natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Assessment of other markers for cytotoxicity or cytostasis (e.g. cell integrity, apoptosis, necrosis, metaphase counting, Proliferation index (PI), cell cycle, nucleoplasmic bridges or nuclear buds) could provide useful additional information, but should not be used in place of either the RPD or RICC.
Humana perifera blodlymfocyter bör tas från unga rökfria personer (cirka 18–35 år) utan kända sjukdomar som inte nyligen har exponerats för genotoxiska agens (t.ex. kemikalier, joniserande strålning) vid nivåer som skulle öka den bakomliggande incidensen av celler med mikrokärnor.
The use of single cultures is particularly relevant when more than 3 concentrations are assessed (see paragraphs 44-45).
Detta garanterar att den bakomliggande incidensen av celler med mikrokärnor är låg och konstant.
The results obtained from the independent replicate cultures at a given concentration can be pooled for the data analysis.
Förekomsten av celler med mikrokärnor ökar med åldern och denna tendens är mer markerad hos kvinnor än hos män (55).
Where cytotoxicity occurs, the test concentrations selected should cover a range from that producing cytotoxicity as described in paragraph 29 and including concentrations at which there is moderate and little or no cytotoxicity.
Cellodlingarna hålls i en exponentiell tillväxtfas (cellinjer) eller stimuleras så att de delar sig (primära lymfocytodlingar).
If the maximum concentration is based on cytotoxicity, the highest concentration should aim to achieve 55 ± 5 % cytotoxicity using the recommended cytotoxicity parameters (i.e. reduction in RICC and RPD for cell lines when cytoB is not used, and reduction in CBPI or RI when cytoB is used to 45± 5 % of the concurrent negative control) (72).
De primära celler som måste stimuleras med mitogena agens för att dela sig är i regel inte längre synkroniserade under exponeringen för testkemikalien (t.ex. humana lymfocyter efter mitogenisk stimulans i 48 timmar).
Care should be taken in interpreting positive results only found in the higher end of this 55 ± 5 % cytotoxicity range (71).
Användning av synkroniserade celler under behandling med testkemikalien rekommenderas inte, men kan vara godtagbar om det är motiverat.
Even if cytotoxicity occurs above the lowest insoluble concentration, it is advisable to test at only one concentration inducing turbidity or with visible precipitate because artifactual effects may result from the precipitate.
Lämpliga odlingsmedier och inkubationsförhållanden (odlingskärl, luftfuktighet på 5 % CO2 i förekommande fall, en temperatur på 37 °C) bör väljas för odlingarna.
If no precipitate or limiting cytotoxicity is observed, the highest test concentration should correspond to 10 mM, 2 mg/ml or 2 μl/ml, whichever is the lowest (73) (74) (75).
Cellinjer bör rutinmässigt kontrolleras med avseende på det modala kromosomantalets stabilitet och frånvaro av kontaminerad mykoplasma, och cellerna får inte användas om kontamination har skett eller om det modala kromosomantalet har ändrats.
When the test chemical is not of defined composition, e.g. a substance of unknown or variable composition, complex reaction products or biological materials (UVCB) (76), environmental extract, etc., the top concentration may need to be higher (e.g. 5 mg/ml) in the absence of sufficient cytotoxicity, to increase the concentration of each of the components.
Cellernas normala cellcykeltid eller den normala cellcykeltiden hos de primära kulturer som används i testlaboratoriet bör fastställas och bör överensstämma med kända cellegenskaper.
It should be noted however that these requirements may differ for human pharmaceuticals (93).
Lymfocyter: helblod, behandlat med en antikoagulant (t.ex. heparin), eller separerade lymfocyter odlas (t.ex.
Concurrent negative controls (see paragraph 21), consisting of solvent alone in the treatment medium and processed in the same way as the treatment cultures, should be included for every harvest time.
48 timmar för humana lymfocyter) i närvaro av ett mitogen (t.ex. fytohemaglutinin [PHA] för humana lymfocyter) för att framkalla celldelning innan cellerna exponeras för testkemikalien och cytoB.
Concurrent positive controls are needed to demonstrate the ability of the laboratory to identify clastogens and aneugens under the conditions of the test protocol used and the effectiveness of the exogenous metabolic activation system (when applicable).
Exogena metaboliserande system bör användas när cellerna inte har tillräcklig endogen metabolisk kapacitet.
Examples of positive controls are given in Table 1 below.
Det mest använda systemet, som rekommenderas som standard om inte annat kan motiveras, är en kofaktorstödd post-mitokondriell fraktion (S9) beredd ur lever från gnagare (vanligen råttor) som behandlats med enzyminducerande ämnen såsom Aroclor 1254 (56) (57) eller en kombination av fenobarbital och b-naftoflavon (58) (59) (60).
