natgillin/translations-raw huggingface dataset:
By use of this method VTG and histopathology are evaluated on each individual and a possible change in the VTG level can thus be related to the phenotypic sex of the fish or genetic sex (Japanese medaka and the three-spined stickleback) of the fish.
De angivna värdena kan representera koncentrationer uttryckta som procenthalt per volym eller vikt (mg/l eller μg/l).
For further information see guidance for homogenisation (Appendix 5) and guidance for VTG quantification (Appendix 6).
Värdena kan multipliceras eller divideras med en eller flera tiopotenser, beroende på vad som är lämpligt.
Liver homogenate method for VTG analysis
Kolumn 1 kan användas om det råder betydande osäkerhet om toxicitetsnivån.
The liver is dissected out and stored at – 70 °C or below.
Vägledning för homogenisering av huvud och stjärt från unga exemplar av sebrafisk, knölskallelöja, storspigg och japansk risfisk
Recommended procedures for liver excision and pre-treatment are available in OECD TG 229 (37) or Chapter C.37 of this Annex (38).
Syftet med detta avsnitt är att beskriva de förfaranden som föregår bestämningen av VTG-koncentrationen.
Livers are then individually homogenised as described in OECD TG 229 or Chapter C.37 of this Annex.
Andra förfaranden som leder till en jämförbar bestämning av VTG kan också användas.
Blood plasma method for VTG analysis
Alla dissektionsinstrument och skärbrädan bör sköljas och rengöras ordentligt (t.ex. med 96 % etanol) mellan hanteringen av varje enskild fisk att förhindra ’VTG-förorening’ från honor eller inducerade hanar till oinducerade hanar.
Blood is collected from the anaesthetised fish by cardiac puncture, caudal vein or tail cutting, and centrifuged at 4 °C for plasma collection.
När en homogen massa erhållits tillsätts iskall homogeniseringsbuffertlösning med en mängd på 4–10 gånger vävnadens vikt (lägg märke till utspädningen).
How to cut a fish for measurement of VTG in head/tail homogenate and histological evaluation of the mid section
Buffertlösning för homogenisering:50 mM Tris-HCl pH 7,4;
Genetic sex determination
1 % proteashämmarblandning (Sigma):
A biological sample for the determination of the genetic sex is taken from individual fish in species possessing appropriate markers.
12 ml Tris-HCl pH 7,4 + 120 μl proteashämmarblandning (eller liknande proteashämmarblandningar).TRIS:
For Japanese medaka, the anal fin or dorsal fin is collected.
TRIS-ULTRA PURE (ICN)Proteashämmarblandning:
A detailed description is given in Appendix 9 including tissue sampling and sex determination by a PCR-method.
Från Sigma (för däggdjursvävnader) produkt nr P 8340.
Equally, for the three spined stickleback, a description of tissue sampling and a sex determining PCR-method is given in Appendix 10.
Vägledning för beräkning av vitellogenin för huvud/stjärthomogenat av sebrafisk (Danio rerio) (modifierat från Holbech m.fl., 2001).
VTG measurement
Andra förfaranden som använder homologa antikroppar och standarder kan användas
The measurement of VTG should be based upon a quantitative and analytically validated method.
Mikrotiterplattor (certifierade Maxisorp F96, Nunc, Roskilde Danmark) som i förväg belagts med 5 μg/ml anti-sebrafisk lipovitellin-IgG tinas upp och tvättas tre gånger med en tvättbuffert (*).
Information should be available upon the intra-assay and inter-assay variability of the method used in a given laboratory.
Renad sebrafisk-vitellogenin-standardlösning [1] späds ut i omgångar till 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10 och 20 ng/ml i en utspädningsbuffert (**), och proven späds ut minst 200 gånger (för att förhindra matriseffekter) i en utspädningsbuffert och appliceras på plattorna.
The source of inter- and intra-laboratory variability is (most likely) based on the different developing stages of the fish population.
En testkontroll appliceras i två exemplar.
Considering the variability of VTG measurement, NOECs based on this endpoint alone should be treated with great care.
