natgillin/translations-raw huggingface dataset:
HAS ADOPTED THIS DECISION:
Bilaga IV till direktiv 2009/156/EG ska ersättas med texten i bilagan till detta beslut.
Annex IV to Directive 2009/156/EC is replaced by the text set out in the Annex to this Decision.
Detta beslut riktar sig till medlemsstaterna.
Article 2
Utfärdat i Bryssel den 14 oktober 2016.
Done at Brussels, 14 October 2016.
Ledamot av kommissionen
For the Commission
EUT L 192, 23.7.2010, s. 1.
Member of the Commission
Rådets direktiv 92/35/EEG av den 29 april 1992 om kontrollregler och åtgärder för bekämpning av afrikansk hästpest (EGT L 157, 10.6.1992, s. 19).
OJ L 192, 23.7.2010, p. 1.
Invest., 2008, 20, s. 325–328.
Council Directive 92/35/EEC of 29 April 1992 laying down control rules and measures to combat African horse sickness (OJ L 157, 10.6.1992, p. 19).
http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.05.01_AHS.pdf
http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahc/current/chapitre_ahs.pdf
DIAGNOSTISERING
See footnote 2.
DEL A
ANNEX
Serologiska tester
‘ANNEX IV
Den serologiska metoden är ett Elisa-test (enzyme-linked immunosorbent assays) baserat på kapitel 2.5.1 avsnitt B punkt 2 i Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (upplaga 2016) som antogs av OIE:s World Assembly of Delegates i maj 2012.
AFRICAN HORSE SICKNESS
Virusproteinet VP7 är ett betydande immunodominant antigen i afrikansk hästpest-virus (AHSV) och är konserverat i de nio AHSV-serotyperna.
DIAGNOSIS
Rekombinanta AHSV-VP7-proteiner har visat sig vara stabila, ofarliga och lämpliga att använda som antigener i Elisa-metoder för bestämning av AHSV-antikroppar med en hög sensitivitet och specificitet (Laviada et al.
PART A
(1992b) [1], Maree och Paweska (2005)).
Serological tests
Indirekt Elisa och blockerande Elisa är de två AHS-VP7 Elisa-tester som är lämpliga för serologisk diagnostisering av afrikansk hästpest (AHS).1.
The serological method described hereinafter are enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) based on point 2 of Section B in Chapter 2.5.1 of the Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Edition 2016 as adopted by the World Assembly of Delegates of the OIE in May 2012.
Indirekt Elisa för påvisande av antikroppar mot afrikansk hästpest-virus (AHSV)
The VP7 viral protein is an immuno-dominant major antigen of the African horse sickness virus (AHSV) and is conserved across the nine AHSV serotypes.
Konjugatet som används i denna metod är ett antihästgammaglobulin konjugerat med pepparrotsperoxidas (HPR) som reagerar med serum från hästar, mulor och åsnor.
Recombinant AHSV-VP7 proteins have been shown to be stable and innocuous and suitable to be used as antigens in ELISA procedures for determination of AHSV antibodies with a high degree of sensitivity and specificity (Laviada et al., 1992b [1]; Maree and Paweska, 2005).
Testförfarande
The indirect ELISA and the blocking ELISA are the two AHS-VP7 ELISA tests suitable for serological diagnosis of African horse sickness (AHS).
Fast fas
Indirect ELISA for the detection of antibodies to African horse sickness virus (AHSV)
Coata Elisa-plattorna med rekombinant AHSV-4 VP7 som spätts i en karbonat-bikarbonatbuffert med pH 9,6.
The antigen may be provided by the Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA), Spain, within 4 to 6 months of request.
Slå försiktigt plattorna mot ett absorberande material för att få bort eventuella tvättrester.
Test procedure
Blockera plattorna med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) (pH 7,2) innehållande 5 % (w/v) skummjölk (Nestlé Dry Skim MilkTM), 200 μl/brunn, i en timme vid 37 °C.
Solid phase
Avlägsna den blockerande lösningen och slå försiktigt plattorna mot ett absorberande material.
Coat ELISA plates with recombinant AHSV-4 VP7 diluted in carbonate/bicarbonate buffer, pH 9,6.
Prover
Incubate plates overnight at 4 °C.
De serumprover som ska testas samt positiva och negativa kontrollserum späds 1:25 i PBS innehållande 5 % (w/v) skummjölk och 0,05 % (v/v) Tween 20, 100 μl/brunn.
