natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Care should be taken not to score binucleate cells with irregular shapes or where the two nuclei differ greatly in size.
Rekommenderade referenskemikalier för utvärdering av laboratoriets kompetens att välja positiva kontroller.
In addition, binucleate cells should not be confused with poorly spread multi-nucleate cells.
Aneugener
Cells containing more than two main nuclei should not be analysed for micronuclei, as the baseline micronucleus frequency may be higher in these cells (84).
Colchicin
Scoring of mononucleate cells is acceptable if the test chemical is shown to interfere with cytoB activity.
Vinblastin
A repeat test without CytoB might be useful in such cases.
Behandlingsschema
Scoring mononucleate cells in addition to binucleate cells could provide useful information (85) (86), but is not mandatory.
För att maximera sannolikheten för att detektera en aneugen eller klastogen som agerar i ett visst skede av cellcykeln är det viktigt att ett tillräckligt antal celler som representerar alla de olika skedena i cellcykeln behandlas med testkemikalien.
In cell lines tested without cytoB treatment, micronuclei should be scored in at least 2000 cells per test concentration and control (83), equally divided among the replicates, if replicates are used.
Alla behandlingar bör inledas och avslutas medan cellerna växer exponentiellt och cellerna bör fortsätta att växa fram till provtagningen.
When single cultures per concentration are used (see paragraph 28), at least 2000 cells per culture should be scored in this single culture.
Behandlingsschemat för cellinjer och primära cellodlingar kan därför avvika något från behandlingsschemat för lymfocyter som kräver mitogen stimulering för att inleda sin cellcykel (17).
If substantially fewer than 1000 cells per culture (for duplicate cultures), or 2000 (for single culture), are available for scoring at each concentration, and if a significant increase in micronuclei is not detected, the test should be repeated using more cells, or at less cytotoxic concentrations, whichever is appropriate.
För lymfocyter är det effektivast att inleda behandlingen med testkemikalien 44–48 timmar efter PHA-stimulering, när cellerna delar sig på ett asynkront sätt (6).
When cytoB is used, a CBPI or an RI should be determined to assess cell proliferation (see Appendix 2) using at least 500 cells per culture.
Offentliggjorda data (19) tyder på att de flesta aneugener och klastogener detekteras med en kortvarig behandlingsperiod på 3–6 timmar med och utan tillsats av S9, åtföljd av borttagning av testkemikalien och provtagning vid en tidpunkt som motsvarar ungefär 1,5–2,0 gånger den normala cellcykelns längd efter inledandet av behandlingen (7).
When treatments are performed in the absence of cytoB, it is essential to provide evidence that the cells in culture have divided, as discussed in paragraphs 24-28.
Celler bör exponeras för testkemikalien med metabolisk aktivering i 3-6 timmar, och provtas vid en tidpunkt som motsvarar cirka 1,5–2,0 gånger den normala cellcykelns längd efter behandlingens början (19),
In order to establish sufficient experience with the assay prior to using it for routine testing, the laboratory should have performed a series of experiments with reference positive chemicals acting via different mechanisms (at least one with and one without metabolic activation, and one acting via an aneugenic mechanism, and selected from the chemicals listed in Table 1) and various negative controls (including untreated cultures and various solvents/vehicle).
Cellerna bör exponeras kontinuerligt utan metabolisk aktivering tills provtagning under en tidsperiod som motsvarar cirka 1,5–2,0 gånger de normala cellcykellängderna.
This is not applicable to laboratories that have experience, i.e. that have an historical data base available as defined in paragraphs 49 to 52.
Om det är känt eller man misstänker att testkemikalien påverkar cellcykellängden (t.ex. vid testning av nukleosidanaloger), särskilt för p53-kompetenta celler (35) (36) (77), kan provtagnings- eller återhämtningstiderna förlängas med upp till ytterligare 1,5–2,0 gånger den normala cellcykelns längd (dvs. totalt 3,0–4,0 gånger den normala cellcykelns längd efter inledandet av kort- och långvariga behandlingar).
A selection of positive control chemicals (see Table 1) should be investigated with short and long treatments in the absence of metabolic activation, and also with short treatment in the presence of metabolic activation, in order to demonstrate proficiency to detect clastogenic and aneugenic chemicals, determine the effectiveness of the metabolic activation system and demonstrate the appropriateness of the scoring procedures (microscopic visual analysis, flow cytometry, laser scanning cytometry or image analysis).
Dessa alternativ gäller för situationer där det kan finnas tvivel rörande eventuell växelverkan mellan testkemikalien och cytoB.
