natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Depending upon the size of the fish, collectable blood volumes generally range from 5 to 60 μl per individual for fathead minnows and 5-15 μl per individual for zebrafish.
bevis för att kontrollerna uppfyller testets godkännandekriterier,
Plasma is separated from the blood via centrifugation, and stored with protease inhibitors at – 80 °C, until analysed for vitellogenin.
uppgifter om mortalitet i alla koncentrationer och i kontrollen,
Alternatively, in medaka the liver will be used, and in zebrafish the head/tail homogenate can be used as tissue-source for vitellogenin determination (Appendix 6).
de statistiska analystekniker som har använts, behandlingen av data och motivering av de tekniker som har använts,
The measurement of VTG should be based upon a validated homologous ELISA method, using homologous VTG standard and homologous antibodies.
uppgifter om biologiska observationer av makromorfologi, inklusive sekundära könskaraktärer och vitellogenin,
It is recommended to use a method capable to detect VTG levels as low as few ng/ml plasma (or ng/mg tissue), which is the background level in unexposed male fish.
resultaten av dataanalyserna, helst i tabellform och grafisk form,
Quality control of vitellogenin analysis will be accomplished through the use of standards, blanks and at least duplicate analyses.
förekomsten av eventuella ovanliga reaktioner hos fiskarna och eventuella synliga effekter som har orsakats av testkemikalien.
For each ELISA method, a test for matrix effect (effect of sample dilution) should be run to determine the minimum sample dilution factor.
RIKTLINJER FÖR TOLKNING OCH GODKÄNNANDE AV TESTRESULTATEN
Each ELISA plate used for VTG assays should include the following quality control samples:
Detta avsnitt innehåller några överväganden som måste göras vid tolkningen av testresultaten för de olika endpoints som uppmätts.
at least 6 calibration standards covering the range of expected vitellogenin concentrations, and at least one non-specific binding assay blank (analysed in duplicate).
Resultaten bör tolkas med försiktighet när testkemikalien förefaller orsaka uppenbar toxicitet eller inverka på försöksdjurens allmäntillstånd.
Absorbance of these blanks should be less than 5 % of the maximum calibration standard absorbance.
När man fastställer intervallet för testkoncentrationerna bör man vara noga med att inte överskrida den högsta tolererade koncentrationen för att möjliggöra en meningsfull tolkning av data.
At least two aliquots (well-duplicates) of each sample dilution will be analysed.
Det är viktigt att ha minst en behandling där det inte finns några tecken på toxiska effekter.
Well-duplicates that differ by more than 20 % should be re-analysed.
Tecken på sjukdom och tecken på toxiska effekter bör utvärderas noggrant och rapporteras.
The correlation coefficient (R2) for calibration curves should be greater than 0,99.
Det är till exempel möjligt att produktionen av VTG hos honor även kan påverkas av den allmänna toxiciteten och av icke-endokrina toxiska verkningsmekanismer, t.ex. hepatotoxicitet.
If the curve is split, both line segments should have R2 > 0,99.
Exempel på intervallerna för de värden som påträffats i kontroll- och behandlingsgrupperna finns i godkännanderapporterna (1, 2, 3, 4).
The ratio of the expected concentration to the measured concentration will be reported along with the results from each set of assays performed on that day.
Valideringsstudierna användes för att utarbeta dessa riktlinjer.
Evaluation of Biomarker Responses by Analysis of Variance (ANOVA)
Om ett laboratorium inte har utfört testet tidigare eller väsentliga förändringar (t.ex. byte av fiskstam eller leverantör) har gjorts är det lämpligt att en teknisk kompetensstudie utförs.
To identify potential endocrine activity of a chemical, responses are compared between treatments and control groups using analysis of variance (ANOVA).
Det rekommenderas att man använder kemikalier som omfattar en rad olika verkningsmekanismer eller som påverkar ett antal olika endpoints.
Where a solvent control is used, an appropriate statistical test should be performed between the dilution water and solvent controls for each endpoint.
I praktiken uppmuntras varje laboratorium att samla in egna historiska kontrolldata för hanar och honor och att utföra ett test med en positiv kontrollkemikalie för östrogenaktivitet (t.ex.