Wash the plates five times with distilled water containing 0,01 % (v/v) Tween 20 (washing solution).
Inkubera i en timme vid 37 °C.
Gently tap the plates onto absorbent material to remove any residual wash.
Vid titreringen görs en tvåfaldig spädningsserie från 1:25 (100 μl/brunn), ett serum per kolumn på plattan, och detsamma görs med de positiva och negativa kontrollerna.
Block the plates with phosphate buffered saline (PBS) pH 7,2 + 5 % (w/v) skimmed milk (Nestlé Dry Skim MilkTM), 200 μl/well, for 1 hour at 37 °C.
Konjugat
Remove the blocking solution and gently tap the plates onto absorbent material.
Tillsätt 100 μl/brunn av HRP-konjugerat antihästgammaglobulin som spätts i PBS innehållande 5 % mjölk och 0,05 % Tween 20 (pH 7,2).
Test samples
Kromogen/substrat
Serum samples to be tested, and positive and negative control sera, are diluted 1 in 25 in PBS + 5 % (w/v) skimmed milk + 0,05 % (v/v) Tween 20, 100 μl per well.
Tillsätt 200 μl/brunn av kromogen-/substratlösning (10 ml 80,6 mM DMAB [dimetylaminobensaldehyd] och 10 ml 1,56 mM MBTH [3-metyl-2-bensotiazolinhydrazonhydroklorid] och 5 μl H2O2).
Incubate for 1 hour at 37 °C.
Färgutvecklingen stoppas genom tillsats av 50 μl 3N H2SO4 efter cirka 5–10 minuter (innan det negativa kontrollprovet börjar färgas).
For titration, make a twofold dilution series from 1 in 25 (100 μl/well), one serum per plate column, and do the same with positive and negative controls.
Andra kromogener såsom ABTS (2,2′-azino-bis-[3-etylbensotiazolin-6-sulfonsyra]), TMB (tetrametylbensidin) eller OPD (orto-fenyldiamin) kan också användas.
Conjugate
Avläs plattorna vid 600 nm (eller 620 nm).
Dispense 100 μl/well of horseradish-peroxidase (HRP) -conjugated anti-horse gamma-globulin diluted in PBS + 5 % milk + 0,05 % Tween 20, pH 7,2.
Tolkning av resultaten
Chromogen/Substrate
Beräkna cut-off-värdet genom att lägga till 0,06 till det negativa kontrollvärdet (0,06 är standardavvikelsen för en grupp med 30 negativa serum).
Add 200 μl/well of chromogen/substrate solution (10 ml of 80,6 mM DMAB (dimethyl aminobenzaldehyde) + 10 ml of 1,56 mM MBTH (3-methyl-2-benzo-thiazoline hydrazone hydrochlorid) + 5 μl H2O2).
Prover som ger absorbansvärden som är lägre än cut-off-värdet ska betraktas som negativa.
Colour development is stopped by adding 50 μl of 3N H2SO4 after approximately 5 to 10 minutes (before the negative control begins to be coloured).
Prover som ger absorbansvärden som är högre än cut-off-värdet (+ 0,15) ska betraktas som positiva.
Other chromogens such as ABTS (2,2′-Azino-bis-[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid]), TMB (tetramethyl benzidine), or OPD (ortho-phenyldiamine) can also be used.
Prover som ger absorbansvärden som ligger mellan negativt och positivt ska betraktas som osäkra och en annan metod måste användas för att bekräfta resultatet.
Read the plates at 600 nm (or 620 nm).
Blockerande Elisa för påvisande av antikroppar mot afrikansk hästpest-virus (AHSV)
Interpretation of the results
Det kompetitiva blockerande Elisa-testet är utformat för att påvisa specifika AHSV-antikroppar i serum från alla arter av hästdjur (dvs. hästar, åsnor, zebror och korsningar av dessa), och därmed undviks problemet med specificitet som ibland har uppkommit vid indirekt Elisa.
Calculate the cut-off value by adding 0,06 to the value of the negative control (0,06 is the standard deviation derived with a group of 30 negative sera).
Principen för testet är en blockering av reaktionen mellan det rekombinanta VP7-proteinet som är absorberat till Elisa-plattan och en konjugerad AHS-VP7-specifik monoklonal antikropp.
Test samples giving absorbance values lower than the cut-off are regarded as negative.
