natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Intraperitoneal injection is generally not recommended since it is not a typical relevant route of human exposure, and should only be used with specific justification (e.g. some positive control substances, for investigative purposes, or for some drugs that are administered by the intraperitoneal route).
Procentandelen DNA i kometsvans hos de parallella negativa kontrolldjuren bör hålla sig inom laboratoriets på förhand fastställda bakgrundsintervall för varje enskild vävnad och provtagningstid för arten (se punkt 16).
The volume should not exceed 1 ml/100 g body weight, except in the case of aqueous solutions where 2 ml/100g body weight may be used.
I avsaknad av historiska eller publicerade kontrolldata som visar att inga skadliga eller gentoxiska effekter induceras av den valda vehikeln, antalet administreringar eller administreringsvägar, bör preliminära undersökningar göras innan den fullständiga undersökningen genomförs, i syfte att fastställa att vehikelkontrollen är godtagbar.
The use of volumes greater than this (if permitted by animal welfare legislation) should be justified.
Djurens antal och kön
Wherever possible different dose levels should be achieved by adjusting the concentration of the dosing formulation to ensure a constant volume in relation to body weight at all dose levels.
Det finns få data om hondjur som möjliggör en jämförelse mellan könen i samband med kometmetoden.
Sampling Time
Dock är andra gentoxiska responser in vivo vanligen liknande mellan han- och hondjur, och därför kan de flesta undersökningar utföras på båda könen.
The sampling time is a critical variable because it is determined by the period needed for the test chemicals to reach maximum concentration in the target tissue and for DNA strand breaks to be induced but before those breaks are removed, repaired or lead to cell death.
Om det finns data som visar på relevanta skillnader mellan hanar och honor (t.ex. skillnader i systemisk toxicitet, metabolism, biotillgänglighet osv., inklusive ett preliminärt test) bör båda könen användas.
The persistence of some of the lesions that lead to the DNA strand breaks detected by the comet assay may be very short, at least for some chemicals tested in vitro (52) (53).
I detta fall kan det vara lämpligt att göra en undersökning av båda könen, t.ex. som en del av en upprepad dostoxicitetsundersökning.
Accordingly, if such transient DNA lesions are suspected, measures should be taken to mitigate their loss by ensuring that tissues are sampled sufficiently early, possibly earlier than the default times given below.
Målet bör vara minst fem analyserbara djur av ett kön, eller av varje kön om båda könen används, per grupp (färre i den parallella positiva kontrollgruppen, se punkt 29).
The optimum sampling time(s) may be chemical- or route-specific resulting in, for example, rapid tissue exposure with intravenous administration or inhalation exposure.
Som en vägledning för ett vanligt krav på maximalt antal djur skulle det krävas 25–35 djur för en undersökning som utförs enligt de parametrar som fastställs i punkt 33, med tre dosgrupper och parallella negativa och positiva kontrollgrupper (fem djur av ett kön i varje grupp)
Accordingly, where available, sampling times should be determined from kinetic data (e.g. the time (Tmax) at which the peak plasma or tissue concentration (Cmax) is achieved, or at the steady state for multiple administrations).
BEHANDLINGSSCHEMA
In the absence of kinetic data a suitable compromise for the measurement of genotoxicity is to sample at 2-6 h after the last treatment for two or more treatments, or at both 2-6 and 16-26 h after a single administration, although care should be taken to necropsy all animals at the same time after the last (or only) dose.
Djuren bör ges dagliga behandlingar under två eller flera dagar (dvs. två eller flera behandlingar i intervall på cirka 24 timmar) och proverna bör samlas in varannan till var sjätte timme (eller vid Tmax) efter den sista behandlingen (12).
Information on the appearance of toxic effects in target organs (if available) may also be used to select appropriate sampling times.
Prover från förlängda doseringssystem (t.ex.
General clinical observations related to the health of the animals should be made and recorded at least once a day preferably at the same time(s) each day and considering the peak period of anticipated effects after dosing (54).
28 dagars daglig dosering) är godtagbara.
At least twice daily, all animals should be observed for morbidity and mortality.
Det har visats att kometmetoden och mikrokärntest av erytrocyter kan kombineras med framgång (10) (19).
Animals exhibiting non-lethal indicators of excessive toxicity should be euthanized prior to completion of the test period, and are generally not used for comet analysis.
Användning av andra behandlings- och provtagningsscheman bör motiveras (se tillägg 3).
