natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Plasma is collected in the test tubes and stored at – 20 °C until analysed for VTG or other proteins of interest.
Rören förvaras vid – 80 °C fram till användningen.
Procedure 3B:
VITELLOGENINBERIKNINGSPROVER OCH REFERENSSTANDARD FÖR TESTER MELLAN LABORATORIER
Zebrafish, Blood Collection by Cardiac Puncture
Varje dag som VTG-tester utförs ska ett berikningsprov analyseras som beretts med en referensstandard för tester mellan laboratorier.
To avoid coagulation of blood and degradation of protein the samples are collected within Phosphate-buffered saline (PBS) buffer containing heparin (1000 units/ml) and the protease inhibitor aprotinin (2 TIU/ml).
VTG som används för beredning av referensstandarden för tester mellan laboratorier ska komma från en annan sats än den som används för att bereda kalibreringsstandarderna för det test som utförs.
As ingredients for the buffer, heparin, ammonium-salt and lyophilised aprotinin are recommended.
Ett berikningsprov bereds genom att man tillsätter en känd mängd av referensstandarden för tester mellan laboratorier till ett prov med plasma från kontrollhanar.
For blood sampling, a syringe (1ml) with a fixed thin needle (e.g. Braun Omnikan-F) is recommended.
Provet berikas tills en VTG-koncentration på mellan 10 och 100 gånger den förväntade vitellogeninkoncentrationen i hanliga kontrollfiskar uppnås.
The syringe should be prefilled with buffer (approximately 100 microliter) to completely elute the small blood volumes from each fish.
Det berikade provet med hanlig kontrollplasma kan komma från en enda fisk eller vara en blandning av flera olika fiskar.
The blood samples are taken by cardiac puncture.
Ett delprov av den oberikade hanliga kontrollplasman analyseras i minst två duplikatbrunnar.
At first the fish should be anesthetized with MS-222 (100 mg/l).
Det berikade provet analyseras också i minst två duplikatbrunnar.
The proper plane of anaesthesia allows the user to distinguish the heartbeat of the zebrafish.
Den genomsnittliga mängden vitellogenin i de två icke-berikade hanliga kontrollproven läggs till den beräknade mängden VTG som lagts till berikningsproverna i syfte att fastställa en förväntad koncentration.
While puncturing the heart, keep the syringe piston under weak tension.
Förhållandet mellan denna förväntade koncentration och den uppmätta koncentrationen rapporteras tillsammans med resultaten från varje försöksomgång som utförs på samma dag.
Collectable blood volumes range between 20 - 40 microliters.
FLÖDESSCHEMA ÖVER BESLUTSGÅNGEN FÖR DEN STATISTISKA ANALYSEN Variansstabiliserande
After cardiac puncture, the blood/buffer-mixture should be filled into the test tube.
omvandling?
Plasma is separated from the blood via centrifugation (20 min; 5000 g) and should be stored at – 80°C until required for analysis.
Replikatmedelvärden normalfördelade
Procedure 3C:
Dunns test på replikatmedel-värden Dunnetts test på hierarkisk
SOP: Zebrafish, homogenisation of head & tail
Normaliserings-omvandling?
The fish are anaesthetised and euthanised in accordance with the test description.
Whitneys test på replikatmedelvärden
The head and tail are cut of the fish in accordance with Figure 1.
Replikatmedelvärden normala och homogena
Important: All dissection instruments, and the cutting board should be rinsed and cleaned properly (e.g. with 96 % ethanol) between handling of each single fish to prevent “vitellogenin pollution” from females or induced males to uninduced males.
< = 3 repl. per konc.
For gonad histology
> = 4 repl. per konc.
Cut behind
Hierarkisk ANOVA normal
Cut behind dorsal fin
Hierarkisk ANOVA ej normal
For Vtg analysis
Variansstabiliserande omvandling?
The weight of the pooled head and tail from each fish is measured to the nearest mg.
Varianserna
After being weighed, the parts are placed in appropriate tubes (e.g. 1,5 ml eppendorf) and frozen at – 80 °C until homogenisation or directly homogenised on ice with two plastic pistils.
lika
(Other methods can be used if they are performed on ice and the result is a homogenous mass).
