natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Following an appropriate time for detachment of the cells, the enzyme action should be stopped with the addition of supplemented medium at a ratio of 3 × the volume used for the enzyme treatment.
Kvalitetskontrollplattan (QC) används för att kontrollera prestanda hos H295R-celler under standardodlingsbetingelser, och för att upprätta en historisk databas för hormonkoncentrationer i lösningsmedelskontroller, positiva och negativa kontroller, samt andra QC-mått över tiden.
Cells are placed into a centrifuge tube, centrifuged at room temperature, the supernatant is removed, and the pellet of cells is re-suspended in supplemented medium.
H295R-cellprestandan bör bedömas med hjälp av en QC-platta för varje nytt ATCC-parti eller efter användningen av ett tidigare fryst lager av celler för första gången, om inte laboratoriets kvalifikationsprövning (punkterna 32–34) har genomförts med denna sats av celler.
The cell density is calculated using e.g. a haemocytometer or cell counter.
En QC-platta ger en fullständig bedömning av de testförhållanden (t.ex. cellviabilitet, lösningsmedelkontroller, negativa och positiva kontroller, samt variation mellan och inom tester) när man testar kemikalier och bör ingå i varje testomgång.
The cell solution should be diluted to the desired plating density and thoroughly mixed to assure homogenous cell density.
QC-provningen ska utföras på en 24-hålsplatta och följer samma förfaranden som för inkubation, dosering, cellviabilitet/cytotoxicitet, hormonextraktion och hormonanalys som beskrivs i punkterna 38 till 46 för testning av kemikalier.
The cells should be plated with 1 ml of the cell solution/well and the plates and wells labelled.
En detaljerad beskrivning av plattans utformning ges i tabell 4.
The seeded plates are incubated at 37 °C under 5 % CO2 in air atmosphere for 24 hours to allow the cells to attach to the wells.
De kriterier som ska uppfyllas för QC-plattan anges i tabell 5.
QUALITY CONTROL REQUIREMENTS
Den minsta basala hormonproduktionen för T och E2 ska uppfyllas i både lösningsmedelskontrollen och blankhålen.
It is critical that exact volumes of solutions and samples are delivered into the wells during dosing because these volumes determine the concentrations used in the calculations of assay results.
Efter avslutning av exponeringsexperimentet och avlägsnande av mediet, tillsätts en 70 % metanollösning i samtliga MeOH-hål för att fungera som en positiv kontroll för cytotoxicitet (se cytotoxicitetstest i tillägg III till valideringsrapporten [hänvisning 4])
Prior to the initiation of cell culture and any subsequent testing, each laboratory should demonstrate the sensitivity of its hormone measurement system (paragraphs 29-31).
Blank [23](+ MeOH) [24]
If antibody-based hormone measurement assays are to be used, the chemicals to be tested should be analysed for their potential to interfere with the measurement system used to quantify T and E2 as outlined in paragraph 32 prior to initiating testing.
(+ MeOH) [24]
DMSO is the recommended solvent for the assay.
Tabell 5
If an alternative solvent is utilised, the following should be determined:
Prestandakriterier för kvalitetskontrollplatta
The solubility of the test chemical, forskolin and prochloraz in the solvent;
Basalproduktion av hormonet i lösningsmedelskontrollen (SC)
The cytotoxicity as a function of the concentration of solvent.
≥ 5 gånger LOQ
It is recommended that the maximum allowable solvent concentration should not exceed a 10 × dilution of the least cytotoxic concentration of the solvent.
≥ 2,5 gånger LOQ
Prior to conducting testing for the first time, the laboratory should conduct a qualifying experiment demonstrating that the laboratory is capable of maintaining and achieving appropriate cell culture and experimental conditions required for chemical testing as described in paragraphs 33-35.
Induktion (10 μM forskolin)
When initiating testing using a new batch, a control plate should be run before using a new batch of cells to evaluate the performance of the cells as described in paragraphs 36 and 37.
