natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Polymerase chain reaction (PCR) analysis
salthalt,
Amplifications were performed using 2,5 μl of the DNA extract in a 50 μl reaction volume using the Idh locus primers (as described by Peichel et al., 2004.
tid mellan provtagningen och användningen i testet.
Current Biology 1:1416-1424):
Om halten löst organiskt kol (DOC) i havsvattenprovet befinns vara hög (punkt 8) rekommenderas att havsvattnet får åldras i cirka en vecka före användning.
Forward primer
Lagra provet under aeroba förhållanden vid testtemperaturen och i mörker eller indirekt ljus.
Reverse primer
Bibehåll de aeroba förhållandena genom skonsam luftning vid behov.
There are numerous suppliers of suitable PCR reagents.
Under åldringsprocessen minskar innehållet av lätt nedbrytbara organiska material.
The method outlined below is that currently used at the Cefas Weymouth laboratory.
I ringtestet (3) framkom det inga skillnader mellan potentialen för nedbrytning i åldrade och nyinsamlade havsvattenprov.
Preparation of the “Reaction Mix” (50 μl per sample):
Före användning ska havsvattnet förbehandlas för att avlägsna grova partiklar, exempelvis genom filtrering genom ett nylonfilter eller grovt pappersfilter (inte membran eller GF/C-filter), eller genom sedimentering och dekantering.
A mastermix is prepared as follows.
Det förfarande som används måste anges.
This can be prepared in advance and stored frozen at – 20 °C until required.
Om man låter vattnet åldras, görs förbehandlingen efter detta.
Make sufficient mastermix for a negative control (molecular biology grade water only).
Stamlösningar för oorganiska näringsämnen
Volume (stock conc.)/ sample
Följande stamlösningar framställs av reagens av analyskvalitet:
® Reaction Buffer
Kaliumdivätefosfat, KH2PO4
Nucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
8,50 g
0,5 μl (25 mM each)
Dikaliumväteortofosfat, K2HPO4
250 μM each
21,75 g
Forward Primer
Dinatriumväteortofosfat dihydrat, Na2HPO4 · 2H2O
0,5μl (0,1 nmol/μl)
33,30 g
Reverse Primer
Ammoniumklorid, NH4Cl
2,0μM
0,50 g
Molecular biology grade water
Lös upp och fyll på till 1 liter med destillerat vatten.
GoTaq polymerase
Kalciumklorid, CaCl2
Dispense 47,5 μl to a labelled 0,5 ml thin walled PCR tube.
27,50 g
Add 2,5 μl of the purified DNA to the appropriately labelled tube.
Magnesiumsulfatheptahydrat, MgSO4 · 7H2O
Repeat for all samples and the negative control.
22,50 g
Over lay with 2 drops of mineral oil.
Järn(III)kloridhexahydrat, FeCl3 · 6H2O
Alternatively, use a thermal cycler with a heated lid.
0,25 g
Close the lids.
Utfällning i lösning (d) kan förebyggas genom tillsats av en droppe koncentrerad HCl eller 0,4 g etylendiamintetraättiksyra (EDTA, dinatriumsalt) per liter.
Samples were denatured in a Peltier PTC-225 thermal cycler at 94 ± 2 °C for 5 minutes followed by 39 cycles of 94 ± 2 °C for 1 minute, 55 ± 2 °C for 1 minute, 72 ± 2 °C for 1 minute, and a final extension of 72 ± 2 °C for 10 minutes.
Om utfällning konstateras i en stamlösning ersätts den med nyberedd lösning.
Preparation of the agarose gel (2 %):
Beredning av testmediet
Traditionally the PCR products are resolved on a 20 % agarose gel containing ethidium bromide.
Tillsätt 1 ml av var och en av stamlösningarna ovan per liter förbehandlat havsvatten.
Capillary based electrophoresis systems can also be used.
Tillsätt inte särskilda inokulat utöver de mikroorganismer som redan finns i havsvattnet.
Weigh 2 g agarose in 100 ml 1 × TAE-buffer
Fastställ (eventuellt) antalet kolonibildande heterotrofer i havsvattentestmediet (och helst också i de ursprungliga havsvattenproverna), t.ex. genom platträkning med marin agar.