When first acquiring data for an historical negative control distribution, concurrent negative controls should be consistent with published negative control data where they exist.
Om förlängda provtagningstider används (dvs. totalt 3,0–4,0 gånger den normala cellcykelns längd) är det viktigt att säkerställa att cellerna fortfarande aktivt delar på sig.
As more experimental data are added to the control distribution, concurrent negative controls should ideally be within the 95 % control limits of that distribution (87) (88).
Lymfocyters exponentiella tillväxt kan t.ex. minska vid 96 timmar efter stimulering och celler som växer i monolager kan bli konfluenta.
The laboratory's historical negative control database, should initially be built with a minimum of 10 experiments but would preferably consist of at least 20 experiments conducted under comparable experimental conditions.
Förslag till cellbehandlingsscheman sammanfattas i tabell 2.
Laboratories should use quality control methods, such as control charts (e.g. C-charts or X-bar charts (88)), to identify how variable their positive and negative control data are, and to show that the methodology is ‘under control’ in their laboratory (83).
Dessa allmänna behandlingsscheman kan modifieras (och bör motiveras) beroende på testkemikaliens stabilitet eller reaktivitet eller de särskilda tillväxtegenskaper som gäller för de celler som används.
Further recommendations on how to build and use the historical data (i.e. criteria for inclusion and exclusion of data in historical data and the acceptability criteria for a given experiment) can be found in the literature (87).
Tidpunkter för cellbehandling och skörd när MNvit-testet används
Any changes to the experimental protocol should be considered in terms of the consistency of the data with the laboratory's existing historical control databases.
Lymfocyter, primära celler och cellinjer behandlade med cytoB
Negative control data should consist of the incidence of micronucleated cells from a single culture or the sum of replicate cultures as described in paragraph 28.
behandling
Concurrent negative controls should ideally be within the 95 % control limits of the distribution of the laboratory's historical negative control database (87) (88).
Behandla 3–6 timmar med tillsats av S9,
Where concurrent negative control data fall outside the 95 % control limits, they may be acceptable for inclusion in the historical control distribution as long as these data are not extreme outliers and there is evidence that the test system is ‘under control’ (see paragraph 50) and there is evidence of absence of technical or human failure.
avlägsna S9 och behandlingsmedium,
If the cytokinesis-block technique is used, only the frequencies of binucleate cells with micronuclei (independent of the number of micronuclei per cell) are used in the evaluation of micronucleus induction.
tillsätt färskt medium och cytoB,
The scoring of the numbers of cells with one, two, or more micronuclei can be reported separately and could provide useful information, but is not mandatory.
skörda efter 1,5–2,0 normala cellcykler efter inledandet av behandlingen.
Concurrent measures of cytotoxicity and/or cytostasis for all treated, negative and positive control cultures should be determined (16).
Behandla 3–6 timmar,
The CBPI or the RI should be calculated for all treated and control cultures as measurements of cell cycle delay when the cytokinesis-block method is used.
avlägsna behandlingsmedium,
In the absence of cytoB, the RPD or the RICC should be used (see Appendix 2).
behandling
The concurrent negative control is considered acceptable for addition to the laboratory historical negative control database as described in paragraph 50.
Behandla under 1,5–2 normala cellcykellängder med tillsats av cytoB,
Concurrent positive controls (see paragraph 50) should induce responses that are compatible with those generated in the laboratory's historical positive control data base and produce a statistically significant increase compared with the concurrent negative control.
skörda i slutet av behandlingsperioden.
Cell proliferation criteria in the solvent control should be fulfilled (paragraph 25-27).
Cellinjer som behandlas utan cytoB
All experimental conditions were tested unless one resulted in positive results (paragraphs 36-40).
(samma som de behandlingsscheman som anges ovan utom att cytoB inte tillsätts)
Adequate number of cells and concentrations are analysable (paragraphs 28 and 44-46).
I monolagerodlingar kan det finnas mitotiska celler (som identifieras genom att de är runda och lösgör sig från ytan) i slutet av behandlingen på 3–6 timmar.
The criteria for the selection of top concentration are consistent with those described in paragraphs 24-31.
Om det finns bevis för en betydande ökning av antalet mitotiska celler jämfört med kontrollerna, vilket tyder på en sannolik mitotisk hämning, bör cellerna samlas in genom centrifugering och tillsättas till odlingarna igen, så att man undviker risken att förlora celler i mitos och risken för mikrokärn-/kromosomavvikelser vid skördetidpunkten.
