natgillin/translations-raw huggingface dataset:
The classical methods based on guinea-pigs, the Magnusson Kligman Guinea Pig Maximisation Test (GMPT) and the Buehler Test (TM B.6 (5)), study both the induction and elicitation phases of skin sensitisation.
Referenskontroll A, rep 2
A murine test, the Local Lymph Node Assay (LLNA) (TM B.42 (4)) and its two non-radioactive modifications, LLNA: DA (TM B.50 (6)) and LLNA: BrdU-ELISA (TM B.51 (7)), which all assess the induction response exclusively, have also gained acceptance since they provide advantages over the guinea pig tests in terms of both animal welfare and objective measurement of the induction phase of skin sensitisation.
Referenskontroll A, rep 3
More recently, mechanistically-based in chemico and in vitro test methods have been considered scientifically valid for the evaluation of the skin sensitisation hazard of chemicals.
Samelueringskontroller
However, combinations of non-animal methods (in silico, in chemico, in vitro) within Integrated Approaches to Testing and Assessment (IATA) will be needed to be able to fully substitute for the animal tests currently in use given the restricted AOP mechanistic coverage of each of the currently available non-animal test methods (2) (3).
Samelueringskontroll 1 för testkemikalie 1
This test method (ARE-Nrf2 luciferase assay) is proposed to address the second key event as explained in paragraph 2.
Samelueringskontroll 2 för testkemikalie 2
Skin sensitisers have been reported to induce genes that are regulated by the antioxidant response element (ARE) (8) (9).
Referenskontroller
Small electrophilic substances such as skin sensitisers can act on the sensor protein Keap1 (Kelch-like ECH-associated protein 1), by e.g. covalent modification of its cysteine residue, resulting in its dissociation from the transcription factor Nrf2 (nuclear factor-erythroid 2-related factor 2).
Referenskontroll B, rep 1
The dissociated Nrf2 can then activate ARE-dependent genes such as those coding for phase II detoxifying enzymes (8) (10) (11).
Referenskontroll B, rep 2
Currently, the only in vitro ARE-Nrf2 luciferase assay covered by this test method is the KeratinoSensTM assay for which validation studies have been completed (9) (12) (13) followed by an independent peer review conducted by the European Union Reference Laboratory for Alternatives to Animal Testing (EURL ECVAM) (14).
Referenskontroll B, rep 3
The KeratinoSensTM assay was considered scientifically valid to be used as part of an IATA, to support the discrimination between skin sensitisers and non-sensitisers for the purpose of hazard classification and labelling (14).
Första uppsättningen replikat
Laboratories willing to implement the test method can obtain the recombinant cell line used in the KeratinoSensTM assay by establishing a licence agreement with the test method developer (15).
Referenskontroll C, rep 1
Since activation of the Keap1-Nrf2-ARE pathway addresses only the second key event of the skin sensitisation AOP, information from test methods based on the activation of this pathway is unlikely to be sufficient when used on its own to conclude on the skin sensitisation potential of chemicals.
Referenskontroll C, rep 1
Therefore, data generated with the present test method should be considered in the context of integrated approaches, such as IATA, combining them with other complementary information e.g. derived from in vitro assays addressing other key events of the skin sensitisation AOP as well as non-testing methods including read-across from chemical analogues.
Prov 1, rep 1
Examples on how to use the ARE-Nrf2 luciferase test method in combination with other information are reported in literature (13) (16) (17) (18) (19).
Prov 2, rep 1
This test method can be used to support the discrimination between skin sensitisers (i.e. UN GHS/CLP Category 1) and non-sensitisers in the context of IATA.
Andra uppsättningen replikat
This test method cannot be used on its own, neither to sub-categorise skin sensitisers into subcategories 1A and 1B as defined by the UN GHS/CLP nor to predict potency for safety assessment decisions.
Referenskontroll C, rep 2
However, depending on the regulatory framework, a positive result may be used on its own to classify a chemical into UN GHS/CLP category 1.
Kanelaldehyd, rep 2
Based on the dataset from the validation study and in-house testing used for the independent peer-review of the test method, the KeratinoSensTM assay proved to be transferable to laboratories experienced in cell culture.
Prov 1, rep 2
The level of reproducibility in predictions that can be expected from the test method is in the order of 85 % within and between laboratories (14).
Prov 2, rep 2
The accuracy (77 % - 155/201), sensitivity (78 % - 71/91) and specificity (76 % - 84/110) of the KeratinoSensTM assay for discriminating skin sensitisers (i.e. UN GHS/CLP Cat.
