natgillin/translations-raw huggingface dataset:
For the KeratinoSensTM assay, test chemicals are dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) to the final desired concentration (e.g. 200 mM).
Negativa resultat bör behandlas med försiktighet eftersom ämnen som endast reagerar på lysinrester kan detekteras som negativa av testmetoden.
The DMSO solutions can be considered self-sterilising, so that no sterile filtration is needed.
På grund av den begränsade metaboliska kapaciteten hos den använda cellinjen (21) och försöksbetingelserna kan även prohaptener (dvs. kemikalier som kräver enzymatisk aktivering, t.ex. via P450-enzymer) och prehaptener (dvs. kemikalier som aktiveras av autooxidation) också ge negativa resultat, särskilt om de har en låg oxidationsgrad.
Test chemical not soluble in DMSO is dissolved in sterile water or culture medium, and the solutions sterilised by e.g. filtration.
Testkemikalier som inte är hudsensibiliserande men ändå är kemiska stressorer kan å andra sidan leda till falska positiva resultat (14).
For a test chemical which has no defined molecular weight (MW), a stock solution is prepared to a default concentration (40 mg/mL or 4 % (w/v)) in the KeratinoSensTM assay.
Mycket cytotoxiska testkemikalier kan inte alltid bedömas på ett tillförlitligt sätt.
In case solvents other than DMSO, water or the culture medium are used, sufficient scientific rationale should be provided.
Testkemikalier som har en störande inverkan på luciferasenzymet kan störa luciferasens aktivitet i cellbaserade försök, vilket antingen orsakar skenbar inhibition eller ökad luminiscens (22).
Alternative concentrations may be used upon justification (e.g. in case of cytotoxicity or poor solubility).
Förutom att KeratinoSensTM-testet fungerar som underlag för att skilja mellan hudsensibiliserande ämnen och icke-hudsensibiliserande ämnen ger det även information om koncentration-respons som eventuellt kan bidra till bedömning av kemikaliers sensibiliseringspotential när försöket används inom ramen för integrerade strategier som IATA (19).
It undergoes the same dilution as described for the master concentrations in paragraph 22, so that the final negative (solvent) control concentration is 1 %, known not to affect cell viability and corresponding to the same concentration of DMSO found in the tested chemical and in the positive control.
Testmetoden ARE-Nrf2-luciferas använder en immortaliserad vidhäftande cellinje som härletts från mänskliga keratinocyter av typen HaCaT som stabilt transfekteras med valfri plasmid.
The positive control used in the case of the KeratinoSensTM assay is cinnamic aldehyde (CAS No. 14371-10-9, ≥ 98 % purity), for which a series of 5 master concentrations ranging from 0,4 to 6,4 mM are prepared in DMSO (from a 6,4 mM stock solution) and diluted as described for the master concentrations in paragraph 22, so that the final concentration of the positive control range from 4 to 64 μM.
Luciferassignalen avspeglar hudsensibiliserande ämnen som aktiverar endogena Nrf2-beroende gener.
Application of the test chemical and control substances
Detta möjliggör kvantitativ mätning (genom luminiscensdetektion) av luciferasgenens induktion, med användning av väletablerade ljusproducerande luciferassubstrat som en indikator på Nrf2-transkriptionsfaktorns aktivitet i celler efter exponering för elektrofila ämnen.
For each test chemical and positive control substance, one experiment is needed to derive a prediction (positive or negative), consisting of at least two independent repetitions containing each three replicates (i.e. n = 6).
Testkemikalier anses som positiva i KeratinoSensTM-testet om de orsakar en statistiskt signifikant induktion av luciferasaktiviteten över en viss gräns (dvs. > 1,5-faldig eller en ökning på 50 %), under en fastställd koncentration som inte avsevärt påverkar cellens viabilitet (dvs. under 1000 μM och vid en koncentration där cellens viabilitet är över 70 % (9) (12)).
In case of discordant results between the two independent repetitions, a third repetition containing three replicates should be performed (i.e. n = 9).
