natgillin/translations-raw huggingface dataset:
The HPLC set-up described in the validated protocol uses a Zorbax SB-C-18 2,1 mm × 100 mm × 3,5 micron as preferred column.
Beredning av testkemikalien
With this reversed-phase HPLC column, the entire system should be equilibrated at 30 °C with 50 % phase A (0,1 % (v/v) trifluoroacetic acid in water) and 50 % phase B (0,085 % (v/v) trifluoroacetic acid in acetonitrile) for at least 2 hours before running.
Testkemikaliens löslighet i ett lämpligt lösningsmedel bör bedömas innan försöket utförs.
The HPLC analysis should be performed using a flow rate of 0,35 ml/min and a linear gradient from 10 % to 25 % acetonitrile over 10 minutes, followed by a rapid increase to 90 % acetonitrile to remove other materials.
Bedömningen bör göras enligt det upplösningsförfarande som beskrivs i DPRA DB-ALM-protokollet (20).
Equal volumes of each standard, sample and control should be injected.
Testkemikalien löses upp fullständigt med ett lämpligt lösningsmedel.
The column should be re-equilibrated under initial conditions for 7 minutes between injections.
Eftersom testkemikalien i DPRA-testet inkuberas i ett stort överskott av antingen cystein- eller lysinpeptider anses en visuell kontroll av bildningen av en klar lösning vara tillräcklig för att fastställa att testkemikalien (och alla dess komponenter vid testning av ett multikomponentämne eller en blandning) har lösts upp.
If a different reversed-phase HPLC column is used, the set-up parameters described above may need to be adjusted to guarantee an appropriate elution and integration of the cysteine and lysine peptides, including the injection volume, which may vary according to the system used (typically in the range from 3-10 μl).
Lämpliga lösningsmedel är acetonitril, vatten, 1:1 blandning vatten och acetonitril, isopropanol, aceton eller 1:1 blandning aceton och acetonitril.
Importantly, if an alternative HPLC set-up is used, its equivalence to the validated set-up described above should be demonstrated (e.g. by testing the proficiency substances in Appendix 2).
Andra lösningsmedel kan användas om de inte inverkar på peptidens stabilitet, vilket övervakas med referenskontroller (dvs. prover av enbart peptiden löses upp i det berörda lösningsmedlet, se tillägg 3).
Absorbance is monitored at 220 nm.
Om testkemikalien inte är löslig i några av dessa lösningsmedel bör man som ett sista alternativ försöka att lösa upp den i 300 μL DMSO och späda ut den lösningen med 2700 μL acetonitril.
If a photodiode array detector is used, absorbance at 258 nm should also be recorded.
Om testkemikalien inte är löslig i den blandningen heller bör man försöka lösa upp samma mängd av testkemikalien i 1500 μL DMSO och späda ut den lösningen med 1500 μL acetonitril.
It should be noted that some supplies of acetonitrile could have a negative impact on peptide stability and this has to be assessed when a new batch of acetonitrile is used.
Testkemikalien bör vägas i förväg i glasflaskor och lösas upp omedelbart före testning i ett lämpligt lösningsmedel för att bereda en lösning på 100 mM.
The ratio of the 220 peak area and the 258 peak area can be used as an indicator of co-elution.
För blandningar och multikomponentämnen med känd sammansättning bör man fastställa en enda renhetsgrad genom summan av andelen av dess beståndsdelar (förutom vatten) samt en enda uppskattad molekylärvikt med hänsyn till individuell molekylärvikt för varje komponent i blandningen (förutom vatten) och deras individuella andelar.
For each sample a ratio in the range of 90 % < mean [13] area ratio of control samples < 100 % would give a good indication that co-elution has not occurred.
Den resulterande renhetsgraden och uppskattade molekylärvikten bör sedan användas för att beräkna den vikt av testkemikalien som krävs för att bereda en lösning på 100 mM.
There may be test chemicals which could promote the oxidation of the cysteine peptide.
När det gäller polymerer för vilka det inte går att fastställa en dominerande molekylärvikt bör monomerens molekylärvikt (eller den uppskattade molekylärvikten för de olika monomerer som utgör polymeren) övervägas för beredningen av lösningen på 100 mM.