Step-downgrundat Jonckheeres test
Important: The tubes should be numbered properly so that the head and tail from the fish can be related to their respective body-section used for gonad histology.
Step-downtrendtest på replikatmedelvärden
When a homogenous mass is achieved, 4 x the tissue weight of ice-cold homogenisation buffer [1] is added.
Ej monoton
Keep working with the pistils until the mixture is homogeneous.
Monoton
Important note: New pistils are used for each fish.
Avgör om dos-responsen är monoton
The samples are placed on ice until centrifugation at 4 °C at 50000 g for 30 min.
C.49 Akut toxicitetstest på fiskembryo (FET)
Use a pipette to dispense portions of 20 μl supernatant into at least two tubes by dipping the tip of the pipette below the fat layer on the surface and carefully sucking up the supernatant without fat- or pellet fractions.
Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 236 (2013).
The tubes are stored at – 80 °C until use.
Här beskrivs ett FET-test med sebrafisk (Danio rerio).
Homogenisation buffer:(50 mM Tris-HCl pH 7,4; 1 % Protease inhibitor cocktail (Sigma)): 12 ml Tris-HCl pH 7,4 + 120 μl Protease inhibitor cocktail.TRIS: TRIS-ULTRA PURE (ICN) e.g. from Bie & Berntsen, Denmark.Protease inhibitor cocktail: From Sigma (for mammalian tissue) Product number P 8340.NOTE: The homogenisation buffer should be used the same day as manufactured.
Detta test är utformat för att bestämma kemikaliers akuta toxicitet under fiskars embryonala utveckling.
Place on ice during use.
FET-testet är baserat på studier och valideringar av sebrafisk (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14).
VITELLOGENIN FORTIFICATION SAMPLES AND INTER-ASSAY REFERENCE STANDARD
FET-testet har framgångsrikt tillämpats på ett brett spektrum kemikalier med olika verkningssätt, löslighet, volatilitet och hydrofobicitet (översikt ges i 15 och 16).
On each day that VTG assays are performed, a fortification sample made using an inter-assay reference standard will be analysed.
Nyligen befruktade sebrafiskägg exponeras för testkemikalien under en 96-timmarsperiod.
The VTG used to make the inter-assay reference standard will be from a batch different from the one used to prepare calibration standards for the assay being performed.
Var 24:e timme registreras upp till fyra apikala observationer som indikatorer för dödlighet (6): i) koagulering av befruktade ägg, ii) avsaknad av somitbildning, iii) svansknoppen avlossas inte från gulesäcken och (iv) avsaknad av hjärtslag.
The fortification sample will be made by adding a known quantity of the inter-assay standard to a sample of control male plasma.
I slutet av exponeringstiden bestäms akut toxicitet baserat på ett positivt resultat i någon av de fyra apikala observationerna och LC50 beräknas.
The sample will be fortified to achieve a VTG concentration between 10 and 100 times the expected vitellogenin concentration of control male fish.
Användbar information om ämnesspecifika egenskaper innefattar strukturformel, molekylvikt, renhet, stabilitet i vatten och ljus, pKa och Kow, vattenlöslighet och ångtryck samt resultat av ett test avseende biologisk lättnedbrytbarhet (TM C.4 (17) eller TM C.29 (18)).
The sample of control male plasma that is fortified may be from an individual fish or may be a composite from several fish.
Löslighet och ångtryck kan användas för att beräkna Henrys konstant, som anger eventuell förlust på grund av avdunstning av testkemikalien.
A subsample of the unfortified control male plasma will be analysed in at least two duplicate wells.
Man bör ha tillgång till en tillförlitlig analysmetod för kvantifiering av ämnet i testlösningen.
The fortified sample also will be analysed in at least two duplicate wells.
Metoden bör ha känd och rapporterad noggrannhet och detektionsgräns.
The mean quantity of vitellogenin in the two unfortified control male plasma samples will be added to the calculated quantity of VTG added to fortification the samples to determine an expected concentration.
Om testmetoden används för att testa en blandning ska dess sammansättning karakteriseras så långt detta är möjligt, t.ex. beståndsdelarnas kemiska identitet, deras kvantitativa förekomster och deras ämnesspecifika egenskaper (se punkt 4).