≥ 1,5 gånger SC
Performance of the Hormone Measurement System
≥ 7,5 gånger SC
Method sensitivity, accuracy, precision and cross-reactivity with sample matrix
Inhibition (1μM prokloraz)
Each laboratory may use a hormone measurement system of its choice for the analysis of the production of T and E2 by H295R cells so long as it meets performance criteria, including the Limit of Quantification (LOQ).
≤ 0,5 gånger SC
Nominally these are 100 pg/ml for T and 10 pg/ml for E2, which are based on the basal hormone levels observed in the validation studies.
KEMISKT EXPONERINGSFÖRFARANDE
However, greater or lower levels may be appropriate depending upon the basal hormone levels achieved in the performing laboratory.
De förinkuberade cellerna ska avlägsnas från inkubatorn (punkt 21) och kontrolleras i mikroskop för att säkerställa att de är i gott skick (fastsättning, morfologi) före doseringen.
Prior to initiation of QC plate and test runs, the laboratory should demonstrate that the hormone assay to be used can measure hormone concentrations in supplemented medium with sufficient accuracy and precision to meet the QC criteria specified in Tables 1 and 5 by analysing supplemented medium spiked with an internal hormone control.
Cellerna placeras i ett biosäkerhetsskåp och det berikade mediet avlägsnas och ersätts med ett nytt berikat medium (1 ml/hål).
Supplemented medium should be spiked with at least three concentrations of each hormone (e.g. 100, 500 and 2500 pg/ml of T; 10, 50 and 250 pg/ml of E2; or the lowest possible concentrations based upon the detection limits of the chosen hormone measurement system can be used for the lowest spike concentrations for T and E2) and analysed.
DMSO är det lösningsmedel som föredras för denna testmetod.
Measured hormone concentrations of non-extracted samples should be within 30 % of nominal concentrations, and variation between replicate measurements of the same sample should not exceed 25 % (see also Table 8 for additional QC criteria).
Men om det finns skäl att använda andra lösningsmedel bör den vetenskapliga grunden beskrivas.
If these QC criteria are fulfilled it is assumed that the selected hormone measurement assay is sufficiently accurate, precise and does not cross-react with components in the medium (sample matrix) such that a significant influence on the outcome of the assay would be expected.
Cellerna exponeras för testkemikalien genom att 1 μl av lämplig stamlösning tillsätts DMSO (se tillägg II till valideringsrapporten [hänvisning 4]) per 1 ml berikat medium (hålvolym).
In this case, no extraction of samples prior to measurement of hormones is required.
Detta resulterar i en slutlig koncentration av 0,1 % DMSO i hålen.
In the case that the QC criteria in Tables 1 and 8 are not fulfilled, a significant matrix effect may be occurring, and an experiment with extracted spiked medium should be conducted.
För att säkerställa adekvat blandning föredras i allmänhet att den lämpliga stamlösningen av testkemikalien i DMSO blandas med berikat medium för erhållande av den önskade slutkoncentrationen för varje dos, och blandningen tillsätts varje hål omedelbart efter borttagandet av gammalt medium.
An example of an extraction procedure is described in Appendix II to the validation report (4).
Om detta alternativ används bör koncentrationen av DMSO (0,1 %) vara oförändrat för alla hål.
If it can be shown that after extraction the components of the medium do not interfere with the hormone detection method as defined by the QC criteria, all further experiments should be conducted using extracted samples.
Om sådana tillstånd (grumlighet, fällningsformationer) observeras, granskas också de hål som innehåller de närmaste lägre koncentrationerna (och så vidare) och koncentrationer som inte helt löser sig undantas från vidare utvärdering och analys.
If the QC criteria cannot be met after extraction, the utilised hormone measurement system is not suitable for the purpose of the H295R Steroidogenesis Assay, and an alternative hormone detection method should be used.Standard curve
Plattan återförs till inkubatorn vid 37 °C med 5 % CO2 i luftatmosfär under 48 timmar.
The hormone concentrations of the solvent controls (SC) should be within the linear portion of the standard curve.
Testkemikalieplattans utformning visas i tabell 6.
