natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Tyler (2004), “Successful detection of (anti-) androgenic and aromatase inhibitors in pre-spawning adult fathead minnows (Pimephales promelas) using easily measured endpoints of sexual development”, Aquatic Toxicology 70, pp. 11-21.
Permanent identifiera färgade preparat på ett sätt som möjliggör fullständig spårbarhet.
Petersen, and P. Bjerregaard (2007), “Effects of the fungicide prochloraz on the sexual development of zebrafish (Danio rerio)”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 145, pp. 165-170.
Färgning
Chapter C.14 of this Annex, Fish Juvenile Growth Test.
a.
Chapter C.4 of this Annex, Ready Biodegradability.
Täckglasen lufttorkas över natten före färgningen.
Chapter C.37 of this Annex, 21-Day Fish Assay:
b.
A Short Term Screening for Oestrogenic and Androgenic Activity, and Aromatase Inhibition.
Preparaten färgas med hematoxylin-eosin.
Schäfers, C., Teigeler, M., Wenzel, A., Maack, G., Fenske, M., Segner, H (2007), “Concentration- and time-dependent effects of the synthetic estrogen, 17 alpha-ethinylestradiol, on reproductive capabilities of the zebrafish, Danio rerio” Journal of Toxicology and Environmental Health-Part A, 70, 9-10 pp 768-779.
Täckning av preparaten med täckglas
Apical endpoint
Täckglas kan läggas på antingen manuellt eller automatiskt.
Causing effect at population level
b.
Air saturation value
Ett objektglas sänks ned i xylen eller TissueClear, och överskottet av xylen/TissueClear skakas försiktigt av från glaset.
Biomarker
c.
Causing effect at individual level
Ca 0,1 ml monteringsmedium appliceras nära objektglasets kant mitt emot den mattslipade kanten eller på täckglaset.
A substance or a mixture.
d.
Days post hatch
Täckglaset vinklas i spetsig vinkel när det anbringas mot objektglaset.
Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish
Märkning
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
a.
Fish weight
Etiketten på varje objektglas ska innehålla följande information.
Fish wet weight (blotted dry)
i.
FSDT
Laboratoriets namn
Fish Sexual Development Test
Provexemplar nr/Objektglas nr
Hypothalamic-pituitary-gonadal axis
Kemikalie / Behandlingsgrupp
Intersex fish
Statistiskt flödesschema för vitellogeninanalys
Fish with more than one oocyte in testis per 6 sections analysed or spermatogenetic cells in ovaries (yes/no)
>=4 replikat per koncentration
Wet weight of fish per volume of water
Tamhane-Dunnetts test på nästlad ANOVA
Mode of action
Dunns eller Mann-Whitneys test på replikat- medelvärden
Reverse Transcriptase Polymerase Chain-Reaction
Replikatmedelvärden normalfördelade
Undifferentiated fish
Dunnetts test
Fish with gonads exhibiting no discernible germ cells.
Variansstabiliserande omvandling?
Vitellogenin
<=3 replikat per koncentration
Experimental conditions for the FSDT (freshwater species)
Dunns test
Japanese medaka (Oryzias latipes)
Uteslut vattenkontrollen Dunns test
Zebrafish (Danio rerio)
>=4 replikat per koncentration
Three-spined Stickleback (Gasterostreus aculeatus)
Jonckheeres eller Williams test (step-down)
Flow-through or semi-static
Kombinera kontrollerna, behåll undergrupperna
Fluorescent bulbs (wide spectrum
Jämför controller med Wilcoxon-test eller t-test.
Light intensity
Skiljer sig kontrollerna åt?
10-20 μE/m2/s, 540-1080 lux, or 50-100 ft-c (ambient laboratory levels)
Används både lösningsmedelskontroller och kontroller utan lösningsmedel?
12-16 h light, 8-12 h dark
Statistiskt flödesschema för analys av könsfördelningen
Minimum chamber size
Använd step-down-grundat Jonckheere-Terpstras test (+) för bestämning av NOEC
Individual chambers should contain a minimum of 7 l water volume
Dunns eller Mann-Whitneys U-test m./Bonferroni-Holm-justering för bestämning av NOEC
Age of test organisms at start of exposure
Använd Dunnetts test om varianserna är homogena (*), annars Tamhane-Dunnetts (T3) test för bestämning av NOEC
Newly fertilised eggs (Early blastula stage)
Är data normalfördelade?
