NaOH do konačne koncentracije 0,05M može pomoći
lizi stanica. Uzorci se mogu potom, do uporabe, pohraniti na – 16 do – 24 °C.
(c) Upotrijebite prikladne PCR postupke za umnožavanje specifičnih fragmenata C.
m. subsp. sepedonicus (npr. Pastrik, 2000; vidi Dodatak 4; Li i de Boer, 1995;
Mills i sur., 1997; Pastrik i Rainey, 1999; Schaad i sur., 1999.)
(d) Identifikacija C. m. subsp. sepedonicus je pozitivna ako su PCR produkti
iste veličine i imaju iste polimorfizme dužina restrikcijskih fragmenata kao i
pozitivni kontrolni soj.
9.4. Test FISH
(a) Pripremite suspenziju od približno 10⁶ stanica po ml u ultra čistoj vodi.
(b) Primijenite FISH postupak (Dio 5).
(c) FISH test je pozitivan ako su postignute iste reakcije iz kulture i
pozitivne kontrole.
9.5. Profiliranje masnih kiselina (FAP)
(a) Uzgajajte kulturu na triptikaza-soja-agaru (Oxoid) 72 sata na
21 °C (+/– 1 °C).
(b) Primijenite prikladan FAP postupak (Janse, 1991; Stead, 1992).
(c) FAP test je pozitivan ako je profil vjerojatne kulture identičan profilu
pozitivne kontrole. Prisutnost karakterističnih masnih kiselina: 15:1 Anteiso A,
15:0 Iso, 15:0 Anteiso, 16:0 Iso, 16:0 i 17:0 Anteiso, u velikoj mjeri ukazuje
na C. m. subsp. sepedonicus. Drugi rodovi kao što su Curtobacterium,
Arthrobacter i Micrococcus također imaju neke od ovih kiselina, ali 15:1 Anteiso
A je rijetka kiselina u tim bakterijama, ali se pojavljuje u svim bakterijama
Clavibacter spp. između 1 do 5 %. Kod C. m. sC. m. subsp. sepedonicus vrijednostbično oko 5 %.
9.6. BOX-PCR
(a) Pripremite suspenziju od približno 10⁶ stanica po ml u ultra čistoj vodi.
(b) Primijenite test u skladu s postupkom (Smith i sur., 2001).

10. TEST POTVRDE

Test patogenosti mora se provesti kao konačna potvrda dijagnoze C. m. subsp.
sepedonicus i za procjenu virulentnosti kultura identificiranih kao C. m. subsp.
sepedonicus:
10.1. Pripremite inokulum od približno 10⁶ stanica po ml iz trodnevnih kultura
izolata koji se testira i prikladan soj pozitivne kontrole C. m. subsp.
sepedonicus.
10.2. Inokulirajte stabljike 5 do 10 mladih sadnica patlidžana u fazi 3 prava
lista (Dio 7.3 ili 7.4).
10.3. Inkubirajte na 18 do 24 °C uz dovoljnu količinu svjetla i visoku relativnu
vlagu te prikladno zalijevajte kako bi izbjegli nakupljanje vode ili stres od
suše (Dio 7.7). Kod čistih kultura, tipično bi se venuće trebalo pojaviti u roku
od dva tjedna, ali biljke koje ne pokazuju simptome (vidi Dio 7.8) nakon tog
vremena trebaju se inkubirati do tri tjedna na temperaturama koje su povoljne za
rast patlidžana, ali ne više od 25 °C (Dodatak 8). Ako simptomi nisu prisutni ni
nakon tri tjedna, kultura se ne može potvrditi kao patogeni oblik C. m. subsp.
sepedonicus.
10.4. Izolirajte iz biljaka sa simptomima tako da odstranite dio stabljike 2 cm
iznad mjesta inokulacije. Usitnite i suspendirajte u maloj količini sterilne
destilirane vode ili 50 mM fosfatnog pufera (Dodatak 3). Izolirajte iz
suspenzije razmazom na MTNA i YPGA (Dodatak 5), inkubirajte tri do pet dana na
21 do 23 °C i pregledajte jesu li narasle tipične kolonije bakterije C. m.
subsp. sepedonicus.

