natgillin/translations-raw huggingface dataset:
But further work would be needed to adequately characterize the necessary protocol modifications.
Ker je mogoče proučevati indukcijo prelomov verig DNK (kometov) v skoraj vsakem tkivu, je treba izbiro tkiv, ki bodo odvzeta, jasno opredeliti ter utemeljiti z razlogom za izvedbo študije in kakršnimi koli obstoječimi podatki o procesih absorpcije, porazdelitve, presnove in izločanja (ADME), genotoksičnosti, rakotvornosti ali drugi toksičnosti za preiskovane preskusne kemikalije.
Thus detection of cross linking agents is not the primary purpose of the assay as described here.
Pomembni dejavniki, ki jih je treba upoštevati, morajo zajemati način dajanja (na podlagi najverjetnejših načinov izpostavljenosti ljudi), predvideno porazdelitev in absorpcijo v tkivu, vlogo metabolizma ter možni mehanizem delovanja preskusnih kemikalij.
The assay is not appropriate, even with modifications, for detecting aneugens.
Jetra so najpogosteje proučevano tkivo in zanj obstaja največ podatkov.
Due to the current status of knowledge, several additional limitations (see Appendix 3) are associated with the in vivo comet assay.
Če torej ni na voljo nobenih informacij o ozadju in niso opredeljena nobena posebna preiskovana tkiva, bi bilo vzorčenje jeter utemeljeno, saj so primarno mesto ksenobiotičnega metabolizma in pogosto močno izpostavljene tako matičnim snovem kot tudi metabolitom.
It is expected that the test method will be reviewed in the future and if necessary revised in light of experience gained.
V nekaterih primerih bo morda najustrezneje proučiti mesto neposrednega kontakta (na primer žlezni želodec ali dvanajsternik/tešče črevo za kemikalije, ki se dajejo oralno, ali pljuča za kemikalije, ki se vdihavajo).
PRINCIPLE OF THE METHOD
Izbrati je treba dodatna ali druga tkiva glede na posebne razloge za izvedbo preskusa, morda pa je uporabno proučiti več tkiv istih živali, če je laboratorij dokazal usposobljenost za ta tkiva in hkratno obravnavanje več tkiv.
A detailed description of dosing and sampling is given in paragraphs 36-40.
Priprava vzorcev
At the selected sampling time(s), the tissues of interest are dissected and single cells/nuclei suspensions are prepared (in situ perfusion may be performed where considered useful e.g. liver) and embedded in soft agar so as to immobilize them on slides.
Za procese, opisane v naslednjih odstavkih (44–49), je pomembno, da se vse raztopine ali stabilne suspenzije uporabijo do datuma izteka roka njihove uporabnosti ali se po potrebi pripravijo sveže.
Cells/nuclei are treated with lysis buffer to remove cellular and/or nuclear membrane, and exposed to strong alkali e.g. pH ≥13 to allow DNA unwinding and release of relaxed DNA loops and fragments.
V naslednjih odstavkih se kot ključne spremenljivke (glej opredelitve pojmov v Dodatku 1) obravnavajo tudi čas, ki je potreben za (i) odstranitev vsakega tkiva po obdukciji, (ii) predelavo vsakega tkiva v suspenzijo s celicami/jedri in (iii) obdelavo suspenzije in pripravo preparatov, sprejemljivo trajanje vsakega od teh korakov pa bi moralo biti določeno med vzpostavljanjem metode in dokazovanjem usposobljenosti.
The nuclear DNA in the agar is then subjected to electrophoresis.
Živali se evtanazirajo v skladu z veljavno zakonodajo o dobrobiti živali in načeli 3R ob ustreznem času po zadnjem tretiranju s preskusno kemikalijo.
Normal non-fragmented DNA molecules remain in the position where the nuclear DNA had been in the agar, while any fragmented DNA and relaxed DNA loops would migrate towards the anode.
Izbrana tkiva se odstranijo in secirajo, en del pa se odvzame za kometni preskus; hkrati je treba odrezati rezino istega dela tkiva in jo vstaviti v formaldehidno raztopino ali ustrezen fiksativ za morebitno histopatološko analizo (glej odstavek 55) v skladu s standardnimi metodami (12).
