natgillin/translations-raw huggingface dataset:
The enzyme in the steroidogenic pathway which converts androgenic chemicals into oestrogenic chemicals is aromatase (CYP19).
Cellerna sköljs tre gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS, utan Ca2+ Mg2+.) och släpps fria från odlingskolven genom tillsats av ett lämpligt lösgörande enzym, t.ex.trypsin i PBS (utan Ca2+ Mg2+.).
CYP19 converts T into 17β-oestradiol (E2) and androstenedione into oestrone.
Omedelbart efter att cellerna har lossats från odlingskolven bör enzymaktiviteten stoppas med tillsats av berikat medium med ett förhållande på 3 gånger den volym som använts vid enzymbehandlingen.
E2 and T are considered end-product hormones of the steroidogenic pathway.
Cellerna placeras i ett centrifugrör, centrifugeras vid rumstemperatur, supernatanten avlägsnas och pelleten av celler återsuspenderas i berikat medium.
The specificity of the lyase activity of CYP17 differs for the intermediate substrates among species.
Lämplig mängd av cellösningen placeras i den nya odlingskolven.
In the human, the enzyme favours substrates of the Δ5-hydroxysteroid pathway (pregnenolone), whereas substrates in the Δ4-ketosteroid pathway (progesterone) are favoured in the rat (19).
Mängden cellösning bör justeras så att cellerna är utväxta inom 5–7 dagar.
Such differences in the CYP17 lyase activity may explain some species-dependent differences in response to chemicals that alter steroidogenesis in vivo (6).
Det rekommenderade sub-odlingsförhållandet är 1:3 till 1:4.
The H295 cells have been shown to most closely reflect human adult adrenal enzyme expression and steroid production pattern (20), but are known to express enzymes for both the Δ5-hydroxysteroid and Δ4-ketosteroid pathways for androgen synthesis (7) (11) (13) (15).
Plattan ska märkas noga.
Steroidogenic pathway in H295R cells.
Cellerna är nu redo för att användas i testet och överskottet av celler bör frysas i flytande kväve, såsom beskrivs i punkt 20.
Enzymes are in italics, hormones are bolded and arrows indicate the direction of synthesis.
Frysning av H295R-celler (förberedning av celler för förvaring i flytande kväve)
Gray background indicates corticosteroid pathways/products.
För att förbereda H295R-celler för frysning, bör det ovan beskrivna förfarandet för att dela celler följas fram till steget för återsuspendering av pelleten av celler i botten av centrifugröret.
Sex steroid pathways/products are circled.
Här återsuspenderas pelleten av celler i frysmediet.
CYP = cytochrome P450;
Lösningen överförs till ett kryorör, märkt på lämpligt sätt, och fryses vid – 80 °C under 24 timmar, varefter kryoröret överförs till flytande kväve för lagring.
HSD = hydroxysteroid dehydrogenase;
Utstrykning och förinkubation av celler för testning
DHEA = dehydroepiandrosterone.
Antalet 24-hålsplattor, preparerade i enlighet med punkt 19, som kommer att behövas beror på hur många kemikalier som ska testas och cellernas konfluens i odlingsskålarna.
The human H295R adreno-carcinoma cell line is a useful in vitro model for the investigation of effects on steroid hormone synthesis (2) (7) (8) (9) (10).
Som en allmän regel, tillhandahåller en odlingskolv (75 cm2) med 80–90 % konfluenta celler tillräckligt många celler för 1–1,5 (24-håls) platta med en måldensitet på 200000 till 300000 celler per ml medium som leder till cirka 50–60 % konfluens i hålen efter 24 timmar (figur 2).
The H295R cell line expresses genes that encode for all the key enzymes for steroidogenesis noted above (11) (15) (Figure 1).
Detta är vanligtvis den optimala celldensiteten för hormonproduktion i testet.
This is a unique property because in vivo expression of these genes is tissue and developmental stage-specific with typically no one tissue or one developmental stage expressing all of the genes involved in steroidogenesis (2).
