natgillin/translations-raw huggingface dataset:
ANNEX II
Om ett prov består av en hel fisk som är 4–6 cm ska inälvorna inklusive njure samlas in.
This Annex sets out the detailed procedures for the diagnostic methods to be used for the laboratory examination in the eradication and surveillance programmes set out in Annex I to this Decision, and in order to confirm or rule out the suspected presence of the following non-exotic diseases listed in Part II to Annex IV to Directive 2006/88/EC (‘the listed diseases’) in accordance with Article 57 (b) to that Directive:
Vävnadsproverna ska sönderdelas med steril sax eller skalpell, homogeniseras enligt första stycket och blandas med transportmedium.
Infectious hematopoietic necrosis (IHN)
Det slutliga förhållandet mellan vävnadsmaterial och transportmedium ska på laboratoriet justeras till 1:10.
For the purpose of this Annex, ‘transport medium’ means a cell culture medium with 10 % calf serum and with 200 iu penicillin, 200 μg streptomycin, and 200 μg kanamycin per millilitre or with other antibiotics of proven efficacy.
Homogenatet ska centrifugeras i en kylcentrifug vid 2000–4000 × g vid 2–5 °C i 15 minuter, varefter supernatanten ska samlas in och får behandlas med antibiotika antingen vid 15 °C i 4 timmar eller vid 4–8 °C över natten.
PART 1
Om provet har transporterats i ett transportmedium får man utelämna behandlingen av supernatanten med antibiotika.
DETAILED DIAGNOSTIC METHODS AND PROCEDURES FOR THE SURVEILLANCE AND CONFIRMATION OF IHN AND VHS
Om det uppstår praktiska svårigheter (t.ex. om inkubatorn inte fungerar eller om man får problem med cellkulturerna) som gör det omöjligt att inokulera cellerna inom 48 timmar efter insamlingen av fiskvävnadsproverna får man frysa supernatanten vid – 80 °C och genomföra den virologiska undersökningen inom 14 dagar.
I. Diagnostic methods and procedures for the surveillance of VHS and IHN
Om den insamlade supernatanten förvaras vid – 80 °C inom 48 timmar efter provtagningen får den återanvändas endast en gång för virologisk undersökning.
When sampling and laboratory examination for the purpose of obtaining or maintaining disease-free health status with regard to IHN or VHS as set out in Section I of Part 1 of Annex I are carried out, using the diagnostic methods set out in points II.1 and II.2 of Part 1 of that Annex, the detailed diagnostic methods and procedures set out in following points I.1 to I.6 shall apply.
Före inokuleringen av cellerna ska supernatanten blandas med lika delar av lämpligt utspätt, sammanslaget antiserum mot de inhemska serotyperna av virus för infektiös pankreasnekros (IPN-virus) och inkuberas vid 15 °C i minst en timme eller vid 4 °C i högst 18 timmar.
Tissues for virological examination on cell culture
Alla inokulat behandlas med antiserum mot IPN-virus för att förhindra att en cytopatisk effekt (CPE) orsakad av IPN-virus utvecklas i inokulerade cellkulturer.
Before shipment or transfer to the laboratory, pieces of the organs to be examined shall be removed from the fish with sterile dissection tools and transferred to sterile plastic tubes containing transport medium.
Detta gör de virologiska undersökningarna snabbare och ger färre fall där förekomsten av CPE skulle uppfattas som en potentiell indikation på VHS-virus eller IHN-virus.
The quantity of fish material suitable for virological examination on cell culture and by RT-qPCR is dependent on fish size.
När prover kommer från produktionsenheter som anses fria från IPN behöver inokulat inte behandlas med antiserum mot IPN-virus.
Thus, whole alevin (body length < 4 cm), viscera including kidney (4 cm < body length < 6 cm) or, for larger size fish, kidney, spleen, heart and/or encephalon, and ovarian fluid from brood fish at the time of spawning shall be the tissues to be sampled.
Om prover har samlats in i transportmedium ska förfarandet i punkterna I.4.2 och I.4.3 genomföras.
Ovarian or seminal fluid or organ pieces from a maximum of 10 fish may be collected in one sterile tube containing at least 4 ml transport medium and represent one pooled sample.
