## Pravilnik o izmjenama i dopunama Pravilnika o provođenju sustavnog istraživanja i mjera za sprječavanje širenja i suzbijanja smeđe truleži gomolja krumpira i bakterijskog venuća krumpira i rajčice, k

### NN 89/2008 (30.7.2008.), Pravilnik o izmjenama i dopunama Pravilnika o provođenju sustavnog istraživanja i mjera za sprječavanje širenja i suzbijanja smeđe truleži gomolja krumpira i bakterijskog venuća krumpira i rajčice, k

# MINISTARSTVO POLJOPRIVREDE, RIBARSTVA I RURALNOG RAZVOJA

2843

Na temelju članka 10. stavka 4., članka 11. stavka 5., članka 14. stavka 4. i
članka 50. Zakona o biljnom zdravstvu (»Narodne novine«, br. 75/05), ministar
poljoprivrede, ribarstva i ruralnog razvoja donosi

## PRAVILNIK

### O IZMJENAMA I DOPUNAMA PRAVILNIKA O PROVOĐENJU SUSTAVNOG ISTRAŽIVANJA I MJERA ZA SPRJEČAVANJE ŠIRENJA I SUZBIJANJE SMEĐE TRULEŽI GOMOLJA KRUMPIRA I BAKTERIJSKOG VENUĆA KRUMPIRA I RAJČICE, KOJU PROUZROKUJE BAKTERIJA RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL.

Članak 1.

U Pravilniku o provođenju sustavnog istraživanja i mjera za sprječavanje
širenja i suzbijanje smeđe truleži gomolja krumpira i bakterijskog venuća
krumpira i rajčice, koju prouzrokuje bakterija Ralstonia solanacearum (Smith)
Yabuuchi et al. (»Narodne novine« br. 119/06) u članku 1. briše se točka i
dodaju se riječi: »i postupci laboratorijskog testiranja za dijagnosticiranje,
detekciju i identifikaciju bakterije Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et
al.«.

Članak 2.

Članak 4. stavak 2. mijenja se i glasi:
»(2) Laboratorijska testiranja iz stavka 1. točke 1. i 3. ovoga članka provode
se sukladno postupcima iz Priloga II »SHEMA TESTIRANJA ZA DIJAGNOSTICIRANJE,
DETEKCIJU I IDENTIFIKACIJU BAKTERIJE Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et
al.« koji je tiskan uz ovaj Pravilnik i njegov je sastavni dio (u daljnjem
tekstu: propisani postupci).«

Članak 3.

Prilog tiskan uz Pravilnik o provođenju sustavnog istraživanja i mjera za
sprječavanje širenja i suzbijanje smeđe truleži gomolja krumpira i bakterijskog
venuća krumpira i rajčice, koju prouzrokuje bakterija Ralstonia solanacearum
(Smith) Yabuuchi et al. postaje Prilog I.

Članak 4.

Ovaj Pravilnik stupa na snagu osmog dana od dana objave u »Narodnim
novinama«.
Klasa: 011-02/08-01/19
Urbroj: 525-2-08-1
Zagreb, 16. srpnja 2008.

Ministar poljoprivrede,
ribarstva i ruralnog razvoja
**mr. sc. Božidar Pankretić, v. r.**

PRILOG II.

SHEMA TESTIRANJA ZA DIJAGNOSTICIRANJE, DETEKCIJU I
IDENTIFIKACIJU BAKTERIJE Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.
PODRUČJE PRIMJENE SHEME TESTIRANJA

Prikazana shema testiranja opisuje različite postupke za:
(i) dijagnosticiranje smeđe truleži gomolja krumpira i bakterijskog venuća
krumpira, rajčice i drugih biljaka domaćina;
(ii) detekciju bakterije Ralstonia solanacearum u uzorcima gomolja krumpira,
biljaka krumpira, rajčice i drugih biljaka domaćina te u vodi i tlu;
(iii) identifikaciju bakterije Ralstonia solanacearum (R. solanacearum).

OPĆA NAČELA

Optimizirani protokoli za pojedine metode, validirani reagensi i pojedinosti
za pripremu materijala za testiranje i kontrolnih materijala navedeni su u
Dodacima. Popis laboratorija koji su sudjelovali u optimizaciji i validaciji
protokola nalazi se u Dodatku 1.
S obzirom da protokoli uključuju detekciju karantenskog organizma i uključivat
će uporabu vijabilnih kultura R. solanacearum kao kontrolnih materijala,
postupci će se morati izvoditi u primjerenim karantenskim uvjetima s
odgovarajućom opremom za zbrinjavanje otpada te prema uvjetima dozvola koje
izdaju nadležna tijela za biljnu karantenu.
Parametri testiranja moraju osigurati dosljednu i ponovljivu detekciju onih
razina R. solanacearum prema propisanim pragovima detekcije za pojedine metode.
Precizna priprema pozitivnih kontrola je nužna.
Testiranje u skladu s potrebnim pragovima detekcije podrazumijeva pravilno
postavljanje, održavanje i kalibriranje opreme, pažljivo pohranjivanje i
rukovanje reagenasima te poduzimanje mjera za sprečavanje kontaminacije među
uzorcima, npr. razdvajanje pozitivnih kontrola od uzoraka za testiranje. Moraju
se primijeniti standardi kontrole kvalitete kako bi se izbjegle administrativne
i druge pogreške, posebice pri označavanju uzoraka i vođenju dokumentacije.
Sumnja na zarazu, kao što je navedeno u članku 6. Pravilnika o provođenju
sustavnog istraživanja i mjera za sprječavanje širenja i suzbijanje smeđe
truleži gomolja krumpira i bakterijskog venuća krumpira i rajčice, koju
prouzrokuje bakterija Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. (u daljnjem
tekstu: Pravilnik), podrazumijeva pozitivan rezultat testa za dijagnosticiranje
ili brzog testa provjere provedenog na uzorku kao što je prikazano u dijagramima
toka. Pozitivan rezultat dobiven u prvom brzom testu provjere (IF test,
PCR/FISH, selektivna izolacija) mora se potvrditi drugim testom provjere koji se
temelji na drugom biološkom načelu.
Ako je rezultat prvog testa provjere pozitivan, tada se sumnja na zarazu
bakterijom R. solanacearum i mora se provesti drugi test provjere. Ako je
rezultat drugog testa provjere pozitivan, tada je sumnja potvrđena i testiranje
se mora nastaviti prema shemi testiranja. Ako je rezultat drugog testa provjere
negativan, tada se smatra da uzorak nije zaražen bakterijom R. solanacearum.
Potvrđena zaraza, kao što je navedeno u članku 9. Pravilnika, podrazumijeva
izolaciju i identifikaciju čiste kulture R. solanacearum te potvrdu patogenosti.

ODJELJAK I.
PRIMJENA SHEME TESTIRANJA

1. Shema za detekciju i dijagnosticiranje uzročnika smeđe truleži i
bakterijskog venuća (R. solanacearum) u gomoljima krumpira te biljkama krumpira,
rajčice ili drugim biljkama domaćinima sa simptomima smeđe truleži ili
bakterijskog venuća
Postupak testiranja je namijenjen za gomolje i biljke krumpira sa simptomima
tipičnim za ili koji upućuju na smeđu trulež ili bakterijsko venuće. Postupak
uključuje brzi test provjere, izolaciju patogena iz zaraženog provodnog tkiva na
(selektivnu) hranjivu podlogu i, u slučaju pozitivnog rezultata, identifikaciju
čiste kulture kao bakterije Ralstonia solanacearum.
![](dodatni/348369.gif)

(1) Opis simptoma naveden je u Odjeljku II.1.
(2) Brzi dijagnostički testovi olakšavaju postavljanje vjerojatne dijagnoze, ali
nisu nužni. Negativan rezultat ne jamči uvijek odsutnost patogena.
(3) Test bakterijskog iscjetka iz provodnog tkiva stabljike opisan je u Odjeljku
VI.A.1.
(4) Test za detekciju zrnaca poli-β-hidroksibutirata u bakterijskim stanicama
opisan je u Odjeljku VI.A.2.
(5) Serološki testovi aglutinacije na bakterijskom iscjetku ili ekstraktu iz
simptomatskog tkiva opisani su u Odjeljku VI.A.3.
(6) IF test na bakterijskom iscjetku suspendiranom u vodi ili na ekstraktu iz
simptomatskog tkiva opisan je u Odjeljku VI.A.5.
(7) FISH test na bakterijskom iscjetku suspendiranom u vodi ili na ekstraktu iz
simptomatskog tkiva opisan je u Odjeljku VI.A.7.
(8) ELISA test na bakterijskom iscjetku suspendiranom u vodi ili na ekstraktu iz
simptomatskog tkiva opisan je u Odjeljku VI.A.8.
(9) PCR test na bakterijskom iscjetku suspendiranom u vodi ili na ekstraktu iz
simptomatskog tkiva opisan je u Odjeljku VI.A.6.
(10) Patogen se obično može lako izolirati iz simptomatskog biljnog materijala
metodom razrjeđivanja i nasađivanja na hranjivu podlogu (Odjeljak II.3.)
(11) Tipična morfologija kolonije opisana je u Odjeljku II.3.d.
(12) Uzgoj bakter bakterulture može biti neuspješan u naprednom stadiju
infekcije zbog kompeticije ili pretjeranog razmnožavanja saprofitnih bakterija.
Ako su simptomi bolesti tipični, a test izolacije negativan, test izolacije se
mora ponoviti, najbolje na selektivnoj hranjivoj podlozi.
(13) Pouzdana identifikacija čistih kultura vjerojatnih izolata bakterije R.
solanacearum postiže se provođenjem testova opisanih u Odjeljku VI.B.
Nespecifična karakterizacija je neobvezna ali se preporučuje za svaki novi
slučaj.
(14) Test patogenosti opisan je u Odjeljku VI.C.
2. Shema detekcije i identifikacije bakterije R. solanacearum u uzorcima gomolja
krumpira bez simptoma
Načelo:
Postupak testiranja namijenjen je za detekciju skrivene zaraze u gomoljima
krumpira. Pozitivan rezultat iz najmanje dva testa provjere (3), koji se temelje
na različitim biološkim načelima, mora se dopuniti izolacijom patogena nakon
čega slijedi, u slučaju izolacije tipičnih kolonija, potvrda čiste kulture kao
R. solanacearum. Pozitivan rezultat dobiven samo jednog od testova provjere nije
dovoljan da bi se uzorak smatrao zaraženim.
Testovi provjere i izolacija moraju omogućiti prag detekcije 103 do 104
stanica/ml resuspendiranog taloga uključenog kao pozitivna kontrola u svakoj
seriji testova.
![](dodatni/348370.gif)

(1) Standardna veličina uzoraka je 200 gomolja, iako se postupak može provesti i
na manjim uzorcima ako nije na raspolaganju 200 gomolja.
(2) Metode ekstrakcije i koncentriranja patogena opisane su u Odjeljku III.1.1.
(3) Ako su rezultati najmanje dva testa, koji se temelje na različitim biološkim
načelima, pozitivni, potrebno je provesti izolaciju i potvrdu. Provedite barem
jedan test provjere. Kada je rezultat tog testa negativan, smatra se da je taj
uzorak negativan. U slučaju da je rezultat tog testa pozitivan, potrebno je
provesti drugi ili više testova provjere, koji se temelje na različitim
biološkim načelima, kako bi se potvrdio pozitivan rezultat. Ako su rezultati
drugih ili ostalih testova negativni, smatra se da je taj uzorak negativan.
Daljnji testovi nisu potrebni.
(4) IF test opisan je u Odjeljku VI.A.5.
(5) Selektivna izolacija opisana je u Odjeljku VI.A.4.
(6) PCR testovi opisani su u Odjeljku VI.A.6.
(7) FISH test opisan je u Odjeljku VI.A.7.
(8) ELISA testovi opisani su u Odjeljku VI.A.8.
(9) Biotest opisan je u Odjeljku VI.A.9.
(10) Tipična morfologija kolonije opisana je u Odjeljku II.3.d.
(11) Uzgoj bakterijske kulture ili biotest mogu biti neuspješni zbog kompeticije
ili inhibicije saprofitnim bakterijama. Ako se testovima provjere dobiju jasno
pozitivni rezultati, a rezultati izolacije su negativni, ponovite testove
izolacije iz istog resuspendiranog taloga ili ponovite uzimanje provodnog tkiva
iz pupka gomolja iz istog uzorka te, ako je potrebno, testirajte dodatne uzorke.

(12) Pouzdana identifikacija čistih kultura vjerojatnih izolata bakterije R.
solanacearum postiže se provođenjem testova opisanih u Odjeljku VI.B.
(13) Test patogenosti opisan je u Odjeljku VI.C.
3. Shema za detekciju i identifikaciju bakterije R. solanacearum u uzorcima
biljaka krumpira, rajčice ili drugih biljaka domaćina bez simptoma
![](dodatni/348371.gif)

(1) Za preporučene veličine uzoraka vidi Odjeljak III.2.1.
(2) Metode ekstrakcije i koncentriranja patogena opisane su u Odjeljku III.2.1.
(3) Ako su rezultati najmanje dva testa, koji se temelje na različitim biološkim
načelima, pozitivni, potrebno je provesti izolaciju i potvrdu. Provedite barem
jedan test provjere. Kada je rezultat tog testa negativan, smatra se da je taj
uzorak negativan. U slučaju da je rezultat tog testa pozitivan, potrebno je
provesti drugi ili više testova provjere, koji se temelje na različitim
biološkim načelima, kako bi se potvrdio pozitivan rezultat. Ako su rezultati
drugih ili ostalih testova negativni, smatra se da je taj uzorak negativan.
Daljnji testovi nisu potrebni.
(4) Selektivna izolacija opisana je u Odjeljku VI.A.4.
(5) IF test opisan je u Odjeljku VI.A.5.
(6) PCR testovi opisani su u Odjeljku VI.A.6.
(7) FISH test opisan je u Odjeljku VI.A.7.
(8) ELISA Test opisani su u Odjeljku VI.A.8.
(9) Biotest opisan je u Odjeljku VI.A.9.
(10) Tipična morfologija kolonije opisana je u Odjeljku II.3.d.
(11) Uzgoj bakterijske kulture ili biotest mogu biti neuspješni zbog kompeticije
ili inhibicije saprofitnim bakterijama. Ako se testovima provjere dobiju jasno
pozitivni rezultati, a rezultati izolacije su negativni, ponovite testove
izolacije.
(12) Pouzdana identifikacija čistih kultura vjerojatnih izolata bakterije R.
solanacearum postiže se provođenjem testova opisanih u Odjeljku VI.B.
(13) Test patogenosti opisan je u Odjeljku VI.C.

ODJELJAK II.
PODROBNE METODE ZA DETEKCIJU BAKTERIJE R. SOLANACEARUM U GOMOLJIMA KRUMPIRA, TE
BILJKAMA KRUMPIRA, RAJČICE ILI DRUGIM BILJAKAMA DOMAĆINIMA SA SIMPTOMIMA SMEĐE
TRULEŽI ODNOSNO BAKTERIJSKOG VENUĆA

1. Simptomi
(vidi mrežnu stranicu http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)
1.1. Simptomi na krumpiru
Biljka krumpira. Početna faza infekcije u polju prepoznaje se po venuću lišća
pri vrhu biljke na visokim temperaturama tijekom dana, ali koje se oporavlja
tijekom noći. U ranim fazama venuća lišće ostaje zeleno ali kasnije počinje
žutjeti i razvija se smeđa nekroza. Dolazi i do epinastije. Ubrzo dolazi do
nepovratnog venuća izdanka ili cijele biljke što dovodi do propadanja i
odumiranja. Provodno tkivo poprečno prerezane stabljike uvenule biljke obično je
smeđe boje, a iz prereza izlazi ili se lako može gnječenjem istisnuti mliječni
bakterijski iscjedak. Kad se prerezana stabljika stavi uspravno u vodu, niti
sluzi će izlaziti iz provodnih snopova.
Gomolj krumpira. Gomolje krumpira treba prerezati poprečno ili uzdužno u blizini
pupka gomolja. Početna faza infekcije prepoznaje se po promjeni boje provodnog
prstena od staklasto-žute do svijetlosmeđe iz kojeg se spontano, nakon nekoliko
minuta, pojavljuje blijedi kremasti bakterijski iscjedak. Kasnije, provodno
tkivo postaje izrazitije smeđe i nekroza se može proširiti na parenhimsko tkivo.
U uznapredovalim fazama infekcija izbija prema van od kraja pupka gomolja i
okaca iz kojih može curiti bakterijska sluz na koju se lijepe čestice tla. Na
kori se mogu pojaviti crvenkasto-smeđa uleknuća zbog propadanja provodnog tkiva
iznutra. U uznapredovalim fazama bolesti uobičajen je i sekundarni razvoj
gljivične i bakterijske meke truleži.
1.2. Simptomi na rajčici
Biljka rajčice. Prvi vidljivi simptom je povenulost najmlađih listova. U
uvjetima koji su povoljni za patogen (temperatura tla oko 25 °C; zasićenost
vlagom) u roku od nekoliko dana dolazi do epinastije i venuća samo jedne strane
ili cijele biljke što dovodi do potpunog propadanja. U manje povoljnim uvjetima
(temperatura tla manja od 21 °C) venuće se rjeđe pojavljuje, ali se na stabljici
može razviti veliki broj adventivnog korijenja. Moguće je uočiti kao vodom
natopljene pruge koje se protežu duž stabljike, od njene baze, koje su trag
nekroze u provodnom sustavu. Ako se stabljika unakrsno prereže, iz provodnog
tkiva čija je boja promijenjena u smeđu, curi bijeli ili žućkasti bakterijski
iscjedak.
1.3. Simptomi na drugim biljkama domaćinima
Biljke Solanum dulcamara i S. nigrum. U prirodnim uvjetima rijetko se uočavaju
simptomi venuća kod ovih biljaka domaćina, osim ako temperatura tla prelazi 25
°C ili ako su razine inokuluma iznimno visoke (npr. S. nigrum koji raste blizu
oboljele biljke krumpira ili rajčice). Ako dođe do venuća, simptomi su isti kao
i kod rajčice. Biljke S. dulcamara rastu sa stabljikama i korijenjem u vodi i na
njima nije vidljivo venuće, ali je na poprečnom prerezu baze stabljike ili
dijelovima stabljike koji su pod vodom vidljiva svijetlosmeđa obojenost
provodnprovodnog tkiva. Baktogu izlaziti iz prerezanog provodnog tkiva, u obliku
sluzavog iscjetka ili niti, ako prerezanu stabljiku stavimo uspravno u vodu, čak
i ako nema simptoma venuća.
2. Brzi testovi provjere
Brzi testovi provjere olakšavaju postavljanje vjerojatne dijagnoze, ali nisu
presudni. Primijenite jedan ili više sljedećih validiranih testova:
2.1. Test iscjetka iz stabljike
(vidi Odjeljak VI.A.1.)
2.2. Detekcija zrnaca poli-β-hidroksibutirata (PHB)
Karakteristična zrnca PHB-a u stanicama R. solanacearum postaju vidljiva pri
bojanju termički fiksiranog razmaza bakterijskog iscjetka iz zaraženog tkiva na
mikroskopskom stakalcu nilskim plavilom A i sudanskim crnilom B. (vidi Odjeljak
VI.A.2.).
2.3. Serološki testovi aglutinacije
(vidi Odjeljak VI.A.3.)
2.4. Ostali testovi
U ostale prikladne brze testove provjere spadaju IF test (vidi Odjeljak
VI.A.5.), FISH test (vidi Odjeljak VI.A.7.), ELISA testovi (vidi Odjeljak
VI.A.8.) i PCR testovi (vidi Odjeljak VI.A.6.)
3. Postupak izolacije
(a) Uzmite bakterijski iscjedak ili dijelove tkiva promijenjene boje iz
provodnog prstena gomolja krumpira ili iz provodnih snopova stabljike krumpira,
rajčice ili drugih venućih biljaka domaćina. Suspendirajte u manjoj količini
sterilne destilirane vode ili 50 mM fosfatnog pufera (Dodatak 4) te ostavite 5
do 10 minuta.
(b) Pripremite niz decimalnih razrjeđenja suspenzije.
(c) Prenesite 50-100 µl suspenzije i razrjeđenja na uobičajenu hranjivu podlogu
(NA, YPGA ili SPA; vidi Dodatak 2.) i/ili na Kelmanovu tetrazolij-podlogu
(Dodatak 2.) i/ili na validiranu selektivnu podlogu (npr. SMSA; vidi Dodatak
2.). Razmažite primjenjujući odgovarajuću tehniku nanošenja razrjeđenja na
podlogu. Ako se smatra korisnim, pripremite odvojene podloge s razrijeđenom
staničnom suspenzijom bakterije R. solanacearum biovar 2 za pozitivnu kontrolu.
(d) Inkubirajte podloge od dva do šest dana na 28 °C.
– Na uobičajenoj hranjivoj podlozi virulentni izolati bakterije R. solanacearum
stvaraju plosnate, nepravilne i tekuće kolonije biserne kremasto-bijele boje,
često s karakterističnim spiralama u sredini. Nevirulentni oblici bakterije R.
solanacearum stvaraju male, okrugle, netekuće, maslaste kolonije koje su u
cijelosti kremasto-bijele boje.
– Na Kelmanovoj tetrazolij-podlozi i na SMSA podlozi spirale su krvavo crvene
boje. Nevirulentni oblici bakterije R. solanacearum stvaraju male, okrugle,
netekuće, maslaste kolonije koje su u cijelosti tamno crvene boje.
4. Identifikacijski testovi za bakteriju R. solanacearum
Testovi za potvrdu identifikacije vjerojatnih izolata R. solanacearum navedeni
su u Odjeljku VI.B.

