natgillin/translations-raw huggingface dataset:
The most commonly used system that is recommended by default, unless otherwise justified, is a co-factor-supplemented post-mitochondrial fraction (S9) prepared from the livers of rodents (generally rats) treated with enzyme-inducing agents such as Aroclor 1254 (21) (22) (23) or a combination of phenobarbital and β-naphthoflavone (24) (25) (26) (27) (28) (29).
Gaser eller flyktiga testkemikalier bör testas genom lämpliga modifikationer av standardprotokollen, såsom behandling i slutna odlingskärl (32) (33) (34).
The latter combination does not conflict with the Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants (30) and has been shown to be as effective as Aroclor 1254 for inducing mixed-function oxidases (24) (25) (26) (28).
Testkemikalien bör beredas strax innan behandling om inte stabilitetsdata visar att lagringen är acceptabel.
The S9 fraction typically is used at concentrations ranging from 1 to 2 % (v/v) but may be increased to 10 % (v/v) in the final test medium.
Lösningsmedel
The use of products that reduce the mitotic index, especially calcium complexing products (31) should be avoided during treatment.
Man bör välja ett lösningsmedel som optimerar testkemikaliens löslighet utan att testet påverkas negativt, t.ex. genom förändringar i celltillväxten som påverkar testkemikaliens integritet, reaktion med odlingskärlen eller försämrad metabolisk aktivering.
The choice of type and concentration of exogenous metabolic activation system or metabolic inducer employed may be influenced by the class of chemicals being tested.
När det är möjligt, rekommenderas att man i första hand överväger vattenbaserade lösningsmedel (eller odlingsmedier).
Test chemical preparation
Vedertagna lösningsmedel är till exempel vatten eller dimetylsulfoxid.
Solid test chemicals should be prepared in appropriate solvents and diluted, if appropriate, prior to treatment of the cells (see paragraph 23).
Generellt bör organiska lösningsmedel inte överstiga 1 volymprocent och vattenhaltiga lösningsmedel (saltlösningar eller vatten) bör inte överstiga 10 volymprocent i det slutliga behandlingsmediet.
Liquid test chemicals may be added directly to the test system and/or diluted prior to treatment of the test system.
Om man använder lösningsmedel som inte är vedertagna (t.ex. etanol eller aceton) bör detta stödjas av uppgifter om att de är förenliga med testkemikalierna och testsystemet och att de inte är genetiskt toxiska vid den använda koncentrationen.
Gaseous or volatile test chemicals should be tested by appropriate modifications to the standard protocols, such as treatment in sealed culture vessels (32) (33) (34).
Om ett sådant underlag saknas är det viktigt att inkludera obehandlade kontroller (se tillägg 1) som påvisar att inga skadliga eller klastogena effekter induceras av det valda lösningsmedlet.
Preparations of the test chemical should be made just prior to treatment unless stability data demonstrate the acceptability of storage.
Mätning av cellproliferation och cytotoxicitet och val av exponeringskoncentrationer
Solvents
Vid bestämning av den högsta testkemikaliekoncentrationen bör man undvika koncentrationer som kan ge artefaktiska positiva resultat, t.ex. för kraftig cytotoxicitet (se punkt 22), utfällning i odlingsmediet (se punkt 23) eller markerade ändringar av pH eller osmolalitet (se punkt 5).
The solvent should be chosen to optimize the solubility of the test chemicals without adversely impacting the conduct of the assay, e.g. changing cell growth, affecting the integrity of the test chemical, reacting with culture vessels, impairing the metabolic activation system.
Om testkemikalien orsakar en markerad ändring av pH i mediet vid tillsättningstidpunkten kan pH justeras, företrädesvis genom buffring av det slutliga behandlingsmedlet för att undvika artefaktiska positiva resultat och upprätthålla lämpliga odlingsförhållanden.
It is recommended that, wherever possible, the use of an aqueous solvent (or culture medium) should be considered first.
Cellproliferationen bör mätas för att se till att ett tillräckligt antal behandlade celler har nått mitos under försöket och att behandlingarna görs på lämpliga nivåer av cytotoxicitet (se punkterna 18 och 22).
Well established solvents are for example water or dimethyl sulfoxide.
Cytotoxicitet bör fastställas med och utan metabolisk aktivering i huvudförsöket med hjälp av lämplig indikation på celldöd och tillväxt.
Generally organic solvents should not exceed 1 % (v/v) and aqueous solvents (saline or water) should not exceed 10 % (v/v) in the final treatment medium.
Även om det kan vara användbart att utvärdera cytotoxicitet i ett preliminärt test för att bättre definiera de koncentrationer som ska användas i huvudförsöket är ett preliminärt test inte obligatoriskt.