Heat in a microwave (ca.
Detta är särskilt lämpligt för prover från kustområden eller förorenade områden.
2-3 min) to dissolve the agarose.
Kontrollera den heterotrofa mikrobiella aktiviteten i havsvattnet genom att utföra ett test med ett referensämne.
Add 2 drops of ethidium bromide final concentration 0,5 μg/ml
Förberedelse av kolvar
Transfer the hot solution into the gel casting equipment.
Se till att alla glaskärl är ytterst noggrant rengjorda men inte nödvändigtvis steriliserade (t.ex. med hjälp av alkoholisk saltsyra), sköljda och torkade före användning för att undvika kontaminering med rester från tidigare tester.
Allow the gel to harden
Kolvarna ska också rengöras före första användningen.
Gel-Electrophoresis:
Utvärdera testämnet i två flaskor samtidigt, tillsammans med en enda kolv för referensämnet.
Transferred the agarose gel to the electrophoresis equipment and submerge in 1 × TAE-buffer
Utför ett blankprov i två exemplar med varken test- eller referensämne för bestämning av analytiska blanklösningar.
Load 20 μl of each sample to a separate well, adding a molecular weight marker (100 bp DNA ladder, Promega) to a spare well.
Lös upp testämnena i testmediet – de kan enkelt tillsättas via en koncentrerad stamlösning – så att man får de önskade startkoncentrationerna, som normalt är 5–40 mg DOC/l.
Electrophoresis is performed at 120 V for 30-45 minutes.
Referensämnet testas normalt vid en startkoncentration motsvarande 20 mg DOC/l.
Visualisation of the amplification products
Se till att salthalten i havsvattenmediet inte ändras avsevärt om stamlösningar av test- och/eller referensämnen används.
If the ethidium bromide was incorporated in to the agarose gel as described above, the DNA products are visualised under a UV source.
Om toxiska effekter kan förväntas eller inte kan uteslutas kan det vara lämpligt att ett hämningsexperiment i två exemplar läggs till i testets utformning.
Alternatively the agarose gel is stained by covering the gel in a dilute solution of ethidium bromide (0,5 μg/ml in water) for 30 minutes prior to visualisation.
Eftersom referensämnets koncentration normalt är densamma som i kontrolltestet (dvs. 20 mg DOC/l) tillsätts test- och referensämnen i samma kärl för att möjliggöra jämförelser.
Appendix 11
Fördela tillräckliga mängder testlösningar i erlenmeyerkolvarna (upp till omkring hälften av flaskvolymen är en lämplig mängd) och lägg därefter ett löst lock på varje kolv (t.ex. aluminiumfolie) som möjliggör gasutbyte mellan kolven och den omgivande luften.
Guidance for artificial fertilisation procedure for the three-spined stickleback
(Bomullspluggar är olämpliga om man använder en DOC-analys).
The purpose of this section is to describe the procedures to obtain fertilised eggs from the three-spined stickleback in view of using them in the FSDT.
Placera kärlen i skakapparaten och skaka dem kontinuerligt vid låg frekvens (t.ex.
Procedures
100 rpm) under hela testet.
Obtaining sperm from the males
Kontrollera temperaturen (15–20 °C med ± 2 °C noggrannhet), och skydda kärlen mot ljus i syfte att undvika tillväxt av alger.
A well-coloured male of the desired population is euthanised.
Se till att luften är fri från giftiga ämnen.
The testes are dissected from each side of the fish.
Fysikalisk-kemiskt kontrolltest (frivilligt)
The testes are generally heavily pigmented, rod shaped structures that are readily apparent at the lateral midline of the body.
Om man misstänker att det förekommer abiotisk nedbrytning eller abiotiska förlustmekanismer, t.ex. hydrolys (ett problem endast i särskilda analyser), avdunstning eller adsorption, är det lämpligt att genomföra ett fysikalisk-kemiskt kontrollexperiment.
Use either of the following methods:
Detta kan göras genom tillägg av kvicksilver(II)klorid (HgCl2) [10] (50–100 mg/l) i kärlen med testämne i syfte att hejda den mikrobiella aktiviteten.
Using a pair of fine scissors, begin at the cloaca and make a 1-1,5 cm incision with a single snip angled at about 45 degrees.