ODJELJAK III.

1. Podrobne metode za detekciju i identifikaciju bakterije R. solanacearum u
uzorcima gomolja krumpira bez simptoma
1.1. Priprema uzorka
Napomena:
– standardna veličina uzorka je 200 gomolja po testu. Intenzivnije uzorkovanje
zahtijeva više testova na uzorcima ove veličine. Veći broj gomolja u uzorku
dovest će do inhibicije ili će otežati tumačenje rezultata. Međutim, postupak se
može prikladno primijeniti za uzorke s manje od 200 gomolja, kada je na
raspolaganju manje gomolja;
– validacija svih metoda za detekciju, koje su opisane u daljnjem tekstu,
temelji se na testiranju uzoraka od 200 gomolja;
– ekstrakt krumpira koji je opisan u daljnjem tekstu može se koristiti i za
detekciju bakterije Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus koja uzrokuje
prstenastu trulež gomolja krumpira.
Neobvezna obrada prije pripreme uzorka:
(a) Inkubirajte uzorak na 25-30 °C u razdoblju do dva tjedna prije provođenja
testova, kako bi se potaklo umnožavanje populacija bakterije R. solanacearum.
(b) Operite gomolje. Upotrijebite prikladna dezinfekcijska sredstva (spojeve
klora kada će se provesti PCR test kako bi se uklonila moguća DNK patogena) i
deterdžente između svakog uzorka. Osušite gomolje na zraku. Postupak pranja je
posebice koristan (ali ne obvezan) za uzorke s previše tla i ako će se provesti
PCR test ili direktna izolacija.
1.1.1. Čistim i dezinficiranim skalpelom ili nožem za povrće uklonite koru na
pupku gomolja tako da provodno tkivo bude vidljivo. Pažljivo izrežite malu
jezgru provodnog tkiva iz pupka gomolja pazeći da zahvatite što manje okolnog,
neprovodnog tkiva.
(vidi mrežnu stranicu http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Napomena:
Odvojite sve (trule) gomolje s mogućim simptomima smeđe truleži i testirajte ih
posebno. Ako se pri izrezivanju jezgre pupka uoče mogući simptomi smeđe truleži,
taj se gomolj mora vizualno pregledati i prerezati blizu pupka. Svaki prerezani
gomolj sa sumnjivim simptomima treba držati najmanje dva dana na sobnoj
temperaturi kako bi suberizirao, te čuvati u hladnjaku (na temperaturi od 4 do
10 °C) u odgovarajućim karantenskim uvjetima. Svi se gomolji, uključujući i one
sa sumnjivim simptomima, trebaju čuvati u skladu s člankom 7. Pravilnika.
1.1.2. Stavite jezgre pupaka u neupotrebljene posude za jednokratnu uporabu koje
se mogu zatvoriti i/ili hermetički zatvoriti (ako su posude već upotrebljavane,
moraju se temeljito očistiti i dezinficirati spojevima klora). Poželjno ih je
odmah obraditi. Ako to nije moguće, čuvajte ih u posudi bez dodatka pufera,
najdulje 72 sata u hladnjaku ili najdulje 24 sata na sobnoj temperaturi.
Obradite jezgre pupaka jednim od sljedećih postupaka:
(a) dodajte dovoljnu količinu (oko 40 ml) ekstrakcijskog pufera (Dodatak 4) da
pokrije jezgre pupaka i tresite na rotacijskoj tresilici (50-100 okretaja/min) 4
sata na temperaturi ispod 24 °C ili 16 do 24 sata uz hlađenje,
ili
(b) homogenizirajte jezgre pupaka s dovoljnom količinom (oko 40 ml)
ekstrakcijskog pufera (Dodatak 4), bilo u miješalici (npr. Waring ili Ultra
Thurax) ili drobljenjem u dobro zatvorenoj vrećici za maceraciju za jednokratnu
uporabu (npr. vrećice Stomacher ili Bioreba od čvrstog politena, 150 mm x 250
mm, sterilizirane zračenjem) koristeći gumeni bat ili prikladnu drobilicu (npr.
Homex).
Napomena:
Ako se uzorci homogeniziraju u miješalici, postoji velika opasnost od njihove
unakrsne kontaminacije. Poduzmite mjere opreza kako biste spriječili nastajanje
aerosola ili razlijevanje tijekom postupka ekstrakcije. Pobrinite se da za svaki
uzorak upotrijebite svježe sterilizirane nožiće i posude miješalice. Ako će se
provesti PCR test, spriječite prijenos DNK na spremnike ili drobilicu. Za PCR
test preporučuje se drobljenje u vrećicama za jednokratnu uporabu i korištenje
epruveta za jednokratnu uporabu.
1.1.3. Odlijte supernatant. Ako je previše mutan, razbistrite ga sporim
centrifugiranjem (na najviše 180 g 10 minuta na temperaturi od 4 do 10 °C) ili
vakuumskom filtracijom (40 do 100 µm), i dodatno isperite filtar ekstrakcijskim
puferom (oko 10 ml).
1.1.4. Koncentrirajte bakterijsku frakciju centrifugiranjem na 7000 g 15 minuta
(ili 10000 g 10 minuta) na temperaturi od 4 do 10 °C te odlijte supernatant
pazeći pri tom da se ne pomiješa talog.
1.1.5. Resuspendirajte talog u 1.5 ml pufera za talog (Dodatak 4). Upotrijebite
500 µl za testiranje na R. solanacearum, 500 µl za Clavibacter michiganensis
subsp. sepedonicus i 500 µl kao referentni materijal. U referentni alikvot od
500 µl i u preostale alikvote koji se testiraju dodajte sterilni glicerol do
konačne koncentracije od 10 do 25 % (v/v), snažno promiješajte u vrtložnoj
mješalici te pohranite na temperaturi od –16 do –24 °C (tjednima) ili od –68 do
–86 °C (mjesecima). Tijekom testiranja, alikvote koji se koriste čuvajte na
temperaturi od 4 do 10 °C.
Ne preporučuje se višekratno zamrzavanje i odmrzavanje.
Ako je potreban transport ekstrakta, osigurajte dostavu u prijenosnome hladnjaku
u roku od 24 do 48 sati.
1.1.6. Sve pozitivne kontrole i uzorci R. solanacearum moraju se odvojeno
pripremiti i obraditi kako bi sko bi se izbjegla konija. To vrijedi za stakalca
za imunofluorescenciju kao i za sve ostale testove.
1.2. Testiranje
Vidi dijagram te opis testova i optimizirane protokole u odgovarajućim dodacima:
Selektivna izolacija (vidi Odjeljak VI.A.4.)
IF test (vidi Odjeljak VI.A.5.)
PCR testovi (vidi Odjeljak VI.A.6.)
FISH test (vidi Odjeljak VI.A.7.)
ELISA testovi (vidi Odjeljak VI.A.8.)
Biotest (vidi Odjeljak VI.A.9.)
2. Podrobne metode za detekciju i identifikaciju bakterije R. solanacearum u
uzorcima biljaka krumpira, rajčice ili drugih biljaka domaćina bez simptoma
2.1. Priprema uzorka
Napomena:
Za detekciju latentnih populacija bakterije R. solanacearum preporučuje se
testiranje sastavljenih uzoraka. Postupak se može prikladno primijeniti na
sastavljene uzorke s najviše 200 dijelova stabljika. Ako se provode sustavna
istraživanja, ona se moraju temeljiti na statistički reprezentativnom uzorku
biljne populacije koja se ispituje.
2.1.1. Stavite dijelove stabljika veličine 1 do 2 cm u zatvorenu sterilnu posudu
prema sljedećim postupcima uzorkovanja:
Presadnice rajčice iz rasadnika. Čistim dezinficiranim nožem odrežite dio
veličine 1 cm s donjeg dijela svake stabljike, neposredno iznad razine tla.
Biljke rajčice iz polja ili staklenika. Čistim, dezinficiranim nožem odrežite
najniži postrani izdanak na svakoj biljci režući tik iznad spoja sa stabljikom.
Sa svakog bočnog izdanka odrežite donji dio veličine 1 cm.
Ostale biljke domaćini. Čistim, dezinficiranim nožem ili vrtlarskim škarama
odrežite dio veličine 1 cm s donjeg dijela svake stabljike, neposredno iznad
razine tla. Ako se uzorkuje S. dulcamara ili druge biljke domaćini koje rastu u
vodi, odrežite dio veličine 1-2 cm s podvodnog dijela stabljike ili sa stolona s
vodenim korijenjem.
Pri uzorkovanju na određenoj lokaciji, preporučuje se testirati statistički
reprezentativni uzorak od najmanje 10 biljaka po mjestu uzorkovanja za svaku
vrstu samoniklog bilja koja je potencijalni domaćin. Detekcija patogena
najpouzdanija je krajem proljeća te tijekom ljeta i jeseni, iako se prirodne
infekcije mogu otkriti tijekom cijele godine kod višegodišnje biljke Solanum
dulcamara koja raste u tekućicama. Poznati domaćini su samonikle biljke krumpira
(gomolji ostali u tlu), Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium i drugi
vrste porodice Solanaceae. Ostale biljke domaćini su Pelargonium spp. i
Portulaca oleracea. Europske vrste samoniklog bilja koje u specifičnim uvjetima
okoliša mogu biti potencijalni domaćini populacija R. solanacearum biovar 2 /
rasa 3 u korijenju i/ili rizosferi su Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium
glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora,
Ranunculus scleratus, Rorippa spp, Rumex spp., Silene alba, S. nutans.,
Tussilago farfarra i Urtica dioica.
Napomena:
U ovoj se fazi može obaviti vizualni pregled biljaka (obojenost žila ili
bakterijski iscjedak). Odvojite sve dijelove stabljika sa simptomima i
testirajte ih posebno. (vidi Odjeljak II.)
2.1.2. Kratko dezinficirajte dijelove stabljika 70 %-tnim etanolom i odmah
posušite papirnatim ručnikom. Dijelove stabljika potom obradite jednim od
sljedećih postupaka:
(a) prekrijte ih dovoljnom količinom (oko 40 ml) ekstrakcijskog pufera (Dodatak
4) i tresite na rotacijskoj tresilici (50-100 okretaja/min) četiri sata na
temperaturi ispod 24 °C ili 16 do 24 sata uz hlađenje,
ili
(b) odmah obradite drobljenjem u čvrstoj vrećici za maceraciju (npr. Stomacher
ili Bioreba) s odgovarajućom količinom ekstrakcijskog pufera (Dodatak 4)
koristeći gumeni bat ili prikladnu drobilicu (npr. Homex). Ako to nije moguće,
dijelove stabljika čuvajte u hladnjaku najdulje 72 sata ili na sobnoj
temperaturi najdulje 24 sata.
2.1.3. Nakon 15 minuta taloženja, izlijte supernatant.
2.1.4. Dodatno bistrenje ekstrakta ili koncentriranje bakterijske frakcije
obično nije potrebno, ali se može postići filtriranjem i/ili centrifugiranjem
kako je opisano u Odjeljku III.1.1.3. – 1.1.5.
2.1.5. Podijelite čisti ili koncentrirani ekstrakt uzorka na dva jednaka dijela.
Jednu polovicu čuvajte na temperaturi od 4 do 10 °C tijekom testiranja, a drugu
polovicu pohranite s 10-25 % (v/v) sterilnog glicerola na temperaturi od –16 do
– 25 °C (tjednima) ili od – 68 do – 86 °C (mjesecima) u slučaju da je potrebno
daljnje testiranje.
2.2. Testiranje
Vidi dijagram te opis testova i optimizirane protokole u odgovarajućim dodacima:
Selektivna izolacija (vidi Odjeljak VI.A.4.)
IF test (vidi Odjeljak VI.A.5.)
PCR testovi (vidi Odjeljak VI.A.6.)
FISH test (vidi Odjeljak VI.A.7.)
ELISA testovi (vidi Odjeljak VI.A.8.)
Biotest (vidi Odjeljak VI.A.9.)

ODJELJAK IV.

1. Shema za detekciju i identifikaciju bakterije R. solanacearum u vodi
![](dodatni/348372.gif)

(1) Za preporučene postupke uzorkovanja vidi Odjeljak IV.2.1.
(2) Metode koncentriranja patogena opisane su u Odjeljku IV.2.1. Koncentriranjem
se povećavaju populacije i patogena i konkurentnih saprofitnih bakterija te se
taj postupak preporučuje jedino ako neće inhibirati izolaciju.
(3) Selektivna izolacija opisana je u Odjeljku VI.A.4.
(4) Biotest je opisan u Odjeljku VI.A.9.
(5) Metode obogaćivanja za PCR test opisane su u Odjeljku VI.A.4.2. i Odjeljku
VI.A.6.
(6) Metode obogaćivanja za ELISA test opisane su u Odjeljku VI.A.4.2. i Odjeljku
VI.A.8.
(7) Tipična morfologija kolonije opisana je u Odjeljku II.3.d.
(8) Uzgoj bakterijske kulture može biti neuspješan zbog kompeticije ili
inhibicije saprofitnih bakterija. Ako se sumnja da će velike populacije
saprofitnih bakterija utjecati na pouzdanost izolacije, ponovite izolaciju nakon
što uzorak razrijedite u sterilnoj vodi.
(9) Pouzdana identifikacija čistih kultura vjerojatnih izolata bakterije R.
solanacearum postiže se provođenjem testova opisanih u Odjeljku VI.B.
(10) Test patogenosti opisan je u Odjeljku VI.C.
2. Metode za detekciju i identifikaciju bakterije R. solanacearum u vodi
Načelo
Validirani postupak opisan u ovom odjeljku može se primijeniti za detekciju
patogena u uzorcima površinske vode kao i za ispitivanje uzoraka tekućeg otpada
nastalog pri preradi krumpira ili otpadnih voda. Međutim, važno je napomenuti da
će očekivana osjetljivost detekcije ovisiti o supstratu. Na osjetljivost
izolacije utječu populacije konkurentnih saprofitnih bakterija koje su općenito
veće u otpadnim vodama nastalim pri preradi i obradi krumpira nego u površinskim
vodama. Dok se može očekivati da će se dalje opisanim postupkom detektirati tek
103 stanica po litri površinske vode, osjetljivost detekcije u tekućem otpadu
nastalom pri preradi krumpira i u otpadnim vodama bit će vjerojatno znatno niža.
Stoga se preporučuje testirati otpadne vode poslije svakog postupka
pročišćavanja (npr. sedimentiranja ili filtriranja) tijekom kojega se smanjuju
populacije saprofitnih bakterija. Kada ocjenjujemo pouzdanost dobivenih
negativnih rezultata, treba uzeti u obzir ograničenja u osjetljivosti postupka
testiranja. Iako se ovaj postupak uspješno primjenjuje u istraživanjima čiji je
cilj utvrditi prisutnost ili odsutnost patogena u površinskim vodama, treba biti
svjestan njegovog ograničenja ako se koristi u sličnim istraživanjima tekućeg
otpada nastalog pri preradi krumpira ili otpadnih voda.
2.1. Priprema uzorka
Napomena:
– Detekcija bakterije R. solanacearum u površinskim vodama najpouzdanija je u
kasno proljeće te tijekom ljeta i jeseni kada je temperatura vode iznad 15 °C.
– Ponovljena uzorkovanja u različito vrijeme tijekom gore navedenih razdoblja na
određenim mjestima uzorkovanja povećat će pouzdanost detekcije jer će se
smanjiti učinci vremenskih promjena.
– Treba uzeti u obzir učinke obilnih padalina te zemljopisna obilježja tekućice
kako bi se izbjegao značajni utjjni utjecaj razrjeđenja kojirikriti prisutnost
patogena.
– Uzorke površinske vode treba uzeti blizu biljaka domaćina ako one postoje.
2.1.1. Na odabranim mjestima uzorkovanja uzmite uzorke vode u sterilne epruvete
ili boce za jednokratnu uporabu, po mogućnosti na dubini većoj od 30 cm i na
udaljenosti od najviše 2 m od obale. U slučaju tekućeg otpada nastalog pri
preradi krumpira i otpadnih voda, uzorke uzmite na mjestu njihovog ispusta.
Preporučena veličina uzorka je 500 ml po mjestu uzorkovanja. Ako se žele manji
uzorci, preporučuje se uzimanje uzoraka najmanje tri puta na svakom mjestu
uzorkovanja, pri čemu se svaki uzorak sastoji od dva poduzorka od najmanje 30
ml. Za intenzivno istraživanje odaberite najmanje tri mjesta uzorkovanja na 3 km
tekućice te osigurajte uzimanje uzoraka i iz pritoka te tekućice.
2.1.2. Uzorke prevozite u tami i pri niskim temperaturama (4 do
10 °C) i testirajte ih u roku od 24 sata.
2.1.3. Bakterijska frakcija može se, po potrebi, koncentrirati pomoću jedne od
sljedećih metoda:
(a) centrifugirajte 30 do 50 ml poduzorka na 10 000 g 10 minuta (ili 7 000 g 15
minuta) po mogućnosti na temperaturi od 4 do
10 °C, uklonite supernatant i resuspendirajte talog u 1 ml pufera za talog
(Dodatak 4.);
(b) membranskom filtracijom (najmanja veličina pora 0,45 µm) nakon koje se
filter ispire u 5 do 10 ml pufera za talog, koji se sakuplja. Ova je metoda
prikladna za veće količine vode koja sadrži mali broj saprofita.
Koncentriranje se obično ne preporučuje za uzorke tekućeg otpada nastalog pri
preradi krumpira ili uzorke otpadnih voda jer će veće populacije konkurentnih
saprofitnih bakterija spriječiti detekciju bakterije Ralstonia solanacearum.
2.2. Testiranje
Vidi dijagram te opis testova i optimizirane protokole u odgovarajućim dodacima.

