natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Titration by end point dilution shall include at least six replicates at each dilution step.
För att bekräfta förekomsten av infektion orsakad av KHV ska den generiska nästade PCR-metod som beskrivs i tabell 2.1 användas, följt av sekvensering av den amplifierade produkten.
The titres shall be compared with previously obtained titres.
Tabell 2.1
If the titre of any of the three virus isolates drops by a factor of 2 logs or more, compared with the initial titre, the cell line shall no longer be used for surveillance purposes.
Primrar och förhållanden för den nästade PCR-metod som riktar in sig på alla cyprinidherpesvirus (CyHV-1, CyHV-2 och CyHV-3)
If different cell lines are kept in the laboratory each line shall be examined separately.
Primer
Records shall be kept for a period of at least 10 years.
Sekvens
DETAILED DIAGNOSTIC METHODS AND PROCEDURES FOR THE SURVEILLANCE AND CONFIRMATION OF KHV DISEASE (KHVD)
Cykelförhållanden
When a laboratory examination is required for the purpose of confirmation of the presence of or to rule out the suspicion of KHVD in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC, using the diagnostic methods set out in Section III of Part 2 of Annex I, the detailed diagnostic methods and procedures set out in points I.1 – I.2 of this Part shall apply.
Första omgången PCR
Preparation of samples from fish
1 cykel:
For diagnostic purposes the fish (sent alive or killed and packed separately in sealed aseptic containers) or alternatively frozen organs or organ pieces preserved in 80 % to absolute ethanol or viral transport medium (to be processed within 48 hours after collection) may be used for testing with conventional PCR or qPCR based methods.
95 °C i 2 minuter
For the detection of KHV, gill and kidney shall be collected; in addition spleen, encephalon and intestine may be included in an additional separated sample.
40 cykler:
In acute cases, tissue material of up to five fish may be pooled.
95 °C i 30 sekunder
Furthermore, non-lethal samples such as blood, gill swabs, gill biopsy, mucus scrape may be used in certain cases (namely very valuable fish may be used in the case of the suspicion of the presence of KHV).
55 °C i 30 sekunder
DNA extraction
72 °C i 45 sekunder
The commercially available DNA extraction kits that produce high quality DNA suitable for use with the PCR protocols referred to in point I.2 may be used.
Andra omgången PCR
Agent detection and identification by Polymerase chain reaction (PCR) based methods
95 °C i 2 minuter
I.2.1. qPCR for KHV detection
Även andra varianter av PCR med liknande dokumenterad effektivitet får användas.
For qPCR detection of KHV, the following qPCR assay shall be used:
Sekvensering får utföras av laboratoriet eller vid externa specialiserade sekvenseringsföretag.
Forward primer (KHV-86f): 5′- GACGCCGGAGACCTTGTG -3′;
Sekvenseringsresultat ska analyseras genom att jämföra sekvenserna med kända referenssekvenser för KHV (GenBank nummer AP008984, DQ657948 och DQ177346).
Reverse primer (KHV-163r): 5′- CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT -3′;
Den erhållna rena konsensus-sekvensen ska överensstämma med referenssekvenserna till minst 98 %.
and probe (KHV-109p): 5′-FAM- CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG -3′.
DETALJERADE DIAGNOSTISKA METODER OCH FÖRFARANDEN FÖR ÖVERVAKNING OCH BEKRÄFTELSE AV FÖREKOMST AV INFEKTIÖS LAXANEMI (ILA/ISA)
Cycling conditions: one cycle of 95 °C at 15 minutes, followed by 40 cycles of 94 °C at 15 seconds and 60 °C for 60 seconds.
I. Provtagningsförfaranden för övervakning och kontroll av ILA/ISA
However, other qPCR versions of proven similar efficacy may be used instead.
När provtagning och laboratorieanalys genomförs för övervaknings- eller utrotningsprogram enligt del 3 i bilaga I eller för att bekräfta eller utesluta förekomst av ILA/ISA i enlighet med artikel 57 b i direktiv 2006/88/EG, ska de detaljerade metoderna och förfarandena i punkterna I.1, I.2 och I.3 tillämpas.
Conventional PCR for KHV detection
Vid laboratorieanalys för att undersöka förekomst av ILA/ISA ska fiskprover om möjligt inte slås samman.