Vid högre densiteter förändras produktionsmönstret för T såväl som för E2.
Changes recorded by the test system in the form of alteration in the production of T and E2 can be the result of a multitude of different interactions of test chemicals with steroidogenic functions that are expressed by the H295R cells.
Obduktion P-djur
These include modulation of the expression, synthesis or function of enzymes involved in the production, transformation, or elimination of steroid hormones (12) (13) (14).
Före parning
Inhibition of hormone production can be due to direct competitive binding to an enzyme in the pathway, impact on co-factors such as NADPH (Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate) and cAMP (cyclic Adenosine Monophosphate), and/or increase in steroid metabolism or suppression of gene expression of certain enzymes in the steroidogenesis pathway.
Efter parning
While inhibition can be a function of both direct or indirect processes involved with hormone production, induction is typically of an indirect nature, such as by affecting co-factors such as NADPH and cAMP (as in the case of forskolin), decreasing steroid metabolism (13), and or up-regulating steroidogenic gene expression.
2 veckor
The H295R assay has several advantages:
6 veckor
It allows for the detection of both increases and decreases in the production of both T and E2;
Dräktighet
It does not require the use of animals;
Före avvänjning
The H295R cell line is commercially available.
Efter avvänjning
The principle limitations of the assay are as follows:
Föräldra-generation
Its metabolic capability is unknown but probably quite limited;
Kohort
therefore, chemicals that need to be metabolically activated will probably be missed in this assay.
Benämning
Being derived from adrenal tissue, the H295R possesses the enzymes capable of producing the gluco-, and mineral-corticoids as well as the sex hormones;
Djur/kohort
therefore, effects on the production of gluco-, and mineral corticoids could influence the levels of T and E2 observed in the assay.
Ungefärlig ålder vid obduktion (veckor)
It does not measure DHT and, therefore, would not be expected to detect chemicals that inhibit 5α-reductase in which case the Hershberger assay (16) can be used.
Målet är 20 kullar per grupp
The H295R assay will not detect chemicals that interfere with steroidogenesis by affecting the hypothalamic-pituitary-gonadal axis (HPG) axis as this can only be studied in intact animals.
Överskott
The purpose of the assay is the detection of chemicals that affect T and E2 production.
Reproduktiv
T is also an intermediate in the pathway to produce E2.
Neurotoxicitet
The assay can detect chemicals that typically inhibit or induce the enzymes of the steroidogenesis pathway.
Immunotoxicitet
The assay is usually performed under standard cell culture conditions in 24-well culture plates.
Reserver
Alternatively, other plate sizes can be used for conducting the assay;
14 eller 20–25 om detta utlöses
however, seeding and experimental conditions should be adjusted accordingly to maintain adherence to the performance criteria.
@ en per kull och representativt för 20 kullar totalt, om möjligt
After an acclimation period of 24 h in multi-well plates, cells are exposed for 48 h to seven concentrations of the test chemical in at least triplicate.
Mediet pipetteras från odlingskolven och cellerna sköljs 3 gånger med steril PBS (utan Ca2+Mg2+).
Solvent and a known inhibitor and inducer of hormone production are run at a fixed concentration as negative and positive controls.
En enzymlösning (i PBS) tillsätts för att lösgöra cellerna från odlingskolven.
At the end of the exposure period, the medium is removed from each well.
När det gått en lämplig tid för cellerna att lossna bör enzymverkan stoppas med tillsats av berikat medium med ett förhållande på 3 gånger den volym som används för enzymbehandlingen.
Cell viability in each well is analysed immediately after removal of medium.
Cellerna placeras i ett centrifugrör, centrifugeras vid rumstemperatur, supernatanten avlägsnas och pelleten av celler återsuspenderas i berikat medium.
Concentrations of hormones in the medium can be measured using a variety of methods including commercially available hormone measurement kits and/or instrumental techniques such as liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS).
Celldensiteten beräknas med t.ex. en hemocytometer eller cellräknare.