Tredje uppsättningen replikat
1) from non-sensitisers when compared to LLNA results were calculated by considering all of the data submitted to EURL ECVAM for evaluation and peer-review of the test method (14).
Referenskontroll C, rep 3
These figures are similar to those recently published based on in-house testing of about 145 substances (77 % accuracy, 79 % sensitivity, 72 % specificity) (13).
Kanelaldehyd, rep 3
The KeratinoSensTM assay is more likely to under predict chemicals showing a low to moderate skin sensitisation potency (i.e. UN GHS/CLP subcategory 1B) than chemicals showing a high skin sensitisation potency (i.e. UN GHS/CLP subcategory 1A) (13) (14).
Prov 1, rep 3
Taken together, this information indicates the usefulness of the KeratinoSensTM assay to contribute to the identification of skin sensitisation hazard.
Prov 2, rep 3
However, the accuracy values given here for the KeratinoSensTM assay as a stand-alone test method are only indicative since the test method should be considered in combination with other sources of information in the context of an IATA and in accordance with the provisions of paragraph 9 above.
Referenskontroll B, rep 4
Furthermore when evaluating non-animal methods for skin sensitisation, it should be kept in mind that the LLNA as well as other animal tests, may not fully reflect the situation in the species of interest i.e. humans.
Referenskontroll B, rep 5
The term “test chemical” is used in this test method to refer to what is being tested and is not related to the applicability of the ARE-Nrf2 luciferase test method to the testing of substances and/or mixtures.
Referenskontroll B, rep 6
On the basis of the current data available the KeratinoSensTM assay was shown to be applicable to test chemicals covering a variety of organic functional groups, reaction mechanisms, skin sensitisation potency (as determined with in vivo studies) and physico-chemical properties (9) (12) (13) (14).
B.60 Hudsensibilisering in vitro: Testmetoden ARE-Nrf2-uciferas
Mainly mono-constituent substances were tested, although a limited amount of data also exist on the testing of mixtures (20).
Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 442D (2015).
The test method is nevertheless technically applicable to the testing of multi-constituent substances and mixtures.
Hudsensibiliserande ämnen är ämnen som leder till en allergisk reaktion efter hudkontakt enligt definitionen i FN:s globala harmoniserade system för klassificering och märkning av kemikalier (GHS) (1) och förordning (EU) nr 1272/2008 om klassificering, märkning och förpackning av ämnen och blandningar (CLP-förordningen) [18].
However, before use of this test method on a mixture for generating data for an intended regulatory purpose, it should be considered whether, and if so why, it may provide adequate results for that purpose.
Den befintliga kunskapen om de kemiska och biologiska mekanismer som är förknippade med hudsensibilisering har sammanfattats i form av AOP (Adverse Outcome Pathway) (2), från den inledande molekylära händelsen via de mellanliggande händelser som orsakar den negativa hälsoeffekten, nämligen allergisk kontaktdermatit hos människor och överkänslighet mot kontakt hos gnagare (2) (3).
Moreover, when testing multi-constituent substances or mixtures, consideration should be given to possible interference of cytotoxic constituents with the observed responses.
Den molekylära inledande händelsen är en kovalent bindning av elektrofila ämnen till nukleofila centrum i hudproteiner.
The test method is applicable to test chemicals soluble or that form a stable dispersion (i.e. a colloid or suspension in which the test chemical does not settle or separate from the solvent into different phases) either in water or DMSO (including all of the test chemical components in the case of testing a multi-constituent substance or a mixture).
Den andra nyckelhändelsen i AOP sker i keratinocyterna och inkluderar inflammationsrespons samt genuttryck i samband med specifika cellsignalerande vägar, såsom ARE-beroende vägar (antioxidant/electrophile response element).
Test chemicals that do not fulfil these conditions at the highest final required concentration of 2000 μM (cf. paragraph 22) may still be tested at lower concentrations.
Den tredje nyckelhändelsen är aktivering av dendritiska celler, vilket vanligen bedöms genom uttryck av specifika cellytmarkörer, kemokines och cytokines.
In such a case, results fulfilling the criteria for positivity described in paragraph 39 could still be used to support the identification of the test chemical as a skin sensitiser, whereas a negative result obtained with concentrations < 1000 μM should be considered as inconclusive (see prediction model in paragraph 39).
Den fjärde nyckelhändelsen är spridning av T-celler, som bedöms indirekt i murintestmetoden LLNA(4).
In general substances with a LogP of up to 5 have been successfully tested whereas extremely hydrophobic substances with a LogP above 7 are outside the known applicability of the test method (14).
I de klassiska metoderna som baseras på marsvin, Magnusson Kligman Guinea Pig Maximisation Test (GPMT) och Buehler-testet (TM B.6 (5)), undersöks både induktions- och eliciteringsfaserna i hudsensibilisering.