At the present time, no aneugens are known that require metabolic activation for their genotoxic activity (17).
Den senare kombinationen bryter inte mot Stockholmskonventionen om långlivade organiska föroreningar (61) och har visat sig vara lika effektiv som Aroclor 1254 när det gäller att inducera monooxygenaser (”mixed-function oxidases”) (58) (59) (60).
Because in vitro mammalian cell tests for genetic toxicity are sufficiently standardised for the short-term treatments done concurrently with and without metabolic activation using the same treatment duration, the use of positive controls may be confined to a clastogen requiring metabolic activation.
Användning av produkter som minskar det mitotiska indexet, särskilt kalciumkomplexprodukter (62), bör undvikas under behandlingen.
In this case a single clastogenic positive control response will demonstrate both the activity of the metabolic activation system and the responsiveness of the test system.
Fasta testkemikalier bör beredas med lämpliga lösningsmedel och vid behov spädas ut innan cellerna behandlas.
However, long term treatment (without S9) should have its own positive control, as the treatment duration will differ from the test using metabolic activation.
Gaser eller flyktiga testkemikalier bör testas genom lämpliga modifikationer av standardprotokollen, såsom behandling i slutna kärl (63) (64) (65).
If a clastogen is selected as the single positive control for short-term treatment with and without metabolic activation, an aneugen should be selected for the long-term treatment without metabolic activation.
Man bör välja ett lösningsmedel som optimerar testkemikaliens löslighet utan att testet påverkas negativt, t.ex. genom förändringar i celltillväxten som påverkar testkemikaliens integritet, reaktion med odlingskärlen eller försämrad metabolisk aktivering.
Positive controls for both clastogenicity and aneugenicity should be used in metabolically competent cells that do not require S9.
Vedertagna lösningsmedel är vatten eller dimetylsulfoxid (DMSO).
Each positive control should be used at one or more concentrations expected to give reproducible and detectable increases over background in order to demonstrate the sensitivity of the test system (i.e. the effects are clear but do not immediately reveal the identity of the coded slides to the reader), and the response should not be compromised by cytotoxicity exceeding the limits specified in this test method.
Organiska lösningsmedel bör i regel inte överstiga 1 volymprocent.
Reference chemicals recommended for assessing laboratory proficiency and for the selection of positive controls
Om cytoB löses upp i DMSO får den totala mängden organiskt lösningsmedel som används för både testkemikalien och cytoB inte överstiga 1 volymprocent.
Aneugens
I annat fall bör obehandlade kontroller användas för att se till att procentandelen organiskt lösningsmedel inte ger en negativ effekt.
Colchicine
Vattenhaltiga lösningsmedel (saltlösningar eller vatten) bör inte överstiga 10 volymprocent i det slutliga behandlingsmediet.
Vinblastine
Om man använder lösningsmedel som inte är vedertagna (t.ex. etanol eller aceton) bör detta stödjas av uppgifter om att de är förenliga med testkemikalierna och testsystemet och att de inte är genetiskt toxiska vid den använda koncentrationen.
Treatment Schedule
Om ett sådant underlag saknas är det viktigt att inkludera obehandlade kontroller (se tillägg 1) och lösningsmedelskontroller som påvisar att inga skadliga effekter eller kromosomeffekter (t.ex. aneuplodi eller klastogenitet) induceras av det valda lösningsmedlet.
In order to maximise the probability of detecting an aneugen or clastogen acting at a specific stage in the cell cycle, it is important that sufficient numbers of cells representing all of the various stages of their cell cycles are treated with the test chemical.
Användning av cytoB som cytokinesinhibitor
All treatments should commence and end while the cells are growing exponentially and the cells should continue to grow up to the time of sampling.
En av de viktigaste faktorerna när det gäller MNvit-testets resultat är att se till att de celler som analyseras har slutfört mitosen under behandlingen eller under eventuell inkubationsperiod efter behandlingen.
The treatment schedule for cell lines and primary cell cultures may, therefore, differ somewhat from that for lymphocytes which require mitogenic stimulation to begin their cell cycle (17).
Analysen av mikrokärnor bör då begränsas till celler som har genomgått mitos under eller efter behandlingen.
For lymphocytes, the most efficient approach is to start the treatment with the test chemical at 44-48 hours after PHA stimulation, when cells will be dividing asynchronously (6).
CytoB är det ämne som oftast används för blockering av cytokines eftersom det hindrar aktinbildning och således hindrar separationen av dotterceller efter mitosen så att binukleära celler kan bildas (6) (66) (67).