Newly fertilised eggs
Är erhållna data förenliga med monoton dos-respons?
No. of eggs per treatment
(‡) Eller något annat överenskommet kontrollurval
Minimum 120
Efter arcsin-kvadratrotstransformation
Minimum 3 (plus appropriate controls)
(+) Med färre ån fem testenheter per behandling bör om möjligt exakta J-T:s eller M-W:s test användas
No. replicates per treatment
Kombinera kontrollerna
Minimum 4 (unless square root allocation to controls)
Uteslut vattenkontrollen (‡)
Live Artemia, frozen adult brine shrimp, flake food, etc.
Jämför kontrollerna med t-test.
It is recommended to feed twice daily
Används lösningsmedel?
Special fry food, live Artemia, frozen adult brine shrimp, flake food, etc.
Tillägg 9
It is recommended to feed twice daily
Vägledning för vävnadsprovtagning för bestämning av genetiskt kön och för bestämning av genetiskt kön med PCR-metoden
None unless DO concentration falls below 60 % saturation
Vävnadsprovtagning, beredning och lagring före bestämning av det genetiska könet hos risfiskar med PCR-metoden (utarbetad av Laboratory for Aquatic Organisms hos Bayer CropScience AG)
None unless DO concentration falls below 70 % saturation
Analfenan eller ryggfenan klipps av från varje fisk med en fin sax och placeras i ett rör med 100 μl extraktionsbuffert 1 (för information om beredning av buffertlösning, se nedan).
Clean surface, well or reconstituted water
Saxen ska rengöras efter varje enskild fisk i en bägare fylld med destillerat H2O och torkas av med ett mjukt papper.
Test chemical exposure duration
Fenvävnaderna homogeniseras nu med en teflonbelagd mortelstöt för mikrorör för att uppnå lysis hos cellerna.
Hatching success, Survival Gross- morphology, VTG gonadal histology, Genetic sex, Sex ratio
För varje rör används en ny mortelstöt för att förhindra kontaminering.
Hatching success > 80 %
Extraktionen går dock lättare om man extraherar DNA samtidigt (hantering se ovan; proven ska tinas på is efter lagring vid – 80 °C innan bufferten fyllas på i rören).
Post hatch survival ≥ 70 %
Efter homogeniseringen placeras alla rör i vattenbad och kokas i 15 minuter vid 100 °C.
growth (Fish wet weight, blotted dry) > 150 mg
Sedan pipetteras 100 μl av extraktionsbuffert 2 (information om beredning av buffertlösning finns nedan) till varje provrör.
growth (Fish wet weight, blotted dry) > 75 mg
Proven förvaras vid rumstemperatur i 15 minuter, och skakas ibland under tiden försiktigt för hand.
growth (Fish wet weight, blotted dry) > 120 mg
Därefter placeras alla rör i vattenbadet igen och kokas i ytterligare 15 minuter vid 100 °C.
Length (standard length) > 20mm
Rören fryses vid – 20 °C och lagras för ytterligare analys.
Length (standard length) > 14 mm
Beredning av buffertlösning
Length (standard length) > 20 mm
PCR-buffert 1:
Sex ratio (% males or females) 30 %-70 %
500 mg N-lauroylsarkosin (t.ex.
Chemical characteristics of an acceptable dilution water
Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland)
CONCENTRATION
ad 100 ml dest.
Particular matter
→ autoklavera
From test method C.14/Guidance on test concentrations
PCR-buffert 2:
Column (Number of concentrations between 100 and 10, or between 10 and 1) [1]
20 g Chelex (t.ex.
A series of three (or more) successive concentrations may be chosen from a column.
Biorad, München, Tyskland)
Mid-points between concentrations in column (x) are found in column (2x + 1).
Låt svälla i 100 ml dest.
The values listed can represent concentrations expressed as percentage per volume or weight (mg/l or μg/l).
Bestämning av det genetiska könet (genom PCR-metoden) hos risfiskar (utarbetad av Laboratory for Aquatic Organisms hos Bayer CropScience AG och Universität Würzburg Biozentrum)
Values can be multiplied or divided by any power of 10 as appropriate.
De beredda och frysta rören (som beskrivs i avsnittet ovan) tinas på is.
Column 1 might be used if there was considerable uncertainty on the toxicity level.
Den klara supernatanten som separerats från utfällningen används för PCR.
