natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Body weight of the fish at the start of the exposure (from a sub-sample of the fish stock)
Predloga za izpuščaje
Test Conditions:
Številska ocena
Test procedure used (test-type, loading rate, stocking density, etc.);
1 – prisoten
Method of preparation of stock solutions and flow-rate;
Datum
The nominal test concentrations, weekly measured concentrations of the test solutions and analytical method used, means of the measured values and standard deviations in the test vessels and evidence that the measurements refer to the concentrations of the test chemical in true solution;
2 – povečan
Dilution water characteristics (including pH, hardness, alkalinity, temperature, dissolved oxygen concentration, residual chlorine levels, total organic carbon, suspended solids and any other measurements made)
Skupna ocena
Water quality within test vessels:
3 – izrazit
pH, hardness, temperature and dissolved oxygen concentration;
Dodatek 5B
Detailed information on feeding (e.g. type of food(s), source, amount given and frequency and analyses for relevant contaminants if available (e.g. PCBs, PAHs and organochlorine pesticides).
Ocena sekundarnih spolnih značilnosti pri medaki za zaznavanje nekaterih kemikalij z endokrinim delovanjem
Evidence that the controls met the acceptance criteria of the test;
V nadaljevanju je naveden opis bradavičastih podaljškov, ki so sekundarna spolna značilnost pri medaki (Oryzias latipes).
Data on mortalities occurring in any of the test concentrations and control;
Po odstranitvi jeter (Dodatek 6) se telo postavi v koničasto epruveto, ki vsebuje približno 10 ml 10-odstotnega nevtralno pufranega formalina (glava navzgor in rep navzdol).
Statistical analytical techniques used, treatment of data and justification of techniques used;
Če so spolne žleze fiksirane v raztopini, ki ni 10-odstotni nevtralno pufran formalin, se z rezilom naredi prečni rez čez telo med anteriornim območjem predrepne plavuti in anusom, pri čemer je treba paziti, da se ne poškodujejo gonopora in same spolne žleze (slika 3).
Data on biological observations of gross morphology, including secondary sex characteristics and vitellogenin;
Kranialna stran telesa ribe se vstavi v raztopino fiksativa, da se ohranijo spolne žleze, repna stran telesa ribe pa se vstavi v 10-odstotni nevtralno pufran formalin, kot je opisano zgoraj.
Results of the data analyses preferably in tabular and graphical form;
Ko se telo ribe vstavi v 10-odstotni nevtralno pufran formalin, se anteriorno območje predrepne plavuti prime s pinceto in za približno 30 sekund prepogne, da je predrepna plavut odprta.
Incidence of any unusual reactions by the fish and any visible effects produced by the test chemical
Pri prijemu predrepne plavuti s pinceto se nekaj plavutnic v anteriornem območju previdno prime, da se bradavičasti podaljški ne opraskajo.
This section contains a few considerations to be taken into account in the interpretation of test results for the various endpoints measured.
Merjenje
In setting the range of test concentrations, care should be taken not to exceed the maximum tolerated concentration to allow a meaningful interpretation of the data.
Riba se obrne s trebušno stranjo navzgor.
It is important to have at least one treatment where there are no signs of toxic effects.
Nato se predrepna plavut previdno odreže z majhnimi secirnimi škarjami (predrepna plavut se po možnosti odreže z nekaj radiji (pterygiophore).
Signs of disease and signs of toxic effects should be thoroughly assessed and reported.
Anteriorni del odrezane predrepne plavuti se prime s pinceto in položi na objektno stekelce z nekaj kapljicami vode.
For example, it is possible that production of VTG in females can also be affected by general toxicity and non-endocrine toxic modes of action, e.g. hepatotoxicity.
Nato se predrepna plavut prekrije s krovnim stekelcem.
However, interpretation of effects may be strengthened by other treatment levels that are not confounded by systemic toxicity.
Med prijemanjem predrepne plavuti s pinceto je treba paziti, da se bradavičasti podaljški ne opraskajo.