Preferably, the SC values should fall close to the centre of the linear portion to ensure that induction and inhibition of hormone synthesis can be measured.
Block 1–7 visar placering av ökande doser av testkemikalien.
Dilutions of medium (or extracts) to be measured are to be selected accordingly.
Tabell 6
The linear relationship is to be determined by a suitable statistical approach.
Doseringsschema för exponeringen av H295R-celler för att testa kemikalier i en 24-hålsplatta
Chemical interference test
Block 4
If antibody-based assays such as Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISAs) and Radio-Immuno Assays (RIAs) are going to be used to measure hormones, each chemical should be tested for potential interference with the hormone measurement system to be utilised prior to initiation of the actual testing of chemicals (Appendix III to the validation report (4)) because some chemicals can interfere with these tests (17).
Block 1
If interference occurs that is ≥ 20 % of basal hormone production for T and/or E2 as determined by hormone analysis, the Chemical Hormone Assay Interference Test (such as described in Appendix III to the validation report (4) section 5.0) should be run on all test chemical stock solution dilutions to identify the threshold dose at which significant (≥ 20 % ) interference occurs.
Block1
If interference is less than 30 %, results may be corrected for the interference.
Block 5
If interference exceeds 30 %, the data are invalid and the data at these concentrations should be discarded.
Block 2
Limit of Quantification (LOQ)
Om cellviabilitet/cytotoxicitet inte ska mätas direkt tillsätts 200 μl PBS med Ca2+ och Mg2+ till varje hål.
Hormone Extraction Efficiency (only when extraction is needed)
Mediet fryses vid – 80 °C tills vidare bearbetning för analys av hormonkoncentrationer (se punkterna 44–46).
The average recovery rates (based on triplicate measures) for the spiked amounts of hormone should not deviate more than 30 % from amount that was added.
Medan T och E2 i medium som lagras vid – 80 °C i allmänhet är stabila i minst 3 månader bör hormonstabiliteten under lagringen dokumenteras på varje laboratorium.
Chemical Interference (only antibody based systems)
Omedelbart efter avlägsnande av mediet bestäms cellviabilitet/cytotoxicitet för varje exponeringsplatta.
No substantial (≥ 30 % of basal hormone production of the respective hormone) cross-reactivity with any of the hormones produced by the cells should occur [19] [20]
Cellviabilitetsbestämning
Laboratory Proficiency Test
Ett valfritt cellviabilitets-/cytotoxicitetstest kan användas för att bestämma den testkemikaliens potentiella effekt på cellernas livskraft.
As the performance of an assay is directly linked to the laboratory personnel conducting the assay, these procedures should be partly repeated if a change in laboratory personnel occurs.
Ett alternativt test som har visat sig fungera lika bra är MTT [3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid]-testet (se hänvisning 18).
This proficiency test will be conducted under the same conditions listed in paragraphs 38 through 40 by exposing cells to 7 increasing concentrations of strong, moderate and weak inducers and inhibitors as well as a negative chemical (see Table 2).
Bedömningen av cellviabiliteten med hjälp av ovanstående metoder är ett relativt mått som inte nödvändigtvis uppvisar linjära samband med det totala antalet celler i ett hål.
Specifically, chemicals to be tested include the strong inducer forskolin (CAS No 66575-29-9);
Därför bör en subjektiv parallell visuell bedömning av varje hål genomföras av analytikern och digitala bilder av lösningsmedelskontroller och de två högsta icke-cytotoxiska koncentrationerna ska tas och arkiveras för att senare kunna bedöma sann celltäthet om det skulle krävas.
the strong inhibitor prochloraz (CAS No 67747-09-5);
Om det genom visuell inspektion eller om det framgår av viabilitets-/cytotoxicitetstestet att det tycks finnas en ökning av antalet celler måste den eventuella ökningen verifieras.
the moderate inducer atrazine (CAS No 1912-24-9);
Om en ökning av cellantalet verifieras bör detta anges i testrapporten.
the moderate inhibitor aminoglutethimide (CAS No 125-84-8);
Cellernas livsduglighet uttrycks i förhållande till den genomsnittliga responsen i lösningsmedelskontroller, som anses vara 100 % viabla celler och beräknas som lämpliga för det cellviabilitets-/ cytotoxicitetstest som används.
the weak inducer (E2 production) and weak inhibitor (T production) bisphenol A (CAS No 80-05-7);
För MTT- testet kan följande formel användas:
and the negative chemical human chorionic gonadotropin (HCG) (CAS No 9002-61-3) as shown in Table 2.