För detta ändamål fastställs det maximala förhållandet för luciferasaktivitetens induktion på lösningsmedelskontrollen (negativ kontroll) (Imax).
Each independent repetition is performed on a different day with fresh stock solution of test chemicals and independently harvested cells.
Eftersom cellerna exponeras för en rad koncentrationer av testkemikalien bör de koncentrationer som behövs för en statistiskt signifikant induktion av luciferasaktiviteten över gränsen (dvs. värdet EC1,5) interpoleras från dos-responskurvan (se beräkningar i punkt 32).
Cells may come from the same passage however.
Parallella cytotoxicitetsmätningar bör dessutom göras för att bedöma huruvida induktionsnivåerna för luciferasaktiviteten förekommer vid subcytotoxiska koncentrationer.
After seeding as described in paragraph 20, cells are grown for 24 hours in the 96-wells microtiter plates.
Före rutinanvändning av ARE-Nrf2-luciferas-testet enligt denna testmetod bör laboratoriet visa teknisk kompetens med hjälp av de tio kvalifikationsämnen som anges i tillägg 2.
The medium is then removed and replaced with fresh culture medium (150 μl culture medium containing serum but without Geneticin in the case of KeratinoSensTM) to which 50 μl of the 25 fold diluted test chemical and control substances are added.
Prestandastandarder (PS) (28) finns tillgängliga för att underlätta valideringen av nya eller modifierade testmetoder för ARE-Nrf2-luciferas in vitro som liknar KeratinoSensTM-testet, och för att möjliggöra snabba ändringar av denna testmetod för att inbegripa dessa.
At least one well per plate should be left empty (no cells and no treatment) to assess background values.
Ömsesidig acceptans av data (Mutual Acceptance of Data, MAD) enligt OECD-avtalet garanteras endast för testmetoder som validerats enligt PS, och om de har granskats och inbegripits i motsvarande testriktlinje av OECD.
The treated plates are then incubated for about 48 hours at 37 ± 1 °C in the presence of 5 % CO2 in the KeratinoSensTM assay.
Den enda metod som för närvarande omfattas av denna testmetod är det vetenskapligt giltiga KeratinoSensTM-testet (9) (12) (13) (14).
Care should be taken to avoid evaporation of volatile test chemicals and cross-contamination between wells by test chemicals by e.g. covering the plates with a foil prior to the incubation with the test chemicals.
Standardrutiner (SOP) för KeratinoSensTM-testet finns tillgängliga och bör användas när testmetoden genomförs och används i laboratoriet (15).
the use of a luciferase substrate with sufficient light output to ensure sufficient sensitivity and low variability.
Efter mottagandet uppförökas cellerna (t.ex.
After the 48 hour exposure time with the test chemical and control substances in the KeratinoSensTM assay, cells are washed with a phosphate buffered saline, and the relevant lysis buffer for luminescence readings added to each well for 20 min at room temperature.
Celler från denna ursprungliga stam kan uppförökas upp till ett maximalt passageantal (dvs. 25 för KeratinoSensTM) och används för rutintestning med användning av lämpligt underhållsmedium (för KeratinoSensTM används DMEM med serum och Geneticin).
In case alternative settings are used, e.g. depending on the model of luminometer used, these should be justified.
Det är viktigt att se till att cellerna aldrig blir helt konfluenta.
Furthermore, a glow substrate may also be used provided that the quality control experiment of Appendix 3 is successfully fulfilled.
Cellerna skördas en dag före testningen och fördelas till 96-hålsplattor (10000 celler/hål för KeratinoSensTM).
Cytotoxicity Assessment
Det är viktigt att undvika att cellerna sedimenteras under sådden för att säkerställa att ett enhetligt antal celler fördelas mellan hålen.
For the KeratinoSensTM cell viability assay, medium is replaced after the 48 hour exposure time with fresh medium containing MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Thiazolyl blue tetrazolium bromide; CAS No. 298-93-1) and cells incubated for 4 hours at 37 °C in the presence of 5 % CO2.
Om antalet inte är enhetligt kan detta steg ge upphov till en stor variation mellan hålen.