Tissue Collection
En enda behandling med flera provtagningstillfällen kan tillämpas, men det bör noteras att fler djur kommer att krävas för undersökningar med en enda administrering eftersom provtagningstillfällena är fler.
Since it is possible to study induction of DNA strand breaks (comets) in virtually any tissue, the rationale for selection of tissue(s) to be collected should be clearly defined and based upon the reason for conducting the study together with any existing ADME, genotoxicity, carcinogenicity or other toxicity data for the test chemicals under investigation.
I vissa fall kan detta dock vara att föredra, t.ex. när testkemikalien inducerar överdriven toxicitet efter upprepade administreringar.
Important factors for consideration should include the route of administration (based on likely human exposure route(s)), the predicted tissue distribution and absorption, the role of metabolism and the possible mechanism of action of the test chemicals.
Hur testet än genomförs är det godtagbart så länge testkemikalien ger ett positivt svar, eller för en negativ undersökning, så länge direkta eller indirekta bevis till stöd för exponering eller toxicitet för målvävnaderna har visats eller om gränsdosen uppnås (se punkt 36).
The liver has been the tissue most frequently studied and for which there are the most data.
Testkemikalier kan även administreras i form av en delad dos, dvs. två behandlingar under en och samma dag med högst två till tre timmars intervall, för att på så sätt underlätta administrering av stora volymer med material.
Therefore, in the absence of any background information, and if no specific tissues of interest are identified, sampling the liver would be justified as this is a primary site of xenobiotic metabolism and is often highly exposed to both parent substance(s) and metabolite(s).
Under dessa omständigheter bör provtagningstillfällena schemaläggas baserat på tidpunkten för den sista doseringen (se punkt 40).
In some cases, examination of a site of direct contact (for example, for orally-administered chemicals the glandular stomach or duodenum/jejunum, or for inhaled chemicals the lungs) may be most relevant.
Dosnivåer
Additional or alternative tissues should be selected based on the specific reasons for the test is being conducted but it may be useful to examine multiple tissues in the same animals providing the laboratory has demonstrated proficiency with those tissues and competency in handling multiple tissues at the same time.
För båda akuta och subakuta versioner av kometmetoden bör man, förutom högsta tolererbara dos (MTD, högsta möjliga dos, maximal exponering eller gränsdos) välja en sjunkande sekvens med minst två lämpligt skilda dosnivåer (företrädesvis separerade med mindre än √10) för varje provtagningstidpunkt för att visa dosrelaterade responser.
Preparation of specimens
Dessa dosnivåer bör helst även täcka ett intervall från maximal toxicitet till svag eller ingen toxicitet.
For the processes described in the following paragraphs (44-49) it is important that all solutions or stable suspensions should be used within their expiration date, or should be freshly prepared if needed.
När så är möjligt bör olika dosnivåer uppnås genom en justering av koncentrationen av doseringsberedningen för att säkerställa en konstant volym i förhållande till kroppsvikt vid alla dosnivåer.
Also in the following paragraphs, the times taken to (i) remove each tissue after necropsy, (ii) process each tissue into cell/nuclei suspensions, and (iii) process the suspension and prepare the slides are all considered critical variables (see Definitions, Appendix 1), and acceptable lengths of time for each of these steps should have been determined during establishment of the method and demonstration of proficiency.
Provtagningstid
Animals will be euthanised, consistent with effective animal welfare legislation and 3Rs principles, at the appropriate time(s) after the last treatment with a test chemical.
Provtagningstiden är en kritisk variabel eftersom den avgörs av den period som behövs för att testkemikalierna ska nå högsta koncentration i målvävnaden och inducera brott på DNA-strängar, men innan dessa brott avlägsnas, repareras eller leder till celldöd.
Selected tissue(s) is removed, dissected, and a portion is collected for the comet assay, whilst at the same time a section from the same part of the tissue should be cut and placed in formaldehyde solution or appropriate fixative for possible histopathology analysis (see paragraph 55) according to standard methods (12).
Vissa av de skador som leder till brott på DNA-strängen och som detekteras med kometmetoden kan vara mycket kortvariga, åtminstone för vissa kemikalier testade in vitro (52) (53).
The tissue for the comet assay is placed into mincing buffer, rinsed sufficiently with cold mincing buffer to remove residual blood, and stored in ice-cold mincing buffer until processed.
De optimala provtagningstidpunkterna kan vara specifika för kemikalien eller administreringsvägen, t.ex. vid snabb vävnadsexponering med intravenös administrering eller exponering via inandning.
