natgillin/translations-raw huggingface dataset:
However, a chemical that is not predicted as ocular corrosive or severe irritant with the FL test method would need to be tested in one or more additional test methods (in vitro and/or in vivo) that are capable of accurately identifying i) chemicals that are in vitro false negative ocular corrosives/severe irritants in the FL (UN GHS Category 1; EU CLP Category 1; U.S. EPA Category I); ii) chemicals that are not classified for eye corrosion/irritation (UN GHS No Category; EU CLP No Category; U.S. EPA Category IV); and/or iii) chemicals that are moderate/mild eye irritants (UN GHS Categories 2A and 2B; EU CLP Category 2; U.S. EPA Categories II and III).
5–20
The purpose of this test method is to describe the procedures used to evaluate the potential ocular corrosivity or severe irritancy of a test chemical as measured by its ability to induce damage to an impermeable confluent epithelial monolayer.
In vivo-förutsägelserna angående fara (och potential) baseras på LLNA-data (13).
The integrity of trans-epithelial permeability is a major function of an epithelium such as that found in the conjunctiva and the cornea.
In vivo-kraft härleds med användning av de kriterier som föreslagits av ECETOC (24).
Trans-epithelial permeability is controlled by various tight junctions.
En KeratinoSensTM-förutsägelse bör övervägas inom ramen för en IATA och enligt anvisningarna i punkterna 9 och 11 i denna testmetod.
Increasing the permeability of the corneal epithelium in vivo has been shown to correlate with the level of inflammation and surface damage observed as eye irritation develops.
Baserat på historiska observerade värden (12).
In the FL test method, toxic effects after a short exposure time to the test chemical are measured by an increase in permeability of sodium fluorescein through the epithelial monolayer of Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells cultured on permeable inserts.
KVALITETSKONTROLL FÖR LUMINISCENSMÄTNING
The amount of fluorescein leakage that occurs is proportional to the chemical-induced damage to the tight junctions, desmosomal junctions and cell membranes, and can be used to estimate the ocular toxicity potential of a test chemical.
Grundläggande försök för att säkerställa optimala luminiscensmätningar i KeratinoSensTM-testet
Appendix 1 provides a diagram of MDCK cells grown on an insert membrane for the FL test method.
Följande tre parametrar är kritiska för att se till att tillförlitliga resultat erhålls med luminometern:
Definitions are provided in Appendix 2.
Tillräcklig känslighet som ger en stabil bakgrund i kontrollhålen.
This test method is based on the INVITTOX protocol No. 71 (6) that has been evaluated in an international validation study by the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM), in collaboration with the US Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the Japanese Center for the Validation of Alternative Methods (JaCVAM).
Ingen gradient över plattan till följd av långa avläsningsperioder.
The FL test method is not recommended for the identification of chemicals which should be classified as mild/moderate irritants or of chemicals which should not be classified for ocular irritation (substances and mixtures) (i.e. GHS Cat.
Ingen ljusförorening i närliggande hål från starkt aktiva hål.
2A/2B, no category; EU CLP Cat.
Innan testningen inleds bör man ha lämpliga luminiscensmätningar, genom att testa en konfiguration för kontrollplattan enligt beskrivningen nedan (tredubbel analys).
2, no category; US EPA Cat.
Konfiguration för plattan vid första övningsförsöket
II/III/IV), as demonstrated by the validation study (3) (7).
Blankprov
The test method is only applicable to water soluble chemicals (substances and mixtures).
EGDMA etylenglykoldimetakrylat (CAS-nr: 97-90-5) en starkt inducerande kemikalie
The ocular severe irritation potential of chemicals that are water soluble and/or where the toxic effect is not affected by dilution is generally predicted accurately using the FL test method (7).
CA kanelaldehyd, positiv referens (CAS-nr: 104-55-2
To categorise a chemical as water soluble, under experimental conditions, it should be soluble in sterile calcium-containing (at a concentration of 1,0-1,8 mM), phenol red-free, Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) at a concentration ≥ 250 mg/ml (one dose above the cut-off of 100 mg/ml).
