## Pravilnik o metodama analiza toplinski obrađenog mlijeka za prehranu ljudi

### NN 133/2007 (27.12.2007.), Pravilnik o metodama analiza toplinski obrađenog mlijeka za prehranu ljudi

# MINISTARSTVO POLJOPRIVREDE, ŠUMARSTVA I VODNOGA GOSPODARSTVA

**3799**

Na temelju članka 94. stavka 2. podstavka 4. Zakona o hrani (»Narodne novine« br.
46/07), ministar poljoprivrede, šumarstva i vodnoga gospodarstva donosi

## PRAVILNIK

### O METODAMA ANALIZA TOPLINSKI OBRAĐENOG MLIJEKA ZA PREHRANU LJUDI1

I. OPĆE ODREDBE

Članak 1.

Ovim se Pravilnikom propisuju referentne metode uzimanja uzoraka i referentne
metode analize toplinski obrađenog mlijeka namijenjenog za prehranu ljudi radi
kontrole kakvoće.

Članak 2.

Referentne metode analize toplinski obrađenog mlijeka su sljedeće:
– određivanje udjela ukupne suhe tvari,
– određivanje udjela masti,
– određivanje udjela bezmasne suhe tvari,
– određivanje udjela ukupnog dušika,
– određivanje udjela proteina,
– određivanje specifične mase.

Članak 3.

Izvedba referentnih metoda analiza, određivanja kriterija pouz­danosti i
uzorkovanja provodi se sukladno odredbama propisanima u Prilogu 1. koji je
tiskan uz ovaj Pravilnik i njegov je sastavni dio.

Članak 4.

Metode iz članka 2. ovoga Pravilnika propisane su u Prilogu 2. koji je tiskan uz
ovaj Pravilnik i njegov je sastavni dio.

II. ZAVRŠNE ODREDBE

Članak 5.

Ovaj Pravilnik stupa na snagu osmog dana od dana objave u »Narodnim novinama«.

Klasa: 011-02/07-01/117
Urbroj: 525-1-07-1
Zagreb, 19. prosinca 2007.

Ministar
**Petar Čobanković**, v. r.

\_\_\_\_\_
1 Pravilnik preuzima odredbe
Odluke Vijeća 92/608/EEZ od 14. studenoga 1992. kojom se propisuju metode
analize i ispitivanja toplinski obrađenog mlijeka za izravnu ljudsku potrošnju

PRILOG 1.

I. OPĆE ODREDBE

1. UVOD

Propisane su opće odredbe vezane za reagense, opremu, izražavanja rezultata,
preciznosti i analitičkih izvješća. Laboratoriji zaduženi za provedbu
uzorkovanja i ispitivanja mlijeka moraju udovoljavati odredbama ovoga
Pravilnika.

2. REAGENSI

*2.1. Voda*

2.1.1. Voda koja se koristi za postupke otapanja, razrjeđivanja ili ispiranja,
mora biti destilirana, deionizirana ili demineralizirana voda najmanje jednake
čistoće osim ukoliko nije drugačije navedeno.
2.1.2. Pojam »otapanje« ili »razrjeđivanje« bez dodatnih navoda, podrazumijeva
»otapanje u vodi« ili »razrjeđivanje vodom«.

*2.2. Kemijske tvari*

Sve kemijske tvari koje se koriste moraju imati priznatu analitičku čistoću osim
ukoliko nije drugačije navedeno.

3. OPREMA

*3.1. Popis opreme*

Popisi opreme za različite referentne metode sadrže samo pribor za
specijaliziranu upotrebu i pribor koji zahtijeva posebnu specifikaciju.

*3.2. Analitička vaga*

Pojam »analitička vaga« odnosi se na vagu osjetljivosti 0.1 mg.

4. IZRAŽAVANJE REZULTATA

*4.1. Rezultati*

Osim ukoliko je drugačije navedeno, rezultati navedeni u analitičkom izvješću iz
točke 6. ovoga Priloga odnose se na aritmetičku vrijednost dobivenu iz dvije
analize koje zadovoljavaju kriterij ponov­ljivosti iz točke 5.1.1. ovoga Priloga
naveden za tu metodu. Ukoliko kriterij ponovljivosti nije zadovoljen, analiza
mora biti ponovljena, ukoliko je to moguće, ili rezultat proglašen nevažećim.

*4.2. Izračunavanje masenog udjela*

Ukoliko nije drugačije navedeno, rezultati se moraju izračunavati kao maseni
udio uzorka.

5. KRITERIJI PRECIZNOSTI: PONOVLJIVOST I OBNOVLJIVOST

5.1. Kriteriji preciznosti koji su zadani u svakoj metodi definirani su kako
slijedi:
5.1.1. Ponovljivost (r) je vrijednost ispod koje se nalazi apsolutna razlika
između dva pojedinačna rezultata analiza dobivena primjenom istog postupka na
istom materijalu za analizu, pod istim uvjetima (isti analitičar, ista oprema,
isti laboratorij i kratki vremenski interval).
5.1.2. Obnovljivost (R) je vrijednost ispod koje se nalazi apsolutna razlika
između dva pojedinačna rezultata analiza dobivena primjenom istog postupka na
istom materijalu za analizu, pod različitim uvjetima (drugi analitičar, druga
oprema, drugi laboratoriji i/ili drugo vrijeme).
5.1.3. Ukoliko nije navedeno drugačije, za svaku pojedinu metodu vrijednosti
kriterija ponovljivosti i obnovljivosti svakog postupka predstavljaju intervale
s razinom pouzdanosti od 95% u skladu s HRN ISO 5725-2:2004.
5.1.4. Potrebne međulaboratorijske pokuse i studije trebalo bi planirati i
provoditi u skladu s međunarodnim smjernicama.

6. ANALITIČKO IZVJEŠĆE

U analitičkom izvješću treba biti navedena korištena metoda analize i dobiveni
rezultati. Osim toga, izvješće mora sadržavati sve pojedinosti o postupku koje
nisu određene metodom analize ili su izborne, kao i sve druge okolnosti koje su
mogle utjecati na dobivene rezultate. Analitičko izvješće treba pružiti sve
potrebne informacije za potpunu identifikaciju uzorka.

II. UZORKOVANJE TOPLINSKI OBRAĐENOG MLIJEKA

1. OPSEG I PODRUČJE PRIMJENE

Ovim se postupkom opisuje referentna metoda uzorkovanja, prijevoza i
skladištenja uzoraka toplinski obrađenog mlijeka.

2. OPĆE ODREDBE

Uzorkovanje toplinski obrađenog mlijeka u spremnicima i dr. provest će stručna
osoba koja je prošla odgovarajuću obuku prije uzorkovanja mlijeka.
Ukoliko je to potrebno, nadležno tijelo ili ispitni laboratorij mora osoblje
koje radi uzorkovanje podučiti tehnikama uzorkovanja kako bi se osiguralo da
uzorak bude reprezentativan i u skladu s cijelom serijom.
Ukoliko je to potrebno, nadležno tijelo ili ispitni laboratorij moraju uputiti
osoblje koje radi uzorkovanje na poduku označavanja uzorka kako bi se osigurao
nedvojbeni identitet uzorka.

3. OPREMA ZA UZORKOVANJE

*3.1. Opće odredbe*

Oprema za uzorkovanje mora biti izrađena od nehrđajućeg čelika ili drugog
odgovarajućeg materijala primjerene čvrstoće i konstrukcije koji odgovara njenoj
namjeni (miješanje, uzorkovanje itd.). Stapovi i miješalice za miješanje
tekućine u spremnicima moraju imati dovoljno prostora za odgovarajuće miješanje
proizvoda, a da ne uzrokuju nastajanje užeglosti. Žlica mora imati čvrstu ručku
dostatne dužine kako bi se omogućilo uzimanje uzoraka na bilo kojoj dubini u
spremniku. Kapacitet žlice ne smije biti manji od 50 ml.
Spremnici za uzorke i poklopci moraju biti od stakla, odgovarajućih metala ili
plastike.
Materijali od kojih je izrađena oprema za uzorkovanje (uključujući spremnike i
poklopce) ne smiju uzrokovati nikakve promjene na uzorcima koje bi mogle
utjecati na rezultate analize. Sve površine opreme za uzorkovanje i spremnika za
uzorke moraju biti čiste i suhe, glatke i bez pukotina, i rubovi im trebaju biti
zaobljeni.