Published data (19) indicate that most aneugens and clastogens will be detected by a short term treatment period of 3 to 6 hours in the presence and absence of S9, followed by removal of the test chemical and sampling at a time equivalent to about 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths after the beginning of treatment (7).
Samtidigt kan man mäta testkemikaliens effekt på cellproliferationskinetiken när cytoB används.
However, for thorough evaluation, which would be needed to conclude a negative outcome, all three following experimental conditions should be conducted using a short term treatment with and without metabolic activation and long term treatment without metabolic activation (see paragraphs 56, 57 and 58): Cells should be exposed to the test chemical without metabolic activation for 3-6 hours, and sampled at a time equivalent to about 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths after the beginning of treatment (19),
CytoB ska användas som cytokinesinhibitor när humana lymfocyter används eftersom cellcykeltiderna varierar mellan givare och eftersom inte alla lymfocyter ger respons på PHA-stimulans.
Cells should be exposed to the test chemical with metabolic activation for 3-6 hours, and sampled at a time equivalent to about 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths after the beginning of treatment (19),
CytoB är inte obligatoriskt för andra celltyper om det kan fastställas att de har genomgått uppdelning enligt beskrivningen i punkt 27.
Cells should be continuously exposed without metabolic activation until sampling at a time equivalent to about 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths.
CytoB används normalt inte när proverna utvärderas med avseende på mikrokärnor med användning av flödescytometriska metoder.
If it is known or suspected that the test chemical affects the cell cycling time (e.g. when testing nucleoside analogues), especially for p53 competent cells (35) (36) (77), sampling or recovery times may be extended by up to a further 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths (i.e. total 3,0 to 4,0 cell cycle lengths after the beginning of short-term and long-term treatments).
Laboratoriet bör fastställa lämplig koncentration av cytoB för varje celltyp i syfte att nå optimal förekomst av binukleära celler i kontrollodlingarna för lösningsmedel/vehikel och bör visa att det kan producera en tillräcklig mängd binukleära kärnor för klassificering.
These options address situations where there may be concern regarding possible interactions between the test chemical and cytoB.
Lämplig cytoB-koncentration är i regel 3–6 μg/ml (19).
When using extended sampling times (i.e. total 3,0 to 4,0 cell cycle lengths culture time), care should be taken to ensure that the cells are still actively dividing.
Vid bestämning av den högsta testkemikaliekoncentrationen ska man undvika koncentrationer som kan ge artefaktiska positiva resultat, t.ex. för kraftig cytotoxicitet (se punkt 29), utfällning i odlingsmediet (se punkt 30) och markerade ändringar av pH eller osmolalitet (se punkt 9).
For example, for lymphocytes exponential growth may be declining at 96 hours following stimulation and monolayer cultures of cells may become confluent.
Cellproliferationen bör mätas för att se till att tillräckligt många behandlade celler har genomgått mitos under testet och att behandlingarna görs på lämpliga nivåer av cytotoxicitet (se punkt 29).
The suggested cell treatment schedules are summarised in Table 2.
Cytotoxicitet bör fastställas med och utan metabolisk aktivering i huvudförsöket med hjälp av lämplig indikation på celldöd och tillväxt (se punkterna 26 och 27).
These general treatment schedules may be modified (and should be justified) depending on the stability or reactivity of the test chemical or the particular growth characteristics of the cells being used.
Även om det kan vara användbart att utvärdera cytotoxicitet i ett preliminärt test för att bättre definiera de koncentrationer som ska användas i huvudförsöket är ett preliminärt test inte obligatoriskt.
Cell treatment and harvest times for the MNvit test
Behandling av odlingarna med cytoB och mätning av de relativa frekvenserna av mononukleära, binukleära och multinukleära celler i odlingen är en noggrann metod för kvantifiering av effekten på cellproliferationen och behandlingens cytotoxiska eller cytostatiska aktivitet (6) och säkerställer att endast celler som har delat sig under eller efter behandlingen analyseras mikroskopiskt.
Lymphocytes, primary cells and cell lines treated with cytoB
CBPI (Cytokinesis-Block Proliferation Index) (6) (27) (68) eller replikeringsindex (RI) från minst 500 celler per odling (se tillägg 2 för formler) rekommenderas för att uppskatta behandlingens cytotoxiska eller cytostatiska aktivitet genom en jämförelse av värdena i de behandlade odlingarna och kontrollodlingarna.