If not well-established solvents are used (e.g. ethanol or acetone), their use should be supported by data indicating their compatibility with the test chemicals, the test system and their lack of genetic toxicity at the concentration used.
Om ett preliminärt test utförs bör det inte ersätta mätning av cytotoxicitet i huvudförsöket.
In the absence of that supporting data, it is important to include untreated controls (see Appendix 1) to demonstrate that no deleterious or clastogenic effects are induced by the chosen solvent.
Relativ populationsfördubblingstid (RPD) eller relativ ökning av celltal (RICC) är lämpliga metoder för bedömning av cytotoxicitet i cytogenetiska tester (13) (15) (35) (36) (55) (se tillägg 2 för formler).
Measuring cell proliferation and cytotoxicity and choosing treatment concentrations
Om behandlings- och provtagningstiderna är långa efter det att behandlingen inletts kan cellcykellängder som är längre än 1,5 normala cellcykellängder (dvs. längre än totalt tre cellcykellängder) leda till en underskattning av cytotoxiteten om RPD används (37).
When determining the highest test chemical concentration, concentrations that have the capability of producing artifactual positive responses, such as those producing excessive cytotoxicity (see paragraph 22), precipitation in the culture medium (see paragraph 23), or marked changes in pH or osmolality (see paragraph 5), should be avoided.
Under dessa omständigheter kan RICC vara ett bättre mått.
If the test chemical causes a marked change in the pH of the medium at the time of addition, the pH might be adjusted by buffering the final treatment medium so as to avoid artifactual positive results and to maintain appropriate culture conditions.
RPD kan dock även vara användbart för att utvärdera utvecklingen av cytotoxicitet efter 1,5 normala cellcykellängder.
Measurements of cell proliferation are made to assure that a sufficient number of treated cells have reached mitosis during the test and that the treatments are conducted at appropriate levels of cytotoxicity (see paragraphs 18 and 22).
När det gäller lymfocyter i primära odlingar är mitotiskt index (MI) ett mått på cytotoxiska/cytostatiska verkningar.
Cytotoxicity should be determined with and without metabolic activation in the main experiment using an appropriate indication of cell death and growth.
Det påverkas dock av mätningstidpunkten efter behandling, använt mitogen och eventuella störningar i cellcykeln.
While the evaluation of cytotoxicity in an initial test may be useful to better define the concentrations to be used in the main experiment, an initial test is not mandatory.
MI är dock godtagbart eftersom andra cytotoxiska mätningar kan vara besvärliga och opraktiska och kanske inte går att använda för målpopulationen av lymfocyter som växer till följd av PHA-stimulering.
If performed, it should not replace the measurement of cytotoxicity in the main experiment.
Rekommenderade cytotoxicitetsparametrar är således RICC och RPD för cellinjer och MI för primära odlingar av lymfocyter.
Relative Population Doubling (RPD) or Relative Increase in Cell Count (RICC) are appropriate methods for the assessment of cytotoxicity in cytogenetic tests (13) (15) (35) (36) (55) (see Appendix 2 for formulas).
Andra indikatorer (t.ex. cellintegritet, apoptos, nekros och cellcykel) kan ge värdefull kompletterande information.
In case of long-term treatment and sampling times after the beginning of treatment longer than 1,5 normal cell cycle lengths (i.e. longer than 3 cell cycle lengths in total), RPD might underestimate cytotoxicity (37).
Minst tre testkoncentrationer (exklusive lösningsmedel och positiva kontroller) som uppfyller acceptanskriterierna (lämplig cytotoxicitet, antal celler osv.) bör utvärderas.
Under these circumstances RICC might be a better measure or the evaluation of cytotoxicity after 1,5 normal cell cycle lengths would be a helpful estimate using RPD.
Oavsett celltyp (cellinjer eller primära odlingar av lymfocyter) kan antingen replikat eller så kan enstaka behandlade kulturer användas för varje testad koncentration.
For lymphocytes in primary cultures, while the mitotic index (MI) is a measure of cytotoxic/cytostatic effects, it is influenced by the time after treatment it is measured, the mitogen used and possible cell cycle disruption.
Två odlingar rekommenderas, men enstaka odlingar är också godtagbara under förutsättning att samma totala antal celler registreras för antingen enstaka eller dubbla kulturer.
However, the MI is acceptable because other cytotoxicity measurements may be cumbersome and impractical and may not apply to the target population of lymphocytes growing in response to PHA stimulation.
Användning av enstaka kulturer är särskilt relevant när fler än tre koncentrationer utvärderas (se punkt 31).