Efter centrifugering ska supernatanten samlas in och RNA extraheras.
The virological examination on cell culture shall be started as soon as possible and no later than 48 hours after the collection of the samples.
Vid analys av fiskvävnader som bevarats i RNA-stabiliserande lösning ska efterföljande steg utföras inom följande tidsramar beroende på den temperatur som proverna förvarats vid:
In exceptional cases, the virological examination may be started at the latest within 72 hours after the collection of the material, provided that the material to be examined is protected by a transport medium and that the temperature requirements during transportation can be fulfilled.
Prover förvarade vid 37 °C: en dag.
Samples for reversed transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR or RT-qPCR) analysis
Prover förvarade vid 25 °C: en vecka.
Samples shall be taken from the fish in accordance with the procedure described in point I.1.1 using a sterile instrument and transferred to a sterile plastic tube containing transport medium.
Prover förvarade vid 4 °C: en månad.
Tissue from 10 fish may be collected in one tube and shall represent one pooled sample.
Prover förvarade vid – 20 °C: på obestämd tid.
However, in case the amount of inoculum is small, tissue from up to five fish may be used.
Samlingsprover i RNA-stabiliserande lösning ska behandlas som enskilda prover i RNA-stabiliserande lösning.
Alternatively, samples may be pooled in RNA stabilization reagents, such as 0,2 g tissue/ml reagent according to the recommendation from the manufacturers, although each fish shall be processed individually and shall not be pooled in the samples because of the small amount of material to be used for extraction.
För prover som slås samman i RNA-stabiliserande lösning får provmängden inte överstiga den som rekommenderas av tillverkaren vid extraktion med RNA-kit, såsom RNeasy Mini kits (Qiagen) eller liknande.
Whole fish may also be sent to the laboratory.
Om större prover slås samman ska extraktionskiten eller extraktionsmetoderna återspegla denna sammanslagning.
However, freezing of the samples shall be avoided.
På grund av den lilla mängd inokulat som används vid PCR jämfört med vid cellodling ska alla fiskvävnader noggrant homogeniserade innan materialet slås samman för extraktion.
The temperature of a sample during transit must never exceed 10 °C and ice must still be present in the transport box at receipt or one or more freeze blocks must still be partly or completely frozen.
Samma princip ska också tillämpas om prover samlas in i RNA-stabiliserande lösning.
Whole fish may be sent to the laboratory if the temperature requirements referred to in the first paragraph during transportation can be fulfilled.
Virologisk undersökning i cellkultur
Live fish may also be shipped.
När cellerna odlas i stängda flaskor ska mediet buffras med bikarbonat.
Collection of supplementary diagnostic material
Emellertid kan cellkulturer som är 4–48 timmar godtas.
When approved by the diagnostic laboratory, other fish tissues may be collected as well and prepared for supplementary examinations.
Cellerna ska vara aktivt växande vid inokuleringen.
Preparation of samples for cell culture examination and RT-qPCR
Antibiotikabehandlade organsuspensioner ska inokuleras i cellkulturer i två spädningar för att förhindra homolog interferens, dvs. primärspädningen plus en spädning på 1:10 av denna, vilket resulterar i slutliga spädningar av vävnadsmaterial i cellodlingsmedium på 1:100 respektive 1:1000.
Freezing in exceptional cases
Minst två cellinjer ska inokuleras enligt punkt I.5.1.
Where practical difficulties arise, which make it impossible to process the samples within 48 hours after the collection of the fish tissues, it may be acceptable to freeze the tissue specimens in transport medium at – 20 °C or below and to carry out virological examination within 14 days.
Förhållandet mellan inokulatets storlek och cellodlingsmediets volym ska vara cirka 1:10.
Records shall be kept with details on the reason for each freezing of fish tissue samples.
Cellodlingsplattor ska användas när så är möjligt.
Homogenisation of organs
De inokulerade cellkulturerna ska inkuberas vid 15 °C i 7–10 dagar.
In the laboratory, the fish tissue in the tubes shall be completely homogenised, either by stomacher, blender or mortar and pestle with sterile sand, and subsequently suspended in the original transport medium.