4. TEHNIKE UZORKOVANJA

*4.1. Opće odredbe*

Bez obzira na analize koje treba provesti, mlijeko treba potpuno promiješati
prije uzorkovanja, i to ručno ili strojno.
Uzorak treba uzeti odmah nakon miješanja, dok se mlijeko još giba.
Volumen uzorka treba odgovarati zahtjevima analize. Kapacitet korištenih
spremnika za uzorke treba biti takav da su gotovo u potpunosti ispunjeni
uzorkom i da se time omogući odgovarajuće miješanje sadržaja prije analize i
izbjegne bućkanje tijekom transporta.

*4.2. Ručno uzorkovanje*
4.2.1. Uzorkovanje iz više posuda

U slučaju kada se količina mlijeka iz koje se trebaju uzeti uzorci nalazi u više
spremnika, treba uzeti reprezentativnu količinu iz svakog spremnika i
zabilježiti na koju količinu mlijeka se odnosi koji uzorak. U slučaju da uzorke
iz svakog spremnika ne treba zasebno analizirati, tada treba promiješati udjele
ovih reprezentativnih količina u omjerima proporcionalnima količini koja se
nalazi u sprem­n­icima iz kojih je uzet uzorak. Uzorke iz tih skupnih razmjernih
količina treba uzeti nakon miješanja.

4.2.2. Uzorkovanje iz velikih posuda – skladišni, željeznički i cestovni
spremnici

4.2.2.1. Miješanje mlijeka odgovarajućim postupkom prije uzorkovanja.
Za miješanje sadržaja velikih posuda ili skladišnih, željezničkih i cestovnih
spremnika savjetuje se korištenje strojne miješalice sukladno točki 4.2.2.2.
ovoga Priloga.
Vrijeme miješanja odgovara vremenskom razdoblju u kojem je mlijeko mirovalo.
Potrebno je dokazati da učinkovitost postupka miješanja koji se primijeni pod
bilo kojim okolnostima odgovara potrebama predviđene analize; kriterij
učinkovitosti miješanja naročito utječe na sličnost rezultata analize provedene
na uzorcima uzetima ili iz različitih dijelova pošiljke, ili iz ispusta
spremnika u razmacima tijekom pražnjenja. Postupak miješanja mlijeka
(neobrađenog ili punomasnog mlijeka) smatrat će se učinkovitim ukoliko razlika u
količini masti koju sadrže dva uzroka uzeta pod ovim uvjetima iznosi manje od
0,1%.
U velikoj posudi s ispustom za izlijevanje na dnu može na točki izlijevanja
postojati manja količina mlijeka koja nije reprezentativna za cjelokupni sadržaj
čak ni nakon miješanja. Stoga je bolje uzimati uzorke kroz gornji otvor. Ukoliko
se uzorci uzimaju na ispustu za izlijevanje, treba pustiti dovoljnu količinu
mlijeka da proteče kako bi se osigurala reprezentativnost uzoraka u odnosu na
cjelinu.
4.2.2.2. Miješanje sadržaja velikih posuda ili skladišnih, željez­ničkih i
cestovnih spremnika može se provesti na sljedeće načine:
– strojnom miješalicom ugrađenom u spremnike koju pokreće električni motor;
– propelerom ili miješalicom koju pokreće električni motor te je postavljena na
otvor s miješalicom uronjenom u mlijeko;
– u slučaju cestovnih ili željezničkih spremnika ponovnim kruženjem mlijeka kroz
ispusnu cijev koja je povezana s pumpom za pražnjenje spremnika te je umetnuta
kroz gornji otvor;
– čistim filtriranim komprimiranim zrakom. U ovom slučaju trebalo bi koristiti
minimalni tlak i volumen zraka kako bi se spriječilo nastajanje užeglosti.

*4.3. Uzorkovanje toplinski obrađenog mlijeka za prehranu ljudi u maloprodajnoj
ambalaži*

Uzorci toplinski obrađenog mlijeka za prehranu ljudi u maloprodajnoj ambalaži
moraju biti u originalnom pakiranju. Ukoliko je moguće, uzorke treba uzeti iz
stroja za pakiranje ili hladnjače u postrojenju za obradu što je prije moguće
nakon obrade (za pasterizirano mlijeko na dan obrade).
Uzorci se uzimaju iz svake vrste toplinski obrađenog mlijeka (pasteriziranog,
UHT- obrađenog i steriliziranog) i to u broju koji odgovara analizama koje će se
vršiti i u skladu s uputama koje je propisao laboratorij koji vrši ispitivanja
ili drugo nadležno tijelo.

5. IDENTIFIKACIJA UZORKA

Uzorak treba biti označen identifikacijskim kodom tako da se može odmah
identificirati prema uputama laboratorija koji vrši analize ili drugog nadležnog
tijela.

6. ČUVANJE, TRANSPORT I SKLADIŠTENJE UZORAKA

Laboratorij koji provodi analize dužan je u dogovoru s nadležnim tijelom
pripremiti upute vezane za uvjete čuvanja (kemijske, temperaturne), transporta,
skladištenja i vremenskih razdoblja između uzorkovanja i analize mlijeka prema
vrsti mlijeka i postupku analize koji se koristi.
Upute trebaju sadržavati sljedeće:
– Tijekom transporta i skladištenja treba poduzeti preventivne mjere kojima će
se spriječiti izlaganje stranim mirisima i izravnoj sunčevoj svjetlosti. U
slučaju da je spremnik za uzorke proziran, treba ga pohraniti na tamnom mjestu.

PRILOG 2.

I. ODREĐIVANJE UDJELA UKUPNE SUHE TVARI

1. OPSEG I PODRUČJE PRIMJENE

Ovim se postupkom opisuje referentna metoda za određivanje udjela ukupne suhe
tvari u mlijeku.

2. DEFINICIJA

Udio ukupne suhe tvari – je masa koja ostane po završetku točno određenog
postupka sušenja na konstantnoj temperaturi do konstantne mase, a izražava se
kao maseni udio.

3. NAČELO

Isparavanje vode iz uzorka za analizu na temperaturi od 102 ± 2 °C u sušioniku.

4. OPREMA I STAKLENI PRIBOR

Uobičajena laboratorijska oprema, a naročito:
4.1. Analitička vaga
4.2. Eksikator, s učinkovitim sredstvom za sušenje (npr. svježe osušeni silika-gel
s pokazateljem udjela vode).
4.3. Sušionik, ventiliran, s temperaturom održavanom na 102 ± 2 °C na cijelom
radnom prostoru.
4.4. Posude s ravnim dnom, visine 20 do 25 mm, promjera 50 do 75 mm, i od
odgovarajućeg materijala, zajedno s poklopcima koji dobro prianjaju i lako se
uklanjaju.
4.5. Vruća vodena kupelj
4.6. Homogenizator

5. PRIPREMA UZORKA ZA ANALIZU

Uzorak mlijeka treba zagrijati na temperaturu između 20 i 25 °C. Temeljito
promiješati kako bi se osigurala ravnomjerna distribucija masti u cijelom
uzorku. Izbjegavati previše snažno miješanje da ne bi došlo do pjenjenja mlijeka
ili bućkanja masti. U slučaju da se pokaže da je teško raspršiti sloj vrhnja,
treba polako zagrijati na temperaturu između 25 i 40 °C i pažljivim miješanjem
umiješati svo vrhnje sa stjenke spremnika. Brzo ohladiti uzorak na 20 – 25 °C.
Može se koristiti homogenizator kao pomagalo pri raspršivanju masti.
Ne može se očekivati dobivanje točnih rezultata ukoliko uzorak sadrži odvojenu
tekuću mast ili vidljive odvojene bijele čestice nepravilnog oblika koje
prianjaju uza stjenke spremnika.