Providing that all acceptability criteria are fulfilled, a test chemical is considered to be clearly positive if, in any of the experimental conditions examined (see paragraphs 36-39):
Skörd av celler och beredning av utstryksglas
at least one of the test concentrations exhibits a statistically significant increase compared with the concurrent negative control (89)
Varje odling bör skördas och hanteras separat.
the increase is dose-related in at least one experimental condition when evaluated with an appropriate trend test (see paragraph 28)
Cellerna kan förberedas med hypoton behandling, men detta steg är inte nödvändigt om lämplig cellspridning kan åstadkommas på annat sätt.
any of the results are outside the distribution of the historical negative control data (e.g. Poisson-based 95 % control limits; see paragraph 52).
Olika tekniker kan användas för beredningen av utstryksglasen, förutsatt att cellberedningar av hög kvalitet för klassificeringen erhålls.
When all of these criteria are met, the test chemical is then considered able to induce chromosome breaks and/or gain or loss in this test system.
Celler med intakta cellmembran och cytoplasma bör behållas för att ge möjlighet att detektera mikrokärnor och (vid metoden med blockering av cytokines) tillförlitlig identifiering av binukleära celler.
Recommendations for the most appropriate statistical methods can also be found in the literature (90) (91) (92).
Utstryksglasen kan färgas med olika metoder, såsom Giemsa eller fluorescerande DNA-specifika färgämnen.
Providing that all acceptability criteria are fulfilled, a test chemical is considered clearly negative if, in all experimental conditions examined (see paragraphs 36-39):
Användningen av lämplig fluoresceinfärgning (t.ex. akridinorange (78) eller Hoechst 33258 plus pyronin-Y (79)) kan eliminera några av de artefakter som ar associerade med användning av ett färgämne som inte är DNA-specifikt.
all results are inside the distribution of the historical negative control data (e.g. Poisson-based 95 % control limits; see paragraph 52).
Anti-kinetokor-antikroppar, FISH-teknik med pancentromera DNA-prober eller primad in situ-märkning med pancentromerspecifik primer, tillsammans med lämplig DNA-motfärgning kan användas för att identifiera innehållet (hela kromosomer färgas medan acentriska kromosomfragment inte färgas) av mikrokärnor om man är intresserad av mekanismer för hur de bildas (16) (17).
The test chemical is then considered unable to induce chromosome breaks and/or gain or loss in this test system.
Andra metoder för differentiering mellan klastogener och aneugener kan användas om de har visat sig vara effektiva och är validerade.
There is no requirement for verification of a clear positive or negative response.
För vissa cellinjer kan t.ex. mätningar av kärnor av typen sub-2N som hypodiploida händelser med hjälp av tekniker som bildanalys, laserskanningcytometri eller flödescytometri också ge användbar information (80) (81) (82).
In case the response is neither clearly negative nor clearly positive as described above and/or in order to assist in establishing the biological relevance of a result, the data should be evaluated by expert judgement and/or further investigations.
Morfologiska observationer av kärnor kan också ge indikationer på eventuell aneuploidi.
Scoring additional cells (where appropriate) or performing a repeat experiment possibly using modified experimental conditions (e.g. concentration spacing, other metabolic activation conditions [i.e. S9 concentration or S9 origin]) could be useful.
Ett test avseende metafas-kromosomavvikelser, företrädesvis av samma celltyp och protokoll med jämförbar sensitivitet, kan också vara ett användbart sätt att avgöra om mikrokärnorna beror på kromosombrott (med vetskap om att kromosomförlust inte upptäcks i testet avseende kromosomavvikelser).
In rare cases, even after further investigations, the data set will not allow a conclusion of positive or negative, and will therefore be concluded as equivocal.
Alla utstryksglas, inklusive glasen från lösningsmedelskontrollerna och de obehandlade kontrollerna (om sådana används) samt de positiva kontrollerna, bör ges en oberoende kodning före mikroskopanalysen av mikrokärnornas frekvenser.
Test chemicals that induce micronuclei in the MNvit test may do so because they induce chromosome breakage, chromosome loss, or a combination of the two.
I cytoB-behandlade odlingar bör mikrokärnornas frekvenser analyseras i minst 2000 binukleära celler per koncentration och kontroll (83), lika fördelade mellan replikaten om sådana används.
Further analysis using anti-kinetochore antibodies, centromere specific in situ probes, or other methods may be used to determine whether the mechanism of micronucleus induction is due to clastogenic and/or aneugenic activity.