For substances having a LogP falling between 5 and 7, only limited information is available.
Ett murintest, Local Lymph Node Assay (LLNA, TM B.42 (4)) och dess två icke radioaktiva modifieringar, LLNA: DA (TM B.50 (6)) och LLNA: BrdU-ELISA (TM B.51 (7)), som endast bedömer induktionsresponsen, har också vunnit erkännande eftersom de är mer fördelaktiga än marsvinstester ur djurskyddssynpunkt och ger en objektiv mätning av induktionsfasen i hudsensibilisering.
Negative results should be interpreted with caution as substances with an exclusive reactivity towards lysine-residues can be detected as negative by the test method.
Mer nyligen har man kommit fram till att mekaniskt baserade tester in chemico och in vitro kan anses vara vetenskapligt giltiga för utvärdering av kemikaliers hudsensibiliserande faror.
Furthermore, because of the limited metabolic capability of the cell line used (21) and because of the experimental conditions, pro-haptens (i.e. chemicals requiring enzymatic activation for example via P450 enzymes) and pre-haptens (i.e. chemicals activated by auto-oxidation) in particular with a slow oxidation rate may also provide negative results.
Det är dock nödvändigt att kombinera metoder utan försöksdjur (in silico, in chemico, in vitro) inom IATA (Integrated Approaches to Testing and Assessment) för att fullständigt ersätta de djurförsök som används i dagsläget, med tanke på AOP:s begränsade mekanistiska täckning av de testmetoder utan försöksdjur som finns tillgängliga för närvarande (2) (3).
Test chemicals that do not act as a sensitiser but are nevertheless chemical stressors may lead on the other hand to false positive results (14).
Denna testmetod (ARE-Nrf2-luciferas) föreslås för att hantera den andra nyckelhändelsen som beskrivs i punkt 2.
Furthermore, highly cytotoxic test chemicals cannot always be reliably assessed.
Hudsensibiliserande ämnen har rapporterats inducera gener som regleras av ARE (antioxidant response element) (8) (9).
Finally, test chemicals that interfere with the luciferase enzyme can confound the activity of luciferase in cell-based assays causing either apparent inhibition or increased luminescence (22).
Små elektrofila ämnen såsom hudsensibiliserande ämnen kan agera mot sensorproteinet Keap1 (Kelch-like ECH-associated protein 1), t.ex. genom kovalent modifikation av dess cysteinrest, vilket leder till att det löser sig från transkriptionsfaktorn Nrf2 (nuclear factor-erythroid 2-related factor 2).
For example, phytoestrogen concentrations higher than 1 μM were reported to interfere with the luminescence signals in other luciferase-based reporter gene assays due to over-activation of the luciferase reporter gene (23).
Den upplösta Nrf2 kan därefter aktivera ARE-beroende gener, t.ex. gener som kodar för fas II avgiftande enzymer (8) (10) (11).
As a consequence, luciferase expression obtained at high concentrations of phytoestrogens or similar chemicals suspected of producing phytoestrogen-like over-activation of the luciferase reporter gene needs to be examined carefully (23).
Det enda ARE-Nrf2-luciferas-test in vitro som för närvarande täcks av denna testmetod är KeratinoSensTM-testet, för vilket valideringsstudier har slutförts (9) (12) (13), följt av en oberoende granskning som utförts av Europeiska centret för bestämning av alternativa metoder (EURL ECVAM) (14).
In cases where evidence can be demonstrated on the non-applicability of the test method to other specific categories of test chemicals, the test method should not be used for those specific categories.
KeratinoSensTM-testet ansågs vetenskapligt giltigt för att användas som en del av en IATA i syfte att skilja mellan hudsensibiliserande ämnen och icke-hudsensibiliserande ämnen för klassificering och märkning av farliga ämnen (14).
In addition to supporting discrimination between skin sensitisers and non-sensitisers, the KeratinoSensTM assay also provides concentration-response information that may potentially contribute to the assessment of sensitising potency when used in integrated approaches such as IATA (19).
Laboratorier som vill tillämpa denna testmetod kan erhålla den rekombinanta cellinje som används i KeratinoSensTM-testet genom ett licensavtal med testmetodens utvecklare (15).
However, further work preferably based on reliable human data is required to determine how KeratinoSensTM assay results can contribute to potency assessment (24) and to sub-categorisation of sensitisers according to UN GHS/CLP.
Eftersom aktiveringen av Keap1-Nrf2-ARE-vägen endast behandlar den andra nyckelhändelsen i AOP-hudsensibilisering är information från testmetoder som baseras på denna väg sannolikt inte tillräcklig om den används som enda underlag för att dra slutsatser om kemikaliers hudsensibiliserande potential.
