ការបង្កឡើងរបស់ កោសិកាដើម pluripotent: វិធីសាស្រ្តនៃការបង្កើតកោសិកាដើម pluripotent ដែលត្រូវបានជំរុញ

វិធីសាស្រ្តនៃការបង្កើតកោសិកាដើម pluripotent ដែលត្រូវបានជំរុញ 
alt=유도만능줄기세포를 만드는데 필요한 4가지 전사인자|ស៊ុម| ដំណើរការ induction កោសិកាដើម pluripotent ដែលត្រូវបានជំរុញ http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Induction_of_iPS_cells.svg រូបភាពបានកែប្រែ
ទីមួយសាស្រ្តាចារ្យ Yamanaka ផ្អែកលើការពិតដែលថា pluripotency ត្រូវបានជំរុញនៅក្នុង កោសិកា នៅពេលដែល ការផ្ទេរនុយក្លេអ៊ែរ កោសិកា somatic ត្រូវបានអនុវត្តនៅលើ oocytes ឬនៅពេលដែលកោសិកា somatic និងកោសិកាដើមអំប្រ៊ីយ៉ុងត្រូវបានបញ្ចូលគ្នា ហ្សែនដែលដើរតួយ៉ាងសំខាន់ក្នុងការរក្សា pluripotency នៅក្នុងកោសិកាដើមអំប្រ៊ីយ៉ុងត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណ។ ពួកគេបានសន្មត់ថាវានឹងដើរតួនាទីយ៉ាងសំខាន់ក្នុងការជំរុញឱ្យមាន pluripotency នៅក្នុងកោសិកា somatic ។ ហើយក្នុងចំណោមហ្សែនផ្សេងៗដែលដើរតួនាទីយ៉ាងសំខាន់ក្នុងការរក្សាបាននូវសារធាតុ pluripotency នៅក្នុងកោសិកាដើមអំប្រ៊ីយ៉ុង មាន 24 ហ្សែន (Ecat1, Dpp5 (Esg1), Fbx015, Nanog, ERas, Dnmt3l, Ecat8, Gdf3, Sox15, Dppa4, Dppa, Fl72, Oct4, Sox2, Rex1, Utf1, Tcl1, Dppa3, Klf4, b-cat, cMyc, Stat3, Grb2) ត្រូវបានជ្រើសរើសជាបេក្ខភាពដែលគិតថានឹងជំរុញឱ្យមានពហុភាពនៅក្នុងកោសិកា somatic ។

មុនពេលណែនាំហ្សែន 24 ជាមួយនឹងមេរោគ retrovirus ហ្សែន neomycin/lacZ ត្រូវបានបញ្ចូលដោយ ការផ្សំឡើងវិញដូចគ្នា នៅជាប់នឹង អ្នកផ្សព្វផ្សាយ Fbx15 នៅក្នុង fibroblasts ស្បែកកណ្តុរ។ Fbx15 គឺជាភ្នាក់ងារផ្សព្វផ្សាយដែលត្រូវបានធ្វើឱ្យសកម្មនៅក្នុងកោសិកាដើម pluripotent ហើយហ្សែនដែលបង្ហាញពីហ្សែន neomycin/lacZ មានភាពធន់នឹង G418 (អង់ទីប៊ីយ៉ូទិក aminoglycoside ដែលបង្ហាញជាតិពុល cytotoxicity ខ្លាំងដោយការរារាំងការសំយោគប្រូតេអ៊ីន) https://terms.naver.com/entry.nhn?cid=561&docId=435663&mobile&categoryId=561 បន្ទាប់មក ហ្សែនទាំង 24 ត្រូវបាន បំប្លែង ទៅជា fibroblasts ស្បែកកណ្ដុរ ដោយប្រើមេរោគ retrovirus ។ កោសិកាទាំងនេះត្រូវបានដាំដុះនៅលើកោសិកាចំណី STO ដែលមានប្រហែល 0.3 mg/ml នៃ G418 ។ ក្នុង​ចំណោម​កោសិកា​ដែល​ហ្សែន​ត្រូវ​បាន​គេ​ណែនាំ កោសិកា​មួយ​ចំនួន​ក្លាយ​ជា​កោសិកា​ដើម​ដែល​មាន​សារធាតុ pluripotent ដែល​ជំរុញ​ឱ្យ​មាន ហើយ​អាណានិគម​ត្រូវ​បាន​បង្កើត​ឡើង។