Treat for 3-6 hours in the presence of S9;
I studier utan cytoB är det nödvändigt att påvisa att cellerna i odlingen har genomgått delning, så att en avsevärd andel av de klassificerade cellerna har genomgått delning under eller efter behandling med testkemikalien.
remove the S9 and treatment medium;
Annars kan man få falsk negativ respons.
add fresh medium and cytoB;
Mätning av relativ populationsfördubbling (RPD) eller relativ ökning av celltal (RICC) rekommenderas för att uppskatta den cytotoxiska eller cytostatiska aktiviteten i behandlingen (17) (68) (69) (70) (71) (se tillägg 2 för formler).
harvest 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths after the beginning of treatment.
Vid förlängda provningstider (t.ex. behandling för 1,5–2 gånger den normala cellcykelns längd och skörd efter ytterligare 1,5–2 gånger den normala cellcykelns längd som leder till provtagningstider som är längre än totalt 3–4 normala cellcykellängder enligt beskrivningen i punkterna 38 och 39) kan cytotoxiciteten underskattas med RPD (71).
Treat for 3-6 hours;
Under dessa omständigheter kan RICC vara ett bättre mått.
remove the treatment medium;
Det kan också vara användbart att utvärdera utvecklingen av cytotoxicitet efter 1,5–2 gånger den normala cellcykelns längd.
Extended treatment
Bedömning av andra markörer för cytotoxicitet eller cytostas (t.ex. cellintegritet, apoptos, nekros, antalet metafaser, proliferationsindex (PI), cellcykel, nukleoplasmabryggor eller nukleära knoppar kan ge värdefull information, men bör inte användas i stället för RPD eller RICC.
Treat for 1,5 - 2 normal cell cycle lengths in the presence of cytoB;
Användningen av en enstaka odling är särskilt relevant när fler än tre koncentrationer bedöms (se punkterna 44–45).
harvest at the end of the treatment period.
De resultat som erhölls i de oberoende replikatodlingarna vid en given koncentration kan slås ihop för dataanalysen.
Cell lines treated without cytoB
Där cytotoxicitet uppträder bör de valda testkoncentrationerna omfatta intervallet från att producera cytotoxicitet som beskrivs i punkt 29 och inkludera koncentrationer vid vilka det är måttlig och liten eller ingen cytotoxicitet.
(Identical to the treatment schedules outlined above with the exception that no cytoB is added)
Många testkemikalier uppvisar koncentrationsreponskurvor.
For monolayer cultures, mitotic cells (identifiable as being round and detaching from the surface) may be present at the end of the 3-6 hour treatment.
För att få uppgifter vid låg och måttlig cytotoxicitet eller undersöka dos-responsförhållandet i detalj är det därför nödvändigt att använda mer nära varandra liggande koncentrationer och/eller fler än tre koncentrationer (enstaka kulturer eller replikat) i situationer där försöket måste upprepas (se punkt 60).
If there is evidence for a substantial increase in the number of mitotic cells compared with controls, indicating likely mitotic arrest, then the cells should be collected by centrifugation and added back to the culture, to avoid losing cells that are in mitosis, and at risk for micronuclei/chromosome aberration, at the time of harvest.
Om den maximala koncentrationen baseras på cytotoxicitet bör den högsta koncentrationen syfta till att uppnå 55 ± 5 % cytotoxicitet med hjälp av de rekommenderade cytotoxicitetparametrarna (dvs. minskning av RICC och RPD för cellinjer när cytoB inte används och minskning av CBPI eller RI när cytoB används till 45 ± 5 % av den parallella negativa kontrollen) (72).
Cell harvest and slide preparation
Man bör vara försiktig i tolkningen av positiva resultat som endast återfinns i den övre delen av detta cytotoxicitetsintervall på 55 ± 5 % (71).
Each culture should be harvested and processed separately.
Även om cytotoxicitet förekommer över den lägsta olösliga koncentrationen är det lämpligt att testa endast en koncentration som inducerar grumlighet eller har en synlig fällning, eftersom fällningen kan ge artefaktiska effekter.
Cell preparation may involve hypotonic treatment, but this step is not necessary if adequate cell spreading is otherwise achieved.
Om ingen cytotoxicitet eller utfällning observeras ska de högsta testkoncentrationerna motsvara 10 mM, 2 mg/ml eller 2 μl/ml, enligt det som är lägst (73) (74) (75).
Different techniques can be used in slide preparation provided that high-quality cell preparations for scoring are obtained.
Om testkemikalien inte har en definierad sammansättning, t.ex. ett ämne med okänd eller variabel sammansättning, komplexa reaktionsprodukter eller biologiskt material (UVCB) (76), miljöextrakt osv., kan man behöva använda en högre toppkoncentration (t.ex.