ODJELJAK V.

1. Shema za detekciju i identifikaciju bakterije R. solanacearum u tlu
![](dodatni/348373.gif)

(1) Za preporučene postupke uzorkovanja vidi Odjeljak IV.2.1.
(2) Selektivna izolacija opisana je u Odjeljku VI.A.4.
(3) Metode obogaćivanja za PCR test opisane su u Odjeljku VI.A.4.2. i Odjeljku
VI.A.6.
(4) Biotest je opisan u Odjeljku VI.A.9.
(5) Tipična morfologija kolonije opisana je u Odjeljku II.3.d.
(6) Uzgoj bakterijske kulture može biti neuspješan zbog kompeticije ili
inhibicije saprofitnih bakterija. Ako se sumnja da će velike populacije
saprofitnih bakterija utjecati na pouzdanost izolacije, ponovite izolaciju nakon
što uzorak dodatno razrijedite.
(7) Pouzdana identifikacija čistih kultura vjerojatnih izolata bakterije R.
solanacearum postiže se primjenom testova opisanih u Odjeljku VI.B.
(8) Test patogenosti opisan je u Odjeljku VI.C.
2. Metode za detekciju i identifikaciju bakterije R. solanacearum u tlu
Načela
Validirani postupak opisan u ovom odjeljku može se primijeniti za detekciju
patogena u uzorcima tla kao i za ispitivanje uzoraka krutog otpada nastalog pri
preradi krumpira ili uzoraka kanalizacijskog mulja. Međutim, važno je napomenuti
da ove metode nisu dovoljno osjetljive da bi jamčile detekciju manjih i/ili
neravnomjerno raspoređenih populacija bakterije R. solanacearum koje mogu biti
prirodno prisutne u uzorcima tih supstrata.
Treba uzeti u obzir ograničenja u osjetljivosti ovog postupka testiranja pri
ocjenjivanju pouzdanosti dobivenih negativnih rezultata kao i kada ovaj postupak
primjenjujemo u istraživanjima čiji je cilj utvrditi prisutnost ili odsutnost
patogena u tlu ili mulju. Najpouzdaniji način utvrđivanja prisutnosti patogena u
tlu na polju je taj da posadimo biljku domaćina koja je osjetljiva na taj
patogen te pratimo hoće li doći do infekcije, ali čak ni ovom metodom neće se
otkriti niske razine kontaminacije.
2.1. Priprema uzorka
2.1.1. Uzorkovanje tla u polju treba obavljati u skladu s osnovnim načelima koja
se primjenjuju kod uzorkovanja za ispitivanje nematoda. Sa 60 mjesta na svaka
0,3 ha uzmite 0,5 do 1 kg tla po uzorku, s dubine od 10 do 20 cm (ili na mreži
od 7 x 7 metara). Ako se sumnja na prisutnost patogena, povećajte broj mjesta
uzorkovanja na 120 na svakih 0,3 ha. Prije testiranja uzorke čuvajte na
temperaturi od 12 do 15 °C. Uzorkovanje krutog otpada nastalog pri preradi
krumpira ili uzorkovanje kanalizacijskog mulja obavite tako što ćete uzeti
ukupno 1 kg na mjestima koja predstavljaju ukupnu količinu mulja koju treba
testirati. Svaki uzorak dobro promiješajte prije testiranja.
2.1.2. Rastresite poduzorke od 10 do 25 g tla ili mulja na rotacijskoj tresilici
(250 o/min) u 60 do 150 ml ekstrakcijskog pufera (Dodatak 4) najdulje dva sata.
Dodavanje 0,02 %-tnog sterilnog Tween-20 i 10 do 20 g sterilnog pijeska može, po
potrebi, pridonijeti rastresanju.
2.1.3. Suspenziju održavajte na temperaturi od 4 °C tijekom testiranja.
2.2. Testiranje
Vidi dijagram i opis testova u odgovarajućim dodacima.

ODJELJAK VI.
OPTIMIZIRANI PROTOKOLI ZA DETEKCIJU I IDENTIFIKACIJU BAKTERIJE R. SOLANACEARUM
A. DIJAGNOSTIČKI TESTOVI I TESTOVI ZA DETEKCIJU

1. Test iscjetka iz stabljike
Vjerojatna prisutnost bakterije R. solanacearum u stabljikama uvelih biljaka
krumpira, rajčice ili drugih biljaka domaćina može se utvrditi sljedećim
jednostavnim testom: odrežite stabljiku neposredno iznad razine tla. Odrezani
kraj stavite u epruvetu s čistom vodom. Pratite hoće li nakon nekoliko minuta iz
prerezanih provodnih snopova početi spontano izlaziti karakteristične niti
bakterijske sluzi.
2. Detekcija zrnaca poli-β-hidroksibutirata (PHB)
1. Na mikroskopskom stakalcu pripremite razmaz bakterijskog iscjetka iz
zaraženog tkiva ili iz 48-satne kulture sa hranjive podloge YPGA ili SPA (vidi
Dodatak 2).
2. Za pozitivnu kontrolu pripremite razmaze biovara 2, bakterije R. solanacearum
i, ako smatrate korisnim, za negativnu kontrolu razmaz bakterijske vrste za koju
je poznato da je negativna na PHB.
3. Razmaze ostavite da se osuše na zraku i donju stranu svakog stakalca brzo
povucite iznad plamena da se razmazi fiksiraju.
4. Obojite preparat ili Nilskim plavilom ili Sudanskim crnilom te promatrajte
pod mikroskopom kako je opisano u daljnjem tekstu:
Nilsko plavilo test:
(a) Prelijte svako stakalce s 1 %-tnom vodenom otopinom Nilskog plavila A i
inkubirajte 10 minuta na 55 °C.
(b) Ocijedite otopinu boje. Isperite kratko pod blagim mlazom vode iz slavine.
Višak vode uklonite upijajućim papirom.
(c) Prelijte razmaz 8 %-tnom vodenom otopinom octene kiseline i inkubirajte
jednu minutu na sobnoj temperaturi.
(d) Isperite kratko pod blagim mlazom vode iz slavine. Višak vode uklonite
upijajućim papirom.
(e) Ponovo navlažite kapljicom vode i pokrijte pokrovnim stakalcem.
(f) Pregledajte obojeni razmaz epifluorescentnim mikroskopom na 450 nm,
imerzijskim objektivom povećanja od 600 do 1000 x (uljna ili vodena imerzija).
(g) Pregledajte da li je prisutna svijetlonarančasta fluorescencija zrnaca
PHB-a. Također pregledajte pod normalnim svjetlom kako biste se uvjerili da su
zrnca unutarstanična i da je stanična morfologija tipična za bakteriju R.
solanacearum.
Sudansko crnilo test:
(a) Prelijte svako stakalce 0,3 %-tnom otopinom Sudanskog crnila B u 70 %-tnom
etanolu i inkubirajte 10 minuta na sobnoj temperaturi.
(b) Ocijedite otopinu boje, kratko isperite pod mlazom vode iz slavine i višak
vode uklonite upijajućim papirom.
(c) Stakalca nakratko umočite u ksilol te ih osušite na upijajućem papiru.
Oprez! Ksilol je opasan za zdravlje. Poduzmite potrebne sigurnosne mjere i
radite u digestoru.
(d) Prelijte stakalca 0,5 %-tnom (w/v) vodenom otopinom safranina i ostavite 10
sekundi na sobnoj temperaturi. Oprez! Safranin je opasan za zdravlje. Poduzmite
potrebne sigurnosne mjere i radite u digestoru.
(e) Isperite pod blagim mlazom vode iz slavine, osušite na upijajućem papćem papiru te
pokrijte pokrovnim em.
(f) Pregledajte obojene razmaze pod mikroskopom koji koristi prolazno svjetlo,
uljnim imerzijskim objektivom povećanja od 1000 x.
(g) Pregledajte uočavaju li se plavo-crno obojena zrnca PHB-a u stanicama R.
solanacearum s ružičasto obojenim staničnim stjenkama.
3. Serološki test aglutinacije
Aglutinacija stanica bakterije R. solanacearum u bakterijskom iscjetku ili
ekstraktima simptomatskih tkiva najbolje se opaža korištenjem validiranih
antitijela (vidi Dodatak 3) obilježenih odgovarajućim obojenim oznakama kao što
su crvene stanice Staphylococcus aureus ili obojene čestice lateksa. Ako
koristite komplet koji je dostupan na tržištu (vidi Dodatak 3), slijedite upute
proizvođača. U protivnom, primijenite sljedeći postupak:
(a) pomiješajte kapljice suspenzije obilježenog antitijela i bakterijskog
iscjetka (oko 5 µl svakog) na predmetnim stakalcima s više jažica;
(b) pripremite pozitivne i negativne kontrole koristeći suspenzije R.
solanacearum biovar 2 i heterolognog soja;
(c) promatrajte hoće li doći do aglutinacije u pozitivnim uzorcima nakon 15
sekundi laganog miješanja.
4. Selektivna izolacija
4.1. Nasađivanje na selektivnu podlogu
Napomena:
Prije nego ovu metodu prvi put primijenite, obavite prethodne testove kako biste
osigurali ponovljivu detekciju 103 do 104 jedinica koje stvaraju kolonije (CFU)
bakterije R. solanacearum po ml, a koje su dodane ekstraktima uzoraka koji su
prema ranijim testiranjima negativni.
Koristite primjereno validiranu selektivnu hranjivu podlogu kao što je SMSA
(prilagođenu prema Elphinstone i sur., 1996; vidi Dodatak 2).
Trebate dobro paziti da razlikujete R. solanacearum od drugih bakterija čije
kolonije mogu rasti na toj hranjivoj podlozi. Nadalje, kolonije R. solanacearum
mogu biti netipične morfologije ako su podloge prenatrpane ili ako su prisutne
antagonističke bakterije. Ako se sumnja na učinke kompeticije ili antagonizma,
uzorak treba ponovo testirati drugim testom.
Najveća osjetljivost detekcije ovom metodom može se očekivati ako se koriste
svježe pripremljeni ekstrakti uzoraka. Međutim, ova se metoda može primjenjivati
i na ekstraktima koji su bili pohranjeni s glicerolom na temperaturi od – 68 do
– 86 °C.
Za pozitivnu kontrolu pripremite decimalna razrjeđenja suspenzije od 106 CFU/ml
virulentnog soja biovara 2, R. solanacearum (npr. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP
3857). Kako bi se spriječila svaka mogućnost kontaminacije, pozitivne kontrole
pripremite potpuno odvojeno od uzoraka koje ćete ispitivati.
Za svaku novopripremljenu seriju selektivne hranjive podloge treba, prije nego
se upotrijebi za testiranje rutinskih uzoraka, provjerite da li je prikladna za
rast patogena.
Kontrolni materijal testirajte na isti način kao i uzorke.
4.1.1. Primijenite odgovarajuću tehniku nanošenja razrjeđenja kako biste
osigurali da su sve populacije saprofitnih bakterija dovoljno razrijeđene.
Nanesite 50 – 100 µl ekstrakta uzorka po podlozi i po svakom razrjeđenju.
4.1.2. Inkubirajte podloge na 28 °C. Očitajte podloge nakon 48 sati, a nakon
toga svaki dan u razdoblju do šest dana. Tipične kolonije R. solanacearum na
hranjivoj podlozi SMSA mliječno-bijele su boje, plosnate, nepravilnog oblika i
tekuće, a nakon tri dana inkubacije sredina im postaje ružičasta do
krvavo-crvena s unutarnjim prugama ili spiralama
(vidi mrežnu stranicu http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Napomena:
Na ovoj hranjivoj podlozi ponekad rastu i netipične kolonije R. solanacearum.
One mogu biti malene, okrugle, potpuno crvene boje i netekuće ili samo
djelomično tekuće te ih je, stoga, teško razlikovati od kolonija saprofitnih
bakterija.
4.1.3. Vjerojatne kolonije R. solanacearum, nakon što ste ih nanijeli ili
razrijedili i precijepili na uobičajenu hranjivu podlogu, pročistite kako biste
dobili pojedinačne izdvojene kolonije (vidi Dodatak 2).
4.1.4. Kulture se kratko vrijeme mogu čuvati u sterilnoj vodi (pH 6 do 8, bez
klora) na sobnoj temperaturi u tami ili duže vrijeme u prikladnom krioprotektoru
na temperaturi od – 68 do – 86 °C ili liofilizirane.
4.1.5. Identificirajte vjerojatne kulture (vidi Odjeljak VI.B) i provedite test
patogenosti (vidi Odjeljak VI.C).
Tumačenje rezultata selektivne izolacije
Selektivna izolacija je negativna ako se nakon šest dana ne uočavaju nikakve
bakterijske kolonije ili ako se ne pronađu sumnjive kolonije tipične za R.
solanacearum, pod uvjetom da se ne sumnja na inhibiciju zbog konkurencije ili
antagonizma drugih bakterija i da su tipične kolonije R. solanacearum pronađene
u pozitivnim kontrolama.
Selektivna izolacija je pozitivna ako se izdvoje sumnjive kolonije R.
solanacearum.
4.2. Postupak obogaćivanja
Upotrijebite validirani medij za obogaćivanje kao što je modificirani Wilbrink
tekući medij (vidi Dodatak 2).
Ovaj se postupak može primijeniti za selektivno povećanje populacije R.
solanacearum u ekstraktima uzoraka te da se poveća osjetljivost detekcije. Ovim
se postupkom, također, učinkovito razrjeđuju inhibitori PCR reakcije (1:100).
Međutim, treba napomenuti da obogaćivanje R. solanacearum može biti neuspješno
zbog kompeticije ili antagonizma saprofitnih organizama koji se često istodobno
obogaćuju. Zbog toga može biti teško izdvojiti R. solanacearum iz kultura
obogaćenih u tekućem mediju. Pored toga, s obzirom da se populacije serološki
srodnih saprofita mogu povećati, preporučuje se uporaba specifičnih monoklonskih
antitijela umjesto poliklonskih antitijela ako će se provesti ELISA test.
4.2.1. Za obogaćivanje za PCR test prenesite 100 µl ekstrakta uzorka u 10 ml
tekućeg medija za obogaćivanje (Dodatak 2) koji je prethodno podijeljen u
alikvote u epruvete ili bočice bez DNK. Za obogaćivanje za ELISA test mogu se
koristiti veći udjeli ekstrakta uzorka u tekućem mediju (npr. 100 µl u 1,0 ml
tekućeg medija za obogaćivanje).
4.2.2. Inkubirajte 72 sata na temperaturi od 27 do 30 °C sa ili bez
protresivanja, s labavim čepom da se omogući prozračivanje.
4.2.3. Dobro promiješajte prije korištenja u ELISA ili PCR testovima
4.2.4. S obogaćenim tekućim medijem postupajte isto kao i s uzorcima u prije
opisanim testovima.
Napomena:
Ako očekujete da će obogaćivanje R. solanacearum biti onemogućeno zbog velikih
populacija određenih konkurentnih saprofitnih bakterija, bolje rezultate ćete
možda dobiti ako ekstrakte uzoraka obogatite prije centrifugiranja ili drugih
postupaka koncentriranja.
5. IF Test
Načelo
Uporaba IF testa kao osnovnog testa provjere preporuča se zbog njegove dokazane
dosljednosti pri postizanju zahtijevanih pragova detekcije.
Kada se IF test koristi kao glavni test provjere i ako je IF očitanje pozitivno,
mora se provesti izolacija, PCR test ili FISH test kao drugi test provjere. Kada
se IF test koristi kao drugi test provjere i IF očitanje je pozitivno, potrebno
je daljnje testiranje prema dijagramu toka kako bi se dovršila analiza.
Napomena:
Koristite validirani izvor antitijela za R. solanacearum
(vidi mrežnu stranicu http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Preporuča se da se titar odredi za svaku novu seriju antitijela. Titar se
definira kao najveće razrjeđenje kod kojeg dolazi do optimalne reakcije pri
testiranju suspenzije koja sadrži 105 do 106 stanica po ml homolognog soja
bakterije R. solanacearum uz korištenje fluorescein-izotiocijanat (FITC)
konjugiranih antitijela prema preporukama proizvođača. Svi validirani
poliklonski serumi imali su IF titar najmanje 1:2000. Tijekom testiranja, treba
koristiti antitijela u radnim razrjeđenjima koja su blizu ili jednaka titru.
Test treba provesti na svježe pripremljenim ekstraktima uzoraka. On se, po
potrebi, može uspješno provesti i na ekstraktima koji su bili pohranjeni na
temperaturi od – 68 do – 86 °C s dodatkom glicerola. Glicerol se mož se može ukloniti
dodavanjem 1 ml za talog (Dodatak 4), ponovnim 15-minutnim
centrifugiranjem na 7000 g i resuspendiranjem u jednakom volumenu pufera za
talog. To je rijetko potrebno, naročito ako su uzorci plamenom fiksirani na
stakalca.
Za pozitivnu kontrolu pripremite odvojena stakalca s homolognim sojem ili nekim
drugim referentnim sojem bakterije R. solanacearum suspendiranim u ekstraktu
krumpira kako je navedeno u Dodatku 3B te, po izboru, u puferu.
Kao sličnu kontrolu na istom stakalcu trebalo bi, po mogućnosti, koristiti
prirodno zaraženo tkivo (održavano liofilizacijom ili zamrzavanjem na –16 do –
24 °C).
Za negativnu kontrolu mogu se upotrijebiti alikvoti ekstrakta uzoraka koji su u
ranijem testiranju na R. solanacearum pokazali negativan rezultat.
U Dodatku 3. navedeni su standardizirani pozitivni i negativni kontrolni
materijali koji se mogu upotrebljavati u ovom testu.
Koristite predmetna stakalca sa više jažica, po mogućnosti s 10 jažica promjera
najmanje 6 mm.
Kontrolni materijal testirajte jednako kao i uzorke.
5.1. Pripremite stakalca za testiranje prema jednom od sljedećih postupaka:
(i) Za suspenzije taloga s relativno malo škroba:
U prvu jažicu pipetom odmjerite standardni volumen (15 µl je dovoljno za jažice
promjera 6 mm – za veće jažice povećajte volumen) razrjeđenja od 1/100
resuspendiranog taloga krumpira. Potom u ostale jažice u istom redu pipetom
odmjerite slični volumen nerazrijeđene suspenzije (1/1) taloga. Drugi se red
može koristiti za duplikat istog ili za drugi uzorak kako je prikazano na slici
1.
(ii) Za ostale suspenzije taloga:
Pripremite decimalna razrjeđenja (1/10, 1/100) resuspendiranog taloga u puferu
za talog. U jedan red jažica pipetom odmjerite standardni volumen (15 µl je
dovoljno za jažice promjera 6 mm – za veće jažice povećajte volumen)
resuspendiranog taloga i svakog razrjeđenja. Drugi se red može koristiti kao
duplikat istog ili za drugi uzorak kako je prikazano na slici 2.
5.2 Ostavite da se kapljice osuše na sobnoj temperaturi ili ih zagrijavajte do
temperature od 40 do 45 °C. Fiksirajte bakterijske stanice na stakalce bilo
zagrijavanjem (15 minuta na 60 °C), provlačenjem kroz plamen, 95 %-tnim etanolom
ili prema posebnim uputama dobavljača antitijela.
Prije daljnjih testiranja, fiksirana se stakalca mogu, po potrebi, kratko
vrijeme (najviše do tri mjeseca) čuvati zamrznuta u suhom spremniku.
5.3. IF postupak
(i) U skladu s postupkom za pripremu stakalaca za testiranje kako je opisan pod
5.1.(i):
Pripremite niz dvostrukih razrjeđenja antitijela. Prva jažica mora imati 1/2
titra (T/2), a ostale 1/4 titra (T/4), 1/2 titra (T/2), titar (T) i dvostruki
titar (2T).
(ii) U skladu s postupkom za pripremu stakalaca za testiranje kako je opisan pod
5.1.(ii):
Pripremite radno razrjeđenje antitijela u IF puferu. Radno razrjeđenje utječe na
specifičnost.
Slika 1. Priprema stakalca u skladu s točkama 5.1.(i) i 5.3.(i)
Razrjeđenja resuspoendiranog taloga
![](dodatni/348374.gif)