Kvalitetskontrollanalysen bör visa följande:
However, if the test chemical is soluble below the concentration 100 mg/ml, but already induces a FL induction of 20 % at that concentration (meaning FL20 < 100 mg/ml), it can still be classified as GHS Cat.
En tydlig dos-respons i rad D, med Imax > 20-faldig över bakgrunden (i de flesta fall nås Imax-värden mellan 100 och 300).
1 or EPA Cat.
Ingen dos-respons i raderna C och E (inget induktionsvärde över 1,5 (helst inte över 1,3) på grund av eventuell ljusförorening, särskilt nära starkt aktiva hål i EGDMA-raden.
I.
Ingen statistiskt signifikant skillnad mellan raderna A, B, C, E, F och G (dvs. ingen gradient över plattan).
The identified limitations for this test method exclude strong acids and bases, cell fixatives and highly volatile chemicals from the applicability domain.
Variation i någon av raderna A, B, C, E, F och G, DMSO-hålen i rad H bör vara under 20 % (dvs. stabil bakgrund).
These chemicals have mechanisms that are not measured by the FL test method, e.g. extensive coagulation, saponification or specific reactive chemistries.
B.61 Testmetoden fluoresceinläckage för identifiering av ämnen som är frätande och kraftigt irriterande för ögonen
Other identified limitations for this method are based upon the results for the predictive capacity for coloured and viscous test chemical (7).
Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 460 (2012).
It is suggested that both types of chemicals are difficult to remove from the monolayer following the short exposure period and that predictivity of the test method could be improved if a higher number of washing steps was used.
Testmetoden fluoresceinläckage (FL) är en testmetod in vitro som kan användas under särskilda omständigheter och med specifika begränsningar för att klassificera kemikalier (ämnen och blandningar) som frätande och kraftigt irriterande för ögonen enligt definitionen i FN:s globala harmoniserade system för klassificering och märkning av kemikalier (GHS) (kategori 1), förordning (EG) nr 1272/2008 om klassificering, märkning och förpackning av ämnen och blandningar (CLP-förordningen) [19] (kategori 1) och amerikanska Environmental Protection Agency (EPA) (kategori I) (1)(2).
Based on the purpose of this test method (i.e. to identify ocular corrosives/severe irritants only), false negative rates (see Paragraph 13) are not critical since such chemicals would be subsequently tested with other adequately validated in vitro tests or in rabbits, depending on regulatory requirements, using a sequential testing strategy in a weight of evidence approach (5) (see also paragraphs 3 and 4).
Dessa kemikalier klassificeras som GHS-kategori 1, CLP-kategori 1 eller EPA-kategori I.Även om FL-testmetoden inte anses vara en fullgod ersättning för in vivo-ögontest på kanin, rekommenderas testmetoden som en del av en strategi för stegvis testning när det gäller rättslig klassificering och märkning.
Other identified limitations of the FL test method are based on false negative and false positive rates.
FL-testmetoden rekommenderas som ett inledande steg inom ramen för en uppifrån och ned-strategi för att identifiera frätande/kraftigt irriterande kemikalier, särskilt för begränsade typer av kemikalier (dvs. vattenlösliga ämnen och blandningar) (3)(4).
When used as an initial step within a Top-Down approach to identify water soluble ocular corrosive/severe irritant substances and mixtures (UN GHS Category 1; EU CLP Category 1; U.S. EPA Category I), the false positive rate for the FL test method ranged from 7 % (7/103; UN GHS and EU CLP) to 9 % (9/99; U.S. EPA) and the false negative rate ranged from 54 % (15/28; U.S. EPA) to 56 % (27/48; UN GHS and EU CLP) when compared to in vivo results.