While RICC and RPD for cell lines and MI for primary culture of lymphocytes are the recommended cytotoxicity parameters, other indicators (e.g. cell integrity, apoptosis, necrosis, cell cycle) could provide useful additional information.
De resultat som erhölls i de oberoende replikatodlingarna vid en given koncentration kan slås ihop för dataanalysen (38).
At least three test concentrations (not including the solvent and positive controls) that meet the acceptability criteria (appropriate cytotoxicity, number of cells, etc) should be evaluated.
För testkemikalier med låg eller ingen cytotoxicitet är två- till trefaldiga koncentrationsintervaller vanligen lämpliga.
Whatever the types of cells (cell lines or primary cultures of lymphocytes), either replicate or single treated cultures may be used at each concentration tested.
Om testkemikalien är cytotoxisk bör de valda testkoncentrationerna täcka ett relevant intervall för cytotoxiciteten enligt beskrivningen i punkt 22 och omfatta koncentrationer med måttlig, låg eller ingen cytotoxicitet.
While the use of duplicate cultures is advisable, single cultures are also acceptable provided that the same total number of cells are scored for either single or duplicate cultures.
Många testkemikalier uppvisar branta koncentrations-reponskurvor.
The use of single cultures is particularly relevant when more than 3 concentrations are assessed (see paragraph 31).
För att få uppgifter vid låg och måttlig cytotoxicitet eller undersöka dos-responsförhållandet i detalj är det därför nödvändigt att använda mera näraliggande koncentrationer och/eller fler än tre koncentrationer (enstaka kulturer eller replikat) i situationer där försöket måste upprepas (se punkt 47).
The results obtained in the independent replicate cultures at a given concentration can be pooled for the data analysis (38).
Om den maximala koncentrationen baseras på cytotoxicitet bör den högsta koncentrationen syfta till att uppnå 55 ± 5 % cytotoxicitet med hjälp av de rekommenderade cytotoxicitetsparametrarna (dvs. minskning av RICC och RPD för cellinjer och minskning av MI för primära odlingar av lymfocyter till 45 ± 5 % av den parallella negativa kontrollen).
For test chemicals demonstrating little or no cytotoxicity, concentration intervals of approximately 2 to 3 fold will usually be appropriate.
Man bör vara försiktig i tolkningen av positiva resultat som endast återfinns i den övre delen av detta cytotoxicitetsintervall på 55 ± 5 % (13).
Where cytotoxicity occurs, the test concentrations selected should cover a range from that producing cytotoxicity as described in paragraph 22 and including concentrations at which there is moderate and little or no cytotoxicity.
För svårlösliga testkemikalier som inte är cytotoxiska vid koncentrationer som är lägre än den lägsta olösliga koncentrationen bör den högsta analyserade koncentrationen framkalla grumlighet eller en fällning som är synlig med blotta ögat eller med hjälp av ett inverterat mikroskop vid slutet av behandlingen med testkemikalien.
Many test chemicals exhibit steep concentration response curves and in order to obtain data at low and moderate cytotoxicity or to study the dose response relationship in detail, it will be necessary to use more closely spaced concentrations and/or more than three concentrations (single cultures or replicates), in particular in situations where a repeat experiment is required (see paragraph 47).
Även om cytotoxicitet förekommer över den lägsta olösliga koncentrationen är det lämpligt att testa endast en koncentration som producerar grumlighet eller har en synlig fällning, eftersom fällningen kan ge artefaktiska effekter.
If the maximum concentration is based on cytotoxicity, the highest concentration should aim to achieve 55 ± 5 % cytotoxicity using the recommended cytotoxicity parameters (i.e. reduction in RICC and RPD for cell lines and reduction in MI for primary cultures of lymphocytes to 45 ± 5 % of the concurrent negative control).
När det gäller koncentrationer som ger fällningar bör man se till att detta inte stör testet (t.ex. färgning eller bestämning).
Care should be taken in interpreting positive results only to be found in the higher end of this 55 ± 5 % cytotoxicity range (13).
Bestämning av löslighet i odlingsmediet före försöket kan vara användbart.
For poorly soluble test chemicals that are not cytotoxic at concentrations lower than the lowest insoluble concentration, the highest concentration analysed should produce turbidity or a precipitate visible by eye or with the aid of an inverted microscope at the end of the treatment with the test chemical.
Om ingen fällning eller begränsande cytotoxicitet observeras ska de högsta testkoncentrationerna motsvara 10 mM, 2 mg/ml eller 2 μl/ml, enligt det som är lägst (39) (40) (41).