All biological response data should be analysed and reported separately by sex.
17-beta-trenbolon vid 5 μg/l), som leder till induktion av sekundära könskaraktärer hos honor av knölskallelöja och risfisk.
If the required assumptions for parametric methods are not met — non-normal distribution (e.g. Shapiro-Wilk's test) or heterogeneous variance (Bartlett's test or Levene's test), consideration should be given to transforming the data to homogenise variances prior to performing the ANOVA, or to carrying out a weighted ANOVA.
Alla dessa data kan jämföras med tillgängliga data från valideringsstudierna (1, 2, 3) för att säkerställa laboratoriekompetensen.
Dunnett's test (parametric) on multiple pair-wise comparisons or a Mann-Whitney with Bonferroni adjustment (non-parametric) may be used for non-monotonous dose-response.
I allmänhet bör mätningar av vitellogenin anses vara positiva om det finns en statistiskt signifikant ökning av VTG hos hanar (p < 0,05), eller en statistiskt signifikant minskning hos honor (p < 0,05) åtminstone vid den högsta testdosen jämfört med kontrollgruppen, och i avsaknad av tecken på allmän toxicitet.
Other statistical tests may be used (e.g. Jonckheere-Terpstra test or Williams test) if the dose-response is approximately monotone.
Ett positivt resultat bekräftas ytterligare om man kan påvisa ett biologiskt sannolikt samband mellan dosen och responskurvan.
Additional information can also be obtained from the OECD Document on Current Approaches to Statistical Analysis of Ecotoxicity Data (27).
I allmänhet bör ett positivt resultat dock tolkas som bevis för endokrin aktivitet in vivo, och normalt bör man då vidta åtgärder för ytterligare klargöranden.
Reporting of test results
Vitellogenin induction by 17ß-estradiol and 17ß-ethinylestradiol in male zebrafish (Danio rerio).
Study data should include:
Effects of waterborne exposure to 17B-estradiol on secondary sex characteristics and gonads of the fathead minnow (Pimephales promelas).
Responsible personnel and their study responsibilities
Kemikalie
Each laboratory should have demonstrated proficiency using a range of representative chemicals
ett ämne eller en blandning
Characterisation of test chemical
variationskoefficient.
Physical nature and relevant physicochemical properties
Fisktäthet
Solvent:
antalet exemplar per vattenvolym.
Characterization of solvent (nature, concentration used)
ett fosfolipoglykoprotein, en prekursor till ägguleprotein som normalt förekommer hos alla sexuellt aktiva honor av äggläggande arter.
Justification of choice of solvent (if other than water)
HPG-axeln
Test animals:
stressaxeln, bestående av hypotalamus, hypofysen och binjurebarken.
Species and strain
den högsta tolererade koncentrationen, dvs. ungefär 10 % av LC50.
Supplier and specific supplier facility
Försöksbetingelser för endokrint screeningtest på fisk
Details of animal acclimation procedure
Knölskallelöja
Body weight of the fish at the start of the exposure (from a sub-sample of the fish stock)
Sebrafisk
Test Conditions:
Testtyp
Test procedure used (test-type, loading rate, stocking density, etc.);
Genomflödestest
Method of preparation of stock solutions and flow-rate;
Vattentemperatur
The nominal test concentrations, weekly measured concentrations of the test solutions and analytical method used, means of the measured values and standard deviations in the test vessels and evidence that the measurements refer to the concentrations of the test chemical in true solution;
Belysningskvalitet
Dilution water characteristics (including pH, hardness, alkalinity, temperature, dissolved oxygen concentration, residual chlorine levels, total organic carbon, suspended solids and any other measurements made)
Fluorescerande lampor (brett spektrum)
Water quality within test vessels:
10–20 μE/m2/s, 540–1000 lux, eller 50–100 ft-c (omgivande ljusnivåer i laboratoriet)
pH, hardness, temperature and dissolved oxygen concentration;
Fotoperiod (övergångar mellan gryning och skymning är frivilliga, men anses dock inte vara nödvändiga)
Detailed information on feeding (e.g. type of food(s), source, amount given and frequency and analyses for relevant contaminants if available (e.g. PCBs, PAHs and organochlorine pesticides).