Guidance for homogenisation of head & tail from juvenile zebrafish, fathead minnow, three spined stickleback and Japanese medaka
Man måste absolut undvika att några spår av Chelex (lokaliserad i utfällningen) överförs till PCR-reaktionen, eftersom detta skulle påverka ’Taq’-polymerasaktiviteten.
The purpose of this section is to describe the procedures that occur prior to the quantification of the VTG concentration.
Supernatanten ska användas direkt eller kan lagras fryst (vid – 20 °C) och tinas upp igen i flera omgångar utan några negativa effekter på DNA:t för senare analyser.
Other procedures that result in comparable VTG quantification can be used.
Beredning av reaktionsblandning ’Reaction Mix’ (25 μl per prov):
It is an option to determine the VTG concentration in blood plasma or liver instead of head/tail homogenate.
Volym
The head and tail are cut of the fish in accordance with the test description.
Slutlig koncentration
All dissection instruments, and the cutting board should be rinsed and cleaned properly (e.g. with 96 % ethanol) between handling of each single fish to prevent “VTG pollution” from females or induced males to un-induced males.
Templat-DNA
When a homogenous mass is achieved an amount of 4-10 time the tissue weight of ice-cold homogenisation buffer is added (note the dilution).
0,5 μl–2 μl
The samples are placed on ice until centrifugation at 4 °C at 50000 g for 30 min.
buffert med MgCl2
Use a pipette to dispense portions of 20 to 50 μl (note the amount) supernatant into at least two tubes by dipping the tip of the pipette below the fat layer on the surface and carefully sucking up the supernatant without fat- or pellet fractions.
2,5 μl
Place on ice during use
Nukleotider (var och en av dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Homogenisation buffer:50 mM Tris-HCl pH 7,4;
Forward primer (10μM) (se nedan 3–5)
12 ml Tris-HCl pH 7,4 + 120 μl Protease inhibitor cocktail (or equivalent protease inhibitor cocktails).TRIS:
Reverse primer (10 μM) (se nedan 3–5)
TRIS-ULTRA PURE (ICN)Protease inhibitor cocktail:
Vatten (av PCR-kvalitet)
From Sigma (for mammalian tissue) Product number P 8340.
upp till 25 μl
Guidance for quantification of head & tail homogenate vitellogenin in zebrafish (Danio rerio) (modified from Holbech et al., 2001). other procedures using homologous antibodies and standards can be used
Taq E-polymeras
Purified zebrafish vitellogenin standard [1] is serially diluted to 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10 and 20 ng/ml in dilution buffer (**) and samples are diluted at least 200 times (to prevent matrix effect) in dilution buffer and applied to the plates.
buffert med MgCl2:
An assay control is applied in duplicate.
670 mM Tris/HCl (pH 8,8 vid 25 °C), 160 mM (NH4)2SO4, 25 mM MgCl2, 0,1 % Tween 20
150 μl are applied to each well.
Beredning av agarosgel (1 %) – medan PCR-programmen pågår:
Standards are applied in duplicate and samples in triplicate.
Lös upp 3 g agaros i 300 ml 1 × TAE-buffert (1 % agarosgel)
Incubate over night at 4 °C on a shaker.
Denna lösning bör kokas i en mikrovågsugn (ca 2–3 minuter)
The plates are washed 5 times with washing buffer (*)
Överför den varma lösningen till en särskild gjutlåda, som ligger på is
HRP coupled to a dextran chain (e.g. AMDEX A/S, Denmark) and conjugated antibodies are diluted in washing buffer;
Efter ca 20 min är agarosgelen färdig för användning
Actual dilution differs by batch and age.
Förvara agarosgelen i 1 × TAE-buffert till dess att PCR-programmen avslutats
150 μl are applied to each well and the plates are incubated for 1 hour at room temperature on a shaker.
Aktin-PCR-program:
The plates are washed 5 times with washing buffer (*) and the bottom of the plates is carefully cleaned with ethanol.
Denna PCR-reaktion syftar till att visa att DNA i provet inte skadas.
150 μl TMB plus (***) are applied to each well.
Särskild primer:
Protect the plate against light with tinfoil, and watch the colour development on a shaker.
’Mact1(upper/forward)’ → TTC AAC AGC CCT GCC ATG TA
When the standard curve is fully developed the enzyme activity is stopped by adding 150 μl 0,2 M H2SO4 to each well.
’Mact2(lower/reverse)’ → GCA GCT CAT AGC TCT TCT CCA GGG AG
The absorbance is measured at 450 nm (e.g. on a Molecular Devices Thermomax plate reader).