After electrophoresis, the DNA is visualized using an appropriate fluorescent stain.
Tkivo za kometni preskus se vstavi v pufer za mletje, spere z zadostno količino hladnega pufra za mletje, da se odstranijo ostanki krvi, in shrani v ledeno mrzlem pufru za mletje do obdelave.
Preparations should be analysed using a microscope and full or semi-automated image analysis systems.
Izvede se lahko tudi perfuzija in situ, na primer za jetra ali ledvice.
The extent of DNA that has migrated during electrophoresis and the migration distance reflects the amount and size of DNA fragments.
Objavljene so številne metode za izolacijo celic/jeder.
There are several endpoints for the comet assay.
Te zajemajo mletje tkiv, kot so jetra in ledvice, postrganje vzorca s sluzničnih površin v primeru prebavnega trakta, homogenizacija in encimska prebava.
The DNA content in the tail ( % tail DNA or % tail intensity) has been recommended to assess DNA damage (12) (40) (41) (42).
V validacijskem preskusu JaCVAM so bile proučene samo izolirane celice, zato se v okviru določanja metode in možnosti sklicevanja na podatke preskusa JaCVAM za dokazovanje usposobljenosti priporoča uporaba izoliranih celic.
After analysis of a sufficient number of nuclei, the data are analysed with appropriate methods to judge the assay results.
Dokazano pa je bilo, da ni bilo bistvenih razlik v rezultatih preskusa, če so bile uporabljene izolirane celice ali jedra (8).
It should be noted that altering various aspects of the methodology, including sample preparation, electrophoresis conditions, visual analysis parameters (e.g. stain intensity, microscope bulb light intensity, and use of microscope filters and camera dynamics) and ambient conditions (e.g. background lighting), have been investigated and may affect DNA migration (43) (44) (45) (46).
Primerljivi rezultati so bili pridobljeni tudi z različnimi metodami za izolacijo celic/jeder (npr. homogenizacija, mletje, encimska prebava in filtriranje skozi mrežo) (55).
Each laboratory should establish experimental competency in the comet assay by demonstrating the ability to obtain single cell or nuclei suspensions of sufficient quality for each target tissue(s) for each species used.
Zato se lahko uporabijo izolirane celice ali izolirana jedra.
The quality of the preparations will be evaluated firstly by the % tail DNA for vehicle treated animals falling within a reproducible low range.
Laboratorij mora skrbno oceniti in validirati metode za izolacijo posameznih celic/jeder, ki se uporabljajo za posamezna tkiva.
Current data suggest that the group mean % tail DNA (based on mean of medians — see paragraph 57 for details of these terms) in the rat liver should be preferably not exceed 6 %, which would be consistent with the values in the JaCVAM validation trial (12) and from other published and proprietary data.
Kot je navedeno v odstavku 40, je lahko obstojnost nekaterih poškodb, ki vodijo v prelome verig DNK, ki jih zazna kometni preskus, zelo kratka (52) (53).
There are not enough data at this time to make recommendations about optimum or acceptable ranges for other tissues.
Ne glede na to, katera metoda se uporabi za pripravo suspenzij s posameznimi celicami/jedri, je torej pomembno, da se tkiva obdelajo čim prej po evtanaziji živali in vstavijo v pogoje, ki zmanjšajo odstranjevanje poškodb (npr. hranjenje tkiva pri nizki temperaturi).
This does not preclude the use of other tissues if justified.
Suspenzije s celicami se morajo hraniti v ledeno mrzlih pogojih, dokler niso pripravljene za uporabo, zato da se lahko dokažejo kar najmanjše variacije med vzorci ter ustrezni odzivi pozitivnih in negativnih kontrol.
The test report should provide appropriate review of the performance of the comet assay in these tissues in relation to the published literature or from proprietary data.
PRIPRAVA PREPARATOV
Firstly, a low range of % tail DNA in controls is desirable to provide sufficient dynamic range to detect a positive effect.