16 timmar ljus, 8 timmar mörker
Evidence that the controls met the acceptance criteria of the test;
12–16 timmar ljus, 12–8 timmar mörker
Data on mortalities occurring in any of the test concentrations and control;
< 5 g/l
Statistical analytical techniques used, treatment of data and justification of techniques used;
Testbehållarens storlek
Data on biological observations of gross morphology, including secondary sex characteristics and vitellogenin;
Minst 10 l
Results of the data analyses preferably in tabular and graphical form;
Minst 2 l
Incidence of any unusual reactions by the fish and any visible effects produced by the test chemical
Minst 5 l
This section contains a few considerations to be taken into account in the interpretation of test results for the various endpoints measured.
Minst 8 l
It is important to have at least one treatment where there are no signs of toxic effects.
Volymutbyte av testlösningar
For example, it is possible that production of VTG in females can also be affected by general toxicity and non-endocrine toxic modes of action, e.g. hepatotoxicity.
Minst fem per dag
Examples of the range of values encountered in control and treatment groups are available in the validation reports (1, 2, 3, 4).
Antal fiskar per testkärl
High VTG values in control males could compromise the responsiveness of the assay and its ability to detect weak oestrogen agonists.
6 (2 hanar och 4 honor)
Low VTG values in control females could compromise the responsiveness of the assay and its ability to detect aromatase inhibitors and oestrogen antagonists.
10 (5 hanar och 5 honor)
The validation studies were used to build that guidance.
Antal testkärl
If a laboratory has not performed the assay before or substantial changes (e.g. change of fish strain or supplier) have been made it is advisable that a technical proficiency study is conducted.
= 3 (plus lämpliga kontroller)
It is recommended that chemicals covering a range of modes of action or impacts on a number of the test endpoints are used.
Antal kärl per behandling
In practice, each laboratory is encouraged to build its own historical control data for males and females and to perform a positive control chemical for estrogenic activity (e.g. 17β-estradiol at 100 ng/l, or a known weak agonist) resulting in increased VTG in male fish, a positive control chemical for aromatase inhibition (e.g. fadrozole or prochloraz at 300 μg/l) resulting in decreased VTG in female fish, and a positive control chemical for androgenic activity (e.g. 17β-trenbolone at 5 μg/l) resulting in induction of secondary sex characteristics in female fathead minnow and medaka.
Minst 4
All these data can be compared to available data from the validation studies (1, 2, 3) to ensure laboratory proficiency.
Minst 2
In general, vitellogenin measurements should be considered positive if there is a statistically significant increase in VTG in males (p < 0,05), or a statistically significant decrease in females (p < 0,05) at least at the highest dose tested compared to the control group, and in the absence of signs of general toxicity.
Antal fiskar per testkoncentration
A positive result is further supported by the demonstration of a biologically plausible relationship between the dose and the response curve.
16 vuxna honor och 8 hanar (4 honor och 2 hanar i varje replikatkärl)
As mentioned earlier, the vitellogenin decrease may not entirely be of endocrine origin;
10 vuxna honor och 10 hanar (5 honor och 5 hanar i varje replikatkärl)
however a positive result should generally be interpreted as evidence of endocrine activity in vivo, and should normally initiate actions for further clarification.
Utfodring
Vitellogenin induction by 17β-estradiol and 17β-ethinylestradiol in male zebrafish (Danio rerio).
Levande eller frysta vuxna eller nauplier av Artemia två eller tre gånger dagligen (ad libitum), kommersiellt tillgängligt foder eller en blandning av dessa
Development of an ELISA for determination of the hepatic vitellogenin in Medaka (Oryzias latipes).
Artemia-nauplier två eller tre gånger dagligen (ad libitum), kommersiellt tillgängligt foder eller en blandning av dessa
Fish full life-cycle testing for androgen methyltestosterone on medaka (Oryzias latipes).
Ingen såvida inte halten löst syre sjunker under 60 % luftmättnad
Screening and testing for endocrine disruption in fish-biomarkers as “signposts”, not “traffic lights”, in risk assessment.
