natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Taken together, this information indicates the usefulness of the DPRA to contribute to the identification of skin sensitisation hazard.
Replikeringsindex indikerar det relativa antalet cellcykler per cell under exponeringsperioden för cytoB i behandlade odlingar i jämförelse med kontrollodlingar och kan användas för att beräkna procentandelen cytostas:
The term “test chemical” is used in this test method to refer to what is being tested and is not related to the applicability of the DPRA to the testing of substances and/or mixtures.
% cytostas = 100-100(CBPIT – 1) ÷ (CBPIC – 1)
This test method is not applicable for the testing of metal compounds since they are known to react with proteins with mechanisms other than covalent binding.
T odling behandlad med testkemikalie
A test chemical should be soluble in an appropriate solvent at a final concentration of 100 mM (see paragraph 18).
C kontrollodling
However, test chemicals that are not soluble at this concentration may still be tested at lower soluble concentrations.
antal mononukleära celler
In such a case, a positive result could still be used to support the identification of the test chemical as a skin sensitiser but no firm conclusion on the lack of reactivity should be drawn from a negative result.
antal binukleära celler
Limited information is currently available on the applicability of the DPRA to mixtures of known composition (18) (19).
antal multinukleära celler
The DPRA is nevertheless considered to be technically applicable to the testing of multi-constituent substances and mixtures of known composition (see paragraph 18).
totalt antal celler
Before use of this test method on a mixture for generating data for an intended regulatory purpose, it should be considered whether, and if so why, it may provide adequate results for that purpose.
Således gäller att ett CBPI-värde på 1 (alla celler är mononukleära) motsvarar 100 % cytostas.
Such considerations are not needed when there is a regulatory requirement for testing of the mixture.
Cytostas = 100 – RI
The current prediction model cannot be used for complex mixtures of unknown composition or for substances of unknown or variable composition, complex reaction products or biological materials (i.e. UVCB substances) due to the defined molar ratio of test chemical and peptide.
T behandlade odlingar
For this purpose a new prediction model based on a gravimetric approach will need to be developed.
C kontrollodlingar
In cases where evidence can be demonstrated on the non-applicability of the test method to other specific categories of chemicals, the test method should not be used for those specific categories of chemicals.
Således betyder ett RI-värde på 53 % att, jämfört med antalet celler som har delat sig till binukleära och multinukleära celler i kontrollodlingen, endast 53 % av detta antal har delat sig i den behandlade odlingen, dvs. 47 % cytostas.
This test method is an in chemico method that does not encompass a metabolic system.
När cytoB inte används, rekommenderas att cytotoxiciteten utvärderas på grundval av relativ ökning av celltal (RICC) eller relativ populationsfördubbling (RPD) (69), eftersom den andel av cellpopulationen som har delat sig beaktas i båda metoderna.
Chemicals that require enzymatic bioactivation to exert their skin sensitisation potential (i.e. pro-haptens) cannot be detected by the test method.
Således indikerar ett RICC-värde eller ett RPD-värde på 53 % att det förekommer 47 % cytotoxicitet/cytostas.
Chemicals that become sensitisers after abiotic transformation (i.e. pre-haptens) are reported to be in some cases correctly detected by the test method (18).
Genom att använda ett proliferationsindex (PI) kan cytotoxiciteten bestämmas genom att räkna antalet kloner som består av 1 cell (cl1), 2 celler (cl2), 3 till 4 celler (cl4) och 5 till 8 celler (cl8).
In the light of the above, negative results obtained with the test method should be interpreted in the context of the stated limitations and in the connection with other information sources within the framework of an IATA.
PI har använts som en värdefull och tillförlitlig cytotoxicitetsparameter även för cellinjer som har odlats in vitro utan tillsats av cytoB (35) (36) (37) (38) och kan anses utgöra en användbar ytterligare parameter.
Test chemicals that do not covalently bind to the peptide but promote its oxidation (i.e. cysteine dimerisation) could lead to a potential over estimation of peptide depletion, resulting in possible false positive predictions and/or assignement to a higher reactivity class (see paragraphs 29 and 30).
I alla händelser bör antalet celler före behandling vara detsamma för behandlade och negativa kontrollodlingar.
As described, the DPRA supports the discrimination between skin sensitisers and non-sensitisers.
Tidigare användes RCC (dvs. antalet celler i behandlade kulturer/antalet celler i kontrollkulturer) som cytotoxicitetsparameter, men rekommenderas inte längre eftersom cytotoxiciteten kan underskattas enligt detta mått.
However, it may also potentially contribute to the assessment of sensitising potency (11) when used in integrated approaches such as IATA.