Preparate je treba pripraviti čim prej (načeloma v roku ene ure) po pripravi posameznih celic/jeder, temperatura in čas med smrtjo živali in pripravo preparata pa morata biti skrbno nadzorovana in validirana v laboratorijskih pogojih.
Secondly, each laboratory should be able to reproduce expected responses for direct mutagens and pro-mutagens, with different modes of action as suggested in Table 1 (paragraph 29).
Volumen suspenzije s celicami, ki se jo doda v agarozo z nizkim tališčem (običajno 0,5–1,0 %) za pripravo preparatov, ne sme zmanjšati odstotka agaroze z nizkim tališčem na manj kot 0,45 %.
Positive substances may be selected, for example from the JaCVAM validation trial (12) or from other published data (see paragraph 9), if appropriate, with justification, and demonstrating clear positive responses in the tissues of interest.
Optimalna gostota celic bo določena na podlagi sistema za analizo slik, ki se uporablja za ocenjevanje kometov.
The ability to detect weak effects of known mutagens e.g. EMS at low doses, should also be demonstrated, for example by establishing dose-response relationships with appropriate numbers and spacing of doses.
Liza
Initial efforts should focus on establishing proficiency with the most commonly used tissues e.g. the rodent liver, where comparison with existing data and expected results may be made (12).
Pogoji lize so prav tako ključna spremenljivka in lahko vplivajo na prelome verig, ki so posledica posebnih tipov sprememb DNK (določene alkilacije DNK in adukti baz).
Data from other tissues e.g. stomach/duodenum/jejunum, blood etc. could be collected at the same time.
Priporoča se torej, da se za vse preparate v preskusu ohranijo čim bolj konstantni pogoji lize.
The laboratory needs to demonstrate proficiency with each individual tissue in each species they are planning to study, and will need to demonstrate that an acceptable positive response with a known mutagen (e.g. EMS) can be obtained in that tissue.
Ko so preparati pripravljeni, jih je treba potopiti v ohlajeno lizirno raztopino za vsaj eno uro (ali čez noč) pri približno 2–8 °C in zatemnjenih svetlobnih pogojih, npr. pri rumeni svetlobi (ali povsem zatemnjeno), ki preprečujejo, da bi bili izpostavljeni beli svetlobi, ki lahko vsebuje UV-komponente.
Vehicle/negative control data should be collected so as to demonstrate reproducibility of negative data responses, and to ensure that the technical aspects of the assay were properly controlled or to suggest the need to re-establish historical control ranges (see paragraph 22).
Po tej inkubacijski dobi je treba preparate sprati, da se odstranijo ostanki detergenta in soli pred korakom odvitja DNK v alkalnih pogojih.
It should be noted, that whilst multiple tissues can be collected at necropsy and processed for comet analysis, the laboratory needs to be proficient in harvesting multiple tissues from a single animal, thereby ensuring that any potential DNA lesion is not lost and comet analysis is not compromised.
To se lahko stori s prečiščeno vodo, nevtralizacijskim pufrom ali fosfatnim pufrom.
The length of time from euthanasia to removal of tissues for processing may be critical (see paragraph 44).
Uporabi se lahko tudi elektroforezni pufer.
Animal welfare must be considered whilst developing proficiency in this test and therefore tissues from animals used in other tests can be used when developing competence in the various aspects of the test.
V tem primeru se v komori za elektroforezo ohranijo alkalni pogoji.
Furthermore, it may not be necessary to conduct a full study during the stages of establishing a new test method in a laboratory and fewer animals or test concentrations can be used when developing the necessary skills.
Odvijanje DNK in elektroforeza
During the course of the proficiency investigations, the laboratory should build a historical database to establish positive and negative control ranges and distributions for relevant tissues and species.
Preparati se naključno položijo na platformo horizontalne enote za elektroforezo, ki vsebuje dovolj elektroforezne raztopine, da so površine preparatov povsem prekrite (globina pokritja bi morala biti konsistentna v vsaki ponovitvi preskusa).
Recommendations on how to build and use the historical data (i.e. criteria for inclusion and exclusion of data in historical data and the acceptability criteria for a given experiment) can be found in the literature (47).