Om färgen på cellodlingsmediet ändras från rött till gult, vilket är ett tecken på att mediet blivit surt, ska pH-värdet justeras med steril bikarbonatlösning eller likvärdiga ämnen för att säkerställa cellernas mottaglighet för virusinfektion.
If a sample consists of a whole fish less than 4 cm long, it shall be minced with sterile scissors or scalpel after removal of the body behind the gut opening.
Minst var sjätte månad eller så snart man misstänker att cellernas mottaglighet för infektion har minskat ska frusna lager av VHS-virus och IHN-virus titreras för att kontrollera cellkulturernas mottaglighet för infektion.
If a sample consists of a whole fish with body length between 4 cm and 6 cm, the viscera including kidney shall be collected.
Förfarandet i avsnitt III ska användas när så är möjligt.
If a sample consists of a whole fish more than 6 cm long, the tissue specimens shall be collected as described in point I.1.
Inokulerade cellkulturer ska regelbundet (minst tre gånger per vecka) undersökas vid 40–150 × förstoring för förekomst av CPE.
The tissue specimens shall be minced with sterile scissors or scalpel and homogenised as described in the first paragraph of this point and suspended in transport medium.
Om tydlig CPE iakttas ska förfaranden för identifiering av virus enligt punkt I.6 påbörjas omedelbart.
The final ratio between tissue material and transport medium shall be adjusted in the laboratory to 1:10.
Subkultivering
Centrifugation of homogenate
Om CPE inte har utvecklats efter 7–10 dagars primärinkubering ska subkultivering till friska cellkulturer göras och en ungefär lika stor cellyta som i primärkulturen ska användas.
If the sample has been shipped in a transport medium, the treatment of the supernatant with antibiotics may be omitted.
Det sammanslagna mediet ska sedan inokuleras i homologa cellkulturer både outspätt och i spädning 1:10 (vilket resulterar i slutliga spädningar av supernatanten på 1:10 respektive 1:100) enligt punkt I.5.2.
Where practical difficulties arise, such as incubator breakdown or problems with cell cultures, which make it impossible to inoculate cells within 48 hours after the collection of the fish tissue samples, the supernatant may be frozen at – 80 °C and virological examination may be carried out within 14 days.
Alternativt inokuleras alikvoter om 10 % av primärkulturens medium direkt i brunnar med frisk cellkultur (dvs. subkultivering från brunn till brunn).
If the collected supernatant is stored at – 80 °C within 48 hours after the sampling, it may be reused only once for virological examination.
Inokuleringen får föregås av preinkubering av de utspädda lösningarna med antiserum mot IPN-virus i lämplig spädning enligt punkt I.4.3.
Prior to the inoculation of the cells, the supernatant shall be mixed with equal parts of a suitably diluted pool of antisera to the indigenous serotypes of Infectious pancreatic necrosis (IPN) virus and incubated with this for a minimum of one hour at 15 °C or a maximum of 18 hours at 4 °C.
De inokulerade kulturerna ska därefter inkuberas vid 15 °C i 7–10 dagar och undersökas i enlighet med punkt I.5.4.
The titre of the antiserum shall be at least 1/2000 in a 50 % plaque neutralisation test.
Om toxisk CPE förekommer under inkuberingens 3 första dagar ska subkultivering göras i detta skede och cellerna ska inkuberas i 7 dagar och därefter återigen subkultiveras med ytterligare 7 dagars inkubering.
Treatment of all inocula with antiserum to IPN virus aims at preventing cytopathic effect (CPE) due to IPN virus from developing in inoculated cell cultures.
Om toxisk CPE utvecklas efter 3 dagar ska cellerna subkultiveras en gång och inkuberas så att det totalt fortlöper 14 dagar från primärinokuleringen.
This will reduce the duration of the virological examinations as well as the number of cases in which occurrence of CPE would have to be considered potentially indicative of VHSV or IHNV.
Det får inte finnas några tecken på toxicitet under de sista 7 dagarna av inkuberingen.
When samples come from production units, which are considered free from IPN, the treatment of inocula with antiserum to IPN virus may be omitted.
