natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Note: If inhibition of enrichment of R. solanacearum is anticipated, due to high populations of certain competing saprophytic bacteria, enrichment of sample extracts before any centrifugation or other concentration steps may give better results.
Anmärkning: Om anrikningen av R. solanacearum förväntas inhiberas på grund av stora populationer av vissa konkurrerande saprofytiska bakterier, kan anrikning av provextrakten före centrifugering eller andra koncentrationssteg ge bättre resultat.
IF Test
IF-test
The use of the IF test as the principal screening test is recommended because of its proven robustness to achieve the required thresholds.
Det rekommenderas att IF-test används som huvudsakligt screeningtest på grund av dess dokumenterade förmåga att uppnå de föreskrivna tröskelvärdena.
When the IF test is used as the principal screening test and the IF reading is positive, the Isolation, PCR or FISH test must be performed as a second screening test.
Om IF-testet används som huvudsakligt screeningtest och resultatet är positivt, skall ett andra screeningtest med isolerings-, PCR- eller FISH-test göras.
Note: Use a validated source of antibodies to R. solanacearum (see web site http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Anmärkning: Använd antikroppar mot R. solanacearum med validerat ursprung (se webbplats: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
The titre is defined as the highest dilution at which optimum reaction occurs when testing a suspension containing 105 to 106 cells per ml of the homologous strain of R. solanacearum and using an appropriate fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugate according to the manufacturer’s recommendations.
Titern definieras som den högsta utspädning vid vilken en optimal reaktion sker när en suspension av 105–106 celler per ml av den homologa stammen av R. solanacearum testas och när en lämplig fluoresceinisothiocyanat (FITC) konjugat i överensstämmelse med tillverkarens rekommendationer används.
Validated polyclonal antisera all had an IF titre of at least 1:2000.
Validerade polyklonala antiserum bör ha en IF-titer av minst 1:2000.
During testing, the antibodies should be used at a working dilution(s) close to or at the titre.
Vid testningen bör antikropparna användas vid en arbetsutspädning (arbetsutspädningar) nära eller vid titern.
Glycerol can be removed from the sample by addition of 1 ml pellet buffer (Appendix 4), re-centrifugation for 15 minutes at 7000 g and re-suspension in an equal volume of pellet buffer.
Glycerolen kan avlägsnas från provet genom tillsats av 1 ml pelletbuffert (tillägg 4), omcentrifugering under 15 minuter vid 7000 g och återsuspension i en lika stor volym av pelletbuffert.
This is often not necessary, especially if samples are fixed to the slides by flaming.
Detta krävs vanligtvis inte, särskilt inte om glasproverna har fixerats på glasen med flambering.
Prepare separate positive control slides of the homologous strain or any other reference strain of R. solanacearum, suspended in potato extract, as specified in Appendix 3 B, and optionally in buffer.
Bered separata positiva kontrollglas av den homologa stammen eller någon annan referensstam av R. solanacearum, som suspenderats i potatisextrakt, alternativt i en buffert, såsom anges i tillägg 3 B.
Naturally infected tissue (maintained by lyophilisation or freezing at –16 to –24 °C) should be used where possible as a similar control on the same slide.
Naturligt infekterad vävnad (som har bevarats genom frystorkning eller nedfrysning vid en temperatur av –16 till –24 °C) bör om möjligt användas som en liknande kontroll på samma glas.
As negative controls, aliquots of sample extract which previously tested negative for R. solanacearum can be used.
Som negativa kontroller kan användas portioner av provextrakt som tidigare givit negativt svar beträffande R. solanacearum när de testats.
Standardised positive and negative control materials available for use with this test are listed in Appendix 3.
Standardiserade positiva och negativa kontrollmaterial som kan användas i detta test förtecknas i tillägg 3.
Prepare the test slides by one of the following procedures:
Preparera testglas enligt någon av följande metoder
Pipette a measured standard volume (15 µl is appropriate for 6 mm window diameter – scale up volume for larger windows) of a 1/100 dilution of the resuspended potato pellet onto the first window.