The peak of the dimerised cysteine peptide may be visually monitored.
Vid testning av blandningar, multikomponentämnen eller polymerer med känd sammansättning bör man även överväga att testa den rena kemikalien.
If dimerisation appears to have occurred, this should be noted as percent peptide depletion may be over-estimated leading to false positive predictions and/or assignment to a higher reactivity class (see paragraphs 29 and 30).
För flytande kemikalier bör den rena kemikalien testas som den är: utan föregående utspädning genom inkubation med cystein- respektive lysinpeptiderna vid molförhållandena 1:10 och 1:50.
HPLC analysis for the cysteine and lysine peptides can be performed concurrently (if two HPLC systems are available) or on separate days.
För fasta kemikalier bör testkemikalien lösas upp i sin högsta lösningsbara koncentration i samma lösningsmedel som använts för att bereda 100 mM-lösningen.
If analysis is conducted on separate days then all test chemical solutions should be freshly prepared for both assays on each day.
Den bör sedan testas som den är: utan ytterligare utspädning genom inkubation med cystein- respektive lysinpeptiderna vid förhållandena 1:10 och 1:50.
The analysis should be timed to assure that the injection of the first sample starts 22 to 26 hours after the test chemical was mixed with the peptide solution.
Överensstämmande resultat (reaktiva och icke-reaktiva) mellan 100 mM-lösningen och den rena kemikalien bör möjliggöra en definitiv slutsats om resultatet.
For the HPLC set up used in the validation study and described in this test method, up to 26 analysis samples can be accommodated in a single HPLC run (see also paragraph 17).
Beredning av den positiva kontrollen, referenskontrollerna och kontrollerna av sameluering
An example of HPLC analysis sequence is provided in Appendix 3.
Kanelaldehyd (CAS 104-55-2, ≥ 95 % livsmedelskvalitet) bör användas som positiv kontroll vid en koncentration på 100 mM i acetonitril.
Data evaluation
Andra lämpliga positiva kontroller som företrädesvis ger minskningsvärden i mitten av intervallet kan användas om historiska data finns tillgängliga för att härleda jämförbara acceptanskriterier.
The concentration of cysteine or lysine peptide is photometrically determined at 220 nm in each sample by measuring the peak area (area under the curve, AUC) of the appropriate peaks and by calculating the concentration of peptide using the linear calibration curve derived from the standards.
Dessutom bör även referenskontroller (dvs. prover som endast innehåller peptiden upplöst i lämpligt lösningsmedel) ingå i HPLC-körningssekvensen.
The percent peptide depletion is determined in each sample by measuring the peak area and dividing it by the mean peak area of the relevant reference controls C (see Appendix 3) according to the formula described below.
Referenskontroller används för att kontrollera HPLC-systemets lämplighet före analysen (referenskontroller A), referenskontrollernas stabilitet över tiden (referenskontroller B) samt för att kontrollera att det lösningsmedel som används för att lösa upp testkemikalien inte påverkar procentvärdet för peptidens minskning (referenskontroller C) (se tillägg 3).
Percent peptide depletion
Lämpliga referenskontroller för varje kemikalie används för att beräkna procentvärdet för peptidens minskning för den kemikalien (se punkt 26).
Peptide peak area in replicate injection
Dessutom bör en samelueringskontroll bestående av endast testkemikalien för varje analyserad testkemikalie ingå i körningssekvensen för att upptäcka eventuell sameluering av testkemikalien med antingen lysin- eller cysteinpeptiden.
ean peptide peak area in reference controls C
Inkubation av testkemikalien med cystein- och lysinpeptidlösningar
Acceptance criteria
Cystein- och lysinpeptidlösningarna bör inkuberas i autosampler-glasflaskor med testkemikalien vid ett förhållande på 1:10 respektive 1:50.