Det är allmänt vedertaget att inget ögonirritationstest in vitro inom överskådlig framtid kommer att kunna ersätta ögontext in vivo (TM B.5 (5)) för att förutsäga alla typer av ögonirritation för olika kemiska klasser.
Chemical groups showing false positive and/or false negative results in the FL test method are not defined here.
Strategiska kombinationer av flera alternativa testmetoder inom ramen för en (differentierad) teststrategi kan dock ersätta ögontest in vivo (4).
Certain technical limitations are specific to the MDCK cell culture.
Uppifrån och ned-strategin (4) är utformad för att användas när en kemikalier, baserat på befintlig information, förväntas ha en hög irritationspotential.
The tight junctions that block the passage of the sodium-fluorescein dye through the monolayer are increasingly compromised with increasing cell passage number.
Baserat på den prediktionsmodell som anges i punkt 35 kan FL-testmetoden identifiera kemikalier med begränsat tillämpningsområde som frätande/kraftigt irriterande för ögonen (GHS-kategori 1, CLP-kategori 1 och EPA-kategori I) utan ytterligare testning.
Incomplete formation of the tight junctions results in increased FL in the non-treated control.
Detsamma antas för blandningar, även om blandningar inte användes i valideringen.
Therefore, a defined permissible maximal leakage in the non-treated controls is important (see paragraph 38: 0 % leakage).
FL-testmetoden kan därför användas för att bestämma hur irriterande/frätande kemikalier är för ögonen enligt den stegvisa teststrategin i TM B.5 (5).
As with all in vitro assays there is the potential for the cells to become transformed over time, thus it is vital that passage number ranges for the assays are stated.
En kemikalie som inte förutsägs vara frätande eller kraftigt irriterande enligt FL-testmetoden måste dock testas enligt en eller flera kompletterande testmetoder (in vitro och/eller in vivo) som gör det möjligt att exakt identifiera i) kemikalier som in vitro ger en falsk negativ respons som frätande/kraftigt irriterande enligt FL (GHS-kategori 1, CLP-kategori 1 och EPA-kategori I), ii) kemikalier som inte är klassificerade som frätande/irriterande (GHS Ingen klassificering, CLP Ingen klassificering och EPA-kategori IV), och/eller iii) kemikalier som är måttligt/milt irriterande (GHS-kategorierna 2A och 2B, CLP-kategori 2 och EPA-kategorierna II och III).
The current applicability domain might be increased in some cases, but only after analysing an expanded data set of studied test chemicals, preferably acquired through testing (3).
Syftet är att beskriva de metoder som används för att utvärdera en testkemikalies potentiellt frätande eller kraftigt irriterande egenskaper på ögon, uppmätta som dess förmåga att orsaka skada på ett impermeabelt konfluent monolager av epitelceller.
This test method will be updated accordingly as new information and data are considered.
Opåverkad permeabilitet är en viktig epitelfunktion, t.ex. i ögats bindhinna (konjunktiva) och hornhinnan.
For any laboratory initially establishing this assay, the proficiency chemicals provided in Appendix 3 should be used.
Epitelets permeabilitet begränsas genom s.k. täta fogar (tight junctions).
Laboratories can use these chemicals to demonstrate their technical competence in performing the FL test method prior to submitting FL assay data for regulatory hazard classification purposes.
Ökad permeabilitet i hornhinnans epitel in vivo kan korreleras med den grad av inflammation och ytskador som observeras när ögonirritationen utvecklas.
The FL test method is a cytotoxicity and cell-function based in vitro assay that is performed on a confluent monolayer of MDCK CB997 tubular epithelial cells that are grown on semi-permeable inserts and model the non-proliferating state of the in vivo corneal epithelium.
I FL-testmetoden mäts toxiska effekter efter en kort tids exponering för testkemikalien i form av en ökning av permeabiliteten hos natriumfluorescein genom epitel-monolagret hos MDCK-celler (Madin-Darby Canine Kidney) som odlas på permeabla insatser.