There are a few aspects to consider for the acceptance of test results.
S števcem se pod biološkim mikroskopom (pokončni mikroskop ali obrnjeni mikroskop) prešteje število ploščic z bradavičastimi podaljški.
As a guide, the VTG levels in control groups of males and females should be distinct and separated by about three orders of magnitude in fathead minnow and zebrafish, and about one order of magnitude for medaka.
Bradavičasti podaljški se prepoznajo, če je na posteriornem robu ploščice vidna majhna tvorba podaljškov.
Examples of the range of values encountered in control and treatment groups are available in the validation reports (1, 2, 3, 4).
Na delovni list se zapiše število ploščic z bradavičastimi podaljški na vsaki plavutnici (npr. prva plavutnica: 0, druga plavutnica: 10, tretja plavutnica: 12 itd.), vsota teh števil po posameznih ribah pa se vnese v Excelovo preglednico.
High VTG values in control males could compromise the responsiveness of the assay and its ability to detect weak oestrogen agonists.
Po potrebi se predrepna plavut fotografira in na fotografiji prešteje število ploščic z bradavičastimi podaljški.
Low VTG values in control females could compromise the responsiveness of the assay and its ability to detect aromatase inhibitors and oestrogen antagonists.
Po meritvi se predrepna plavut vstavi v koničasto epruveto, opisano v (1), in shrani.
The validation studies were used to build that guidance.
Slika 1
If a laboratory has not performed the assay before or substantial changes (e.g. change of fish strain or supplier) have been made it is advisable that a technical proficiency study is conducted.
Diagram, na katerem so prikazane razlike v obliki in velikosti predrepne plavuti glede na spol.
It is recommended that chemicals covering a range of modes of action or impacts on a number of the test endpoints are used.
A, samec;
In practice, each laboratory is encouraged to build its own historical control data for males and females and to perform a positive control chemical for estrogenic activity (e.g. 17β-estradiol at 100 ng/l, or a known weak agonist) resulting in increased VTG in male fish, a positive control chemical for aromatase inhibition (e.g. fadrozole or prochloraz at 300 μg/l) resulting in decreased VTG in female fish, and a positive control chemical for androgenic activity (e.g. 17β-trenbolone at 5 μg/l) resulting in induction of secondary sex characteristics in female fathead minnow and medaka.
B, samica.
All these data can be compared to available data from the validation studies (1, 2, 3) to ensure laboratory proficiency.
Slika 2
In general, vitellogenin measurements should be considered positive if there is a statistically significant increase in VTG in males (p < 0,05), or a statistically significant decrease in females (p < 0,05) at least at the highest dose tested compared to the control group, and in the absence of signs of general toxicity.
A, podaljški na ploščicah predrepne plavutnice.
A positive result is further supported by the demonstration of a biologically plausible relationship between the dose and the response curve.
J.P., ploščica;
As mentioned earlier, the vitellogenin decrease may not entirely be of endocrine origin;
A.S., aksialni prostor;
however a positive result should generally be interpreted as evidence of endocrine activity in vivo, and should normally initiate actions for further clarification.
P., proces.
Vitellogenin induction by 17β-estradiol and 17β-ethinylestradiol in male zebrafish (Danio rerio).
B, distalna okončina plavutnice.
Development of an ELISA for determination of the hepatic vitellogenin in Medaka (Oryzias latipes).
Actinotrichia (Act.) so na vrhu.
Fish full life-cycle testing for androgen methyltestosterone on medaka (Oryzias latipes).
Slika 3
Screening and testing for endocrine disruption in fish-biomarkers as “signposts”, not “traffic lights”, in risk assessment.
Fotografija telesa ribe, na kateri je prikazana stran reza, če so spolne žleze fiksirane v raztopini za fiksiranje, ki ni 10-odstotni nevtralno pufran formalin.
Effects of waterborne exposure to 17β-estradiol on secondary sex characteristics and gonads of the fathead minnow (Pimephales promelas).