The ratio of this expected concentration to the measured concentration will be reported along with the results from each set of assays performed on that day.
När det gäller ämnen som kan aktiveras via metabolism, finns det bevis för att sebrafiskembryon har biotransformationskapacitet (19) (20) (21) (22).
DECISION FLOWCHART FOR THE STATISTICAL ANALYSIS
Fiskembryons ämnesomsättning liknar dock inte alltid unga eller vuxna fiskars ämnesomsättning.
Rep means normally distributed
Det protoxiska ämnet allylalkohol (9) har t.ex. utelämnats i FET-testet.
Stept-down Jonckheere or Williams' test
Om det finns indikationer på att metaboliter eller andra omvandlingsprodukter av betydelse kan vara giftigare än huvudföreningen bör testet även utföras med dessa metaboliter/omvandlingsprodukter och dessa resultat bör även beaktas i slutsatserna om testkemikaliens toxicitet.
Normalising transform?
Alternativt kan ett annat test utföras där ämnesomsättningen beaktas ytterligare.
variance stabilising transform?
Embryon förväntas inte vara känsliga för ämnen med en molekylvikt på ≥ 3 kDa, en mycket komplex och voluminös molekylstruktur, och ämnen som orsakar fördröjd kläckning och kan hindra eller minska exponeringen efter kläckning.
Tamhane-Dunnett test on nested ANOVA
Detta beror på ämnets begränsade biotillgänglighet och därför kan andra toxicitetstester vara lämpligare.
Dunnett test on nested ANOVA No
För att testresultaten ska vara giltiga måste följande kriterier vara uppfyllda:
Yes Yes
Den totala befruktningsgraden för alla ägg som samlats in bör vara ≥ 70 % i det testade partiet.
No >=4 reps per conc
Vattentemperaturen bör hållas vid 26 ± 1 °C i testkärlen under testet.
<=3 reps per conc
Det totala antalet överlevande embryon i den negativa kontrollen (utspädningsvatten) och, i förekommande fall, i lösningsmedelskontrollen bör vara ≥ 90 % fram till slutet av 96-timmarsexponeringen.
Dunn or Mann-Whitney test on rep means
Exponering för den positiva kontrollen (t.ex.
Dunn test on rep means Dunn or Mann-Whitney test
4,0 mg/l 3,4-dikloranilin för sebrafisk) bör leda till en minimal dödlighet på 30 % i slutet av 96-timmarsexponeringen.
Dunn test <=3 reps per conc
Kläckningsgraden i den negativa kontrollen (i förekommande fall även i lösningsmedelskontrollen) bör vara ≥ 80 % i slutet av 96-timmarsexponeringen.
>=4 reps per conc Tamhane-Dunnett test
I slutet av 96-timmarsexponeringen bör koncentrationen av upplöst syre i den negativa kontrollen och den högsta testkoncentrationen vara ≥ 80 % av luftmättnadsvärdet.
Nested ANOVA normal
En översikt över rekommenderade underhålls- och testförhållanden ges i tillägg 2.
Nested ANOVA not normal
Följande utrustning behövs:
variance stabilising transformation
Fisktankar tillverkade av kemiskt inert material (t.ex. glas) och tillräckligt stora för den rekommenderade fisktätheten (se ”Hållande av avelsfisk”, punkt 14).
Variances unequal Dunnett test
Inverterat mikroskop och/eller stereolupp med en kapacitet på minst 80 gångers förstoring.
Variances equal
Om det rum som används för att registrera observationer inte kan justeras till 26 ± 1 °C krävs en temperaturkontrollerad ”Cross Movement Stage” eller andra metoder för att upprätthålla temperaturen.
Step-down Jonckheere test
Testkärl, t.ex. standard 24-hålsplattor med ett djup på cirka 20 mm.
Rep means normal or not homogenous
(Se ”Testkärl”, punkt 11),
Rep means normal & homogenous
Exempelvis självhäftande folie för att täcka 24-hålsplattorna.
Step-down trendtest on replicate means
Inkubator eller luftkonditionerat rum med kontrollerad temperatur, som gör det möjligt att hålla 26 ±1 °C i hålen (eller testkärlen).