Dodatak 1

Laboratoriji koji su uključeni u optimizaciju
i validaciju protokola

|  |  |  |
| --- | --- | --- |
| Laboratorij1 | Lokacija | Država |
| Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit | Beč i Linz | Austrija |
| Departement Gewasbescherming | Merelbeke | Belgija |
| Plantedirektoratet | Lyngby | Danska |
| Central Science Laboratory | York | Engleska |
| Scottish Agricultural Science Agency | Edinburgh | Škotska |
| Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Unité de Bactériologie | Angers | Francuska |
| Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terre | Le Rheu | Francuska |
| Biologische Bundesanstalt | Kleinmachnow | Njemačka |
| Pflanzenschutzamt Hannover | Hannover | Njemačka |
| State Laboratory | Dublin | Irska |
| Plantenziektenkundige Dienst | Wageningen | Nizozemska |
| Norwegian Crop Research Institute, Plant Protection Centre | Aas | Norveška |
| Direcção-Geral de Protecção das Culturas | Lisbon | Portugal |
| Nacionalni institut za biologijo | Ljubljana | Slovenija |
| Centro de Diagnostico de Aldearrubia | Salamanca | Španjolska |
| 1 Zontakt sa znanstvenicima: vidi mrežnu stranicu  <http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main> | | |

Dodatak 2

Priprema pozitivnih i negativnih kontrola za osnovne testove provjere, PCR/IF
i FISH
Uzgojite 72-satnu kulturu virulentnog soja bakterije C. m. subsp. sepedonicus
(NCPPB 4053 ili PD 406) na MTNA osnovnoj hranjivoj podlozi i suspendirajte u 10
mM fosfatnom puferu da dobijete gustoću stanica od približno 1 do 2 × 108 cfu po
ml. To je obično slabo mutna suspenzija optičke gustoće od 0,20 na 600 nm.
Odstranite jezgre pupaka iz 200 gomolja krumpira sorte s bijelom korom za koje
je poznato da je nisu zaraženi bakterijom C. m. subsp. sepedonicus.
Obradite pupke uobičajenom metodom i resuspendirajte talog u 10 ml.
Pripremite 10 sterilnih mikroepruveta od 1,5 ml s 900 µl resuspendiranog taloga.
U prvu mikroepruvetu dodajte 100 µl suspenzije C. m. subsp. sepedonicus.
Promiješajte na vrtložnoj miješalici.
U sljedećih pet mikroepruveta pripremite decimalna razrjeđenja.
Ovih šest mikroepruveta s kontaminiranim ekstraktom koristite za pozitivnu
kontrolu. Četiri mikroepruvete s nekontaminiranim ekstraktom koristite za
negativnu kontrolu. U skladu s tim, označite mikroepruvete.
Pripremite alikvote od 100 µl u mikroepruvetama od 1,5 ml tako da dobijete devet
kopija svakog kontrolnog uzorka. Do uporabe ih pohranite na – 16 do – 24 °C.
Prisutnost i količinu C. m. subsp. sepedonicus u kontrolnim uzorcima potvrdite
najprije IF testom.
Za PCR test, obavite ekstrakciju DNK na pozitivnim i negativnim kontrolnim
uzorcima za svaku seriju uzoraka za testiranje.
Za IF i FISH testove, obavite testove na pozitivnim i negativnim kontrolnim
uzorcima za svaku seriju uzoraka za testiranje.
Kod IF, FISH i PCR testova, bakterija C. m. subsp. sepedonicus se mora
detektirati u najmanje 10⁶ i 10⁴ stanica/ml pozitivnih kontrola i niti u jednoj
negativnoj kontroli.