In situ perfusion may also be performed, e.g. for liver, kidney.
Allmänna kliniska observationer av djurens hälsa bör göras och registreras minst en gång per dag, helst vid samma tidpunkt med hänsyn till maximalt förväntade effekter efter doseringen (54).
Many published methods exist for cell/nuclei isolation.
Minst två gånger dagligen bör djuren observeras beträffande morbiditet och mortalitet.
These include mincing of tissues such as liver and kidney, scraping mucosal surfaces in the case of the gastro-intestinal tract, homogenization and enzymic digestion.
För undersökningar med längre varaktighet bör djuren vägas minst en gång i veckan och när testperioden avslutas.
The JaCVAM validation trial only studied isolated cells, and therefore in terms of establishing the method and being able to refer to the JaCVAM trial data for demonstration of proficiency, isolated cells are preferred.
Foderkonsumtionen bör mätas varje gång fodret ändras och minst en gång i veckan.
However, it has been shown that there was no essential difference in the assay result whether isolated cells or nuclei were used (8).
Djur som uppvisar icke-dödliga indikatorer på överdriven toxicitet bör avlivas innan testperioden avslutas och används vanligen inte för komet-analysen.
Also different methods to isolate cells/nuclei (e.g. homogenizing, mincing, enzymic digestion and mesh filtration) gave comparable results (55).
Vävnadsinsamling
Consequently, either isolated cells or isolated nuclei can be used.
Eftersom det är möjligt att undersöka induktion av brott på DNA-strängar (kometer) i praktiskt taget alla vävnader bör valet av de vävnader som ska samlas in tydligt motiveras och grundas på syftet med undersökningen samt eventuell befintlig ADME, gentoxicitet, cancerogenitet eller andra toxicitetsdata för de undersökta testkemikalierna.
A laboratory should thoroughly evaluate and validate tissue-specific methods of single cell/nuclei isolation.
Viktiga faktorer för övervägande bör omfatta administreringsväg (baserat på sannolika mänskliga exponeringsvägar), förutsagd vävnadsdistribution och absorption, metabolismens funktion och möjlig verkningsmekanism för testkemikalierna.
As discussed in paragraph 40, the persistence of some of the lesions that lead to the DNA strand breaks detected by the comet assay may be very short (52) (53).
Levern är den vävnad som har undersökts oftast och som det finns mest data för.
Therefore, whatever method is used to prepare the single cell/nuclei suspensions, it is important that tissues are processed as soon as possible after the animals have been euthanised and placed in conditions that reduce the removal of lesions (e.g. by maintaining the tissue at low temperature).
I avsaknad av bakgrundsinformation och om inga specifika vävnader av intresse identifieras är provtagning av levern motiverat eftersom levern är det primära organet för xenobiotisk metabolism och ofta exponeras starkt både för huvudämnen och metaboliter.
The cell suspensions should be kept ice-cold until ready for use, so that minimal inter-sample variation and appropriate positive and negative control responses can be demonstrated.
I vissa fall kan granskning av en direkt kontaktpunkt (t.ex. den glandulära magsäcken eller tolvfingertarmen/tomtarmen för oralt administrerade kemikalier eller lungorna för kemikalier som inandas) vara mest relevant.
PREPARATION OF SLIDES
Kompletterande eller alternativa vävnader bör väljas baserat på de särskilda syftena med testet men kan även vara användbara för att undersöka flera vävnader hos samma djur, under förutsättning att laboratoriet har visat att det är kvalificerat för sådana vävnader och för att hantera flera vävnader samtidigt.
Slide preparation should be done as soon as possible (ideally within one hour) after single cell/nuclei preparation, but the temperature and time between animal death and slide preparation should be tightly controlled and validated under the laboratory's conditions.
Beredning av prover
The volume of the cell suspension added to low melting point agarose (usually 0,5-1,0 %) to make the slides should not reduce the percentage of low melting point agarose to less than 0,45 %.
För de processer som beskrivs i följande punkter (44–49) är det viktigt att alla lösningar eller stabila suspensioner används före sista förbrukningsdatum eller att nya lösningar bereds vid behov.
The optimum cell density will be determined by the image analysis system used for scoring comets.
I de följande punkterna anses även tidsåtgången för att i) avlägsna varje vävnad efter obduktion, ii) behandla varje vävnad i cell-/kärnsuspensioner, och iii) behandla suspensionen och bereda analysplattformarna vara kritiska variabler (se definitioner, tillägg 1).