Rent yt- eller brunnsvatten, rekonstituerat vatten eller avklorerat kranvatten
Effects of waterborne exposure to 17β-estradiol on secondary sex characteristics and gonads of the fathead minnow (Pimephales promelas).
Förexponeringsperiod
Villeneuve and G.T.
7 dagar rekommenderas
Ankley.
Den kemiska exponeringens varaktighet
Abbreviations & definitions
Biologiska endpoints
Chemical
överlevnad
A substance or a mixture
beteende
Coefficient of variation.
sekundära könskaraktärer
Loading rate
Några kemiska egenskaper för godtagbart utspädningsvatten
Hypothalamic-pituitary-gonadal axis.
en instrumentskål av glas, t.ex.
MTC
22 × 15 × 5,5 cm (längd × bredd × djup), täckt med ett avtagbart trådgaller av rostfritt stål (maskstorlek 2 mm).
Maximum Tolerated Concentration, representing about 10 % of the LC50.
Gallret bör täcka instrumentskålens öppning på en nivå som ligger under kanten.
Experimental conditions for the fish endocrine screening assay
På gallret fästs ett leksubstrat.
Recommended species
Plastmaterialet bör lakas ut i en tillräcklig volym med varmt vatten under tillräckligt lång tid för att säkerställa att inga kemikalier läcker ut i testvattnet.
Fathead minnow
Vid användning av material av glas bör man se till att fiskarna varken skadas eller blir trängda under sina intensiva rörelser.
(Pimephales promelas)
Avståndet mellan skålen och glasrutorna bör vara minst 3 cm för att säkerställa att fiskarna inte leker utanför skålen.
Medaka (Oryzias latipes)
Den rom som läggs i skålen faller ner genom gallret och kan samlas in 45–60 minuter efter att belysningen tänts.
Zebrafish
De genomskinliga äggen är inte vidhäftande och kan lätt räknas i transversellt ljus.
Test type
Om man använder fem honor per kärl kan äggantal på under 20 per dag räknas som ett lågt, upp till 100 som ett genomsnittligt och mer än 100 som ett högt antal.
Illumination quality
I annat fall kan leksubstratet som trigger framkalla individuell parning och lek på ovanliga tider.
Fluorescent bulbs (wide spectrum)
Om situationen kräver ett senare införande av lekskålen bör detta göras tidigast nio timmar efter att belysningen har tänts.
Light intensity 10-20 μE/m2/s, 540-1000 lux, or 50-100 ft-c (ambient laboratory levels)
Vid denna sena tidpunkt på dagen framkallas inte lekbeteendet längre.
10-20 μE/m2/s, 540-1000 lux, or 50-100 ft-c (ambient laboratory levels)
Tillägg 4B
Photoperiod (dawn/dusk transitions are optional, however not considered necessary)
Leksubstrat för knölskallelöja
16 h light, 8 h dark
Två eller tre kombinerade lekplattor och -skålar av keramik/plast/glas eller rostfritt stål placeras i varje testbehållare (t.ex. en 80 mm lång grå halvcirkelformad ränna i en 130 mm lång skål med uppvikt kant) (se bilden).
12-16 h light, 12-8 h dark
Korrekt härdad PVC eller keramiska plattor har visat sig vara lämpliga som leksubstrat (Thorpe et al, 2007).
< 5 g per l
Det rekommenderas att plattorna är nötta för att förbättra vidhäftningen.
Test chamber size
Skålen bör också avskärmas för att förhindra fiskarna från komma åt de lagda äggen såvida inte äggens vidhäftningsförmåga har påvisats för det leksubstrat som används.
10 l (minimum)
Basen är utformad för att samla upp alla ägg som inte fastnar på plattans yta och därför annars skulle falla till akvariets botten (eller de ägg som läggs direkt på den platta plastbasen).
2 l (minimum)
Alla leksubstrat bör lakas ur i utspädningsvatten under minst tolv timmar före användning.