Pri drugem tipu enot za elektroforezo za kometni preskus, tj. z aktivnim hlajenjem, cirkulacijo in visoko zmogljivim napajanjem, bo večje pokritje z raztopino povzročilo večji električni tok pri konstantni napetosti.
Different tissues and different species, as well as different vehicles and routes of administrations, may give different negative control % tail DNA values.
Uporabiti je treba uravnoteženo zasnovo za namestitev preparatov v elektroforezni bazen, da se zmanjšajo učinki kakršnih koli trendov ali robov v bazenu in variabilnost posameznih serij, tj. v vsaki ponovitvi elektroforeze mora biti enako število preparatov z vzorcem vsake živali v študiji in vključiti je treba vzorce iz različnih skupin, ki prejemajo odmerke, ter pozitivne in negativne kontrole.
It is therefore important to establish negative control ranges for each tissue and species.
Preparate je treba pustiti vsaj 20 minut, da se DNK odvije, nato pa jih izpostaviti elektroforezi pod nadzorovanimi pogoji, ki kar najbolj povečajo občutljivost in dinamično območje preskusa (tj. omogočajo sprejemljive ravni odstotka DNK v repu za negativne in pozitivne kontrole, s katerimi se kar najbolj poveča občutljivost).
Laboratories should use quality control methods, such as control charts (e.g. C-charts or X-bar charts (48)), to identify how variable their data are, and to show that the methodology is ‘under control’ in their laboratory.
Raven migracije DNK je linearno povezana s trajanjem elektroforeze in tudi s potencialom (V/cm).
Selection of appropriate positive control substances, dose ranges and experimental conditions (e.g. electrophoresis conditions) may need also to be optimised for the detection of weak effects (see paragraph 17).
Glede na preskus JaCVAM lahko potencial znaša 0,7 V/cm vsaj 20 minut.
Common laboratory strains of healthy young adult rodents (6-10 weeks old at start of treatment though slightly older animals are also acceptable) are normally used.
Trajanje elektroforeze se obravnava kot ključna spremenljivka in čas elektroforeze mora biti nastavljen tako, da optimizira dinamično območje.
The choice of rodent species should be based on (i) species used in other toxicity studies (to be able to correlate data and to allow integrated studies), (ii) species that developed tumours in a carcinogenicity study (when investigating the mechanism of carcinogenesis), or (iii) species with the most relevant metabolism for humans, if known.
Daljša elektroforeza (npr. 30 ali 40 minut, da se kar najbolj poveča občutljivost) običajno povzroči močnejše pozitivne odzive z znanimi mutageni.
Rats are routinely used in this test.
Vendar pa lahko daljša elektroforeza povzroči tudi prekomerno migracijo v kontrolnih vzorcih.
However, other species can be used if ethically and scientifically justified.
V vsakem preskusu mora biti napetost konstantna, variabilnost drugih parametrov pa mora biti znotraj ozkega in določenega območja, na primer v preskusu JaCVAM je potencial 0,7 V/cm dal začetni tok v višini 300 mA.
For rodents, the temperature in the experimental animal room ideally should be 22 °C (± 3 °C).
Globino pufra je treba prilagoditi, da se doseže zahtevane pogoje, in jo vzdrževati ves čas preskusa.
The relative humidity ideally should be 50-60 %, being at least 30 % and preferably not exceeding 70 % other than during room cleaning.
Zabeležiti je treba tok ob začetku in koncu elektroforeze.
Rodents should be housed in small groups (usually no more than five) of the same sex if no aggressive behaviour is expected.
Optimalne pogoje je torej treba določiti med začetnim dokazovanjem usposobljenosti v laboratoriju v zvezi z vsakim preiskovanim tkivom.
Solid floors should be used wherever possible as mesh floors can cause serious injury (49).
Temperatura elektroforezne raztopine med odvijanjem DNK in elektroforezo mora biti nizka, običajno 2–10 °C (10).
Appropriate environmental enrichment must be provided.