Not monotone
Syremätare.
Monotone
Utrustning för bestämning av vattnets hårdhetsgrad och ledningsförmåga.
Determine whether Dose-Response is monotone
Lekfälla: instrumentbrickor av glas, rostfritt stål eller andra inerta material, trådnät (nätstorlek 2 ± 0,5 mm) av rostfritt stål eller annat inert material för att skydda äggen när de väl lagts, leksubstrat (t.ex. konstgjorda växter av inert material) (TM C.48 tillägg 4a (23)).
C.49 Fish Embryo Acute Toxicity (FET) Test
Pipetter med vidgade öppningar för att samla in äggen.
This test method (TM) is equivalent to OECD test guideline (TG) 236 (2013).
Glaskärl för beredning av olika testkoncentrationer och utspädningsvatten (bägare, mätkolvar, mätglas och graderade pipetter) eller för att samla in sebrafiskägg (t.ex. bägare, kristalliseringsfat).
It describes a Fish Embryo Acute Toxicity (FET) test with the zebrafish (Danio rerio).
Om alternativa exponeringssystem, t.ex. genomflöde (24) eller passiv dosering (25), används för utförandet av testet behövs lämplig lokal och utrustning.
This test is designed to determine acute toxicity of chemicals on embryonic stages of fish.
Testbehållare av glas eller polystyren bör användas (t.ex.
The FET-test is based on studies and validation activities performed on zebrafish (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14).
24-hålsplattor med en fyllningskapacitet på 2,5–5 ml per hål).
The FET-test has been successfully applied to a wide range of chemicals exhibiting diverse modes of action, solubilities, volatilities, and hydrophobicities (reviewed in 15 and 16).
Vid misstanke om adsorption till polystyren (t.ex. för opolära plana ämnen med hög Kow) bör inert material (glas) användas för att minska adsorptionsförluster (26).
Newly fertilised zebrafish eggs are exposed to the test chemical for a period of 96 hrs.
Testbehållarna bör placeras slumpvis i inkubatorn.
Every 24 hrs, up to four apical observations are recorded as indicators of lethality (6): (i) coagulation of fertilised eggs, (ii) lack of somite formation, (iii) lack of detachment of the tail-bud from the yolk sac, and (iv) lack of heartbeat.
Vatten och testförhållanden
At the end of the exposure period, acute toxicity is determined based on a positive outcome in any of the four apical observations recorded, and the LC50 is calculated.
Utspädning av underhållsvattnet rekommenderas för att uppnå hårdhetsnivåer som är typiska för många olika ytvatten.
Useful information about substance-specific properties include the structural formula, molecular weight, purity, stability in water and light, pKa and Kow, water solubility and vapour pressure as well as results of a test for ready biodegradability (TM C.4 (17) or TM C.29 (18)).
Utspädningsvattnet bör beredas från rekonstituerat vatten (27).
Solubility and vapour pressure can be used to calculate Henry's law constant, which will indicate whether losses due to evaporation of the test chemical may occur.
Den resulterande hårdhetsgraden bör motsvara 100–300 mg/l CaCO3 för att förhindra överdriven utfällning av kalciumkarbonat.
A reliable analytical method for the quantification of the substance in the test solutions with known and reported accuracy and limit of detection should be available.
Annat välkarakteriserat yt- eller brunnsvatten kan användas.
If the test method is used for the testing of a mixture, its composition should, as far as possible, be characterised, e.g. by the chemical identity of its constituents, their quantitative occurrence and their substance-specific properties (see paragraph 4).
Det rekonstituerade vattnet kan anpassas till underhållsvatten med låg hårdhetsgrad genom utspädning med avjonat vatten upp till ett förhållande på 1:5 till en lägsta hårdhetsgrad på 30–35 mg/l CaCO3.
Concerning substances that may be activated via metabolism, there is evidence that zebrafish embryos do have biotransformation capacities (19)(20)(21)(22).
Vattnet luftas till syremättnad innan testkemikalien tillsätts.
However, the metabolic capacity of embryonic fish is not always similar to that of juvenile or adult fish.