Vid användning av automatiska klassificeringssystem, t.ex. flödescytometri, laserskanningcytometri eller bildanalys, kan antalet celler i formeln ersättas med antalet kärnor.
However further work, preferably based on human data, is required to determine how DPRA results may possibly inform potency assessment.
I de negativa kontrollodlingarna bör populationsfördubbling eller replikatindex överensstämma med kravet att provta celler efter behandlingen vid en tidpunkt som motsvarar cirka 1,5–2,0 gånger den normala cellcykeln.
The DPRA is an in chemico method which quantifies the remaining concentration of cysteine- or lysine-containing peptide following 24 hours incubation with the test chemical at 25 ± 2,5 °C.
I del B ska följande kapitel läggas till:
The synthetic peptides contain phenylalanine to aid in the detection.
Hudsensibilisering in chemico: Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA)
Relative peptide concentration is measured by high-performance liquid chromatography (HPLC) with gradient elution and UV detection at 220 nm.
Den här testmetoden motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 442C (2015).
Cysteine- and lysine peptide percent depletion values are then calculated and used in a prediction model (see paragraph 29) which allows assigning the test chemical to one of four reactivity classes used to support the discrimination between sensitisers and non-sensitisers.
Hudsensibiliserande ämnen är ämnen som leder till en allergisk reaktion efter hudkontakt enligt definitionen i FN:s globala harmoniserade system för klassificering och märkning av kemikalier (GHS) (1) och förordning (EC) nr 1272/2008 om klassificering, märkning och förpackning av ämnen och blandningar (CLP-förordningen) [12].
Prior to routine use of the method described in this test method, laboratories should demonstrate technical proficiency, using the ten proficiency substances listed in Appendix 2.
Den befintliga kunskapen om de kemiska och biologiska mekanismer som är förknippade med hudsensibilisering har sammanfattats i form av AOP (Adverse Outcome Pathway) (2), från den inledande molekylära händelsen via de mellanliggande händelser som orsakar den negativa effekten, nämligen allergisk kontaktdermatit hos människor och överkänslighet mot kontakt hos gnagare.
This test method is based on the DPRA DB-ALM protocol no 154 (20) which represents the protocol used for the EURL ECVAM-coordinated validation study.
Inom AOP för hudsensibilisering är den molekylära inledande händelsen en kovalent bindning av elektrofila ämnen till nukleofila centrum i hudproteiner.
It is recommended that this protocol is used when implementing and using the method in the laboratory.
Bedömning av hudsensibiliteten har normalt inneburit användning av försöksdjur.
The following is a description of the main components and procedures for the DPRA.
I de klassiska metoderna som baseras på marsvin, Magnusson Kligman Guinea Pig Maximisation Test (GPMT) och Buehler-testet (TM B.6 (3)), undersöks både induktions- och eliciteringsfaserna i hudsensibilisering.
Stock solutions of cysteine (Ac-RFAACAA-COOH) and lysine (Ac-RFAAKAA-COOH) containing synthetic peptides of purity higher than 85 % and preferably in the range of 90-95 %, should be freshly prepared just before their incubation with the test chemical.
Det är dock nödvändigt att kombinera metoder utan försöksdjur (in silico, in chemico, in vitro) inom IATA (Integrated Approaches to Testing and Assessment) för att fullständigt ersätta de djurförsök som används i dagsläget, med tanke på AOP:s begränsade mekanistiska täckning av de testmetoder utan försöksdjur som finns tillgängliga för närvarande (2) (7).
The final concentration of the cysteine peptide should be 0,667 mM in pH 7,5 phosphate buffer whereas the final concentration of the lysine peptide should be 0,667 mM in pH 10,2 ammonium acetate buffer.
Tanken med DPRA-metoden är att den ska ersätta den molekylära inledande händelsen vid hudsensibiliserande AOP, nämligen proteinreaktiviteten, genom att kvantifiera testkemikaliernas reaktivitet mot modellens syntetiska peptider, som innehåller antingen lysin eller cystein (8).
The HPLC run sequence should be set up in order to keep the HPLC analysis time less than 30 hours.
Procentvärdena för minskning av cystein- och lysinpeptidnivåer används sedan för att kategorisera ämnet i en av fyra reaktivitetsklasser i syfte att skilja mellan hudsensibiliserande och icke-hudsensibiliserande ämnen (9).
For the HPLC set up used in the validation study and described in this test method, up to 26 analysis samples (which include the test chemical, the positive control and the appropriate number of solvent controls based on the number of individual solvents used in the test, each tested in triplicate), can be accommodated in a single HPLC run.
DPRA har utvärderats i en valideringsstudie som leddes av EU:s referenslaboratorium inom Europeiska centret för bestämning av alternativa metoder (EURL ECVAM) samt i efterföljande oberoende granskningar av EURL ECVAM:s rådgivande vetenskapliga kommitté (ESAC), och ansågs vetenskapligt giltig (10) för användning som en del av en IATA i syfte att skilja mellan hudsensibiliserande och icke-hudsensibiliserande ämnen vid faroklassificering och märkning.
All of the replicates analysed in the same run should use the identical cysteine and lysine peptide stock solutions.
Exempel på användningen av DPRA-data i kombination med annan information finns i litteraturen (11) (12) (13) (14).
It is recommended to prove individual peptide batches for proper solubility prior to their use.
Definitioner av begreppen finns i tillägg 1.
Preparation of the test chemical
INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN, TILLÄMPLIGHET OCH BEGRÄNSNINGAR
Solubility of the test chemical in an appropriate solvent should be assessed before performing the assay following the solubilisation procedure described in the DPRA DB-ALM protocol (20).
Sambandet mellan proteinreaktivitet och risk för hudsensibilisering är väletablerat (15) (16) (17).
An appropriate solvent will dissolve the test chemical completely.
Proteinbindning är endast en av de viktiga händelserna i processen.
Since in the DPRA the test chemical is incubated in large excess with either the cysteine or the lysine peptides, visual inspection of the forming of a clear solution is considered sufficient to ascertain that the test chemical (and all of its components in the case of testing a multi-constituent substance or a mixture) is dissolved.
Trots den molekylära inledande händelsen i AOP-hudsensibilisering kan det hända att den information om proteinreaktivitet som genereras med metoder med och utan testning inte är tillräcklig i sig för att dra slutsatser om kemikaliers hudsensibiliserande potential.
Suitable solvents are acetonitrile, water, 1:1 mixture water:acetonitrile, isopropanol, acetone or 1:1 mixture acetone:acetonitrile.
De data som genereras med denna testmetod bör därför övervägas inom ramen för integrerade strategier som IATA och kombineras med annan kompletterande information, t.ex. från in vitro-test rörande andra nyckelhändelser i AOP-hudsensibiliseringen samt metoder utan testning, inklusive jämförelser från kemiskt analoga ämnen.
Other solvents can be used as long as they do not impact on the stability of the peptide as monitored with reference controls C (i.e. samples constituted by the peptide alone dissolved in the appropriate solvent; see Appendix 3).
Denna testmetod kan, i kombination med annan kompletterande information, användas för att skilja mellan hudsensibiliserande kemikalier (dvs. GHS-/CLP-kategori 1) och icke-hudsensibiliserande ämnen inom ramen för IATA.
As a last option if the test chemical is not soluble in any of these solvents attempts should be made to solubilise it in 300 μL of DMSO and dilute the resulting solution with 2700 μL of acetonitrile and if the test chemical is not soluble in this mixture attempts should be made to solubilise the same amount of test chemical in 1500 μL of DMSO and dilute the resulting solution with 1500 μL of acetonitrile.
Testmetoden kan inte användas fristående, vare sig för att dela in hudsensibiliserande ämnen i underkategorierna 1A och 1B enligt GHS/CLP, eller för att förutsäga styrka när det gäller säkerhetsbedömningsbeslut.
The test chemical should be pre-weighed into glass vials and dissolved immediately before testing in an appropriate solvent to prepare a 100 mM solution.
Beroende på tillämpligt regelverk kan dock ett positivt resultat med DPRA användas fristående för att klassificera kemikalier i GHS-/CLP-kategori 1.
For mixtures and multi-constituent substances of known composition, a single purity should be determined by the sum of the proportion of its constituents (excluding water), and a single apparent molecular weight should be determined by considering the individual molecular weights of each component in the mixture (excluding water) and their individual proportions.
DPRA-testmetoden har visat sig vara överförbar till laboratorier som har erfarenhet av analyser med vätskekromatografi (HPLC).
The resulting purity and apparent molecular weight should then be used to calculate the weight of test chemical necessary to prepare a 100 mM solution.
Det är mer sannolikt att DPRA underskattar kemikalier som visar en låg till måttlig hudsensibiliserande styrka (dvs. GHS-/CLP-underkategori 1B) än kemikalier som visar en hög hudsensibiliserande styrka (dvs. GHS/CLP-underkategori 1A) (18) (19).
For polymers for which a predominant molecular weight cannot be determined, the molecular weight of the monomer (or the apparent molecular weight of the various monomers constituting the polymer) may be considered to prepare a 100 mM solution.
För närvarande finns endast begränsad information om DPRA:s tillämplighet på blandningar med känd sammansättning (18) (19).
However, when testing mixtures, multi-constituent substances or polymers of known composition, it should be considered to also test the neat chemical.
DPRA anses dock vara tekniskt tillämplig på testning av multikomponentämnen och blandningar med känd sammansättning (se punkt 18).
For liquids, the neat chemical should be tested as such without any prior dilution by incubating it at 1:10 and 1:50 molar ratio with the cysteine and lysine peptides, respectively.
Innan testmetoden används på en blandning i syfte att samla in data för ett lagstadgat ändamål bör man överväga om, och i så fall varför, den kommer att ge godtagbara resultat för det syftet.
For solids, the test chemical should be dissolved to its maximum soluble concentration in the same solvent used to prepare the apparent 100 mM solution.
Sådana överväganden är inte nödvändiga om blandningen måste provas enligt lag.
It should then be tested as such without any further dilution by incubating it at 1:10 and 1:50 ratio with the cysteine and lysine peptides, respectively.
Beroende på testkemikaliens och peptidens definierade molförhållande kan den nuvarande prediktionsmodellen inte användas för komplexa blandningar med okänd sammansättning eller ämnen med okänd eller varierande sammansättning, komplexa reaktionsprodukter eller biologiska material (dvs. UVCB-ämnen).
Concordant results (reactive or non-reactive) between the apparent 100 mM solution and the neat chemical should allow for a firm conclusion on the result.
För detta ändamål är det nödvändigt att utveckla en ny prediktionsmodell baserad på en gravimetrisk strategi.
Preparation of the positive control, reference controls and coelution controls
Om det finns bevis för att testmetoden inte är tillämplig på andra specifika kemikaliekategorier bör den inte användas för dessa kategorier.
Cinnamic aldehyde (CAS 104-55-2; ≥ 95 % food-grade purity) should be used as positive control (PC) at a concentration of 100 mM in acetonitrile.
Testmetoden är en in chemico-metod som inte omfattar ett metaboliskt system.
Other suitable positive controls preferentially providing mid-range depletion values may be used if historical data are available to derive comparable run acceptance criteria.
Kemikalier som kräver enzymatisk bioaktivering för att deras hudsensibiliserande potential ska aktiveras (t.ex. prohaptener) kan inte detekteras med denna testmetod.
In addition, reference controls (i.e. samples containing only the peptide dissolved in the appropriate solvent) should also be included in the HPLC run sequence and these are used to verify the HPLC system suitability prior to the analysis (reference controls A), the stability of the reference controls over time (reference controls B) and to verify that the solvent used to dissolve the test chemical does not impact the percent peptide depletion (reference controls C) (see Appendix 3).
Kemikalier som blir hudsensibiliserande efter abiotisk transformation (dvs. prehaptener) rapporteras i vissa fall detekteras korrekt av testmetoden (18).
The appropriate reference control for each chemical is used to calculate the percent peptide depletion for that chemical (see paragraph 26).
Mot bakgrund av ovanstående bör negativa resultat som erhålls med testmetoden tolkas inom ramen för de fastställda begränsningarna och tillsammans med andra informationskällor inom ramen för en IATA.
In addition a co-elution control constituted by the test chemical alone for each of the test chemicals analysed should be included in the run sequence to detect possible co-elution of the test chemical with either the lysine or the cysteine peptide.
Testkemikalier som saknar en kovalent bindning till peptiden, men som får peptiden att oxidera (t.ex. cystein-dimerisering) kan leda till en eventuell överskattning av peptidens minskning, vilket i sin tur eventuellt kan leda till falska positiva förutsägelser och/eller till att kemikalien anvisas en högre reaktivitetsklass (se punkterna 29 och 30).
Incubation of the test chemical with the cysteine and lysine peptide solutions
Såsom beskrivits bidrar DPRA till att skilja mellan hudsensibiliserande och icke-hudsensibiliserande kemikalier.
Cysteine and lysine peptide solutions should be incubated in glass autosampler vials with the test chemical at 1:10 and 1:50 ratio respectively.
Metoden kan eventuellt även bidra till bedömningen av sensibiliseringspotential (11) vid användning av integrerade strategier såsom IATA.
If a precipitate is observed immediately upon addition of the test chemical solution to the peptide solution, due to low aqueous solubility of the test chemical, in this case one cannot be sure how much test chemical remained in the solution to react with the peptide.
Det krävs dock ytterligare arbete, företrädesvis baserat på data om människor, för att avgöra om DPRA-resultat eventuellt kan ligga till grund för bedömningar av sensibiliseringspotential.