The ARE-Nrf2 luciferase test method makes use of an immortalised adherent cell line derived from HaCaT human keratinocytes stably transfected with a selectable plasmid.
De data som genereras med denna testmetod bör därför övervägas inom ramen för integrerade strategier som IATA och kombineras med annan kompletterande information, t.ex. från in vitro-test rörande andra viktiga händelser i AOP-hudsensibiliseringen samt metoder utan testning, inklusive jämförelser från kemiskt analoga ämnen.
The cell line contains the luciferase gene under the transcriptional control of a constitutive promoter fused with an ARE element from a gene that is known to be up-regulated by contact sensitisers (25) (26).
Exempel på hur testmetoden ARE-Nrf2-luciferas kan användas i kombination med annan information finns i litteraturen (13) (16) (17) (18) (19).
The luciferase signal reflects the activation by sensitisers of endogenous Nrf2 dependent genes, and the dependence of the luciferase signal in the recombinant cell line on Nrf2 has been demonstrated (27).
Denna testmetod kan användas för att skilja mellan hudsensibiliserande kemikalier (dvs. GHS-/CLP-kategori 1) och icke-hudsensibiliserande ämnen inom ramen för IATA.
This allows quantitative measurement (by luminescence detection) of luciferase gene induction, using well established light producing luciferase substrates, as an indicator of the activity of the Nrf2 transcription factor in cells following exposure to electrophilic substances.
Testmetoden kan inte användas fristående, vare sig för att dela in hudsensibiliserande ämnen i underkategorierna 1A och 1B enligt GHS/CLP, eller för att förutsäga styrka när det gäller säkerhetsbedömningsbeslut.
Test chemicals are considered positive in the KeratinoSens™ assay if they induce a statistically significant induction of the luciferase activity above a given threshold (i.e. > 1,5 fold or 50 % increase), below a defined concentration which does not significantly affect cell viability (i.e. below 1000 μM and at a concentration at which the cellular viability is above 70 % (9) (12)).
Beroende på tillämpligt regelverk kan dock ett positivt resultat användas fristående för att klassificera kemikalier i GHS-/CLP-kategori 1.
For this purpose, the maximal fold induction of the luciferase activity over solvent (negative) control (Imax) is determined.
Baserat på datauppsättningen från valideringsstudien samt intern testning som använts för den oberoende granskningen av testmetoden har KeratinoSensTM-testet visat sig vara överförbart till laboratorier med erfarenhet av cellodlingar.
Furthermore, since cells are exposed to series of concentrations of the test chemicals, the concentration needed for a statistically significant induction of luciferase activity above the threshold (i.e. EC1,5 value) should be interpolated from the dose-response curve (see paragraph 32 for calculations).
Testmetodens förväntade reproducerbarhet är i storleksordningen 85 % inom och mellan laboratorier (14).
Finally, parallel cytotoxicity measurements should be conducted to assess whether luciferase activity induction levels occur at sub-cytotoxic concentrations.
Noggrannheten (77 % – 155/201), sensitiviteten (78 % – 71/91) och specificiteten (76 % – 84/110) för KeratinoSensTM-testet när det gäller att skilja mellan hudsensibiliserande ämnen (dvs. GHS-/CLP-kategori 1) och icke-hudsensibiliserande ämnen jämfört med LLNA-resultat har beräknats med beaktande av all data som lämnats in till EURL ECVAM för utvärderingen och granskningen av testmetoden (14).
Prior to routine use of the ARE-Nrf2 luciferase assay that adheres to this test method, laboratories should demonstrate technical proficiency, using the ten Proficiency Substances listed in Appendix 2.
Dessa siffror liknar nyligen publicerade siffror baserade på intern testning av cirka 145 ämnen (77 % noggrannhet, 79 % sensitivitet, 72 % specificitet) (13).
Performance standards (PS) (28) are available to facilitate the validation of new or modified in vitro ARE-Nrf2 luciferase test methods similar to the KeratinoSens™ assay and allow for timely amendment of this test method for their inclusion.
Det är mer sannolikt att KeratinoSensTM-testet underskattar kemikalier som visar en låg till måttlig hudsensibiliserande styrka (dvs. GHS-/CLP-underkategori 1B) än kemikalier som visar en hög hudsensibiliserande styrka (dvs. GHS/CLP-underkategori 1A) (13) (14).
Mutual Acceptance of Data (MAD) according to the OECD agreement will only be guaranteed for test methods validated according to the PS, if these test methods have been reviewed and included in the corresponding test guideline by OECD.