Data are expressed as fold change relative to the solvent control and the Lowest-Observed-Effect-Concentration (LOEC).
Cellösningen späds till önskad plattodlingsdensitet och blandas noggrant för att säkerställa en homogen celltäthet.
If the assay is negative, the highest concentration tested is reported as the No-Observed-Effect-Concentration (NOEC).
Cellerna sprids ut med 1 ml cellösning per hål och plattorna och hålen märks.
Conclusions regarding the ability of a chemical to affect steroidogenesis should be based on at least two independent test runs.
De ympade plattorna inkuberas vid 37 °C med 5 % CO2 i luftatmosfär under 24 timmar för att tillåta cellerna att fästa i hålen.
The first test run may function as a range finding run with subsequent adjustment of concentrations for runs 2 and 3, if applicable, if solubility or cytotoxicity problems are encountered or the activity of the chemical seems to be at the end of the range of concentrations tested.
KRAV PÅ KVALITETSKONTROLL
CULTURE PROCEDURE
Det är viktigt att exakta volymer av lösningar och prover fördelas i hålen vid doseringen eftersom dessa volymer bestämmer de koncentrationer som används vid beräkningarna av testresultaten.
Cell Line
Före inledning av cellodling och eventuell efterföljande testning, bör varje laboratorium visa känsligheten hos sitt hormonmätsystem (punkterna 29–31).
The NCI-H295R cells are commercially available from the American Type Culture Collections (ATCC) upon signing a Material Transfer Agreement (MTA) [14].
Om antikroppsbaserade hormonmätningstester ska användas bör testkemikalierna, innan testningen inleds, analyseras för sin potential att störa det mätsystem som används för att kvantifiera T och E2 enligt beskrivningen i punkt 32.
Introduction
DMSO är det rekommenderade lösningsmedlet för testet.
Due to changes in the E2 producing capacity of the cells with increasing age/passages (2), cells should be cultured following a specific protocol before they are used and the number of passages since the cells were defrosted as well as the passage number at which the cells were frozen and placed in liquid nitrogen storage should be noted.
Om ett alternativt lösningsmedel används, ska följande fastställas:
The first number indicates the actual cell passage number and the second number describes the passage number at which the cells were frozen and placed in storage.
Lösligheten av testkemikalien, forskolin och prokloraz i lösningsmedlet samt
For example, cells that were frozen after passage five and defrosted and then were split three times (4 passages counting the freshly thawed cells as passage 1) after they were cultured again would be labelled passage 4.5.
Det rekommenderas att den maximalt tillåtna koncentrationen lösningsmedel inte bör överskrida 10 gånger spädningen av den minst cytotoxiska koncentrationen av lösningsmedlet.
An example of a numbering scheme is illustrated in Appendix I to the validation report (4).
Innan testet genomförs för första gången, bör laboratoriet genomföra ett kvalificerande experiment som visar att laboratoriet kan bibehålla och uppnå lämpliga betingelser för cellodling och försök som krävs för kemisk provning enligt punkterna 33–35.
Stock medium is used as the base for the supplemented and freezing mediums.
Vid inledning av testning med ett nytt parti, bör en kontrollodlingsplatta köras innan man använder en ny sats celler för att utvärdera prestandan hos de celler som beskrivs i punkterna 36 och 37.
Supplemented medium is a necessary component for culturing cells.
Prestandan hos hormonmätsystemet
Freezing medium is specifically designed to allow for impact-free freezing of cells for long-term storage.
Metodens känslighet, noggrannhet, precision och korsreaktivitet med provmatris
Prior to use, Nu-serum (or a comparable serum of equal properties that has been demonstrated to produce data that meets the test performance and Quality Control (QC) requirements), which is a constituent of supplemented media, should be analysed for background T and E2 concentrations.
Varje laboratorium kan själva välja ett hormonmätsystem för analysen av produktionen av T och E2 med H295R-celler så länge det uppfyller prestandakriterierna, inklusive kvantifieringsgränsen (LOQ).
The preparation of these solutions is described in Appendix II to the validation report (4).