Dodatak 3

Puferi za postupke testiranja
OPĆENITO: Neotvoreni sterilizirani puferi mogu se čuvati do jedne godine.
1. Puferi za postupak ekstrakcije
1.1. Ekstrakcijski pufer (50 mM fosfatni pufer, pH 7,0)
Ovaj se pufer koristi za ekstrakciju bakterije iz biljnih tkiva homogenizacijom
ili tresenjem.
Na₂HPO₄ (bezvodni) 4,26 g
KH2PO4 2,72 g
Destilirana voda 1,00 L
Otopite sastojke, provjerite pH i sterilizirajte u autoklavu na 121 °C 15
minuta.
Mogu biti korisni i sljedeći dodatni sastojci:

|  |  |  |
| --- | --- | --- |
|  | Namjena | Količina (po L) |
| Pahuljice Lubrol | Deflokulant\* | 0,5 g |
| DC silikon protiv pjenjenja | sredstvo protiv pjenjenja \* | 1,0 ml |
| Tetranatrijev pirofosfat | Antioksidans | 1,0 g |
| Polivinilpirolidon-40000 (PVP-40)<>  Vezanje PCR inhibitora | 50 g |
| \*Za uporabu kod metode ekstrakcije homogenizacijom | | |

1.2. Pufer za talog (10 mM fosfatni pufer, pH 7,2)
Ovaj se pufer koristi za resuspendiranje i razrjeđivanje ekstrakta jezgre pupaka
gomolja krumpira, nakon koncentriranja u talog centrifugiranjem.
Na₂HPO₄.12H₂O 2,7 g
NaH₂PO₄.2H₂O 0,4 g
Destilirana voda 1,00 L
Otopite sastojke, provjerite pH i sterilizirajte u autoklavu na 121 °C 15
minuta.
2. Puferi za IF test
2.1. IF pufer (10 mM fosfatni pufer s dodatkom soli (PBS), pH 7,2)
Ovaj se pufer koristi za razrjeđivanje antitijela.
Na₂HPO₄.12H₂O 2,7 g
NaH₂PO₄.2H₂O 0,4 g
NaCl 8,0 g
Destilirana voda 1.0 L
Otopite sastojke, provjerite pH i sterilizirajte u autoklavu na 121 °C 15
minuta.
2.2. IF pufer – Tween
Ovaj se pufer koristi za ispiranje stakalca.
IF puferu dodajte 0,1 % Tween 20.
2.3. Glicerol s fosfatnim puferom, pH 7,6
Ovaj se pufer koristi kao tekućina za prekrivanje jažica u IF testu kako bi se
pojačala fluorescencija.
Na₂HPO₄.12H₂O 3,2 g
NaH₂PO₄.2H₂O 0,15 g
Glicerol 50 ml
Destilirana voda 100 ml
Pokrivne otopine protiv izblijeđivanja dostupne su na tržištu, npr. Vectashield®
(Vector Laboratories) ili Citifluor® (Leica).
Dodatak 4
Određivanje stupnja kontaminacije u IF i FISH testovima
1. Odredite srednji broj tipičnih fluorescentnih stanica po vidnom polju (c)
2. Izračunajte broj tipičnih fluorescentnih stanica po jažici mikroskopskog
stakalca (C)
C = c × S/s
gdje je
S = površina jažice stakalca sa više jažica, i
s = površina polja objektiva.
s = πi2/4G2K2
gdje je
i = koeficijent polja (varira od 8 do 24 ovisno o tipu okulara)
K = koeficijent tubusa (1 ili 1,25)
G = povećanje objektiva (100x, 40x itd.).
3. Izračunajte broj tipičnih fluorescentnih stanica po ml resuspendiranog taloga
(N)
N = C × 1000/y × F
gdje je
y = volumen resuspendiranog taloga na svakom oknu, i
F = faktor razrjeđenja resuspendiranog taloga.
Dodatak 5
Hranjive podloge za izolaciju i uzgoj C. m. subsp. sepedonicus
(a) Opće hranjive podloge
Hranjivi agar (NA)
Hranjivi agar (Difco) 23,0 g
Destilirana voda 1,0 L
Otopite sastojke i sterilizirajte u autoklavu na 121 °C 15 minuta.
Hranjivi agar s dekstrozom (NDA)
Difco bacto hranjivi agar koji sadrži 1 % D(+) glukoze (monohidrata).
Sterilizirajte u autoklavu na 115 °C 20 minuta.
Agar s kvascem, peptonom i glukozom (YPGA)