The MTT medium is then removed and cells are lysed (e.g. by adding 10 % SDS solution to each well) overnight.
För varje repetition används tre replikat för mätningen av luciferasaktiviteten och ett parallellt replikat används för cellviabilitetsförsöket.
After shaking, the absorption is measured at i.e. 600 nm with a photometer.
Beredning av testkemikalien och kontrollämnen
The following parameters are calculated in the KeratinoSensTM assay:
Testkemikalien och kontrollämnena bereds på testningsdagen.
the maximal average fold induction of luciferase activity (Imax) value observed at any concentration of the tested chemical and positive control;
För KeratinoSensTM-testet löses testkemikalierna upp i dimetylsulfoxid (DMSO) till slutlig önskad koncentration (t.ex.
the EC1,5 value representing the concentration for which induction of luciferase activity is above the 1,5 fold threshold (i.e. 50 % enhanced luciferase activity) was obtained; and
200 mM).
the IC50 and IC30 concentration values for 50 % and 30 % reduction of cellular viability.
DMSO-lösningarna kan anses vara självsteriliserande, vilket innebär att ingen sterilfiltrering krävs.
Fold luciferase activity induction is calculated by Equation 1, and the overall maximal fold induction (Imax) is calculated as the average of the individual repetitions.
Testkemikalier som inte är lösliga i DMSO löses upp i sterilt vatten eller odlingsmedium och lösningarna steriliseras t.ex. genom filtrering.
Equation 1:
För testkemikalier som inte har en fastställd molekylärvikt (MW) bereds en stamlösning till standardkoncentration (40 mg/ml eller 4 % (w/v)) i KeratinoSensTM-testet).
Fold induction
Om andra lösningsmedel än DMSO, vatten eller odlingsmedium används bör en tillfredsställande vetenskaplig motivering anges.
Lsample
Baserat på testkemikaliens DMSO-stamlösningar görs serieutspädningar med användning av DMSO för att få fram 12 huvudkoncentrationer av den kemikalie som ska testas (från 0,098 till 200 mM i KeratinoSensTM-testet).
Lblank
För testkemikalier som inte är upplösliga i DMSO görs de utspädningar som behövs för att få fram huvudkoncentrationerna med sterilt vatten eller ett sterilt odlingsmedium.
Lsolvent
Oberoende av vilket lösningsmedel som används späds huvudkoncentrationerna därefter ut 25-faldigt till odlingsmedier som innehåller serum och används slutligen för behandling med en ytterligare fyrfaldig utspädningsfaktor så att de slutliga koncentrationerna av den testade kemikalien sträcker sig från 0,98 till 2000 μM i KeratinoSensTM-testet.
where
Alternativa koncentrationer kan användas om det motiveras (t.ex. i händelse av cytotoxicitet eller dålig upplösningsförmåga).
L sample
Den negativa kontroll (lösningsmedel) som används i KeratinoSensTM-testet är DMSO (CAS-nr 67-68-5, ≥ 99 % renhet), för vilken sex hål per platta bereds.
is the luminescence reading in the test chemical well
Den negativa kontrollen genomgår samma utspädning som huvudkoncentrationerna enligt punkt 22, så att den slutliga negativa kontrollen (lösningsmedel) är 1 % och man vet att den inte påverkar cellernas viabilitet.
L blank
Den ska motsvara samma DMSO-koncentration som testkemikalien och den positiva kontrollen.
is the luminescence reading in the blank well containing no cells and no treatment
När det gäller testkemikalier som inte är lösliga i DMSO, för vilka utspädningarna görs i vatten, måste DMSO-nivån i alla hål för den slutliga testlösningen justeras till 1 %, precis som för de andra testkemikalierna och kontrollämnena.
