natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Air-dry the slides (or on slide dryer at 37 °C) and fix them by flaming.
Lufttorka glasen (eller torka på objektglastork vid 37 °C) och fixera dem genom flambering.
At this stage the procedure may be interrupted and the hybridisation continued the following day.
Förfarandet kan på detta stadium avbrytas, och hybridiseringen kan fortsätta följande dag.
Slides should be stored dust-free and dry at room temperature.
Glasen bör förvaras dammfritt och torrt i rumstemperatur.
Pre-hybridisation and hybridisation
Förhybridisering och hybridisering
Prepare a lysozyme solution containing 10 mg lysozyme (Sigma L–6876) in 10 ml buffer (100 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH8.0).
Preparera en lysozymlösning innehållande 10 mg lysozym (Sigma L-6876) i 10 ml buffert (100 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0).
This solution can be stored but it should only be freeze-thawed once.
Denna lösning kan lagras men bör nedfrysas och upptinas endast en gång.
Cover each sample well with approximately 50 µl of lysozyme solution and incubate for 10 minutes at room temperature.
Täck varje prov väl med ungefär 50 µl lysozymlösning och inkubera under 10 minuter vid rumstemperatur.
Then dip the slides in demineralised water, once only and dry with filter paper.
Doppa därefter glasen i demineraliserat vatten en enda gång och torka med filterpapper.
Alternatively, instead of lysozyme add 50 µl of 40 to 400µg ml–1 proteinase K in buffer (20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl2, pH 7,4) to each well and incubate at 37 °C for 30 minutes.
Alternativt kan man i stället för lysozym tillsätta 50 µl av 40–400µg ml–1 proteas K i en buffert (20 mM Tris-HCl, 2mM CaCl2, pH 7,4) till varje brunn och inkubera vid 37 °C under 30 minuter.
Dehydrate the cells in a graded ethanol series of 50 %, 80 % and 96 % for one minute each.
Torka cellerna i en serie av etanol om 50 %, 80 % och 96 % under 1 minut vardera.
Air dry the slides in a slide-holder.
Lufttorka glasen i en hållare för objektglas.
Prepare a moist incubation chamber by covering the bottom of an air-tight box with tissue or filter paper soaked in 1x hybmix (Appendix 7).
Preparera en fuktkammare för inkubation genom att täcka botten av en lufttät behållare med mjuk- eller filterpapper doppat i 1x hybmix (tillägg 7).
Pre-incubate the box in the hybridisation oven at 55 °C for at least 10 minutes.
Preinkubera behållaren i hybridiseringsugn vid 55 °C under minst 10 minuter.
Prepare the hybridisation solution (Appendix 7) allowing 45 µl per slide, and preincubate for five minutes at 55 °C.
Preparera hybridiseringslösningen (tillägg 7) med 45 µl per glas, och preinkubera under 5 minuter vid 55 °C.
Place slides on a hot plate at 45 °C and apply 10 µl of hybridization solution to each of the four wells on the slide(s).
Placera glasen på en värmeplatta vid 45 °C och tillsätt 10 µl hybridiseringslösning till var och en av de 4 brunnarna på glaset (glasen).
Apply two coverslips (24 × 24 mm) to each slide without trapping air.
Anbringa 2 täckglas (24 × 24 mm) på varje glas utan att låta någon luft komma emellan.
Place the slides in the pre-warmed moist chamber and hybridise overnight in the oven at 55 °C in the dark.
Placera glasen i den redan uppvärmda fuktkammaren och hybridisera över natten i ugn vid 55 °C i mörker.
Prepare three beakers containing 1 l of Ultra pure water (UPW), 1 l of 1x hybmix (334 ml 3x hybmix and 666 ml UPW) and 1 l of 1/2x hybmix (167 ml 3x hybmix and 833 ml UPW).
Preparera 3 bägare innehållande 1 l ultrarent vatten, 1 l 1x hybmix (334 ml 3x hybmix och 666 ml ultrarent vatten) och 1 l av 1/2x hybmix (167 ml 3x hybmix och 833 ml ultrarent vatten).
Pre-incubate each in a waterbath at 55 °C.