Ekstrakt kvasca (Difco) 5,0 g
Bacto pepton (Difco) 5,0 g
D(+) glukoza (monohidrat) 10,0 g
Agar Bacto (Difco) 15,0 g
Destilirana voda 1,0 L
Otopite sastojke i sterilizirajte u autoklavu na 121 °C 15 minuta.
Agar s ekstraktom kvasca i mineralnim solima (YGM)
Bacto ekstrakt kvasca (Difco) 2,0 g
D(+) glukoza (monohidrat) 2,5 g
K₂HPO₄ 0,25 g
KH₂HPO₄ 0,25 g
MgSO₄.7H₂O 0,1 g
MnSO₄.H₂O 0,015 g
NaCl 0,05 g
FeSO₄.7H₂O 0,005 g
Bacto agar (Difco) 18 g
Destilirana voda 1,0 L
Otopite sastojke i sterilizirajte 0,5 litara volumena hranjive podloge u
autoklavu na 121 °C 15 minuta.
(b) Validirane selektivne hranjive podloge
MTNA
Osim ako nije drugačije navedeno, svi sastojci su iz BDH.
Ekstrakt kvasca (Difco) 2,0 g
Manitol 2,5 g
K₂HPO₄ 0,25 g
KH₂PO4 0,25 g
NaCl 0,05 g
MgSO₄.7H₂O 0,1 g
MnSO₄.H₂O 0,015 g
FeSO₄.7H₂O 0,005 g
Agar (Oxoid br. 1) 16,0 g
Destilirana voda 1,0 L
Otopite sastojke, podesite pH na 7,2. Nakon sterilizacije u autoklavu (na 121 °C
15 minuta) i hlađenja na 50 °C, dodajte antibiotike: trimetoprim 0,06 g,
nalidiksičnu kiselinu 0,002 g, amfotericin B 0,01 g.
Osnovne otopine antibiotika: trimetoprim (Sigma) i nalidiksična kiselina (Sigma)
(oboje na 5 mg/ml), u 96 %-tnom metanolu, amfotericin B (Sigma) (1 mg/ml) u
dimetilsulfoksidu. Osnovne otopine su sterilizirane filtriranjem.
Napomena:
Rok trajanja osnovne hranjive podloge je tri mjeseca. Nakon što se dodaju
antibiotici, rok trajanja je jedan mjesec kada se čuva u hladnjaku.
NCP-88
Hranjivi agar (Difco) 23 g
Ekstrakt kvasca (Difco) 2 g
D-manitol 5 g
K₂HPO₄ 2 g
KH₂PO₄ 0,5 g
MgSO₄.7H₂O 0,25 g
Destilirana voda 1,0 L
Otopite sastojke, podesite pH na 7,2. Nakon sterilizacije u autoklavu (na 121 °C
15 minuta) i hlađenja na 50 °C, dodajte sljedeće antibiotike: Polimiksin B
sulfat (Sigma) 0,003 g, nalidiksičnu kiselinu (Sigma) 0,008 g, Cikloheksimid
(Sigma) 0,2 g.
Pripremite osnovne otopine antibiotika: nalidiksična kiselina u 0,01 M NaOH,
cikloheksimid u 50 % etanolu, polimiksin B sulfat u destiliranoj vodi. Osnovne
otopine su sterilizirane filtriranjem.
Napomena:
Rok trajanja osnovne hranjive podloge je tri mjeseca. Nakon što se dodaju
antibiotici, rok trajanja je jedan mjesec kada se čuva u hladnjaku.
Dodatak 6
Validirani protokoli i reagensi za PCR
Napomena:
Preliminarna testiranja trebaju omogućiti ponovljivu detekciju 10³ do 10⁴
stanica bakterije C. m. subsp. sepedonicus po ml ekstrakta uzorka.
Preliminarna testiranja ne smiju dati lažno pozitivne rezultate kod određenih
odabranih bakterijskih sojeva.
1. Protokol za multipleks PCR s unutarnjom PCR kontrolom (Pastrik, 2000)
1.1. Oligonukleotidne početnice
Uzvodna početnica PSA-1 5´- ctc ctt gtg ggg tgg gaa aa -3´
Nizvodna početnica PSA-R 5´- tac tga gat gtt tca ctt ccc c -3´
Uzvodna početnica NS-7-F 5´- gag gca ata aca ggt ctg tga tgc -3´
Nizvodna početnica NS-8-R 5’- tcc gca ggt tca cct acg ga -3’
Očekivana dužina umnoženog produkta iz kalupa DNK C. m. subsp. sepedonicus = 502
pb (par početnica PSA).
Očekivana dužina umnoženog produkta iz 18S rRNA unutarnje kontrole = 377 pb (par
početnica NS).
1.2. Reakcijska smjesa za PCR