The MDCK cell line is well established and forms tight junctions and desmosomal junctions similar to those found on the apical side of conjunctival and corneal epithelia.
Den mängd fluoresceinläckage som uppstår är proportionell mot den kemiskt inducerade skadan på de täta fogarna, de desmosomala fogarna och cellmembranen, och kan användas för att uppskatta en testkemikalies toxiska potential.
Tight and desmosomal junctions in vivo prevent solutes and foreign materials penetrating the corneal epithelium.
I tillägg 1 finns ett diagram över MDCK-celler som odlats på ett insatsmembran för FL-testmetoden.
Loss of trans-epithelial impermeability, due to damaged tight junctions and desmosomal junctions, is one of the early events in chemical-induced ocular irritation.
Definitioner av begreppen finns i tillägg 2.
The test chemical is applied to the confluent layer of cells grown on the apical side of the insert.
Testmetoden baserar sig på INVITTOX-protokoll nr 71 (6) som har utvärderats i en internationell valideringsstudie av Europeiska centret för bestämning av alternativa metoder (ECVAM) i samarbete med amerikanska ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) och det japanska centret för validering av alternativa metoder (JaCVAM).
A short 1 min exposure is routinely used to reflect the normal clearance rate in human exposures.
FL-testmetoden rekommenderas inte för identifiering av kemikalier som bör klassificeras som milt/måttligt irriterande eller kemikalier som inte bör klassificeras som ögonirriterande (ämnen och blandningar) dvs. GHS-kategori 2A/2B, Ingen klassificering, CLP-kategori 2, Ingen klassificering och EPA-kategori II/III/IV), vilket har påvisats av valideringsstudien (3) (7).
An advantage of the short exposure period is that water-based substances and mixtures can be tested neat, if they can be easily removed after the exposure period.
Testmetoden är endast tillämplig på vattenlösliga kemikalier (ämnen och blandningar).
This allows more direct comparisons of the results with the chemical effects in humans.
Kraftigt ögonirriterande potential hos vattenlösliga kemikalier och/eller kemikalier vars toxiska effekt inte påverkas av utspädning kan generellt förutsägas korrekt med användning av FL-testmetoden (7).
The test chemical is then removed and the non-toxic, highly fluorescent sodium-fluorescein dye is added to the apical side of the monolayer for 30 minutes.
För att en kemikalie ska kategoriseras som vattenlösning bör den, under försöksbetingelser, vara löslig i steril kalciumhaltig HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) (vid en koncentration på 1,0–1,8 mM), utan fenolrött, vid en koncentration på ≥ 250 mg/ml (en dos över gränsdosen på 100 mg/ml).
The damage caused by the test chemical to the tight junctions is determined by the amount of fluorescein which leaks through the cell layer within a defined period of time.
Om testkemikalien är löslig under 100 mg/ml, men framkallar en FL-induktion på 20 % redan vid den koncentrationen (dvs. FL20 < 100 mg/ml), kan den fortfarande kategoriseras som GHS-kategori 1 eller EPA-kategori I.
The amount of sodium-fluorescein dye that passes through the monolayer and the insert membrane into a set volume of solution present in the well (to which the sodium-fluorescein dye leaks in) is determined by measuring spectrofluorometrically the fluorescein concentration in the well.
De identifierade begränsningarna hos denna testmetod utesluter starka syror och baser, cellfixativ och starkt flyktiga kemikalier från tillämpningsområdet.
The amount of fluorescein leakage (FL) is calculated with reference to fluoresence intensity (FI) readings from two controls: a blank control, and a maximum leakage control.
Sådana kemikalier har mekanismer som inte mäts av FL-testmetoden, t.ex. omfattande koagulering, förtvålning eller specifika reaktiva kemiska egenskaper.
The percentage of leakage and therefore amount of damage to the tight junctions is expressed, relative to these controls, for each of the set concentrations of the test chemical.