Even if cytotoxicity occurs above the lowest insoluble concentration, it is advisable to test at only one concentration producing turbidity or with a visible precipitate because artifactual effects may result from the precipitate.
Om testkemikalien inte har en definierad sammansättning, t.ex. ett ämne med okänd eller variabel sammansättning, komplexa reaktionsprodukter eller biologiskt material (UVCB) (42), miljöextrakt osv., kan man behöva använda en högre toppkoncentration (t.ex.
At the concentration producing a precipitate, care should be taken to assure that the precipitate does not interfere with the conduct of the test (e.g. staining or scoring).
5 mg/ml) om inte cytotoxiciteten är tillräckligt hög, för att öka koncentrationen för varje komponent.
The determination of solubility in the culture medium prior to the experiment may be useful.
Det bör dock noteras att dessa krav kan skilja sig för humanläkemedel (43).
If no precipitate or limiting cytotoxicity is observed, the highest test concentration should correspond to 10 mM, 2 mg/ml or 2 μl/ml, whichever is the lowest (39) (40) (41).
Kontroller
When the test chemical is not of defined composition, e.g. a substance of unknown or variable composition, complex reaction products or biological material (UVCB) (42), environmental extract etc., the top concentration may need to be higher (e.g. 5 mg/ml), in the absence of sufficient cytotoxicity, to increase the concentration of each of the components.
Parallella negativa kontroller (se punkt 15), bestående av enbart lösningsmedel i behandlingsmediet, och hanterade på samma sätt som behandlingsodlingarna, bör inkluderas varje gång odlingen skördas.
It should be noted however that these requirements may differ for human pharmaceuticals (43).
Parallella positiva kontroller behövs för att visa laboratoriets förmåga att identifiera klastogener enligt villkoren i det använda testprotokollet och, i förekommande fall, effektiviteten hos det exogena systemet för metabolisk aktivering.
Controls
Exempel på positiva kontroller ges i tabell 1 nedan.
Concurrent negative controls (see paragraph 15), consisting of solvent alone in the treatment medium and treated in the same way as the treatment cultures, should be included for every harvest time.
Alternativa positiva kontrollkemikalier kan användas om det är motiverat.
Concurrent positive controls are needed to demonstrate the ability of the laboratory to identify clastogens under the conditions of the test protocol used and the effectiveness of the exogenous metabolic activation system, when applicable.
Tester av däggdjursceller in vitro för genetisk toxicitet är tillräckligt standardiserade och de positiva kontrollerna kan därför begränsas till en klastogen som kräver metabolisk aktivering.
Alternative positive control chemicals can be used, if justified.
Separata positiva kontroller bör dock göras av långvariga behandlingar (utan S9) eftersom behandlingstiden skiljer sig från tester med metabolisk aktivering.
Because in vitro mammalian cell tests for genetic toxicity are sufficiently standardized, the use of positive controls may be confined to a clastogen requiring metabolic activation.
Varje positiv kontroll bör användas för en eller flera koncentrationer som förväntas ge ökningar över bakgrunden som går att reproducera och detektera.
Provided it is done concurrently with the non-activated test using the same treatment duration, this single positive control response will demonstrate both the activity of the metabolic activation system and the responsiveness of the test system.
Syftet med detta är att visa testsystemets känslighet (dvs. verkningarna är tydliga men avslöjar inte omedelbart identiteten hos de kodade utstryksglasen för avläsaren), och responsen får inte äventyras av cytotoxicitet som överskrider de gränser som anges i testmetoden.
Long term treatment (without S9) should however have its own positive control as the treatment duration will differ from the test using metabolic activation.
Rekommenderade referenskemikalier för utvärdering av laboratoriets kompetens att välja positiva kontroller.
Each positive control should be used at one or more concentrations expected to give reproducible and detectable increases over background in order to demonstrate the sensitivity of the test system (i.e. the effects are clear but do not immediately reveal the identity of the coded slides to the reader), and the response should not be compromised by cytotoxicity exceeding the limits specified in the test method.
Kategori
Reference chemicals recommended for assessing laboratory proficiency and for selection of positive controls
Klastogener utan metabolisk aktivering
Category
Metylmetansulfonat
Clastogens active without metabolic activation
itrokinolin-N-oxid
Methyl methanesulphonate
Cytosinarabinosid
Mitomycin C
Klastogener som kräver metabolisk aktivering
itroquinoline-N-Oxide
Benso(a)pyren
Cytosine arabinoside
Cyklofosfamid
Clastogens requiring metabolic activation
FÖRFARANDE
Benzo(a)pyrene
Behandling med testkemikalien
Cyclophosphamide
Prolifererande celler behandlas med testkemikalien i såväl närvaro som frånvaro av ett system för metabolisk aktivering.