6. POSTUPAK

*6.1. Priprema posuda*

Zagrijavati posudu (4.4.) i poklopac tako da se stave u sušionik (4.3.) jedno
pokraj drugog, na temperaturi održavanoj na 102 ± 2 °C, barem 30 minuta. Staviti
poklopac na zdjelu i odmah je premjestiti u eksikator (4.2.), te pustiti da se
ohladi na sobnu temperaturu (odnosno barem 30 minuta) i izmjeriti s točnošću od
0,1 mg.

*6.2. Uzorak za analizu*

Odmah izmjeriti, s točnošću od 0,1 mg, 3 do 5 g pripremljenog uzorka za analizu
(5.) i staviti u pripremljenu posudu (6.1.).

*6.3. Određivanje*

6.3.1. Predsušiti posudu 30 minuta grijući je na vrućoj vodenoj kupelji (4.5.).
6.3.2. Zagrijavati posudu, s poklopcem pored nje, u sušioniku (4.3.) dva sata na
konstantnoj temperaturi od 102 ± 2 °C. Staviti poklopac na posudu i izvaditi je
iz sušionika.
6.3.3. Ostaviti posudu u eksikatoru (4.2.) da se ohladi na sobnu temperaturu
(odnosno barem 30 minuta) i izmjeriti s točnošću od 0,1 mg.
6.3.4. Ponovno zagrijati posudu, s poklopcem pored nje, u sušioniku (4.3.) jedan
sat. Staviti poklopac na zdjelu i izvaditi je iz sušionika. Pustiti je da se u
eksikatoru (4.2.) hladi barem 30 minuta i izmjeriti je s točnošću od 0,1 mg.
6.3.5. Ponoviti postupak opisan u točki 6.3.4. dok razlika u masi između dva
uzastopna mjerenja ne prelazi 0,5 mg. Zabilježiti najnižu masu.

7. IZRAŽAVANJE REZULTATA

*7.1. Izračunavanje i formula*

Izračunavanje masenog udjela suhe tvari iz:
![](dodatni/378867.gif)

pri čemu je
WT = udio ukupne suhe tvari u g na 100 g,
m0 = masa posude i poklopca (pogledajte 6.1.), u gramima,
m1 = masa posude, poklopca i uzorka za analizu prije sušenja (pogledajte 6.2.),
u gramima,
m2 = masa posude, poklopca i suhog uzorka za analizu nakon sušenja (pogledajte
6.3.5.), u gramima.
Zaokružiti dobivenu vrijednost s točnošću od 0,01% (maseni udio).

*7.2. Preciznost*

7.2.1. *Ponovljivost* (r): 0,10 g ukupne suhe tvari na 100 g proizvoda.
7.2.2. *Obnovljivost* (R): 0,20 g ukupne suhe tvari na 100 g proizvoda.

II. ODREĐIVANJE UDJELA MASTI

1. OPSEG I PODRUČJE PRIMJENE

Ovim se postupkom opisuje referentna metoda određivanja udjela masti u sirovom
mlijeku i punomasnom mlijeku, djelomično obranom mlijeku i obranom mlijeku.

2. DEFINICIJA

*Udio masti u mlijeku* – je sva tvar određena točno određenom metodom, a izražava
se kao maseni udio.

3. NAČELO

Otopina amonijaka i etanola uzorka za analizu ekstrahira se pomoću dietiletera i
petroletera, otapala koje se uklanja destilacijom ili isparavanjem, a potom se
određuje masa ekstrahirane tvari topive u petroleteru. (Ovaj postupak je poznat
kao Roese-Gottliebova metoda).

4. REAGENSI

Svi reagensi moraju biti priznate analitičke čistoće i ne smiju ostavljati
znatne taloge pri slijepoj probi.
Kako bi se provjerila kvaliteta reagensa, treba provesti određivanje opisano u
točki 6.3. Koristiti praznu tikvicu, čašu ili metalnu zdjelu (5.8.) za mjerenje,
pripremljene u skladu s točkom 6.4., kao taru (kako bi se omogućilo ispravljanje
učinka promjena u atmosferskim prilikama na rezultate mjerenja). Ukoliko talog,
ispravljen za očitu promjenu mase tare prelazi 2,5 mg, potrebno je odvojeno
odrediti talog otapala isparavanjem 100 ml dietiletera (4.4.) i 100 ml
petroletera (4.5.), tim redoslijedom. Također koristiti taru za mjerenje. U
slučaju da je talog veći od 2,5 mg, potrebno je pročistiti otapalo destilacijom
ili ga zamijeniti.
4.1. Otopina amonijaka, koja sadrži otprilike 25% (m/m) NH3. Može se koristiti i
otopina amonijaka veće koncentracije (pogledajte 6.5.1. i A.1.5.1.).
4.2. Etanol, barem 94% (v/v). Etanol razgrađen metanolom može se koristiti
ukoliko je sigurno da to ne utječe na rezultate određivanja.
4.3. Otopina kongo crvenila ili krezol crvenila
Otopiti 1 g kongo crvenila ili krezol crvenila u vodi i razvodniti do 100 ml.
*Napomena:* Korištenje ove otopine, koja omogućava da se lakše vidi granica između
sloja otapala i vodenog sloja, nije obavezno (pogledajte 6.5.2.). Mogu se
koristiti i druge vodene otopine u boji ukoliko ne utječu na rezultate
određivanja.
4.4. Dietileter bez peroksida koji ne sadrži više od 2 mg/kg antioksidansa, i
zadovoljava zahtjeve slijepe probe (6.3.).
4.5. Petroleter, s rasponom ključanja između 30 i 60 °C.
4.6. Smjesa otapala, pripravljeno neposredno prije korištenja miješanjem
jednakih volumena dietiletera (4.4.) i petroletera (4.5.).

5. OPREMA I STAKLENI PRIBOR

*Upozorenje:* Budući da određivanje uključuje korištenje hlapljivih i zapaljivih
otapala, sva korištena električna oprema mora biti u skladu sa zakonima koji se
odnose na korištenje tih otapala.
Uobičajena laboratorijska oprema, a naročito:
5.1. Analitička vaga
5.2. Centrifuga, u kojoj se mogu vrtjeti tikvice ili epruvete za ekstrakciju
masti (5.6.) rotacijskom frekvencijom od 500 do 600 okretaja u minuti kako bi se
proizvelo gravitacijsko polje od 80 do 90 g na vanjskim krajevima tikvica ili
epruveta.
*Napomena:* Korištenje centrifuge nije obavezno (6.5.5.).
5.3. Destilator ili instrument za isparavanje, kako bi se omogućilo destiliranje
otpala i etanola iz tikvica ili isparavanje iz čaša i zdjela (pogledajte 6.5.12.
i 6.5.15.) na temperaturi koja ne prelazi 100 °C.
5.4. Sušionik, koja se zagrijava električnim putem, s potpuno otvorenim
ventilacijskim otvorom(ima), i u kojem se temperatura može održavati na 102 ± 2
°C na cijelom radnom prostoru. Sušionik bi trebala biti opremljena odgovarajućim
termometrom.
5.5. Vodena kupelj, u kojoj se temperatura može održavati na 35 – 45 °C.
5.6. Tikvice za ekstrakciju masti tipa Mojonnier
*Napomena:* Moguće je koristiti i epruvete za ekstrakciju sifonom ili nastavcima
boce štrcaljke, ali u tom slučaju je postupak drugačiji te je naveden u Dodatku.
Tikvice (ili epruvete) moraju imati čepove od brušenog stakla, kvalitetnog pluta
ili drugog materijala na koje ne djeluju reagensi koji se koriste. Čepove od
pluta treba ekstrahirati dietileterom (4.4.), namakati u vodi pri 60 °C ili
najmanje 15 minuta, a nakon toga ostaviti da se ohladi u vodi kako bi ostali
zasićeni pri korištenju.
5.7. Stalak, za držanje tikvica (ili epruveta) za ekstrakciju masti (pogledajte
5.6.).
5.8. Boca štrcaljka, za korištenje smjese otapala (4.6.). Ne smije se koristiti
plastična boca štrcaljka.
5.9. Posude za sakupljanje masti, npr. tikvice za ključanje (s ravnim dnom), ili
Erlenmeyerove tikvice kapaciteta 125 – 250 ml ili metalne posude. Ukoliko se
koriste metalne posude, najbolje je da su od nehrđajućeg čelika, s ravnim dnom,
po mogućnosti s noscem, i trebaju biti promjera 80 do 100 mm i visine oko 50 mm.
5.10. Pomagala za ključanje, bez masti, od neporoznog porculana ili
silicij-karbida ili staklenih kuglica (neobavezno u slučaju metalnih zdjela).
5.11. Menzure, kapaciteta 5 i 25 ml.
5.12. Pipete, s označenom skalom, kapaciteta 10 ml.
5.13. Kliješta, metalna, namijenjena držanju tikvica, čaša ili zdjela.