När det gäller enstaka odlingar per dos (se punkt 28) bör åtminstone 2000 binukleära celler per odling (83) klassificeras i den enstaka odlingen.
reactivity of the test chemicals with the solvent/vehicle or cell culture media;
Om betydligt mindre antal än 1000 binukleära celler per odling (för dubbla odlingar), eller 2000 (för enstaka odlingar) finns att tillgå för analys för varje koncentration och en väsentlig ökning av mikrokärnor inte upptäcks, bör testet upprepas med användning av flera celler eller vid mindre cytotoxiska koncentrationer, enligt det som är lämpligt.
solubility and stability of the test chemical in solvent, if known;
Man bör vara noga med att inte klassificera binukleära celler med oregelbundna former eller om de två kärnorna skiljer sig betydligt i storlek.
measurement of pH, osmolality, and precipitate in the culture medium to which the test chemical was added, as appropriate.
Dessutom får binukleära celler inte sammanblandas med dåligt spridda flerkärniga celler.
justification for choice of solvent;
Celler som innehåller fler än två huvudkärnor bör inte analyseras för mikrokärnor, eftersom grundvärdet för mikrokärnornas frekvenser kan vara högre i dessa celler (84).
percentage of solvent in the final culture medium
Klassificering av enkärniga celler är godtagbart om testkemikalien har visat sig störa cytoB-aktiviteten.
type and source of cells used;
I sådana fall kan ett upprepat test utan cytoB vara användbart.
suitability of the cell type used;
Klassificering av enkärniga celler förutom binukleära celler kan ge användbar information (85) (86), men är inte obligatoriskt.
absence of mycoplasma, in case of cell lines;
I cellinjer som testas utan cytoB-behandling bör mikrokärnorna klassificeras i minst 2000 celler per testkoncentration och kontroll (83), lika fördelade mellan replikaten om sådana används.
for cell lines, information on cell cycle length or proliferation index;
Om enstaka odlingar används per koncentration (se punkt28) bör minst 2000 celler per odling klassificeras i den enstaka odlingen.
where lymphocytes are used, sex of blood donors, age and any relevant information on the donor, whole blood or separated lymphocytes, mitogen used;
Om betydligt mindre antal än 1000 celler per odling (för dubbla odlingar), eller 2000 (för enstaka odlingar) finns att tillgå för analys för varje koncentration och en väsentlig ökning av mikrokärnor inte upptäcks, bör testet upprepas med användning av flera celler eller vid mindre cytotoxiska koncentrationer, enligt det som är lämpligt.
normal (negative control) cell cycle time;
När cytoB används bör proliferationsindex vid cytokinesinhibering (CBPI) eller replikeringsindex (RI) bestämmas för bedömning av cellproliferationen (se tillägg 2) med användning av minst 500 celler per odling.
methods for the maintenance of cell cultures, for cell lines;
När behandlingar görs utan tillsats av cytoB är det väsentligt att belägg ges för att cellerna i odlingen har delats, enligt beskrivningen punkterna 24–28.
modal number of chromosomes, for cell lines;
För att fastställa att det finns tillräcklig erfarenhet av testet innan det används för rutintestning bör laboratoriet ha utfört en serie försök med positiva referenskemikalier som agerar via olika mekanismer (åtminstone ett med och ett utan metabolisk aktivering och ett som agerar via en aneugenisk mekanism, valt från kemikalierna i tabell 1) och flera negativa kontroller (inklusive obehandlade odlingar och olika lösningsmedel/vehiklar).
Test Conditions:
Detta gäller inte laboratorier som redan har erfarenhet, dvs. har en historisk databas enligt punkterna 49–52.
identity of the cytokinesis blocking substance (e.g. cytoB), if used, and its concentration and duration of cell exposure;
Laboratoriet bör undersöka ett urval av positiva kontrollkemikalier (se tabell 1) med korta och långa behandlingar utan metabolisk aktivering, och även med kort behandlingstid med metabolisk aktivering, för att visa att det har kompetens att upptäcka klastogena och aneugena kemikalier, bestämma effektiviteten hos det metaboliska aktiveringssystemet och visa att klassificeringsförfarandena är lämpliga (visuell mikroskopanalys, flödescytometri, laserskanningcytometri eller bildanalys).
concentration of the test chemical expressed as a final concentration in the culture medium (e.g. μg or mg/mL, or mM of culture medium);
Om data för en historisk negativ kontrollfördelning samlas in först bör de parallella negativa kontrollerna överensstämma med publicerade data för negativa kontroller om sådana finns.