The following criteria should be met for a run to be considered valid:
Om en fällning omedelbart observeras när lösningen med testkemikalien tillsätts peptidlösningen på grund av att testkemikalien har en låg upplösning i vatten, kan man inte vara säker på hur stor mängd av testkemikalien som finns kvar i lösningen för att reagera med peptiden.
the standard calibration curve should have an r2 > 0,99,
I ett sådant fall kan ett positivt resultat fortfarande användas, men ett negativt resultat är osäkert och bör tolkas med vederbörlig försiktighet (se även anvisningarna i punkt 11 om testning av kemikalier som inte är lösliga upp till en lösning på 100 mM).
the mean percent peptide depletion value of the three replicates for the positive control cinnamic aldehyde should be between 60,8 % and 100 % for the cysteine peptide and between 40,2 % and 69,0 % for the lysine peptide and the maximum standard deviation (SD) for the positive control replicates should be < 14,9 % for the percent cysteine depletion and < 11,6 % for the percent lysine depletion, and
Reaktionslösningen bör förvaras i mörker vid 25 ± 2,5 °C i 24 ± 2 timmar innan HPLC-analysen körs.
the mean peptide concentration of reference controls A should be 0,50 ± 0,05 mM and the coefficient of variation (CV) of peptide peak areas for the nine reference controls B and C in acetonitrile should be < 15,0 %.
Varje testkemikalie bör analyseras tre gånger för båda peptiderna.
If one or more of these criteria is not met the run should be repeated.
Proverna ska kontrolleras visuellt före HPLC-analysen.
The following criteria should be met for a test chemical's results to be considered valid:
Beredning av standardkalibreringskurvan för HPLC
the maximum standard deviation for the test chemical replicates should be < 14,9 % for the percent cysteine depletion and < 11,6 % for the percent lysine depletion,
En standardkalibreringskurva bör genereras för både cystein- och lysinpeptiderna.
the mean peptide concentration of the three reference controls C in the appropriate solvent should be 0,50 ± 0,05 mM.
Peptidstandarderna bör beredas i en lösning av 20 % eller 25 % acetonitrilbuffert med användning av fosfatbuffert (pH 7,5) för cysteinpeptiden och ammoniumacetatbuffert (pH 10,2) för lysinpeptiden.
If these criteria are not met the data should be rejected and the run should be repeated for that specific test chemical.
Om serieutspädningsstandarder används för peptidstamlösningen (0,667 mM) bör sex kalibreringslösningar beredas för att täcka intervallet från 0,534 till 0,0167 mM.
Prediction model
Ett blankprov av utspädningsbufferten bör också ingå i standardkalibreringskurvan.
The mean percent cysteine and percent lysine depletion value is calculated for each test chemical.
Kalibreringskurvorna bör ha en r2 > 0,99.
Negative depletion is considered as “0” when calculating the mean.
Förberedelse av HPLC och HPLC-analys
By using the cysteine 1:10/lysine 1:50 prediction model shown in Table 1, the threshold of 6,38 % average peptide depletion should be used to support the discrimination between skin sensitisers and non-sensitisers in the framework of an IATA.
HPLC-systemets lämplighet bör kontrolleras innan analysen utförs.
Application of the prediction model for assigning a test chemical to a reactivity class (i.e. low, moderate and high reactivity) may perhaps prove useful to inform potency assessment within the framework of an IATA.
Peptidernas minskning övervakas av HPLC kombinerat med en UV-detektor (detektor med fotodiodkretsar eller en detektor med våglängdsabsorption med en signal på 220 nm).
Cysteine 1:10/lysine 1:50 prediction model [14]
En lämplig kolonn installeras i HPLC-systemet.
Mean of cysteine and lysine % depletion
Den HPLC-konfiguration som beskrivs i det validerade protokollet använder en Zorbax SB-C-18 2,1 mm × 100 mm × 3.5 mikron som föredragen kolonn.
Reactivity Class
Med denna HPLC-kolonn med omvänd fas bör hela systemet bringas i jämvikt vid 30 °C med 50 % fas A (0,1 % (v/v) trifluorättiksyra i vatten) och 50 % fas B (0,085 % (v/v) trifluorättiksyra i acetonitril) i minst två timmar före körning.