6. POSTUPAK

*Napomena:* Druga mogućnost koja je opisana u Dodatku je korištenje epruveta za
ekstrakciju masti sa sifonom ili nastavcima boce štrcaljke (pogledajte napomenu
pod 5.6.).

*6.1. Priprema uzorka za analizu*

Prilagoditi temperaturu laboratorijskog uzorka na otprilike 35 – 40 °C 15
minuta, i to pomoću vodene kupelji. Temeljito, ali lagano promiješati uzorak
stalnim preokretanjem boce tako da ne nastaje pjena, i brzo ohladiti na
otprilike 20 °C.

*6.2. Uzorak za analizu*

Promiješati uzorak za analizu (6.1.) polaganim preokretanjem boce tri ili četiri
puta i odmah izvagati, s točnošću od 1 mg, 10 do 11 g uzorka za analizu, izravno
ili na temelju razlike, i prenijeti ga u tikvicu za ekstrakciju (5.6.).
Uzorak za analizu mora u cijelosti biti u donjem (manjem) dijelu tikvice za
ekstrakciju.

*6.3. Slijepa proba*

Provesti slijepu probu istovremeno, i to korištenjem istog postup­ka i istog
reagensa, ali tako da umjesto uzorka za analizu stavimo 10 do 11 ml vode.
Promjena prave mase posude za sakupljanje masti, ispravljena za ukupnu promjenu
mase kontrolne posude ne smije prelaziti 2,5 mg.

*6.4. Priprema posude za sakupljanje masti*

Osušiti posudu (5.9.) zajedno s nekoliko pomagala za ključanje (5.10.) kako bi
se potaknulo lagano ključanje tijekom narednog uklanjanja otapala u sušioniku
(5.4.) u trajanju od jedan sat. Ostavite posudu da se ohladi (ne u eksikatoru,
ali zaštitite od prašine) na sobnoj temperaturi za mjerenje (staklene posude
pustiti da se hlade barem jedan sat, a metalne posude barem 30 minuta).
Koristiti kliješta za stavljanje posude na vagu i provedite vaganje s točnošću
od 0.1 mg, te pri tome treba izbjegavati promjene temperature.

*6.5. Određivanje*

6.5.2. Dodati 10 ml etanola (4.2.) i lagano, ali temeljito promiješati
dopuštajući da sadržaj tikvice teče naprijed nazad između njena dva dijela;
izbjegavati da tekućina dođe preblizu vratu tikvice. Prema želji dodati dvije
kapi otopine kongo crvenila ili krezol crvenila (4.3.).
6.5.3. Dodati 25 ml dietiletera (4.4.), zatvoriti tikvicu čepom od pluta
zasićenim vodom ili zatvaračem smočenim vodom (pogledajte 5.6.), i tresti
tikvicu umjerenom jačinom (kako bi se izbjeglo stvaranje postojanih emulzija)
jednu minutu s tikvicom u vodoravnom položaju, tako da manji dio stoji prema
gore. Povremeno dopustiti da se tekućina iz većeg dijela pretoči u manji dio.
Prema potrebi ohladiti tikvicu u vodi iz slavine, a zatim pažljivo ukloniti čep
od pluta ili drugi zatvarač i pomoću boce štrcaljke (5.8.) isprati njega i vrat
tikvice s malo smjese otapala (4.6.) tako da isprani sadržaj uđe u tikvicu.
6.5.4. Dodati 25 ml petroletera (4.5.), zatvoriti tikvicu ponovno namočenim
čepom od pluta ili drugim zatvaračem (ponovno smočiti uranjanjem u vodu), i
lagano tresti tikvicu 30 sekundi kako je opisano u točki 6.5.3.
6.5.5. Centrifugirati zatvorenu tikvicu 1 do 5 minuta rotacijskom brzinom od 500
do 600 okretaja u minuti (5.2.). Ukoliko centrifuga nije na raspolaganju
(pogledati napomenu uz 5.2.) ostaviti zatvorenu tikvicu da stoji na stalku
(5.7.) barem 30 minuta dok se gornji sloj jasno i vidljivo ne odvoji od vodenog
sloja. Prema potrebi ohladiti tikvicu pod tekućom vodom.
6.5.6. Pažljivo ukloniti čep pluta ili drugi zatvarač i isprati ga kao i
unutarnju stranu vrata tikvice s malo smjese otapala (4.6.) tako da isprani
sadržaj uđe u tikvicu.
Ukoliko se granica nalazi ispod kraja vrata tikvice, isprani sadržaj treba
podignuti nešto iznad te razine lagano ulijevajući vodu niz stjenku tikvice tako
da se olakša prelijevanje otapala.
6.5.7. Držeći tikvicu za ekstrakciju za manji dio, pažljivo preliti najveću
moguću količinu gornjeg sloja u pripremljene posude za sakupljanje masti (6.4.)
koje sadrže nekoliko pomagala za ključanje (5.10.) u slučaju tikvica (po izboru
s metalnim posudama), izbjegavajući izlijevanje vodenog sloja.
6.5.8. Isprati vanjsku stranu vrata tikvice za ekstrakciju s malo smjese otapala
(4.6.), sakupljajući isprani sadržaj u posudu za sakupljanje masti i pazeći da
se smjesa otapala ne prelije preko vanjskog dijela tikvice za ekstrakciju.
Prema želji se otapalo ili dio otapala može ukloniti iz posude destilacijom ili
isparavanjem kako je opisano u točki 6.5.12.
6.5.9. Dodati 5 ml etanola (4.2.) sadržaju tikvice za ekstrakciju, pri tome
koristeći etanol za ispiranje unutrašnjosti vrata tikvice, i promiješati kako je
opisano u točki 6.5.2.
6.5.10. Provesti drugu ekstrakciju ponavljanjem radnji opisanih u točkama od
6.5.3. do 6.5.8., ali koristeći samo 15 ml dietiletera (4.4.) i 15 ml
petroletera (4.5.); koristiti eter za ispiranje unutrašnjosti vrata tikvice za
ekstrakciju. Prema potrebi podignuti granicu na sredinu vrata tikvice kako bi se
omogućilo da konačno izlijevanje otapala bude što potpunije.
6.5.11. Provesti treću ekstrakciju daljnjim ponavljanjem radnji opisanih u
točkama od 6.5.3. do 6.5.8., ali koristeći samo 15 ml dietil etera (4.4.) i 15
ml petroletera (4.5.); koristiti eter za ispiranje unutrašnjosti vrata tikvice
za ekstrakciju. Prema potrebi podignuti granicu na sredinu vrata tikvice kako bi
se omogućilo da konačno izlijevanje otapala bude što potpunije.
Treća ekstrakcija se može ispustiti kod obranog mlijeka.
6.5.12. Otapala (uključujući etanol) iz tikvice ukloniti što potpunije postupkom
destilacije, ili iz čaše ili zdjele isparavanjem (5.3.), ispirući unutrašnjost
vrata tikvice s malo miješanog otapala (4.6.) prije započinjanja destilacije.
6.5.13. Grijati posudu za sakupljanje masti (s tikvicom pored nje kako bi para
otapala isparila) jedan sat u sušioniku (5.4.). Ukloniti posudu za sakupljanje
masti iz sušionika, ostaviti da se ohladi (ne u eksikatoru, ali zaštitite od
prašine) na temperaturu sobe za mjerenje (staklene posude neka stoje barem sat
vremena, a metalne posude barem 30 minuta) i izvršiti mjerenje s točnošću od 0,1
mg.
Ne brisati posudu neposredno prije mjerenja. Staviti posudu na vagu korištenjem
kliješta i naročito izbjegavati promjene temperature.
6.5.14. Ponavljati radnje opisane u točki 6.5.13. dok se masa posude za
sakupljanje masti ne smanji za 0,5 mg ili manje, ili poveća, između dva
uzastopna mjerenja. Zabilježiti najmanju izmjerenu masu posude za sakupljanje
masti i ekstrahirane tvari.
6.5.15. Dodati 25 ml petroletera u posudu za sakupljanje masti kako bi se
provjerilo je li ekstrahirana tvar u potpunosti topljiva. Lagano zagrijati i
miješati otapalo dok se sva mast ne otopi.
Ukoliko je ekstrahirana tvar u potpunosti topljiva u petroleteru, uzima se da je
masa masti razlika između konačne mase posude koja sadrži ekstrahiranu tvar
(6.5.14.) i početne mase.
6.5.16. Ukoliko je ekstrahirana tvar u potpunosti topljiva u petroleteru, ili u
slučaju sumnje, u potpunosti ekstrahirati mast iz posude ponavljanim ispiranjem
toplim petroleterom.
Pustiti sve tragove netopljive tvari da se slegnu i pažljivo izliti petroleter
bez da se ukloni netopljiva tvar. Ponoviti ovaj postupak još tri puta
korištenjem petroletera za ispiranje unutrašnjosti vrata posude.
Na kraju isprati vanjski dio vrha posude smjesom otapala tako da se otapalo ne
proširi preko vanjske strane posude. Ukloniti paru petroletera iz posude
jednosatnim zagrijavanjem posude u sušioniku, pustiti da se ohladi i izmjeriti,
kako je opisano u točkama 6.5.13. i 6.5.14.
Uzeti da je masa masti razlika mase određene u točki 6.5.14. i ove konačne mase.