Slika 2. Priprema stakalca u skladu s točkama 5.1.(ii) i 5.3.(ii)
Radna razrjeđenja seruma/antitijela

5.3.1. Posložite stakalca na navlaženi upijajući papir. Svaku jažicu potpuno
prekrijte razrjeđenjem antitijela. Volumen antitijela koji se stavlja u pojedinu
jažicu mora biti jednak volumenu stavljenog ekstrakta.
Slijedite sljedeći postupak ako nema posebnih uputa dobavljača antitijela:
5.3.2. Inkubirajte stakalca na vlažnom papiru, pokrivena, 30 minuta na sobnoj
temperaturi (18 do 25 °C).
5.3.3. Otresite kapljice sa svakog stakalca i pažljivo ih isperite IF puferom.
Potopite ih 5 minuta u IF pufer-Tween (Dodatak 4) i nakon toga u IF pufer.
Pazite da ne dođe do stvaranja aerosola ili prijenosa kapljica jer bi to moglo
dovesti do unakrsne kontaminacije. Stakalca pažljivo osušite upijajućim papirom.

5.3.4. Posložite stakalca na navlaženi upijajući papir. Jažice prekrijte
razrijeđenim FITC konjugatom koji se koristi za određivanje titra. Volumen
konjugata nanesenog na jažice mora biti jednak volumenu nanesenog antitijela.
5.3.5. Inkubirajte stakalca na vlažnom papiru, pokrivena, 30 minuta na sobnoj
temperaturi (18 do 25 °C).
5.3.6. Otresite kapljice konjugata sa stakalca. Isperite i operite kako je
prethodno opisano (5.3.3).
Pažljivo osušite.
5.3.7. Na svaku jažicu pipetom nanesite 5-10 µl 0,1 M glicerola s fosfatnim
puferom (Dodatak 4) ili sredstvo protiv izbljeđivanja koje je dostupno na
tržištu te stavite pokrovno stakalce.
5.4. Očitavanje IF testa
5.4.1. Pregledajte pripremljena stakalca pod epifluorescentnim mikroskopom s
odgovarajućim filtrima za ekscitaciju FITC-a, uz uljnu imerziju i povećanje od
500-1000 x. Pregledajte svaku jažicu preko dva međusobno okomita promjera i duž
vanjskog ruba. Za uzorke u kojima je vidljiv mali broj stanica ili ih uopće nema
pregledajte najmanje 40 mikroskopskih vidnih polja.
Najprije pregledajte stakalce s pozitivnom kontrolom. Stanice moraju snažno
fluorescirati i moraju biti potpuno obojene na utvrđenom titru antitijela ili
radnog razrjeđenja. U slučaju da kod obojenosti dođe do odstupanja, IF test se
mora ponoviti (Odjeljak VI.A.5).
5.4.2. Pregledajte da li su u jažicama vidljive jasno fluorescirajuće stanice
karakteristične morfologije za bakteriju R. solanacearum
(vidi mrežnu stranicu http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Intenzitet fluorescencije mora biti jednak kao i kod pozitivnog kontrolnog soja
pri jednakom razrjeđenju antitijela. Stanice s nepotpunim obojenjem ili sa
slabom fluorescencijom moraju se zanemariti.
Test se mora ponoviti ako se sumnja na kontaminaciju. Sumnjati se može ako sva
stakalca u seriji pokazuju pozitivne stanice zbog kontaminacije pufera ili ako
su pozitivne stanice pronađene (izvan jažica) na površini stakalca.
5.4.3. Postoji nekoliko problema vezanih uz specifičnost testa
imunofluorescencije. U koncentriranom ekstraktu jezgri pupaka ili dijelova
stabljika mogu se nalaziti populacije fluorescirajućih stanica netipične
morfologije i saprofitne bakterije s kojima dolazi do unakrsne reakcije i koje
su po veličini i morfologiji slične bakteriji R. solanacearum.
5.4.4. U obzir uzmite samo fluorescirajuće stanice tipične veličine i
morfologije u titru ili radnom razrjeđenju antitijela kako je opisan u točki
5.3.
5.4.5. Tumačenje očitanja IF testa
(i) Ako nađete jasno fluorescirajuće stanice karakteristične morfologije,
odredite prosječni broj tipičnih stanica po mikroskopskom vidnom polju i
izračunajte broj tipičnih stanica po ml resuspendiranog taloga (Dodatak 5).
Očitanje IF testa je pozitivno za uzorke koji imaju najmanje 5 x 103 tipičnih
stanica po ml resuspendiranog taloga. Uzorak se smatra potencijalno
kontaminiranim i potrebno je daljnje testiranje.
(ii) Očitanje IF testa je negativno za uzorke koji imaju manje od 5 x 103
stanica po ml resuspendiranog taloga te se uzorak smatra negativnim. Nije
potrebno daljnje testiranje.
6. PCR Testovi
Načela
Kada se PCR test koristi kao glavni test provjere i rezultat je pozitivan, mora
se provesti IF test ili izolacija kao drugi obvezni test provjere. Kada se PCR
test koristi kao drugi test provjere i rezultat je pozitivan, za postavljanje
konačne dijagnoze potrebno je daljnje testiranje prema dijagramu.
Korištenje ove metode kao glavnog testa provjere preporučuje se samo ako ste
stručno osposobljeni.
Napomena:
Preliminarno testiranje ovom metodom treba omogućiti ponovljivu detekciju 103 do
104 stanica bakterije R. solanacearum po ml, koje su dodane ekstraktima uzoraka
koji su u prethodnim testiranjima dali negativni rezultat. Kako bi se postigao
najveći stupanj osjetljivosti i specifičnosti u svim laboratorijima, mogu biti
potrebni pokusi za optimizaciju metode.
Koristite validirane reagense i protokole za PCR (vidi D(vidi Dodatak 6). Poželjno je
odabrati m internom kontrolom.
Poduzmite odgovarajuće mjere opreza kako biste izbjegli kontaminaciju uzorka
ciljnom DNK. Da bi se spriječila kontaminacija ciljnom DNK, PCR test trebali bi
obavljati iskusni stručnjaci, u specijaliziranim laboratorijima za molekularnu
biologiju.
Negativne kontrole (za ekstrakciju DNK i PCR postupak) treba uvijek obraditi kao
zadnje uzorke u postupku kako bi se vidjelo je li došlo do prijenosa DNK.
U PCR test treba uključiti sljedeće negativne kontrole:
– ekstrakt uzorka koji je u ranijem testiranju na R. solanacearum bio negativan
– pufer korišten za ekstrakciju bakterije i DNK iz uzorka
– reakcijsku smjesu za PCR
Treba uključiti sljedeće pozitivne kontrole:
– alikvote resuspendiranih taloga u koje je dodana bakterija R. solanacearum (za
pripremu vidi Dodatak 3B).
– suspenziju u vodi od 106 stanica/ml bakterije R. solanacearum virulentnog
izolata (npr. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; vidi Dodatak 3 B).
– ako je moguće, u PCR testu upotrijebite i DNK ekstrahiranu iz pozitivnih
kontrolnih uzoraka.
Da bi se izbjegla moguća kontaminacija, pozitivne kontrole pripremite prostorno
odvojeno od uzoraka za testiranje.
Ekstrakti uzoraka moraju sadržavati što je moguće manje tla. Ako namjeravate
primjenjivati PCR protokole, u nekim bi slučajevima bilo preporučljivo oprati
gomolje prije pripreme ekstrakta.
U Dodatku 3. navedeni su standardizirani pozitivni i negativni kontrolni
materijali koji se mogu koristiti u ovim testovima.
6.1. Metode pročišćavanja DNK
Koristite uzorke za pozitivnu i negativnu kontrolu kako je gore opisano (vidi
Dodatak 3).
Testirajte kontrolni materijal na isti način kao i uzorke.
Postoje različite metode za pročišćavanje ciljne DNK iz kompleksnih uzoraka,
kojima se uklanjaju inhibitori PCR reakcije i drugih enzimskih reakcija te se u
ekstraktu uzorka koncentrira ciljna DNK. Sljedeća je metoda optimizirana za
korištenje s validiranim PCR metodama koje su navedene u Dodatku 6.
(a) Metoda prema Pastriku (2000)
1) Pipetom odmjerite 220 µl pufera za lizu [100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH
8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)] u Eppendorf epruvetu od 1,5 ml.
2) Dodajte 100 µl ekstrakta uzorka i stavite u blok za zagrijavanje ili vodenu
kupelj na 95 °C 10 minuta.
3) Stavite epruvetu na led 5 minuta.
4) Dodajte 80 µl osnovne otopine lizozima (50 mg lizozima na ml u 10 mM
Tris-HCl, pH 8,0) te inkubirajte 30 minuta na 37 °C.
5) Dodajte 220 µl Easy DNA® otopine A (Invitrogen), dobro promiješajte na
vrtložnoj miješalici i inkubirajte 30 minuta na 65 °C.
6) Dodajte 100 µl Easy DNA® otopine B (Invitrogen), snažno miješajte na
vrtložnoj miješalici sve dok precipitat ne bude slobodno kružio po epruveti i
dok uzorak ne bude jednoliko viskozan.
7) Dodajte 500 µl kloroforma te miješajte na vrtložnoj miješalici dok se
viskoznost ne smanji i smjesa postane homogena.
8) Centrifugirajte na 15000 g 20 minuta na 4 °C da se odijele faze i stvori
interfaza.
9) Gornju fazu prenesite u novu Eppendorf epruvetu.
10) Dodajte 1 ml 100 %-tnog etanola (– 20 °C), kratko promiješajte na vrtložnoj
miješalici i inkubirajte na ledu 10 minuta.
11) Centrifugirajte na 15000 g 20 minuta na 4 °C te uklonite etanol iz taloga.
12) Dodajte 500 µl 80 %-tnog etanola (– 20 °C) te promiješajte okretanjem
epruvete.
13) Centrifugirajte na 15000 g 10 minuta na 4 °C, sačuvajte talog, a etanol
uklonite.
14) Ostavite talog da se suši na zraku ili u vakuumskoj centrifugi (DNA speed
vac).
15) Resuspendirajte talog u 100 µl sterilne ultra čiste vode i ostavite na
sobnoj temperaturi najmanje 20 minuta.
16) Pohranite na – 20 °C dok ne bude potrebno za PCR.
17) Centrifugiranjem izdvojite mogući bijeli precipitat te za PCR upotrijebite 5
µl supernatanta koji sadrži DNK.
(b) Druge metode
Mogu se primijeniti druge metode ekstrakcije DNK, npr. Qiagen DNeasy Plant Kit,
ako su dokazano jednako učinkovite u pročišćavanju DNK iz kontrolnih uzoraka
koji sadrže 103 do 104 patogenih stanica po ml.
6.2. PCR
6.2.1. Pripremite kalupe za testiranje i kontrolu za PCR prema validiranim
protokolima (Odjeljak VI.A.6). Pripremite jedno decimalno razrjeđenje ekstrakta
DNK iz uzorka (1:10 u ultra čistoj vodi).
6.2.2. U nekontaminiranom prostoru pripremite odgovarajuću reakcijsku smjesu za
PCR prema objavljenim protokolima (Dodatak 6). Preporučuje se da, ako je moguće,
koristite protokol za multipleks PCR koji uključuje i unutarnju kontrolu.
6.2.3. Prema protokolu za PCR (Dodatak 6) dodajte 2-5 µl ekstrakta DNK na 25 µl
reakcijske smjese u sterilne epruvete za PCR.
6.2.4. Uključite i uzorak za negativnu kontrolu koji sadrži samo reakcijsku
smjesu za PCR te, umjesto uzorka, dodajte isti izvor ultra čiste vode koji je
korišten za pripremu reakcijske smjese za PCR.
6.2.5. Stavite epruvete u uređaj za PCR (thermal cycler) koji je korišten u
preliminarnom testiranju te pokrenite optimizirani PCR program (Dodatak 6).
6.3. Analiza PCR produkata
6.3.1. Elektroforezom u agaroznom gelu razdvojite umnožene PCR produkte.
Najmanje 12 µl reakcijske smjese umnožene DNK iz svakog uzorka, pomiješane s 3
µl pufera za nanošenje (Dodatak 6), nanesite u 2,0 %-tni (w/v) agarozni gel u
tris-acetat EDTA puferu (TAE) (Dodatak 6), uz napon od 5 do 8 V po cm.
Upotrijebite odgovarajući DNK standard, npr. 100 bp ljestvicu.
6.3.2. Obojite elektroforetske pruge DNK u gelu etidijevim bromidom (0,5 mg/l)
30 do 60 minuta poduzimajući pri tomu odgovarajuće mjere opreza za rad s ovim
mutagenom.
6.3.3. Obojeni gel pregledajte na kratkovalnom UV transiluminatoru (λ = 302 nm)
i tražite umnožene fragmente očekivane dužine (Dodatak 6) te ih dokumentirajte.
6.3.4. Za svaki novi nalaz/slučaj provjerite autentičnost umnoženog PCR produkta
analizom restrikcijskim enzimima preostale umnožene DNK uzorka i to inkubacijom
pri optimalnoj temperaturi i u optimalnom vremenu s odgovarajućim enzimom i
puferom (vidi Dodatak 6). Pocijepane fragmente razdvojite elektroforezom u
agaroznom gelu kako je gore navedeno te nakon bojenja etidijevim bromidom na UV
transiluminatoru promatrajte karakteristični restrikcijski obrazac i usporedite
ga s pozitivnom kontrolom prije i poslije cijepanja.
Tumačenje rezultata PCR testa
PCR test je negativan ako u testiranom uzorku nije vidljiv PCR produkt očekivane
dužine koji je specifičan za bakteriju R. solanacearum, ali je vidljiv u svim
pozitivnim kontrolnim uzorcima (kod multipleks PCR-a s početnicama za unutarnju
kontrolu koje su specifične za biljku domaćina: u testiranom se uzorku mora
umnožiti drugi produkt PCR-a očekivane veličine).
PCR test je pozitivan ako je vidljiv PCR produkt koji je specifičan za bakteriju
R. solanacearum i koji je očekivane dužine i restrikcijskog obrasca, pod uvjetom
da nije umnožen u nijednom uzorku negativne kontrole. Pouzdanu potvrdu
pozitivnog rezultata možete dobiti i ponavljanjem testa s drugim parom početnica
(Dodatak 6).
Napomena:
Može se sumnjati da je došlo do inhibicije PCR reakcije ako se iz uzorka
pozitivne kontrole koji sadrži R. solanacearum u vodi dobije očekivani produkt,
a iz pozitivnih kontrola s R. solanacearum u ekstraktu krumpira dobiju negativni
rezultati. U multipleks PCR protokolima s unutarnjim kontrolama, inhibicija
reakcije je indicirana ako nije dobiven niti jedan od dva produkta.
Ako se iz jedne ili više negativnih kontrola dobije očekivani produkt, može se
sumnjati da je došlo do kontaminacije.
7. FISH test
Načelo
Kada se FISH test koristi kao prvi test provjere i ako se njime dobije pozitivan
rezultat, mora se provesti IF test ili izolacija kao drugi obvezni test
provjere. Ako se FISH test koristi kao drugi test provjere i ako se njime dobije
pozitivan rezultat, za postavljanje konačne dijagnoze treba obaviti daljnje
testiranje prema dijema dijagramu.
Napomena:
Koristidirane oligo-probe specifične za bakteriju R. solanacearum (vidi
Dodatak 7). Preliminarna testiranja ovom metodom trebaju omogućiti ponovljivu
detekciju najmanje 103 do 104 stanica bakterije R. solanacearum po ml koje su
dodane ekstraktima uzoraka koji su u ranijim testiranjima bili negativni.
Sljedeći je postupak najbolje provesti na svježe pripremljenim ekstraktima
uzoraka, ali se može uspješno primijeniti i na ekstraktu uzorka koji je bio
pohranjeni s glicerolom na temperaturi od – 16 do – 24 °C ili od – 68 do – 86
°C.
Za negativnu kontrolu upotrijebite alikvote ekstrakta uzoraka koji su u ranijem
testiranju na R. solanacearum bili negativni.
Za pozitivnu kontrolu pripremite suspenzije koje sadrže 105 do 106 stanica/ml
0,01 M fosfatnog pufera (PB) bakterije R. solanacearum biovar 2 (npr. soj NCPPB
4156 = PD 2762 = CFBP 3857; vidi Dodatak 3) iz kulture stare 3 – 5 dana.
Pripremite odvojena stakalca za pozitivnu kontrolu s homolognim sojem ili nekim
drugim referentnim sojem bakterije R. solanacearum suspendiranim u ekstraktu
krumpira kako je navedeno u Dodatku 3B.
Korištenje eubakterijske oligo-probe obilježene FITC-om omogućuje kontrolu
procesa hibridizacije jer će se obojiti sve eubakterije koje su prisutne u
uzorku.
U Dodatku 3A. navedeni su standardizirani pozitivni i negativni kontrolni
materijali koji se mogu upotrebljavati u ovom testu.
Kontrolni materijal testirajte jednako kao i uzorke.
7.1. Fiksiranje ekstrakta krumpira
Sljedeći se protokol temelji na Wullings i sur. (1998):
7.1.1. Pripremite otopinu za fiksiranje (vidi Dodatak 7).
7.1.2. Pipetom odmjerite 100 µl svakog ekstrakta uzorka u Eppendorf epruvetu te
centrifugirajte 7 minuta na 7000 g.
7.1.3. Uklonite supernatant i resuspendirajte talog u 200 µl fiksativa
pripremljenog prije najviše 24 sata. Promiješajte na vrtložnoj miješalici i
inkubirajte jedan sat u hladnjaku.
7.1.4. Centrifugirajte 7 minuta na 7000 g, uklonite supernatant te
resuspendirajte talog u 75 µl 0,01 M PB (vidi Dodatak 7).
7.1.5. U jažice čistog stakalca nanesite 16 µl fiksiranih suspenzija kako je
prikazano na slici 7.1. Na svako stakalce nanesite nerazrijeđena dva različita
uzorka i upotrijebite 10 µl za pripremanje razrjeđenja 1:100 (u 0,01 M PB).
Preostalu fiksiranu otopinu uzorka (49 µl) možete pohraniti na – 20 °C nakon
dodavanja jednog volumena 96 %-tnog etanola. Ako FISH test trebate ponoviti,
centrifugiranjem uklonite etanol i dodajte jednaki volumen 0,01 PB (promiješati
na vrtložnoj miješalici).
Slika 7.1. Prikaz stakalca za FISH test
![](dodatni/348375.gif)