Pipettera på det första glaset en uppmätt standardvolym (15 µl är lämpligt för 6 mm fönsterdiameter – öka volymen för större fönster) av en 1/100-utspädning av den återsuspenderade potatispelleten.
Prepare decimal dilutions (1/10, 1/100) of the resuspended pellet in pellet buffer.
Preparera decimala utspädningar (1/10, 1/100) av den återsuspenderade pelleten i pelletbuffert.
Pipette a measured standard volume (15 µl is appropriate for 6 mm window diameter – scale up volume for larger windows) of the resuspended pellet and each dilution on a row of windows.
Pipettera en uppmätt standardvolym (15 µl är lämpligt för 6 mm fönsterdiameter – öka volymen för större fönster) av den återsuspenderade pelleten och varje utspädning på en fönsterrad.
Dry the droplets at ambient temperature or by warming to temperatures of 40 to 45 °C.
Torka dropparna i omgivande temperatur eller genom uppvärmning till en temperatur av 40–45 °C.
If necessary, fixed slides may then be stored frozen in a desiccated box for as little time as necessary (up to a maximum of three months) prior to further testing.
Vid behov får fixerade glas lagras frysta i en torkad låda under så kort tid som möjligt (maximalt 3 månader) innan vidare testning sker.
IF procedure
IF-förfarande
According to test slide preparation in 5.1(i):
Enligt testglaspreparering i 5,1 (i): Preparera en serie dubbla utspädningar.
Prepare a set of twofold dilutions The first well should have 1/2 of the titre (T/2), the others 1/4 of the titre (T/4), 1/2 of the titre (T/2), the titre (T) and twice the titre (2T).
Den första brunnen bör ha 1/2 av titern (T/2), de övriga 1/4 av titern (T/4), 1/2 av titern (T/2), titern (T) och två gånger titern (2T).
According to test slide preparation in 5.1(ii):
Enligt testglaspreparering i 5,1 ii:
Preparation of the test slide according to 5.1(i) and 5.3(i)
Preparering av testglaset enligt 5.1 i och 5.3 i.
Arrange the slides on moist tissue paper.
Ordna glasen på fuktigt mjukpapper.
Wash by submerging for five minutes in IF buffer-Tween (Appendix 4) and subsequently in IF buffer.
Tvätta genom att under 5 minuter sänka ned i IF-buffert-Tween (tillägg 4) och därefter i IF-buffert.
Rinse and wash as before (5.3.3).
Skölj och tvätta som ovan (5.3.3).
Pipette 5 - 10 µl of 0,1M phosphate-buffered glycerol (Appendix 4) or a commercially antifading mountant on each window and apply a coverslip.
Pipettera 5–10 µl 0,1 M fosfatbuffrad glycerol (tillägg 4) eller en monteringslösning som motverkar blekning som finns tillgänglig i handeln på varje fönster och lägg på ett täckglas.
Reading the IF test:
Avläsning av IF-testet
Examine test slides on an epifluorescence microscope with filters suitable for excitation of FITC, under oil or water immersion at a magnification of 500-1000.
Undersök testglasen i ett epifluorescensmikroskop med filter lämpliga för FITC under olje- eller vattenimmersion vid 500–1000 gångers förstoring.
The IF test (Section VI.A.5.) must be repeated if the staining is aberrant.
IF-testet (avsnitt VI.A.5.) skall återupprepas om färgningen är avvikande.
Observe for bright fluorescing cells with characteristic morphology of R. solanacearum in the test windows of the test slides (see website http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Sök efter ljusa fluorescerande celler med morfologi som är karakteristisk för R. solanacearum i testfönstren på testglasen (se webbplats: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
The fluorescence intensity must be equivalent to the positive control strain at the same antibody dilution.
Fluorescensintensiteten måste motsvara det positiva kontrollisolatets vid samma antikropputspädning.
If any contamination is suspected the test must be repeated.
Om nedsmittning misstänks skall testet upprepas.