En betydande minskning av DOC eller av det särskilda ämnets koncentration i det fysikalisk-kemiska kontrolltestet tyder på abiotiska elimineringsmekanismer.
Use a scalpel to make a small incision in the side of the fish slightly posterior to the pelvis and just ventral of the lateral plates.
(Om kvicksilverklorid används, bör man ägna särskild uppmärksamhet åt interferenser eller katalysatorförgiftning i DOC-analysen.)
The testes are removed using fine forceps and placed into a petri dish.
Antal kolvar
Each testis is covered with 100 μl freshly made Hank's final solution.
I en typisk testomgång används följande kolvar:
The testes are finely diced by using a razor blade or scalpel.
Kolv 1 & 2 innehåller testämne (testsuspension),
This will release sperm and give the Hank's solution a milky appearance.
Kolv 3 & 4 innehåller endast havsvatten (blank),
The fluid containing sperm is added into a tube, while trying not to include any pieces of testes tissue when pipetting.
Kolv 5 innehåller referensämne (förfarandekontroll),
800 μl of Hank's final solution are added into the tube and mixed well.
Kolv 6 innehåller test- och referensämne (toxicitetskontroll) – frivilligt,
If required, the male can be preserved by fixing in 100 % ethanol or other desired fixative.
Kolv 7 innehåller testämne och steriliseringsämnet (abiotisk steril kontroll) – frivilligt.
This is particularly important if the study is assigning parental origin of offsprings.
Analys av löst organiskt kol (DOC)
Although most of the stock solutions required can be made in advance, stock 5 and subsequently the final solution, should be made up fresh on the day of use.
Under testets gång tas prover med lämpliga intervaller för analys av DOC (tillägg 1).
Stock 1
Ta alltid prover vid testets början (dag 0) och på dag 60.
8,00 g
Minst fem prover totalt krävs för att beskriva nedbrytningens tidsförlopp.
0,40 g
Något bestämt tidsschema för provtagningen kan inte anges eftersom den biologiska nedbrytningshastigheten varierar.
Distilled water (DW)
Bestäm DOC i två exemplar för varje prov.
100 ml
Den erforderliga provmängden beror på analysmetoden (särskild analys), på den använda kolanalysatorn, och på det valda förfarandet (membranfiltrering eller centrifugering) för behandlingen av proverna före kolbestämningen (punkterna 25 och 26).
Stock 2
Se före provtagningen till att testmediet blandats väl och att allt material som sitter fast på kolvens väggar har lösts upp eller suspenderats.
HPO4 (anhydrous)
Membranfiltrera eller centrifugera omedelbart efter provtagningen.
0,358 g
Förvara vid behov de filtrerade eller centrifugerade proverna vid 2–4 °C i upp till 48 timmar, eller under – 18 °C under längre perioder (om det är känt att ämnet kommer att förbli oförändrat ska det surgöras till pH 2 före lagring).
0,60 g
Membranfilter (0,2–0,45 μm) är lämpliga om det kan garanteras att de varken frigör kol eller adsorberar ämnet i filtreringssteget, t.ex. membranfilter av polykarbonat.
Stock 3
Vissa membranfilter är impregnerade med ytaktiva ämnen för hydrofilering, vilket kan leda till att de frigör betydande mängder upplöst kol.
0,72 g
Bearbeta sådana filter genom kokning i avjonat vatten i tre på varandra följande perioder på en timme vardera.
50 ml
Efter kokning lagras filtren i avjonat vatten.
Stock 4
Kassera de första 20 ml av filtratet.
MgSO4.7H2O
Centrifugering av proverna kan väljas som ett alternativ till membranfiltrering.
1,23 g
Centrifugera vid 40000 m.s– 2 (ca 4000 g) i 15 minuter, helst i en kylcentrifug.
Stock 5 (freshly prepared)
Det tycks inte fungera att differentiera mellan totalhalten organiskt kol (TOC) och DOC (TOC/DOC) genom centrifugering vid mycket låga koncentrationer, eftersom antingen alla bakterier inte avlägsnas eller kolet som är en del av bakteriernas cytoplasma återupplöses.
0,35 g
Vid högre testkoncentrationer (> 10 mg C per liter) tycks felen efter centrifugering vara jämförelsevis små.