Cells with intact cell membrane and intact cytoplasm should be retained to allow the detection of micronuclei and (in the cytokinesis-block method) reliable identification of binucleate cells.
5 mg/ml) om inte cytotoxiciteten är tillräckligt hög så att koncentrationen för varje komponent ökas.
The slides can be stained using various methods, such as Giemsa or fluorescent DNA specific dyes.
Det bör dock noteras att dessa krav kan skilja sig för humanläkemedel (93).
The use of appropriate fluorescent stains (e.g. acridine orange (78) or Hoechst 33258 plus pyronin-Y (79)) can eliminate some of the artifacts associated with using a non-DNA specific stain.
Parallella negativa kontroller (se punkt 21), bestående av lösningsmedel eller enbart en vehikel i behandlingsmediet, och hanterade på samma sätt som behandlingsodlingarna, bör inkluderas var gång som odlingen skördas.
Anti-kinetochore antibodies, FISH with pancentromeric DNA probes, or primed in situ labelling with pancentromere-specific primers, together with appropriate DNA counterstaining, can be used to identify the contents (whole chromosomes will be stained while acentric chromosome fragments will not) of micronuclei if mechanistic information of their formation is of interest (16) (17).
Parallella positiva kontroller behövs för att visa laboratoriets förmåga att identifiera klastogener och aneugener enligt villkoren i det använda testprotokollet och, i förekommande fall, effektiviteten hos det exogena systemet för metabolisk aktivering.
Other methods for differentiation between clastogens and aneugens may be used if they have been shown to be effective and validated.
Exempel på positiva kontroller ges i tabell 1 nedan.
For example, for certain cell lines the measurements of sub-2N nuclei as hypodiploid events using techniques such as image analysis, laser scanning cytometry or flow cytometry could also provide useful information (80) (81) (82).
För närvarande känner man inte till några aneugener som kräver metabolisk aktivering för sin genotoxiska aktivitet (17).
Morphological observations of nuclei could also give indications of possible aneuploidy.
Tester in vitro av däggdjursceller med avseende på genetisk toxicitet är tillräckligt standardiserade för de kortvariga behandlingar som görs parallellt med och utan metabolisk aktivering med samma behandlingslängd.
Moreover, a test for metaphase chromosome aberrations, preferably in the same cell type and protocol with comparable sensitivity, could also be a useful way to determine whether micronuclei are due to chromosome breakage (knowing that chromosome loss would not be detected in the chromosome aberration test).
Användningen av positiva kontroller kan därför begränsas till en klastogen som kräver metabolisk aktivering.
All slides, including those of the solvent and the untreated (if used) and positive controls, should be independently coded before the microscopic analysis of micronucleus frequencies.
I detta fall visar en enda klastogen positiv kontrollrespons både aktiviteten hos det metaboliska aktiveringssystemet och testsystemets responsivitet.
Appropriate techniques should be used to control any bias or drift when using an automated scoring system, for instance, flow cytometry, laser scanning cytometry or image analysis.
Separata positiva kontroller bör dock göras av långvariga behandlingar (utan S9) eftersom behandlingstiden skiljer sig från tester med metabolisk aktivering.
Regardless of the automated platform is used to enumerate micronuclei, CBPI, RI, RPD, or RICC should be assessed concurrently.
Om en klastogen används som den enda positiva kontrollen för en kortvarig behandling med eller utan metabolisk aktivering bör en aneugen väljas för den långvariga behandlingen utan metabolisk aktivering.
In cytoB-treated cultures, micronucleus frequencies should be analysed in at least 2000 binucleate cells per concentration and control (83), equally divided among the replicates, if replicates are used.
Positiva kontroller för både klastogenicitet och aneugenicitet bör användas för metaboliskt kompetenta celler som inte kräver S9.
In the case of single cultures per dose (see paragraph 28), at least 2000 binucleate cells per culture (83) should be scored in this single culture.
Varje positiv kontroll bör användas för en eller flera koncentrationer som förväntas ge ökningar över bakgrunden som går att reproducera och detektera.
If substantially fewer than 1000 binucleate cells per culture (for duplicate cultures), or 2000 (for single culture), are available for scoring at each concentration, and if a significant increase in micronuclei is not detected, the test should be repeated using more cells, or at less cytotoxic concentrations, whichever is appropriate.
Syftet med detta är att visa testsystemets sensitivitet (dvs. verkningarna är tydliga men avslöjar inte omedelbart identiteten hos de kodade utstryksglasen för avläsaren), och responsen får inte äventyras av cytotoxicitet som överskrider de gränser som anges i testmetoden.