|  |  |  |
| --- | --- | --- |
| Reagens | Količina po reakciji | Konačna  koncentracija |
| Sterilna ultra čista voda | 15,725 µl |  |
| 10x PCR pufer1 (15 mM MgCl2) | 2,5 µl | 1x (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (frakcija V) (10 %) | 0,25 µl | 0,1 % |
| Smjesa d-NTP (20 mM) | 0,125 µl | 0,1 mM |
| Početnica PSA-1 (10 µM) | 0,5 µl | 0,2 µM |
| Početnica PSA-R (10 µM) | 0,5 µl  0,2 µM |
| Početnica NS-7-F (10 µM)2 | 0,1 µl | 0,04 µM |
| Početnica NS-8-R (10 µM)2 | 0,1 µl | 0,04 µM |
| Taq polimeraza (5 U/µl)1 | 0,2 µl | 1,0 U |
| Volumen uzorka | 5,0 µl |  |
| Ukupni volumen | 25,0 µl |  |

1Metoda je bila validirana Taq polimerazom iz Perkin Elmer (AmpliTaq ili Gold) i
Gibco BRL.
2Koncentracija početnica NS-7 F i NS-8-R je bila optimizirana za ekstrakciju
jezgre pupka krumpira metodom homogenizacije i pročišćavanja DNK prema Pastriku
(2000) (vidi dio 6.1.a i 6.2). Ponovna optimizacija koncentracija reagensa bit
će potrebna ako se upotrijebi ekstrakcija tresenjem ili druga metoda izolacije
DNK.
1.3. Uvjeti PCR reakcije
Izvedite sljedeći program:
1 ciklus: (i) 3 minute na 95 °C (denaturacija kalupa DNK)
10 ciklusa: (ii) 1 minutu na 95 °C (denaturacija kalupa DNK)
(iii) 1 minuta na 64 °C (sparivanje početnica i kalupa)
(iv) 1 minuta na 72 °C (produljivanje kopije)
25 ciklusa: (v) 30 sekundi na 95 °C (denaturacija kalupa DNK)
(vi) 30 sekundi na 62 °C (sparivanje početnica i kalupa)
(vii) 1 minuta na 72 °C (produljivanje kopije)
1 ciklus: (viii) 5 minuta na 72 °C (konačno produljivanje)
(ix) držati na 4 °C.
Napomena:
Ovaj je program optimiziran za uporabu sorabu s uređajem za PCR MJ Research0.
Kod uporabe s drugim modelima vjerojatno će biti potrebno prilagoditi trajanje
ciklusa (ii), (iii) (iv), (v), (vi) i (vii).
1.4. Analiza produkta umnožavanja restrikcijskim enzimom
PCR produkti umnoženi iz DNK bakterije C. m. subsp. sepedonicus daju
karakteristični obrazac polimorfizma duljine restrikcijskih fragmenata s enzimom
Bgl II nakon inkubacije na 37 °C 30 minuta. Restrikcijski fragmenti dobiveni iz
specifičnoga fragmenta C. m. subsp. sepedonicus su veličine 282 bp i 220 bp.
2. Priprema pufera za nanošenje
2.1. Bromfenol plavilo (10 %-tna osnovna otopina)
Bromfenol plavilo 5 g