Användning av väteklorid (HCl) och natriumhydroxid (NaOH) för att korrigera pH-värdet i lösningarna med testkemikalien rekommenderas.
For instance, the protoxicant allyl alcohol (9) has been missed in the FET.
Testlösningar av de valda koncentrationerna kan beredas t ex. genom spädning av en stamlösning.
Therefore, if there are any indications that metabolites or other transformation products of relevance may be more toxic than the parent compound, it is also recommended to perform the test with these metabolites/transformation products and to also use these results when concluding on the toxicity of the test chemical, or alternatively perform another test which takes metabolism into further account.
Stamlösningen bör helst beredas genom att man helt enkelt blandar eller skakar testkemikalien i utspädningsvattnet på mekanisk väg (t.ex. omrörning och/eller ultraljud).
For substances with a molecular weight ≥ 3kDa, a very bulky molecular structure, and substances causing delayed hatch which might preclude or reduce the post-hatch exposure, embryos are not expected to be sensitive because of limited bioavailability of the substance, and other toxicity tests might be more appropriate.
Om testkemikalien är svårlöslig i vatten bör man följa de förfaranden som beskrivs i OECD:s vägledningsdokument nr 23 om hantering av svåra ämnen och blandningar (28).
For the test results to be valid, the following criteria apply:
Man bör undvika att använda lösningsmedel, men det kan i vissa fall krävas för att framställa en stamlösning med lämplig koncentration.
The overall fertilisation rate of all eggs collected should be ≥ 70 % in the batch tested.
Om ett lösningsmedel används som hjälpmedel i beredningen av stamlösningen bör dess slutliga koncentration inte överskrida 100 μl/l och vara densamma i alla testkärl.
The water temperature should be maintained at 26 ± 1 °C in test chambers at any time during the test.
När lösningsmedel används krävs en extra lösningsmedelskontroll.
Overall survival of embryos in the negative (dilution-water) control, and, where relevant, in the solvent control should be ≥ 90 % until the end of the 96 hrs exposure.
Hållande av avelsfisk
Exposure to the positive control (e.g. 4,0 mg/l 3,4-dichloroaniline for zebrafish) should result in a minimum mortality of 30 % at the end of the 96 hrs exposure.
Ett avelsbestånd av oexponerad sebrafisk av vildtyp med väldokumenterad fertilitetsgrad används för äggproduktion.
Hatching rate in the negative control (and solvent control if appropriate) should be ≥ 80 % at the end of 96 hrs exposure.
Fisken bör vara fri från makroskopiskt urskiljbara symtom på infektion och sjukdom och bör inte ha genomgått läkemedelsbehandling (akut eller profylaktisk) under två månader innan lek.
At the end of the 96 hrs exposure, the dissolved oxygen concentration in the negative control and highest test concentration should be ≥ 80 % of saturation.
Avelsfisken hålls i akvarier med en rekommenderad fisktäthet på 1 liter vatten per fisk och en fast ljusperiod på 12–16 timmar (29) (30) (31) (32) (33).
An overview of recommended maintenance and test conditions is available in Appendix 2.
Filtreringsgraden bör justeras så att den blir optimal och en överdrivet hög filtreringsgrad som orsakar kraftiga störningar i vattnet bör undvikas.
The following equipment is needed:
Se tillägg 2 för utfodringsförhållanden.
Fish tanks made of chemically inert material (e.g. glass) and of a suitable capacity in relation to the recommended loading (see “Maintenance of brood fish”, paragraph 14);
Överskottsfoder bör undvikas och man bör regelbundet kontrollera vattenkvaliteten och att akvarierna är rena.
Inverted microscope and/or binocular with a capacity of at least 80-fold magnification.
Vattnet bör återställas till sitt ursprungliga tillstånd vid behov.
If the room used for recording observations cannot be adjusted to 26 ± 1 °C, a temperature-controlled cross movement stage or other methods to maintain temperature are necessary;
Kvalifikationsprövning
Test chambers; e.g., standard 24-well plates with a depth of approx.
Som referenskemikalie bör 3,4-dikloranilin (används i valideringsstudierna (1)(2)) testas i en fullständig koncentrationsrespons för att kontrollera känsligheten hos den fiskstam som används, företrädesvis två gånger per år.