Andra identifierade begränsningar hos metoden baseras på resultaten för färgade och viskösa testkemikaliers prediktionsförmåga (7).
Then the FL20 (i.e. concentration that causes 20 % FL relative to the value recorded for the untreated confluent monolayer and inserts without cells), is calculated.
Båda typerna av kemikalier anses vara svåra att avlägsna från monolagret efter den korta exponeringsperioden.
The FL20 (mg/ml) value is used in the prediction model for identification of ocular corrosives and severe irritants (see paragraph 35).
Testmetodens prediktivitet skulle därför kunna förbättras om fler tvättningssteg används.
Preparation of the cellular monolayer
Om man ser till syftet med detta test (dvs. att enbart identifiera ämnen som är frätande eller kraftigt irriterande för ögonen) är falska negativa värden (se punkt 13) inte kritiska, eftersom sådana kemikalier därefter testas med andra tillbörligt validerade in vitro-test eller på kaniner, beroende på kraven i tillämpliga bestämmelser, med tillämpning av en strategi med stegvis testning och enligt principen om sammanvägd bedömning (5) (se även punkterna 3 och 4).
The monolayer of MDCK CB997 cells is prepared using sub-confluent cells growing in cell culture flasks in DMEM/Nutrient Mix F12 (1x concentrate with L-glutamine, 15 mM HEPES, calcium (at a concentration of 1,0-1,8 mM) and 10 % heat-inactivated FCS/FBS).
Andra identifierade begränsningar hos FL-testmetoden baseras på falska negativa och falska positiva värden.
Importantly, all media/solutions used throughout the FL assay should contain calcium at a concentration between 1,8 mM (200 mg/l) and 1,0 mM (111 mg/l) to ensure tight junction formation and integrity.
När FL-metoden används inom ramen för en uppifrån och ned-strategi för att identifiera vattenlösliga ämnen och blandningar som är frätande/kraftigt irriterande för ögonen (GHS-kategori 1, CLP-kategori 1 och EPA-kategori I) sträcker sig de falska positiva värdena för FL-testmetoden från 7 % (7/103, GHS och CLP) till 9 % (9/99, EPA) och de falska värdena från 54 % (15/28, EPA) till 56 % (27/48, GHS och CPL) jämfört med in vivo-resultat.
Cell passage number range should be controlled to ensure even and reproducible tight junctions formation.
Kemikaliegrupper som visar falska positiva och/eller falska negativa resultat i FL-testmetoden definieras inte här.
Preferably, the cells should be within the passage range 3-30 from thawing because cells within this passage range have similar functionality, which aids assay results to be reproducible.
Vissa tekniska begränsningar är specifika för MDCK-cellkulturen.
Prior to performing the FL test method, the cells are detached from the flask by trypsinisation, centrifuged and an appropriate amount of cells is seeded into the inserts placed in 24-well plates (see Appendix 1).
De täta fogar som blockerar passagen för natriumfluoresceinfärgen genom monolagret blir alltmer utsatta när cellpassageantalet ökar.
Twelve mm diameter inserts with membrane of mixed cellulose esters, a thickness of 80-150 μm and a pore size of 0,45 μm, should be used to seed the cells.
Ofullständig information om täta fogar leder till ökad FL i den icke-behandlade kontrollen.
In the validation study, Millicell-HA 12 mm inserts were used.
Därför är det viktigt att fastställa ett maximalt godtagbart läckage i den icke-behandlande kontrollen (se punkt 38: 0 % läckage).
The properties of the insert and membrane type are important as these may affect cell growth and chemical binding.
Precis som för alla in vitro-test kan cellerna transformeras med tiden.
Certain types of chemicals may bind to the Millicell-HA insert membrane, which could affect the interpretation of results.
Därför är det viktigt att ange passageintervall för försöken.
Proficiency chemicals (see Appendix 3) should be used to demonstrate equivalency if other membranes are used.