ដើម្បីស្វែងយល់ពីកត្តាសំខាន់ៗដែលជំរុញឱ្យមាន pluripotency នៅក្នុងកោសិកា somatic ក្នុងចំណោមហ្សែនទាំង 24 ហ្សែនត្រូវបានជំរុញនៅក្នុង fibroblasts ស្បែកកណ្តុរដោយការលុបហ្សែនមួយក្នុងចំណោមហ្សែនទាំង 24 ។ តាមរយៈដំណើរការនៃការវាស់ស្ទង់ការផ្លាស់ប្តូរកម្រិតនៃការបង្កើតអាណានិគមជាកោសិកាដើម pluripotent ដែលត្រូវបានជំរុញដោយការបាត់បង់ហ្សែនមួយក្នុងចំនោម 24 ហ្សែន ប្រតិចារិកចំនួន 4 គ្រប់គ្រាន់ដើម្បីបំប្លែងកោសិកាស្បែកកណ្ដុរទៅជាកោសិកាដើម pluripotent ត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណ។ កត្តា (តុលា 3/4, Sox2, c-Myc, Klf4) ត្រូវបានរកឃើញ។ ជាលទ្ធផល សាស្រ្តាចារ្យ Yamanaka បានទទួលជោគជ័យក្នុងការបង្កើតកោសិកាដើម pluripotent ដែលជំរុញដោយកត្តាចម្លងចំនួនបួន។ វាអាចត្រូវបានគេមើលឃើញថាកោសិកាដើម pluripotent ដែលជំរុញឱ្យបង្ហាញលក្ខណៈសម្បត្តិស្រដៀងទៅនឹងកោសិកាដើមអំប្រ៊ីយ៉ុង។ កោសិកាដើមអំប្រ៊ីយ៉ុង និងកោសិកាដើម pluripotent ដែលបង្កឡើងគឺស្រដៀងគ្នានៅក្នុង morphology ហ្សែនដែលបានសម្តែង (ប្រៀបធៀបតាមរយៈ RT-PCR និង DNA microarray ) និងគំរូ DNA methylation (ប្រៀបធៀបតាមរយៈបណ្តុំហ្សែន bisulfite) ។

ក្នុងឆ្នាំ 2006 សាស្រ្តាចារ្យ Yamanaka បានទទួលជោគជ័យក្នុងការបង្កើតកោសិកាដើម pluripotent ដោយណែនាំកត្តាចម្លងចំនួន 4 ចូលទៅក្នុង fibroblasts កណ្ដុរ។ នៅឆ្នាំបន្ទាប់គាត់ក៏បានជោគជ័យក្នុងការបង្កើតកោសិកាដើម pluripotent បំផុសគំនិតដោយមនុស្សដោយបង្កើតកត្តាចម្លងចំនួនបួនដូចគ្នានៅក្នុង fibroblasts ស្បែករបស់មនុស្សបានធ្វើ។ Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K et al (2007). Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131:861-872 ក្នុងឆ្នាំដដែលនោះ ក្រុមការងាររបស់សាស្រ្តាចារ្យ James Thompson នៅសាកលវិទ្យាល័យ Wisconsin Madison បានទទួលជោគជ័យក្នុងការបង្កើតកោសិកាដើម pluripotent ពីកោសិកាស្បែកមនុស្ស ដោយណែនាំហ្សែន (Oct4, Sox2, Nanog និង Lin28) ដោយប្រើមេរោគ retrovirus ។ Junying Yu, Maxim A. Vodyanik, Kim Sumuga-Otto, Jessica Antosiewicz-Bourget, Jeniffer L. Frane, Shulan Tian, Jeff Nie, Gurdrun A. Jonsdottir, Victor Ruotti, Ron Stewart, Igor I. Slukvin, and James A. Thomson (2007). Induced Pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.. Science 21 December 2007: 1917-1920

ដំណើរការដែល fibroblasts កណ្ដុរវិវត្តន៍ទៅជាកោសិកាដើម pluripotent ដែលត្រូវបានបំផុសគំនិត ឆ្លងកាត់ដំណាក់កាលជាច្រើនដែលហ្សែនត្រូវបានធ្វើឱ្យសកម្មជាបន្តបន្ទាប់។