Preinkubera var och en i vattenbad vid 55 °C.
Remove the coverslips from the slides and place the slides in a slide holder.
Avlägsna täckglasen från glasen och placera glasen i en hållare för objektglas.
Wash away excess probe by incubation for 15 mins. in the beaker with 1x hybmix at 55 °C.
Tvätta bort probe-överskott genom inkubation under 15 minuter i bägaren med 1x hybmix vid 55 °C.
Transfer the slide holder to 1/2 hybmix washing solution and incubate for a further 15 mins.
För över hållaren för objektglas till 1/2 hybmix tvättlösning och inkubera under ytterligare 15 minuter
Dip the slides briefly in UPW and place them on filter paper.
Doppa glasen hastigt i ultrarent vatten och placera dem på filterpapper.
Remove excess moisture by covering the surface gently with filter paper.
Avlägsna överskottsfukt genom att försiktigt täcka ytan med filterpapper.
Pipette 5 to 10 μl of anti-fading mountant solution (e.g. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA or equivalent) on each window and apply a large coverslip (24 × 60 mm) over the whole slide.
Pipettera 5–10 μl av inbäddningslösning som motverkar blekning (t.ex. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA eller liknande) på varje fönster och lägg ett stort täckglas (24 × 60 mm) över hela glaset.
Reading the FISH test
Tolkning av FISH-testet
Observe the slides immediately with a microscope fitted for epifluorescence microscopy at 630 or 1000x magnification under immersions oil.
Observera glasen omedelbart i ett mikroskop utrustat för epifluorescensmikroskopi vid 630 eller 1000x förstoring under oljeimmersion.
With a filter suitable for fluorescein isothiocyanate (FITC) eubacterial cells (including most gram negative cells) in the sample are stained fluorescent green.
Med ett filter lämpligt för fluoresceinisothiocyanat (FITC) färgas eubakteriecellerna (inklusive de flesta gramnegativa cellerna) i provet fluorescerande gröna.
Using a filter for tetramethylrhodamine-5-isothiocyanate, Cy3-stained cells of C. m. subsp. sepedonicus appear fluorescent red.
Med ett filter för tetrametylrodamin-5-isotiocyanat framträder Cy3-infärgade celler av C. m. subsp. sepedonicus som fluroscerande röda. Jämför cellmorfologin med de positiva kontrollernas cellmorfologi.
Compare cell morphology with that of the positive controls.
Cellerna skall vara klart fluorescerande och helt färgade.
Cells must be bright fluorescent and completely stained The FISH test (section 9.4) must be repeated if the staining is aberrant.
FISH-testet (avsnitt 9.4) skall återupprepas om färgningen är avvikande.
The fluorescence intensity must be equivalent or better than that of the positive control strain.
Intensiteten hos fluorescensen skall vara likvärdig med eller större än fluorescensen hos den positiva kontrollstammen.
There are several problems inherent to the specificity of the FISH test.
FISH-testets specificitet medför flera problem.
Background populations of fluorescing cells with atypical morphology and cross reacting saprophytic bacteria with size and morphology similar to C. m. subsp. sepedonicus may occur, although much less frequent than in the IF test, in potato heel end core and stem segment pellets.
Bestånd av fluorescerande celler med atypisk morfologi och korsreagerande saprofytiska bakterier som har en liknande storlek och morfologi som C. m. subsp. sepedonicus kan förekomma hos potatisar, dels i naveländarna, dels i pelletar av stjälksegmentet, även om de är mycket mer lågfrekventa än i IF-test.
Consider only fluorescing cells with typical size and morphology, see in 5.3.2.
Endast fluorescerande celler med typisk storlek och morfologi tas i beaktande (se 5.3.2).
Interpretation of the FISH test result:
Tolkning av resultaten från FISH-test:
Valid FISH test results are obtained if bright green fluorescent cells of size and morphology typical of C. m. subsp. sepedonicus are observed using the FITC filter and if bright red fluorescent cells using the rhodamine filter in all positive controls and not in any of the negative controls.