Nominellt är dessa 100 pg/ml för T och 10 pg/ml för E2, vilket grundas på de basala hormonnivåer som observerats i valideringsstudierna.
After initiation of an H295R cell culture from an original ATCC batch, cells should be grown for five passages (i.e.the cells are split 4 times).
Emellertid kan högre eller lägre nivåer vara lämpliga beroende på de basala hormonnivåer som uppnåtts i det utförande laboratoriet.
Passage five cells are then frozen in liquid nitrogen for storage.
Innan starten av QC-platta och provomgångar bör laboratoriet visa att hormontestet som ska användas kan mäta hormonhalter i berikat medium med tillräcklig noggrannhet och precision för att uppfylla de QC-kriterier som anges i tabellerna 1 och 5, genom att analysera berikat medium som spikats med en intern hormonkontroll.
Prior to freezing the cells, a sample of the previous passage four cells is run in a QC plate (See paragraph 36 and 37) to verify whether the basal production of hormones and the response to positive control chemicals meet the assay quality control criteria as defined in Table 5.
Berikat medium bör spikas med minst tre koncentrationer av varje hormon (t.ex.100, 500 och 2500 pg/ml T; 10, 50 och 250 pg/ml av E2, eller de lägsta möjliga koncentrationerna baserade på detektionsgränserna för det valda hormonmätsystemet kan användas för de lägsta spikkoncentrationerna av T och E2) och analyseras.
H295R cells need to be cultured, frozen and stored in liquid nitrogen to make sure that there are always cells of the appropriate passage/age available for culture and use.
Uppmätta hormonkoncentrationer för icke-extraherade prover ska ligga inom 30 % av de nominella koncentrationerna, och variationen mellan upprepade mätningar av samma prov bör inte överstiga 25 % (se även tabell 8 för ytterligare QC-kriterier).
The maximum number of passages after taking a new [15] or frozen [16] batch of cells into culture that is acceptable for use in the H295R assay should not exceed 10.
Om dessa QC-kriterier uppfylls antas det att den valda hormonmätningstestet är tillräckligt noggrann och exakt och inte korsreagerar med komponenter i mediet (provmatrisen) så att en betydande påverkan på testresultatet kan förväntas.
For example, acceptable passages for cultures of cells from a batch frozen at passage 5 would be 4.5 through 10.5.
I detta fall krävs ingen extraktion av proverna före hormonmätningarna.
For cells started from these frozen batches, the procedure described in paragraph 19 should be followed.
I fall QC-kriterierna i tabell 1 och 8 inte uppfylls, kan en betydande matriseffekt förekomma och ett experiment med extraherat spikat medium bör genomföras.
These cells should be cultured for at least four (4) additional passages (passage 4.5) prior to their use in testing.Starting Cells from the Frozen Stock
Ett exempel på ett extraktionsförfarande beskrivs i tillägg II till valideringsrapporten (se hänvisning 4).
The procedure for starting the cells from frozen stock is to be used when a new batch of cells is removed from liquid nitrogen storage for the purpose of culture and testing.
Mätningar av hormonkoncentrationer i de extraherade proverna bör göras med tre replikat [17].
Details for this procedure are set forth in Appendix III to the validation report (4).
Om man efter extraktionen kan påvisa att komponenterna i mediet inte stör hormondetekteringsmetoden såsom definieras av QC-kriterierna, bör alla ytterligare försök utföras med de extraherade proverna.
Cells are removed from liquid nitrogen storage, thawed rapidly, placed in supplemented medium in a centrifuge tube, centrifuged at room temperature, re-suspended in supplemented medium, and transferred to a culture flask.
Om QC-kriterierna inte kan uppfyllas efter extraktionen, är det använda hormonmätsystemet inte lämpligt för H295R-steroidogenestestet, och en alternativ hormondetekteringsmetod bör användas.Standardkurva
The medium should be changed the following day.
Hormonkoncentrationerna i lösningskontrollerna (SC) bör ligga inom den linjära delen av standardkurvan.