Om antikroppar finns i testserumet blockeras reaktionen mellan antigenet och den monoklonala antikroppen, vilket minskar färgutvecklingen.
Test samples giving absorbance values greater than the cut-off + 0,15 are regarded as positive.
Eftersom den monoklonala antikroppen riktas mot VP7 har testet en hög sensitivitet och specificitet.
Test samples giving intermediate absorbance values are considered to be inconclusive and a second technique must be employed to confirm the result.
Det kompetitiva blockerande Elisa-testet är kommersiellt tillgängligt.
Blocking ELISA for the detection of antibodies to African horse sickness virus (AHSV)
Fast fas
The competitive blocking ELISA is designed to detect specific AHSV antibodies in sera from animals of any equine species, i.e. horses, donkeys, zebra and their crosses, preventing the problem of specificity experienced occasionally using the indirect ELISAs.
Coata Elisa-plattorna med 50–100 ng rekombinant AHSV-4 VP7 som spätts i en karbonat-bikarbonatbuffert med pH 9,6.
The principle of the test is the blocking of the reaction between the recombinant VP7 protein absorbed to the ELISA plate and a conjugated AHS-VP7 specific monoclonal antibody (Mab).
Inkubera över natten vid 4 °C.
Antibody in the test sera will block the reaction between the antigen and the Mab resulting in a reduction in colour.
Skölj plattorna tre gånger med PBS 0,1× innehållande 0,135 M NaCl och 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST).
Because the Mab is directed against the VP7, the assay will give a high level of sensitivity and specificity.
Slå försiktigt plattorna mot ett absorberande material för att få bort eventuella tvättrester.
The competitive blocking ELISA is commercially available.
Prover och kontroller
Solid Phase
De serumprover som ska testas samt positiva och negativa kontrollserum späds 1:5 i ett spädningsmedel innehållande 0,35 M NaCl, 0,05 % (v/v) Tween 20 och 0,1 % Kathon, 100 μl/brunn.
Coat ELISA plates with 50-100 ng of recombinant AHSV-4 VP7 diluted in carbonate/bicarbonate buffer, pH 9,6.
Vid titreringen görs en tvåfaldig spädningsserie av testserumet från 1:10 till 1:280 över åtta brunnar (100 μl/brunn), ett serum per kolumn på plattan, och detsamma görs med de positiva och negativa kontrollerna.
Incubate overnight at 4 °C.
Inkubera i en timme vid 37 °C.
Wash the plates three times with phosphate buffered saline (PBS) 0,1× containing 0,135 M NaCl and 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST).
Skölj plattorna fem gånger med PBS 0,1× innehållande 0,135 M NaCl och 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST).
Gently tap the plates on to absorbent material to remove any residual wash.
Tillsätt 100 μl/brunn av HPR-konjugerade monoklonala antikroppar mot VP7.
Test samples and controls
Denna monoklonala antikropp har i förväg spätts 1:5000–1:15000 i en 1:1 lösning av StabiliZyme Select® Stabilizer (SurModics, referens: SZ03) och destillerat vatten.
Serum samples to be tested, and positive and negative control sera, are diluted 1 in 5 in diluent containing 0,35 M NaCl, 0,05 % (v/v) Tween 20 and 0,1 % Kathon, 100 μl per well.
Inkubera i 30 minuter vid 37 °C.
For titration, make a twofold dilution series of the test sera from 1 in 10 to 1 in 280 across 8 wells (100 μl/well), one serum per plate column, and do the same with positive and negative controls.
Tillsätt 100 μl/brunn av kromogen-/substratlösning, dvs. 1 ml 5 mg/ml ABTS (2,2′-azino-bis-[3-etylbensotiazolin-6-sulfonsyra]) och 9 ml substratbuffert (0,1 M fosfatcitratbuffert med pH 4 innehållande 0,03 % H2O2) och inkubera i tio minuter vid rumstemperatur.
Incubate for 1 hour at 37 °C.
Färgutvecklingen stoppas genom tillsats av 100 μl/brunn av 2 % (w/v) SDS (natriumdodecylsulfat).
Wash the plates five times with phosphate buffered saline (PBS) 0,1× containing 0,135 M NaCl and 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST).
Avläsning
Dispense 100 μl/well of horseradish peroxidase-conjugated Mab anti-VP7.
Avläs vid 405 nm i Elisa-läsare.