DPRA Prediction [15]
HPLC-analysen bör utföras med hjälp av en flödeshastighet på 0,35 ml/min och en linjär gradient från 10 % till 25 % acetonitril under 10 minuter, följt av en snabb ökning till 90 % acetonitril för att avlägsna andra material.
0 % ≤ mean % depletion ≤ 6,38 %
Lika stora volymer av varje standard, prov och kontroll bör injiceras.
No or minimal reactivity
Kolonnen bör omkalibreras under initiala förhållanden i sju minuter mellan injektionerna.
Negative
Om en annan HPLC-kolonn med omvänd fas används kan de konfigurationsparametrar som beskrivs ovan behöva justeras för att garantera lämplig eluering och integration av cystein- och lysinpeptiderna, inklusive injektionsvolymen, som kan variera beroende på använt system (vanligen i intervallet 3–10 μl).
6,38 % < mean % depletion ≤ 22,62 %
Om en alternativ HPLC-konfiguration används är det viktigt att laboratoriet visar att den motsvarar den validerade konfiguration som beskrivs ovan (t.ex. genom att testa kvalifikationsämnena i tillägg 2).
Low reactivity
Absorbansen övervakas vid 220 nm.
Positive
Om en detektor med fotodiodkretsar används ska absorbans vid 258 nm också registreras.
22,62 % < mean % depletion ≤ 42,47 %
Det bör noteras att vissa acetonitrilpartier kan ha en negativ inverkan på peptidernas stabilitet.
Moderate reactivity
Detta måste bedömas när en ny acetonitrilsats används.
42,47 % < mean % depletion ≤ 100 %
Förhållandet mellan topparean vid 220 och topparean vid 258 kan användas som en indikator på sameluering.
High reactivity
För varje prov ger ett förhållande i intervallet 90 % < medelvärdet [13] för kontrollprovernas topparea < 100 % en god indikation på att sameluering inte har förekommit.
There might be cases where the test chemical (the substance or one or several of the components of a multi-constituent substance or a mixture) absorbs significantly at 220 nm and has the same retention time of the peptide (co-elution).
Vissa testkemikalier kan få cysteinpeptiden att oxidera.
Co-elution may be resolved by slightly adjusting the HPLC set-up in order to further separate the elution time of the test chemical and the peptide.
Toppen på den dimeriserade cysteinpeptiden kan övervakas visuellt.
If an alternative HPLC set-up is used to try to resolve co-elution, its equivalence to the validated set-up should be demonstrated (e.g. by testing the proficiency substances in Appendix 2).
Om dimerisering tros ha förekommit bör detta registreras eftersom procentvärdet för peptidens minskning kan överskattas, vilket leder till falska positiva förutsägelser och/eller till att kemikalien anvisas en högre reaktivitetsklass (se punkterna 29 och 30).
When co-elution occurs the peak of the peptide cannot be integrated and the calculation of the percent peptide depletion is not possible.
HPLC-analysen av cystein- och lysinpeptiderna kan utföras parallellt (om två HPLC-system finns tillgängliga) eller olika dagar.
If co-elution of such test chemicals occurs with both the cysteine and the lysine peptides then the analysis should be reported as “inconclusive”.
Om analysen utförs olika dagar ska nya testkemikalielösningar beredas för båda försöken varje dag.
In cases where co-elution occurs only with the lysine peptide, then the cysteine 1:10 prediction model reported in Table 2 can be used.
Analysen bör planeras för att säkerställa att injiceringen av det första provet startar 22 till 26 timmar efter det att testkemikalien blandades med peptidlösningen.
Cysteine 1:10 prediction model [16]
När det gäller den HPLC-konfiguration som används i valideringsstudien och som beskrivs i denna testmetod kan man samla upp till 26 analysprover i en enda HPLC-körning (se även punkt 17).
Cysteine (Cys) % depletion
Ett exempel på en HPLC-analyssekvens ges i tillägg 3.
Reactivity class
Utvärdering av data
DPRA prediction [17]
Koncentrationen av cystein- eller lysinpeptiderna fastställs fotometriskt vid 220 nm i varje prov genom mätning av topparean (Area Under the Curve, AUC) för lämpliga toppar och genom beräkning av peptidkoncentrationen med användning av den linjära kalibreringskurva som härrörts från standarderna.
