natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Depending on the size of the fathead minnow (which is sex-dependent), collectable plasma volumes generally range from 5 to 60 microlitres per fish (Jensen et al.
För in mortelstöten i 1,5 ml mikroröret.
2001).
Håll mikrorörshomogenisatorn och pressa levern mellan mortelstötens yta och innerväggen på 1,5 ml mikroröret.
Procedure 1B:
Kör mikrorörshomogenisatorn i 10–20 sekunder.
Fathead Minnow, Blood Collection from Heart
Kyl ner 1,5 ml mikroröret med krossad is när detta görs.
Alternatively, blood may also be collected by cardiac puncture using a heparinized syringe (1000 units of heparin per ml).
Ta ut mortelstöten från 1,5 ml mikroröret och låt det stå i ca 10 sekunder.
The blood is transferred into Eppendorf tubes (held on ice) and then centrifuged (5 min, 7000 g, room temperature).
Kontrollera därefter suspensionen visuellt.
The plasma should be transferred into clean Eppendorf tubes (in aliquots if the volume of plasma makes this feasible) and promptly frozen at – 80 °C, until analyzed (Panter et al., 1998).
Om man kan se delar av lever i suspensionen ska steg (3) och (4) upprepas tills ett godtagbart leverhomogenat har beretts.
Procedure 2A:
Kyl ner det suspenderade leverhomogenatet i isstället till dess att centrifugeringen utförs.
Japanese Medaka, Excision of the Liver in Medaka
Byt ut mortelstöten mot en ny för varje homogenat.
Removal of the test fish from the test chamber
Homogenisera alla levrar med homogenatbuffertlösningen enligt det förfarande som beskrivs ovan.
Test fish should be removed from the test chamber using the small spoon-net.
Centrifugering av det suspenderade leverhomogenatet
Be careful not to drop the test fish into other test chambers.
Bekräfta att temperaturen i kylcentrifugkammaren är ≤ 5 °C.
In principle, the test fish should be removed in the following order:
Ställ in 1,5 ml mikrorören som innehåller de suspenderade leverhomogenaten i kylcentrifugen (justera jämvikten vid behov).
control, solvent control (where appropriate), lowest concentration, middle concentration, highest concentration and positive control.
Centrifugera de suspenderade leverhomogenaten vid 13000 g i 10 minuter vid ≤ 5 °C.
In addition, all males should be removed from one test chamber before the remaining females are removed.
Om supernatanterna är tillräckligt separerade kan dock centrifugalkraften och varaktigheten justeras efter behov.
The sex of each test fish is identified on the basis of external secondary sex characteristics (e.g. the shape of the anal fin).
Efter centrifugeringen kontrolleras att supernatanterna är tillräckligt separerade (yta: fett, mellanparti: supernatant, bottenskikt: levervävnad).
Place the test fish in a container for transport and carry it to the workstation for excision of the liver.
Om skikten inte är tillräckligt separerade centrifugeras suspensionen igen under samma betingelser.
Check the labels of the test chamber and the transport container for accuracy and to confirm that the number of fish that have been removed from the test chamber and that the number of fish remaining in the test chamber are consistent with expectation.
Avlägsna alla prov från kylcentrifugen och ordna dem efter de nummer proven har i isstället.
If the sex cannot be identified by the fish's external appearance, remove all fish from the test chamber.
Var noga med att inte återsuspendera de åtskilda skikten efter centrifugeringen.
In this case, the sex should be identified by observing the gonad or secondary sex characteristics under a stereoscopic microscope.
Insamling av supernatanten
Excision of the liver
Placera fyra 0,5 ml mikrorör i provrörsstället för lagring av supernatanten.
Transfer the test fish from the container for transport to the anaesthetic solution using the small spoon-net.
Samla in 30 μl supernatant (separerad som det mellanliggande skiktet) med mikropipetten och tillsätt supernatanten till ett 0,5 ml mikrorör.
After the test fish is anaesthetised, transfer the test fish on the filter paper (or a paper towel) using tweezers (commodity type).
Var noga med att inte få med fettet på ytan eller levervävnaden i det undre lagret.