In advance, this Mab has been diluted 1/5000-1/15000 in a 1/1 solution of StabiliZyme Select® Stabilizer (SurModics.
Fastställ hur många procent av varje prov som blockerats (BP) med hjälp av följande formel, där ”Abs” betecknar antikroppar:
Reference: SZ03) in distilled water.
Abskontroll
Incubate for 30 minutes at 37 °C.
Absprov
Add 100 μl/well chromogen/substrate solution, i.e. 1 ml of ABTS (2,2′-Azino-bis-[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid]) 5 mg/ml + 9 ml of substrate buffer (0,1 M Phosphate-Citrate buffer of pH 4 containing 0,03 % H2O2), and incubate for 10 minutes at room temperature.
Prover som visar ett BP-värde som är högre än 50 % bör betraktas som positiva för AHSV-antikroppar.
Colour development is stopped by adding 100 μl/well of 2 % (w/v) SDS (sodium dodecyl sulphate).
Prover som visar ett BP-värde som är lägre än 45 % bör betraktas som negativa för AHSV-antikroppar.
Reading
Prover som visar ett BP-värde på 45–50 % bör betraktas som osäkra och måste testas på nytt.
Read at 405 nm in an ELISA reader.
Om resultatet återigen är osäkert bör djuren testas på nytt på prover som tas tidigast två veckor efter det att det prov som betraktades som osäkert togs.
Determine the blocking percentage (BP) of each sample by applying the following formula, where “Abs” stands for antibodies:
DEL B
Abscontrol
Identifiering av agens
Abssample
Realtids PCR med omvänd transkription (rRT-PCR)
Samples showing a BP value higher than 50 % should be considered as positive for AHSV antibodies.
Tester för identifiering av agens som baseras på nukleinsyremetoder ska påvisa referensstammar av de nio AHSV-serotyperna.
Samples showing a BP value lower than 45 % should be considered as negative for AHSV antibodies.
Metoden som beskrivs i punkt 2.1 är baserad på kapitel 2.5.1 avsnitt B punkt 1.2 i Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (upplaga 2016) som antogs av OIE:s World Assembly of Delegates i maj 2012.
Samples showing a BP value between 45 % and 50 % should be considered as inconclusive and must be retested.
De RT-PCR detektionsmetoder som används för testning av prover (antingen blod eller mjälte) inom ramen för direktiv 2009/156/EG måste ha en sensitivitet som motsvarar eller överstiger den hos de metoder som beskrivs i punkt 2.
If the result is again inconclusive, the animals should be retested on samples taken not earlier than two weeks after the sample which was considered to be inconclusive was taken.
Inaktiverade virus av referensstammar av serotyperna 1–9 kan erhållas från EU:s referenslaboratorium eller från OIE:s referenslaboratorium för afrikansk hästpest i Algete, Spanien.
PART B
Extraktion av virus-RNA
Identification of the agent
Det AHSV-RNA som extraheras från provet måste vara av hög kvalitet för att garantera en bra reaktion.
Real-time Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction (rRT-PCR)
Nukleinsyror kan extraheras från kliniska prover med flera olika egenutvecklade eller kommersiella metoder.
Agent identification tests based on nucleic acid methods must detect reference strains from the nine virus serotypes of the AHSV.
Kommersiella kit använder olika metoder för att isolera RNA.
The method described in point 2.1 is based on point 1.2 of Section B in Chapter 2.5.1 of the Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Edition 2016 as adopted by the World Assembly of Delegates of the OIE in May 2012.
De flesta är baserade på någon av följande metoder:
Any RT-PCR detection method used for the testing of samples, either blood or spleen, in the context of Directive 2009/156/EC must perform equal to or exceed the sensitivity of the methodologies described in point 2.
Fenol-kloroformextraktion av nukleinsyror.
Inactivated virus of serotypes 1 to 9 reference strains may be obtained from the European Union Reference Laboratory or the OIE Reference Laboratory for African horse sickness, Algete, Spain.
Adsorption av nukleinsyror med filtersystem.
Extraction of viral RNA
Adsorption av nukleinsyror med magnetisk partikelteknik.
To assure a good reaction it is necessary to extract from the sample an AHSV RNA of high quality.
Följande metod är ett exempel på en egenutvecklad metod för RNA-extraktion:
The extraction of nucleic acids from clinical samples can be performed by a variety of in-house and commercially available methods.