7. IZRAŽAVANJE REZULTATA

*7.1. Izračun i formula*

Izračunajte maseni udio masti iz:
![](dodatni/378868.gif)

pri čemu je
F = udio masti,
m0 = masa uzorka za analizu (6.2.), u gramima,
m1 = masa posude za sakupljanje masti i ekstrahirane tvari određene u točki
6.5.14., u gramima,
m2 = masa pripremljene posude za sakupljanje masti ili, u slučaju neotopljenog
materijala, posude za sakupljanje masti i netopivog taloga određenog u točki
6.5.16., u gramima,
m3 = masa posude za sakupljanje masti korištene u slijepoj probi (6.3.) i sav
ekstrahirani materijal određen u točki 6.5.14., u gramima,
m4 = masa pripremljene posude za sakupljanje masti (pogledati 6.4.) korištene u
slijepoj probi (6.3.) ili, u slučaju netopljenog materijala, posude za
sakupljanje masti i netopivog taloga određenog u točki 6.5.16., u gramima.
Prikazati rezultat s točnošću od 0,01 mg.

*7.2. Preciznost*
7.2.1. Ponovljivost (r):

– za punomasno mlijeko i djelomično obrano mlijeko; 0,02 g masti na 100 g
proizvoda,
– za obrano mlijeko: 0,01 g masti na 100 g proizvoda

7.2.2. Obnovljivost (R):

– za punomasno mlijeko: 0,04 g masti na 100 g proizvoda,
– za djelomično obrano mlijeko: 0,03 g masti na 100 g proizvoda,
– za obrano mlijeko: 0,025 g masti na 100 g proizvoda.

III. ODREĐIVANJE UDJELA BEZMASNE SUHE TVARI

1. OPSEG I PODRUČJE PRIMJENE

Ovim se postupkom opisuje referentna metoda za određivanje udjela bezmasne suhe
tvari u toplinski obrađenom mlijeku.

2. DEFINICIJA I IZRAČUN

Udio bezmasne suhe tvari izražava se kao maseni udio.
*Udio bezmasne suhe tvari* – je udio ukupne suhe tvari (pogledati odjeljak I.)
umanjen za udio masti (pogledati odjeljak II.).

IV. ODREĐIVANJE UDJELA UKUPNOG DUŠIKA

1. OPSEG I PODRUČJE PRIMJENE

Ovim se postupkom opisuje referentna metoda za određivanje udjela ukupnog dušika
u sirovom mlijeku i punomasnom mlijeku, djelomično obranom mlijeku i obranom
mlijeku.

2. DEFINICIJA

*Udio ukupnog dušika u mlijeku* – je udio dušika, izražen kao maseni udio, kako je
određeno točno opisanom Kjeldahlovom metodom.

3. NAČELO

Izmjerena količinu uzorka mlijeka tretira se koncentriranom sumpornom kiselinom
i kalij-sulfatom i bakar(II)-sulfatom kao katalizatorom, kako bi se dušik iz
organskih spojeva preveo u amonij-sulfat. Amonijak se oslobađa dodavanjem
otopine natrij-hidroksida, a zatim se destilira i apsorbira u otopinu borne
kiseline. To se titrira kiselom otopinom.

4. REAGENSI

4.1. Kalij-sulfat (K2SO4).
4.2. Otopina bakar-sulfata. Otopiti 5,0 g bakar(II)-sulfata pentahidrata (CuSO4,
5H2O) u vodi i razvodniti do 100 ml (na 20°C) u odmjernoj tikvici.
4.3. Sumporna kiselina, barem 98,0 % (m/m) H2SO4.
4.4. Otopina natrij-hidroksida, 47 % (m/m) 704 g NaOH/l (20°C).
*Napomena:* može se koristiti i otopina natrij-hidroksida manje koncentracije, npr.:
40 % (m/m) 572 g/l, 20 °C; ili 30 % (m/m) 399 g/l, 20 °C.
4.5. Otopina borne kiseline. Otopiti 40 g borne kiseline (H3BO3) u jednoj litri
vruće vode, ostaviti da se ohladi i spremiti u bocu od borosilikatnog stakla.
4.6. Indikatorska otopina. Otopiti 0,01 g crvenog metila, 0,02 g plavog
bromtimola i 0,06 g zelenog bromkrezola u 100 ml etanola. Spremiti otopinu u
smeđu zatvorenu bocu na hladno i tamno mjesto.
4.7. Volumetrijska otopina
c(1/2 H2SO4) ili c(HCl) = 0,1 mol/l standardizirana s točnošću od 0,0001 mol/l.
4.8. Saharoza bez dušika.
4.9. Amonijeva sol, čista, kao što su amonij-oksalat (NH4)2C2O4, H2O ili amonij-sulfat
(NH4)2SO4.
4.10. Triptofan (C11H12N2O2), fenacetin (C10H7CH2CONH2) ili lizin mono- ili
dihidroklorid (C6H14N2O2 · HCl ili C6H14N2O2 · 2HCl).
Napomena: čistoća reagensa u točkama 4.9. i 4.10. trebala bi biti iznad stupnja
»analitičke čistoće«. Ukoliko je na raspolaganju, trebala bi se koristiti
certificirana otopinu amonijeve soli (4.9.).