Program:
Data are analysed on the associated software (e.g. Softmax).
Cykel (35 ggr):
Washing buffer:
Denaturering
PBS-stock (****)
→ 45 sek. vid 95 °C
Adjust pH to 7,3 and fill to 5 l with millipore H2O.
Hybridisering
Store at 4 °C.
→ 45 sek. vid 56 °C
Dilution buffer:
Elongering
PBS-Stock (****)
→ 1 min. vid 68 °C
Adjust pH to 7,3 and fill to 1 l with millipore H2O.
15 min. vid 68 °C
TMB plus is a “ready-to-use” substrate produced by KemEnTec (Denmark).
X- och Y-gen-PCR-program:
It is sensitive to light.
Proven med intakt DNA används i detta PCR-program för att påvisa X- och Y-gener.
PBS stock
Hanligt DNA bör uppvisa ett dubbelband och honligt DNA bör uppvisa ett enda band (efter färgning och gel-elektrofores).
HPO4 · 2H2O
I denna programkörning bör en positiv kontroll för hanar (XY-prov) och en för honor (XX-prov) inkluderas.
Adjust pH to 6,8 and fill with millipore H2O to 2 l.
’PG 17.5’ (upper/forward) → CCG GGT GCC CAA GTG CTC CCG CTG
Store at room temperature.
’PG 17.6’ (lower/reverse) → GAT CGT CCC TCC ACA GAG AAG AGA
Battelle AP4.6.04 (1,18 mg/ml (AAA)), purified according to:
Cykel (40 ggr):
Guidance for the preparation of tissue sections for sex determination and staging of gonads
→ 45 sek. vid 55 °C
The purpose of this section is to describe the procedures that occur prior to the evaluation of histological sections.
→ 1 min.
Other procedures that result in similar sex determination and gonadal staging can be used.
30 sek. vid 68 °C
With a few exceptions, these procedures are similar for Japanese medaka (JMD) and zebrafish (ZF).
Y-gen-PCR-program som ’kontroll’ för X- och Y-gen-PCR-programmet:
Euthanasia, Necropsy, and Tissue Fixation
’DMTYa (upper/forward)’ → GGC CGG GTC CCC GGG TG
Objectives:
’DMTYd (lower/reverse)’ → TTT GGG TGA ACT CAC ATG G
Provide for the humane sacrifice of fish.
Färgning av PCR-proven:
Obtain necessary body weights and measurements.
Färgningslösning:
Evaluate secondary sex characteristics.
0,25 % bromfenolblått
Dissect tissues for VTG analysis.
0,25 % xylencyanol
Fixation of the gonads.
Pipettera 1 μl av färglösningen till varje enskilt rör
Procedures:
Påbörja gelelektroforesen:
Fish should be sacrificed immediately prior to necropsy.
Den beredda 1 % agarosgelen överförs till en gelelektrofores-kammare fylld med 1 × TAE-buffert
Therefore, unless multiple prosectors are available, multiple fish should not be sacrificed simultaneously.
10–15 μl av varje färgat PCR-prov pipetteras till en agarosgel-brunn
Using the small dip net, a fish is removed from the experimental chamber and transported to the necropsy area in the transport container.
Även 5–15 μl av 1kb-’stegen’ (Invitrogen) pipetteras till en separat brunn
The fish is placed in the euthanasia solution.
Inled elektroforesen med 200 V
The fish is removed from the solution when there is cessation of respiration and the fish is unresponsive to external stimuli.
Avsluta efter 30–45 minuter
The fish is wet weighed.
Bestämning av banden:
For Japanese medaka the abdomen is opened via a carefully made incision that extends along the ventral midline from the pectoral girdle to a point just cranial to the anus.
Därefter ska en bild tas av agarosgelen i en UV-ljusbox
Using the small forceps and small scissors, the liver is carefully removed.
Slutligen analyseras proverna genom att jämföra dem med banden i den positiva kontrollen och stegen
Specimen for VTG analysis are placed in eppendorf tubes and immediately frozen in liquid nitrogen.
Tillägg 10
The carcass including the gonads is placed into a pre-labelled plastic tissue cassette, which is transferred into Davidson's or Bouin's fixative.
Riktlinjer för vävnadsprov för bestämning av genetiskt kön hos storspigg med PCR-metoden
The volume of fixative should be at least 10 times the approximated volume of the tissues.