7.1.6 Stakalca osušite na zraku (ili u sušioniku na 37 °C) te ih fiksirajte
provlačenjem kroz plamen.
Na ovom se koraku postupak može prekinuti i nastaviti hibridizaciju sljedeći
dan. Stakalca se trebaju pohraniti na sobnoj temperaturi u suhom prostoru bez
prašine.
7.2. Hibridizacija
7.2.1. Dehidrirajte stanice uzastopnim jednominutnim uranjanjem u 50 %-tni, 80
%-tni i 90 %-tni etanol. Stakalca postavite na držač i osušite na zraku.
7.2.2. Pripremite vlažnu komoru za inkubaciju tako što ćete dno hermetičke
kutije prekriti upijajućim ili filtar papirom namočenim u 1x hybmix (Dodatak 7).
Kutiju prethodno inkubirajte u hibridizacijskoj pećnici najmanje 10 minuta na 45
°C.
7.2.3. Nanesite po 10 µl otopine za hibridizaciju (Dodatak 7) u osam jažica
(jažice 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 i 10; vidi sliku 7.1) svakog stakalca, a dvije
središnje jažice (3 i 8) ostavite prazne.
7.2.4. Prve i zadnje četiri jažice pokrijte pokrovnim stakalcem (24 x 24 mm)
pazeći pri tom da u jažicama ne ostane zraka. Stavite stakalca u prethodno
zagrijanu vlažnu komoru i hibridizirajte pet sati u pećnici na 45 °C u tami.
7.2.5. Pripremite tri posude sa 1 L Milli Q vode (za uporabu u molekularnoj
biologiji), 1 L 1x hybmix (334 ml 3x hybmix i 666 ml Milli Q vode) i 1 L 1/8x
hybmix (42 ml 3X hybmix i 958 ml Milli Q vode). Svaku posudu prethodno
inkubirajte u vodenoj kupelji na 45 °C.
7.2.6. Skinite pokrovna stakalca, a predmetna stakalca stavite na držač.
7.2.7. Višak probe isperite inkubiranjem 15 minuta na 45 °C u posudi s 1x
hybmixa.
7.2.8. Prenesite držač stakalaca u otopinu za pranje (1/8x hybmix) i inkubirajte
još 15 minuta.
7.2.9. Stakalca nakratko uronite u Milli Q vodu te ih stavite na filtar papir.
Višak vlage uklonite tako što ćete površinu lagano pokriti filtar papirom. U
svaku jažicu pipetom nanesite 5 do 10 µl zaštitne otopine protiv izbljeđivanja
(npr. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA ili ekvivalentna) te cijelo
predmetno stakalce pokrijte velikim pokrovnim stakalcem (24 x 60 mm).
7.3. Očitavanje FISH testa
7.3.1. Stakalca odmah pregledajte epifluorescentnim mikroskopom uz uljnu
imerziju, s povećanjem od 630 ili 1000 x. S filtrom prikladnim za
fluorescein-izotiocijanat (FITC), eubakterijske stanice (uključujući većinu gram
negativnih stanica) u uzorku vide se kao fluorescentno zelene. Uporabom filtra
za tetrametilrodamin-5-izotiocijanat stanice bakterije R. solanacearum, obojene
s Cy 3, vide se kao fluorescentno crvene. Usporedite morfologiju stanice s
morfologijom pozitivnih kontrola. Stanice moraju biti jasno flourescentne i u
cijelosti obojene. Ako dođe do odstupanja u obojenosti, FISH test (Odjeljak
VI.A.7) se mora ponoviti. Pregledajte svaku jažicu duž dva međusobno okomita
promjera i duž vanjskog ruba. Za uzorke u kojima je vidljiv mali broj stanica
ili ih uopće nema pregledajte najmanje 40 mikroskopskih vidnih polja.
7.3.2. Pregledajte da li su u jažicama vidljive jasno fluorescirajuće stanice
karakteristične morfologije za bakteriju R. solanacearum
(vidi mrežnu stranicu http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Intenzitet fluorescencije mora biti jednak ili bolji nego na soju pozitivne
kontrole. Stanice koje nisu u potpunosti obojene ili su slabe fluorescencije ne
smiju se uzeti u obzir.
7.3.3. Test se mora ponoviti ako se sumnja na kontaminaciju. Sumnjati se može
ako sva stakalca u seriji pokazuju pozitivne stanice zbog kontaminacije pufera
ili ako su pozitivne stanice pronađene (izvan jažica) na površini stakalca.
7.3.4. Postoji nekoliko problema vezanih uz specifičnost FISH testa. U
koncentriranom ekstraktu jezgri pupaka i dijelova stabljika mogu se pojaviti,
iako rjeđe nego kod IF testa, populacije fluorescirajućih stanica netipiče
morfologije i saprofitne bakterije koje su po veličini i morfologiji slične
bakteriji R. solanacearum.
7.3.5. U obzir uzmite samo fluorescirajuće stanice tipične veličine i
morfologije.
7.3.6. Tumačenje rezultata FISH testa
(i) Rezultati FISH testa smatraju se valjanim ako se primjenom FITC filtra opaze
zeleno fluorescirajuće stanice čija je veličina i morfologija tipična za
bakteriju R. solanacearum i ako se primjenom filtra za rodamin opaze crveno
fluorescirajuće stanice, i to u svim pozitivnim kontrolama i niti jednoj
negativnoj kontroli. Ako se pronađu jasno fluorescirajuće stanice
karakteristične morfologije, odredite prosječni broj tipičnih stanica po
mikroskopskom vidnom polju i izračunajte broj tipičnih stanica po ml
resuspendiranog taloga (Dodatak 4). Uzorci s najmanje 5 x 103 tipičnih stanica
po ml resuspendiranog taloga smatraju se potencijalno kontaminiranima. Potrebni
su daljnji testovi. Uzorci s manje od 5 x 103 tipičnih stanica po ml
resuspendiranog taloga smatraju se negativnima.
(ii) FISH Test je negativan ako se primjenom filtra za rodamin ne uoče snažno
fluorescirajuće crvene stanice čija je veličina i morfologija tipična za
bakteriju R. solanacearum, pod uvjetom da se primjenom filtra za rodamin uoče
tipične snažno fluorescirajuće crvene stanice u preparatima pozitivne kontrole.
8. ELISA Testovi
Načelo
Zbog relativno niske osjetljivosti, ELISA se može primijeniti samo kao neobvezni
dodatni test pored IF, PCR ili FI ili FISH testova. Ako se primjenjuje DAS ELISA, no je prethodno obogaćivanje ekstrakta i uporaba monoklonskih antitijela

(vidi mrežnu stranicu http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Obogaćivanje uzoraka prije primjene ELISA testa može biti korisno u svrhu
povećanja osjetljivosti testa, ali može biti i neuspješno zbog kompeticije
ostalih organizama u uzorku.
Napomena:
Koristite validirani izvor antitijela za R. solanacearum
(vidi mrežnu stranicu http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Preporučljivo je da se titar odredi za svaku novu seriju antitijela. Titar se
definira kao najveće razrjeđenje kod kojeg dolazi do optimalne reakcije pri
testiranju suspenzije koja sadrži 105 do 106 stanica/ml homolognog soja
bakterije R. solanacearum uz korištenje odgovarajućih konjugata sekundarnih
antitijela prema preporukama proizvođača. Tijekom testiranja, treba koristiti
antitijela u radnim razrjeđenjima koja su blizu ili jednaka titru formulacije
dostupne na tržištu.
Odredite titar antitijela na suspenziji od 105 do 106 stanica po ml homolognog
soja bakterije R. solanacearum.
Za negativnu kontrolu koristite ekstrakt uzorka koji je u ranijem testiranju na
R. solanacearum bio negativan i suspenziju bakterije, s kojom ne dolazi do
unakrsne reakcije, u fosfatnom puferu s dodatkom soli (PBS).
Za pozitivnu kontrolu koristite alikvote ekstrakta uzorka koji je u ranijem
testiranju bio negativan, pomiješane s 103 do 104 stanica/ml bakterije R.
solanacearum biovar 2 (npr. soj NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; vidi Dodatak
2A i B). Za usporedbu rezultata na svakoj mikrotitarskoj ploči koristite
standardnu suspenziju od 105 do 106 stanica/ml bakterije R. solanacearum u
PBS-u. Pobrinite se da pozitivne kontrole na mikrotitarskoj ploči budu dobro
odvojene od uzoraka koji se testiraju.
U Dodatku 3A. navedeni su standardizirani pozitivni i negativni kontrolni
materijali koji se mogu upotrebljavati u ovom testu.
Kontrolni materijal testirajte jednako kao i uzorke.
Validirana su dva protokola za ELISA test.
(a) NEIZRAVNA ELISA (Robinson Smith i sur., 1995)
1) Upotrijebite alikvote od 100 do 200 µl ekstrakta uzorka. (Zagrijavanjem
četiri minute na 100 °C u vodenoj kupelji ili bloku za zagrijavanje u nekim se
slučajevima mogu smanjiti nespecifični rezultati).
2) Dodajte jednaki volumen pufera za oblaganje dvostruke jačine (Dodatak 4) i
promiješajte na vrtložnoj miješalici.
3) Nanesite alikvote od 100 µl u svaku od najmanje dvije jažice na
mikrotitarskoj ploči (npr. Nunc-Polysorp ili ekvivalentna) i inkubirajte jedan
sat na 37 °C ili preko noći na 4 °C.
4) Uklonite ekstrakte iz jažica. Isperite jažice tri puta otopinom PBS-Tween
(Dodatak 4), a zadnju otopinu za ispiranje ostavite u jažicama najmanje pet
minuta.
5) Pripremite odgovarajuće razrjeđenje antitijela za R. solanacearum u
blokirajućem puferu (Dodatak 4). Za validirana antitijela koja su dostupna na
tržištu koristite preporučena razrjeđenja (obično dvostruka koncentracija
titra).
6) Dodajte 100 µl u svaku jažicu i inkubirajte jedan sat na 37 °C.
7) Uklonite otopinu antitijela iz jažica i operite jažice kao prije (korak 4).
8) Pripremite odgovarajuće razrjeđenje sekundarnih antitijela- konjugata alkalne
fosfataze u blokirajućem puferu. Dodajte 100 µl u svaku jažicu i inkubirajte
jedan sat na 37 °C.
9) Uklonite konjugat antitijela iz jažica i operite jažice kao prije (korak 4).
10) U svaku jažicu dodajte 100 µl otopine supstrata alkalne fosfataze (Dodatak
4), inkubirajte u tami na sobnoj temperaturi i očitavajte apsorbanciju pri 405
nm u pravilnim razmacima tijekom 90 minuta.
(b) DASI ELISA
1) Pripremite odgovarajuće razrjeđenje poliklonskih imunoglobulina za bakteriju
R. solanacearum u puferu za oblaganje pH 9,6 (Dodatak 4). Nanesite 200 µl u
svaku jažicu. Inkubirajte četiri do pet sati na 37 °C ili 16 sati na 4 °C.
2) Jažice isperite tri puta otopinom PBS-Tween (Dodatak 4).
U najmanje dvije jažice nanesite 190 µl ekstrakta uzorka. Na svakoj ploči
dodajte pozitivnu i negativnu kontrolu, i to svaku u po dvije jažice.
Inkubirajte 16 sati na 4 °C.
3) Jažice isperite tri puta otopinom PBS-Tween (Dodatak 4).
4) Pripremite odgovarajuće razrjeđenje monoklonskih antitijela specifičnih za
bakteriju R. solanacearum u PBS-u (Dodatak 4) koji sadrži i 0,5 % goveđeg
serumskog albumina (BSA) te nanesite 190 µl u svaku jažicu. Inkubirajte dva sata
na 37 °C.
5) Jažice isperite tri puta otopinom PBS-Tween (Dodatak 4).
6) Pripremite odgovarajuće razrjeđenje antimišjih imunoglobulina konjugiranih s
alkalnom fosfatazom u PBS-u. Nanesite 190 µl u svaku jažicu. Inkubirajte dva
sata na 37 °C.
7) Jažice isperite tri puta otopinom PBS-Tween (Dodatak 4).
8) Pripremite otopinu supstrata alkalne fosfataze koja sadrži 1 mg p-nitrofenil
fosfata po ml pufera supstrata (Dodatak 4). Nanesite 200 µl u svaku jažicu.
Inkubirajte u tami na sobnoj temperaturi i očitavajte apsorbanciju pri 405 nm u
pravilnim razmacima tijekom 90 minuta.
Tumačenje rezultata ELISA testova
ELISA test je negativan ako je prosječna optička gustoća (OD) u jažicama s
duplikatom uzorka < 2x OD u jažici s negativnom kontrolom ekstrakta uzorka, pod
uvjetom da su sve vrijednosti OD pozitivnih kontrola iznad 1,0 (nakon 90 minuta
inkubacije sa supstratom) i da su veće od dvostruke vrijednosti OD dobivene za
negativne ekstrakte uzorka.
ELISA test je pozitivan ako je prosječna optička gustoća (OD) u jažicama s
duplikatom uzorka > 2x OD u jažici s negativnom kontrolom ekstrakta uzorka, pod
uvjetom da su vrijednosti OD za sve jažice s negativnom kontrolom < 2x OD u
jažicama s pozitivnom kontrolom.
Ako se u ELISA testu očitaju negativni rezultati u jažicama s pozitivnom
kontrolom, to ukazuje da test nije pravilno proveden ili da je došlo do
inhibicije. Ako se u ELISA testu očitaju pozitivni rezultati u jažicama s
negativnom kontrolom, to ukazuje da je došlo do unakrsne kontaminacije ili do
nespecifičnog vezanja antitijela.
9. Biotest
Napomena:
Preliminarno testiranje ovom metodom treba omogućiti ponovljivu detekciju 103 do
104 jedinica koje stvaraju kolonije (CFU) bakterije R. solanacearum po ml, a
koje su dodane ekstraktima uzoraka koji su u ranijem testiranju bili negativni.
[za pripremu vidi Dodatak 3]
Najveća osjetljivost detekcije može se očekivati ako se koriste svježe
pripremljeni ekstrakti uzoraka te optimalni uvjeti rasta. Međutim, ova se metoda
može uspješno primijeniti i s ekstraktima koji su bili pohranjeni s glicerolom
na temperaturi od – 68 do – 86 °C.
Sljedeći se protokol temelji na Janse (1988):
9.1. Za svaki uzorak koristite 10 biljaka osjetljivog kultivara rajčice (npr.
Moneymaker ili drugi kultivar za koji je u laboratoriju utvrđeno da je jednako
osjetljiv) u fazi trećeg pravog lista. Za pojedinosti o uzgoju, vidi Dodatak 8.
Moguće je upotrijebiti i patlidžane (npr. kultivar Black Beauty ili kultivar
ekvivalentne osjetljivosti), ali samo biljke u fazi 2-3 lista do potpunog
razvoja trećeg pravog lista. Pokazalo se da su kod patlidžana simptomi slabiji i
da se sporije razvijaju. Preporučuje se, stoga, po mogućnosti koristiti sadnice
rajčice.
9.2. 100 µl ekstrakta uzorka rasporedite na testne biljke.
9.2.1. Inokulacija injekcijom
Inokulirajte stabljike neposredno iznad supki injekcijom s potkožnom iglom
(najmanje 23G). Uzorak rasporedite na testne biljke.
9.2.2. Inokulacija zarezivanjem
Držeći biljku među prstima, pipetom nanesite kapljicu (oko 5-10 µl)
resuspendiranog taloga na stabljiku između supki i prvog lista.
Sterilnim skalpelom napravite dijagonalni rez, dug oko 1 cm i dubok oko 2/3
debljine stabljike, počevši od nanešene kapljice resuspendiranog taloga.
Čvrsto zatvorite rez sterilnim vazelinom iz injekcije.
9.3. Koristeći istu metodu, inokulirajte pet biljaka suspka suspenzijom u vodi od 105
do 106 stanica/ml ljenom iz 48-satne kulture virulentnog soja biovara 2,
bakterije R. solanacearum za pozitivnu kontrolu, a puferom za talog za negativnu
kontrolu (Dodatak 4). Kako ne bi došlo do unakrsne kontaminacije, odvojite
biljke za pozitivnu i negativnu kontrolu od ostalih biljaka.
9.4. Testne biljke uzgajajte u karantenskim uvjetima do četiri tjedna na
temperaturi od 25 do 30 °C i uz visoku relativnu vlažnost te ih primjereno
zalijevajte pazeći da ne dođe do zasićenja vodom ili venuća zbog nedostatka
vode. Kako ne bi došlo do kontaminacije, biljke za pozitivnu i negativnu
kontrolu uzgajajte na jasno odvojenim policama u stakleniku ili komori za uzgoj
ili, ako je prostor ograničen, osigurajte da pojedini postupci budu jasno
odvojeni. Ako se biljke za različite uzorke moraju inkubirati jedne blizu
drugih, odvojite ih prikladnim zaslonima. Kod prihrane, zalijevanja,
pregledavanja i svakog drugog postupka s biljkama dobro pazite da ne dođe do
unakrsne kontaminacije. Od ključne je važnosti da u staklenicima i komorama za
uzgoj ne bude nikakvih kukaca jer oni mogu prenijeti bakteriju s uzorka na
uzorak.
Pratite javljaju li se simptomi venuća, epinastije, kloroze i/ili zaostajanja u
rastu.
9.5. Iz inficiranih biljaka izolirajte (Odjeljak II.3) i identificirajte
pročišćene kulture vjerojatne bakterije R. solanacearum (Odjeljak VI.B).
9.6. Ako se nakon tri tjedna ne uoče nikakvi simptomi, obavite IF/PCR test
/izolaciju na sastavljenom uzorku dijelova stabljike dugih 1 cm, uzetih iznad
mjesta inokulacije, sa svake testne biljke. Ako test bude pozitivan, primijenite
metodu nasađivanja razrjeđenja na selektivnu podlogu (odjeljak 4.1.)
9.7. Identificirajte sve pročišćene kulture vjerojatne bakterije R. solanacearum
(Odjeljak VI.B).
Tumačenje rezultata biotesta
Rezultati biotesta su valjani ako biljke pozitivne kontrole pokazuju tipične
simptome, ako se iz tih biljaka može ponovo izdvojiti bakterija, i ako se na
negativnim kontrolama ne pronađu nikakvi simptomi.
Biotest je negativan ako testne biljke nisu zaražene bakterijom R. solanacearum,
pod uvjetom da je bakterija R. solanacearum detektirana u pozitivnim kontrolama.
Biotest je pozitivan ako su testne biljke zaražene bakterijom R. solanacearum.