Lysis
Godtagbar tidsåtgång för varje steg bör fastställas när metoden etableras och laboratoriet visar att det är kvalificerat för testet.
Lysis conditions are also a critical variable and may interfere with the strand breaks resulting from specific types of DNA modifications (certain DNA alkylations and base adducts).
Djuren avlivas enligt gällande djurskyddslagstiftning och 3R-principerna vid lämpliga tidpunkter efter den sista behandlingen med testkemikalien.
It is therefore recommended that the lysis conditions be kept as constant as possible for all slides within an experiment.
De utvalda vävnaderna avlägsnas och dissekeras och en del samlas in för undersökning med kometmetoden.
Once prepared, the slides should be immersed in chilled lysing solution for at least one hour (or overnight) at around 2-8 °C under subdued lighting conditions e.g. yellow light (or light proof) that avoid exposure to white light that may contain UV components.
En del av samma vävnad bör samtidigt skäras ut och placeras i formaldehydlösning eller lämpligt fixativ för en eventuell histopatologisk analys (se punkt 55) enligt standardmetoderna (12).
After this incubation period, the slides should be rinsed to remove residual detergent and salts prior to the alkali unwinding step.
Den vävnad som ska undersökas med kometmetoden placeras i en buffert för finfördelning, sköljs ordentligt med kall buffert för att avlägsna restblod och lagras i iskall buffert fram till behandlingen.
This can be done using purified water, neutralization buffer or phosphate buffer.
Perfusion in situ kan också utföras, t.ex. för lever och njure.
Electrophoresis buffer can also be used.
I JaCVAM-valideringsförsöket undersöktes endast isolerade celler.
This would maintain the alkaline conditions in the electrophoresis chamber.
Därför är isolerade celler att föredra när metoden etableras så att laboratoriet kan hänvisa till JaCVAM-testdata för att visa att det är kvalificerat.
Unwinding and electrophoresis
Man har dock visat att inga större skillnader uppstod i försöksresultatet beroende på om man använde isolerade celler eller kärnor (8).
Slides should be randomly placed onto the platform of a submarine-type electrophoresis unit containing sufficient electrophoresis solution such that the surfaces of the slides are completely covered (the depth of covering should also be consistent from run to run).
Andra metoder för att isolera celler/kärnor (t.ex. homogenisering, finfördelning, enzymatisk nedbrytning och nätfiltrering) gav jämförbara resultat (55).
In another type of comet assay electrophoresis units i.e. with active cooling, circulation and high capacity power supply a higher solution covering will result in higher electric current while the voltage is kept constant.
Följaktligen kan antingen isolerade celler eller isolerade kärnor användas.
A balanced design should be used to place slides in the electrophoresis tank to mitigate the effects of any trends or edge effect within the tank and to minimize batch-to-batch variability, i.e., in each electrophoresis run, there should be the same number of slides from each animal in the study and samples from the different dosage groups, negative and positive controls, should be included.
Laboratoriet bör noggrant utvärdera och validera vävnadsspecifika metoder för isolering av enstaka celler/kärnor.
The slides should be left for at least 20 minutes for the DNA to unwind, and then subjected to electrophoresis under controlled conditions that will maximize the sensitivity and dynamic range of the assay (i.e. lead to acceptable levels of % tail DNA for negative and positive controls that maximize sensitivity).
Såsom diskuteras i punkt 40 kan vissa av de skador som leder till brott på DNA-strängen som detekteras med kometmetoden kan vara mycket kortvariga (52) (53).
The level of DNA migration is linearly associated with the duration of electrophoresis, and also with the potential (V/cm).
Vilken metod som än används för att bereda suspensionerna med enstaka celler/kärnor är det därför viktigt att vävnaderna behandlas så snart som möjligt efter avlivningen av djuren och att de förvaras under förhållanden som minskar avlägsnandet av skador (t.ex. genom förvaring i låg temperatur).
Based on the JaCVAM trial this could be 0,7 V/cm for at least 20 minutes.
Cellsuspensionerna bör hållas iskalla tills de är färdiga för användning, så att laboratoriet kan visa minimal variation mellan proverna och lämpliga positiva och negativa kontrollresponser.
The duration of electrophoresis is considered a critical variable and the electrophoresis time should be set to optimize the dynamic range.
BEREDNING AV ANALYSPLATTFORMAR
Longer electrophoresis times (e.g. 30 or 40 minutes to maximize sensitivity) usually lead to stronger positive responses with known mutagens.