This may be the case when all slides in a batch show positive cells due to the contamination of buffer or if positive cells are found (outside of the slide windows) on the slide coating.
Detta kan vara fallet om alla glas i ett parti uppvisar positiva celler på grund av nedsmittning av en buffert eller om positiva celler påträffas (utanför glasets fönster) på objektglasöverdraget.
Background populations of fluorescing cells with atypical morphology and cross reacting saprophytic bacteria with size and morphology similar to R. solanacearum are likely to occur in potato heel end core and stem segment pellets.
Bestånd av fluorescerande celler med atypisk morfologi och korsreagerande saprofytiska bakterier som har en liknande storlek och morfologi som R. solanacearum kan förekomma hos potatisar i naveländarna och i pelletar av stjälksegmentet.
Consider only fluorescing cells with typical size and morphology at the titre or working dilution of the antibodies as in 5.3.
Endast fluorescerande celler med typisk storlek och morfologi vid titern eller vid arbetsutspädningen av antikropparna skall beaktas, såsom i 5,3.
If bright fluorescing cells with characteristic morphology are found, estimate the average number of typical cells per microscope field and calculate the number of typical cells per ml of resuspended pellet (Appendix 5).
För varje prov med ljusa fluorescerande celler med karakteristisk morfologi, bestäm medeltalet typiska celler per mikroskopfält och beräkna antal typiska celler per ml återsuspenderad pellet (tillägg 5).
The sample is considered potentially contaminated and further testing is required.
Provet betraktas som potentiellt smittat, och ytterligare tester krävs.
The IF reading is negative for samples with less than 5 × 103 cells per ml of resuspended pellet and the sample is considered negative.
IF-testet är negativt om proven innehåller färre än 5 × 103 celler per ml återsuspenderad pellet och provet betraktas som negativt.
When the PCR test is used as the principal screening test and found to be positive, isolation or IF must be performed as a second compulsory screening test.
Om ett PCR-test används som huvudsakligt screeningtest och resultatet är positivt, skall ett andra screeningtest i form av ett isoleringstest eller IF-test göras.
When PCR is used as the second screening test and found to be positive, further testing according to the flow scheme is required to complete the diagnosis.
Om PCR används som andra screeningtest och resultatet är positivt, krävs ytterligare testning enligt flödesschemat för att diagnosen skall bli fullständig.
Note: Preliminary testing with this method should permit reproducible detection of 103 to 104 cells of R. solanacearum per ml added to sample extracts which previously tested negative.
Anmärkning: Preliminär testning med denna metod bör möjliggöra reproducerbar upptäckt av 103–104 celler av R. solanacearum per ml som tillsätts till provextrakt som tidigare testats och gett negativt svar.
Negative controls (for DNA extraction and PCR procedures) should always be handled as final samples in the procedure, to make evident whether any carry over of DNA has occurred.
Negativa kontroller (för DNA-extraktions- och PCR-förfaranden) bör alltid behandlas som slutligt prov i förfarandet för att tydligt kunna visa om överföring till mål-DNA har inträffat eller ej.
Sample extract that previously tested negative for R. solanacearum,
Provextrakt som tidigare gett negativt svar när det testats med avseende på R. solanacearum.
Buffer controls used for extracting the bacterium and the DNA from the sample,
Buffertkontroller som används för extrahering av bakterien och DNA från provet.
PCR-reaction mix.
PCR-reaktionsblandning.
Aliquots of resuspended pellets to which R. solanacearum has been added (preparation see Appendix 3 B).
Portioner av återsuspenderad pellet till vilka R. solanacearum har tillsatts (information om preparering finns i tillägg 3 B).
A suspension of 106 cells per ml of R. solanacearum in water from a virulent isolate (e.g. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; see Appendix 3 B).
En suspension av 106 celler per ml av R. solanacearum i vatten från ett virulent isolat (t.ex. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; se tillägg 3 B).
If possible use also DNA extracted from positive control samples in the PCR test.
Om möjligt använd dessutom DNA från positiva kontrollprover från PCR-tester.