150 μl tillsätts i varje brunn.
Different methods are available to assess VTG production in the fish species considered in this assay.
Standarderna appliceras i två exemplar och proverna i tre exemplar.
A measurement technique that is both relatively sensitive and specific is the determination of protein concentrations via enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
Inkubera över natten vid 4 °C i en skakapparat.
Homologous antibodies (raised against VTG of the same species) and most important homologous standards should be used.
Plattorna tvättas fem gånger med en tvättbuffert (*)
Dependent on the VTG sampling procedure, whole fish or the remaining mid-section of each fish is placed in a pre-labelled processing cassette and fixed in an appropriate fixative for histological determination of sex (optionally also for evaluation of gonadal staging).
AMDEX A/S, Danmark) och konjugerade antikroppar späds i en tvättbuffert.
Guidance on fixation and embedding is provided in Appendix 7 as well as in the OECD Guidance Document on the Diagnosis of Endocrine-Related Histopathology of Fish Gonads (22).
Den faktiska utspädningen varierar beroende på parti och ålder.
The individuals should be placed longitudinally in the paraffin block.
Plattorna tvättas fem gånger med tvättbuffert (*) och plattornas botten rengörs noggrant med etanol.
At least six longitudinal sections (3-5 μm in thickness) in a frontal plane including gonadal tissue from both gonads are taken from each individual.
150 μl TMB plus (***) tillsätts i varje brunn.
The interval between these sections should be approximately 50 μm for males and 250 μm for females.
Skydda plattan mot ljus med aluminiumfolie, och observera färgutvecklingen i en skakapparat.
However, since each block will often contain males and females (if more than one individual are embedded in each block), the interval between sections from these blocks should be approximately 50 μm until at least six sections of the gonads from each male are obtained.
När standardkurvan är fullt utvecklad hejdas enzymaktiviteten genom tillsats av 150 μl 0,2 M H2SO4 i varje brunn.
Thereafter, the interval between sections can be increased to approximately 250 μm for the females.
Tvättbuffert:
Sections are stained with haematoxylin and eosin and examined by light-microscopy with focus on sex (male, female, intersex or undifferentiated).
PBS-stamlösning (****)
Intersex is defined as presence of more than one oocyte in testis per six sections analysed or spermatogenic cells (yes/no) in ovaries.
Justera pH till 7,3 och fyll upp till 5 l med Millipore H2O.
Histopathology and staging of ovaries and testis is optional but if investigated, the results should be statistically analyzed and reported.
Förvara vid 4 °C.
It should be noted that some fish species naturally lack a fully developed pair of gonads and only one gonad may be present (e.g. Japanese medaka and occasionally zebrafish).
Utspädningsbuffert:
Genetic sex determination in individual Japanese medaka is based on the presence or absence of the medaka male-sex determining gene, DMY, which is located on the Y chromosome.
Justera pH till 7,3 och fyll upp till 1 l med Millipore H2O.
The genotypic sex of medaka can be identified by sequencing the DMY gene from DNA extracted from for instance a piece of anal fin or dorsal fin.
PBS-stamlösning
The presence of DMY indicates a XY (male) individual regardless of phenotype, while the absence of DMY indicates a XX (female) individual regardless of phenotype (23).
Justera pH till 6,8 och fyll upp till 2 l med Millipore H2O.
Guidance for tissue preparation and PCR method is given in Appendix 9.
Förvara vid rumstemperatur.
The genetic sex determination in individual three-spined stickleback is also performed via a PCR method, described in Appendix 10.
Vägledning för beredning av vävnadspreparat för könsbestämning och stadiebestämning av könskörtlar
The occurrence of intersex (for definition, see Appendix 1) should be reported.
Syftet med detta avsnitt är att beskriva de förfaranden som föregår utvärderingen av histologiska preparat.
Secondary sexual characteristics
Andra förfaranden som leder liknande resultat för könsbestämningen och stadiebestämningen av könskörtlarna kan också användas.