Temperaturo elektroforezne raztopine je treba zabeležiti ob začetku odvijanja ter ob začetku in koncu elektroforeze.
Animals are randomly assigned to the control and treatment groups.
Po koncu elektroforeze je treba preparate potopiti/spirati v nevtralizacijskem pufru vsaj 5 minut.
The animals are identified uniquely and acclimated to the laboratory conditions for at least five days before the start of treatment.
Geli se lahko obarvajo in ocenijo „sveži“ (npr. v roku 1–2 dni) ali pa se dehidrirajo za poznejše ocenjevanje (npr. v roku 1–2 tednov po barvanju) (56).
The least invasive method of uniquely identifying animals must be used.
Vendar je treba validirati pogoje med dokazovanjem usposobljenosti ter pridobiti in ohraniti podatke iz preteklih preskusov ločeno za vsakega od teh pogojev.
Appropriate methods include ringing, tagging, micro-chipping and biometric identification.
V primeru poznejšega ocenjevanja je treba preparate dehidrirati tako, da se jih potopi v absolutni etanol za vsaj 5 minut, posuši na zraku in nato shrani pri sobni temperaturi ali v posodi v hladilniku do ocenjevanja.
Toe and ear clipping are not scientifically justified in these tests.
Merilne metode
Cages should be arranged in such a way that possible effects due to cage placement are minimized.
Komete je treba oceniti količinsko z avtomatiziranim ali polavtomatiziranim sistemom za analizo slik.
At the commencement of the study, the weight variation of animals should be minimal and not exceed ± 20 %.
Preparati se obarvajo z ustreznim fluorescentnim barvilom, npr. SYBR Gold, Green I, propidijevim jodidom ali etidijevim bromidom, ter izmerijo pri ustrezni povečavi (npr. 200-kratni) na epifluorescenčnem mikroskopu z ustreznimi detektorji ali digitalno kamero (npr. naprava CCD).
Solid test chemicals should be dissolved or suspended in appropriate vehicles or admixed in diet or drinking water prior to dosing of the animals.
Celice se lahko razvrstijo v tri kategorije, kot je opisano v atlasu slik kometov (57), in sicer tiste, ki jih je mogoče oceniti, tiste, ki jih ni mogoče oceniti in celice „hedgehog“ (ang. „jež“ oziroma močno poškodovane celice) (glej odstavek 56 za več podrobnosti).
For inhalation exposures, test chemicals can be administered as gas, vapour, or a solid/liquid aerosol, depending on their physicochemical properties (50) (51).
Odstotek DNK v repu je treba oceniti samo za celice, ki jih je mogoče oceniti (jasno razločna glava in rep brez motenj zaradi sosednjih celic), da se prepreči izkrivljene rezultate.
Vehicle
O pogostosti celic, ki jih ni mogoče oceniti, ni treba poročati.
The vehicle should not produce toxic effects at the dose volumes used, and should not be suspected of chemical reaction with the test chemicals.
Pogostost močno poškodovanih celic je treba določiti na podlagi vizualnega ocenjevanja (saj analiza slik ne more zlahka zaznati kometov brez jasno razločne glave) pri vsaj 150 celicah na vzorec (glej odstavek 56 za več podrobnosti) in jih ločeno opisati.
If other than well-known vehicles are used, their inclusion should be supported with reference data indicating their compatibility in terms of test animals, route of administration and endpoint.
Vse preparate za analizo, vključno s tistimi s pozitivnimi in negativnimi kontrolami, je treba neodvisno označiti in oceniti „na slepo“, tako da oseba, ki beleži ugotovitve, ne pozna pogojev tretiranja.
It should be noted that some vehicles (particularly viscous vehicles) can induce inflammation and increase background levels of DNA strand breaks at the site of contact, particularly with multiple administrations.
Za vsak vzorec (na tkivo na žival) je treba analizirati vsaj 150 celic (kar ne vključuje močno poškodovanih celic – glej odstavek 56).
At this time, a group of a minimum of 3 analysable animals of one sex, or of each sex if both are used (see paragraph 32), treated with a positive control substance should normally be included with each test.