To avoid potential contamination prepare positive controls in a separate environment from samples to be tested.
För att undvika risk för nedsmittning, preparera positiva kontroller i en separat omgivning från de prover som skall testas.
It could therefore, in certain cases, be advisible to prepare extracts from washed potatoes if PCR protocols are to be used.
Om PCR-protokoll skall användas kan det därför i vissa fall vara tillrådligt att preparera extraheringar från tvättade potatisar.
Standardized positive and negative control material available for use with this test are listed in Appendix 3).
Standardiserade positiva och negativa kontrollmaterial som kan användas i detta test förtecknas i tillägg 3.
Use positive and negative control samples as described above (see Appendix 3).
Använd positiva och negativa kontrollprover såsom beskrivs ovan (se tillägg 3).
The following method has been optimised for use with the validated PCR methods shown in Appendix 6.
Följande metod har optimerats för att användas tillsammans med den validerade PCR-metod som visas i tillägg 6.
Add 100 µl sample extract and place in a heating block or water bath at 95 °C for 10 min.
Tillsätt 100 µl provextrakt och placera i värmeblock eller vattenbad vid 95 °C under 10 minuter.
Put tube on ice for 5 min.
Ställ röret på kylning under 5 minuter.
Add 80 µl Lysozyme stock solution (50 mg Lysozyme per ml in 10 mM Tris HCl, pH 8,0) and incubate at 37 °C for 30 min.
Tillsätt 80 µl Lysozym stocklösning (50 mg lysozym per ml i 10 mM Tris HCl, pH 8,0) och inkubera vid 37 °C under 30 minuter.
Add 220 µl of Easy DNA® solution A (Invitrogen), mix well by vortexing and incubate at 65 °C for 30 min.
Tillsätt 220 µl Easy DNA® lösning A (Invitrogen), blanda väl genom skakning och inkubera vid 65 °C under 30 minuter.
Add 100 µl of Easy DNA® solution B (Invitrogen), vortex vigorously until the precipitate runs freely in the tube and the sample is uniformly viscous.
Tillsätt 100 µl Easy DNA® lösning B (Invitrogen), skaka kraftigt till fällningen svävar fritt i röret och provet är jämnt trögflytande.
Add 500 µl of chloroform and vortex until the viscosity decreases and the mixture is homogeneous.
Tillsätt 500 µl chloroform och skaka till viskositeten ökar och blandningen är homogen.
Centrifuge at 15000 g for 20 min at 4 °C to separate phases and form the interphase.
Centrifugera vid 15000 g under 20 minuter vid 4 °C för att separera faserna och bilda interfasen.
Add 1 ml of 100 % ethanol (–20 °C) vortex briefly and incubate on ice for 10 min.
Tillsätt 1 ml 100-procentig etanol (–20 °C), skaka snabbt och inkubera under nedkylning under 10 minuter.
Centrifuge at 15000 g for 20 min at 4 °C and remove ethanol from pellet.
Centrifugera vid 15000 g under 20 minuter vid 4 °C och avlägsna etanolen från pelleten.
Centrifuge at 15000 g for 10 min at 4 °C, save the pellet and remove ethanol.
Centrifugera vid 15000 g under 10 minuter vid 4 °C, spara pelleten och avlägsna etanolen.
Allow the pellet to dry in air or in a DNA speed vac.
Låt pelleten lufttorka eller torka i DNA speed vac.
Other DNA extraction methods, e.g. Qiagen DNeasy Plant Kit, could be applied providing that they are proven to be equally as effective in purifying DNA from control samples containing 103 to 104 pathogen cells per ml.
Andra metoder för extraktion av DNA, t.ex. Qiagen DNeasy Plant Kit, skulle kunna användas, förutsatt att det är belagt att de har lika stor inverkan när det gäller att rena DNA från kontrollprover innehållande 103–104 patogena celler per ml.
Prepare test and control templates for PCR according to the validated protocols (Section VI.A.6.).