Secondary sexual characteristics are under endocrine control in species like the Japanese medaka;
Med några få undantag är dessa förfaranden är likartade för japansk risfisk (JMD) och sebrafisk (ZF).
therefore observations of physical appearance of the fish should if possible be made at the end of the exposure.
Avlivning, obduktion och fixering av vävnader
In the Japanese medaka, the papillary formation on the posterior part of the anal fin in females is androgen sensitive.
Mål:
Chapter C.37 of this Annex (38) provides relevant photographs of male secondary sex characteristics and androgenised females.
Sörja för human avlivning av fisk.
It is important that the strongest valid statistical test determine the endpoint.
Erhålla nödvändiga data rörande kroppsvikt och kroppsmätningar.
The replicate is the experimental unit but intra-replicate variability should be included in the statistical testing.
Utvärdera sekundära könskaraktärer.
A decision flow-chart is available in Appendix 8 to help with the most appropriate statistical test to use based on the characteristic of the data obtained from the test.
Dissekera vävnader för VTG-analys.
Statistical significance level is 0,05 for all endpoints included.
Fixering av könskörtlarna.
Proportions of sex and genetic sex
Förfaranden:
The proportions of sex should be analysed for significant effect (NOEC/LOEC approach) of exposure by Jonckheere-Terpstra (Trend test) if a monotone dose-response exists.
Fiskarna bör avlivas omedelbart innan obduktionen.
If non-monotonicity is found then a pair wise test should be applied:
Om det inte står flera prosektorer till förfogande bör därför inte flera fiskar avlivas samtidigt.
Use Dunnett's test if normality and homogenous variance can be obtained.
Med hjälp av en liten håv avlägsnas fisken från testbehållaren och förs till obduktionsplatsen i transportbehållaren.
Use Tamhane-Dunnett if heterogeneous variance is present.
Fisken släpps ut i avlivningslösningen.
Otherwise use exact Mann-Whitney test with Bonferroni-Holm adjustment.
Fisken avlägsnas från lösningen när andningen upphör och fisken inte reagerar på extern retning.
A flow chart describing the statistics of the proportions of sex is placed in Appendix 8.
Fiskens våtvikt fastställs.
The proportions of sex should be presented in tables as concentration proportions ± SD of males, females, intersex and undifferentiated.
För beredning av vävnader för VTG-analys kan fisken kan placeras på en korkplatta på objektbordet i ett dissektionsmikroskop.
Statistical significance should be highlighted.
a.
Examples are presented in the FSDT Phase 2 validation report (42).
För sebrafisk skärs huvudet av rakt bakom bröstfenan och stjärten skärs av rakt bakom ryggfenan.
Genetic sex should be reported as percentage of phenotypic sex reversal of males, females, intersex and undifferentiated.
b.
VTG concentrations
För japansk risfisk öppnas buken genom ett försiktigt gjort snitt som sträcker sig längs den ventrala mittlinjen från skuldergördeln till en punkt som ligger precis kranialt från anus.
VTG concentrations should be analysed for significant effect (NOEC/LOEC approach) of exposure.
Med hjälp av en liten pincett och en liten sax avlägsnas levern försiktigt.
The Dunnett test is preferable to the t-test with Bonferroni correction.
Prov för VTG-analys placeras i eppendorfrör och fryses omedelbart i flytande kväve.
Where a Bonferroni correction is used, the Bonferroni-Holm correction is preferable.
Kroppen, inklusive könskörtlar, placeras i en på förhand märkt vävnadskassett av plast som överförs till Davidsons eller Bouins fixativ.
Allowance should be made for log-transformation of VTG to achieve normality and variance homogeneity.
Fixativets volym ska vara minst tio gånger den uppskattade vävnadsvolymen.
Next, if the concentration-response is consistent with monotonicity, then the JonckheereTerpstra test is preferable to any of the above.
Fixeringsbehållaren omskakas varsamt i fem sekunder för att lösgöra luftbubblor från kassetten.
For details see the flow chart in Appendix 8.