Giltiga resultat från FISH-test erhålls om klart fluorescerande gröna celler med storlek och morfologi som är typiskt för C. m. subsp. sepedonicus observeras när ett FITC-filter används respektive klart fluorescerande röda celler när ett rodamin-filter används i alla positiva kontroller och inte i någon av de negativa kontrollerna.
Samples with at least 5 × 103 typical cells per ml of resuspended pellet are considered potentially contaminated.
Prover som innehåller minst 5 × 103 typiska celler per ml återsuspenderad pellet betraktas som potentiellt smittade.
Further testing is required.
Ytterligare provtagning krävs.
Samples with less than 5 × 103 typical cells per ml of resuspended pellet are considered negative.
Prover som innehåller färre än 5 × 103 typiska celler per ml återsuspenderad pellet betraktas som negativa.
The FISH test is negative if bright red fluorescent cells with size and morphology typical of C. m. subsp. sepedonicus are not observed using the rhodamine filter, provided that typical bright red fluorescent cells are observed in the positive control preparations when using the rhodamine filter.
FISH-testet är negativt om klart fluorescerande röda celler med storlek och morfologi som är typiskt för C. m. subsp. sepedonicus inte observeras när rodamin-filtret används, förutsatt att typiska klart fluorescerande röda celler observeras i de positiva kontrollpreparaten när rodamin-filtret används.
When the PCR test is used as the principal screening test and found to be positive, the IF test must be performed as a second compulsory screening test.
Om ett PCR-test används som huvudsakligt screeningtest och resultatet är positivt, skall ett andra screeningtest i form av ett IF-test göras.
When the PCR test is used as the second screening test and found to be positive, further testing according to the flow scheme is required to complete the diagnosis.
Om PCR-testet används som andra screeningtest och resultatet är positivt, krävs ytterligare testning enligt flödesschemat för att diagnosen skall bli fullständig.
Full exploitation of this method as principal screening test is only recommended when specialised expertise has been acquired.
Fullt utnyttjande av denna metod som huvudsakligt screeningtest rekommenderas endast när särskild fackkompetens har uppnåtts.
Preliminary testing with this method should permit reproducible detection of 103 to 104 cells of C. m. subsp. sepedonicus per ml added to sample extracts which previously tested negative.
Preliminär testning med denna metod bör möjliggöra reproducerbar upptäckt av 103–104 celler av C. m. subsp. sepedonicus per ml som tillsätts till provextrakt som tidigare testats och gett negativt svar.
Optimisation experiments may be required to achieve maximum levels of sensitivity and specificity in all laboratories.
Optimeringsexperiment kan krävas för att uppnå maximal sensitivitets- och specificitetsnivå i alla laboratorier.
Use validated PCR reagents and protocols.
Använd validerade PCR-reagens och PCR-protokoll.
Preferably select a method with an internal control.
Välj helst en metod med internkontroll.
Use appropriate precautions to avoid contamination of sample with target DNA.
Vidta lämpliga åtgärder för att undvika nedsmittning av prover med mål-DNA.
The PCR test should be performed by experienced technicians, in dedicated molecular biology laboratories, in order to minimise the possibility of contamination with target DNA.
PCR-testerna bör utföras av erfarna tekniker i specialiserade molekylärbiologiska laboratorier för att minimera risken för nedsmittning av mål-DNA.
Negative controls (for DNA extraction and PCR procedures) should always be handled as final samples in the procedure, to make evident whether any carry over of DNA has occurred.
Negativa kontroller (för DNA-extraktions- och PCR-förfaranden) bör alltid behandlas som slutliga prov i förfarandet för att tydligt kunna visa om överföring till mål-DNA har inträffat eller ej.
The following negative controls should be included in the PCR test:
Följande negativa kontroller bör ingå i PCR-testet:
buffer controls used for extracting the bacterium and the DNA from the sample,
Buffertkontroller som används för extrahering av bakterien och DNA från provet.
PCR-reaction mix.
PCR-reaktionsblandningen.