% viabla celler = (respons i hål – genomsnittlig respons i MeOH-behandlade [= 100 % döda] hål) ÷ (genomsnittlig respons i SC-hål – genomsnittlig respons i MeOH-behandlade [= 100 % döda] hål)
Separate plates are run for all chemicals using the format as shown in Table 6.
Hål med viabilitet lägre än 80 %, i förhållande till den genomsnittliga viabiliteten i SC (= 100 % viabilitet), bör inte ingå i den slutliga dataanalysen.
One QC plate (Table 4, paragraphs 36-37) should be included with each daily run for the proficiency chemicals.
Inhibering av steroidogenes som uppträder i närvaro av nästan 20 % cytotoxicitet bör utvärderas noggrant för att säkerställa att cytotoxiciteten inte är orsaken till inhibitionen.
Proficiency chemicals and exposure concentrations
Hormonanalys
Proficiency chemical
Varje laboratorium kan använda ett valfritt hormonmätsystem för analysen av T och E2.
Test Concentrations [μM]
Restalikvoter av medium från varje behandlingsgrupp kan användas för att bereda spädningar, för att hålla koncentrationen inom den linjära delen av standardkurvan.
Prochloraz
Som anges i punkt 29, bör varje laboratorium påvisa överensstämmelsen mellan sitt hormonmätsystem (t.ex.Elisa, RIA, LC-MS, LC-MS/MS) och QC-kriterierna genom att analysera berikat medium spikat med en intern hormonkontroll innan QC-omgångarna eller testningen av kemikalierna genomförs.
Forskolin
För att säkerställa att komponenterna i testsystemet inte stör mätningen av hormoner kan hormonerna behöva extraheras från mediet innan de mäts (se punkt 30 för de omständigheter under vilka en extraktion krävs eller ej).
Atrazine
Det rekommenderas att man utför extraktion enligt förfarandena i tillägg III till valideringsrapporten (se hänvisning 4).
Aminoglutethimide
Om ett kommersiellt testkit används för att mäta hormonproduktionen bör hormonanalysen utföras enligt de manualer som tillhandahålls av testkittillverkaren.
Dosing is in μM for all test chemical doses.
Värden utanför den linjära delen av standardkurvan bör avvisas.
Doses should be administered in DMSO at 0,1 % v/v per well.
Slutliga hormonkoncentrationer beräknas enligt följande:
All test concentrations should be tested in triplicate wells (Table 6).
Exempel:
Separate plates are run for each chemical.
Extraherat:
One QC plate is included with each daily run.
Beredd i:
Cell viability and hormone analyses should be conducted as provided in paragraphs 42 through 46.
250 μl testbuffert
The threshold value (lowest observed effect concentration, LOEC) and classification decision should be reported and compared with the values in Table 3.
Utspädning i test:
The data are considered acceptable if they meet the LOEC and decision classification in Table 3.
1:10 (för att hålla provet inom det linjära området för standardkurvan)
n/a:
150 pg/ml (redan justerad till koncentration per ml prov som testas)
not applicable as no changes should occur after exposure to non-cytotoxic concentrations of negative control.
Återvinning:
CAS No
Slutlig hormonkoncentration =
+ [22] (Inhibition)
(150 pg/ml) ÷ (0,89) × (250 μl/450 μl) × 10 = 936,3 pg/ml
+ (Induction)
Minst två oberoende omgångar av testet ska genomföras.
n/a
Om resultaten från den första omgången är tvetydiga (dvs. den X-faldiga förändringen är statistiskt signifikant från SC vid endast en koncentration) eller positiva (dvs. den X-faldiga förändringen för två eller flera intilliggande koncentrationer är statistiskt säkerställd), ska testet upprepas enligt tabell 7 genom förfining av de valda testkoncentrationerna.