Alla vävnader blir kvar i Davidsons fixativ över natten, och överförs sedan till separata behållare med 10 % neutral buffrad formalin följande dag.
Results should be reported in tables as concentration means ± SD for males, females, intersex and undifferentiated separately.
Behållare med kassetter omskakas varsamt i fem sekunder för att säkerställa tillräcklig infiltrering av formalinet i kassetterna.
Statistical significance for phenotypic females and phenotypic males should be highlighted.
b.
Test chemical actual concentrations
Vävnaderna blir kvar i Bouins fixativ i 24 timmar och överförs därefter till 70 % etanol.
The actual chamber concentrations of the test chemical should be analysed in frequencies described in paragraph 34.
Bearbetning av vävnader
Results should be reported in tables as mean concentration ± SD on replicate basis as well as on concentration basis with information on number of samples and with outliers from the mean treatment concentration ± 20 % highlighted.
Torka ut vävnaden för tillräcklig infiltrering av paraffin.
Examples can be found in the FSDT Phase 2 validation report (42).
Impregnera vävnaden med paraffin för att bevara vävnadsintegriteten och skapa en fast yta för mikrotomi.
The test results should be interpreted with caution where measured test chemical concentrations in test solutions occur at levels near the detection limit of the analytical method.
Märkta vävnadskassetter avlägsnas från lagringen i formalin/etanol och kassetterna placeras i beredningskorgarna.
Relevant physical-chemical properties;
Beredningskorgen fylls i vävnadsberedaren.
chemical identification data including purity and analytical method for quantification of the test chemical.
Tidsplanen för beredningen väljs ut.
Test procedure used (e.g. flow-through semi-static/renewal);
Efter det att vävnadsberedaren har slutfört behandlingscykeln kan korgarna överföras till inbäddningsstationen.
test design including test concentrations, method of preparation of stock solutions (in an Annex), frequency of renewal (the solubilising agent and its concentration should be given, when used);
Inbäddning
The nominal test concentrations, the means of the measured values and their standard deviations in the test chambers and the method by which these were attained (the analytical method used should be presented in an Annex);Evidence that the measurements refer to the concentrations of the test chemical in true solution;
Mål:
Water quality within test chambers:
Att korrekt justera provexemplarets position i stelnat paraffin för mikrotomi.
Detailed information on feeding (e.g. type of food(s), source, amount given and frequency and analyses for contaminants (e.g. PCBs, PAHs and organochlorine pesticides) if relevant.
Korgen med kassetter avlägsnas från beredaren och sänks ned i den paraffinfyllda främre behållaren i inbäddningsstationens värmekonsol, eller så flyttas kassetterna till en separat paraffinvärmare.
Evidence that controls met the validity criteria:
Den första kassetten som ska bäddas in avlägsnas från den främre behållaren i inbäddningsstationens värmekonsol eller från paraffinvärmaren.
data on hatching rate should be presented in tables as percentage per replicate and per concentration.
Kassettens lock avlägsnas och kasseras, och kassettens etikett kontrolleras mot djurregistret för att lösa eventuella problem med avvikelser innan inbäddningen.
Outliers from the acceptance criteria (in controls) should be highlighted.
En lagom stor inbäddningsform väljs ut.
Survival should be presented as percentage per replicate and per concentration.
Formen hålls under fördelningskonsolens påfyllningspip och fylls med flytande paraffin.
Outliers from the validity criteria (in controls) should be highlighted;
Provexemplaret avlägsnas från kassetten och placeras i det flytande paraffinet i formen.
Clear indication of the results obtained on the different endpoints observed:
Detta ska upprepas med 4–8 exemplar för varje paraffinform.
embryo survival and hatching success;
De enskilda fiskarnas position markeras genom att fisk nr 1 placeras 180 grader mot fisk nr 2–4/8.
external abnormalities;
Ytterligare paraffin tillsätts för att täcka provexemplaret.
length and weight;
Formen och kassettens underdel placeras på kylplattan i kryokonsolen.