 ដំណើរការណែនាំលម្អិត 
ហ្សែន SOX2 ដើរតួនាទីយ៉ាងសំខាន់ក្នុងការរក្សាបាននូវភាពសម្បូរបែប។ SOX2 គ្រប់គ្រងកន្សោមនៃ 'DKK1' ដែលជាហ្សែនមួយផ្សេងទៀតដែលរារាំង ផ្លូវសញ្ញា Wint ហើយជាលទ្ធផលមិនត្រឹមតែរក្សា 'ពហុប៉ូត' នៃកោសិកាដើមពេញវ័យប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែថែមទាំងធ្វើនិយ័តកម្មដំណើរការនៃភាពខុសគ្នាទៅជាកោសិកាជាក់លាក់ផងដែរ។ គោលការណ៍នៃសកម្មភាពរបស់ហ្សែន SOX2 យោងតាមប្រព័ន្ធ 'SOX2-DKK1-Wint signal' នេះគឺដូចគ្នាមិនត្រឹមតែនៅក្នុងកោសិកាដើមពេញវ័យប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែវាក៏មាននៅក្នុងកោសិកាដើមអំប្រ៊ីយ៉ុង និងកោសិកាដើមដែលមានសារធាតុ pluripotent ផងដែរ។ http://app.yonhapnews.co.kr/YNA/Basic/article/new_search/YIBW_showSearchArticle_New.aspx?searchpart=article&searchtext=%EC%84%B1%EC%B2%B4%EC%A4%84%EA%B8%B0%EC%84%B8%ED%8F%AC+%EB%B6%84%ED%99%94%EC%A1%B0%EC%A0%88+%EC%9C%A0%EC%A0%84%EC%9E%90%EF%BF%BD%EC%9B%90%EB%A6%AC+%EB%B0%9D%ED%98%80&contents_id=AKR20111110102500017

 អាល់កាឡាំង phosphatase (AP) → អង់ទីហ្សែនអំប្រ៊ីយ៉ុងជាក់លាក់ដំណាក់កាលទី 1 (SSEA1) → ហ្សែន Nanog និង Oct4

ក្នុងចំណោមទាំងនេះ AP ចាប់ផ្តើមត្រូវបានបង្ហាញចាប់ពីថ្ងៃទី 3 បន្ទាប់ពីហ្សែនចំនួន 4 (Oct4, Sox2, Klf4, និង c-Myc) ត្រូវបានបង្ហាញនៅក្នុងកោសិកា SSEA1 ចាប់ផ្តើមបង្ហាញចាប់ពីថ្ងៃទី 9 ហើយថ្ងៃទី 4 ខែតុលា និង Nanog ចាប់ផ្តើមបង្ហាញពី ថ្ងៃទី 16. ផ្លាស់ប្តូរទៅជាកោសិកាដើម pluripotent ។ ដូច្នេះ ការបង្ហាញជាបន្តនៃហ្សែនទាំងបួនត្រូវតែកើតឡើងក្នុងរយៈពេល 12 ទៅ 16 ថ្ងៃដើម្បីបង្កើតកោសិកាដើម pluripotent ពេញលេញ។ http://bloodjournal.hematologylibrary.org/content/114/27.abstract.pdf

 កត្តាភាពខុសគ្នាដែលទាក់ទង 

 សុក ២ 
ហ្សែន c-Myc ដើរតួក្នុងការលើកកម្ពស់ការរីកសាយ និងការផ្លាស់ប្តូរកោសិកា។ លើសពីនេះទៀតទាក់ទងទៅនឹង histone acetyltransferase វា acetylates histones ដើម្បីបន្ធូរទំនាក់ទំនងរបស់ពួកគេជាមួយ DNA ដោយហេតុនេះកាត់បន្ថយស្ថានភាពនៃការបង្ក្រាបហ្សែន។ នេះអនុញ្ញាតឱ្យខែតុលា 3/4 និង Sox2 ភ្ជាប់យ៉ាងល្អទៅនឹងទីតាំងហ្សែនជាក់លាក់ និងជំរុញការចម្លង។ Fernandez, P.C., Frank, S.R., Wang, L., Schroeder, M., Liu, S., Greene,J., Cocito, A. and Amati, B. (2003). Genomic targets of the human c-Myc protein. Genes Dev. 17, 1115-1129 ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ហ្សែននេះគឺជាហ្សែនមហារីកមួយប្រភេទ ហើយសាស្រ្តាចារ្យ Yamanaka បានរកឃើញថា វាមិនចាំបាច់សម្រាប់ការកំណត់កោសិកាឡើងវិញនាពេលអនាគតនោះទេ។