The assay described in this point targeting the Thymine kinase (TK) gene of KHV shall be used.
Vid övervakning av ILA/ISA får dock 2–5 fiskar slås samman.
However, other PCR assays with demonstrated similar sensitivities and specificities to the described assay may be used instead.
Prover för PCR med omvänd transkription (RT-PCR) ska tas från alla fiskar som provtas.
Forward primer (KHV-TKf): 5′-GGGTTACCTGTAC GAG-3′;
En bit av njurens mellersta del ska avlägsnas från fisken med ett sterilt instrument och överföras till ett mikrofugrör med 1 ml RNA-stabiliserande lösning med dokumenterad effektivitet.
Reverse primer (KHV-TKr): 5′-CACCCAGTAGATTA TGC-3′.
Vävnad från upp till 5 fiskar får samlas in i ett rör med transportlösning och ska utgöra ett samlingsprov.
Cycling conditions: one cycle of 95 °C for 5 minutes followed by 35 cycles of 95 °C for 30 seconds, 52 °C for 30 seconds, 72 °C for one minute and one cycle of 72 °C for 10 minutes.
Vikten på vävnaden i ett prov ska vara 0,5 g.
Product size should be 409 bp.
När fisken är för liten för att man ska kunna ta ett prov som väger så mycket får även delar av njure, hjärta, mjälte, lever eller pylorusbihang, i den ordningen, användas så att provet kommer upp i 0,5 g.
Furthermore, false-positive results may occur because of false primer annealing or contamination.
Vävnad för histologisk undersökning ska endast tas från nyligen dödad fisk med normal konstitution som visar kliniska tecken eller tecken vid inspektion efter slakt som överensstämmer med förekomst av ILA/ISA.
However, other PCR versions of proven similar efficacy may be used instead.
Eventuella yttre eller inre skador ska provtas och under alla omständigheter ska prover tas från njurens mellersta del, hjärta, lever, bukspottskörtel, tarm, gäle och mjälte från enskilda fiskar med skalpell och överföras till 8–10 % (v/v) buffrad formalinlösning.
The first detection in an area shall be confirmed by sequencing or sent to a to a national reference laboratory or to the EU reference laboratory for fish diseases referred to in Annex VI to Directive 2006/88/EC, for immediate identification.
Förhållandet mellan fixativ och vävnad ska vara minst 20:1 för att säkerställa att vävnaderna bevaras på ett tillfredsställande sätt.
Detailed diagnostic methods and procedures for the surveillance of KHVD
För immunhistokemi (IHK) ska prover tas från njurens mellersta del och hjärta.
When sampling and laboratory examination for the purpose of obtaining or maintaining certain health statuses with regard to KHVD as set out in Section I of Part 2 of Annex I are carried out using the diagnostic methods set out in Sections II or III of Part 2 of that Annex, the detailed diagnostic methods and procedures set out in the following points II.1 and II.2 of this Part shall apply.
Vävnader för virologisk undersökning i cellkultur ska tas från alla fiskar som provtas.
If possible, fish that have been kept for a prolonged time period at the virus permissive temperature range (namely, 2 to 3 weeks at 15 °C to 26 °C) shall be sampled.
Delar av lever, njurens främre eller mellersta del, hjärta och mjälte ska avlägsnas från fisken med ett sterilt instrument och överföras till plaströr med 9 ml transportlösning.
If possible, samples shall be collected 24 hours but not later than 72 hours after management practices that may reactivate the virus in fish with a carrier status, such as netting or transport, in order to enhance the chance of KHV detection.
Vävnad från upp till 5 fiskar får samlas in i ett rör med transportlösning och ska utgöra ett samlingsprov.
For the purpose of the surveillance of KHVD, the fish may be sent alive or killed and packed separately in sealed aseptic containers or alternatively frozen organs or organ pieces preserved in 80 % to 100 % alcohol or viral transport medium (to be processed within 48 hours after collection) may be used for testing PCR based methods.
Vikten på vävnaden i ett prov ska vara 1,0 ± 0,5 g.
For the surveillance of KHVD, gill and kidney tissue shall be collected.
Hel fisk får transporteras till laboratoriet om de temperaturkrav som anges i tredje stycket kan uppfyllas under transporten.