B. TESTOVI ZA IDENTIFIKACIJU

Identificirajte čiste kulture vjerojatnih izolata bakterije R. solanacearum
pomoću najmanje dva od sljedećih testova koja se temelje na različitim biološkim
načelima.
Prema potrebi, u svaki test uključite poznate referentne sojeve (vidi Dodatak
3).
1. Nutritivni i enzimatski testovi za identifikaciju
Odredite sljedeće fenotipske osobine koje su sustavno prisutne ili odsutne kod
bakterije R. solanacearum, prema metodama iz Lelliot i Stead (1987), Klement i
sur. (1990), Schaad (2001).

|  |  |
| --- | --- |
| Test | Očekivani rezultat |
| Stvaranje fluorescentnog pigmenta | – |
| Inkluzije poli-β-hidroksibutirata | + |
| Oksidacijski/fermentacijski (O/F) test | O+/F– |
| Aktivnost katalaze | + |
| Test oksidaze po Kovacu | + |
| Redukcija nitrata | + |
| Iskorištavanje citrata | + |
| Rast na 40 °C | – |
| Rast u 1 % NaCl | + |
| Rast u 2 % NaCl | – |
| Aktivnost arginin-dihidrolaze | – |
| Likvefikacija želatine | – |
| Hidroliza škroba | – |
| Hidroliza eskulina | – |
| Stvaranje levana | – |

2. IF test
2.1. Pripremite suspenziju od oko 106 stanica/ml u puferu za IF (Dodatak 4).
2.2. Pripremite niz dvostrukih razrjeđenja odgovarajućeg seruma
(vidi mrežnu stranicu http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
2.3. Provedite IF test (Odjeljak VI.A.5).
2.4. IF test je pozitivan ako je IF titar kulture jednak onom pozitivne
kontrole.
3. ELISA test
Napomena:
Ako primjenjujete samo 2 identifikacijska testa, ne primjenjujte drugi serološki
test uz ovaj.
3.1. Pripremite suspenziju od oko 108 stanica/ml u 1x PBS (Dodatak 4).
3.2. Provedite odgovarajući postupak ELISA s monoklonskim antitijelima
specifičnim za bakteriju R. solanacearum.
3.3. ELISA test je pozitivan ako je ELISA vrijednost očitanja kulture jednaka
najmanje polovici vrijednosti pozitivne kontrole.
4. PCR testovi
4.1. Pripremite suspenziju od oko 106 stanica/ml u sterilnoj vodi namijenjenoj
uporabi u molekularnoj biologiji.
4.2. Zagrijte 100 µl stanične suspenzije u zatvou zatvorenim epruvetama u bloku za
zagrijavanjeeloj vodenoj kupelji četiri minute na 100 °C. Uzorci se mogu
potom, do uporabe, pohraniti na – 16 do – 24 °C.
4.3. Primijenite odgovarajuće PCR postupke kako biste umnožili fragmente
specifične za R. solanacearum [npr. Seal i sur. (1993), Pastrik & Maiss (2000),
Pastrik i sur. (2002), Boudazin i sur. (1999), Opina i sur. (1997), Weller i
sur. (1999)].
4.4. Smatra se da je R. solanacearum identificirana ako su umnoženi PCR produkti
iste dužine i imaju iste polimorfizme duljine restrikcijskih fragmenata kao i
soj pozitivne kontrole.
5. FISH test
5.1. Pripremite suspenziju od oko 106 stanica/ml u ultra čistoj vodi.
5.2. Primijenite postupak FISH (Odjeljak VI.A.7.) s najmanje dvije oligo-probe
specifične za R. solanacearum (Dodatak 7).
5.3. FISH test je pozitivan ako se i kod kulture i kod pozitivne kontrole dobiju
iste reakcije.
6. Profiliranje masnih kiselina (FAP)
6.1. Uzgajajte kulturu 48 sati na 28 °C na triptikaza-soja-agaru (Oxoid).
6.2. Primijenite odgovarajući FAP postupak (Janse, 1991; Stead, 1992).
6.3. FAP test je pozitivan ako je profil vjerojatne kulture identičan profilu
pozitivne kontrole. Prisutnost karakterističnih masnih kiselina 14:0 3OH, 16:0
2OH, 16:1 2OH i 18:1 2OH te odsutnost 16:0 3OH u velikoj mjeri ukazuje na
Ralstonia sp.
7. Metode karakterizacije soja
Kod svakog novog slučaja izolacije R. solanacearum preporučuje se obaviti
karakterizaciju soja jednom od sljedećih metoda.
Prema potrebi, u svaki korišteni test uključite poznate referentne sojeve (vidi
Dodatak 3).
7.1. Određivanje biovara
R. solanacearum se dijeli na biovare na temelju sposobnosti iskorištavanja i/ili
oksidiranja tri disaharida i tri heksozna alkohola (Hayward, 1964 i Hayward i
sur., 1990). Hranjivi mediji za određivanje biovara opisani su u Dodatku 2. Test
se može uspješno obaviti inokuliranjem medija čistim kulturama izolata R.
solanacearum te inkubiranjem na 28 °C. Ako se medij rasporedi u 96 sterilnih
jažica na ploči za uzgoj stanica (200 µl po jažici), u roku od 72 sata može se
uočiti promjena boje od maslinasto zelene na žutu, što znači da je rezultat
testa pozitivan.

|  |  |  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
|  | Biovar | | | | |
|  | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Iskorištavanje: |  |  |  |  |  |
| Maltoza | – | + | + | – | + |
| Laktoza | – | + | + | – | + |
| D (+) celobioza | – | + | + | – | + |
| Manitol | – | – | + | + | + |
| Sorbitol | – | – | + | + | – |
| Dulcitol | – | – | + | + | – |

Biovar 2 se dijeli na podfenotipove pomoću dodatnih testova.

|  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- |
|  | Biovar 2A  (proširen u cijelom svijetu) | Biovar 2A  (u Čileu i Kolumbiji) | Biovar 2T  (u tropskim područjima) |
| Iskorištavanje  trehaloze | – | + | + |
| Iskorištavanje  mezo-inozitola | + | – | + |
| Iskorištavanje  D-riboze | – | – | + |
| Pektolitička aktivnost (1) | slaba | slaba | visoka |
| (1) Vidi Lelliot i Stead (1987) | | | |

7.2. Genomski otisak prsta
Molekularna diferencijacija sojeva u kompleksu R. solanacearum može se postići
primjenom nekoliko metoda, uključujući sljedeće:
7.2.1. Analiza polimorfizma duljine restrikcijskih fragmenata (RFLP) (Cook i
sur., 1989).
7.2.2. PCR ponavljajućih sljedova, korištenjem početnica REP, BOX i ERIC (Louws
i sur., 1995, Smith i sur., 1995).
7.2.3. Analiza polimorfizma duljine umnoženih fragmenata (AFLP) (Van der Wolf i
sur., 1998).
7.3. PCR metode
Specifične PCR početnice (Pastrik i sur., 2002; vidi Dodatak 6) mogu se
upotrijebiti za diferencijaciju sojeva koji pripadaju skupini 1 (biovari 3, 4 i
5) i skupini 2 (biovari 1, 2A i 2T) bakterije R. solanacearum, kako je prvobitno
bilo utvrđeno metodom RFLP (Cook i sur., 1989) i sekvenciranjem 16S rDNK
(Taghavi i sur., 1996).
C. TEST POTVRDE
Test patogenosti mora se provesti kao konačna potvrda dijagnoze R. solanacearum
i za ocjenu virulentnosti kultura identificiranih kao R. solanacearum.
1) Pripremite inokulum od oko 106 stanica/ml iz 24 do 48 sati stare kulture
izolata koji namjeravate testirati te odgovarajući pozitivni kontrolni soj
bakterije R. solanacearum (npr. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; vidi Dodatak
3).
2) Inokulirajte 5 do 10 sadnica osjetljivih rajčica ili patlidžana u fazi trećeg
pravog lista (vidi Odjeljak VI.A.9).
3) Inkubirajte do dva tjedna na 25 do 28 °C i uz visoku relativnu vlažnost te ih
primjereno zalijevajte pazeći da ne dođe do zasićenja vodom ili venuća zbog
nedostatka vode. Kod čistih bi se kultura trebalo pojaviti tipično venuće u roku
od 14 dana. Ako nakon ovog razdoblja simptomi nisu prisutni, ne može se
potvrditi da je kultura patogeni oblik bakterije R. solanacearum.
4) Pratite javljaju li se simptomi venuća i/ili epinastije, kloroze i
zaostajanja u rastu.
5) Iz biljaka sa simptomima izdvojite dio stabljike oko 2 cm iznad mjesta
inokulacije. Smrvite i suspendirajte u manjem volumenu sterilne destilirane vode
ili 50 mM fosfatnog pufera (Dodatak 4). Izolaciju iz suspenzije izvedite
razmazom razrjeđenja na prikladnu hranjivu podlogu, po mogućnosti selektivnu
(Dodatak 2), inkubirajte 48 do 72 sata na 28 °C te pratite rast kolonija
tipičnih za R. solanacearum.

Dodatak 1.
Laboratoriji uključeni u optimizaciju i validaciju protokola

|  |  |  |
| --- | --- | --- |
| Laboratorij (1) | Mjesto | Država |
| Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit | Beč i Linz | Austrija |
| Departement Gewasbescherming | Merelbeke | Belgija |
| Plantedirektoratet /p> | Lyngby | Danska |
| Central Science Laboratory | York | Engleska |
| Scottish Agricultural Science Agency | Edinburgh | Škotska |
| Laboratoire national de la protection des végétaux, unité de bactériologie | Angers | Francuska |
| Laboratoire national de la protection des végétaux, Station de quarantaine de la pomme de terre | Le Rheu | Francuska |
| Biologische Bundesanstalt | Kleinmachnow | Njemačka |
| Pflanzenschutzamt Hannover | Hannover | Njemačka |
| State Laboratory | Dublin | Irska |
| Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali | Bologna | Italija |
| Regione Veneto Unità Periferica per i Servizi Fitosanitari | Verona | Italija |
| Nederlandse Algemene Keuringsdienst | Emmeloord | Nizozemska |
| Plantenziektenkundige Dienst | Wageningen | Nizozemska |
| Direcção-Geral de Protecção das Culturas | Lisabon | Portugal |
| Centro Diagnostico de Aldearrubia | Salamanca | Španjolska |
| Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias | Valencia | Španjolska |
| Swedish University of Agricultural Sciences | Uppsala | Švedska |
| (1) Znanstvenici za vezu: vidi mrežnu stranicu http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main | | |

Dodatak 2.
Podloge za izolaciju i uzgoj bakterije R. solanacearum
(a) Uobičajene hranjive podloge
Hranjivi agar (NA)
Hranjivi agar (Difco) 23,0 g
Destilirana voda 1,0 L

Otopite sastojke i sterilizirajte u autoklavu na 121 °C 15 minuta.
Agar s kvascem, peptonom i glukozom (YPGA)
Ekstrakt kvasca (Difco) 5,0 g
Bacto pepton (Difco) 5,0 g
D (+) glukoza (monohidrat) 10,0 g
Bacto agar (Difco) 15,0 g
Destilirana voda 1,0 L

Otopite sastojke i sterilizirajte u autoklavu na 121 °C 15 minuta.
Agar sa saharozom i peptonom (SPA)
Saharoza 20,0 g
Bacto pepton (Difco) 5,0 g
K2HPO4 0,5 g
MgSO4.7H2O 0,25 g
Bacto agar (Difco) 15,0 g
Destilirana voda 1,0 L
pH 7,2 – 7,4

Otopite sastojke i sterilizirajte u autoklavu na 121 °C 15 minuta.
Kelmanova tetrazolium-podloga
Casamino kiseline (Difco) 1,0 g
Bacto pepton (Difco) 10,0 g
Dekstroza 5,0 g
Bacto agar (Difco) 15,0 g
Destilirana voda 1,0 L

Otopite sastojke i sterilizirajte u autoklavu na 121 °C 15 minuta.
Ohladite na 50 °C i dodajte otopinu 2,3,5-trifenil-tetrazolium-klorida (Sigma),
steriliziranu filtriranjem, kako biste dobili konačnu koncentraciju od 50 mg/l.
(b) Validirane selektivne hranjive podloge
SMSA podloga (Englebrecht, 1994, izmijene prema Elphinstone i sur., 1996)
Osnovna podloga
Casamino kiseline (Difco) 1,0 g
Bacto pepton (Difco) 10,0 g
Glicerol 5,0 ml
Bacto agar (Difco); vidi napomenu 2 15,0 g
Destilirana voda 1,0 L

Rastopite sastojke i sterilizirajte u autoklavu na 121 °C 15 minuta.
Ohladite na 50 °C i dodajte osnovne vodene otopine sljedećih sastojaka,
sterilizirane filtriranjem, kako biste dobili predviđene konačne koncentracije:
Kristal violet (Sigma) 5 mg na L
Polimiksin-B-sulfat (Sigma P-1004) 600 000 U (oko 100 mg) na L
Bacitracin (Sigma B-0125) 1 250 U (oko 25 mg) na L
Kloramfenikol (Sigma C-3175) 5 mg na L
Penicilin-G (Sigma P-3032) 825 U (oko 0,5 mg) na L
2,3,5-trifenil-tetrazolium-klorid (Sigma) 5igma) 50 mg na L

Napomena:
1. Rearugačiji od gore navedenih mogu utjecati na rast bakterije R.
solanacearum.
2. Umjesto Bacto agara (Difco) može se koristiti Oxoid agar br. 1. U tom će
slučaju R. solanacearum sporije rasti, ali se može smanjiti i rast konkurentnih
saprofita. Za formiranje tipičnih kolonija bakterije R. solanacearum možda će
trebati 1 do 2 dana više, a crveno obojenje može biti svjetlije i difuznije nego
na Bacto agaru.
3. Povećanjem koncentracije bacitracina na 2500 U/L mogu se smanjiti populacije
konkurentnih bakterija, a da se ne utječe na rast bakterije R. solanacearum.
Pohranite hranjivu podlogu i osnovnu otopinu antibiotika na 4 °C na tamno mjesto
i upotrijebite u roku od jednog mjeseca.
Prije uporabe, s podloga moramo ukloniti površinsku kondenzaciju.
Podloge ne smijete pretjerano osušiti.
Nakon pripremanja svake nove serije hranjive podloge, treba obaviti kontrolu
kakvoće tako što se nasadi suspenzija referentne kulture R. solanacearum (vidi
Dodatak 3) i prati hoće li doći do stvaranja tipičnih kolonija nakon dva do pet
dana inkubacije na 28 °C.
(c) Validirani mediji za obogaćivanje
SMSA tekući medij (Elphinstone i sur., 1996)
Pripremite kao za selektivnu podlogu SMSA s agarom, ali izostavite Bacto agar i
2,3,5-trifenil-tetrazol-klorid.
Modificirani Wilbrink tekući medij (Caruso i sur., 2002)
Saharoza 10 g
Proteoza pepton 5 g
K2HPO4 0,5 g
MgSO4 0,25 g
NaNO3 0,25 g
Destilirana voda 1 L

Sterilizirajte u autoklavu na 121 °C 15 minuta te ohladite na 50 °C.
Dodajte osnovne otopine antibiotika kao za SMSA tekući medij.

Dodatak 3.