Negative
Testkoncentrationerna i omgång två och tre (i förekommande fall) ska justeras på grundval av resultaten från den inledande omgången, och intervallet ska inkludera de koncentrationer som gav en effekt varvid en 1/2-log koncentrationsfördelning används (t.ex. om den ursprungliga omgången på 0,001 – 0,01 – 0,1 – 1 – 10 – 100 – 1000 μM resulterade i induktioner vid 1 och 10 μM, bör de koncentrationer som testas i den andra omgången vara 0,1 – 0,3 – 1 – 3 – 10 – 30 – 100 μM), såvida inte lägre koncentrationer måste användas för att fastställa ett LOEC-värde.
Quality Control Plate
I det senare fallet bör åtminstone fem koncentrationer under den lägsta testade koncentrationen i den första omgången ingå i den andra omgången, med användning av en 1/2-logskala.
The quality control (QC) plate is used to verify the performance of the H295R cells under standard culture conditions, and to establish a historical database for hormone concentrations in solvent controls, positive and negative controls, as well as other QC measures over time.
Om den andra omgången inte bekräftar den första omgången (dvs.statistisk signifikans inträffar inte vid den tidigare positivt testade koncentrationen ± 1 koncentrationsökning), ska ett tredje försök utföras under de ursprungliga testbetingelserna.
H295R cell performance should be assessed using a QC plate for each new ATCC batch or after using a previously frozen stock of cells for the first time unless the laboratory proficiency test (paragraphs 32-34) has been run with that batch of cells.
Tvetydiga resultat i den första omgången betraktas som negativa om den observerade effekten inte kunde bekräftas i någon av de två efterföljande omgångarna.
A QC plate provides a complete assessment of the assay conditions (e.g. cell viability, solvent controls, negative and positive controls, as well as intra- and inter-assay variability) when testing chemicals and should be part of each test run.
Tvetydiga resultat betraktas som positiva responser (effekt) när svaret kan bekräftas i ytterligare minst en omgång med en koncentrationsökning inom ± 1 (se avsnitt 55 beträffande datatolkning).
The QC test is conducted in a 24-well plate and follows the same incubation, dosing, cell viability/cytotoxicity, hormone extraction and hormone analysis procedures described in paragraphs 38 through 46 for testing chemicals.
Tabell 7
The QC plate contains blanks, solvent controls, and two concentrations of a known inducer (forskolin, 1, 10 μM) and inhibitor (prochloraz, 0,1, 1 μM) of E2 and T synthesis.
Beslutsmatris för möjliga utfallsscenarier
In addition, MeOH is used in select wells as a positive control for the viability/cytotoxicity assay.
Omgång 1
A detailed description of the plate layout is provided in Table 4.
Omgång 2
The criteria to be met on the QC plate are listed in Table 5.
Omgång 3
The minimum basal hormone production for T and E2 should be met in both the solvent control and blank wells.
Beslut
Table 4 Quality control plate layout for testing performance of unexposed H295R cells and cells exposed to known inhibitors (PRO = prochloraz) and stimulators (FOR = forskolin) of E2 and T production.
Positiv
After termination of the exposure experiment and removal of medium, a 70 % methanol solution will be added to all MeOH wells to serve as a positive control for cytotoxicity (see cytotoxicity assay in Appendix III to the validation report (4))
Bekräfta [26]
Blank [23]
Stoppa
Blank [23](+ MeOH) [24]
Förfina [27]
(+ MeOH) [24]
Tvetydig [28]
Table 5
Kvalitetskontroll av testplattan
Performance criteria for the Quality Control Plate
Förutom att uppfylla kriterierna för QC-plattan bör andra kvalitetskriterier som gäller för acceptabel variation mellan likadana hål, replikatexperiment, linjäritet och känslighet hos hormonmätsystem, variation mellan replikata hormonmätningar för samma prov samt procentuella utbyte av hormontoppar efter extraktion av medium (om tillämpligt, se punkt 30 om extraktionskrav) uppfyllas, och de anges i tabell 8.