L solvent
Den positiva kontroll som används i KeratinoSensTM -testet är kanelaldehyd (CAS-nr 14371-10-9, ≥ 98 % renhet), för vilken en serie av fem huvudkoncentrationer som sträcker sig från 0,4 till 6,4 mM bereds i DMSO (från en stamlösning på 6,4 mM).
is the average luminescence reading in the wells containing cells and solvent (negative) control
De späds ut på samma sätt som huvudkoncentrationerna enligt punkt 22, så att den slutliga koncentrationen för den positiva kontrollen sträcker sig från 4 till 64 μM.
,5 is calculated by linear interpolation according to Equation 2, and the overall EC1,5 is calculated as the geometric mean of the individual repetitions.
Andra lämpliga positiva kontroller, som helst bör ge EC1,5-värden i mitten av intervallet, kan användas om historiska data finns tillgängliga för att härleda jämförbara acceptanskriterier.
Equation 2:
Applicering av testkemikalien och kontrollämnen
is the lowest concentration in μM with > 1,5 fold induction
För varje testkemikalie och positivt kontrollämne krävs ett försök för att härleda en förutsägelse (positiv eller negativ).
is the highest concentration in μM with < 1,5 fold induction
Försöken bör bestå av minst två oberoende repetitioner med tre replikat var (dvs. n = 6).
is the fold induction measured at the lowest concentration with > 1,5 fold induction (mean of three replicate wells)
Om resultaten för de två oberoende repetitionerna inte överensstämmer bör en tredje repetition med tre replikat utföras (dvs. n = 9).
is the fold induction at the highest concentration with < 1,5 fold induction (mean of three replicate wells)
Varje oberoende repetition utförs på olika dagar med färska stamlösningar av testkemikalier och nyskördade celler.
Viability is calculated by Equation 3:
Cellerna får däremot komma från samma passage.
Equation 3:
Efter sådd enligt beskrivningen i punkt 20 odlas cellerna i 24 timmar i 96-hålsmikrotiterplattor.
Viability
Därefter avlägsnas mediet och ersätts med färskt odlingsmedium (150 μl odlingsmedium innehållande serum, men utan Geneticin för KeratinoSensTM), till vilket 50 μl av den 25-faldigt utspädda testkemikalien och kontrollämnena tillsätts.
Vblank
De behandlade plattorna inkuberas sedan i cirka 48 timmar vid 37 ± 1 °C med 5 % CO2 i KeratinoSensTM-testet.
Vsolvent
Det är viktigt att undvika förångning av flyktiga testkemikalier och korskontaminering mellan hålen av testkemikalierna, t.ex. genom att täcka över plattorna med folie före inkubationen med testkemikalierna.
V sample
Mätning av luciferasaktiviteten
is the MTT-absorbance reading in the test chemical well
Följande tre faktorer är kritiska för att säkerställa lämpliga luminiscensavläsningar:
V blank
Luminometern bör vara tillräckligt känslig.
is the MTT-absorbance reading in the blank well containing no cells and no treatment
Plattorna bör vara tillräckligt höga för att undvika ljuskorskontaminering.
V solvent
Luciferassubstratet bör ha ett tillräckligt ljusutfall för att säkerställa tillräcklig känslighet och låg variabilitet.
is the average MTT-absorbance reading in the wells containing cells and solvent (negative) control
Före testning bör ett kontrollförsök enligt beskrivningen i tillägg 3 utföras för att se till att dessa tre villkor är uppfyllda.
and IC30 are calculated by linear interpolation according to Equation 4, and the overall IC50 and IC30 are calculated as the geometric mean of the individual repetitions.
Efter 48-timmarsexponeringen med testkemikalien och kontrollämnena i KeratinoSensTM-testet tvättas cellerna med fosfatbuffrad koksaltlösning och relevant lyseringsbuffert för luminiscensavläsningarna tillsätts varje hål i 20 minuter i rumstemperatur.
Equation 4:
Plattorna med cellyseringen placeras därefter i luminometern för avläsning.