Destilirana voda (bidestilirana) 50 ml
2.2. pufer za nanošenje
Glicerol (86 %) 3,5 ml
Bromfenol plavilo (5.1) 300 µl
Destilirana voda (bidestilirana) 6,2 ml
3. 10x Tris acetatni EDTA pufer (TAE), pH 8,0
Tris pufer 48,4 g
Ledena octena kiselina 11,42 ml
EDTA (dinatrijeva sol) 3,72 g
Destilirana voda 1,00 L
Razrijedite do 1× prije uporabe.
Dostupan je i na tržištu (npr. Invitrogen ili jednakovrijedan).
Dodatak 7
Validirani reagensi za FISH test
1. Oligo-probe
Specifična proba za Cms CMS-CY3-01: 5´- ttg cgg ggc gca cat ctc tgc acg -3´
Nespecifična eubakterijska proba EUB-338-FITC: 5´- gct gcc tcc cgt agg agt -3´
2. Otopina za fiksiranje
(UPOZORENJE! OTOPINA ZA FIKSIRANJE SADRŽI PARAFORMALDEHID KOJI JE TOKSIČAN.
NOSITE RUKAVICE I NE UDIŠITE GA. PREPORUČUJE SE RADITI U DIGESTORU.)
(i) Zagrijte 9 ml vode za molekularnu biologiju (npr. ultra čiste vode) na oko
60 °C i dodajte 0,4 g paraformaldehida. Paraformaldehid se otapa nakon što
dodate 5 kapi 1N NaOH i promiješate na magnetskoj miješalici.
(ii) Podesite pH na 7,0 dodajući 1 ml 0,1M fosfatnog pufera (PB; pH 7,0) i 5
kapi 1N HCl. Indikatorskim papirom provjerite vrijednost pH i ako je potrebno
podesite je pomoću HCl ili NaOH.
(UPOZORENJE! U OTOPINAMA S PARAFORMALDEHIDOM NE UPOTREBLJAVAJTE pH METAR)
(iii) Profiltrirajte otopinu kroz membranski filter od 0,22 µm te je do daljnje
uporabe pohranite na 4 °C i zaštitite od prašine.
(iv) Napomena:
Alternativna otopina za fiksiranje: 96 %-tni etanol.
3. 3x Hybmix
NaCl 2,7 M
Tris-HCl 60 mM (pH 7,4)
EDTA (sterilizirana filtriranjem i u autoklavu) 15 mM
Razrijedite do 1x prema potrebi.
4. Otopina za hibridizaciju
1x Hybmix
Natrijev dodecil sulfat (SDS) 0,01 %
Proba EUB 338 5 ng/μl
Proba CMSCY301 5 ng/μl
Pripremite količine otopine za hibridizaciju prema izračunima u Tablici 1. Za
svako stakalce (s 2 različita uzorka u duplikatu) treba 90 μl otopine za
hibridizaciju.
Tablica: Predložene količine za pripremanje smjese za hibridizaciju

|  |  |  |
| --- | --- | --- |
|  | 2 stakalca | 8 stakalca |
| Sterilna ultra čista voda | 50,1 | 200,4 |
| 3x hybmix | 30,0 | 120,0 |
| 1 % SDS | 0,9 | 3,6 |
| Proba EUB 338 (100 ng/μl) | 4,5 | 18,0 |
| Proba CMSCY301 (100 ng/μl) | 4,5 | 18,0 |
| Ukupni volumen (μl) | 90,0 | 360,0 |