The H295R cells are cultivated in an incubator at 37 °C with 5 % CO2 in air atmosphere and the medium is renewed 2-3 times per week.
Företrädesvis bör SC-värdena ligga nära mitten av den linjära delen för att säkerställa att induktion och inhibering av hormonsyntesen kan mätas.
When the cells are approximately 85-90 % confluent, they should be split.
Utspädningar av medium (eller extrakt) som ska mätas ska väljas i enlighet därmed.
Splitting of the cells is necessary to ensure the health and growth of the cells and to maintain cells for performing bioassays.
Det linjära förhållandet ska bestämmas med en lämplig statistisk metod.
The cells are rinsed three times with phosphate-buffered saline (PBS, without Ca2+ Mg2+.) and freed from the culture flask by the addition of an appropriate detachment enzyme, e.g. trypsin, in PBS (without Ca2+ Mg2+).
Kemiskt interferenstest
Immediately after the cells detach from the culture flask, the enzyme action should be stopped with the addition of supplemented medium at a ratio of 3× the volume used for the enzyme treatment.
Om antikroppsbaserade analyser såsom enzymkopplade immunadsorberande analyser (Elisa) och radioimmunanalyser (RIA) ska användas för att mäta hormoner, bör varje kemikalie testas för potentiell störning av det hormonmätsystem som ska användas före starten av den faktiska kemikalietestningen (tillägg III till valideringsrapporten [se hänvisning 4]), eftersom vissa kemikalier kan störa dessa tester (se hänvisning 17).
Cells are placed into a centrifuge tube, centrifuged at room temperature, the supernatant is removed and the pellet of cells is re-suspended in supplemented medium.
Om störningar inträffar som är ≥ 20 % av den basala hormonproduktionen av T och/eller E2 som bestämts genom hormonanalys, bör Chemical Hormone Assay Interference-testet (som beskrivs i tillägg III till valideringsrapporten [se hänvisning 4] avsnitt 5.0) utföras för alla utspädningar av testkemikaliestamlösning för att identifiera den tröskeldos vid vilken betydande (≥ 20 %) interferens uppträder.
The appropriate amount of cell solution is placed in the new culture flask.
Om interferensen är mindre än 30 % kan resultaten korrigeras avseende interferens.
The amount of cell solution should be adjusted so that the cells are confluent within 5-7 days.
Om interferensen överstiger 30 % är data ogiltiga och ska kasseras vid dessa koncentrationer.
The recommended sub-cultivation ratio is 1:3 to 1:4.
Om betydande interferens av en testkemikalie med ett hormonmätsystem uppträder vid mer än en icke-cytotoxisk koncentration, bör ett annat hormonmätsystem användas.
The plate should be carefully labelled.
För att undvika störningar från förorenande kemikalier rekommenderas att hormoner extraheras från mediet med hjälp av ett lämpligt lösningsmedel, möjliga metoder finns i valideringsrapporten (se hänvisning 4).
The cells are now ready to be used in the assay and excess cells should be frozen in liquid nitrogen as described in paragraph 20.
Prestandakriterier för hormonmätsystem
Freezing H295R Cells (preparing cells for liquid nitrogen storage)
Kriterium
To prepare H295R cells for freezing, the procedure described above for splitting cells should be followed until the step for re-suspending the pellet of cells in the bottom of the centrifuge tube.
Mätmetodens känslighet
Here, the pellet of cells is re-suspended in freezing medium.
Kvantifieringsgränsen (LOQ)
The solution is transferred to a cryogenic vial, labelled appropriately, and frozen at – 80 °C for 24 hours after which the cryogenic vial is transferred to liquid nitrogen for storage.
Hormonextraktionseffektivitet (endast när extraktion behövs)
Plating and Pre-incubation of Cells for Testing
De genomsnittliga återvinningsnivåerna (baserat på mätning i tre replikat) för de spikade mängderna av hormon bör inte avvika mer än 30 % från den mängd som tillsatts
The number of 24-well plates, prepared as outlined in paragraph 19, that will be needed depends on the number of chemicals to be tested and the confluency of the cells in the culture dishes.