Om bakteriell kontaminering förekommer trots antibiotikabehandling ska subkultiveringen föregås av centrifugering vid 2000–4000 × g vid 2–5 °C i 15–30 minuter eller av filtrering av supernatanten genom ett 0,45 μm filter, eller av båda (membran med låg proteinbindningsgrad).
Sample preparation for RT-PCR and RT-qPCR based surveillance programmes
Subkultiveringen ska dessutom följa samma förfaranden som det som gäller vid toxisk CPE i fjärde stycket i denna punkt.
If samples were collected in transport medium, the procedure set out in points I.4.2 and I.4.3 shall be carried out.
Om ingen CPE förekommer kan testet förklaras vara negativt.
After centrifugation, supernatant shall be collected and RNA extracted.
Identifiering av virus
If further examination is not to be undertaken directly after centrifugation, the samples shall be immediately frozen at – 20 °C or below.
Om tecken på CPE har iakttagits i en cellkultur ska mediet (supernatanten) samlas in och undersökas med en eller flera av följande metoder: ELISA (enzymkopplad immunadsorberande analys), immunofluorescens (IF), neutralisationstest, RT-PCR eller RT-qPCR.
samples stored at 37 °C: 1 day;
En antigen-ELISA med dubbla antikroppar ska utföras för att identifiera virusisolatet.
samples stored at 25 °C: 1 week;
Mikrotiterplattorna ska vara belagda med 50 μl/brunn (0,9 pg) av protein-A renade immunoglobuliner (Ig) av dokumenterad kvalitet från kaninantiserum mot VSH-virus eller IHN-virus vilka spätts i karbonatbuffert (pH 9,6) innehållande 15 mM natriumazid och plattorna ska inkuberas vid 4 °C i 18 timmar–2 veckor.
samples stored at 4 °C: 1 month;
I en spädningsplatta ska varje prov innehållande 1 % Triton X-100 och de positiva kontrollerna spädas med buffertlösning (dvs. fosfatbuffrad koksaltlösning med 1 % BSA (PBS-T-BSA)) i en fyrfaldig spädning: outspätt, 1:4, 1:16 och 1:64.
Pooled samples in RNA stabilization reagent shall be treated like single samples in RNA stabilization reagent.
I nästa steg ska ELISA-plattorna inkuberas vid 37 °C i 30 minuter.
If larger samples are pooled, the extraction kits or methods must reflect this pooling.
50 μl HRP-konjugerade (HRP = pepparrotperoxidas) kanin-antikroppar mot mus utspädda i PBS-T-BSA (1:1000) ska överföras till ELISA-plattan.
Samples collected in RNA stabilization reagents shall not be used for cell cultivation.
Efter ytterligare en tvättning ska reaktionerna startas genom tillsats av 50 μl orto-fenylendiamin (OPD)/brunn.
As the RT-qPCR protocols given are of similar or higher sensitivity than the cell cultivation methods, it may be acceptable to use supernatant from homogenised fish tissue material of pooled organs from up to 10 fish in cell culture medium for PCR.
Absorbansen ska mätas vid 492 och 620 nm i en ELISA-spektrofotometer.
However, due to the much smaller inoculum used for PCR compared to cell cultivation, all fish tissues shall be carefully homogenised before collating material for extraction.
Genom att jämföra testresultaten med absorbansvärdena för de positiva och negativa kontrollerna ska proverna bedömas som positiva eller negativa.
However, in that case it is often difficult to collect representative material from up to 10 fish in one tube, and the number of fish per pool shall therefore be reduced to 2 to 5.
Även andra varianter av ELISA med liknande dokumenterad effektivitet får användas i stället för den som anges i denna punkt.
Virological examination on cell culture
De förtecknade patogenerna VHS-virus och IHN-virus ska identifieras genom att celler i svarta 96-hålsplattor, i konventionella 24-hålsplattor eller på täckglas i 24-hålsplattor smittas.