10 ml
Provtagningsfrekvens
If you already have some of the above salts but with different water content (i.e. 2H2O instead of anhydrous) you can still use it but first adjust weight based on molecular weight).
Om analyserna utförs omedelbart efter provtagningen bör man uppskatta nästa provtagningstid genom att beakta resultatet av den analytiska bestämningen.
For Hank's final solution combine in the following order:
Om proverna bevaras (punkt 24) för analys vid en senare tidpunkt ska man ta fler prover än fem, som är det minsta tillåtna antalet.
stock 1
Om en platå på nedbrytningskurvan iakttas före dag 60 ska testet avslutas.
1,0 ml
Om det på dag 60 är tydligt att nedbrytningen har inletts men inte har nått en platå, ska försöket förlängas med ytterligare en tidsperiod.
stock 2
Registrera analysresultaten på bifogade resultatformulär (tillägg 2) och beräkna bionedbrytningsvärdena både för test- och referensämnena med följande ekvation:
0,1 ml
nedbrytning i procent DOC eller eliminering av ett särskilt ämne vid tidpunkten t,
stock 3
startkoncentration för DOC eller det särskilda ämnet i testmediet,
8,6 ml
koncentration för DOC eller det särskilda ämnet i testmediet vid tidpunkten t,
stock 4
startkoncentration för DOC eller det särskilda ämnet i blankprovet,
stock 5
koncentration för DOC eller det särskilda ämnet i blankprovet vid tidpunkten t.
Mix well before use.
Ange nedbrytningen som procentandelen DOC som har eliminerats (fullständig nedbrytning) eller av det särskilda ämne som har eliminerats (primär nedbrytning) vid tidpunkten t.
Fertilisation
Beräkna DOC-koncentrationerna till närmaste 0,1 mg per liter, och avrunda medelvärdena för Dt-värdena till närmaste hela procent.
Large, gravid females are identified from the desired population;
Testrapporten måste innehålla följande information:
females are ready for squeezing only when you can see eggs protruding from the cloaca.
Testämne:
Ready females have the characteristic “head up” posture.
fysikalisk form och, när så är tillämpligt, fysikalisk-kemiska egenskaper,
Gently run a finger or thumb down the side of the fish towards the tail to encourage the expulsion of an egg sack into a fresh petri dish.
identifikationsuppgifter.
Repeat on the other side and return the fish to its tank.
beskrivning av provtagningsstället och dess läge:
The eggs can be spread out (forming a monolayer) using a fine paintbrush.
förorenings- och näringsstatus (koloniräkning, nitrat, ammonium, fosfat i tillämpliga fall),
It is important to try and expose as many eggs as possible to the sperm so maximising the surface area of the eggs is helpful.
beskrivning av provet (datum för provtagning, djup, utseende, temperatur, salthalt, DOC (frivillig uppgift), tid mellan provtagning och användning i testet),
Keep the eggs humid by laying damp tissue around them (it is important the eggs do not touch water directly as this can prematurely harden the chorion preventing fertilisation).
metod som används (i förekommande fall) för åldrande av havsvatten,
There is a large variation in the number of eggs each female can produce but as an average, about 150 eggs should be easily obtained from a single gravid female.
metod som används för förbehandling (filtrering/sedimentering) av havsvattnet,
of sperm in Hank's mixture is spread evenly over the whole surface of the eggs using the paintbrush.
metod som används för bestämning av DOC,
The eggs will quickly harden and change colour (within a minute) once fertilisation has begun.
metod som används för särskild analys (frivillig uppgift),
If the estimated number of eggs is more than 150, repeat the procedure.
metod som används för att fastställa antalet heterotrofer i havsvattnet (platträkning eller alternativt förfarande) (frivilligt),
Similarly if the eggs don't harden within a minute add a bit more sperm.
andra metoder (frivillig uppgift) som används för att karakterisera havsvattnet (mätning av ATP-halten osv.).
Adding more sperm does not necessarily improve fertilisation rate.
analysdata rapporteras på ett resultatformulär (tillägg 2),
The eggs and the sperm solution should be left to “interact” for at least 15 minutes and the fertilised eggs should be placed into the exposure aquaria within 1,5 hours post fertilisation.
nedbrytningstestets förlopp illustreras grafiskt i ett diagram som visar lagfasen (tL), lutningen och den tid det tar (från lagfasens slut) för att nå 50 procents eliminering (t50).