Kemisk interferens (endast antikroppsbaserade system)
As a general rule, one culture flask (75 cm2) of 80-90 % confluent cells will supply sufficient cells for one to 1,5 (24-well) plates at a target density of 200000 to 300000 cells per ml of medium resulting in approximately 50-60 % confluency in the wells at 24 hours (Figure 2).
Ingen betydande (≥ 30 % av basal hormonproduktion av respektive hormon) korsreaktivitet med någon av de hormoner som produceras av cellerna ska inträffa [19] [20]
This is typically the optimal cell density for hormone production in the assay.
Kvalifikationsprövning av laboratorium
At higher densities, T as well as E2 production patterns are altered.
Före testning av okända kemikalier bör ett laboratorium visa att det kan uppnå och bibehålla de lämpliga cellodlings- och testbetingelser som krävs för ett framgångsrikt genomförande av testet, genom en kvalifikationsprövning av laboratoriet.
Before conducting the assay the first time, it is recommended that different seeding densities between 200000 and 300000 cells per ml be tested, and the density resulting in 50-60 % confluency in the well at 24 hours be selected for further experiments.
Eftersom resultatet av ett test är direkt kopplat till den laboratoriepersonal som utför testet bör dessa förfaranden delvis upprepas om en förändring av laboratoriepersonal sker.
Photomicrograph of H295R cells at a seeding density of 50 % in a 24 well culture plate at 24 hours taken at the edge (A) and centre (B) of a well
Kvalifikationsprövningen ska genomföras med samma förutsättningar som anges i punkterna 38 till 40 genom att exponera celler för 7 ökande koncentrationer av starka, måttliga och svaga inducerare och hämmare samt en negativ kemikalie (se tabell 2).
Necropsy P animals
Separata plattor odlas för alla kemikalier med användning av det format som visas i tabell 6.
Pre-mating
En QC-platta (tabell 4, punkterna 36–37) bör inkluderas vid varje daglig odling av kvalifikationskemikalierna.
Post-mating
Kvalifikationskemikalier och exponeringskoncentrationer
2 weeks
Kvalifikationskemikalie
6 weeks
Testkoncentrationer [μM]
Pregnancy
Prokloraz
Pre-weaning
Bisfenol A
Post-weaning
Exponering av H295R för kvalifikationskemikalier bör utföras på 24-håls odlingsplattor vid laboratoriets kvalifikationsprövning.
Parental generation
Doseringen är i μM för samtliga testkemikaliedoser.
Cohort
Doserna ska administreras i DMSO med 0,1 % v/v per hål.
Designation
Alla testkoncentrationer bör testas i tre hål (tabell 6).
Animals/cohort
Separata plattor odlas för varje kemikalie.
Approximate age at necropsy (weeks)
En QC-platta inkluderas för varje daglig omgång.
Target is 20 litters per group
Cellviabilitets- och hormonanalys genomförs i enlighet med punkterna 42 till 46.
Surplus
Tröskelvärdet (lägsta koncentration med observerad effekt, LOEC) och klassificeringsbeslut bör redovisas och jämföras med värdena i tabell 3.
Reproductive
Uppgifterna anses godtagbara om de uppfyller LOEC och klassificeringsbeslut i tabell 3.
Neurotoxicity
Tröskelvärden (LOEC) och klassificeringsbeslut avseende kvalifikationskemikalier
Immunotoxicity
inte tillämpligt:
Spares
inte tillämpligt eftersom inga ändringar inträffar efter exponering av icke-cytotoxiska koncentrationer för negativ kontroll.
20 M + 20 F
CAS-nr
10 M + 10 F @
Klassificeringsbeslut
14 or 20-25 if triggered
+ (induktion)
@ one per litter and representative of 20 litters in total where possible
inte tillämpligt
An enzyme solution (in PBS) is added to detach the cells from the culture flask.
Kvalitetskontrollplatta