When grasping the test fish, apply the tweezers to the sides of the head to prevent breaking the tail.
Samla in supernatanten och tillsätt den till två andra 0,5 ml mikrorör på samma sätt som beskrivs ovan.
Wipe the water on the surface of the test fish on the filter paper (or the paper towel).
Samla in resten av supernatanten med mikropipetten (om möjligt: ≥ 100 μl).
Then make a small transverse incision partway between the ventral neck region and the mid-abdominal region using dissection scissors.
Tillsätt därefter supernatanten till de återstående 0,5 ml mikrorören.
Insert the dissection scissors into the small incision, and incise the abdomen from a point caudal to the branchial mantle to the cranial side of the anus along the midline of the abdomen.
Stäng locket på 0,5 ml mikroröret och anteckna supernatantens volym på etiketten.
Be careful not to insert the dissection scissors too deeply so as to avoid damaging the liver and gonad.
Kyl därefter omedelbart ner mikrorören i isstället.
Conduct the following operations under the stereoscopic microscope.
Byt ut spetsen på mikropipetten till en ny för varje supernatant.
Place the test fish abdomen side up on the paper towel (glass Petri dish or slide glass are also available).
Om en stor mängd fett fäster sig vid spetsen bör den omedelbart bytas ut mot en ny för att undvika kontaminering av leverextraktet med fett.
Extend the walls of the abdominal cavity with precision tweezers and exteriorise the internal organs.
Fördela hela den centrifugerade supernatanten i 0,5 ml mikrorör enligt det förfarande som beskrivs ovan.
It is also acceptable to exteriorise the internal organs by removing one side of the wall of the abdominal cavity if necessary.
Efter att supernatanten har tillsatts till 0,5 ml mikrorör placeras de alla i provrörsstället med identifieringsetiketten och fryses sedan omedelbart ner i frysen.
Expose the connected portion of the liver and gallbladder using another pair of precision tweezers.
Om VTG-halterna ska mätas omedelbart efter förbehandlingen hålls ett 0,5 ml mikrorör (med 30 μl supernatant) kallt i provrörsstället och överförs sedan till arbetsstationen där ELISA-testet utförs.
Then grasp the bile duct and cut off the gallbladder.
I ett sådant fall ska alla övriga mikrorör placeras i provrörsställen och frysas ner i frysen.
Be careful not to break the gallbladder.
Efter insamling av supernatanten kasseras restprodukterna på lämpligt sätt.
Grasp the oesophagus and excise the gastrointestinal tract from the liver in the same way.
Lagring av provet
Be careful not to leak the contents of the gastrointestinal tract.
Lagra 0,5 ml mikrorören som innehåller supernatanten av leverhomogenatet vid ≤ – 70 °C tills de används för ELISA-testet.
Excise the caudal gastrointestinal tract from the anus and remove the tract from the abdominal cavity.
Förfarande 3A:
Trim the mass of fat and other tissues from the periphery of the liver.
Sebrafisk, insamling av blod från den kaudala venen/artären
Be careful not to scratch the liver.
Omedelbart efter bedövning skärs stjärtspolen av transversalt, och blodet insamlas från den kaudala artären/venen med ett hepariniserat mikrohematokrit-centrifugerat kapillärrör.
Grasp the hepatic portal area using the precision tweezers and remove the liver from the abdominal cavity.
Volymerna blod varierar mellan 5 och 15 μl beroende på fiskens storlek.
Place the liver on the slide glass.
En lika stor mängd buffertlösning med aprotinin (6 μgml i fosfatbuffrad saltlösning (PBS)) tillsätts i mikrokapillärröret och plasman separeras från blodet genom centrifugering (5 minuter vid 600 g).
Using the precision tweezers, remove any additional fat and extraneous tissue (e.g., abdominal lining), if needed, from the surface of the liver.
Plasman samlas i provrören och lagras vid – 20 °C tills de analyseras med avseende på vitellogenin eller andra proteiner av intresse.
Measure the liver weight with 1.5 ml microtube as a tare using an electronic analytical balance.