Basal Production of hormone in the solvent control (SC)
Data bör falla inom acceptabla gränser som definierats för varje parameter som ska beaktas för vidare utvärdering.
≥ 5 times the LOQ
Om dessa kriterier inte uppfylls, ska det på kalkylbladet noteras att QC-kriterierna inte uppfylldes för provet i fråga och provet ska analyseras på nytt eller tas bort från datamängden.
≥ 2,5 times the LOQ
Tabell 8
Induction (10 μM forskolin)
Acceptabla områden och/eller variationer (%) för H295R-testplattans parametrar
≥ 1,5 times the SC
(LOQ: kvantifieringsgränsen för hormonmätsystemet.
≥ 7,5 times the SC
CV: Variationskoefficient.
Inhibition (1μM prochloraz)
SC: Lösningsmedelskontroll.
≤ 0,5 times the SC
DPM: Sönderfall per minut)
CHEMICAL EXPOSURE PROCEDURE
Jämförelse mellan
The pre-incubated cells are removed from the incubator (paragraph 21) and checked under a microscope to assure that they are in good condition (attachment, morphology) prior to dosing.
Basal hormonproduktion i SC
The cells are placed in a bio-safety cabinet and the supplemented medium removed and replaced with new supplemented medium (1 ml/well).
X-faldig högre än LOQ
DMSO is the preferred solvent for this test method.
≥ 5-faldig
However, if there are reasons for using other solvents the scientific rationale should be described.
≥ 2,5-faldig
Cells are exposed to the test chemical by adding 1 μl of the appropriate stock solution in DMSO (see Appendix II to the validation report (4)) per 1 ml supplemented medium (well volume).
Exponeringsexperiment – inom plattans CV för SC (replikathål)
This results in a final concentration of 0,1 % DMSO in the wells.
Absoluta koncentrationer
To assure adequate mixing it is generally preferred that the appropriate stock solution of the test chemical in DMSO is mixed with supplemented medium to yield the desired final concentration for each dose, and the mixture added to each well immediately after removal of old medium.
Exponeringsexperiment – inom plattans CV för SC (replikathål)
If this option is used, the concentration of DMSO (0,1 %) should remain consistent among all wells.
X-faldig förändring
The wells containing the greatest two concentrations are visually assessed for formation of precipitates or cloudiness as an indication of incomplete solubility of the test chemical by using a stereo microscope.
Hormonmätsystem – känslighet
If such conditions (cloudiness, formation precipitates) are observed, wells containing the next lesser concentrations are examined as well (and so forth) and concentrations that did not completely go into solution are to be excluded from further evaluation and analysis.
Detekterbar X-faldig minskning i förhållande till SC
The plate is returned to the incubator at 37 °C under a 5 % CO2 in air atmosphere for 48 hours.
Hormonmätsystem – replikata mätningar CV för SC [29]
The test chemical plate layout is shown in Table 6.
Mediumextraktion – återvinning av intern 3H-standard (om tillämpligt)
Stocks 1 -7 show placement of increasing doses of test chemical.
≥ 65 % nominell
Table 6
DATAANALYS OCH RAPPORTERING
Dosing schematic for the exposure of H295R cells to test chemicals in a 24 well plate
Dataanalys
Stock 4
För att utvärdera den relativa ökningen/minskningen av en kemiskt förändrad hormonproduktion, bör resultaten normaliseras mot medelvärdet av SC-värdet för varje testplatta och resultaten bör uttryckas som förändringar i förhållande till SC för varje testplatta.
Stock 1
All data är ska uttryckas som medelvärde ± 1 standardavvikelse (SD).
Stock1
Endast hormondata från hål där cytotoxiciteten var mindre än 20 % bör ingå i dataanalysen.
Stock 5
Relativa förändringar bör beräknas på följande sätt: