natgillin/translations-raw huggingface dataset:
After analysis of a sufficient number of nuclei, the data are analysed with appropriate methods to judge the assay results.
Tekniken är i princip tillämplig på alla vävnader från vilka analyserbara enstaka cell-/kärnsuspensioner kan härledas.
It should be noted that altering various aspects of the methodology, including sample preparation, electrophoresis conditions, visual analysis parameters (e.g. stain intensity, microscope bulb light intensity, and use of microscope filters and camera dynamics) and ambient conditions (e.g. background lighting), have been investigated and may affect DNA migration (43) (44) (45) (46).
Skyddade data från flera laboratorier visar att tekniken har tillämpats med framgång på många olika vävnader.
Each laboratory should establish experimental competency in the comet assay by demonstrating the ability to obtain single cell or nuclei suspensions of sufficient quality for each target tissue(s) for each species used.
Det finns även många publikationer som visar att den är tillämplig på andra organ eller vävnader än lever och magsäck, t.ex. tomtarm (22), njure (23) (24), hud (25) (26) eller urinblåsa (27) (28), lunga och celler från bronkoalveolärt lavage (BAL) (relevant för undersökningar av kemikalier som inandas) (29) (30).
The quality of the preparations will be evaluated firstly by the % tail DNA for vehicle treated animals falling within a reproducible low range.
Tester har också utförts på flera organ (31) (32).
Current data suggest that the group mean % tail DNA (based on mean of medians — see paragraph 57 for details of these terms) in the rat liver should be preferably not exceed 6 %, which would be consistent with the values in the JaCVAM validation trial (12) and from other published and proprietary data.
Gentoxiska effekter på könsceller kan vara av intresse, men det bör noteras att standardvarianten av kometmetoden såsom den beskrivs i denna testmetod inte anses lämplig för att mäta brott på DNA-strängar i mogna könsceller.
There are not enough data at this time to make recommendations about optimum or acceptable ranges for other tissues.
Eftersom höga och variabla bakgrundsnivåer hos DNA-skador har rapporterats i litteraturgranskningar om användningen av kometmetoden för gentoxicitet hos könsceller (33), krävs protokolländringar och förbättrade standardiserings- och valideringsstudier innan kometmetoden för mogna könsceller (t.ex. spermier) kan inbegripas i denna testmetod.
This does not preclude the use of other tissues if justified.
Det rekommenderade exponeringssystem som beskrivs i denna testmetod är inte optimalt, och det krävs längre exponerings- eller provtagningstider för en meningsfull analys av brott på DNA-strängar hos mogna spermier.
The test report should provide appropriate review of the performance of the comet assay in these tissues in relation to the published literature or from proprietary data.
Gentoxiska effekter som uppmätts med kometmetoden i testikelceller på olika differentieringsstadier har beskrivits i litteraturen (34) (35).
Firstly, a low range of % tail DNA in controls is desirable to provide sufficient dynamic range to detect a positive effect.
Det bör dock noteras att könskörtlar innehåller en blandning av somatiska celler och könsceller.
Secondly, each laboratory should be able to reproduce expected responses for direct mutagens and pro-mutagens, with different modes of action as suggested in Table 1 (paragraph 29).
Därför avspeglar positiva resultat i hela könskörtlar (testis) inte nödvändigtvis skada på könsceller.
Positive substances may be selected, for example from the JaCVAM validation trial (12) or from other published data (see paragraph 9), if appropriate, with justification, and demonstrating clear positive responses in the tissues of interest.
De visar dock att de testade kemikalierna och/eller dess metaboliter har nått könskörteln.
The ability to detect weak effects of known mutagens e.g. EMS at low doses, should also be demonstrated, for example by establishing dose-response relationships with appropriate numbers and spacing of doses.
Tvärbindningar kan inte detekteras på ett tillförlitligt sätt med standardförsöksbetingelserna för kometmetoden.
Initial efforts should focus on establishing proficiency with the most commonly used tissues e.g. the rodent liver, where comparison with existing data and expected results may be made (12).
Under vissa modifierade försöksbetingelser är det möjligt att detektera DNA-DNA- och DNA-protein-tvärbindningar och andra basmodifikationer, såsom oxiderade baser (23) (36) (37) (38) (39).
Data from other tissues e.g. stomach/duodenum/jejunum, blood etc. could be collected at the same time.
Det krävs dock ytterligare arbete för att karakterisera dessa nödvändiga protokollmodifieringar på lämpligt sätt.
The laboratory needs to demonstrate proficiency with each individual tissue in each species they are planning to study, and will need to demonstrate that an acceptable positive response with a known mutagen (e.g. EMS) can be obtained in that tissue.
Detektering av tvärbindande agens är således inte det främsta syftet med försöket såsom det beskrivs här.
Vehicle/negative control data should be collected so as to demonstrate reproducibility of negative data responses, and to ensure that the technical aspects of the assay were properly controlled or to suggest the need to re-establish historical control ranges (see paragraph 22).
Försöket är inte lämpligt för detektion av aneugener, inte ens med modifieringar.
It should be noted, that whilst multiple tissues can be collected at necropsy and processed for comet analysis, the laboratory needs to be proficient in harvesting multiple tissues from a single animal, thereby ensuring that any potential DNA lesion is not lost and comet analysis is not compromised.
På grund av nuvarande kunskapsstatus har kometmetoden flera andra begränsningar (se tillägg 3).
The length of time from euthanasia to removal of tissues for processing may be critical (see paragraph 44).
Testmetoden förväntas granskas i framtiden och om nödvändigt revideras mot bakgrund av den erfarenhet som vunnits.
Animal welfare must be considered whilst developing proficiency in this test and therefore tissues from animals used in other tests can be used when developing competence in the various aspects of the test.
TESTMETODENS PRINCIP
Furthermore, it may not be necessary to conduct a full study during the stages of establishing a new test method in a laboratory and fewer animals or test concentrations can be used when developing the necessary skills.
En detaljerad beskrivning av dosering och provtagning ges i punkterna 36–40.
During the course of the proficiency investigations, the laboratory should build a historical database to establish positive and negative control ranges and distributions for relevant tissues and species.
Vävnaderna av intresse dissekeras vid de valda provtagningstidpunkterna och suspensioner av enstaka celler/kärnor bereds (perfusion in situ kan utföras om det anses användbart, t.ex. för lever) och bäddas in i mjukt agar så att de immobiliseras på analysplattformar.
Recommendations on how to build and use the historical data (i.e. criteria for inclusion and exclusion of data in historical data and the acceptability criteria for a given experiment) can be found in the literature (47).
Cellerna/kärnorna behandlas med lyseringsbuffert för att avlägsna cell- och/eller kärnmembran och exponeras för stark alkali, t.ex. pH ≥ 13, så att DNA:t löser upp sig och lossade DNA-slingor och fragment frigörs.
Different tissues and different species, as well as different vehicles and routes of administrations, may give different negative control % tail DNA values.
Kärn-DNA i agar genomgår därefter elektrofores.
It is therefore important to establish negative control ranges for each tissue and species.
Normala icke-fragmenterade DNA-molekyler förblir i den position där kärn-DNA fanns i agar, medan eventuellt fragmenterat DNA och lossade DNA-slingor migrerar mot anoden.
Laboratories should use quality control methods, such as control charts (e.g. C-charts or X-bar charts (48)), to identify how variable their data are, and to show that the methodology is ‘under control’ in their laboratory.
Efter elektrofores visualiseras DNA genom lämplig fluorescerande färg.
Selection of appropriate positive control substances, dose ranges and experimental conditions (e.g. electrophoresis conditions) may need also to be optimised for the detection of weak effects (see paragraph 17).
Beredningarna bör analyseras med mikroskop och hel- eller halvautomatiska bildanalyssystem.
Common laboratory strains of healthy young adult rodents (6-10 weeks old at start of treatment though slightly older animals are also acceptable) are normally used.
Den mängd DNA som har migrerat under elektrofores och migrationsavståndet avspeglar DNA-fragmentens mängd och storlek.
The choice of rodent species should be based on (i) species used in other toxicity studies (to be able to correlate data and to allow integrated studies), (ii) species that developed tumours in a carcinogenicity study (when investigating the mechanism of carcinogenesis), or (iii) species with the most relevant metabolism for humans, if known.
Det finns flera endpoints för kometmetoden.
Rats are routinely used in this test.
DNA-innehållet i kometsvansen ( % DNA i kometsvans eller % intensitet i kometsvans) har rekommenderats för bedömningen av DNA-skador (12) (40) (41) (42).
However, other species can be used if ethically and scientifically justified.
Efter analys av ett tillräckligt antal kärnor analyseras data med lämpliga metoder för att bedöma försöksresultaten.
For rodents, the temperature in the experimental animal room ideally should be 22 °C (± 3 °C).
Det bör noteras att ändringar av olika aspekter av metoden, bland annat provberedning, elektroforesbetingelser, visuella analysparametrar (t.ex. färgintensitet, mikroskopljusets intensitet och användning av mikroskopfilter samt kameradynamik) och omgivningsförhållanden (t.ex. bakgrundsbelysning) har undersökts och kan påverka DNA-migrationen (43) (44) (45) (46).
The relative humidity ideally should be 50-60 %, being at least 30 % and preferably not exceeding 70 % other than during room cleaning.
Aktuella data tyder på att gruppens medelvärde för procentandelen DNA i kometsvans (group mean % tail DNA – baserat på genomsnittet av medianvärdena, se punkt 57 för närmare uppgifter om dessa termer) hos råttlever bör helst inte överstiga 6 %, vilket överensstämmer med värdena i JaCVAM:s valideringsförsök (12) och i andra publicerade och skyddade data.
Rodents should be housed in small groups (usually no more than five) of the same sex if no aggressive behaviour is expected.
För närvarande finns inte tillräckliga data för rekommendationer om optimala eller godtagbara intervall för andra vävnader.
Solid floors should be used wherever possible as mesh floors can cause serious injury (49).
Detta utesluter inte användningen av andra vävnader om det är motiverat.
Appropriate environmental enrichment must be provided.
Testrapporten bör innehålla en lämplig granskning av resultaten av kometmetoden för dessa vävnader jämfört med publicerad litteratur eller skyddade data.
At the commencement of the study, the weight variation of animals should be minimal and not exceed ± 20 %.
Data för andra vävnader, t.ex. magsäck/tolvfingertarm/tomtarm, blod osv. kan samlas in samtidigt.
Solid test chemicals should be dissolved or suspended in appropriate vehicles or admixed in diet or drinking water prior to dosing of the animals.
Laboratoriet måste visa att det är kvalificerat för varje individuell vävnad hos varje art som det planerar att undersöka.
If multiple sampling times are used (e.g. with a single administration protocol) it is only necessary to include positive controls at one of the sampling times, but a balanced design should be ensured (see paragraph 48).
Under kvalifikationsundersökningarna bör laboratoriet bygga upp en historisk databas för att fastställa positiva och negativa kontrollintervall och fördelningar för relevanta vävnader och arter.
It is not necessary to administer concurrent positive control substances by the same route as the test chemical, although it is important that the same route should be used when measuring site-of-contact effects.
Rekommendationer om hur man bygger upp och använder historiska kontrolldatabaser (t.ex. kriterier för att innefatta och utesluta data samt acceptanskriterier för ett givet försök) finns i litteraturen (47).
The positive control substances should be shown to induce DNA strand breaks in all of the tissues of interest for the test chemical, and EMS is likely to be the positive control of choice since it has produced DNA strand breaks in all tissues that have been studied.
Det är därför viktigt att fastställa negativa kontrollintervall för varje vävnad och art.
The doses of the positive control substances should be selected so as to produce moderate effects that critically assess the performance and sensitivity of the assay and could be based on dose-response curves established by the laboratory during the demonstration of proficiency.
Laboratorierna bör använda kvalitetskontrollmetoder såsom kontrolldiagram (t.ex.
Substances other than those given in Table 1 can be selected if scientifically justified.
I regel används vanliga laboratoriestammar av friska unga vuxna gnagare (6–10 veckor gamla vid behandlingsstarten, även om något äldre djur också är godtagbara).
Ethyl methanesulfonate (CAS RN 62-50-0) for any tissue
Andra arter kan dock användas om det är etiskt och vetenskapligt motiverat.
Ethyl nitrosourea (CAS RN 759-73-9) for liver and stomach, duodenum or jejunum
För gnagare är den ideala temperaturen i försöksdjurens rum är 22 °C (± 3 °C).
Methyl methanesulfonate (CAS RN 66-27-3) for liver, stomach, duodenum or jejunum, lung and bronchoalveolar lavage (BAL) cells, kidney, bladder, lung, testis and bone marrow/blood
Den relativa fuktigheten bör helst vara 50–60 %, men minst 30 % och bör helst inte överstiga 70 % utom när rummet rengörs.
N-Methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (CAS RN: 70-25-7) for stomach, duodenum or jejunum
Gnagarna bör hållas i små grupper (vanligen högst fem) av samma kön, om inget aggressivt beteende kan förväntas.
1,2-Dimethylhydrazine 2HCl (CAS RN 306-37-6) for liver and intestine
Fasta golv bör användas när det är möjligt eftersom nätgolv kan orsaka allvarlig skada (49).
N-methyl-N-nitrosourea (CAS RN 684-93-5) for liver, bone marrow, blood, kidney, stomach, jejunum, and brain.
Lämplig miljöberikning krävs.
A group of negative control animals, treated with vehicle alone, and otherwise treated in the same way as the treatment groups, should be included with each test for every sampling time and tissue.
Djuren fördelas slumpvis i kontroll- och behandlingsgrupper.
The % tail DNA in negative control animals should be within the pre-established laboratory background range for each individual tissue and sampling time for that species (see paragraph 16).
Djuren identifieras individuellt och acklimatiseras till laboratoriemiljö under minst fem dagar före behandlingsstart.
In the absence of historical or published control data showing that no deleterious or genotoxic effects are induced by the chosen vehicle, by the number of administrations or by the route of administration, initial studies should be performed prior to conducting the full study, in order to establish acceptability of the vehicle control.
Den minst invasiva metoden för unik identifiering av djur måste användas.
Number and Sex of Animals
Lämpliga metoder är ringmärkning, taggar, mikrochip och biometrisk identifiering.
Although there is little data on female animals from which to make comparison between sexes in relation to the comet assay, in general, other in vivo genotoxicity responses are similar between male and female animals and therefore most studies could be performed in either sex.
Tå- och öronklippning är inte vetenskapligt motiverat i dessa tester.
Data demonstrating relevant differences between males and females (e.g. differences in systemic toxicity, metabolism, bioavailability, etc. including e.g. in a range-finding study) encourage the use of both sexes.
Burarna bör ordnas så att eventuella effekter på grund av deras placering minimeras.
In this case, it may be appropriate to perform a study in both sexes e.g. as part of a repeated dose toxicity study.
När undersökningen ska påbörjas är det lämpligt att viktskillnaden mellan djuren är så liten som möjligt och den bör inte överstiga ± 20 %.
Group sizes at study initiation (and during establishment of proficiency) should be established with the aim of providing a minimum of 5 analysable animals of one sex, or of each sex if both are used, per group (less in the concurrent positive control group — see paragraph 29).
Fasta testkemikalier bör lösas upp i, eller blandas med, lämpliga vehiklar eller blandas i foder eller dricksvatten innan dosen administreras till djuren.
As a guide to maximum typical animal requirements, a study conducted according the parameters established in paragraph 33 with three dose groups and concurrent negative and positive controls (each group composed of five animals of a single sex) would require between 25 and 35 animals.
Vid inhalationexponering kan testkemikalier administreras såsom gas, ånga eller en fast/flytande aerosol, beroende på deras fysikalisk-kemiska egenskaper (50) (51).
TREATMENT SCHEDULE
Vehikel
Animals should be given daily treatments over a duration of 2 or more days (i.e. two or more treatments at approximately 24 hour intervals), and samples should be collected once at 2-6 h (or at the Tmax) after the last treatment (12).
Vehikeln bör inte ge upphov till toxiska effekter vid de dosnivåer som används och bör inte kunna misstänkas för att reagera kemiskt med testkemikalierna.
Samples from extended dose regimens (e.g. 28-day daily dosing) are acceptable.
Om andra vehiklar än väl kända används bör det finnas data som visar att de är kompatibla när det gäller testdjur, administreringssätt och endpoint.
Successful combination of the comet and the erythrocyte micronucleus test has been demonstrated (10) (19).
Det bör noteras att vissa vehiklar (särskilt viskösa vehiklar) kan inducera inflammation och öka bakgrundnivåerna för brott på DNA-strängar vid kontaktpunkten, särskilt vid flera administreringar.
The use of other treatment and sampling schedules should be justified (see Appendix 3).
Om provtagningarna sker vid flera tillfällen (t.ex. med ett enda administreringsprotokoll) behöver man bara inkludera positiva kontroller vid ett av provtagningstillfällena, men det är viktigt att säkerställa en lämplig balans i försöket (se punkt 48).
For example single treatment with multiple sampling could be used however, it should be noted that more animals will be required for a study with a single administration study because of the need for multiple sampling times, but on occasions this may be preferable, e.g. when the test chemical induces excessive toxicity following repeated administrations.
Det är inte nödvändigt att administrera parallella positiva kontrollämnen på samma sätt som testkemikalien, även om det är viktigt att samma administreringssätt används vid mätningen av kontaktpunktseffekter.