Vävnadsprov och DNA-extraktion
The fixative container is gently agitated for five seconds to dislodge air bubbles from the cassette.
DNA kan extraheras med hjälp av olika kommersiellt tillgängliga reagens och både manuella och automatiserade extraktionssystem.
All tissues remain in Davidson's fixative overnight, followed by transfer to individual containers of 10 % neutral buffered formalin the next day.
Det protokoll som används vid Cefas Weymouth-laboratoriet beskrivs nedan, och alternativa metoder har lagts till där så är lämpligt.
Containers with cassettes are gently agitated for 5 seconds to ensure adequate penetration of formalin into cassettes.
En liten bit vävnad (10–20 mg) från det dorsolaterala området (efter att huvudet och stjärten avlägsnats för VTG-analys), avlägsnas från varje enskild fisk med en fin sax.
Tissues remain in Bouins fixative for 24 h, followed by transfer to 70 % ethanol.
Vävnaden läggs i ett rör och placeras antingen direkt i flytande kväve (för lagring vid – 80 °C) eller så fylls röret med 70 % etanol (för transport och efterföljande lagring vid 4 °C).
Tissue Processing
Saxen rengörs efter varje enskild fisk i 70 % etanol och därefter i destillerat vatten, och torkas sedan med mjukt papper.
Dehydrate tissue for adequate penetration of paraffin.
Etanolen (i förekommande fall) avlägsnas genom aspiration och vävnaden bryts sedan ned över natten med hjälp av proteas K i 400 μl ATL-buffert (Qiagen).
Impregnate the tissue with paraffin to maintain tissue integrity and create a firm surface for microtomy.
En alikvot (200 μl) av den nedbrutna vävnaden överförs till ett 96-brunns S-block (Qiagen), och DNA extraheras i ett 96-brunnsformat med hjälp av Qiagen BioRobot Universal System och QIAamp Investigator BioRobot Kit.
Labelled tissue cassettes are removed from formalin/ethanol storage and the cassettes are placed in the processing basket(s).
DNA elueras i 50 μl vatten som är fritt från DNAas och RNAas.
The processing basket is loaded in the tissue processor.
Om man använder hårda vävnader för att extrahera DNA (t.ex. en tagg eller en bröstfena) kan det bli nödvändigt att homogenisera provet i en lyseringsbuffert med hjälp av ett FastPrep®-instrument för vävnadslysering eller motsvarande vävnadsnedbrytningssystem.
The processing schedule is selected.
Alternativ:
After the tissue processor has completed the processing cycle, the basket(s) may be transferred to the embedded station.
Vävnaden bryts ned över natten med proteas K i 400 μl G2 lyseringsbuffert (Qiagen) och DNA extraheras från 200 μl av den nedbrutna vävnaden med hjälp av antingen EZ1 DNA Tissue Kit och BioRobot EZ1 eller DNA easy tissue mini kit.
Embedding
DNA elueras i en volym på 50 μl.
Objective:
Vävnaderna bearbetas med hjälp av DNAzol-reagenset.
Properly orient the specimen in solidified paraffin for microtomy.
Vävnadsproven lyseras i 1 ml DNAzol i 10 minuter i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och centrifugeras därefter vid 13000 rpm i 5 minuter för att avlägsna alla partiklar.
The specimen is removed from the cassette and placed in the molten paraffin in the mould.
Analys genom polymeraskedjereaktion (PCR)
This is repeated with 4-8 specimens for each paraffin mould.
Amplifieringar genomförs med 2,5 μl av DNA-extraktet i en reaktionsvolym på 50 μl med hjälp av primers för genlocus ldh (enligt beskrivning av Peichel m.fl., 2004.
The position of individual fish is marked by putting fish no 1 in 180 degrees to fish 2-4/8.
Current Biology 1, 1416–1424):
Additional paraffin is added to cover the specimen.
Det finns många leverantörer av lämpliga PCR-reagens.
The mould with the cassette base is placed on the cooling plate of the cryo console.
Den metod som beskrivs nedan är den som för närvarande används vid Cefas Weymouth-laboratoriet.
After the paraffin has solidified, the block (i.e., the hardened paraffin containing the tissues and the cassette base) is removed from the mould.
Beredning av reaktionsblandning ’Reaction Mix’ (50 μl per prov):
Microtomy
En masterblandning bereds på det sätt som beskrivs här.
Cut and mount histological sections for staining.