 គ-Myc 
Klf4 ត្រូវបានគេស្គាល់ថារារាំងដោយផ្ទាល់ p53 ។ Rowland, B.D., Bernards, R., and Peeper, D.S. (2005). The KLF4 tumour suppressor is a transcriptional repressor of p53 that acts as a context-dependent oncogene. Nat. Cell Biol. 7, 1074-1082 p53 ត្រូវបានគេស្គាល់ថាដើម្បីទប់ស្កាត់ Nanog ក្នុងអំឡុងពេលនៃភាពខុសគ្នានៃកោសិកាដើមអំប្រ៊ីយ៉ុង។ Lin, T., Chao, C., Saito, S., Mazur, S.J., Murphy, M.E., Appella, E., and Xu, Y. (2004) p53 induces differentiation of mouse embryonic stem cells by suppressing Nanog expression. Nat. Cell Biol. 7, 165-171. Published Online December 26, 2004. 10.1038/ncb1211 កោសិកាដើម pluripotent ដែលត្រូវបានបង្កឡើងបង្ហាញពីប្រូតេអ៊ីន p53 តិចជាង fibroblasts ។ ដូច្នេះ ដោយការទប់ស្កាត់ p53 Klf4 នឹងធ្វើឱ្យ Nanog សកម្ម និងធ្វើឱ្យហ្សែនដែលបង្ហាញជាពិសេសនៅក្នុងកោសិកាដើមអំប្រ៊ីយ៉ុង។ Takahashi K, Yamanaka S(2006). Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126: 663-676

 Klf4 
កត្តាចម្លងនេះ ត្រូវបានគេស្គាល់ថាជា Oct-3/4 (octamer-binding transcription) ឬ POU5F1 (POU domain, class 5, transcription factor 1) គឺជាប្រូតេអ៊ីនដែលបានអ៊ិនកូដនៅក្នុងរាងកាយដោយហ្សែន POU5F1 ។ ខែតុលា-3/4 គឺជាកត្តាចម្លង homeodomain នៃគ្រួសារ POU ។ ប្រូតេអ៊ីននេះមានសារៈសំខាន់ក្នុងការបន្តដោយខ្លួនឯងនៃកោសិកាដើមអំប្រ៊ីយ៉ុងដែលមិនមានលក្ខណៈខុសគ្នា។ ដូច្នេះ កត្តាចម្លងនេះត្រូវបានប្រើជាសញ្ញាសម្គាល់សម្រាប់ក្រឡាដែលមិនខុសគ្នា។ ការបញ្ចេញមតិនៃខែតុលា-3/4 ត្រូវតែត្រូវបានគ្រប់គ្រង។ ការបញ្ចេញមតិនៃខែតុលា-3/4 ច្រើនពេក ឬតិចពេក បណ្តាលឱ្យកោសិកាដែលមិនមានលក្ខណៈខុសគ្នា។

 តុលា-៣/៤ 
ក្រុមការងាររបស់សាស្រ្តាចារ្យ Shinya Yamanaka នៅសាកលវិទ្យាល័យ Kyoto ក្នុងប្រទេសជប៉ុនបានបង្កើតកោសិកាដើម pluripotent ដោយបញ្ចូលហ្សែន Oct3/4, Sox2, c-Myc និង Klf4 ចូលទៅក្នុងកោសិកាស្បែកកណ្តុរដោយប្រើ មេរោគ retrovirus ។ សាស្ត្រាចារ្យ Shinya Yamanaka បានបង្ហាញថា ការដាក់បញ្ចូលហ្សែនទាំងបួននេះ អាចបង្កើតបានគ្រប់គ្រាន់នូវ pluripotency នៅក្នុងកោសិកា somatic ។ Takahashi K, Yamanaka S(2006). Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126: 663-676