Cell cultures and media
När VHS-virus eller IHN-virus, eller båda, identifieras genom att celler på täckglas smittas ska följande protokoll tillämpas:
Bluegill fry cell line -2 (BF-2) or Rainbow trout gonad cell line - 2 (RTG-2) and either Epithelioma papulosum cyprini (EPC) or Fathead minnow (FHM) cells shall be grown at 20 to 30 °C in suitable medium, namely Eagle's Minimum essential medium (MEM) or modifications thereof, with a supplement of 10 % foetal bovine serum and antibiotics in standard concentrations.
Cellerna ska sås ut på täckglas med en densitet som ger 60–90 % konfluens efter 24 timmars odling.
When the cells are cultivated in closed vials, the medium shall be buffered with bicarbonate.
Om möjligt ska EPC-celler användas för detta ändamål eftersom de fäster bra på glasytor, men även andra cellinjer får användas, t.ex.
The pH must be 7,6 ± 0,2.
150 μl av cellkulturens supernatant i två olika spädningar (1:10 och 1:1000) ska inokuleras i duplikat på endagsgamla monolager och inkuberas vid 15 °C i 24 timmar.
The cell cultures to be used for inoculation with fish tissue material shall be young, normally 1 day old cell culture monolayers where possible; however, a range between 4 to 48 hours old may be accepted.
Därefter ska cellodlingsmediet avlägsnas och de smittade monolagren fixeras med 0,5 ml iskall, vattenlösning av aceton (80 % v/v).
The cells must be actively growing at inoculation.
Fixeringen ska göras i dragskåp vid rumstemperatur i 15 minuter, sedan ska acetonlösningen avlägsnas och täckglasen ska lufttorka i minst 30 minuter.
Inoculation of cell cultures
I detta skede ska plattorna antingen bearbetas omedelbart eller förvaras vid – 20 °C för vidare användning.
At least two cell lines shall be inoculated as referred to in point I.5.1.
50–100 μl/brunn ska tillsättas till det fixerade monolagret och plattorna ska inkuberas vid 37 °C i 1 timme i en fuktkammare.
The ratio between inoculum size and volume of cell culture medium shall be about 1:10.
Täckglasen ska tvättas försiktigt tre gånger med PBS innehållande 0,05 % Tween-20 (PBS-T) och bufferten ska avlägsnas helt efter den sista sköljningen.
For each dilution and each cell line, a minimum of about 2 cm2 cell area, corresponding to one well in a 24-well cell culture tray, shall be utilised.
Cellerna ska därefter inkuberas vid 37 °C i 1 timme med fluoresceinisotiocyanat (FITC)- eller tetrametylrodamin-5-(och -6-)isotiocyanat (TRITC)-konjugerade antikroppar mot musimmunglobulin (dvs. den primära antikroppen) utspädda enligt leverantörens anvisningar, och återigen tvättas med PBS-T samt torkas.
Cell culture trays shall be used where possible.
Färgade kulturer ska monteras på objektglas med glycerolsaltlösning och undersökas under infallande UV-ljus.
Incubation of cell cultures
Använd okular med förstoringsgrad 10 × eller 12 × och objektiv × 25 eller × 40 med bländare > 0,7 respektive > 1,3.
The inoculated cell cultures shall be incubated at 15 °C for seven to 10 days.
Även andra IF-metoder (med cellkulturer, fixering och antikroppar av referenskvalitet) med liknande dokumenterad effektivitet får användas.
If the colour of the cell culture medium changes from red to yellow indicating medium acidification, pH adjustment with sterile bicarbonate solution or equivalent substances shall be performed to ensure cell susceptibility to virus infection.
Cellerna ska avlägsnas från den insamlade supernatanten genom centrifugering (2000–4000 × g) eller membranfiltrering (0,45 μm) med ett membran med låg proteinbindningsgrad och supernatanten ska spädas 1:100 och 1:10000 i cellodlingsmedium.
At least every 6 months or if decreased cell susceptibility is suspected, titration of frozen stocks of VHSV and IHNV shall be performed to verify the susceptibility of the cell cultures to infection.
Alikvoter av minst två supernatantspädningar ska blandas separat med lika delar av vart och ett av följande reagens och inkuberas vid 15 °C i 60 minuter:
The procedure set out in Section III shall be used, if possible.