Den kan beredas i förväg och lagras fryst vid – 20 °C fram till användning.
The initial phase of microtomy termed “facing” is conducted as follows:
Bered tillräckligt med masterblandning för en negativ kontroll (endast vatten av molekylärbiologisk kvalitet).
The paraffin block is placed in the chuck of the microtome.
Volym (stamlösningskonc.)/prov
The chuck is advanced by rotating the microtome wheel and thick sections are cut from the paraffin surface of the block until the knife reaches the embedded tissues.
Nukleotider (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
The section thickness on the microtome is set between 3 - 5 microns.
0,5 μl (25 mM vardera)
The chuck is advanced and multiple sections are cut from the block to remove any artefacts created on the cut surface of the tissue during rough trimming.
250 μM vardera
The block can be removed from the chuck and placed facedown on ice to soak the tissue.
0,5 μl (0,1 nmol/μl)
The next phase of microtomy is final sectioning and mounting of tissue sections on slides.
2,0 μM
These procedures are conducted as follows:
Vatten av molekylärbiologisk kvalitet
If the block has been placed on ice, the block is removed from the ice and replaced in the chuck of the microtome.
GoTaq-polymeras
With the section thickness on the microtome set to 3 - 5 microns, the chuck is advanced by rotating the microtome wheel.
Mät upp 47,5 μl i ett etiketterat 0,5 ml tunnväggigt PCR-rör.
Sections are cut from the block until a “ribbon” containing at least one acceptable section including the gonads has been produced.
Tillsätt 2,5 μl renat DNA till röret med lämplig etikett.
(As necessary during sectioning, the block may be removed from the chuck, placed on ice to soak the tissue, and replaced in the chuck.)
Upprepa för alla prover och den negativa kontrollen.
The sections are floated flat on the surface of the water in the water bath.
Täck med 2 droppar mineralolja.
An attempt is made to obtain at least one section that contains no wrinkles and has no air bubbles trapped beneath it.
Alternativt kan man använda en termocykler med uppvärmt lock.
A microscope slide is immersed beneath the best section, which is lifted out of the water using the slide.
Stäng locken.
This process is referred to as “mounting” the section on the slide.
Proven denatureras i en Peltier PTC-225 termocykler vid 94 ± 2 °C i 5 minuter följt av 39 cykler vid 94 ± 2 °C i 1 minut, 55 ± 2 °C i 1 minut, 72 ± 2 °C i 1 minut, och en avslutande förlängning vid 72 ± 2 °C i 10 minuter.
Three sections are prepared for a set of fish.
Beredning av agarosgelen (2 %):
The second and third sections are taken at 50 micron intervals following the first section.
Vanligtvis löses PCR-produkterna upp på 20 % agarosgel som innehåller etidiumbromid.
If the fish are not embedded with their gonads in the same sectioning level, more sections are to be made to ensure that at least six sections including the gonads are obtained from each fish.
Kapillärbaserade elektroforessystem kan också användas.
With a slide-marking pen, the block number from which the slide was produced is recorded on the slide.
Väg upp 2 g agaros i 100 ml 1 × TAE-buffert.
The slide is placed in a staining rack.
Värm i mikrovågsugn (ca 2–3 minuter) för att lösa upp agarosen.
The block is removed from the chuck and placed facedown for storage.
Tillsätt 2 droppar etidiumbromid, slutkoncentration 0,5 μg/ml.
Permanently seal mounted and stained tissues.
Gelelektrofores:
Permanently identify stained sections in a manner that allows complete traceability.
Överför agarosgelen till elektroforesutrustningen och sänk ner den i 1 × TAE-buffert.
Staining
Ladda 20 μl av varje prov i en separat brunn och lägg till en molekylviktsmarkör (100 bp DNA-stege, Promega) i en tom brunn.
Slides are air-dried overnight before staining.
Elektroforesen utförs vid 120 V i 30–45 minuter.
Cover slipping
Om etidiumbromiden tillsattes till agarosgelen enligt beskrivning ovan kan DNA-produkterna visualiseras under en ultraviolett ljuskälla.
Cover slips can be applied manually or automatically.
Alternativt kan agarosgelen färgas genom att gelen täcks med en lösning av upplöst etidiumbromid (0,5 μg/ml i vatten) i 30 minuter innan visualiseringen.
A slide is dipped in xylene or TissueClear, and the excess xylene/TissueClear is gently knocked off the slide.
Tillägg 11