X is the % reduction at the concentration to be calculated (50 and 30 for IC50 and IC30)
I KeratinoSensTM-testet är avläsningen programmerad enligt följande: i) tillsätt luciferassubstratet till varje hål (dvs. 50 μl), ii) vänta i 1 sekund, och iii) integrera luciferasaktiviteten i 2 sekunder.
is the lowest concentration in μM with > x % reduction in viability
Om alternativa inställningar används, t.ex. beroende på använd luminometermodell, bör detta motiveras.
is the highest concentration in μM with < x % reduction in viability
Dessutom kan ett glödsubstrat användas, förutsatt att kvalitetskontrollförsöket i tillägg 3 är uppfyllt.
is the % viability at the lowest concentration with > x % reduction in viability
Bedömning av cytotoxicitet
is the % viability at the highest concentration with < x % reduction in viability
För KeratinoSensTM cellviabilitetsförsök byts mediet ut efter exponeringstiden på 48 timmar mot färskt medium som innehåller MTT (3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid, tiazolylblåtetrazoliumbromid, CAS-nr 298-93-1) och cellerna inkuberas i fyra timmar vid 37 °C med 5 % CO2.
For each concentration showing > 1,5 fold luciferase activity induction, statistical significance is calculated (e.g. by a two-tailed Student's t-test), comparing the luminescence values for the three replicate samples with the luminescence values in the solvent (negative) control wells to determine whether the luciferase activity induction is statistically significant (p < 0,05).
Därefter avlägsnas MTT-mediet och cellerna lyseras (t.ex. genom att tillsätta 10 % SDS-lösning till varje hål) över natten.
The lowest concentration with > 1,5 fold luciferase activity induction is the value determining the EC1,5 value.
Efter skakning mäts absorptionen vid 600 nm med en fotometer.
It is checked in each case whether this value is below the IC30 value, indicating that there is less than 30 % reduction in cellular viability at the EC1,5 determining concentration.
Följande parametrar beräknas i KeratinoSensTM-testet:
It is recommended that data are visually checked with the help of graphs.
Maximalt genomsnittligt induktionsförhållande avseende det värde som observerats för luciferasaktiviteten (Imax) vid någon koncentration av den testade kemikalien och den positiva kontrollen.
If no clear dose-response curve is observed, or if the dose-response curve obtained is biphasic (i.e. crossing the threshold of 1,5 twice), the experiment should be repeated to verify whether this is specific to the test chemical or due to an experimental artefact.
,5-värdet, som utgör den koncentration där induktionen av luciferasaktiviteten ligger över den 1,5-faldiga gränsen (dvs. 50 % ökad luciferasaktivitet).
In case the biphasic response is reproducible in an independent experiment, the lower EC1,5 value (the concentration when the threshold of 1,5 is crossed the first time) should be reported.
Koncentrationsvärdena IC50 och IC30 för minskning av cellens viabilitet med 50 % respektive 30 %.
In the rare cases where a statistically non-significant induction above 1,5 fold is observed followed by a higher concentration with a statistically significant induction, results from this repetition are only considered as valid and positive if the statistically significant induction above the threshold of 1,5 was obtained for a non-cytotoxic concentration.
Induktionsförhållandet för luciferasaktivitet beräknas med ekvation 1 och det totala maximala induktionsförhållandet (Imax) beräknas som genomsnittet av de individuella repetitionerna.
Finally, for test chemicals generating a 1,5 fold or higher induction already at the lowest test concentration of 0,98 μM, the EC1,5 value of < 0,98 is set based on visual inspection of the dose-response curve.
Ekvation 1:
The following acceptance criteria should be met when using the KeratinoSensTM assay.
Induktionsförhållande
First, the luciferase activity induction obtained with the positive control, cinnamic aldehyde, should be statistically significant above the threshold of 1,5 (e.g. using a T-test) in at least one of the tested concentrations (from 4 to 64 μM).
där
Second, the EC1,5 value should be within two standard deviations of the historical mean of the testing facility (e.g. between 7 μM and 30 μM based on the validation dataset) which should be regularly updated.
är luminiscensavläsningen i hålet med testkemikalien
In addition, the average induction in the three replicates for cinnamic aldehyde at 64 μM should be between 2 and 8.