1 g vävnadsprov homogeniseras i 1 ml denatureringsmedel (4 M guanidiumtiocyanat, 25 mM natriumcitrat, 0,1 M 2-merkaptoetanol, 0,5 % sarkosyl).
Commercial kits use different approaches for RNA isolation.
Efter centrifugering tillsätts 1 μg jäst-RNA, 0,1 ml 2 M natriumacetat (pH 4), 1 ml fenol och 0,2 ml av en kloroform-isoamylalkoholblandning (49:1) till supernatanten.
Most are based on one of the following procedures:
Suspensionen skakas kraftigt och kyls på is i 15 minuter.
Phenol-chloroform extraction of nucleic acids;
Efter centrifugering extraheras det RNA som finns i vattenfasen med fenol, fälls ut med etanol och återsuspenderas i sterilt vatten.
Adsorption of nucleic acids to filter system;
Realtids RT-PCR-metod
Adsorption of nucleic acids to magnetic beads system.
Gruppspecifik realtids RT-PCR enligt Agüero et al.
An example of an in-house RNA extraction is given below:
(2008) [3]
1 g of tissue sample is homogenised in 1 ml of denaturing solution (4 M guanidium thiocyanate, 25 mM sodium citrate, 0,1 M 2-mercaptoethanol, 0,5 % sarcosyl).
Detta gruppspecifika realtids RT-PCR riktar in sig på VP7 i AHSV och kan påvisa alla kända AHSV-serotyper och AHSV-stammar som för närvarande cirkulerar.
After centrifugation, 1 μg of yeast RNA, 0,1 ml of 2 M sodium acetate pH 4, 1 ml of phenol and 0,2 ml of chloroform/isoamyl alcohol mixture (49/1) are added to the supernatant.
Primer- och probsekvenser för påvisande av AHSV:
The suspension is vigorously shaken and cooled on ice for 15 minutes.
Framåtriktad primer: 5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′
After centrifugation, the RNA present in the aqueous phase is phenol extracted, ethanol precipitated and resuspended in sterile water.
Bakåtriktad primer: 5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′
Real-time RT-PCR Procedure
MGB-TaqMan-prob: 5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′
This group-specific real-time RT-PCR targets VP7 of the AHSV and is able to detect all known AHSV serotypes and strains currently circulating.
En mall för testplattan bör utformas och läggas in i programvaran för realtids PCR-instrumentet.
It has been employed with very good results by the participating national reference laboratories of the European Union Member States in the proficiency tests annually organised by the European Union Reference Laboratory for the period 2009-2015.
2,5 μl av arbetslösningen för varje primer (på 8 μM) tillsätts varje brunn som enligt mallen ska innehålla RNA-prover, positiva och/eller negativa kontroller (primerns slutkoncentration kommer att vara 1 μM i 20 μl RT-PCR-mix).
Moreover, in an international ring trial organised in 2015 in the framework of the OIE reference laboratories network this protocol was ranked very high amongst others.
Plattan förvaras på is.
Primer and probe sequences for the detection of AHSV species viruses:
2 μl isolerat RNA (prover och positiv kontroll) eller 2 μl RNas-fritt vatten (negativ kontroll) blandas med framåtriktade och bakåtriktade primrar.
forward Primer 5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′
Blandningen denatureras genom upphettning i 5 minuter vid 95 °C, följt av en snabb kylning på is i minst 5 minuter.
reverse Primer 5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′
Bered enligt tillverkarens anvisningar den volym av mastermix för ettstegs realtids RT-PCR som är lämplig för det antal prover som ska testas.
MGB-TaqMan probe 5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′
0,1 μl av arbetslösningen för proben (på 50 μM) tillsätts varje brunn med RNA-prover (probens slutkoncentration kommer att vara 0,25 μM i varje brunn med RNA-prover).
Primer stock concentration is diluted to a working concentration of 8 μM (“primer working stock 8 μM”) whereas probe is diluted to a working concentration of 50 μM (“probe working stock 50 μM”).
13 μl mastermix för ettstegs realtids RT-PCR tillsätts varje brunn i PCR-plattan innehållande denaturerade primrar och denaturerat RNA.
A test plate layout should be designed and loaded into the real time PCR machine software.
Plattan placeras i en realtids termocykler programmerad för omvänd transkription och cDNA amplifiering/fluorescensdetektion.
Using the layout as a guide, 2,5 μl of each primer working stock 8 μM is added to each well that will contain RNA samples, positive and/or negative controls (final concentration of the primer will be 1 μM in the 20 μl RT-PCR mix).