Förfarande 3B:
Record the value on the worksheet (read: 0,1 mg).
Sebrafisk, insamling av blod genom hjärtpunktering
Confirm the identification information on the microtube label.
För att undvika koagulering av blod och nedbrytning av proteiner tas proven i en buffertlösning bestående av fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som innehåller heparin (1000 enheter/ml) och proteashämmaren aprotinin (2 TIU/ml).
Close the cap of the microtube containing the liver.
Som ingredienser i buffertlösningen rekommenderas heparin (ammoniumsalt) och frystorkad aprotinin.
Store it in a cooling rack (or ice rack).
För blodprovstagning rekommenderas en spruta (1 ml) med en fast tunn nål (t.ex.
Following the excision of one liver, clean the dissection instruments or replace them with clean ones.
Braun omnikan-F).
Remove livers from all of the fish in the transport container as described above.
Sprutan ska fyllas på förhand med en buffert (ca 100 μl) för att helt eluera de små blodvolymerna från varje fisk.
After the livers have been excised from all of the fish in the transport container (i.e., all males or females in a test chamber), place all liver specimens in a tube rack with a label for identification and store it in a freezer.
Blodproven tas genom hjärtpunktering.
When the livers are donated for pre-treatment shortly after the excision, the specimens are carried to the next workstation in a cooling rack (or ice rack).
Till att börja med bör fisken bedövas med MS-222 (100 mg/l).
Following liver excision, the fish carcass is available for measurement of secondary sex characteristics.
En lämplig bedövningsnivå gör det möjligt för användaren att urskilja sebrafiskens hjärtslag.
Specimen
Medan hjärtpunkteringen utförs ska sprutans kolv hållas under svagt tryck.
Store the liver specimens taken from the test fish at ≤ – 70 °C if they are not used for the pre-treatment shortly after the excision.
Samla in blodvolymer på mellan 20 och 40 ml.
A cut is made just anterior to pectoral fins with scissors.
Efter hjärtpunkteringen ska blod/buffert-blandningen tillsättas i provröret.
Figure 2
Plasman separeras från blodet genom centrifugering (20 min., 5000 g) och bör förvaras vid – 80 °C tills den behövs för analys.
The midline of abdomen is incised with scissors to a point approximately 2 mm cranial to the anus.
Förfarande 3C:
Figure 3
Standardförfarande:
The abdominal walls are spread with forceps for exposure of the liver and other internal organs.
Sebrafisk, homogenisering av huvud och stjärt
(Alternatively, the abdominal walls may be pinned laterally).
Fiskarna bedövas eller avlivas i enlighet med testbeskrivningen.
Figure 4
Huvudet och stjärten skärs av i enlighet med figur 1.
The liver is bluntly dissected and excised using forceps.
Obs!
Figure 5
Alla dissektionsinstrument och skärbrädan bör sköljas och rengöras ordentligt (t.ex. med 96 % etanol) mellan hanteringen av varje enskild fisk att förhindra ’vitellogenin-förorening’ från honor eller inducerade hanar till oinducerade hanar.
The intestines are gently retracted using forceps.
Skär bakom bröstfenan
Testis 6
Skär bakom ryggfenan
Both ends of the intestines and any mesenteric attachments are severed using scissors.
För Vtg-analys
Testis 7 (female)
För gonadhistologi
The procedure is identical for the female.
Den sammanlagda vikten av huvud och stjärt från varje fisk mäts till närmaste mg.
Testis 8
Efter vägning placeras delarna i lämpliga rör (t.ex.
The completed procedure.
1,5 ml eppendorfrör) och fryses vid – 80 °C tills homogeniseringen, eller homogeniseras direkt på is med två mortelstötar av plast.
Procedure 2 B:
(Andra metoder kan användas om de utförs på is och resultatet är en homogen massa).
Japanese Medaka (Oryzias latipes), Liver Pre-treatment for Vitellogenin Analysis
Rören ska numreras noggrant så att fiskarnas huvud och stjärt kan hänföras till deras respektive kroppar, som används för histologisk undersökning av könskörtlarna.