A. Standardizirani kontrolni materijali dostupni na tržištu
(a) Bakterijski izolati
Preporučuje se korištenje sljedećih bakterijskih izolata kao standardnog
referentnog materijala bilo za pozitivne kontrole (Tablica 1) ili tijekom
optimizacije testova u svrhu izbjegavanja unakrsnih reakcija (Tablica 2). Svi su
sojevi dostupni na tržištu i mogu se nabaviti kod:
1. National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science
Laboratory, York, UK
2. Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen,
Nizozemska
3. Collection française de bactéries phytopathogènes (CFBP), INRA – Station de
phytobactériologie, Angers, Francuska
Tablica 1. SMT popis referentnih izolata bakterije R. solanacearum

|  |  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| Oznaka NCPPB | Br. SMT | Ostale oznake | Država podrijetla | Biovar |
| NCPPB 4153 | 6 | CFBP 4582, Pr 3020, EURS11 | Egipat | 2 |
| NCPPB 4154 | 10 | CFBP 4585, 550, EURS21 | Turska | 2 |
| NCPPB 3857 | 12 | CFBP 4587, Pr 1140, EURS26 | Engleska | 2 |
| NCPPB 1584 | 23 | CFBP 4598, EURS49 | Cipar | 2 |
| NCPPB 2505 | 24 | CFBP 4599, EURS50 | Švedska | 2 |
| NCPPB 4155 | 26 | CFBP 4601, 502, EURS55 | Belgija | 2 |
| NCPPB 4156\* | 71 \* | PD 2762, CFBP 3857 | Nizozemska | 2 |
| NCPPB 4157 | 66 | LNPV 15.59 | Francuska | 2 |
| NCPPB 4158 | 39 | CFBP 4608, Port 448, EURS80 | Portugal | 2 |
| NCPPB 4160 | 69 | IVIA–1632-2 | Španjolska | 2 |
| NCPPB 4161 | 76 | B3B | Njemačka | 2 |
| NCPPB 325 | 41 | CFBP 2047, KEL60-1, R842 | SAD | 1 |
| NCPPB 3967 | 42 | CFBP 4610, R285, GONg7 | Kostarika | 1 |
| NCPPB 4028 | 43 | CFBP 4611, R303/571, CIP310, SEQ205 | Kolumbija | 2 |
| NCPPB 3985 | 44 | CFBP 4612, R578, CIP312 | Peru | 2T |
| NCPPB 3989 | 45 | CFBP 4613, R568, CIP226 | Brazil | 2T |
| NCPPB 3996 | 46 | CFBP 3928, R276/355, CIP72, SEQ225 | Peru | 3 |
| NCPPB 3997 | 47 | CFBP 4614, R280/363, CIP49, HAY0131a | Australija | 3 |
| NCPPB 4029 | 48 | CFBP 4615, R297/349, CIP121, CMIb2861 | Sri Lanka | 4 |
| NCPPB 4005 | 49 | CFBP 4616, R470 | Filipini | 4 |
| NCPPB 4011 | 50 | CFBP 4617, R288, HEmps2 | Kina | 5 |
| \* Upotrebljavati kao standardni referentni soj bakterije *R. solanacearum* biovar 2 (rasa 3) | | | | |

Napomena:
Autentičnost gore navedenih sojeva može se jamčiti samo ako su oni dobiveni iz
autentične zbirke kultura.
Tablica 2. SMT popis referentnih serološki ili genetski srodnih bakterija za
uporabu pri optimizaciji testova detekcije

|  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- |
| Oznaka NCPPB | Br. SMT | Ostale oznake | Identifikacija |
| NCPPB 4162 | 51 | CFBP 1954 | *Bacill>Bacillus polymyxa* (1)< |
| NCPPB 4163 | 52 | CFBP 1538 | *Pseudomonas marginalis pv. marginalis* (1) |
| NCPPB 4164 | – | CFBP 2227 | *Burkholderia cepacia* (2) |
| NCPPB 4165 | – | CFBP 2459 | *Ralstonia pickettii* (2) |
| NCPPB 4166 | 58 | CFBP 3567  CSL Pr1150 | *Ralstonia pickettii* (1) |
| NCPPB 4167 | 60 | CFBP 4618  PD 2778 | *Ralstonia*sp. (1) |
| NCPPB 1127 | 53 | CFBP 3575 | *Burkholderia andropogonis* (1) |
| NCPPB 353 | 54 | CFBP 3572 | *Burkholderia caryophylli* (1) |
| NCPPB 945 | 55 | CFBP 3569 | *Burkholderia cepacia* (1) |
| NCPPB 3708 | 56 | CFBP 3574 | *Burkholderia glumae* (1) |
| NCPPB 3590 | 57 | CFBP 3573 | *Burkholderia plantarii* (1) |
| NCPPB 3726 | 59 | CFBP 3568 | *Banana Blood Disease Bacterium* (1) (2) (3) |
| NCPPB 4168 | 61 | CFBP 4619  IPO S339 | *Enterobacter* sp. (1) |
| NCPPB 4169 | 62 | IPO 1695 | *Enterobacter* sp. (1) |
| NCPPB 4170 | 63 | CFBP 4621  IPO S306 | *Ochrobactrum anthropi* (1) (2) |
| NCPPB 4171 | 64 | CFBP 4622  IPO 1693 | *Curtobacterium* sp. (1) (2) |
| NCPPB 4172 | 65 | IPO 1696a | *Pseudomonas* sp. (1) |
| NCPPB 4173 | – | PD 2318 | *Aureobacterium* sp. (2) |
| NCPPB 4174 | 81 | IVIA 1844.06 | *Flavobacterium* sp. (1) (2) |
| (1) Soj koji u serološkim testovima (IF i/ili ELISA) može unakrsno reagirati s poliklonskim serumima. | | | |
| (2) Soj od kojega se u nekim laboratorijima može umnožiti PCR produkt dužine slične dužini koja se očekuje pri uporabi specifičnih početnica OLI-1 i Y-2 (vidi Dodatak 6). | | | |
| (3) U većini testova mogao bi unakrsno reagirati, ali je poznato da se javlja samo na bananama u Indoneziji. | | | |

(b) Standardizirani kontrolni materijali dostupni na tržištu
Dolje navedeni standardni kontrolni materijal može se dobiti iz zbirke kultura
NCPPB.
Liofilizirane granule ekstrakta krumpira iz 200 zdravih gomolja krumpira kao
negativna kontrola za sve testove.
Liofilizirane granule ekstrakta krumpira iz 200 zdravih gomolja krumpira s 103
do 104 i 104 do 106 stanica R. solanacearum biovar 2 (soj NCPPB 4156 = PD 2762 =
CFBP 3857) kao pozitivna kontrola za serološke i PCR testove. S obzirom da
liofilizacija utječe na vijabilnost stanica, one nisu prikladne kao standardna
kontrola za izolaciju ili biotestove.
Formalinom fiksirane suspenzije bakterije R. solanacearum biovar 2 (soj NCPPB
4156 = PD 2762 = CFBP 3857) s 106 stanica/ml kao pozitivna kontrola za serološke
testove.
B. Pripremanje pozitivnih i negativnih kontrola za osnovne testove provjere
(PCR/IF i FISH)
Uzgojite 48-satnu kulturu virulentnog soja R. solanacearum rasa 3/biovar 2 (npr.
soj NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) na osnovnoj SMSA podlozi i suspendirajte u
10 mM fosfatnom puferu da dobijete gustoću stanica od oko 2 x 108 cfu/ml. Ovo je
obično blago zamućena suspenzija optičke gustoće 0,15 na 600 nm.
Izrežite jezgre pupaka iz 200 gomolja krumpira sorte s bijelom korom za koje je
poznato da nisu zaraženi bakterijom R. solanacearum.
Obradite jezgre pupaka uobičajenom metodom i resuspendirajte talog u 10 ml.
Napunite 10 sterilnih mikroepruveta od 1,5 ml s 900 µl resuspendiranog taloga.
U prvu mikroepruvetu dodajte 100 µl suspenzije R. solanacearum. Promiješajte na
vrtložnoj miješalici.
U sljedećih pet mikroepruveta pripremite decimalna razrjeđenja.
Ovih šest mikroepruveta s kontaminiranim ekstraktom koristite za pozitivnu
kontrolu. Četiri mikroepruvete s nekontaminiranim ekstraktom koristite za
negativnu kontrolu. U skladu s tim, označite mikroepruvete.
Pripremite alikvote od 100 µl u mikroepruvetama od 1,5 ml tako da dobijete devet
kopija svakog kontrolnog uzorka. Do uporabe ih pohranite na – 16 do – 24 °C.
Prisutnost i količinu R. solanacearum u kontrolnim uzorcima potvrdite najprije
IF testom.
Za PCR test, obavite ekstrakciju DNK na pozitivnim i negativnim kontrolnim
uzorcima za svaku seriju uzoraka za testiranje.
Za IF i FISH testove, obavite testove na pozitivnim i negativnim kontrolnim
uzorcima za svaku seriju uzoraka za testiranje.
Kod IF, FISH i PCR testova, R. solanacearum se mora detektirati u najmanje 106 i
104 stanica/ml pozitivnih kontrola i niti u jednoj negativnoj kontroli.
Dodatak 4
Puferi za postupke testiranja
Općenito: Neotvorenitvoreni sterilni puferi mogu se pohraniti do godi.
1. Puferi za postupak ekstrakcije
1.1. Ekstrakcijski pufer (50 mM fosfatni pufer, pH 7,0)
Ovaj se pufer koristi za ekstrakciju bakterije iz biljnog tkiva homogenizacijom
ili tresenjem.

|  |  |
| --- | --- |
| Na2HPO4 (bezvodni) | 4,26 g |
| KH2PO4 | 2,72 g |
| Destilirana voda | 1,00 L |

Otopite sastojke, provjerite pH i sterilizirajte u autoklavu 15 minuta na 121
°C.
Mogu biti korisni i sljedeći dodatni sastojci:

|  |  |  |
| --- | --- | --- |
|  | Svrha | Količina (na litru) |
| Pahuljice Lubrol | deflokulant (\*) | 0,5 g |
| DC silikon protiv  pjenjenja | sredstvo protiv pjenjenja (\*) | 1,0 ml |
| Tetranatrijev pirofosfat | antoksidans | 1,0 g |
| Polivinilpirolidon-40000 (PVP-40) | vezanje PCR inhibitora | 50 g |
| (\*) Upotrebljavati za metodu ekstrakcije homogeniziranjem | | |

1.2. Pufer za talog (10 mM fosfatni pufer, pH 7,2)
Ovaj se pufer koristi za resuspendiranje i razrjeđivanje ekstrakta jezgri pupaka
gomolja krumpira nakon koncentriranja u talog centrifugiranjem.

|  |  |
| --- | --- |
| Na2HPO4.12H2O | 2,7 g |
| NaH2PO4.2H2O | 0,4 g |
| Destilirana voda | 1,0 L |

Otopite sastojke, provjerite pH i sterilizirajte u autoklavu 15 minuta na 121
°C.
2. Puferi za IF test
2.1. IF pufer (10 mM fosfatni pufer s dodatkom soli (PBS), pH 7,2)
Ovaj se pufer koristi za razrjeđivanje antitijela

|  |  |
| --- | --- |
| Na2HPO4.12H2O | 2,7 g |
| NaH2PO4.2H2O | 0,4 g |
| NaCl | 8,0 g |
| Destilirana voda | 1,0 L |

Otopite sastojke, provjerite pH i sterilizirajte u autoklavu 15 minuta na 121
°C.
2.2. IF pufer Tween
Ovaj se pufer koristi za pranje stakalaca.
IF puferu dodajte 0,1 % Tween 20.
2.3. Glicerol s fosfatnim puferom, pH 7,6
Ovaj se pufer koristi kao tekućina za prekrivanje jažica u IF testu kako bi se
pojačala fluorescencija.

|  |  |
| --- | --- |
| Na2HPO4·12H2O | 3,2 g |
| NaH2PO4·2H2O | 0,15 g |
| Glicerol | 50 ml |
| Destilirana voda | 100 ml |

Pokrivne otopine protiv izblijeđivanja dostupne su na tržištu, npr. Vectashield®
(Vector Laboratories) ili Citifluor® (Leica).
3. Puferi za neizravni ELISA test
3.1. Pufer za oblaganje dvostruke jačine, pH 9,6

|  |  |
| --- | --- |
| Na2CO3 | 6,36 g |
| NaHCO3 | 11,72 g |
| Destilirana voda | 1,00 L |

Otopite sastojke, provjerite pH i sterilizirajte u autoklavu 15 minuta na 121°C.
Može se dodati natrijev sulfit (0,2 %) kao antioksidans ako je potrebno
spriječiti stvaranje oksidiranih aromatskih spojeva.
3.2. 10X fosfatni pufer s dodatkom soli (PBS), pH 7,4

|  |  |
| --- | --- |
| NaCl | 80,0 g |
| KH2PO4 | 2,0 g |
| Na2HPO4·12H2O | 29,0 g |
| KCl | 2,0 g |
| Destilirana voda | 1,0 L |

3.3. PBS-Tween

|  |  |
| --- | --- |
| 10X PBS | 100 ml |
| 10 % Tween 20 | 5 ml |
| Destilirana voda | 895 ml |

3.4. Blokirajući (za antitijela) pufer (mora biti svježe pripremljen)

|  |  |
| --- | --- |
| 10X PBS | 10,0 ml |
| Polivinilpirolidon-44000 (PVP-44) | 2,0 g |
| 10 % Tween 20 | 0,5 ml |
| Mlijeko u prahu | 0,5 g |
| Destilirana voda | dopunite do 100 ml |

3.5. Otopina supstrata alkalne fosfataze, pH 9,8
Dietanolamin 97 ml
Destilirana voda 800 ml

Pomiješajte i podesite pH na 9,8 koncentriranom HCl.
Dopunite destiliranom vodom do jedne litre.
Dodajte 0,2 g MgCl2.
Rastopite dvije tablete supstrata fosfataze od 5 miligrama (Sigma) na 15 ml
otopine.
4. Puferi za DASI ELISA test
4.1. Pufer za oblaganje, pH 9,6
Na2CO3 1,59 g
NaHCO3 2,93 g
Destilirana voda 1 000 ml

Otopite sastojke i podesite pH na 9,6.
4.2. 10X fosfatni pufer s dodatkom soli (PBS), pH 7,2 do 7,4
NaCl 80,0 g
NaH2PO4·2H2O 4,0 g
Na2HPO4·12H2O 27,0 g
Destilirana voda 1 000 ml

4.3. PBS-Tween
10X PBS 50 ml
10 % Tween 20 5 ml
Destilirana voda 950 ml

4.4. Pufer supstrata, pH 9,8
Dietanolamin 100 ml
Destilirana voda 900 ml

Pomiješajte i podesite pH na 9,8 koncentriranom HCl.
Dodatak 5
Određivanje stupnja kontaminacije u IF i FISH testovima
1. Odredite srednji broj tipičnih fluorescentnih stanica po vidnom polju (c).
2. Izračunajte broj tipičnih fluorescentnih stanica po jažici mikroskopskog
stakalca (C).
C = c × S/s
gdje je S = površina jažice stakalca sa više jažica
i s = površina polja objektiva

s = πi2/4G2K2 gdje je i = koeficijent polja
(ovisi o vrsti okulara i iznosi od 8 do 24)
K = koeficijent tubusa (1 ili 1,25)
G = povećanje objektiva (100x, 40 x itd.)

3. Izračunajte broj tipičnih fluorescentnih stanica po ml resuspendiranog taloga
(N).
N = C × 1000/y × F
gdje je y = količina resuspendiranog taloga u svakoj jažici
i F = faktor razrjeđenja resuspendiranog taloga

Dodatak 6
Validirani protokoli i reagensi za PCR
Napomena:
Preliminarna testiranja trebaju omogućiti ponovljivu detekciju 103 do 104
stanica bakterije R. solanacearum po ml ekstrakta uzorka.
Preliminarna testiranja ne smiju dati lažno pozitivne rezultate kod određenih
odabranih bakterijskih sojeva (vidi Dodatak 3).
1. Protokol za PCR prema Seal i sur. (1993)
1.1. Oligonukleotidne početnice
Uzvodna početnica OLI-1 5’-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3’
Nizvodna početnica Y-2 5’-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3’

Očekivana dužina umnoženog produkta iz kalupa DNK bakterije R. solanacearum =
288 bp.
1.2. Reakcijska smjesa za PCR

|  |  |  |
| --- | --- | --- |
| Reagens | Količina po reakciji | Konačna koncentracija |
| Sterilna ultra čista voda | 17,65 µl |  |
| 10X PCR pufer (1) (15 mM MgCl2) | 2,5 µl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| dNTP smjesa (20 mM) | 0,25 µl | 0,2 mM |
| Početnica OLI-1 (20 µM) | 1,25 µl | 1µM |
| Početnica Y-2 (20 µM) | 1,25 µl | 1µM |
| Taq polimeraza (5U/µl) (1) | 0,1 µl | 0,5 U |
| Volumen uzorka | 2,0 µl |  |
| Ukupni volumen | 25 µl |  |
| (1) Metoda je bila validirana Taq polimerazom Perkin Elmer (AmpliTaq) i Gibco BRL | | |

1.3. Uvjeti za PCR reakciju
Provedite sljedeći program:
1 ciklus od: (i) 2 minute na 96 °C (denaturacija kalupa DNK)
35 ciklusa od: (ii) 20 sekundi na 94 °C (denaturacija kalupa DNK)
(iii) 20 sekundi na 68 °C (sparivanje početnica i kalupa)
(iv) 30 sekundi na 72 °C (produljivanje kopije)
1 ciklus od: (v) 10 minuta na 72 °C (završno produljivanje)
(vi) držati na 4 °C

Napomena:
Ovaj je program optimiziran za korištenje s uređajem za PCR (thermal cycler)
Perkin Elmer 9600. Za rad s drugim modelima uređaja možda će trebati prilagoditi
trajanje ciklusa (ii), (iii) i (iv).
1.4. Analiza produkta umnožavanja restrikcijskim enzimima
PCR produkti umnoženi iz DNK bakterije R. solanacearum daju karakteristični
obrazac polimorfizma duljine restrikcijskih fragmenata s enzimom Ava II nakon
inkubacije na 37 °C.
2. Protokol za PCR prema Pastrik i Maiss (2000)
2.1. Oligonukleotidne početnice
Uzvodna početnica Ps-1 5’- agt cga acg gca gcg ggg g -3’
Nizvodna početnica Ps-2 5’- ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca -3’

Očekivana dužina umnoženog produkta iz kalupa DNK bakterije R. solanacearum =
553 bp.
2.2. Reakcijska smjesa za PCR

ble17">|  |  |  |
| --- | --- | --- |
| Reagens | Količina po reakciji | Konačna  koncentracija |
| Sterilna ultra čista voda | 16,025 µl |  |
| 10X PCR pufer (1) | 2,5 µl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (frakcija V) (10 %) | 0,25 µl | 0,1 % |
| d-NTP smjesa (20 mM) | 0,125 µl | 0,1 mM |
| Početnica Ps-1 (10 µM) | 0,5 µl | 0,2 µM |
| Početnica Ps-2 (10 µM) | 0,5 µl | 0,2 µM |
| Taq polimeraza (5U/µl) (1) | 0,1 µl | 0,5 U |
| Volumen uzorka | 5,0 µl |  |
| Ukupni volumen | 25,0 µl |  |
| (1) Metoda je bila validirana Taq polimerazom Perkin Elmer (AmpliTaq) i Gibco BRL. | | |