Napomena:
Pohranite sve otopine koje sadrže oligo-probe osjetljive na svjetlost u mraku na
–20 °C. Zaštitite od direktne sunčeve svjetlosti ili električne rasvjete tijekom
uporabe.
5. 0,1M fosfatni pufer, pH 7,0
Na₂HPO₄ 8,52 g
KH₂PO₄ 5,44 g
Destilirana voda 1,00 L
Otopite sastojke, provjerite pH i sterilizirajte u autoklavu na 121 °C 15
minuta.
Dodatak 8
Uzgoj patlidžana
Posijte sjeme patlidžana (Solanum melongena) u pasteriziranom kompostu za sjeme.
Presadite sadnice s potpuno razvijenim supkama (10 do 14 dana) u pasteriziran
kompost za lončanice.
Patlidžani se trebaju uzgajati u stakleniku pod sljedećim uvjetima:
Dužina dana: 14 sati ili prirodna dužina dana, ako je dulja;
Temperatura: dan: 21 do 24 °C,
noć: 15 °C.
Osjetljive sorte patlidžana: »Black Beauty«,
»Long Tom«,
»Rima«,
»Balsas«
Dobavljač: vidi mrežnu stranicu
http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main
Dodatak 9
Postupak bojenja po Gramu (Huckerova modifikacija) (Doetsch, 1981.)
Otopina kristal violeta
Otopite 2 g kristal violeta u 20 ml 95 %-tnog etanola.
Otopite 0,8 g amonij-oksalata u 80 ml destilirane vode.
Pomiješajte dvije otopine.
Lugolova otopina
Jod 1 g
Kalij-jodid 2 g
Destilirana voda 300 ml
Usitnite zajedno koristeći tučak i mužar. Dodajte vodi i promućkajte da se otopi
u zatvorenoj posudi.
Otopina safranina za protubojenje
Osnovna otopina:
Safranin O 2,5 g
95 %-tni etanol 100 ml
Promiješajte i pohranite.
Razrijedite: 1:10 da bi dobili radnu otopinu.
Postupak bojenja
1. Pripremite razmaze, posušite na zraku i fiksirajte zagrijavanjem.
2. Prelijte stakalce otopinom kristal violeta jednu minutu.
3. Kratko isperite tekućom vodom.
4. Prelijte Lugolovom otopinom jednu minutu.
5. Isperite tekućom vodom i posušite filtar-papirom.
6. Uklonite boju 95 %-tnim etanolom, koji se dodaje kap po kap, dok se sva boja
ne ukloni ili uronite razmaz na 30 sekundi i lagano tresite.
7. Isperite tekućom vodom i posušite filtar-papirom.
8. Prelijte otopinom safranina 10 sekundi.
9. Isperite tekućom vodom i posušite filtar-papirom.
Gram pozitivne bakterije se oboje ljubičasto-plavo; Gram negativne bakterije se
oboje ružičasto-crveno.
LITERATURA
1. Anonymous, 1987. Scheme of the detection and diagnosis of the ring rot
bacterium Corynebacterium sepedonicum in batches of potato tubers. Commission of
the European Communities, Luxembourg. Publ EUR 11288 EN, 21 str.
2. Bradbury, J. F., 1970. Isolation and preliminary study of bacteria from
plants. Rev. Pl. Path., 49, 213-218.
3. Dinesen, I. G., 1984. The extraction and diagnosis of Corynebacterium
sepedonicum from diseased potato tubers. EPPO Bull. 14 (2), 147-152.
4. Doetsch, R. N., 1981. Determinative methods of light microscopy. In: Manual
of methods for general bacteriology, American Society for Microbiology,
Washington, 21-23.
5. Hugh, R. and Leifson, F., 1953. The taxonomic significance of fermentative
versus oxidative metabolism of carbohydrates by various gram-negative bacteria.
J. Bact., 66, 24-26.
6. Janse, J. D., 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas
solanacearum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and
Applied Microbiology 14; 335-345.
7. Janse, J. D. and J. Van Vaerenbergh. The interpretation of the EC method for
the detection of latent ring rot infections (Corynebacterium sepedonicum) in
potato. EPPO Bull., No 17, 1987, str. 1-10.
8. Jansing, H. and K. Rudolph, 1998. Physiological capabilities of Clavibacter