Take the bottle of homogenate buffer from the ELISA kit and cool it with crushed ice (temperature of the solution: ≤ 4 °C).
När en homogen massa erhållits tillsätts iskall homogeniseringsbuffertlösning med en mängd på 4 gånger vävnadens vikt.
If homogenate buffer from EnBio ELISA system is used, thaw the solution at room temperature, and then cool the bottle with crushed ice.
Fortsätt att arbeta med mortelstötarna tills blandningen är homogen.
Calculate the volume of homogenate buffer for the liver on the basis of its weight (add 50 μl of homogenate buffer per mg liver weight for homogenate).
Viktig anmärkning:
For example, if the weight of the liver is 4,5 mg, the volume of homogenate buffer for the liver is 225 μl.
Nya mortelstötar används för varje fisk.
Prepare a list of the volume of homogenate buffer for all livers.
Proven läggs på is tills centrifugeringen vid 4 °C och 50000 × g i 30 minuter.
Preparation of the liver for pre-treatment
Använd en pipett för att dosera ut portioner på 20 μl supernatant i minst två rör genom att doppa pipettens spets under fettlagret på ytan och försiktigt suga upp supernatanten utan att få med fragment av fett eller små bitar.
Take the 1,5 ml microtube containing the liver from the freezer just before the pre-treatment.
Rören förvaras vid – 80 °C fram till användningen.
Pre-treatment of the liver from males should be performed before females to prevent vitellogenin contamination.
Buffertlösning för homogenisering:50 mM Tris-HCl pH 7,4; 1 % proteashämmarblandning (Sigma):
In addition, the pre-treatment for test groups should be conducted in the following order:
12 ml Tris-HCl pH 7,4 + 120 μl proteashämmarblandning.TRIS:
The number of 1,5 ml microtubes containing liver samples taken from the freezer at a given time should not exceed the number that can be centrifuged at that time.
TRIS-ULTRA PURE (ICN), t.ex. från Bie & Berntsen, Danmark.Proteashämmarblandning:
Arrange the 1,5 ml microtubes containing liver samples in the order of specimen number on the ice rack (no need to thaw the liver).
Från Sigma (för däggdjursvävnader), produkt nr P 8340.Anmärkning:
Operation of the pre-treatment
Buffertlösningen för homogenisering bör användas samma dag som den beretts.
Addition of the homogenization buffer
Lägg den på is under användningen.
Check the list for the volume of the homogenate buffer to be used for a particular sample of liver and adjust the micropipette (volume range: 100-1000 μl) to the appropriate volume.
Vitellogeninberikade prover och referensstandard för tester
Attach a clean tip to the micropipette.
Varje dag som vitellogenintester utförs ska ett berikningsprov analyseras som beretts med en referensstandard för tester (inter-assay).
Take the homogenate buffer from the reagent bottle and add the buffer to the 1,5 ml microtube containing the liver.
Vitellogeninet som används för beredning av referensstandarden ska komma från ett annat parti än det som används för att bereda kalibreringsstandarderna för det test som utförs.
Add the homogenate buffer to all of 1,5 ml microtubes containing the liver according to the procedure described above.
Ett berikningsprov bereds genom att man tillsätter en känd mängd av referensstandarden till ett prov med plasma från kontrollhanar.
There is no need to change the micropipette tip to a new one.
Provet berikas tills en vitellogeninkoncentration på mellan 10 och 100 gånger den förväntade vitellogeninkoncentrationen i hanliga kontrollfiskar uppnås.
However, if the tip is contaminated or suspected to be contaminated, the tip should be changed.
Det berikade provet med hanlig kontrollplasma kan komma från en enda fisk eller vara en blandning av flera olika fiskar.
Homogenisation of the liver
Ett delprov av den oberikade hanliga kontrollplasman analyseras i minst två duplikatbrunnar.
Attach a new pestle for homogenisation to the microtube homogeniser.
Det berikade provet analyseras också i minst två duplikatbrunnar.
Insert the pestle into the 1,5 ml microtube.