Preparera test- och kontrollmallar för PCR enligt de validerade protokollen (avsnitt VI.A.6.).
Prepare the appropriate PCR reaction mix in a contamination-free environment according to the published protocols (Appendix 6).
Preparera lämplig PCR-reaktionsblandning i en omgivning fri från smitta enligt de offentliggjorda protokollen (tillägg 6).
Where possible, it is recommended to use a multiplex PCR protocol that also incorporates an internal PCR control.
Användning av multiplexa PCR-protokoll som även omfattar en intern PCR-kontroll rekommenderas där så är möjligt.
Add 2-5 µl of DNA extract per 25 µl PCR reaction in sterile PCR tubes according to the PCR protocols, (see Appendix 6).
Tillsätt 2–5 µl DNA-extrakt per 25 µl PCR-reaktion i sterila PCR-rör enligt PCR-protokollen (se tillägg 6).
Resolve PCR amplicons by agarose gel electrophoresis.
Lös PCR-kopior med agarosgelelektrofores.
Run at least 12 µl of amplified DNA reaction mixture from each sample mixed with 3 µl loading buffer (Appendix 6) in 2,0 % (w/v) agarose gels in tris-acetate-EDTA (TAE) buffer (Appendix 6) at 5 to 8 V per cm.
Använd minst 12 µl av amplifierad DNA-reaktionsblandning från varje prov blandat med 3 µl laddningsbuffert (tillägg 6) i 2,0 % (w/v) agarosgel i tris-acetat-EDTA (TAE) buffert (tillägg 6) vid 5–8 V per cm.
Reveal DNA bands by staining in ethidium bromide (0,5 mg per L) for 30 to 60 minutes taking appropriate precautions for handling this mutagen.
Påvisa DNA-band genom att färga i ethidiumbromid (0,5 mg/l) under 30–60 minuter, varvid lämpliga försiktighetsåtgärder bör vidtas vid hanteringen av denna mutagen.
Observe stained gel under short wave UV transillumination (λ = 302 nm) for amplified PCR products of the expected size (Appendix 6) and document.
Observera det färgade gelet i kortvågs-UV-genomlysning (λ = 302 nm) och sök efter amplifierade PCR-produkter av förväntad storlek (tillägg 6) och dokumentera.
For all new findings/cases verify authenticity of the PCR amplicon by performing restriction enzyme analysis on a sample of the remaining amplified DNA by incubating at the optimum temperature and time with an appropriate enzyme and buffer (see Appendix 6).
För varje ny upptäckt/nytt fall verifiera autenticiteten hos PCR-kopian genom att utföra restriktionsenzymanalys på ett prov av det återstående amplifierade DNA genom inkubation vid optimal temperatur och under optimal tid med en lämplig enzym och buffert (se tillägg 6).
The PCR test is negative if the R. solanacearum-specific PCR amplicon of expected size is not detected for the sample in question but is detected for all positive control samples (in case of multiplex PCR with plant specific internal control primers: a second PCR-product of expected size must be amplified with the sample in question).
PCR-testet är negativt om det R. solanacearum-specifika PCR-kopian av den förväntade storleken inte upptäcks i provet, men upptäcks i alla positiva kontrollprover (i fallet multiplex-PCR med plantspecifika interna kontrollprimrar måste en andra PCR-produkt av förväntad storlek amplifieras med provet i fråga).
The PCR test is positive if the R. solanacearum-specific PCR amplicon of expected size and restriction pattern (when required) is detected, providing that it is not amplified from any of the negative control samples.
PCR-testet är positivt om det R. solanacearum-specifika PCR-kopian av den förväntade storleken och det förväntade restriktionsmönstret (vid behov) upptäcks, förutsatt att det inte amplifierats från någon av de negativa kontrollproven.
Reliable confirmation of a positive result can also be obtained by repeating the test with a second set of PCR primers (Appendix 6).
Tillförlitlig bekräftelse av ett positivt resultat kan även erhållas genom att testet upprepas med en andra uppsättning PCR-primrar (tillägg 6).