5. OPREMA I STAKLENI PRIBOR

Uobičajena laboratorijska oprema, a naročito:
5.1. Kjeldahlove tikvice kapaciteta 500 ml.
5.2. Odgovarajuća pomagala za ključanje, npr. staklene kuglice promjera oko 5
mm, Hengarove granule, kamen plavac.
5.3. Birete ili automatska pipeta, za doziranje 1,0 ml.
5.4. Menzure s označenim skalama, staklene, kapaciteta 50, 100 i 250 ml.
5.5. Digestor u nagnutom položaju (oko 45°), s električnim grijačima ili
plinskim plamenicima koji ne zagrijavaju tikvicu iznad razine njenog sadržaja,
sa sustavom za ekstrahiranje dima.
5.6. Destilator, izrađen od borosilikatnog stakla, na koji se može spojiti
Kjeldahlovu tikvicu (5.1.) i koji se sastoji od učinkovite glave štrcaljke
povezane s učinkovitim hladilom s ravnom unutarnjom cijevi i odvodnom cijevi
povezanom s njegovim donjim završetkom; povezne cijevi i zatvarač(i) moraju
dobro prianjati i po mogućnosti biti od neoprenske gume.
5.7. Pipeta ili automatska pipeta, za 0,1 ml.
5.8. Čunjaste tikvice, kapaciteta 500 ml, graduirane na 200 ml.
5.9. Bireta kapaciteta 50 ml, graduirana na 0,1 ml, s maksimalnom mogućnošću
pogreške ± 0,05 ml.
5.10. Povećalo, za očitavanje birete (5.9.).
5.11. pH-metar
5.12. Automatska bireta.

6. POSTUPAK

6.1. Dodati pomagala za ključanje (5.2.) (npr. tri staklene kuglice) u
Kjeldahlovu tikvicu (5.1.), 15 g kalij-sulfata (4.1.), 1,0 ml otopine
bakar-sulfata (4.2.), otprilike 5 g uzorka mlijeka (izmjerenog s točnošću od
0,001 g) i 25 ml sumporne kiseline (4.3.). Koristiti kiselinu za ispiranje
otopine bakar-sulfata, kalij-sulfata ili mlijeka na vratu tikvice, i lagano
promiješati sadržaj tikvice.
*Napomena*: Budući da organska tvar troši sumpornu kiselinu tijekom ključanja, za
razgradnju umjesto 25 ml koristi se 30 ml H2SO4 (4.3.) ukoliko mlijeko sadrži
više od 5,0 % (m/m) masti. Isto bi trebalo učiniti i u slijepoj probi.
6.2. Zagrijte svaku Kjeldahlovu tikvicu u digestoru (5.5.), u početku vrlo
polako tako da crna pjena ostane unutar trbušastog dijela tikvice. Kada prestane
početno pjenjenje i pojavi se obilna bijela para, snažno prokuhajte (kisela para
će se kondenzirati kada dođe na pola puta do vrha vrata tikvice) dok ne nestanu
sve crne čestice i dok sadržaj tikvice ne bude jasno blijede plavo-zelene boje.
Tada lagano kuhati barem 1,5 sat. Primiti na znanje sljedeće:
(a) ne bi trebalo proteći više od 1 sata da sadržaj tikvice postane bistar, a
razgradnja ukupno ne bi trebala trajati ispod 2,5 sata. Ukoliko je potrebno više
od jednog sata za razbistravanje, ukupno trajanje razgradnje treba se povećati
sukladno tome.
(b) dodani kalij-sulfat potiče razgradnju budući da podiže temperaturu ključanja
smjese. Ukoliko je preostali volumen H2SO4 manji od otprilike 15 ml na kraju
razgradnje, dušik je možda izgubljen zbog prekomjernog zagrijavanja. Kod
plinskog grijanja trebate zagrijati tikvicu na ploči od toplinski izolacijskog
materijala, s kružnim otvorom takvog promjera da slobodni plamen samo dodiruje
dio tikvice koja je ispod površine tekućeg sadržaja (5.5.).
(c) ukoliko crne čestice uđu u vrat tikvice i ne spere ih se u potpunosti u
trbuh tikvice kretanjem kiseline u početnim fazama razdoblja snažnog
zagrijavanja (to bi se moglo olakšati okretanjem tikvice) treba pustiti da se
tikvica dovoljno ohladi i pažljivo je isprati minimalnom količinom vode. Zatim
nastaviti razgradnju kako je gore opisano.
6.3. Kada se Kjeldahlove tikvice u potpunosti ohlade, dodati 300 ml vode
(pogledati napomenu) u svaku tako da se pažljivo ispere vrat tikvice, i
temeljito promiješati sadržaj pazeći na to da se kristali koji su se odvojili
otope. Dodati pomagala za ključanje (5.2.) kako bi se osiguralo jednolično
ključanje. Zatim u svaku tikvicu dodati 70 ml otopine natrij-hidroksida (4.4.)
(pogledati napomenu) lagano ulijevajući otopinu kroz nakošeni vrat tikvice da se
stvori donji sloj u trbušastom dijelu; ne močiti vrh vrata otopinom
natrij-hidroksida.
Napomena: Potrebno je da zajednički volumen vode i otopine natrij-hidroksida
iznosi 370 ml kako bi se omogućilo sakupljanje oko 150 ml destilata upravo prije
nego što uslijedi neujednačeno ključanje. Stoga, ako se doda veći odgovarajući
volumen otopine natrij-hidroksida koncentracije manje od 47 % (m/m), volumen
dodane vode smanjit će se prema tome. Na primjer, ukoliko se doda 85 ml od 40 %
(m/m) ili 125 ml od 30 % (m/m) otopine natrij-hidroksida, volumen dodane vode
iznositi će 285 ml ili 245 ml.
6.4. Odmah spojiti svaku Kjeldahlovu tikvicu na destilator (5.6.). Pobrinite se
da vrh odvodne cijevi hladila bude uronjen u 50 ml borne kiseline (4.5.) zajedno
s 0,20 ml (5 – 6 kapi) indikatorske otopine (4.6.) u čunjastoj tikvici (5.8.).
Zavrtiti sadržaj svake Kjeldahlove tikvice kako bi se temeljito promiješao i
zakuhao, ali u početku lagano kako bi se spriječilo pretjerano pjenjenje. Nakon
što se sakupi 100 do 125 ml destilata, spuštati svaku čunjastu tikvicu dok se
vršak odvodne cijevi hladila ne nađe na otprilike 40 mm iznad oznake za 200 ml.
Nastaviti sa svakom pojedinačnom destilacijom dok ne počne neujednačeno
ključanje, a zatim odmah prestati sa zagrijavanjem. Odvojiti sve Kjeldahlove
hlove
tikviceati vrh odvodnih cijevi hladila pomoću malo vode, sakupljajući
isprani sadržaj u čunjastu tikvicu.
Treba znati sljedeće:
(a) Stupanj destilacije mora biti takav da se otprilike 150 ml destilata sakupi
kada započne neujednačeno ključanje, a volumen sadržaja svake čunjaste tikvice
tada će iznositi otprilike 200 ml.
(b) Učinkovitost svakog hladila trebala bi biti takva da temperatura sadržaja
svake čunjaste tikvice ne prelazi 25 °C tijekom destilacije.
6.5. Titrirati svaki destilat sa standardnom volumetrijskom otopinom (4.7.) dok
pH ne bude 4,6 ± 0,1, i pri tome koristiti pH-metar i po želji automatsku
biretu. Dodavanje indikatora pomaže pri provjeravanju pravilnog tijeka
titracije. Očitati vrijednosti na bireti s točnošću od 0,1 ml pomoću povećala
(5.10.) izbjegavajući greške vezane za menisk.
Titriranje se može provesti samo s indikatorom. Potrebno je titrirati dok boja
destilata ne postane jednaka boji prethodno pripremljene otopine od 150 ml vode
u koju je dodano 50 ml otopine borne kiseline i 0,20 ml indikatora sadržanog u
čunjastoj tikvici (5.8.).
6.6. Provesti slijepu probu u skladu s točkama od 6.1. do 6.5., i umjesto uzorka
mlijeka za postupak uzeti 5 ml destilirane vode i otprilike 0,1 g saharoze
(4.8.).
*Napomena:* Za titraciju slijepog destilata potreban je mali volumen standardne
volumetrijske otopine (4.7.).
6.7. Redovito provjeravati ispravnost postupka korištenjem dva rekuperacijska
pokusa prateći postupak opisan u točkama od 6.1. do 6.5.
6.7.1. Provjeriti dolazi li do gubitka dušika zbog prekomjernog zagrijavanja ili
mehaničkih curenja tijekom destilacije, i to korištenjem uzorka za analizu od
0,15 g amonij-oksalata ili sulfata (4.9.) izmjerenog s točnošću od 0,001 g i 0,1
g saharoze (4.8.).
Postotak rekuperiranog dušika mora iznositi između 99,0% i 100,0 %.
Niži ili viši rezultati ukazuju na propuste u postupku i/ili netočnost
koncentracije standardnih otopina (4.7.).
6.7.2. Provjeriti je li postupak razgradnje dovoljan za oslobađanje ukupnog
proteinskog dušika korištenjem uzorka za analizu od 0,20 g čistog triptofana,
0,35 g fenacetina ili 0,20 g lizin hidroklorida (4.10.). Sva mjerenja trebala bi
biti provedena s točnošću od 0,001 g. Najmanje 98 – 99 % dušika trebalo bi biti
rekuperirano.