Whatever way the test is performed, it is acceptable as long as the test chemical gives a positive response or, for a negative study, as long as direct or indirect evidence supportive of exposure of, or toxicity to, the target tissue(s) has been demonstrated or if the limit dose is achieved (see paragraph 36).
Man ska visa att de positiva kontrollämnena inducerar brott på DNA-strängar i alla vävnader för testkemikalien i fråga.
Test chemicals also may be administered as a split dose, i.e., two treatments on the same day separated by no more than 2-3 hours, to facilitate administering a large volume.
EMS är sannolikt den lämpligaste positiva kontrollen, eftersom den har producerat brott på DNA-strängar i alla undersökta vävnader.
Under these circumstances, the sampling time should be scheduled based on the time of the last dosing (see paragraph 40).
Doserna av positiva kontrollämnen ska väljas så att de producerar måttliga effekter som möjliggör en kritisk bedömning av försökets prestanda och sensitivitet.
Dose Levels
De kan baseras på dos-responskurvor som etablerats av laboratoriet när det kvalificerade sig för testet.
If a preliminary range-finding study is performed because there are no suitable data available from other relevant studies to aid in dose selection, it should be performed in the same laboratory, using the same species, strain, sex, and treatment regimen to be used in the main study according to current approaches for conducting dose range-finding studies.
Procentandelen DNA i kometsvans hos de parallella positiva kontrolldjuren bör överensstämma med laboratoriets på förhand fastställda intervall för varje enskild vävnad och provtagningstid för arten (se punkt 16).
The study should aim to identify the maximum tolerated dose (MTD), defined as the dose inducing slight toxic effects relative to the duration of the study period (for example, clear clinical signs such as abnormal behaviour or reactions, minor body weight depression or target tissue cytotoxicity), but not death or evidence of pain, suffering or distress necessitating euthanasia.
Exempel på positiva kontrollämnen och vissa av deras målvävnader (gnagare) finns i tabell 1.
For a non-toxic test chemical, with an administration period of 14 days or more, the maximum (limit) dose is 1000 mg/kg bodyweight/day.
Andra ämnen än de som anges i tabell 1 kan väljas om det är vetenskapligt motiverat.
For administration periods of less than 14 days the maximum (limit) dose is 2000 mg/kg bodyweight/day.
Exempel på positiva kontrollämnen och vissa av deras målvävnader
For certain types of test chemicals (e.g. human pharmaceuticals) covered by specific regulations these limits may vary.
Ämnen och CAS-RN-nummer
Chemicals that exhibit saturation of toxicokinetic properties, or induce detoxification processes that may lead to a decrease in exposure after long-term administration, may be exceptions to the dose-setting criteria and should be evaluated on a case-by-case basis.
Etylmetansulfonat (CAS RN 62-50-0) för alla vävnader
For both acute and sub-acute versions of the comet assay, in addition to the maximum dose (MTD, maximum feasible dose, maximum exposure or limit dose) a descending sequence of at least two additional appropriately spaced dose levels (preferably separated by less than √10) should be selected for each sampling time to demonstrate dose-related responses.
Etylnitrosourea (CAS RN 759-73-9) för lever och magsäck, tolvfingertarm eller tomtarm
However, the dose levels used should also preferably cover a range from the maximum to one producing little or no toxicity.
Metylmetansulfonat (CAS RN 66-27-3) för lever och magsäck, tolvfingertarm eller tomtarm, lunga och celler från bronkoalveolärt lavage (BAL), njure, urinblåsa, lunga, testis och benmärg/blod
When target tissue toxicity is observed at all dose levels tested, further study at non-toxic doses is advisable (see paragraphs 54-55).
N-metyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidin (CAS RN: 70-25-7) för magsäck, tolvfingertarm eller tomtarm
Studies intending to more fully investigate the shape of the dose-response curve may require additional dose group(s).
1,2-dimetylhydrazin 2HCl (CAS RN 306-37-6) för lever och inälvor
Administration of Doses
N-metyl-N-nitrosourea (CAS RN 684-93-5) för lever, benmärg, blod, njure, magsäck, tomtarm och hjärna.
In any case the route should be chosen to ensure adequate exposure of the target tissue(s).
En grupp av negativa kontrolldjur, behandlade med endast vehikel, och i övrigt behandlade på samma sätt som behandlingsgrupperna, bör inkluderas för varje test för varje provtagningstillfälle och vävnad.