Napomena:
Prvotno optimizirano za uređaj (thermo cycler) MJ Research PTC 200 s
Gibco Taq polimerazom. Pri istim koncentracijama može se koristiti i Perkin
Elmer AmpliTaq i pufer
2.3. Uvjeti za PCR reakciju
Provedite sljedeći program:

|  |  |  |
| --- | --- | --- |
| 1 ciklus od: | (i) | 5 minuta na 95 °C (denaturacija kalupa DNK) |
| 35 ciklusa od: | (ii) | 30 sekundi na 95 °C (denaturacija kalupa DNK) |
| 0pt"> | (iii) | 30 sekundi na 68 °C (sparivanje početnica i kalupa) |
|  | (iv) | 45 sekundi na 72 °C (produljivanje kopije) |
| 1 ciklus od: | (v) | 5 minuta na 72 °C (konačno produljivanje) |
|  | (vi) | držanje na 4 °C |

Napomena:
Ovaj je program optimiziran za korištenje s uređajem za PCR (thermal cycler) MJ
Research PTC 200. Za rad s drugim modelima uređaja možda će trebati prilagoditi
trajanje ciklusa (ii), (iii) i (iv).
2.4. Analiza produkta umnožavanja restrikcijskim enzimima
PCR produkti umnoženi iz DNK bakterije R. solanacearum daju karakteristični
obrazac polimorfizma duljine restrikcijskih fragmenata s enzimom Taq I nakon
inkubacije od 30 minuta na 65 °C. Restrikcijski fragmenti dobiveni iz fragmenta
specifičnog za R. solanacearum veliki su 457 bp i 96 bp.
3. Protokol za multipleks PCR s unutarnjom PCR kontrolom (Pastrik i sur., 2002)
3.1. Oligonukleotidne početnice
Uzvodna početnica RS-1-F 5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3'
Nizvodna početnica RS-1-R 5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3'
Uzvodna početnica NS-5-F 5'-AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G-3'
Nizvodna početnica NS-6-R 5'-GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC-3'

Očekivana dužina umnoženog produkta iz kalupa DNK bakterije R. solanacearum =
718 bp (par početnica RS).
Očekivana dužina umnoženog produkta iz unutarnje PCR kontrole 18S rRNA = 310 bp
(par početnica NS).
3.2. Reakcijska smjesa za PCR

|  |  |  |
| --- | --- | --- |
| Reagens | Količina po reakciji | Konačna  koncentracija |
| Sterilna ultra čista voda | 12,625 µl |  |
| 10X PCR pufer (1) (15 mM MgCl2) | 2,5 µl |td> 1X (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (frakcija V) (10 %) | 0,25 µl | 0,1 % |
| d-NTP smjesa (20 mM) | 0,125 µl | 0,1 mM |
| Početnica RS-1-F (10 µM) | 2,0 µl | 0,8 µM |
| Početnica RS-1-R (10 µM) | 2,0 µl | 0,8 µM |
| Početnica NS-5-F (10 µM) (2) | 0,15 µl | 0,06 µM |
| Početnica NS-6-R (10 µM) (2) | 0,15 µl | 0,06 µM |
| Taq polimeraza (5U/µl) (1) | 0,2 µl | 1,0 U |
| Volumen uzorka | 5,0 µl |  |
| Ukupni volumen | 25,0 µl |  |
| (1) Metoda je bila validirana Taq polimerazom Perkin Elmer (AmpliTaq) i Gibco BRL  (2) Koncentracije početnica NS-5-F i NS-6-R bile su optimizirane za ekstrakciju jezgri pupaka metodom homogenizacije i pročišćavanjem DNK prema Pastriku (2000) (vidi Odjeljak VI.A.6.1.a). Ako se ekstrakcija obavlja tresenjem ili ako se primjenjuju druge metode izdvajanja DNK, trebat će ponovo optimizirati koncentracije reagensa. | | |

3.3. Uvjeti za reakciju PCR
Provedite sljedeći program:
1 ciklus od: (i) 5 minuta na 95 °C (denaturacija kalupa DNK)
35 ciklusa od: (ii) 30 sekundi na 95 °C (denaturacija kalupa DNK)
(iii) 30 sekundi na 58 °C (sparivanje početnica i kalupa)
(iv) 45 sekundi na 72 °C (produljivanje kopije)
1 ciklus od: (v) 5 minuta na 72 °C (konačno produljivanje)
(vi) držanje na 4 °C

Napomena:
Ovaj je program optimiziran za korištenje s uređajem za PCR (thermal cycler) MJ
Research PTC 200. Za rad s drugim modelima uređaja možda će trebati prilagoditi
trajanje ciklusa (ii), (iii) i (iv).
3.4. Analiza produkta umnožavanja restrikcijskim enzimom
PCR produkti umnoženi iz DNK bakterije R. solanacearum daju karakteristični
obrazac polimorfizma duljine restrikcijskih fragmenata s enzimom Bsm I ili
izoshizomerom (npr. Mva 1269 I) nakon inkubacije od 30 minuta na 65 °C.
4. Protokol za biovar specifičan PCR (Pastrik i sur. 2001)
4.1. Oligonukleotidne početnice
Uzvodna početnica Rs-1-F 5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3'
Nizvodna početnica Rs-1-R 5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3'
Nizvodna početnica Rs-3-R 5'-TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3'

Očekivana dužina umnoženog produkta iz kalupa DNK bakterije R. solanacearum:
sa Rs-1-F/Rs-1-R = 718 bp
sa Rs-1-F/Rs-3-R = 716 bp
4.2. Reakcijska smjesa za PCR
(a) Specifični PCR za biovar 1/2

|  |  |  |
| --- | --- | --- |
| Reagens | Količina po reakciji | Konačna  koncentracija |
| Sterilna ultra čista voda | 12,925 µl |  |
| 10X PCR pufer (1) | 2,5 µl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (frakcija V) (10 %) | 0,25 µl | 0,1 % |
| d-NTP smjesa (20 mM) | 0,125 µl | 0,1 mM |
| Početnica Rs-1-F (10 µM) | 2 µl | 0,8 µM |
| Početnica Rs-1-R (10 µM) | 2 µl | 0,8 µM |
| Taq polimeraza (5U/µl) (1) | 0,2 µl | 1,0 U |
| Volumen uzorka | 5,0 µl |  |
| Ukupni volumen | 25,0 µl |  |
| (1) Metode su validirane Taq polimerazom Perkin Elmer (AmpliTaq) i Gibco BRL | | |

(b) Specifični PCR za biovar 3/4/5

|  |  |  |
| --- | --- | --- |
| Reagens | Količina po reakciji | Konačna  koncentracija |
| Sterilna ultra čista voda | 14,925µl |  |
| 10X PCR pufer (1) | 2,5 µl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (frakcija V) (10 %) | 0,25 µl | 0,1 % |
| d-nTP smjesa (20 mM) | 0,125 µl | 0,1 mM |
| Početnica Rs-1-F (10 µM) | 1 µl | 0,4 µM |
| Početnica Rs-3-R (10 µM) | 1 µl | 0,4 µM |
| Taq polimeraza (5U/µl) (1) | 0,2 µl | 1,0 U |
| Volumen uzorka | 5,0 µl |  |
| Ukupni volumen | 25,0 µl |  |
| (1) Metode su validirane Taq polimerazom Perkin Elmer (AmpliTaq) i Gibco BRL | | |

4.3. Uvjeti za reakciju PCR
Provedite sljedeći program za specifične reakcije za biovar 1/2 i biovar 3/4/5:
1 ciklus od: (i) 5 minuta na 95 °C (denaturacija kalupa DNK)
35 ciklusa od: (ii) 30 sekundi na 95 °C (denaturacija kalupa DNK)
(iii) 30 sekundi na 58 °C (sparivanje početnica i kalupa)
(iv) 45 sekundi na 72 °C (produljivanje kopije)
1 ciklus od: (v) 5 minuta na 72 °C (konačno produljivanje)
(vi) držanje na 4 °C

Napomena:
Ovaj je program optimiziran za korištenje s uređajem za PCR (thermal cycler) MJ
Research PTC 200. Za rad s drugim modelima uređaja možda će trebati prilagoditi
trajanje ciklusa (ii), (iii) i (iv).
4.4. Analiza produkta umnožavanja restrikcijskim enzimom
PCR produkti umnoženi iz DNK bakterije R. solanacearum s početnicama Rs-1-F i
Rs-1-R daju karakteristični obrazac polimorfizma duljine restrikcijskih
fragmenata s enzimom Bsm I ili izoshizomerom (npr. Mva 1269 I) nakon inkubacije
od 30 minuta na 65 °C. PCR produkti umnoženi iz DNK bakterije R. solanacearum s
početnicama Rs-1-F i Rs-3-R nemaju mjesta restrikcije.
5. Priprema pufera za nanošenje
5.1. Bromfenol plavilo (10%-tna osnovna otopina)
Bromfenol plavilo 5 g
Destilirana voda (bidestilirana) 50 ml

5.2. Pufer za nanošenje
Glicerol (86 %) 3,5 ml
Bromfenol plavo (5,1) 300 µl
Destilirana voda (bidestilirana) 6,2 ml

6. 10X tris-acetatni EDTA pufer (TAE), pH 8,0
Tris pufer 48,40 g
Ledena octena kiselina 11,42 ml
EDTA (dinatrijeva sol) 3,72 g
Destilirana voda 1,00 L

Prije uporabe razrijedite do 1X.
Dostupan je i na tržištu (npr. Invitrogen ili ekvivalentni).
Dodatak 7
Validirani reagensi za FISH test
1. Oligo-probe
Proba OLI-1-CY3 specifična za R. solanacearum: 5'-ggc agg tag caa gct acc ccc-3'
Nespecifična eubakterijska proba EUB-338-FITC: 5'- gct gcc tcc cgt agg agt -3'
2. Otopina za fiksiranje
(UPOZORENJE! OTOPINA ZA FIKSIRANJE SADRŽI PARAFORMALDEHID KOJI JE TOKSIČAN.
NOSITE RUKAVICE I NE UDIŠITE GA. PREPORUČUJE SE RADITI U DIGESTORU.)
(i) Zagrijte 9 ml vode za molekularnu biologiju (npr. ultra čiste vode) na oko
60 °C i dodajte 0,4 g paraformaldehida. Paraformaldehid se otapa nakon što
dodate 5 kapi 1N NaOH i promiješate na magnetskoj miješalici.
(ii) Podesite pH na 7,0 dodajući 1 ml 0,1M fosfatnog pufera (PB; pH 7,0) i 5
kapi 1N HCl. Indikatorskim papirom provjerite vrijednost pH i ako je potrebno
podesite je pomoću HCl ili NaOH.
(UPOZORENJE! U OTOPINAMA S PARAFORMALDEHIDOM NE UPOTREBLJAVAJTE pH-METAR.)
(iii) Profiltrirajte otopinu kroz membranski filter od 0,22 µm te je do daljnje
uporabe pohranite na 4 °C i zaštitite od prašine.
3. 3X Hybmix
NaCl 2,7 M
Tris-HCl 60 mM (pH 7,4)
EDTA (sterilizirana filtriranjem i u autoklavu) 15 mM

Po potrebi razrijedite do 1X.
4. Otopina za hibridizaciju
1X Hybmix
Natrijev dodecil sulfat (SDS) 0,01 %
Formamid 30 %
Proba EUB 338 5 ng/μl
Proba OLI-1 ili OLI-2 5 ng/μl

Pripremite količine otopine za hibridizaciju prema izračunima u Tablici 1. Za
svako stakalce (s 2 različita uzorka u duplikatu) treba 90 μl otopine za
hibridizaciju. VAŽNO: FORMAMID JE VEOMA TOKSIČAN I ZATO NOSITE RUKAVICE I
PODUZMITE POTREBNE MJERE OPREZA!
Tablica 1. Predložene količine za pripremanje smjese za hibridizaciju

|  |  |  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Broj stakalaca | 1 | 4 | 6 | 8 | 10 |
| Sterilna ultra čista voda | 23,1 | 92,4 | 138,6 | 184,8 | 231,0 |
| 3 x hybmix | 30,0 | 120,0 | 180,0 | 240,0 | 300,0 |
| 1 % SDS | 0,9 | 3,6 | 5,4 | 7,2 | 9,0 |
| Formamid | 27,0 | 108,0  162,0 | 216,0 | 270,0 | |
| Proba EUB 338 (100 ng/μl) | 4,5 | 18,0 | 27,0 | 36,0 | 45,0 |
| Proba OLI-1 ili OLI-2 (100 ng/μl) | 4,5 | 18,0 | 27,0 | 36,0 | 45,0 |
| Ukupni volumen (μl) | 90,0 | 360,0 | 540,0 | 720,0 | 900,0 |
| *Napomena:*  Sve otopine koje sadrže oligo-probe osjetljive na svjetlost pohranite u tami na – 20 °C.    Zaštitite ih od izravne sunčeve sti ili električnog svjetla tijekom uporabe. | | | | | |

5. 0,1M fosfatni pufer, pH 7,0
Na2HPO4 8,52 g
KH2PO4 5,44 g
Destilirana voda 1,00 L

Otopite sastojke, provjerite pH i sterilizirajte u autoklavu na 121 °C 15
minuta.
Dodatak 8
Uzgoj patlidžana i rajčice
Sjeme rajčice (Lycopersicon esculentum) i patlidžana (Solanum melongena) posijte
u pasterizirani kompost za sjeme. Sadnice presadite u pasterizirani kompost za
lončanice nakon što se supke u cijelosti razviju (10 do 14 dana).
Prije inokulacije, rajčice i patlidžane treba uzgajati u stakleniku pod
sljedećim uvjetima:
Duljina dana 14 sati ili prirodna duljina dana ako je veća
Temperatura dnevna: 21 do 24 °C
noćna: 14 do 18 °C
Osjetljiva vrsta rajčice »Moneymaker«
Osjetljiva vrsta patlidžana »Black Beauty«
Dobavljači vidi mrežnu stranicu
http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

POPIS LITERATURE
1. Amann, R.I., L. Krumholz and D.A. Stahl. 1990. Fluorescent-oligonucleotide
probing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies
in microbiology. J. Bacteriol. 172: 762-770.
2. Anon. 1998. Council Directive 98/57/EC of 20 July 1998 on the control of
Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Official Journal of the European
Communities L235, 1-39.
3. Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. Labarre and B. Jouan. 1999. Design of
division specific primers of Ralstonia solanacearum and application to the
identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 105;
373-380.
4. Caruso, P., Gorris, M.T., Cambra, M., Palomo, J. L., Collar, J and Lopez,
M.M. 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody for sensitive
Detection of Ralstonia solanacearum in Asymptomatic Potato Tubers. Applied and
Environmental Microbiology, 68, 3634-3638.
5. Cook, D., Barlow, E. and Sequeira, L. 1989. Genetic diversity of Pseudomonas
solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphisms with DNA
probes that specify virulence and the hypersensitive response. Molecular
Plant-Microbe Interactions 1:113-121.
6. Elphinstone, J.G., Hennessy, J., Wilson, J.K. and Stead, D.E. 1996.
Sensitivity of detection of Ralstonia solanacearum in potato tuber extracts.
EPPO Bulletin 26; 663-678.
7. Englebrecht, M.C. (1994) Modification of a semi-selective medium for the
isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. In: A.C. Hayward (ed.)
Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Australian Centre for International
Agricultural Research, Canberra, Australia.
8. Hayward, A.C. 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of
Applied Bacteriology 27; 265-277.
9. Hayward, A.C., El-Nashaar, H.M., Nydegger, U. and De Lindo, L. 1990.
Variation in nitrate metabolism in biovars of Pseudomonas solanacearum. Journal
of Applied Bacteriology 69; 269-280.
10. Ito, S., Y. Ushijima, T. Fujii, S. Tanaka, M. Kameya-Iwaki, S. Yoshiwara and
F. Kishi. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia solanacearum in soil
using a semi-selective medium and a PCR technique. J. Phytopathology 146;
379-384.
11. Janse, J.D. (1988) A detection method for Pseudomonas solanacearum in
symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity.
Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 18, 343-351.
12. Janse, J.D. 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas
solanacaerum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and
Applied Microbiology 14; 335-345.
13. Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity of Pseudomonas
solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44;
693-695.
14. Klement Z.; Rudolph, K and D.C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology.
Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp.
15. Lelliott, R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial
diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd., Oxford. 216 pp.
16. Lopez, M.M., Gorris, M.T., Llop, P., Cubero, J., Vicedo, B., Cambra, M.,
1997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and
molecular detection of plant pathogenic bacteria. In: H.W. Dehne i sur., (eds).
Klewer Academic Publishers. pp. 117-121.
17. Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1994.
Specific genomic fingerprints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas
pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR. Applied and
Environmental Microbiology, 60, 2286-2295.
18. Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J. 1995.
Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly
classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85; 528-536.
19. Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J.-F Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M.
Fegan, A.C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Holloway, J.N. Timmis.
1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA probes
and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas
solanacearum). As Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 5; 19-33.
20. Pastrik, K.H. and Maiss, E. 2000. Detection of R. solanacearum in potato
tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148; 619-626.
21. Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and
detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S
ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European
Journal of Plant Pathology 108, 831-842.
22. Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D. (1995)
Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of
bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79.
23. Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic
bacteria. Schaad [Hrsg.]. - 3. ed.; St. Paul, Minnesota: 373 pp.
24. Seal, S.E., L.A. Jackson, J.P.W. Young, and M.J. Daniels. 1993. Detection of
Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood
Disease Bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of
oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J.
Gen. Microbiol. 139: 1587-1594.
25. Smith, J.J., Offord, L.C., Holderness, M. and Saddler, G.S. 1995. Genetic
diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3
in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61; 4262-4268.
26. Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas
spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic
Bacteriology 42; 281-295.
27. Taghavi, M., Hayward, A.C., Sly, L.I., Fegan, M. 1996. Analysis of the
phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas
syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene
sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46; 10-15.
28. Van Der Wolf, J.M., Bonants, P.J.M., Smith, J.J., Hagenaar, M., Nijhuis, E.,
Van Beckhoven, J.R.C., Saddler, G.S., Trigalet, A., Feuillade, R. 1998. Genetic
diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 in Western Europe as determined by
AFLP, RC-PFGE and rep-PCR. In: Prior, P., Allen, C. and Elphinstone, J. (eds.)
Bacterial wilt disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp.
44-49.
29. Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead, D.E. and Boonham, N.
1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and
quantitative flourogenic 5’ nuclease TaqMan assay. Applied and Environmental
Microbiology 66; 2853-2858.
30. Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A. and A.D.L. Akkermans. 1998.
Detection of R. sorum, which causes brown rot of potato, by fluorescent
in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol.
64: 4546-4554.

Pravilnik, NN 89/2008-2843
Opći uvjeti korištenjaZaštita privatnosti[Pristup podatcima](/data_access_hr.aspx)[ELI](/about_eli_hr.aspx)

©2026. g. Narodne novine d.d.

, izrada [Novena d.o.o.](http://novena.hr/)