0 % ≤ Cys % depletion ≤ 13,89 %
Procentvärdet för peptidens minskning fastställs i varje prov genom att topparean mäts och divideras med medelvärdet för topparean för relevanta referenskontroller (se tillägg 3) enligt den formel som beskrivs nedan.
13,89 % < Cys % depletion ≤ 23,09 %
Procent peptidminsking
23,09 % < Cys % depletion ≤ 98,24 %
peptidens topparea i replikatinjektion
98,24 % < Cys % depletion ≤ 100 %
peptidens genomsnittliga topparea i referenskontroller C
There might be other cases where the overlap in retention time between the test chemical and either of the peptides is incomplete.
Kriterier för godkännande
In such cases percent peptide depletion values can be estimated and used in the cysteine 1:10/lysine 1:50 prediction model, however assignment of the test chemical to a reactivity class cannot be made with accuracy.
Följande kriterier bör uppfyllas för att en körning ska anses vara giltig:
A single HPLC analysis for both the cysteine and the lysine peptide should be sufficient for a test chemical when the result is unequivocal.
Standardkalibreringskurvan ska ha en r2 > 0,99.
However, in cases of results close to the threshold used to discriminate between positive and negative results (i.e. borderline results), additional testing may be necessary.
Procentmedelvärdet för peptidernas minskning för de tre replikaten i den positiva kontrollen med kanelaldehyd bör vara mellan 60,8 % och 100 % för cysteinpeptider och mellan 40,2 % och 69,0 % för lysinpeptider.
If situations where the mean percent depletion falls in the range of 3 % to 10 % for the cysteine 1:10/lysine 1:50 prediction model or the cysteine percent depletion falls in the range of 9 % to 17 % for the cysteine 1:10 prediction model, a second run should be considered, as well as a third one in case of discordant results between the first two runs.
Högsta standardavvikelse (SD) för det positiva kontrollreplikatet bör vara < 14,9 % för procentvärdet för minskning av cystein och < 11,6 % för procentvärdet för minskning av lysin.
The test report should include the following information
Medelvärdet för peptidkoncentrationen i referenskontrollerna A bör vara 0,50 ± 0,05 mM och koefficientvariationen (CV) för peptidernas toppareor för de nio referenskontrollerna B och C i acetonitril bör vara < 15,0 %.
Mono-constituent substance
Om ett eller flera av dessa kriterier inte är uppfyllt bör körningen göras om.
Chemical identification, such as IUPAC or CAS name(s), CAS number(s), SMILES or InChI code, structural formula, and/or other identifiers;
Följande kriterier bör uppfyllas för att testresultatet för testkemikalien ska anses vara giltigt:
Physical appearance, water solubility, molecular weight, and additional relevant physicochemical properties, to the extent available;
Högsta standardavvikelse för testkemikaliereplikaten bör vara < 14,9 % för procentvärdet för minskning av cystein och < 11,6 % för procentvärdet för minskning av lysin.
Purity, chemical identity of impurities as appropriate and practically feasible, etc;
Peptidkoncentrationens medelvärde för de tre referenskontrollerna C i lämpligt lösningsmedel bör vara 0,50 ± 0,05 mM.
Treatment prior to testing, if applicable (e.g. warming, grinding);
Om dessa kriterier inte är uppfyllda bör data förkastas och körningen bör göras om för den specifika testkemikalien.
Concentration(s) tested;
Prediktionsmodell
Storage conditions and stability to the extent available.
Procentmedelvärdet för minskning av cystein och lysin beräknas för varje testkemikalie.
Multi-constituent substance, UVCB and mixture:
Negativ minskning anses vara ”0” när medelvärdet beräknas.
Characterisation as far as possible by e.g. chemical identity (see above), purity, quantitative occurrence and relevant physicochemical properties (see above) of the constituents, to the extent available;
Genom att använda den prediktionsmodell med cystein 1:10/lysin 1:50 som visas i tabell 1 bör gränsvärdet 6,38 % för genomsnittlig minskning av peptiden användas för att skilja mellan hudsensibiliserande och icke-hudsensibiliserande kemikalier inom ramen för en IATA.