Ocenjevanje 150 celic na žival pri vsaj 5 živalih na odmerek (manj pri sočasni pozitivni kontroli – glej odstavek 29) zagotavlja ustrezno statistično moč glede na analizo, ki so jo opravili Smith idr., 2008 (5).
In future, it may be possible to demonstrate adequate proficiency to reduce the need for positive controls.
Če se uporabljajo preparati, bi to pomenilo od 2 do 3 ocenjene preparate na vzorec, kadar se uporablja pet živali na skupino.
If multiple sampling times are used (e.g. with a single administration protocol) it is only necessary to include positive controls at one of the sampling times, but a balanced design should be ensured (see paragraph 48).
Opazovati je treba več predelov preparata pri gostoti, ki zagotavlja, da se repi ne prekrivajo.
It is not necessary to administer concurrent positive control substances by the same route as the test chemical, although it is important that the same route should be used when measuring site-of-contact effects.
Izogniti se je treba ocenjevanju ob robovih preparatov.
The positive control substances should be shown to induce DNA strand breaks in all of the tissues of interest for the test chemical, and EMS is likely to be the positive control of choice since it has produced DNA strand breaks in all tissues that have been studied.
Pri kometnem preskusu se lahko prelomi verig DNK merijo z neodvisnimi končnimi točkami, kot so odstotek DNK v repu, dolžina repa in repni moment.
The doses of the positive control substances should be selected so as to produce moderate effects that critically assess the performance and sensitivity of the assay and could be based on dose-response curves established by the laboratory during the demonstration of proficiency.
Izvedejo se lahko vse tri meritve, če se uporablja ustrezna programska oprema za analizo slik.
The % tail DNA in concurrent positive control animals should be consistent with the pre-established laboratory range for each individual tissue and sampling time for that species (see paragraph 16).
Za vrednotenje in razlago rezultatov pa se priporoča odstotek DNK v repu (ki mu pravimo tudi odstotna intenzivnost repa) (12) (40) (41) (42), določen pa je z intenzivnostjo fragmentov DNK v repu, ki je izražena kot odstotek skupne intenzivnosti celice (13).
Examples of positive control substances and some of their target tissues (in rodents) are included in Table 1.
Poškodbe tkiv in citotoksičnost
Substances other than those given in Table 1 can be selected if scientifically justified.
Pozitivne ugotovitve pri kometnem preskusu morda niso pridobljene samo zaradi genotoksičnosti, saj lahko povečano migracijo DNK povzroči tudi toksičnost za ciljna tkiva (12) (41).
Examples of positive control substances and some of their target tissues
Obratno pa je mogoče opaziti nizko ali zmerno citotoksičnost pri znanih genotoksinih (12), kar pomeni, da ni mogoče razlikovati med migracijo DNK, ki jo povzroča genotoksičnost, in tisto, ki jo povzroča citotoksičnost, samo s kometnim preskusom.
Substances and CAS RN No.
Vendar če je opažena povečana migracija DNK, je priporočeno, da se prouči enega ali več znakov citotoksičnosti, saj lahko to pripomore k razlagi ugotovitev.
Ethyl methanesulfonate (CAS RN 62-50-0) for any tissue
Povečano migracijo DNK, če so ugotovljeni jasni dokazi za citotoksičnost, je treba razlagati previdno.
Ethyl nitrosourea (CAS RN 759-73-9) for liver and stomach, duodenum or jejunum
Predlagana so bila številna merila citotoksičnosti in izmed teh se kot pomembno merilo toksičnosti za tkiva obravnavajo histopatološke spremembe.
Methyl methanesulfonate (CAS RN 66-27-3) for liver, stomach, duodenum or jejunum, lung and bronchoalveolar lavage (BAL) cells, kidney, bladder, lung, testis and bone marrow/blood
S povečano migracijo DNK so povezana opažanja, kot so vnetje, infiltracija celic, apoptozne ali nekrotične spremembe, toda kot je razvidno iz validacijskega preskusa JaCVAM (12), ni na voljo nobenega dokončnega seznama histopatoloških sprememb, ki so vedno povezane s povečano migracijo DNK.