Den genomsnittliga mängden vitellogenin i de två icke-berikade hanliga kontrollproven läggs till den beräknade mängden vitellogenin som lagts till berikningsproverna i syfte att fastställa en förväntad koncentration.
Hold the microtube homogeniser to press the liver between the surface of the pestle and the inner wall of the 1,5 ml microtube.
Förhållandet mellan denna förväntade koncentration och den uppmätta koncentrationen rapporteras tillsammans med resultaten från varje försöksomgång som utförs på samma dag.
Operate the microtube homogeniser for 10 to 20 seconds.
Flödesschema över beslutsgången för den statistiska analysen Dunns test på replikatmedel- värden
Cool the 1,5 ml microtube with crushed ice during the operation.
Dunns test på replikat- medelvärden
Lift up the pestle from the 1,5 ml microtube and leave it at rest for about 10 seconds.
Variansstabiliserande omvandling?
Then conduct a visual check of the state of the suspension.
Variansstabiliserande omvandling?
If pieces of liver are observed in the suspension, repeat the operations (3) and (4) to prepare satisfactory liver homogenate.
Monoton
Cool the suspended liver homogenate on the ice rack until centrifugation.
Varianserna lika
Change the pestle to the new one for each homogenate.
Ej monoton
Homogenise all livers with homogenate buffer according to the procedure described above.
Jonckheeres eller Williams test (step-down)
Centrifugation of the suspended liver homogenate
Step-downtrendtest på replikatmedelvärden
Confirm the temperature of the refrigerated centrifuge chamber at ≤ 5 °C.
Varianser lika Nej Ja Ja
Insert the 1,5 ml microtubes containing the suspended liver homogenate in refrigerated centrifuge (adjust the balance if necessary).
Replikatmedelvärden normala & homogena
However, if the supernatants are adequately separated, centrifugal force and time may be adjusted as needed.
Dunnetts test på nästlad ANOVA
Following centrifugation, check that the supernatants are adequately separated (surface: lipid, intermediate: supernatant, bottom layer: liver tissue).
Varianser olika
If the separation is not adequate, centrifuge the suspension again under the same conditions.
Replikatmedelvärden ej normalfördelade
Collect the supernatant and dispense it to other two 0,5 ml microtubes in the same manner as described above.
Behovet av att utveckla och validera ett testsystem som kan påvisa verksamma kemikalier i sköldkörtelsystemet hos ryggradsdjur härrör från farhågor att koncentrationen av kemikalier i miljön kan orsaka negativa effekter både hos människor och vilda djur.
Collect the rest of the supernatant with the micropipette (if feasible: ≥ 100 μl).
År 1998 inledde OECD en högprioriterad verksamhet för att se över befintliga testriktlinjer och utveckla nya testriktlinjer för screening och testning av potentiellt endokrinstörande ämnen.
Then dispense the supernatant to the remaining 0,5 ml microtube.
Ett inslag i verksamheten var att utveckla en testriktlinje för screening av verksamma kemikalier i sköldkörtelsystemet hos ryggradsdjur.
Close the cap of the 0,5 ml microtube and write the volume of the supernatant on the label.
Både en förbättrad version av studien i kapitel B.7 i denna bilaga, 28-dagars toxicitetsstudie med upprepad oral dosering på gnagare, och testet på groddjursmetamorfos (Amphibian Metamorphosis Assay, AMA) föreslogs.
Then immediately cool the microtubes on the ice rack.
Den förbättrade testmetoden B.7 har genomgått validering och en reviderad testmetod har presenterats.
Change the tip of the micropipette to the new one for each supernatant.
Testet på groddjursmetamorfos genomgick ett omfattande valideringsprogram som innefattade studier både inom och mellan laboratorier, vilka påvisade analysens relevans och tillförlitlighet (1) (2).
If a large amount of lipid becomes attached to the tip, change it to the new one immediately to avoid contamination of the liver extract with fat.
Valideringen av analysen var därefter föremål för utvärdering av en oberoende expertpanel (3).
Dispense all of the centrifuged supernatant to four 0,5 ml microtubes according to the procedure described above.