The procedure is repeated using another female until the desired number of eggs is collected.
Lagfasen kan uppskattas grafiskt såsom visas i figuren i avsnittet ’Resultatens giltighet och deras tolkning’ eller kan lämpligen antas vara den tid som krävs för 10 procents nedbrytning,
Spare few eggs from the last batch and fix them in 10 % acetic acid.
den procentuella nedbrytningen mäts efter 60 dagar, eller vid testets avslutning.
Counting and distributing eggs in test aquaria
Diskussion av resultaten.
Eggs should be evenly distributed between each treatment level to avoid genetic bias.
Resultatens giltighet och deras tolkning
Each batch of fertilised eggs should be separated into equal size groups (as many as the treatment levels) by the use of a blunt instrument (i.e. wide-blade entomology forceps or use of an inoculation loop).
De resultat som erhålls med referensämnen, t.ex. natriumbensoat, natriumacetat och anilin, bör vara jämförbara med resultaten i ringtestet (3) (se avsnittet om ’Referensämnen’, punkt 7).
If you aim for 4 replicates per treatment, with 20 eggs each then you need to distribute 80 eggs per exposure aquaria.
Om de resultat som erhållits med referensämnen är atypiska bör testet upprepas med ett annat havsvattenprov.
It is advisable to add an extra 20 % (i.e. 96 eggs per treatment level) until you are confident that you obtain 100 % fertilisation rates.
Resultaten från hämningstester är inte alltid lätta att tolka på grund av att testämnet bidrar till DOC, men en betydande minskning av den totala graden av DOC-eliminering jämfört med kontrollen är ett positivt tecken på toxiska effekter.
Stickleback eggs are very prone to fungal infections outside the father-guarded nest.
På grund av de relativt höga testkoncentrationer som används jämfört med de koncentrationer som förekommer i de flesta naturliga system (och följaktligen ett ogynnsamt förhållande mellan testämnens och andra kolkällors koncentrationer) bör metoden betraktas som ett preliminärt test som kan användas för att ge en antydan om huruvida ett ämne är lätt biologiskt nedbrytbart.
In this respect, treatment of all eggs with methylene blue during the first 5 days of the test is critically important.
Ett lågt resultat behöver därför inte nödvändigtvis betyda att testämnet inte är bionedbrytbart i marina miljöer, men visar att det krävs mer arbete för att detta förhållande ska kunna fastställas.
A stock solution of methylene blue is prepared at 1 mg/ml and added to the exposure aquaria to give a maximum final concentration of 2,125 mg/l.
Icke-parametriska tester
Sticklebacks should not be exposed to methylene blue once hatched so the system should be free of methylene blue by day 6.
Denna metod är en havsvattenvariant av closed bottle-testet (5), och fick slutligt godkännande efter ett ringtest som organiserades för Europeiska kommissionen (EC) av det danska vattenkvalitetsinstitutet (3).
The eggs are inspected daily and any dead or unfertilised eggs are recorded as such.
I likhet med den åtföljande marina skakkolvmetoden ska resultaten från detta test inte uppfattas som indikationer på lätt bionedbrytbarhet, utan ska uttryckligen användas för att skaffa information om bionedbrytbarheten för ämnen i marina miljöer.
The eggs should never be outside water until they hatch even for very brief periods.
Ett förutbestämd mängd av testämnet upplöses i testmediet med en koncentration på vanligen 2–10 mg testämne per liter (en eller flera koncentrationer kan användas).
Hank's Buffered Salt Solution (HBSS):HBSS is needed to preserve the sperm whilst preparing for fertilisation.
Lösningen förvaras i en fylld försluten kolv i mörker i ett bad eller rum med konstant temperatur på 15–20 °C med en variation på högst ± 1 °C.
C.42 BIODEGRADABILITY IN SEAWATER
Om syftet med undersökningen är att simulera situationer i miljön kan testerna utföras bortom detta normala temperaturintervall förutsatt att lämpliga justeringar görs för temperaturreglering.