Analysplattformarna bör beredas så snart som möjligt (helst inom en timme) efter beredningen av cellerna/kärnorna.
However longer electrophoresis times may also lead to excessive migration in control samples.
Temperaturen och tidsintervallet mellan avlivning och beredningen av analysplattformar bör noggrant kontrolleras och valideras enligt laboratoriets betingelser.
In each experiment the voltage should be kept constant, and the variability in the other parameters should be within a narrow and specified range, for example in the JaCVAM trial 0,7 V/cm delivered a starting current of 300 mA.
Den volym cellsuspension som tillsätts till agaros vid låg smältpunkt (vanligen 0,5–1,0 %) för att bereda analysplattformarna bör inte minska procentandelen av agaros med låg smältpunkt till mindre än 0,45 %.
The depth of buffer should be adjusted to achieve the required conditions and maintained throughout the experiment.
Optimal celltäthet fastställs med det bildanalyssystem som används för att registrera kometerna.
The current at the start and end of the electrophoresis period should be recorded.
Lysering
The optimum conditions should therefore be determined during the initial demonstration of proficiency in the laboratory concerned with each tissue studied.
Lyseringsbetingelserna är också en kritisk variabel.
The temperature of the electrophoresis solution through unwinding and electrophoresis should be maintained at a low temperature, usually 2-10 °C (10).
Den kan störa brott på strängar som är resultatet av specifika typer av DNA-modifieringar (vissa DNA-alkyleringar och DNA-addukter).
The temperature of the electrophoresis solution at the start of unwinding, the start of electrophoresis, and the end of electrophoresis should be recorded.
Lyseringsbetingelserna bör därför hållas så konstanta som möjligt för alla analysplattformar i försöket.
After completion of electrophoresis, the slides should be immersed/rinsed in the neutralization buffer for at least 5 minutes.
När analysplattformarna har beretts sänks de ned i kyld lyseringslösning i minst en timme (eller över natten) vid cirka 2–8 °C under dämpade ljusförhållanden, t.ex. gult ljus (eller ljusbeständighet), för att undvika exponering för vitt ljus som kan innehålla UV-komponenter.
Gels can be stained and scored “fresh” (e.g. within 1-2 days) or can be dehydrated for later scoring (e.g. within 1-2 weeks after staining) (56).
Efter denna inkubationsperiod sköljs analysplattformarna för att avlägsna rester av rengöringsmedel och salter före det alkaliska upplösningssteget.
However, the conditions should be validated during the demonstration of proficiency and historical data should be obtained and retained separately for each of these conditions.
Detta kan göras med renat vatten, neutraliseringsbuffert eller fosfatbuffer.
In case of the latter, slides should be dehydrated by immersion into absolute ethanol for at least 5 minutes, allowed to air dry, and then stored, either at room temperature or in a container in a refrigerator until scored.
Elektroforesbuffert kan också användas.
Methods of Measurement
På så sätt upprätthålls de alkaliska förhållandena i elektroforeskammaren.
Comets should be scored quantitatively using an automated or semi-automated image-analysis system.
Upplösning och elektrofores
The slides will be stained with an appropriate fluorescent stain e.g. SYBR Gold, Green I, propidium iodide or ethidium bromide and measured at a suitable magnification (e.g. 200x) on a microscope equipped with epi-fluorescence and appropriate detectors or a digital (e.g. CCD) camera.
Analysplattformarna placeras slumpmässigt på plattformen på en elektroforesenhet av undervattenstyp som innehåller tillräckligt med elektroforeslösning så att analysplattformarnas ytor täcks fullständigt (täckdjupet bör också vara konsekvent mellan körningarna).
Cells may be classified into three categories as described in the atlas of comet images (57), namely scorable, non-scorable and “hedgehog” (see paragraph 56 for further discussion).
I andra typer av elektroforesenheter för kometmetoden, dvs, med aktiv kylning, cirkulation och strömförsörjning av hög kapacitet kommer en högre lösningsmedelstäckning att leda till högre ström samtidigt som spänningen hålls konstant.
Only scorable cells (clearly defined head and tail with no interference with neighbouring cells) should be scored for % tail DNA to avoid artefacts.
En balanserad utformning bör användas för placeringen av analysplattformarna i elektroforestanken för att begränsa effekterna av eventuella trender eller en kanteffekt inom tanken och minimera skillnaderna mellan satserna, dvs. i varje elektroforeskörning.