For the purpose of surveillance of KHVD, pooling shall be avoided where possible.
Hel fisk ska slås in i absorberande papper, transporteras i plastpåse och kylas enligt tredje stycket.
If pooling is necessary, tissue material from a maximum of two fish may be pooled.
Även levande fisk får transporteras, men endast under överinseende av det nationella referenslaboratoriet för fisksjukdomar och med beaktande av de ytterligare desinficerings- och biosäkerhetfrågor som gäller vid transport av levande fisk.
Larger samples shall be homogenised in mortar and pestle or stomacher, and subsamples retrieved for DNA extraction before clarification.
Blodprover och rör med fiskvävnad för virologisk undersökning eller analys med RT-PCR ska placeras i isolerade behållare (t.ex. tjockväggiga polystyrenlådor) tillsammans med så mycket is eller frysblock så att proverna hålls kylda under transporten till laboratoriet.
Alternatively, subsamples may be collected from each tissue included in the sample and placed in ‘lysis-tubes’.
Frysning av proverna ska förhindras och när de tas emot ska det finnas is kvar i transportlådan eller också ska ett eller flera av frysblocken fortfarande vara helt eller delvis frysta.
Commercially available DNA extraction kits that produce high quality DNA suitable for use with the PCR protocols set out in point II.2 may be used.
I undantagsfall får RT-PCR-prover och prover för virologisk undersökning snabbfrysas och transporteras till laboratoriet vid minst – 20 °C.
The acceptable tissue medium ratio shall be 1:9 w/v.
Vid RT-PCR-analys av vävnader som bevarats i RNAlater ska RNA-extraktion utföras inom följande tidsramar beroende på den temperatur som proverna förvarats vid:
20 to 25 mg tissue material shall be included in the tests.
Prover förvarade vid – 20 °C: på obestämd tid.
Surveillance of KHVD by PCR based methods
Om fiskvävnader transporteras i fixativ för histologisk undersökning ska de transporteras i läckagesäkra rör i stöttåliga behållare.
For the surveillance of KHV, a qPCR shall be used.
Frysning av proverna ska förhindras.
If positive samples appear in an area not previously confirmed positive, the test results shall be confirmed either:
När diagnostiklaboratoriet godkänt det får även andra fiskvävnader än de som avses i punkt I.2 samlas in och beredas för kompletterande undersökningar.
by sequencing of a PCR or nested PCR product from the samples.
Detaljerade diagnostiska metoder och förfaranden för övervakning av och för att utesluta misstanke om eller bekräfta förekomst av ISA
The obtained clean consensus sequence shall match (by at least 98 %) with these reference sequences.
När laboratorieanalys för att erhålla eller få behålla en viss hälsostatus med avseende på ILA/ISA i enlighet med del 3 avsnitt I i bilaga I eller för att utesluta misstanke om eller bekräfta förekomst av ILA/ISA i enlighet med artikel 57 b i direktiv 2006/88/EG genomförs med de diagnostiska metoderna i del 3 avsnitt II i bilaga I, ska de detaljerade diagnostiska metoderna och förfarandena i de följande punkterna II.1–II.5 tillämpas.
or alternatively, samples may be sent to a national reference laboratory for confirmation.
1 Undersökning av prover med RT-PCR
qPCR for KHV detection
Den diagnostiska metod som ska användas för screening med avseende på ISA-virus ska vara RT-qPCR.
The qPCR described as follows shall be used:
Eftersom resultaten från RT-qPCR kan variera beroende på under vilka förhållanden den genomförs ska lämpliga positiva och negativa kontroller samt amplikon användas för att undvika eventuella oklarheter.
The results of the qPCR may vary depending on the conditions under which it is performed, namely the thermal protocols might need optimisation, depending on the thermal cycler in use.
Totalt RNA ska extraheras med fenol/kloroform-metoden eller med spinnkolonner med affinitet för RNA enligt tillverkarens anvisningar.
Conventional PCR for confirmation of KHV detection
Renat RNA ska återsuspenderas i destillerat, RNase-fritt vatten (dvs. vatten som behandlats med 0,1 % dietylpyrokarbonat).