GENERAL INTRODUCTION
Nedbrytningen följs med hjälp av syreanalyser under en 28-dagarsperiod.
This test method is equivalent to OECD Test Guideline (TG) 306 (1992).
Ringtestet visade att om testet förlängdes efter 28 dagar kunde i de flesta fall ingen användbar information inhämtas på grund av allvarliga störningar.
When the original test methods were developed, it was not known to what extent results from the screening tests for ready biodegradability using freshwater, and sewage effluent or activated sludge as inoculum, could be applied to the marine environment.
Värdena för den biokemiska syreförbrukningen (BOD) i blankprovet var mycket höga, förmodligen på grund av algväxt på kärlets väggar som orsakades av brist på skakning, och på grund av nitrifikation.
Variable results on this point have been reported (e.g. (1)).
Den rekommenderade varaktigheten är därför 28 dagar, men om BOD-värdet i blankprovet håller sig inom 30-procentsgränsen (punkterna 15 och 40) kan testet förlängas.
Many industrial waste waters, containing a variety of chemicals, reach the sea either by direct discharge or via estuaries and rivers in which the residence times are low compared with the period necessary for complete biodegradation of many of the chemicals present.
Man måste ha den empiriska formeln så att den teoretiska syreförbrukningen (ThOD) kan beräknas (se tillägg 3).
Because of the growing awareness of the need to protect the marine environment against increasing loads of chemicals and the need to estimate the probable concentration of chemicals in the sea, test methods for biodegradability in seawater have been developed.
I annat fall måste ämnets kemiska syreförbrukning (COD) fastställas och tjäna som referensvärde.
The methods described here use natural seawater both as the aqueous phase and as the source of micro-organisms.
Användningen av COD är mindre tillfredsställande eftersom vissa ämnen inte oxideras helt i COD-testet.
In an endeavour to conform with the methods for ready biodegradability in freshwater, the use of ultra-filtered and centrifuged seawater was investigated, as was the use of marine sediments as inocula.
Ämnets löslighet bör vara minst 2 mg/l, men i princip kan mindre lösliga ämnen testas (t.ex. med hjälp av ultrasonikering), liksom flyktiga ämnen.
These investigations were unsuccessful.
Information om testämnets toxicitet för bakterier, t.ex. uppmätt i kortvariga respirationstester (4), kan vara mycket användbar vid valet av lämpliga testkoncentrationer och kan vara väsentlig när det gäller den korrekta tolkningen av låga värden för biologisk nedbrytbarhet.
The test medium therefore is natural seawater pre-treated to remove coarse particles.
Sådan information är dock inte alltid tillräcklig för tolkning av resultaten från testet av biologisk nedbrytbarhet, och det förfarande som beskrivs i punkt 27 är lämpligare.
In order to assess ultimate biodegradability with the Shake Flask Method, relatively high concentrations of the test substance have to be used because of the poor sensitivity of the dissolved organic carbon (DOC) analytical method.
Anilin, natriumacetat eller natriumbensoat (exempelvis) kan användas för detta ändamål.
This in turn necessitates the addition to the seawater of mineral nutrients (N and P), the low concentrations of which would otherwise limit the removal of DOC.
En nedbrytning av dessa ämnen på minst 60 procent (av deras ThOD) måste äga rum inom en rimligt kort tidsperiod, annars rekommenderas att testet upprepas med ett annat havsvattenprov.
It is also necessary to add the nutrients in the Closed Bottle Method because of the concentration of the added test substance.
I kommissionens ringtest, där havsvattenprover togs på olika platser och vid olika tider på året, var lagfasen (tL) och den tid som behövdes för att uppnå en 50-procentig nedbrytning (t50) exklusive lagfasen 0–2 dagar respektive 1–4 dagar för natriumbensoat.
Hence, the methods are not tests for ready biodegradability since no inoculum is added in addition to the micro-organisms already present in the seawater.
För anilin var tL och t50-värdena 0–7 respektive 2–12 dagar.
Neither do the tests simulate the marine environment since nutrients are added and the concentration of test substance is very much higher than would be present in the sea.
REPRODUCERBARHET
For these reasons the methods are proposed under a new subsection “Biodegradability in Seawater”.
Metodernas reproducerbarhet fastställdes i kommissionens ringtest (3).