Note: Inhibition of the PCR may be suspected if the expected amplicon is obtained from the positive control sample containing R. solanacearum in water but negative results are obtained from positive controls with R. solanacearum in potato extract.
Anmärkning: Inhibering av PCR kan misstänkas om den förväntade kopian erhålls från det positiva kontrollprovet innehållande R. solanacearum i vatten men negativa resultat erhålls från positiva kontroller med R. solanacearum i potatisextrakt.
In multiplex PCR protocols with internal PCR controls, inhibition of the reaction is indicated when neither of the two amplicons are obtained.
I multiplexa PCR-protokoll med interna PCR-kontroller anges inhibering av reaktionen när inget av de båda kopiorna erhålls.
Contamination may be suspected if the expected amplicon is obtained from one or more of the negative controls.
Nedsmittning kan misstänkas om den förväntade kopian erhålls från en eller flera av de negativa kontrollerna.
When the FISH test is used as the first screening test and found to be positive, Isolation or the IF test must be performed as a second compulsory screening test.
Om FISH-testet används som första screeningtest och resultatet är positivt, skall ett andra screeningtest i form av isoleringstest eller IF-test göras.
Note: Use validated R. solanacearum-specific oligo-probes (see Appendix 7).
Anmärkning: Använd validerade R. solanacearum-specifika oligo-prober (se tillägg 7).
Preliminary testing with this method should permit reproducible detection of at least 103 to 104 cells of R. solanacearum per ml added to sample extracts which previously tested negative.
Preliminär testning med denna metod bör möjliggöra reproducerbar upptäckt av minst 103–104 celler av R. solanacearum per ml som tillsätts till provextrakt som tidigare testats och gett negativt svar.
The following procedure should preferably be performed on freshly prepared sample extract but can also be successfully performed on sample extract that has been stored under glycerol at –16 to –24 or –68 to –86 °C.
Följande förfarande bör helst tillämpas på nypreparerade provextrakt men kan även tillämpas på provextrakt som lagrats i glycerol vid en temperatur av –16 till –24 °C eller –68 till –86 °C.
As negative controls, use aliquots of sample extract that previously tested negative for R. solanacearum.
Som negativa kontroller använd portioner av provextrakt som tidigare givit negativt svar när de testats avseende R. solanacearum.
As positive controls prepare suspensions containing 105 to 106 cells per ml of R. solanacearum biovar 2 (e.g. strain NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, see Appendix 3) in 0,01M phosphate buffer (PB) from a 3 to 5 day culture).
Som positiva kontroller preparera suspensioner innehållande 105–106 celler per ml av R. solanacearum biovar 2 (dvs. stam NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, se tillägg 3) i 0,01 M fosfatbuffert från en 3–5 dagar gammal kultur. Bered separata positiva kontrollglas av den homologa stammen eller någon annan referensstam av R. solanacearum, som suspenderats i potatisextrakt, såsom anges i tillägg 3 B. Användningen av FITC-märkt eubakteriell oligo-prob fungerar som en kontroll av hybridiseringsprocessen, eftersom den färgar alla eubakterier som finns i provet.
Prepare separate positive control slides of the homologous strain or any other reference strain of R. solanacearum, suspended in potato extract, as specified in Appendix 3 B. The use of the FITC-labelled eubacterial oligo-probe offers a control for the hybridisation process, since it will stain all eubacteria that are present in the sample.
Standardiserade positiva och negativa kontrollmaterial som kan användas i detta test förtecknas i tillägg 3 punkt A.
Standardized positive and negative control material available for use with this test are listed in Appendix 3A). Test control material in an identical manner as the sample(s).
Testa kontrollmaterialen exakt som provet (proverna).
The following protocol is based upon Wullings et al.
Följande protokoll utgår ifrån Wullings et al.
Pipette 100 µl of each sample extract into an Eppendorf tube and centrifuge for 7 minutes at 7000 g.
Pipettera 100 µl av varje provextrakt i ett Eppendorf-rör och centrifugera under 7 minuteruter på 7000 g.