For confirmation of the presence of infection with KHV, the generic nested PCR described in the following Table 2.1 shall be used followed by sequencing of the amplified product.
Koncentrationen och renheten hos extraherat RNA ska uppskattas genom att mäta den optiska densiteten vid 260 och 280 nm.
Table 2.1
Ett annat tillvägagångssätt kan vara att inkludera interna kontroller som riktar in sig på det virusgenom som avses i punkt II.1.3.
Primers and conditions for the nested PCR assay targeting all cyprinid herpesviruses (CyHV-1, CyHV-2 and CyHV-3)
RT-PCR för påvisande av ISA-virus
Primer name
Flera RT-PCR-metoder får användas för amplifiering av ISA-virusets genom.
Sequence
En tvåstegs-RT-PCR får utföras där RT-steget och PCR-reaktionssteget genomförs i två separata rör.
Cycling conditions
Emellertid får även en enstegs-RT-PCR utföras där de två reaktionerna genomförs i ett rör.
First round PCR
Eftersom den bakåtriktade ILA2-primern inte överensstämmer med isolat från Nordamerika ska ett alternativt primerpar användas i dessa fall.
1 cycle:
Framåtriktad primer (ILA1): 5′-GGCTATCTACCATGAACGAATC-3′.
40 cycles:
Cykelförhållanden: 1 cykel vid 50 °C i 30 minuter, 1 cykel vid 94 °C i 15 minuter, 40 cykler vid 94 °C i 30 sekunder, 55 °C i 30 sekunder och 72 °C i 60 sekunder samt 1 cykel vid 72 °C i 5 minuter.
95 °C for 30 seconds
Produktstorlek 155 baspar.
55 °C for 30 seconds
Även andra varianter av RT-PCR med liknande dokumenterad effektivitet får användas.
72 °C for 45 seconds
RT-qPCR för påvisande av ISA-virus
72 °C for 10 minutes
Användningen av RT-qPCR kan öka specificiteten och förmodligen även sensitiviteten.
CyHVpol-reverse
Metoden kan utföras snabbare eftersom det inte krävs någon gelelektrofores och risken för korskontaminering minskar eftersom det är möjligt att uppskatta mängden genomiska virus-RNA i provröret.
CyHVpol-internal forward
En nackdel med RT-qPCR-metoden är att det ofta inte är möjligt att sekvensera amplifierade produkter.
Second round PCR
Om den amplifierade produktens specificitet är oklar ska dock en annan metod som är specifik för ISA-virus användas för att bekräfta resultatet.
95 °C 2 minutes,
Den metod som beskrivs i denna punkt (dvs. en metod som riktar in sig på segmentet 8) ska användas.
CyHVpol-internal reverse
Metoden ska omfatta isolat från Europeiska unionen, Europeiska frihandelssammanslutningen (Efta) och Nordamerika.
PCR versions of proven similar efficacy may be used instead.
Om möjligt ska enstegsmetoden användas eftersom den metoden minimerar risken för korskontaminering.
Sequencing may be performed by the laboratory or at external specialised sequencing companies.
Framåtriktad primer: 5′-CTACACAGCAGGATGCAGATGT-3′.
Sequencing results shall be analysed by aligning the sequences to the known reference sequences of KHV (Gen Bank accession numbers AP008984, DQ657948 and DQ177346).
Bakåtriktad primer: 5′-CAGGATGCCGGAAGTCGAT-3′.
The obtained clean consensus sequence must match at least to 98 % with those reference sequences.
Prob: 5′-FAM-CATCGTCGCTGCAGTTC – MGBNFQ-3′.
DETAILED DIAGNOSTIC METHODS AND PROCEDURES FOR THE SURVEILLANCE AND CONFIRMATION OF INFECTIOUS SALMON ANEMIA (ISA)
Cykelförhållanden: 1 cykel vid 50 °C i 30 minuter, 1 cykel vid 95 °C i 15 minuter samt 40 cykler vid 94 °C i 15 sekunder och 60 °C i 60 sekunder (justera vid behov).
I. Sampling procedures for the surveillance and control of ISA
Sekvensering av amplifierade PCR-produkter
When sampling and laboratory examination are carried out, for the purpose of the surveillance or eradication programmes set out in Part 3 of Annex I or to confirm or rule out the presence of ISA in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC, the detailed methods and procedures set out in points I.1, I.2 and I.3 of this Section shall apply.