PROCEDURE
Tid för skörd av odlingen
Treatment with test chemical
För en grundlig utvärdering, vilket krävs för en slutsats om ett negativt resultat, bör samtliga tre försöksförhållanden som anges nedan tillämpas i en korttidsbehandling med och utan metabolisk aktivering samt en långtidsbehandling utan metabolisk aktivering (se punkterna 43, 44 och 45):
Proliferating cells are treated with the test chemical in the presence and absence of a metabolic activation system.
Cellerna bör exponeras för testkemikalien utan metabolisk aktivering, under 3–6 timmar och prov bör tas ut vid en tid som motsvarar cirka 1,5 gånger den normala cellcykelns längd efter det att behandlingen har påbörjats (18).
Culture harvest time
Cellerna bör exponeras för testkemikalien utan metabolisk aktivering, under 3–6 timmar och prov bör tas ut vid en tid som motsvarar cirka 1,5 gånger den normala cellcykelns längd efter det att behandlingen har påbörjats (18).
For thorough evaluation, which would be needed to conclude a negative outcome, all three of the following experimental conditions should be conducted using a short term treatment with and without metabolic activation and long term treatment without metabolic activation (see paragraphs 43, 44 and 45):
Cellerna bör exponeras kontinuerligt utan metabolisk aktivering tills provtagning under en tidsperiod som motsvarar cirka 1,5 gånger de normala cellcykellängderna.
Cells should be exposed to the test chemical without metabolic activation for 3-6 hours, and sampled at a time equivalent to about 1,5 normal cell cycle lengths after the beginning of treatment (18),
Vissa kemikalier (t.ex. nukleosida analoger) kan vara enklare att detektera vid behandlings-/provtagningstider som är längre är 1,5 cykellängder (24).
Cells should be exposed to the test chemical with metabolic activation for 3-6 hours, and sampled at a time equivalent to about 1,5 normal cell cycle lengths after the beginning of treatment (18),
Om något av de ovannämnda försöksförhållandena leder till en positiv respons kan andra behandlingssystem behöva övervägas.
Cells should be continuously exposed without metabolic activation until sampling at a time equivalent to about 1,5 normal cell cycle lengths.
Kromosompreparation
Certain chemicals (e.g. nucleoside analogues) may be more readily detected by treatment/sampling times longer than 1,5 normal cell cycle lengths (24).
Cellkulturer behandlas vanligtvis med colcemid eller colchicin under 1–3 timmar före skörd.
In the event that any of the above experimental conditions lead to a positive response, it may not be necessary to investigate any of the other treatment regimens.
Varje cellkultur skördas och behandlas separat för preparationen av kromosomer.
Chromosome preparation
Kromosompreparation innefattar hypoton behandling av cellerna, fixering och infärgning.
Cell cultures are treated with colcemid or colchicine usually for one to three hours prior to harvesting.
I monolager kan det finnas mitotiska celler (som identifieras genom att de är runda och lösgör sig från ytan) i slutet av behandlingen på 3–6 timmar.
Each cell culture is harvested and processed separately for the preparation of chromosomes.
Eftersom dessa mitotiska celler enkelt lösgörs, kan de förloras när mediet som innehåller testkemikalien avlägsnas.
Chromosome preparation involves hypotonic treatment of the cells, fixation and staining.
Om det finns bevis för en betydande ökning av antalet mitotiska celler jämfört med kontrollerna, vilket tyder på en sannolik mitotisk hämning, bör cellerna samlas in genom centrifugering och tillsättas till odlingarna igen, så att man inte förlorar celler som är i mitos och som riskerar kromosomavvikelser vid skördetidpunkten.
In monolayers, mitotic cells (identifiable as being round and detaching from the surface) may be present at the end of the 3-6 hour treatment.
Analys
Because these mitotic cells are easily detached, they can be lost when the medium containing the test chemical is removed.
Alla utstryksglas, inklusive de från positiva och negativa kontroller, bör få en oberoende kodning innan den mikroskopiska analysen av kromosomavvikelser utförs.
If there is evidence for a substantial increase in the number of mitotic cells compared with controls, indicating likely mitotic arrest, then the cells should be collected by centrifugation and added back to cultures, to avoid losing cells that are in mitosis, and at risk for chromosome aberration, at the time of harvest.
Eftersom fixeringen ofta ger upphov till brott på en del metafaser, med åtföljande förlust av kromosomer, bör de celler som påträffas därför innehålla ett centromerantal på minst 2 n ± 2, där n är det haploida antalet kromosomer.