Therefore, in such a case, a positive result could still be used, but a negative result is uncertain and should be interpreted with due care (see also provisions in paragraph 11 for the testing of chemicals not soluble up to a concentration of 100 mM).
DPRA är en in chemico-metod som kvantifierar den kvarstående koncentrationen av peptider som innehåller cystein eller lysin efter en 24-timmars inkubationsperiod med testkemikalien vid 25 ± 2,5 °C.
The reaction solution should be left in the dark at 25 ± 2,5 °C for 24 ± 2 hours before running the HPLC analysis.
De syntetiska peptiderna innehåller fenylalanin för att underlätta detektering.
Each test chemical should be analysed in triplicate for both peptides.
Den relativa peptidkoncentrationen mäts med vätskekromatografi (HPLC), med gradienteluering och UV-detektion vid 220 nm.
Samples have to be visually inspected prior to HPLC analysis.
Därefter beräknas procentvärdena för minskning av cystein- och lysinpeptidnivåer och används i en prediktionsmodell (se punkt 29), som gör det möjligt att kategorisera ämnet i en av fyra reaktivitetsklasser, som används för att skilja mellan hudsensibiliserande och icke-hudsensibiliserande ämnen (9).
If a precipitate or phase separation is observed, samples may be centrifuged at low speed (100-400 xg) to force precipitate to the bottom of the vial as a precaution since large amounts of precipitate may clog the HPLC tubing or columns.
För att visa att det finns tillräcklig erfarenhet av testet innan det används för rutintestning bör laboratoriet visa teknisk kompetens med hjälp av de tio kvalifikationsämnen som anges i tillägg 2.
If a precipitation or phase separation is observed after the incubation period, peptide depletion may be underestimated and a conclusion on the lack of reactivity cannot be drawn with sufficient confidence in case of a negative result.
Denna testmetod är baserad på DPRA DB-ALM-protokoll nr 154 (20), som är det protokoll som använts för EURL ECVAM:s samordnade valideringsstudie.
Preparation of the HPLC standard calibration curve
Detta protokoll bör tillämpas när metoden genomförs och används i laboratoriet.
A standard calibration curve should be generated for both the cysteine and the lysine peptides.
Nedan följer en beskrivning av de huvudsakliga delarna i och förfarandena för DPRA.
Peptide standards should be prepared in a solution of 20 % or 25 % acetonitrile:buffer using phosphate buffer (pH 7,5) for the cysteine peptide and ammonium acetate buffer (pH 10,2) for the lysine peptide.
Om en alternativ HPLC-konfiguration används bör laboratoriet visa att den motsvarar den validerade konfiguration som beskrivs i DB-ALM-protokollet (t.ex. genom att testa kvalifikationsämnena i tillägg 2).
Using serial dilution standards of the peptide stock solution (0,667 mM), 6 calibration solutions should be prepared to cover the range from 0,534 to 0,0167 mM.
Beredning av cystein- eller lysinpeptider
A blank of the dilution buffer should also be included in the standard calibration curve.
Nya stamlösningar av cystein (Ac-RFAACAA-COOH) och lysin (Ac-RFAAKAA-COOH) innehållande syntetiska peptider med en renhetsgrad på över 85 % och helst inom intervallet 90–95 %, bör beredas strax innan inkubationen med testkemikalien.
Suitable calibration curves should have an r2 > 0,99.
Den slutliga koncentrationen av cysteinpeptider bör vara 0,667 mM i pH 7,5 fosfatbuffert och den slutliga koncentrationen av lysinpeptider bör vara 0,667 mM i pH 10,2 ammoniumacetatbuffert.
HPLC preparation and analysis
HPLC-körningssekvensen bör ställas in så att HPLC-analystiden är mindre än 30 timmar.
The suitability of the HPLC system should be verified before conducting the analysis.
När det gäller den HPLC-konfiguration som används i valideringsstudien och som beskrivs i denna testmetod kan man samla upp till 26 analysprover (inbegripet testkemikalien, den positiva kontrollen och ett lämpligt antal lösningskontroller baserat på det antal enskilda lösningsmedel som används i testet, vart och ett testat tre gånger) i en enda HPLC-körning.
Peptide depletion is monitored by HPLC coupled with an UV detector (photodiode array detector or fixed wavelength absorbance detector with 220 nm signal).
Identiska stamlösningar av cystein- och lysinpeptider bör användas i alla replikat som analyseras i samma körning.
The appropriate column is installed in the HPLC system.
Enskilda peptidsatser bör provas för att kontrollera att lösligheten är lämplig före användning.