michiganensis ssp. sepedonicus and development of a semi-selective medium.
Journal of Plant Diseases and Protection, 105, 590-601.
9. Kovacs, N., 1956. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase
reaction. Nature, Lond., 178, 703.
10. Klement Z.; Rudolph, K and D. C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology.
Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 str.
11. Lelliott, R. A., 1966. The plant pathogenic coryneform bactem bacteria. J. appl.
Bact., 29, 1
12. Lelliott, R. A., E. Billing and A. C. Hayward, 1966. A determinative scheme
for the fluorescent plant pathogenic pseudomonads J. appl. Bact., 29, 470-489.
13. Lelliott, R. A. and P. W., Sellar, 1976. The detection of latent ring rot
(Corynebacterium sepedonicum (Spiek. et Kotth.) Skapt. et Burkh.) in potato
stocks. EPPO Bull., 6 (2), 101-106.
14. Li, X. and S.H. de Boer, 1995. Selection of Polymerase Chain Reaction
primers from RNA intergenic spacer region for specific detection of Clavibacter
michiganensis ssp. sepedonicus. Phytopathology, 85, 837-842.
15. Mills, D., Russell, B., W. and J., W. Hanus, 1997. Specific detection of
Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus by amplification of three unique DNA
sequences isolated by subtraction hybridization. Phytopathology, 87, 8, 853-861.
16. Pastrik, K.-H. and R.A. Rainey. 1999. Identification and differentiation of
Clavibacter michiganensis subspecies by polymerase chain reaction-based
techniques. J. Phytopathology 147; 687-693.
17. Pastrik, K.-H., 2000. Detection of Clavibacter michiganensis ssp.
sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA.
European Journal of Plant Pathology, 106, 155-165.
18. Ramamurthi, C. S., 1959. Comparative studies on some Gram-positive
phytopathogenic bacteria and their relationship to the Corynebacteria. Mem.
Cornell agric. Exp. Sta., 366, 52 str.
19. Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A. and Knorr, D. (1999) Detection
of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIO-PCR and
an automated real-time fluorescence detection system. Plant Disease 83;
1095–1100.
20. Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic
bacteria. Schaad [Hrsg.]. — 3. ed.; St. Paul, Minnesota:, 373 str.
21. Skerman, V. B. D., 1967. A guide to the identification of the genera of
bacteria. 2nd ed., William and Wilkins Company, Baltimore.
22. Smith, N. C.; Hennesy, J; Stead, D.E., 2001. Repetetive sequence-derived PCR
profiling using the BOX-A1 Ralstonia solanacearum primer for rapid
identification of plant pathogen Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.
European Journal of Plant Pathology, 107 (7), 739-748.
23. Sneath, P. H. A. and V. G. Collins, 1974. A study in test reproductibility
between laboratories: report of Pseudomonas working party. Antonie van
Leeuwenhoek, 40, 481-527.
24. Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas
spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic
Bacteriology 42; 281-295.
25. Wullings, B. A.; van Beuningen, A. R.; Janse, J. D. and A. D. L. Akkermans,
1998. Detection of Ralstonia solanacearum, which causes brown rot of potato, by
fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ.
Microbiol. 64, 4546–4554.

Pravilnik, NN 89/2008-2844
Opći uvjeti korištenjaZaštita privatnosti[Pristup podatcima](/data_access_hr.aspx)[ELI](/about_eli_hr.aspx)

©2026. g. Narodne novine d.d.

, izrada [Novena d.o.o.](http://novena.hr/)