VTG measurements (ng/g homogenate, ng/ml plasma or ng/mg liver);
Efter att paraffinet har stelnat avlägsnas blocket (dvs. det stelnade paraffinet innehållande vävnaderna och kassettens underdel) från formen.
gonadal histology, sex ratio, genetic sex data;
Mikrotomi
incidence of any unusual reactions by the fish and any visible effects produced by the test chemical.
Skära ut och montera histologiska preparat för färgning.
The results should be presented as mean values ± standard deviation (SD) or standard error (SE).
Den inledande fasen av mikrotomin, som går under benämningen ’skiktning’, utförs enligt följande:
The statistical flow chart (Appendix 8) should be followed.
Paraffinblocket placeras i mikrotomens fastspänningschuck.
Sumpter, J.P. and S. Jobling, 1995, “Vitellogenesis As A Biomarker for Estrogenic Contamination of the Aquatic Environment”, Environmental Health Perspectives 103, pp. 173-178.
Chucken förs framåt genom att mikrotomhjulet roteras, och tjocka preparat skärs ut från paraffinblockets yta tills kniven når de inbäddade vävnaderna.
Hutchinson, S. Maddix, and H. Trip (1999), “An in vivo testing system for endocrine disruptors in fish early life stages using induction of vitellogenin”, Environmental Toxicology and Chemistry 18, pp. 337-347.
c.
Pedersen, and P. Bjerregaard (2001a), “Development of an ELISA for vitellogenin in whole body homogenate of zebrafish (Danio rerio)”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 130, pp. 119-131.
Mikrotomens preparattjocklek ställs in på mellan 3–5 mikrometer.
Andersen, L., P. Bjerregaard, and B. Korsgaard (2003), “Vitellogenin induction and brain aromatase activity in adult male and female zebrafish exposed to endocrine disrupters”, Fish Physiology and Biochemistry 28, pp. 319-321.
Chucken förs framåt och flera preparat skärs ut från blocket för att avlägsna alla artefakter som skapats på vävnadens snittyta under grovputsningen.
Tyler (2002), “Utility of a juvenile fathead minnow screening assay for detecting (anti-)estrogenic substances”, Environmental Toxicology and Chemistry 21, pp. 319-326.
Blocket kan avlägsnas från chucken och placeras på is med framsidan nedåt för att blöta ur vävnaden.
Wang (2007), “Toxicity of the aromatase inhibitor letrozole to Japanese medaka (Oryzias latipes) eggs, larvae and breeding adults”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 145, pp. 533-541.
Nästa fas av mikrotomin är den slutliga uppdelningen och monteringen av vävnadspreparaten på objektglasen.
LeBlanc, and C.V.Sullivan (1999), “Fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin: purification, characterization and quantitative immunoassay for the detection of estrogenic compounds”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 123, pp. 113-125.
Dessa förfaranden genomförs på följande sätt:
Porcher (2002), “Development and validation of an enzyme-linked immunosorbent assay to measure vitellogenin in the zebrafish (Danio rerio)”, Environmental Toxicology and Chemistry 21, pp. 1699-1708.
a.
Hatano, H. Mizukami, M. Yamashita, R. Sakakibara, and E. Tamiya (2002), “Development and application of a monoclonal antibody-based sandwich ELISA for quantification of Japanese medaka (Oryzias latipes) vitellogenin”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 132, pp. 161-169.
Om blocket har lagts på is avlägsnas det från isen och sätts återigen fast i mikrotomens chuck.
Bengtsson (2004), “The juvenile three-spined stickleback (Gasterosteus aculeatus L.) as a model organism for endocrine disruption — II — kidney hypertrophy, vitellogenin and spiggin induction”, Aquatic Toxicology 70, pp. 311-326.
b.
Tatarazako, N., M. Koshio, H. Hori, M. Morita, and T. Iguchi (2004), “Validation of an enzyme-linked immunosorbent assay method for vitellogenin in the medaka”, Journal of Health Science 50, pp. 301-308.