The following positive controls should be included:
Följande positiva kontroller bör tas med:
aliquots of resuspended pellets to which C. m. subsp. sepedonicus has been added (preparation see Appendix 2),
Delprover av återsuspenderad pellet till vilka C. m. subsp. sepedonicus har tillsatts (information om preparering finns i tillägg 2).
a suspension of 106 cells per ml of C. m. subsp. sepedonicus in water from a virulent isolate (e.g. NCPPB 2140 or NCPPB 4053),
En suspension av 106 celler per ml av C. m. subsp. sepedonicus i vatten från ett virulent isolat (t.ex. NCPPB 2140 eller NCPPB 4053).
if possible also use DNA extracted from positive control samples in the PCR test.
Om möjligt använd dessutom DNA från positiva kontrollprover i samband med att PCR-test.
To avoid potential contamination prepare positive controls in a separate environment from samples to be tested.
För att undvika risk för smitta, preparera positiva kontroller i en separat omgivning från de prover som skall testas.
Sample extracts should be as free as possible from soil.
Provextrakten bör vara så fria från jord som möjligt.
It could therefore in certain cases advisible to prepare extractions from washed potatoes if PCR protocols are to be used.
Om PCR-protokoll skall användas kan det därför i vissa fall vara tillrådligt att preparera extraheringar från tvättade potatisar.
DNA purification methods
Metoder för rening av DNA
Use positive and negative control samples as described above.
Använd positiva och negativa kontrollprover såsom beskrivs ovan.
Prepare control material in an identical manner as the sample(s).
Preparera kontrollmaterialen exakt som provet (proven).
A variety of methods are available for purification of target DNA from complex sample substrates, thus removing inhibitors of PCR and other enzymatic reactions and concentrating target DNA in the sample extract.
Det finns en rad olika metoder för att rena mål-DNA från komplexa provsubstrat och på så sätt avlägsna inhibitorer av PCR och andra enzymreaktioner och koncentrera mål-DNA i provextraktet.
The following method has been optimised for use with the validated PCR method shown in Appendix 6.
Följande metod har optimerats för att användas tillsammans med den validerade PCR-metod som visas i tillägg 6.
6.1.(a) Method according to Pastrik (2000)
Metod enligt Pastrik (2000)
Pipette 220 µl of lysis buffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) into a 1,5 ml Eppendorf tube.
Pipettera 220 µl av lyseringsbuffert (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) i ett 1,5 ml Eppendorf-rör.
Add 100 µl sample extract and place in a heating block or waterbath at 95 °C for 10 minutes.
Tillsätt 100 µl provextrakt och placera i värmeblock eller vattenbad vid 95 °C under 10 minuter.
Put tube on ice for five minutes.
Ställ röret på kylning under 5 minuter.
Add 80 µl Lysozyme stock solution (50 mg lysozyme per ml in 10 mM Tris HCl, pH 8,0) and incubate at 37 °C for 30 minutes.
Tillsätt 80 µl Lysozym utgångslösning (50 mg lysozym per ml i 10 mM Tris HCl, pH 8,0) och inkubera vid 37 °C under 30 minuter.
Add 220 µl of Easy DNA® solution A (Invitrogen), mix well by vortexing and incubate at 65 °C for 30 minutes.
Tillsätt 220 µl Easy DNA® lösning A (Invitrogen), blanda väl genom skakning och inkubera vid 65 °C under 30 minuter.
Add 100 µl of Easy DNA® solution B (Invitrogen), vortex vigorously until the precipitate runs freely in the tube and the sample is uniformly viscous.
Tillsätt 100 µl Easy DNA® lösning B (Invitrogen), skaka kraftigt tills fällningen svävar fritt i röret och provet är jämnt trögflytande.
Add 500 µl of chloroform and vortex until the viscosity decreases and the mixture is homogeneous.
Tillsätt 500 µl kloroform och skaka tills viskositeten ökar och blandningen är homogen.
Centrifuge at 15000 g for 20 minutes at 4 °C to separate phases and form the interphase.
Centrifugera vid 15000 g under 20 minuter vid 4 °C för att separera faserna och bilda interfasen.
Transfer the upper phase into a fresh Eppendorf tube.
För över den övre fasen till ett rent Eppendorf-rör.
Add 1 ml of 100 % ethanol (–20 °C) vortex briefly and incubate on ice for 10 minutes.
Tillsätt 1 ml 100-procentig etanol (–20 °C), skaka snabbt och inkubera under nedkylning under 10 minuter.