Denna testmetod är resultatet av de erfarenheter som gjorts under valideringsundersökningarna för påvisande av sköldkörtelaktiva kemikalier, och under arbete som utförts annorstädes i OECD:s medlemsländer.
After dispensing the supernatant to the 0,5 ml microtubes, place all of them in the tube rack with the identification label, and then freeze them in the freezer immediately.
Test på groddjursmetamorfos är ett screeningtest avsett att empiriskt identifiera kemikalier som kan störa den normala funktionen i hypotalamus-hypofys-tyroideaaxeln (nedan kallad HPT-axeln).
If the VTG concentrations are measured immediately after the pre-treatment, keep one 0,5 ml microtube (containing 30 μl of supernatant) cool in the tube rack and transfer it to the workstation where the ELISA assay is conducted.
Testet på groddjursmetamorfos representerar en allmän ryggradsdjursmodell såtillvida att det är baserat på HPT-axelns oförändrade strukturer och funktioner.
In such case, place the remaining microtubes in the tube racks and freeze them in the freezer.
Det är ett viktigt test eftersom groddjursmetamorfosen utgör en grundligt undersökt sköldkörtelberoende process som svarar på kemikalier som är verksamma inom HPT-axeln, och det är det enda befintliga test som påvisar sköldkörtelaktivitet hos ett djur som genomgår en morfologisk utveckling.
After the collection of the supernatant, discard the residue adequately.
Den allmänna utformningen av testet innebär att grodyngel av arten Xenopus laevis (afrikansk klogroda) som befinner sig i stadium 51 utsätts för minst tre olika koncentrationer av testkemikalien och för en kontroll med utspädningsvatten under 21 dagar.
Storage of the specimen
Det finns fyra replikat för varje testkärl.
Store the 0,5 ml microtubes containing the supernatant of the liver homogenate at ≤ – 70 °C until they are used for the ELISA.
Djurtätheten vid testets början är 20 grodyngel per testakvarium för alla behandlingsgrupper.
Zebrafish, Blood Collection from the Caudal Vein / Artery
Testarter
Immediately following anaesthesia, the caudal peduncle is severed transversely, and the blood is removed from the caudal artery/vein with a heparinised microhematocrit capillary tube.
Xenopus laevis odlas i laboratorier världen över och kan lätt erhållas från kommersiella leverantörer.
Blood volumes range from 5 to 15 μl depending on fish size.
Reproduktionen kan lätt framkallas i denna art under hela året med hjälp av injektioner av humant koriongonadotropin (hCG), och stora antal av de yngel som utvecklas till följd av detta kan rutinmässigt uppfödas till utvalda utvecklingsstadier för att möjliggöra användningen av stadiumspecifika testprotokoll.
An equal volume of aprotinin buffer (6 μgml in PBS) is added to the microcapillary tube, and plasma is separated from the blood via centrifugation (5 minutes at 600 g).
Det är att föredra att ynglen som används i testet härrör från vuxna djur som odlats i eget laboratorium.
Plasma is collected in the test tubes and stored at – 20 °C until analyzed for vitellogenin or other proteins of interest.
Som ett alternativ, även om detta inte är att föredra, kan ägg eller embryon sändas till det laboratorium som genomför testet och genomgå acklimatisering.
Procedure 3B:
Att skicka yngelstadier för användning i testet är ett oacceptabelt förfarande.
Zebrafish, Blood Collection by Cardiac Puncture
Utrustning och materiel
To avoid coagulation of blood and degradation of protein the samples are collected within Phosphate-buffered saline (PBS) buffer containing heparin (1000 units/ml) and the protease inhibitor aprotinin (2 TIU/ml).
Följande utrustning och materiel behövs för att utföra detta test:
As ingredients for the buffer, heparin ammonium salt and lyophilised aprotinin are recommended.
exponeringssystem (se beskrivning nedan),
For blood sampling, a syringe (1 ml) with a fixed thin needle (e.g. Braun Omnikan-F) is recommended.
akvarier av glas eller rostfritt stål (se beskrivning nedan),
The syringe should be prefilled with buffer (approximately 100 μl) to completely elute the small blood volumes from each fish.
odlingsakvarier,