rationale for the selection of concentrations and the number of cultures, including cytotoxicity data and solubility limitations;
Allteftersom kontrollfördelningen kompletteras med fler försöksdata bör de parallella negativa kontrollerna i idealfallet ligga inom fördelningens kontrollgräns på 95 % (87) (88).
composition of media, CO2 concentration, if applicable, humidity level;
Laboratoriets historiska negativa kontrolldatabas kontroll bör inledningsvis baseras på minst 10 försök, men bör helst bestå av minst 20 försök utförda under jämförbara försöksbetingelser.
concentration (and/or volume) of the solvent and test chemical added in the culture medium;
Laboratorierna bör använda kvalitetskontrollmetoder såsom kontrolldiagram (t.ex.
incubation temperature and time;
C-diagram eller X-stapeldiagram (88)), för att fastställa hur variabla deras positiva och negativa kontrolldata är och för att visa att metoden är ”under kontroll” (83).
cell density at seeding, if applicable;
Fler rekommendationer om hur man bygger upp och använder historiska kontrolldatabaser (t.ex. kriterier för att innefatta och utesluta data samt acceptanskriterier för ett givet försök) finns i litteraturen (87).
positive and negative control chemicals, final concentrations, conditions and durations of treatment and recovery periods;
Negativa kontrolldata bör bestå av förekomsten av celler med mikrokärnor från en enda odling eller summan av replikatodlingar enligt beskrivningen i punkt 28.
methods of slide preparation and the staining technique used;
Parallella negativa kontroller bör helst ligga inom kontrollgränsen på 95 % för fördelningen av laboratoriets historiska negativa kontrolldatabas (87) (88).
criteria for scoring micronucleate cells (selection of analysable cells and identification of micronucleus);
Om parallella negativa kontrolldata faller utanför kontrollgränserna på 95 % kan de ändå ingå i den historiska kontrollfördelningen så länge de inte är extremt avvikande och det finns bevis för att testsystemet är under kontroll (se punkt 50) och att inga tekniska eller mänskliga fel begåtts.
numbers of cells analysed;
Om blockering av cytokines används ska endast förekomsten av binukleära celler med mikrokärnor (oavsett antalet mikrokärnor per cell) användas för utvärderingen av inducering av mikrokärnor.
criteria for considering studies as positive, negative, or equivocal;
Analysen av antalet celler med en, två eller flera mikrokärnor kan rapporteras separat och kan ge användbar information, men är inte obligatorisk.
method(s) of statistical analysis used;
Parallella mått på cytotoxicitet och/eller cytostas för alla behandlade odlingar och negativa och positiva kontrollodlingar bör bestämmas (16).
definition of acceptable cells for analysis;
Om cytoB inte tillsätts bör relativ populationsfördubbling (RPD) eller relativ ökning av celltal (RICC) användas (se tillägg 2).
in the absence of cyto B, the number of cells treated and the number of cells harvested for each culture in case of cell lines;
Den parallella negativa kontrollen måste anses godtagbar för registrering i laboratoriet historiska databas över negativa kontroller enligt punkt 50.
measurement of cytotoxicity used, e.g. CBPI or RI in the case of cytokinesis-block method; RICC or RPD when cytokinesis-block methods are not used; other observations if any (e.g. cell confluency, apoptosis, necrosis, metaphase counting, frequency of binucleated cells);
Parallella positiva kontroller (se punkt 50) bör framkalla reaktioner som överensstämmer med de kontroller som genereras i laboratoriets historiska databas över positiva kontroller och ge en statistiskt signifikant ökning jämfört med den parallella negativa kontrollen.
data on pH and osmolality of the treatment medium, if determined;
Cellproliferationskriterierna i lösningsmedelskontrollen bör vara uppfyllda (punkterna 25–27).
distribution of mono-, bi-, and multi-nucleate cells if a cytokinesis block method is used;
Samtliga försöksbetingelser testades om inte ett gav positiva resultat (punkterna 36–40).
number of cells with micronuclei given separately for each treated and control culture, and defining whether from binucleate or mononucleate cells, where appropriate;
Tillräckligt många celler och koncentrationer finns tillgängliga för analys (punkterna 28 och 44–46).
historical negative (solvent) and positive control data, with ranges, means and standard deviation and 95 % control limits for the distribution, as well as the number of data;
Urvalskriterierna för toppkoncentrationen överensstämmer med de kriterier som beskrivs i punkterna 24–
statistical analysis; p-values if any.
Under förutsättning att samtliga acceptanskriterier är uppfyllda anses testkemikalien vara klart positiv om något av följande gäller för någon av de undersökta försöksbetingelserna (se punkterna 36–39):