5 l (minimum)
Tillägg 5A
Test solution volume
Bedömning av sekundära könskaraktärer hos knölskallelöja för påvisande av vissa endokrint aktiva kemikalier
8 l (minimum)
Översikt
l (minimum)
Potentiellt viktiga kännetecken för det fysiska utseendet hos vuxna knölskallelöjor i tester av hormonstörande ämnen omfattar kroppsfärgen (dvs. ljus/mörk), färgmönster (dvs. förekomst eller avsaknad av vertikala strimmor), kroppsformen (dvs. formen på huvudet och det pektorala området, uttänjd buk), och särskilda sekundära könskaraktärer (dvs. parningstuberklernas antal och storlek, storleken på nackvalken och äggläggningsröret).
4 l (minimum)
Parningstuberklerna återfinns på huvudet (nackvalken) på reproduktivt aktiva hanar av knölskallelöja, och sitter normalt i ett bilateralt symmetriskt mönster (Jensen m.fl., 2001).
Volume exchanges of test solutions
Kontrollhonor och unga hanar och honor utvecklar inte några tuberkler (Jensen m.fl., 2001).
Minimum of 6 daily
Det kan förekomma upp till åtta enskilda tuberkler runt ögonen och mellan hanarnas luktgropar.
Minimum of 5 daily
Det flesta och största tuberklerna är belägna i två parallella linjer omedelbart under luktgroparna och ovanför munnen.
Age of test organisms See paragraph 20
Många fiskar har grupper av tuberkler under underkäken.
See paragraph 20
De som sitter närmast munnen förekommer i regel som ett enda par, medan de som är belägna mer ventralt kan bestå av upp till fyra tuberkler.
See paragraph 20 12.
Det faktiska antalet tuberkler är sällan mer än 30 (intervall 18–28; Jensen m.fl., 2001).
Approximate wet weight of adult fish (g) Females:
De mest framträdande tuberklerna (mätt i antal) utgörs av en enda, relativt rund struktur med en höjd som ungefär motsvarar radien.
1,5 ± 20 %
De flesta reproduktivt aktiva hanar har också åtminstone några tuberkler som är förstorade och framträdande så att de inte kan särskiljas som enskilda strukturer.
Males:
Vissa typer av endokrinstörande kemikalier kan förorsaka abnorma förekomster av vissa sekundära könskaraktärer hos det motsatta könet.
2,5 ± 20 %
Agonister som påverkar androgenreceptorer, såsom 17-beta-metyltestosteron eller 17-beta-trenbolon, kan få honor av knölskallelöja att utveckla tydliga parningstuberkler (Smith 1974; Ankley m.fl., 2001, 2003), medan agonister som påverkar östrogenreceptorer kan minska parningstuberklernas antal eller storlek hos hanar (Miles-Richardson m.fl., 1999, Harries m.fl., 2000).
Females:
Nedan följer en redogörelse av karakteriseringen av parningstuberkler hos knölskallelöja på grundval av de förfaranden som används vid den amerikanska miljöskyddsmyndighetens (EPA) laboratorium i Duluth, Minnesota.
0,35 ± 20 %
Särskilda produkter och/eller utrustning kan ersättas med tillgängliga jämförbara material.
0,65 ± 20 %
Fiskarna kan bäst observeras med hjälp av ett belyst förstoringsglas eller i ett belyst dissekeringsmikroskop med 3x förstoring.
0,4 ± 20 %
Observera fiskarna dorsalt och med den främre delen framåt (huvudet mot betraktaren).
No. of fish per test vessel
Placera fisken i liten petriskål (t.ex.
6 (2 males and 4 females)
100 mm i diameter), med främre delen framåt och buksidan nedåt.
10 (5 males and 5 females)
Fokusera sökaren för att göra det möjligt att identifiera tuberklerna.
No. of treatments
Rulla långsamt och försiktigt fisken från sida till sida för att identifiera tuberkelområdena.
= 3 (plus appropriate controls)
Räkna och klassificera tuberklerna.
No. vessels per treatment
Upprepa observationen på den ventrala huvudytan genom att placera fisken på ryggen med huvudet framåt i petriskålen.
4 minimum
Observationerna bör göras inom två minuter för varje fisk.
2 minimum
Tuberkelräkning och klassificering
No. of fish per test concentration
Sex särskilda områden har fastställts för bedömning av förekomsten och utvecklingen av tuberkler hos vuxna knölskallelöjor.