Framåtriktad primer (ILAs6-3F): 5′-ATGAGGGAGGTAGCATTGCA-3′.
For the purpose of laboratory examination for the presence of ISA, fish samples shall not be pooled where possible.
Bakåtriktad primer (ILAs6-2R): 5′-CATGCTTTCCAACCTGCTAGGA-3′.
However, for the purpose of surveillance for ISA, the pooling of 2 to be 5 fish is accepted.
Cykelförhållanden (ettstegs-RT-PCR): 1 cykel vid 50 °C i 30 minuter, 1 cykel vid 94 °C i 15 minuter, 40 cykler vid 94 °C i 30 sekunder, 55 °C i 30 sekunder och 72 °C i 60 sekunder samt 1 cykel vid 72 °C i 5 minuter (justera vid behov).
Samples for Reverse Transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis shall be taken from all of the fish sampled.
Alternativt får följande metod för sekvensering av HPR i segment 6 användas:
A piece of mid-kidney shall be removed from the fish using a sterile instrument and transferred to a microfuge tube containing one ml RNA preservative solution of proven efficacy.
Framåtriktad primer: 5′-GAC-CAG-ACA-AGC-TTA-GGT-AAC-ACA-GA-3′.
The weight of tissue in one sample shall be 0,5 g.
Produktstorlek: 304 nukleotider om HPR0.
When the fish are too small to obtain a sample of the required weight, pieces of kidney, heart, spleen, liver or pyloric caeca may be taken, in that order of preference, to make up 0,5 g.
Även andra RT-PCR-metoder som visat liknande sensitivitet och specificitet som den metod som beskrivs i denna punkt får användas.
Tissue for histological examination shall only be taken from freshly killed fish with a normal constitution, exhibiting clinical signs or post-mortem findings consistent with the presence of ISA.
Den amplifierade RT-PCR-produktens renhet ska kontrolleras med gelelektrofores före sekvensering.
Any external or internal lesions shall be sampled and in any case samples of mid-kidney, heart, liver, pancreas, gut, gills and spleen shall be removed from individual fish using a scalpel and transferred to 8 % to 10 % (vol:vol) buffered formol saline.
Om endast ett rent fragment förekommer ska det renas direkt från PCR-reaktionen.
The ratio of fixative to tissue shall be at least 20:1 to ensure satisfactory preservation of the tissues.
Om flera amplifierade fragment förekommer ska det relevanta fragmentet renas med gelelektrofores.
For immunohistochemistry (IHC), samples from mid-kidney and heart shall be taken.
PCR-fragment ska renas från lösningar eller agarosgel med spinnkolonner med affinitet för PCR-fragment enligt tillverkarens anvisningar.
Tissues for virological examination on cell culture shall be taken from all of the fish sampled.
Sekvensering ska utföras med primrar för amplifiering vid externa specialiserade sekvenseringsföretag.
Pieces of the liver, anterior or mid-kidney, heart and spleen shall be removed from the fish using a sterile instrument and transferred to plastic tubes containing 9 ml transport medium.
Resultaten ska analyseras med sökverktyget BLAST och sekvenserna ska jämföras med andra kända sekvenser i NCBI:s databas över nukleotider (NCBI = National Centre for Biotechnical Information i Förenta staterna).
Tissues from up to five fish may be collected in one tube containing transport solution and represent one pooled sample.
Sekvenseringen ska undanröja eventuella oklarheter om en amplifierad RT-PCR-produkts specificitet.
The weight of tissue in one sample shall be 1,0 ± 0,5 g.
2 Isolering av ISA-virus i cellkulturer
Shipment of samples from fish
Beredning av prover
Whole fish may be transported to the laboratory if the temperature requirements during transportation, as described in paragraph 3 of this point can be fulfilled.
Vävnaden får förvaras vid – 80 °C.
Whole fish shall be wrapped in absorbent paper and shipped in a plastic bag, chilled as described in that paragraph.
Vävnaden får endast frysas och tinas upp en gång före undersökningen.
Live fish may also be shipped, but only under the supervision of the National reference laboratory for fish diseases and taking into account the additional disinfection and biosecurity issues when transporting live fish.