Centrifuge at 15000 g for 20 minutes at 4 °C and remove ethanol from pellet.
Centrifugera vid 15000 g under 20 minuter vid 4 °C och avlägsna etanolen från pelleten.
Add 500 µl 80 % ethanol (–20 °C) and mix by inverting the tube.
Tillsätt 500 µl 80-procentig etanol (–20 °C) och blanda genom att vända upp och ned på röret.
Centrifuge at 15000 g for 10 minutes at 4 °C, save the pellet and remove ethanol.
Centrifugera vid 15000 g under 10 minuter vid 4 °C, spara pelleten och avlägsna etanolen.
Allow the pellet to dry in air or in a DNA speed vac.
Låt pelleten lufttorka eller torka i en DNA speed vac.
Resuspend the pellet in 100 µl sterile UPW and leave at room temperature for at least 20 minutes.
Återsuspendera pelleten i 100 µl sterilt ultrarent vatten och låt stå i rumstemperatur under minst 20 minuter.
Store at –20 °C until required for PCR.
Lagra vid –20 °C fram till användning för PCR.
Spin down any white precipitate by centrifugation and use 5 µl of the supernatant containing DNA for the PCR.
Blanda ned alla eventuella vita fällningar genom centrifugering och använd 5 µl av supernatanten innehållande DNA till PCR.
Prepare test and control templates for PCR according to the validated protocol (Appendix 6).
Preparera test- och kontrolltemplat för PCR enligt det validerade protokollet (tillägg 6).
Prepare one decimal dilution of sample DNA extract (1:10 in UPW).
Preparera en decimal utspädning av DNA-provextrakt (1:10 i ultrarent vatten).
Prepare the appropriate PCR reaction mix in a contamination-free environment according to the published protocol (Appendix 6).
Preparera lämplig PCR-reaktionsblandning i en omgivning fri från smitta enligt det offentliggjorda protokollet (tillägg 6).
The validated PCR protocol is a multiplex reaction that also incorporates an internal PCR control.
Det validerade PCR-protokollet är en multiplexreaktion som även omfattar en intern PCR-kontroll.
Add 5 µl of DNA extract per 25 µl PCR reaction in sterile PCR tubes.
Tillsätt 5 µl DNA-extrakt per 25 µl PCR-reaktion i sterila PCR-rör.
Incorporate a negative control sample containing only PCR reaction mix and add the same source of UPW as used in the PCR mix in place of sample.
Blanda i ett negativt kontrollprov innehållande PCR-reaktionsblandning och tillsätt ultrarent vatten av samma ursprung som det som användes i PCR-blandningen i stället för provet.
Place tubes in the same thermal cycler which was used in preliminary testing and run the appropriately optimised PCR programme (Appendix 6).
Placera rören i samma termocykelapparat som användes vid föregående testning och kör lämpligt optimerat PCR-program (tillägg 6).
Analysis of the PCR product
Analys av PCR-produkten
Resolve PCR amplicons by agarose gel electrophoresis.
Lös PCR-produkten med agarosgelelektrofores.
Run at least 12 µl of amplified DNA reaction mixture from each sample mixed with 3 µl loading buffer (Appendix 6) in 2,0 % (w/v) agarose gels in tris-acetate-EDTA (TAE) buffer (Appendix 6) at 5 to 8 V per cm.
Använd minst 12 µl av amplifierad DNA-reaktionsblandning från varje prov blandat med 3 µl laddningsbuffert (tillägg 6) i 2,0 % (w/v) agarosgel i tris-acetat-EDTA (TAE)-buffert (tillägg 6) vid 5–8 V per cm.
Use an appropriate DNA marker, e.g. 100 bp ladder.
Använd en lämplig DNA-markör, t.ex. 100 bp storleksmarkör.
Reveal DNA bands by staining in ethidium bromide (0,5 mg per L) for 30 to 45 min taking appropriate precautions for handling this mutagen.
Påvisa DNA-band genom att färga i etidiumbromid (0,5 mg per l) under 30-45 minuter, varvid lämpliga försiktighetsåtgärder bör vidtas vid hanteringen av mutagenen etidiumbromid.