är luminiscensavläsningen i hålet för blankprov, utan celler och utan behandling
If the latter criterion is not fulfilled, the dose-response of cinnamic aldehyde should be carefully checked, and tests may be accepted only if there is a clear dose-response with increasing luciferase activity induction at increasing concentrations for the positive control.
är den genomsnittliga luminiscensavläsningen i de hål som innehåller celler och lösningsmedel(negativ kontroll)
Finally, the average coefficient of variation of the luminescence reading for the negative (solvent) control DMSO should be below 20 % in each repetition which consists of 6 wells tested in triplicate.
,5 beräknas genom linjär interpolation enligt ekvation 2, och total EC1,5 beräknas som det geometriska medelvärdet för de individuella repetitionerna.
If the variability is higher, results should be discarded.
Ekvation 2
Interpretation of results and prediction model
är den lägsta koncentrationen i μM med > 1,5-faldig induktion
A KeratinoSensTM prediction is considered positive if the following 4 conditions are all met in 2 of 2 or in the same 2 of 3 repetitions, otherwise the KeratinoSensTM prediction is considered negative (Figure 1):
är den högsta koncentrationen i μM med < 1,5-faldig induktion
the Imax is higher than (>) 1,5 fold and statistically significantly different as compared to the solvent (negative) control (as determined by a two-tailed, unpaired Student's t-test);
är induktionsförhållandet mätt vid den lägsta koncentrationen med > 1,5-faldig induktion (medelvärde för tre replikathål)
the cellular viability is higher than (>) 70 % at the lowest concentration with induction of luciferase activity above 1,5 fold (i.e. at the EC1,5 determining concentration);
är induktionsförhållandet vid den högsta koncentrationen med < 1,5-faldig induktion (medelvärde för tre replikathål)
the EC1,5 value is less than (<) 1000 μM (or < 200 μg/ml for test chemicals with no defined MW);
Viabilitet beräknas med ekvation 3:
there is an apparent overall dose-response for luciferase induction (or a biphasic response as mentioned under paragraph 33).
Ekvation 3:
If in a given repetition, all of the three first conditions are met but a clear dose-response for the luciferase induction cannot be observed, then the result of that repetition should be considered inconclusive and further testing may be required (Figure 1).
Viabilitet
In addition, a negative result obtained with concentrations < 1000 μM (or < 200 μg/ml for test chemicals with no defined MW) should also be considered as inconclusive (see paragraph 11).
är avläsningen av MTT-absorbans i hålet med testkemikalien
Figure 1
är avläsningen av MTT-absorbans i hålet för blankprov, utan celler och utan behandling
Prediction model used in the KeratinoSensTM assay.
är den genomsnittliga avläsningen av MTT-absorbans i de hål som innehåller celler och lösningsmedel (negativ kontroll)
A KeratinoSensTM prediction should be considered in the framework of an IATA and in accordance with the provision of paragraphs 9 and 11
och IC30 beräknas genom linjär interpolation enligt ekvation 4, och totala IC50 och IC30 beräknas som det geometriska medelvärdet för de individuella repetitionerna.
In rare cases, test chemicals which induce the luciferase activity very close to the cytotoxic levels can be positive in some repetitions at non-cytotoxic levels (i.e. EC1,5 determining concentration below (<) the IC30), and in other repetitions only at cytotoxic levels (i.e. EC1,5 determining concentration above (>) the IC30).
Ekvation 4:
Such test chemicals shall be retested with more narrow dose-response analysis using a lower dilution factor (e.g. 1,33 or √2 (= 1,41) fold dilution between wells), to determine if induction has occurred at cytotoxic levels or not (9).
X är minskningen uttryckt i % vid den koncentration som ska beräknas (50 och 30 för IC50 och IC30)
Physical appearance, water solubility, DMSO solubility, molecular weight, and additional relevant physicochemical properties, to the extent available;
är den lägsta koncentrationen i μM med en minskning av viabiliteten på > x %
Physical appearance, water solubility, DMSO solubility and additional relevant physicochemical properties, to the extent available;
är den högsta koncentrationen i μM med en minskning av viabiliteten på < x %