Med mikrotomens preparattjocklek inställd på 3–5 mikrometer förs chucken framåt genom att mikrotomhjulet roteras.
Eidem, J.K., H. Kleivdal, K. Kroll, N. Denslow, R. van Aerle, C. Tyler, G. Panter, T. Hutchinson, and A. Goksoyr (2006), “Development and validation of a direct homologous quantitative sandwich ELISA for fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin.
c.
Ankley (2006), “Evaluation of a commercial kit for measuring vitellogenin in the fathead minnow (Pimephales promelas)”, Ecotoxicology and Environmental Safety 64, pp. 101-105.
Man ska försöka erhålla minst ett preparat som inte innehåller några veck och inte har några instängda luftbubblor.
Holbech, H., Petersen, G. I., Norman, A., Örn, S, Norrgren, L., and Bjerregaard, P (2001b), “Suitability of zebrafish as test organism for detection of endocrine disrupting chemicals.
d.
Comparison of vitellogenin in plasma and whole body homogenate from zebrafish (Danio rerio) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)”, Nordic Council of Ministers, TemaNord 2001:597, pp. 48-51.
Ett objektglas sänks ner under det bästa preparatet, som lyfts upp ur vattnet med hjälp av objektglaset.
Porcher, and A. Goksoyr (2004), “Development of quantitative vitellogenin-ELISAs for fish test species used in endocrine disruptor screening”, Analytical and Bioanalytical Chemistry 378, pp. 621-633.
Denna process kallas för ’montering’ av preparatet på objektglaset.
Orn, S., S. Yamani, and L. Norrgren (2006), “Comparison of vitellogenin induction, sex ratio, and gonad morphology between zebrafish and Japanese medaka after exposure to 17 alpha-ethinylestradiol and 17 beta-trenbolone”, Archives of Environmental Contamination and Toxicology 51, pp. 237-243.
e.
Scholz, S. and N. Kluver (2009), “Effects of Endocrine Disrupters on Sexual, Gonadal Development in Fish, Sexual Development 3”, pp. 136-151.
Tre preparat bereds för en uppsättning fiskar.
Fenske, M., G. Maack, C. Schafers, and H. Segner (2005), “An environmentally relevant concentration of estrogen induces arrest of male gonad development in zebrafish, Danio rerio”, Environmental Toxicology and Chemistry 24, pp. 1088-1098.
Det andra och tredje preparatet tas efter intervaller på 50 mikrometer efter det första preparatet.
Flick (2007), “Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, pp. 8897-8901.
Med en objektglasmärkpenna antecknas numret på blocket från vilket objektglaset framställdes.
Tyler (2006), “Development of chronic tests for endocrine active chemicals — Part 1.
Objektglaset placeras i en färgningsställning.
Petersen, P. Jackson, K. Hylland, L. Norrgren, and P. Bjerregaard (2006), “Detection of endocrine disrupters: Evaluation of a Fish Sexual Development Test (FSDT)”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 144, pp. 57-66.
Blocket avlägsnas från chucken och placeras med framsidan nedåt för lagring.
Andersen, L., K. Kinnberg, H. Holbech, B. Korsgaard, and P. Bjerregaard (2004), “Evaluation of a 40 day assay for testing endocrine disrupters: Effects of an anti-estrogen and an aromatase inhibitor on sex ratio and vitellogenin concentrations in juvenile zebrafish (Danio rerio)”, Fish Physiology and Biochemistry 30, pp. 257-266.
Färgning, täckning av preparaten med täckglas, märkning av objektglasen
Morthorst, J.E., H. Holbech, and P. Bjerregaard (2010), “Trenbolone causes irreversible masculinization of zebrafish at environmentally relevant concentrations”, Aquatic Toxicology 98, pp. 336-343.
Färga preparaten för histopatologisk undersökning
Metcalf (2003), “Effects of the antiandrogens, vinclozolin and cyproterone acetate on gonadal development in the Japanese medaka (Oryzias latipes)”, Aquatic Toxicology 63, pp. 391-403.
Permanent försegla de monterade och färgade vävnaderna.