Sammantaget visar informationen att KeratinoSensTM-testet bidrar till att identifiera risker för hudsensibilisering.
Currently, the only method covered by this test method is the scientifically valid KeratinoSensTM assay (9) (12) (13) (14).
De noggrannhetsvärden som anges här för KeratinoSensTM-testet som en fristående testmetod är dock endast vägledande, eftersom testmetoden bör övervägas i kombination med andra informationskällor inom ramen för en IATA och enligt beskrivningen i punkt 9.
The Standard Operating Procedures (SOP) for the KeratinoSensTM assay is available and should be employed when implementing and using the test method in the laboratory (15).
Vid utvärderingen av testmetoder med avseende på hudsensibilisering utan djurförsök bör man dessutom tänka på att både LLNA och andra djurförsök kanske inte fullständigt avspeglar situationen för de arter som är av intresse, t.ex. människor.
Laboratories willing to implement the test method can obtain the recombinant cell line used in the KeratinoSensTM assay by establishing a licence agreement with the test method developer.
I denna metod avser begreppet ”testkemikalie” endast testade kemikalier.
The following paragraphs provide with a description of the main components and procedures of the ARE-Nrf2 luciferase test method.
Frågan om huruvida testmetoden ARE-Nrf2-luciferas är tillämplig på testning av ämnen och/eller blandningar tas inte upp här.
Preparation of the keratinocyte cultures
De uppgifter som finns tillgängliga för närvarande visar att KeratinoSensTM-testet är tillämpligt på testkemikalier som täcker en rad olika organiska funktionella grupper, reaktionsmekanismer, hudsensibiliseringsstyrkor (detta har fastställts i in vivo-undersökningar) och fysikalisk-kemiska egenskaper (9) (12) (13) (14).
A transgenic cell line having a stable insertion of the luciferase reporter gene under the control of the ARE-element should be used (e.g. the KeratinoSens™ cell line).
De ämnen som testades var främst monokomponentämnen, även om en begränsad datamängd även finns om testning av blandningar (20).
Upon receipt, cells are propagated (e.g. 2 to 4 passages) and stored frozen as a homogeneous stock.
Testmetoden är emellertid tekniskt tillämplig på testning av multikomponentämnen och blandningar.
Cells from this original stock can be propagated up to a maximum passage number (i.e. 25 in the case of KeratinoSensTM) and are employed for routine testing using the appropriate maintenance medium (in the case of KeratinoSensTM this represents DMEM containing serum and Geneticin).
Innan testmetoden används på en blandning i syfte att samla in data för ett lagstadgat ändamål bör man dock överväga om, och i så fall varför, den kommer att ge godtagbara resultat för det syftet.
For testing, cells should be 80-90 % confluent, and care should be taken to ensure that cells are never grown to full confluence.
Vid testning av multikomponentämnen eller blandningar bör man även överväga eventuella störningar av cytotoxiska beståndsdelar i de observerade responserna.
One day prior to testing cells are harvested, and distributed into 96-well plates (10000 cells/well in the case of KeratinoSensTM).
Testmetoden är tillämplig på lösliga testkemikalier eller testkemikalier som bildar en stabil dispersion (dvs. en kolloid eller en lösning i vilken testkemikalien inte stabiliseras eller separeras i olika faser från lösningsmedlet), antingen i vatten eller DMSO (inklusive alla komponenter i testkemikalien vid testning av multikomponentämnen eller blandningar).
Attention should be paid to avoid sedimentation of the cells during seeding to ensure homogeneous cell number distribution across wells.
Testkemikalier som inte uppfyller dessa villkor vid den högsta erforderliga slutkoncentrationen på 2000 μM (jfr punkt 22) kan fortfarande testas vid lägre koncentrationer.
If this is not the case, this step may give raise to high well-to-well variability.
I ett sådant fall kan resultat som uppfyller positivitetskriterierna i punkt 39 fortfarande användas som underlag för att identifiera testkemikalien som hudsensibiliserande.
For each repetition, three replicates are used for the luciferase activity measurements, and one parallel replicate used for the cell viability assay.
Negativa resultat vid koncentrationer på < 1000 μM bör dock anses vara tvetydiga (se prediktionsmodellen i punkt 39).
Preparation of the test chemical and control substances
Vanliga ämnen med en LogP upp till 5 har testats med goda resultat, medan extremt hydrofoba ämnen med en LogP över 7 ligger utanför testmetodens kända tillämplighet (14).
The test chemical and control substances are prepared on the day of testing.
För ämnen med en LogP mellan 5 och 7 finns endast begränsad information tillgänglig.