Det gällande tillämpningsområdet kan utökas i vissa fall, dock endast efter en analys av en expanderad datauppsättning av undersökta testkemikalier, företrädesvis inhämtad genom testning (3).
Chemical binding to the insert membrane is more common for cationic chemicals, such as benzalkonium chloride, which are attracted to the charged membrane (7).
Denna testmetod kommer att uppdateras allteftersom ny information och data övervägs.
Chemical binding to the insert membrane may increase the chemical exposure period, leading to an over-estimation of the toxic potential of the chemical, but can also physically reduce the leakage of fluorescein through the insert by binding of the dye to the cationic chemical bound to the insert membrane, leading to an under-estimation of the toxic potential of the chemical.
Laboratorier som tar denna testmetod i bruk för första gången bör använda de kvalifikationskemikalier som förtecknas i tillägg 3.
This can be readily monitored by exposing the membrane alone to the top concentration of the chemical tested and then adding sodium-fluorescein dye at the normal concentration for the standard time (no cell control).
Laboratorierna kan använda dessa kemikalier för att påvisa sin tekniska kompetens att genomföra FL-test innan det lämnar in FL-testdata avsedda för lagstadgad faroklassificering.
If binding of the sodium-fluorescein dye occurs, the insert membrane appears yellow after the test material has been washed-off.
FL-testmetoden är ett in vitro-test som baseras på cytotoxicitet och cellfunktioner.
Thus, it is essential to know the binding properties of the test chemical in order to be able to interpret the effect of the chemical on the cells.
Det utförs på ett konfluent monolager av tubulära epitelceller av typen MDCK CB997, som odlas på halvgenomträngliga insatser för att återskapa ett icke-spridande tillstånd hos hornhinnans epitel in vivo.
Cell seeding on inserts should produce a confluent monolayer at the time of chemical exposure.
MDCK-cellinjen är väletablerad och bildar täta fogar och desmosomala fogar som liknar de fogar som finns på den apikala sidan av bindhinnans och hornhinnans epitel.
1,6 × 105 cells should be added per insert (400 μl of a cell suspension with a density of 4 × 105 cells / ml).
Täta fogar och desmosomala fogar in vivo förhindrar att lösningar och främmande material penetrerar hornhinnans epitel.
Under these conditions, a confluent monolayer is usually obtained after 96 hours in culture.
Förlust av impermeabilitet hos epitel på grund av skadade täta fogar (tight junctions) och desmosomala fogar är en av de tidiga händelserna i kemiskt inducerad ögonirritation.
Inserts should be examined visually prior to seeding, so as to ensure that any damages recorded at the visual control described at paragraph 30 is due to handling.
Testkemikalien appliceras på ett konfluent cellager som odlas på den apikala sidan av insatsen.
The MDCK cell cultures should be kept in incubators in a humidified atmosphere, at 5 % ± 1 % CO2 and 37 ± 1 °C.
En kort exponeringstid på 1 minut används rutinmässigt för att avspegla normal minskningshastighet vid human exponering.
The cells should be free of contamination by bacteria, viruses, mycoplasma and fungi.
En fördel med den korta exponeringsperioden är att vattenbaserade ämnen och blandningar kan testas rena om de är lätta att avlägsna efter exponeringsperioden.
Application of the Test and Control Chemicals
Detta möjliggör mer direkta jämförelser av resultaten med de kemiska effekterna på människor.
A fresh stock solution of test chemical should be prepared for each experimental run and used within 30 minutes of preparation.
Därefter avlägsnas testkemikalien och en icke-toxisk starkt fluorescerande natriumfluoresceinfärg appliceras på den apikala sidan av monolagret i 30 minuter.
Test chemicals should be prepared in calcium-containing (at a concentration of 1,0-1,8 mM), phenol red-free, HBSS to avoid serum protein binding.
Den skada testkemikalien orsakar på de täta fogarna bestäms av den mängd fluorescein som läcker igenom cellagret under en viss period.