20 mm. (see “Test chambers”, paragraph 11);
Alla laboratorier som tar denna testmetod i bruk för första gången bör använda referenskemikalien.
e.g., self-adhesive foil to cover the 24-well plates;
Ett laboratorium kan använda denna kemikalie för att visa sin tekniska kompetens att genomföra analysen innan de lämnar in data för det föreskrivna syftet.
Incubator or air-conditioned room with controlled temperature, allowing to maintain 26 ± 1 °C in wells (or test chambers);
Äggproduktion
Oxygen meter;
Sebrafiskägg kan produceras via lekgrupper (i individuella lektankar) eller via ”masslek” (i underhållstankarna).
Equipment for determination of hardness of water and conductivity;
När det gäller lekgrupper bör hanar och honor (t.ex. i ett förhållande på 2:1) i en avelsgrupp placeras i lektankar några timmar innan mörkerperioden inleds dagen före testet.
Spawn trap: instrument trays of glass, stainless steel or other inert materials; wire mesh (grid size 2 ± 0,5 mm) of stainless steel or other inert material to protect the eggs once laid; spawning substrate (e.g. plant imitates of inert material) (TM C.48, Appendix 4a (23));
Eftersom leken ibland uteblir i lekgrupper av sebrafisk rekommenderas parallell användning av minst tre lektankar.
Pipettes with widened openings to collect eggs;
För att undvika systematiska genetiska avvikelser samlas ägg in från minst tre avelsgrupper, blandas och väljs ut slumpvis.
Glass vessels to prepare different test concentrations and dilution water (beakers, graduated flasks, graduated cylinders and graduated pipettes) or to collect zebrafish eggs (e.g. beakers, crystallisation dishes);
För insamling av äggen placeras lekfällor i lek- eller underhållstankarna innan mörkerperioden inleds dagen före testet eller innan ljusperioden inleds på dagen för testet.
If alternative exposure systems, such as flow-through (24) or passive dosing (25) are used for the conduct of the test, appropriate facilities and equipment are needed.
För att undvika predation av ägg av vuxen sebrafisk täcks lekfällorna med inert trådnät av lämplig maskstorlek (cirka 2 ± 0,5 mm).
Glass or polystyrene test chambers should be used (e.g. 24-well plates with a 2,5-5 ml filling capacity per well).
Om det anses nödvändigt kan konstgjorda växter tillverkade av inert material (t.ex. plast eller glas) fästas vid nätet som lekstimulus (3)(4)(5)(23)(35).
In case adsorption to polystyrene is suspected (e.g., for non-polar, planar substances with high KOW), inert materials (glass) should be used to reduce losses due to adsorption (26).
Vittrat plastmaterial som inte läcker (t.ex. ftalater) bör användas.
Test chambers should be randomly positioned in the incubator.
Parning, lek och befruktning sker inom 30 minuter efter gryningen och lekfällorna med de insamlade äggen kan då försiktigt avlägsnas.
Water and test conditions
Sköljning av äggen med rekonstituerat vatten efter insamling från lekfällorna rekommenderas.
Dilution of the maintenance water is recommended to achieve hardness levels typical of a wide variety of surface waters.
Differentiering av äggen
Dilution water should be prepared from reconstituted water (27).
De befruktade äggen genomgår den första klyvningen vid 26 °C efter cirka 15 minuter och de påföljande samtidiga klyvningarna bildar 4, 8, 16 och 32 cellblastomerer (se tillägg 3)(35).
The resulting degree of hardness should be equivalent to 100-300 mg/l CaCO3 in order to prevent excessive precipitation of calcium carbonate.
Under dessa stadier kan de befruktade äggen tydligt identifieras genom utvecklingen av en blastula.
Other well-characterised surface or well water may be used.
Tjugo embryon per koncentration (ett embryo per hål) utsätts för testkemikalien.
The reconstituted water may be adapted to maintenance water of low hardness by dilution with deionised water up to a ratio of 1:5 to a minimum hardness of 30-35 mg/l CaCO3.
Exponeringen bör vara sådan att ± 20 % av den nominella kemiska koncentrationen bibehålls under hela provningen.