7. SIGURNOSNE MJERE

Pri radu s koncentriranom sumpornom kiselinom i natrij-hidroksidom i kada se
rukuje Kjeldahlovim tikvicama, uvijek nositi laboratorijsku kutu, zaštitne
naočale i rukavice otporne na kiselinu.
Nikad ne ostavljati Kjeldahlove tikvice bez nadzora tijekom destilacije. Zbog
potencijalne opasnosti odmah zaustaviti destilaciju ukoliko sadržaj tikvice
ključa prejako. Ukoliko je struja isključena više od dvije do tri minute,
spustiti tikvicu za sakupljanje tako da destilacijski vršak bude izvan tekućine.

8. IZRAŽAVANJE REZULTATA

*8.1. Izračun i formula:*

Izračunajte udio dušika (WN), izraženo u gramima dušika na 100 g proizvoda
sljedećom formulom:
![](dodatni/378869.gif)

Pri čemu je:
WN = udio dušika,
V = volumen standardne volumetrijske otopine kiseline korištene pri određivanju,
u mililitrima,
V0 = volumen standardne volumetrijske otopine kiseline korištene u slijepoj
probi, u mililitrima,
c = koncentracija, izražena u molima po litri standardne volumetrijske otopine
kiseline (4.7.),
m = masa uzorka za analizu u gramima.
Zaokružiti rezultat na 0,001 g na 100 g.

*8.2. Preciznost*

8.2.1. *Ponovljivost* (r): 0,007 g na 100 g.
8.2.2. *Obnovljivost* (R): 0,015 g na 100 g.

9. IZMJENE POSTUPAKA

9.1. Koristiti aparaturu za razgradnju s cilindričnim tikvicama, umjesto
digestora i Kjeldahlovih tikvica opisanih u točkama 5.5. i 5.1. U tom slučaju
svaki uređaj treba zasebno provjeriti kako bi se utvrdile potencijalne
nepravilnosti (6.7.).
9.2. Koristiti parnu destilaciju umjesto izravnog zagrijavanja tikvica (6.4.).
Kada instrument ne dopušta korištenje destilirane vode, treba obratiti pozornost
na to sadrži li voda hlapljive kiseline ili baze.
9.3. Uzorak za analizu od 1 g mlijeka (semi-makro Kjeldahl) može se koristiti
umjesto 5 g (6.1.) ukoliko:
– se količine reagensa korištenog za mineralizaciju (6.1.): H2SO4, CuSO4 · 5H2O,
K2SO4, smanje u istom omjeru (1/5).
– se ukupno trajanje razgradnje (6.2.) smanji na 75 minuta.
– se količina otopina natrij-hidroksida (6.3.) smanji u istom omjeru (1/5).
– se mora koristiti standardna kisela otopina (4.7.) niže koncentracije (0,02 do
0,03 mol/l).
*Napomena:* Korištenje jedne ili više od ovih mogućnosti prihvatljivo je samo
ukoliko su vrijednost ponovljivosti (8.2.1.) i rezultati dvije provjere točnosti
(6.7.) u skladu s uvjetima propisanima ovom metodom.

V. ODREĐIVANJE UDJELA PROTEINA

1. OPSEG I PODRUČJE PRIMJENE

Ovim se postupkom opisuje referentna metoda za određivanje udjela proteina u
toplinski obrađenom mlijeku.
Na tržište Republike Hrvatske može se stavljati samo ono toplinski obrađeno
kravlje mlijeko namijenjeno za prehranu ljudi koje udovoljava zahtjevu da mu je
točka smrzavanja najviše -0,520 °C i masa najmanje 1028 grama po litri, ako se
određuje u punomasnom mlijeku pri 20 °C ili ekvivalentne vrijednosti ako se
određuje u potpuno obranom mlijeku pri 20 °C, te da sadrži najmanje 28 grama
proteina po litri, izračunato množenjem udjela ukupnog dušika u mlijeku sa 6,38,
a udio bezmasne suhe tvari najmanje 8,50%.
Točka smrzavanja veća od -0,520 °C bit će prihvatljiva pod uvjetom da službene
kontrole pokazuju da u mlijeku nema dodane vode odnosno da sirovo mlijeko
udovoljava odredbama Pravilnika o kakvoći svježeg sirovog mlijeka (»Narodne
novine« br. 102/2000)2.

2. DEFINICIJA

*Udio proteina* – je vrijednost koja se dobije množenjem udjela ukupnog dušika,
izraženog kao maseni udio, određenog metodom opisanom u odjeljku IV. stavku 3.,
s odgovarajućim faktorom (3.).

3. IZRAČUN

Udio proteina u mlijeku kao maseni udio = 6,38 x udio ukupnog dušika N u mlijeku
%.

VI. ODREĐIVANJE SPECIFIČNE MASE

1. OPSEG I PODRUČJE PRIMJENE

Ovim se postupkom opisuje referentna metoda određivanja specifične mase sirovog
mlijeka i punomasnog mlijeka, djelomično obranog mlijeka i obranog mlijeka na 20
°C.

2. DEFINICIJA

Specifična masa mlijeka je omjer mase određenog volumena mlijeka na 20 °C i mase
istog volumena vode na 20 °C.

3. NAČELO

Specifična masa na 20 °C određuje se hidrometrom.

4. OPREMA I STAKLENI PRIBOR

Uobičajena laboratorijska oprema, a naročito:
4.1. Laktodenzimetar
Specifični gravitacijski laktodenzimetar je instrument koji se sastoji od
staklenog plovka koji je u svom donjem dijelu širok i težak. Cilindrična
staklena cjevčica je spojena na gornji kraj plovka te je usporedna s njim;
gornji dio cjevčice je zatvoren.
Stakleni plovak sadrži teret (olovo, živa, itd.) namijenjen prilagođavanju mase
hidrometra. Cjevčica ima skalu od 1,025 do 1,035 g/ml.
Laktodenzimetar bi trebalo provjeriti piknometrijskom metodom, korištenjem
piknometra kapaciteta oko 100 ml koji je opremljen termometrom za mjerenje
preciznosti.
4.2. Cilindri (stakleni ili od nehrđajućeg čelika).
Njihove minimalne dimenzije trebale bi biti sljedeće:
– unutarnji promjer otprilike 35 mm
– unutarnja visina otprilike 225 mm.
4.3. Vodena kupelj regulirana na 20 ± 0,01 ° 0,01 °C.
4.4. Vopelj regulirana na 40 ± 2 °C.
4.5. Termometar, s označenom skalom podijeljenom na 0,5 °C.