Serum innehållande gruppspecifika antikroppar mot VHS-virus i spädning 1:50 (v/v).
Microscopy
Serum innehållande gruppspecifika antikroppar mot IHN-virus i spädning 1:50 (v/v).
Inoculated cell cultures shall be inspected regularly, at least three times a week, for the occurrence of CPE at 40 to 150 × magnification.
Sammanslagna antiserum mot inhemska serotyper av IPN-virus i spädning 1:50 (v/v).
If obvious CPE is observed, virus identification procedures in accordance with point I.6 shall be initiated immediately.
Endast medium (positiv kontroll).
Subcultivation
Minst två cellkulturer ska inokuleras med 50 μl av varje supernatant-serumblandning och sedan inkuberas vid 15 °C.
If no CPE has developed after the primary incubation for 7 to 10 days, subcultivation shall be performed to fresh cell cultures utilising a cell area similar to that of the primary culture.
Utveckling av CPE ska kontrolleras enligt punkt I.5.4.
Aliquots of medium (supernatant) from all cultures or wells constituting the primary culture shall be pooled according to cell line 7 to 10 days after inoculation.
VHS-virusstammar och -virusisolat som inte reagerar i neutralisationstestet ska identifieras med IF eller ELISA.
The pools shall then be inoculated into homologous cell cultures undiluted and diluted 1:10 (resulting in final dilutions of 1:10 and 1:100, respectively, of the supernatant) as described in point I.5.2.
Även andra neutralisationstest med liknande dokumenterad effektivitet får användas.
Alternatively, aliquots of 10 % of the medium constituting the primary culture shall be inoculated directly into a well with fresh cell culture (namely, well to well subcultivation).
Allt arbete med RNA ska utföras på is och handskar ska användas.
The inoculation may be preceded by pre-incubation of the dilutions with the antiserum to IPN virus at appropriate dilution as described in point I.4.3.
RNA ska extraheras med fenol/kloroform-metoden eller med spinnkolonner med affinitet för RNA enligt tillverkarens anvisningar.
The inoculated cultures shall then be incubated for 7 to 10 days at 15 °C and inspected in accordance with point I.5.4.
Kommersiellt tillgängliga RNA-extraktionskit som ger högkvalitativt RNA som lämpar sig för användning med de protokoll för RT-PCR som beskrivs nedan får användas.
If toxic CPE occurs within the first 3 days of incubation, subcultivation shall be performed at that stage, but the cells shall then be incubated for 7 days and sub cultivated again with further 7 days incubation.
RNA ska återsuspenderas i destillerat, RNase-fritt vatten (dvs. vatten som behandlats med 0,1 % dietylpyrokarbonat) eller en lämplig elueringsbuffert.
When toxic CPE develops after 3 days, the cells shall be passed once and incubated to achieve the total of 14 days from the primary inoculation.
Följande primrar ska användas för påvisande av IHN-virus:
There must be no evidence of toxicity in the final 7 days of incubation.
Framåtriktad primer: 5′-AGA-GAT-CCC-TAC-ACC-AGA-GAC-3′.
If bacterial contamination occurs despite treatment with antibiotics, subcultivation shall be preceded by centrifugation at 2000 to 4000 × g for 15 to 30 minutes at 2 to 5 °C, or filtration of the supernatant through a 0,45 μm filter or both (low protein-binding membrane).
Bakåtriktad primer: 5′-GGT-GGT-GTT-GTT-TCC-GTG-CAA-3′.
In addition to this, subcultivation shall follow the same procedures as described for toxic CPE in the fourth paragraph of this point.
Följande cykler ska användas (ettstegs-RT-PCR): 1 cykel: 50 °C i 30 minuter, 1 cykel: 95 °C i 2 minuter, 30 cykler: 95 °C i 30 sekunder, 50 °C i 30 sekunder och 72 °C i 60 sekunder, 1 cykel: 72 °C i 7 minuter och blötläggning vid 4 °C.
If no CPE occurs, the test may be declared negative.
Följande primrar ska användas för påvisande av VHS-virus:
Virus identification
VN For 5′-ATG-GAA-GGA-GGA-ATT-CGT-GAA-GCG-3′.