Observe stained gel under short wave UV transillumination (e.g. λ = 302 nm) for amplified PCR products of the expected size (Appendix 6) and document.
Observera det färgade gelet i kortvågs-UV-genomlysning (t.ex. λ = 302 nm) och sök efter amplifierade DNA-produkter av förväntad storlek (tillägg 6) och dokumentera.
For all new findings/cases verify authenticity of the PCR amplicon by performing restriction enzyme analysis on a sample of the remaining amplified DNA by incubating at the optimum temperature and time with an appropriate enzyme and buffer (see Appendix 6).
För varje ny upptäckt/nytt fall verifiera autenticiteten hos PCR-produkten genom att utföra restriktionsenzymanalys på ett prov av det återstående amplifierade DNA genom inkubation vid optimal temperatur och under optimal tid med en lämplig enzym och buffert (se tillägg 6).
Resolve the digested fragments by agarose gel electrophoresis as before and observe characteristic restriction fragment pattern under UV transillumination after ethidium bromide staining and compare with the undigested and digested positive control.
Lös de uppdelade fragmenten genom agarosgelelektrofores, som ovan, och observera det karakteristiska restriktionsfragmentsmönstret vid UV-genomlysning efter färgning i etidiumbromid, och jämför med den ouppdelade och uppdelade positiva kontrollen.
Interpretation of the PCR test result:
Tolkning av PCR-resultaten:
The PCR test is negative if the C. m. subsp. sepedonicus-specific PCR amplicon of expected size is not detected for the sample in question but is detected for all positive control samples (in case of multiplex PCR with plant specific internal control primers: a second PCR-product of expected size must be amplified with the sample in question).
PCR-testet är negativt om det C. m. subsp. sepedonicus-specifika PCR-produkten av den förväntade storleken inte upptäcks i provet, men upptäcks i alla positiva kontrollprover (i fallet multiplex-PCR med plantspecifika interna kontrollprimrar skall en andra PCR-produkt av förväntad storlek amplifieras med provet i fråga).
The PCR test is positive if the C. m. subsp. sepedonicus-specific PCR amplicon of expected size and restriction pattern (when required) is detected, providing that it is not amplified from any of the negative control samples.
PCR-testet är positivt om det C. m. subsp. sepedonicus-specifika PCR-produkten av den förväntade storleken och det förväntade restriktionsmönstret (vid behov) upptäcks, förutsatt att det inte amplifierats från någon av de negativa kontrollproven.
Reliable confirmation of a positive result can also be obtained by repeating the test with a second set of PCR primers (section 9.3).
Tillförlitlig bekräftelse av ett positivt resultat kan även erhållas genom att testet upprepas med en andra uppsättning PCR-primrar (avsnitt 9.3).
Inhibition of the PCR may be suspected if the expected amplicon is obtained from the positive control sample containing C. m. subsp. sepedonicus in water but negative results are obtained from positive controls with C. m. subsp. sepedonicus in potato extract.
Inhibering av PCR kan misstänkas om den förväntade produkten erhålls från det positiva kontrollprovet innehållande C. m. subsp. sepedonicus i vatten men negativa resultat erhålls från positiva kontroller med C. m. subsp. sepedonicus i potatisextrakt.
In multiplex PCR protocols with internal PCR controls, inhibition of the reaction is indicated when neither of the two amplicons are obtained.
I multiplexa PCR-protokoll med interna PCR-kontroller anges inhibering av reaktionen när inget av de båda produkterna erhålls.
Contamination may be suspected if the expected amplicon is obtained from one or more of the negative controls.
Smitta kan misstänkas om den förväntade produkten erhålls från en eller flera av de negativa kontrollerna.
Preliminary testing with this method should permit reproducible detection of 103 to 104 colony-forming units of C. m. subsp. sepedonicus per ml added to sample extracts that previously tested negative (preparation see Appendix 2).
Preliminär testning med denna metod bör möjliggöra reproducerbar upptäckt av 103–104 koloniformande enheter av C. m. subsp. sepedonicus per ml som tillsätts till provextrakt som tidigare testats och gett negativt svar (information om prepareringen finns i tillägg 2).