5. POSTUPAK

5.1. Promiješati uzorak preokretanjem kako bi se raspršila mast i te isti
staviti u vodenu kupelj na 40 °C (4.4.). Pustiti da uzorak dosegne temperaturu
od 40 °C i održavati tu temperaturu pet minuta. Temeljito promiješati laganim
preokretanjem kako bi se mast ravnomjerno rasporedila uz izbjegavanje nastanka
pjene. Uzorak ohladiti na 20 °C u drugoj vodenoj kupelji (4.3.).
5.2. Temeljito promiješati uzorak laganim preokretanjem kako bi se izbjeglo
stvaranje pjene. Uliti mlijeko u cilindar (4.2.) koji se mora držati nagnutim
kako bi se izbjeglo stvaranje pjene. Koristiti dostatnu količinu uzorka mlijeka
kako bi bili sigurni da će se dio preliti iz cilindra kada se u uzorak uroni
laktodenzimetar (4.1.). Pažljivo spustiti laktodenzimetar u mlijeko i pustiti ga
da slobodno pluta dok ne postigne ravnotežu. Cilindar treba položiti okomito.
Laktodenzimetar treba biti namješten u sredini stupca tekućine i ne bi trebao
dodirivati stranice cilindra.
5.3. Kada se laktodenzimetar umiri očitati oznaku na vrhu meniskusa.
5.4. Odmah nakon što se izvrši očitavanje na hidrometru staviti termometar
(4.5.) u uzorak i očitati temperaturu s točnošću od 0,5 °C. Temperatura ne smije
odstupati više od 2 °C od 20 °C.

6. ISPRAVAK TEMPERATURE

6.1. Ukoliko temperatura uzorka mlijeka ne iznosi točno 20 °C pri mjerenju
specifične mase, onda se dobiveni rezultat mora ispraviti dodavanjem određenoj
specifičnoj masi 0,0002 za svaki stupanj celzija iznad 20 °C, ili oduzimanjem
0,0002 za svaki stupanj celzija ispod 20 °C. Ovaj ispravak provodi se samo
ukoliko temperatura uzorka mlijeka odstupa do 5 °C od 20 °C.

7. IZRAŽAVANJE REZULTATA

Metoda izračuna i formula: specifična masa uzorka izražava se u g/ml obranog
mlijeka na 20 °C u skladu sa sljedećom formulom:
![](dodatni/378870.gif)

pri čemu je
mv = specifična masa uzorka očitana na hidrometru (5.4.) u g/l
MG = udio masti u uzorku u g/l
0,92 = gustoća masti.

8. PRECIZNOST

8.1. Ponovljivost (r): 0,0003 g/ml.
8.2. Obnovljivost (R): 0,0015 g/ml.

DODATAK (Prilogu II.)

ALTERNATIVNI POSTUPAK KOJI UKLJUČUJE KORIŠTENJE EPRUVETA ZA EKSTRAKCIJU MASTI SA
SIFONOM ILI NASTAVKOM BOCE ŠTRCALJKE

A.1. POSTUPAK
*A.1.1. Priprema uzorka za analizu*
Pogledati 6.1.
*A.1.2. Uzorak za analizu*
Učiniti kako je navedeno pod 6.2., ali pri tome koristite epruvete za
ekstrakciju masti (pogledati 5.6.).
Uzorak za analizu treba u potpunosti postaviti na dno epruvete za ekstrakciju.
*A.1.3. Slijepa proba*
Pogledati 6.3.
*A.1.4. Priprema posude za sakupljanje masti*
Pogledati 6.4.
*A.1.5. Određivanje*
A.1.5.1. Dodati 2 ml otopine amonijaka (4.1.), ili jednaki volumen otopine
amonijaka veće koncentracije, i temeljito promiješati s prethodno pripremljenim
uzorkom za analizu na dnu epruvete. Nakon dodavanja amonijaka, provesti analizu
bez odgađanja.
A.1.5.2. Dodati 10 ml etanola (4.2.) i lagano, ali temeljito promiješati na dnu
epruvete. Po želji dodati dvije kapi otopine kongo crvenila ili krezol crvenila
(4.3.).
A.1.5.3. Dodati 25 ml dietiletera (4.4.), zatvoriti epruvetu plutenim čepom
zasićenim vodom ili zatvaračem natopljenim vodom (5.6.), i snažnije tresti
epruvetu (kako bi se izbjeglo nastajanje postojanih emulzija) i preokretati je
jednu minutu. Ukoliko je to potrebno, ohladiti epruvetu u tekućoj vodi, a zatim
pažljivo odstraniti čep od pluta ili drugi zatvarač i isprati čep i vrat
epruvete s malo smjese otapala (4.6.) korištenjem boce štrcaljke (5.8.) tako da
isprani sadržaj uđe u epruvetu.
A.1.5.4. Dodati 25 ml petroletera (4.5.), zatvoriti epruvetu s ponovno
natopljenim plutenim čepom ili drugim zatvaračem (ponovno ga natopiti uranjanjem
u vodu), i lagano tresti epruvetu 30 sekundi kako je opisano u točki A.1.5.3.
A.1.5.5. Centrifugirati zatvorenu epruvetu jednu do pet minuta s rotacijskom
frekvencijom od 500 do 600 okretaja na minutu (5.2.). Ukoliko centrifuga nije na
raspolaganju (pogledati napomenu pod 5.2.), pustiti zatvorenu epruvetu da stoji
u stalku (5.7.) barem 30 minuta, dok gornji sloj ne postane bistar i jasno
odvojen od vodenog sloja. Prema potrebi ohladiti epruvetu pod tekućom vodom.
A.1.5.6. Pažljivo odstraniti pluteni čep ili drugi zatvarač i isprati čep i vrat
epruvete s malo smjese otapala tako da isprani sadržaj uđe u epruvetu.
A.1.5.7. Umetnuti sifonski nastavak ili nastavak boce štrcaljke u epruvetu i
gurnuti prema dolje dugi unutarnji krak nastavka dok dovod ne bude otprilike 3
mm iznad granice između slojeva. Unutarnji krak nastavka treba biti paralelan s
osi epruvete za ekstrakciju.
Pažljivo preliti gornji sloj iz epruvete u pripremljenu posudu za sakupljanje
masti (6.4.) koja sadrži nekoliko pomagala za ključanje (5.10.) u slučaju
tikvica (neobavezno s metalnim zdjelama), izbjegavajući da se pri tome prenese
dio vodenog sloja. Isprati odvod nastavka s malo smijese otapala, sakupljajući
isprani sadržaj u posudu za sakupljanje masti.
A.1.5.8. Otpustiti nastavak iz vrata epruvete, lagano podignuti nastavak i
isprati donji dio njegovog duljeg unutarnjeg kraka s malo smijese otapala.
Spustiti i ponovno umetnuti nastavak pa prenijeti isprani sadržaj u posudu za
sakupljanje masti.
Isprati odvod nastavka s malo smijese otapala, sakupljajući isprani sadržaj u
posudi. Po želji se otapalo ili dio otapala mogu ukloniti iz posude destilacijom
ili isparavanjem, kako je opisano u točki 6.5.12.
A.1.5.9. Ponovno otpustiti nastavak iz vrata, polako podignuti nastavak i
dodajte 5 ml etanola sadržaju epruvete, koristeći etanol za ispiranje dugog
unutarnjeg kraka nastavka; promiješati kako je opisano u točki A.1.5.2.
A.1.5.10. Provesti drugu ekstrakciju ponavljanjem postupka opisanog u točkama od
A.1.5.3. do A.1.5.8., ali pri tome koristiti samo 15 ml dietiletera (4.4.) i 15
ml petroletera (4.5.). Upotrijebiti eter za ispiranje dugog unutarnjeg kraka
nastavka dok se uklanja nastavak iz epruvete nakon prethodne ekstrakcije.
A.1.5.11. Provesti treću ekstrakciju ponovnim ponavljanjem postupka opisanog u
točkama od A.1.5.3. do A.1.5.8., koristeći 15 ml dietiletera i 15 ml petroletera
i ispirući dugi unutarnji krak nastavka u skladu s točkom A.15.10.
Treća ekstrakcija se možete izostaviti kod obranog mlijeka.
A.1.5.12. Postupiti kako je opisano u točkama od 6.5.12. do 6.5.16.

Pravilnik, NN 133/2007-3799
Opći uvjeti korištenjaZaštita privatnosti[Pristup podatcima](/data_access_hr.aspx)[ELI](/about_eli_hr.aspx)

©2026. g. Narodne novine d.d.

, izrada [Novena d.o.o.](http://novena.hr/)