För övervakning och kontroll ska undersökningen genomföras så snabbt som möjligt.
Blood samples and tubes containing fish tissues for virological examination or RT-PCR analysis shall be placed in insulated containers, such as thick-walled polystyrene boxes, together with sufficient ice or freeze blocks to ensure chilling of the samples during transportation to the laboratory.
Varje prov (sammanslaget vävnadsprov i transportlösning) ska vara fullständigt homogeniserat med en validerad homogenisator och centrifugeras vid 2000–4000 × g vid 0–6 °C i 15 minuter; därefter ska supernatanten filtreras (0,45 μm) och inkuberas med en lika stor volym av ett på lämpligt sätt utspätt sammanslaget antiserum mot inhemska serotyper av IPN-virus.
Freezing shall be avoided and ice must still be present in the transport box at receipt of the shipment or one or more of the ‘freeze blocks’ must still be partly or completely frozen.
Antiserumets titer ska vara minst 1:2000 i ett 50 % plackneutralisationstest.
In exceptional circumstances, RT-PCR samples and samples for virological examination may be snap-frozen and transported to the laboratory at – 20 °C or below.
Blandningen ska inkuberas vid 15 °C i 1 timme.
For RT-PCR analysis of tissues preserved in Ribonucleic acid(RNA)later, RNA extraction shall be carried out within the following time frames depending on the temperature the samples are stored at:
Detta utgör inokulatet.
samples stored at – 20 °C: indefinitely.
Alla inokulat behandlas med antiserum mot IPN-virus (ett virus som i vissa delar av Europa finns i 50 % av alla fiskprover) för att förhindra att en cytopatisk effekt (CPE) orsakad av IPN-virus utvecklas i inokulerade cellkulturer.
If fish tissues are transported in fixative for histological examination, they shall be shipped in leak proof tubes in impact-resistant containers.
Sådan behandling får utföras för att göra de virologiska undersökningarna snabbare och ge färre fall där förekomsten av CPE skulle uppfattas som en potentiell indikation på ISA-virus.
Freezing of those samples shall be avoided.
När prover kommer från produktionsenheter som anses fria från IPN behöver inokulat inte behandlas med antiserum mot IPN-virus.
Subject to the approval of the diagnostic laboratory, fish tissues other than those referred to in point I.1 may be collected and prepared for supplementary examination.
Inokulering i cellkulturer
Detailed diagnostic methods and procedures for the surveillance and for the confirmation of the presence of or to rule out the suspicion of ISA
Celler från atlantlaxens njure (ASK-celler) ska användas för primär isolering av ISA-virus.
When laboratory examination for the purpose of obtaining or maintaining a certain health status with regard to ISA as set out in Section I of Part 3 of Annex I, or for the purpose of the confirmation of the presence of or to rule out a suspicion of ISA in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC, are carried out, using the diagnostic methods set out in Section II of Part 3 of Annex I, the detailed methods and procedures set out in the following points II.1 to II.5 shall apply.
Även andra cellinjer med dokumenterad effektivitet och sensitivitet vad gäller isolering av ISA-virus får användas, med beaktande av stamvariationer och olika stammars förmåga att replikera sig i olika cellinjer.
Examination of samples by RT-PCR
ASK-celler verkar stödja isolering och odling av de hittills kända virusisolaten, så länge som celler med ett lågt passagenummer används.
The diagnostic method to be used for the screening for ISAV shall be RT-qPCR.
En tydligare cytopatisk effekt (CPE) kan uppträda i ASK-celler än i andra mottagliga cellinjer såsom SHK-1 (Salmon head kidney-1).
As the results of the RT-qPCR can vary depending on the conditions under which it is performed, adequate positive and negative controls and amplicons shall be included to avoid any doubts.
ASK-celler (passage 65 eller lägre) ska odlas i L-15-medium med 10 % fetalt bovinserum, 2 % (v/v) 200 mM L-glutamin och 0,08 % (v/v) 50 mM 2-merkaptoetanol i mikrotiterplattor.
Total RNA extraction
Organsuspension som behandlats med antiserum ska inokuleras i unga, aktivt växande cellkulturer så att den slutliga spädningen av vävnadsmaterial i odlingsmedium blir 1:1000.