Physical appearance, water solubility and additional relevant physicochemical properties, to the extent available;
Prediktionsmodellen kan användas för att tilldela testkemikalien en reaktivitetsklass (dvs. låg, måttlig och hög reaktivitet) som underlag för bedömningen av sensibiliseringspotential inom ramen för en IATA.
Molecular weight or apparent molecular weight in case of mixtures/polymers of known compositions or other information relevant for the conduct of the study;
Prediktionsmodell [14] för cystein 1:10/lysin 1:50
Storage conditions and stability to the extent available;
Medelvärde i procent för minskning av cystein och lysin
Reference to historical positive control results demonstrating suitable run acceptance criteria, if applicable.
Reaktivitetsklass
Solvent/vehicle used and ratio of its constituents, if applicable;
DPRA-förutsägelse [15]
Chemical identification(s), such as IUPAC or CAS name(s), CAS number(s), and/or other identifiers;
0 % ≤ medelvärde % minskning ≤ 6,38 %
Physical appearance, molecular weight, and additional relevant physicochemical properties in the case other solvents / vehicles than those mentioned in the test method are used and to the extent available;
Ingen eller minimal reaktivitet
Justification for choice of solvent for each test chemical;
Negativ
For acetonitrile, results of test of impact on peptide stability.
6,38 % < medelvärde % minskning ≤ 22,62 %
Preparation of peptides, positive control and test chemical
Låg reaktivitet
Characterisation of peptide solutions (supplier, lot, exact weight of peptide, volume added for the stock solution);
Positiv
Characterisation of positive control solution (exact weight of positive control substance, volume added for the test solution);
22,62 % < medelvärde % minskning ≤ 42,47 %
Characterisation of test chemical solutions (exact weight of test chemical, volume added for the test solution).
Måttlig reaktivitet
HPLC instrument setting and analysis
42,47 % medelvärde % minskning ≤ 100 %
Type of HPLC instrument, HPLC and guard columns, detector, autosampler;
Hög reaktivitet
Parameters relevant for the HPLC analysis such as column temperature, injection volumes, flow rate and gradient.
Det kan hända att testkemikalien (ämnet eller en eller flera komponenter av ett multikomponentämne eller en blandning) absorberar betydligt vid 220 nm och har samma retentionstid som peptiden (sameluering).
System suitability
Sameluering kan lösas genom att HPLC-konfigurationen justeras lite för att ytterligare separera testkemikaliens och peptidens elueringstid.
Peptide peak area at 220 nm of each standard and reference control A replicate;
Om en alternativ HPLC-konfiguration används för att lösa samelueringen bör dess motsvarighet till den validerade konfigurationen visas (t.ex. genom att testa kvalifikationsämnena i tillägg 2).
Linear calibration curve graphically represented and the r2 reported;
Vid sameluering kan peptidens topp inte integreras och det är inte möjligt att beräkna procentvärdet för peptidens minskning.
Peptide concentration of each reference control A replicate;
Om sameluering av sådana kemikalier förekommer med både cystein- och lysinpeptiderna bör analysen redovisas som ”tvetydig”.
Mean peptide concentration (mM) of the three reference controls A, SD and CV;
Om sameluering endast förekommer med lysinpeptiden kan prediktionsmodellen med cystein 1:10 i tabell 2 användas.
Analysis sequence
Cystein (Cys) % minskning
For reference controls:
Reaktivitetsklass
Peptide peak area at 220 nm of each B and C replicate;
DPRA-förutsägelse [17]
Mean peptide peak area at 220 nm of the nine reference controls B and C in acetonitrile, SD an CV (for stability of reference controls over analysis time);
0 % ≤ Cys % minskning ≤ 13,89 %
For each solvent used, the mean peptide peak area at 220 nm of the three appropriate reference controls C (for the calculation of percent peptide depletion);
13,89 % < Cys % minskning ≤ 23,09 %