16 adult females and 8 males (4 females and 2 males in each replicate vessel)
En mall har utarbetats för att kartlägga var och i vilket antal tuberklerna förekommer (se slutet av detta tillägg).
10 adult females and 10 males (5 females and 5 males in each replicate vessel)
Antalet tuberkler registreras och deras storlek rangordnas kvantitativt enligt följande:
Feeding regime
aknas, 1–förekommer, 2–förstorad och 3–framträdande för varje organism (figur 1).
Live or frozen adult or nauplii brine shrimp two or three times daily (ad libitum), commercially available food or a combination of the above
Klassificera avsaknaden av tuberkler som 0.
Brine shrimp nauplii two or three times daily (ad libitum), commercially available food or a combination of the above
Klassificeringen 1–förekommer definieras som alla tuberkler som har en enda punkt vars höjd är nästan lika med dess radie (diameter).
None unless DO concentration falls below 60 % air saturation
Klassificeringen 2–förstorad definieras som vävnad som liknar en asterisk, vanligtvis med en stor radial bas med räfflor eller fåror som utgår från medelpunkten.
Clean surface, well or reconstituted water or dechlorinated tap water
På höjden är tuberkeln ofta mer taggig men kan ibland vara något avrundad.
Pre-exposure period
Klassificeringen 3–framträdande refererar till vanligtvis ganska stora och rundade tuberkler med mindre definition i strukturen.
7 days recommended
Ibland växer dessa tuberkler ihop och utgör en enda massa längs ett enskilt område eller en kombination av områden (B, C och D enligt beskrivning nedan).
Chemical exposure duration
Färgen och utformningen liknar dem för klassificering 2 men är ibland ganska godtyckliga.
Biological endpoints
Med hjälp av detta klassificeringssystem får man i allmänhet ett totalt tuberkelpoängvärde på < 50 för en normal kontrollhane som har 18–20 tuberkler (Jensen m.fl., 2001).
survival
Det faktiska antalet tuberkler hos vissa fiskar kan vara större än antalet mallrutor (tillägg A) för ett visst klassificeringsområde.
behaviour
Om detta är fallet kan ytterligare klassificeringsnummer läggas till inom, till höger eller till vänster om rutan.
sex characteristics
Mallen behöver därför inte vara symmetrisk.
VTG
Ytterligare en metod för kartläggning av tuberklerna som sitter ihop två och två eller vertikalt längs munnens horisontalplan är att dubbelmarkera två tuberkelklassificeringspoäng i en enda ruta.
Test acceptability
Kartläggningsregioner:
Dissolved oxygen > 60 % of saturation;
A Tuberkler belägna runt ögat.
mean temperature of 25 ± 2 °C;
Kartläggs från rygg till buk runt främre kanten på ögat.
90 % survival of fish in the controls;
Vanligtvis i flertal hos fullt utvecklade kontrollhanar, saknas hos kontrollhonor, vanligtvis parvis (en nära varje öga) eller i ental hos honor som exponerats för androgener.
measured test concentrations within 20 % of mean measured values per treatment level.
B Tuberkler belägna mellan luktgroparna (sinneskanalporer).
mean temperature of 24 ± 2 °C;
Vanligtvis parvis hos kontrollhanar vid mer förhöjda nivåer (2–förstorad eller 3–framträdande).
mean temperature of 26 ± 2 °C;
Saknas hos kontrollhonor med viss förekomst och utveckling hos honor som exponerats för androgener.
Some chemical characteristics of acceptable dilution water
C Tuberkler belägna omedelbart framför luktgroparna, parallellt med munnen.
< 20 mg/l
I allmänhet förstorade eller framträdande hos fullt utvecklade kontrollhanar.
< 2 mg/l
Förekommer eller förstorade hos mindre utvecklade hanar eller androgenbehandlade honor.
Total organophosphorus pesticides
D Tuberkler belägna parallellt med munlinjen.
Appendix 4A
E Tuberkler belägna på underkäken, nära munnen, vanligtvis små och vanligen i par.
Spawning substrate for zebrafish
Varierar hos kontrollhanar och behandlade hanar samt behandlade honor.
Spawning tray
F Tuberkler belägna ventralt jämfört med E. Vanligen små och i par.