Amplifieringsförhållandena består av ett första steg med omvänd transkription i 25 minuter vid 48 °C, följt av 10 minuter vid 95 °C (hot start) och 40 cykler på 15 sekunder vid 95 °C, 35 sekunder vid 55 °C och 30 sekunder vid 72 °C (eller 40 cykler på 2 sekunder vid 97 °C och 30 sekunder vid 55 °C om termocykler och reagenser för snabba reaktioner används).
The plate is held on ice.
Fluorescensdata samlas in vid slutet av steget vid 55 °C.
2 μl of isolated RNA (test samples and positive control), or 2 μl of RNAse-free water in negative reaction controls, is mixed with forward and reverse primers.
Testet betraktas som ogiltigt om atypiska amplifieringskurvor erhålls och ska i så fall upprepas.
This mixture is denatured by heating at 95 °C for 5 minutes, followed by rapid cooling on ice for at least 5 minutes.
Prover betraktas som positiva om Ct-värdet (cykelnummer då fluorescensen i en reaktion passerar tröskelvärdet för fluorescens) är lägre än eller lika med det fastställda Ct-värdet (35) inom 40 PCR-cykler (Ct ≤ 35).
An appropriate volume of real time one-step RT-PCR master mix for the number of samples to be tested is prepared following manufacturer's instructions.
Prover betraktas som osäkra om Ct-värdet är högre än det fastställda Ct-värdet (35) inom 40 PCR-cykler (Ct ≥ 35).
0,1 μl of probe working stock 50 μM is added to each well containing RNA samples (final concentration of the probe will be 0,25 μM in each well containing RNA samples).
Prover betraktas som negativa om en horisontell amplifieringskurva erhålls som inte passerar tröskelvärdet inom 40 PCR-cykler.
13 μl of real time one-step RT-PCR master mix is distributed in each well on the PCR plate containing the denatured primers and RNA.
Gruppspecifik realtids RT-PCR enligt Guthrie et al.
The plate is placed in a real time thermal cycler programmed for reverse transcription and cDNA amplification/fluorescence detection.
(2013) [4]
Amplification conditions consist of a first reverse-transcription step at 48 °C for 25 minutes, followed by 10 minutes at 95 °C (“hot start”) and 40 cycles of 15 seconds at 95 °C, 35 seconds at 55 °C and 30 seconds at 72 °C (or 40 cycles at 97 °C for 2 seconds and 55 °C for 30 seconds if reagents and thermocycler allowing fast reactions are used).
Realtids RT-PCR med FRET-prober (Fluorescence Resonance Energy Transfer) för att påvisa AHSV:s nukleinsyror.
Fluorescence data are acquired at the end of the 55 °C step.
I denna RT-PCR-metod för AHSV används sekvenser från flera olika fältstammar av AHSV som för närvarande cirkulerar (Quan et al.
The assay is considered not valid if atypical amplification curves are obtained, and must be repeated.
(2010) [5]).
Samples are considered positives, if the Ct value (cycle number at which the fluorescence generated within a reaction crosses the fluorescence threshold) is lower than or equal to the defined Ct threshold (35) within 40 PCR cycles (Ct ≤ 35).
Nedan följer några grundläggande steg enligt Guthrie et al.
Samples are considered inconclusive, if the Ct value is higher than the defined Ct threshold (35) within 40 PCR cycles (Ct > 35).
som kan modifieras beroende på lokala/specifika krav, vilka kit som används och vilken utrustning som finns tillgänglig.
Samples are considered negative, if a horizontal amplification curve is obtained which does not cross the threshold line within 40 PCR cycles.
Framåtriktad primer: 5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′
The AHSV RT-PCR assay described was designed using sequences from a wide variety of currently circulating field strains of AHSV (Quan et al., 2010 [5]).
Stamlösningen för primer-probblandningen är koncentrerad 25× och innehåller 5 μΜ framåtriktade och bakåtriktade primrar och 3 μΜ prob.
It also incorporates a proprietary synthetic external control assay to verify proper functioning of the assay components.
En mall för testplattan bör utformas och läggas in i programvaran för realtids PCR-instrumentet.
Kits for the one-step real-time PCR are available commercially.
5 μl RNA-prover (inklusive testprover samt positiva och negativa kontroller) tillsätts de lämpliga brunnarna enligt mallen.