V tem primeru se preostalo telo z rezilom (rdeča) prereže med anteriornim delom predrepne plavuti in anusom, sprednji del ribe se vstavi v raztopino za fiksiranje spolnih žlez, zadnji del ribe pa se vstavi v 10-odstotni nevtralno pufran formalin.
Villeneuve and G.T.
Bradavičasti podaljški se običajno pojavijo le pri odraslih samcih na plavutnicah, in sicer od druge do sedme ali osme s posteriornega konca predrepne plavuti (sliki 1 in 2).
Ankley.
Vendar se podaljški redko pojavijo na prvi plavutnici s posteriornega konca predrepne plavuti.
Abbreviations & definitions
Ta standardni delovni postopek zajema meritev podaljškov na prvi plavutnici (v tem standardnem delovnem postopku se številka plavutnice nanaša na zaporedje od posteriornega konca predrepne plavuti).
Chemical
Priporočeni postopki odvzema vzorcev za analizo vitelogenina
A substance or a mixture
Preprečiti je treba navzkrižno onesnaženje med vzorci VTG samcev in samic.
Coefficient of variation.
Postopek 1A:
Loading rate
Po anesteziji se repno steblo delno prereže z rezilom skalpela, pri čemer se kri odvzame iz repne vene/arterije s heparinizirano mikrohematokritsko kapilarno cevko.
Wet weight of fish per volume of water.
Ko je kri odvzeta, se plazma hitro izolira s 3-minutnim centrifugiranjem pri 15000 g (ali namesto tega 10 minut pri 15000 g in 4 °C).
Stocking density
Po želji se lahko po centrifugiranju določi odstotek hematokrita.
Number of fish per volume of water.
Delež plazme se nato odstrani iz mikrohematokritske cevke in shrani v centrifugirki z 0,13 enotami aprotinina (inhibitor protaze) pri – 80 °C, dokler ni mogoče določiti vitelogenina.
VTG (Vitellogenin)
Odvzete količine plazme so običajno od 5 do 60 mikrolitrov na ribo, odvisno od velikost črnoglavega pisanca (ki je odvisna od spola) (Jensen idr., 2001).
Phospholipoglycoprotein precursor to egg yolk protein that normally occurs in sexually active females of all oviparous species.
Postopek 1B:
HPG axis
Črnoglavi pisanec, odvzem krvi iz srca
Hypothalamic-pituitary-gonadal axis.
Namesto tega se lahko kri odvzame tudi s srčno punkcijo s heparinizirano brizgo (1000 enot heparina na ml).
MTC
Kri se prenese v mikroepruvete (shranjene na ledu) in nato centrifugira (5 minut, 7000 g, sobna temperatura).
Maximum Tolerated Concentration, representing about 10 % of the LC50.
Plazmo je treba prenesti v čiste mikroepruvete (v alikvotih, če količina plazme to omogoča) in takoj zamrzniti pri – 80 °C, dokler se ne analizira (Panter idr., 1998).
Experimental conditions for the fish endocrine screening assay
Postopek 2A:
Recommended species
Japonska medaka, odstranitev jeter pri medaki
Fathead minnow
Odstranitev preskusne ribe iz preskusne komore
(Pimephales promelas)
Preskusno ribo je treba iz preskusne komore odstraniti z lovilno mrežico.
Medaka (Oryzias latipes)
Paziti je treba, da preskusna riba ne pade v druge preskusne komore.
Zebrafish
Načeloma je treba preskusne ribe odstraniti po naslednjem vrstnem redu:
Test type
kontrola, kontrola s topilom (če je primerno), najnižja koncentracija, srednja koncentracija, najvišja koncentracija in pozitivna kontrola.
Flow-through
Poleg tega je treba odstraniti vse samce iz ene preskusne komore, preden se odstranijo preostale samice.
Water temperature
Spol posamezne preskusne ribe se določi na podlagi zunanjih spolnih značilnosti (npr. oblike predrepne plavuti).
Illumination quality
Preskusna riba se vstavi v posodo za prenos in prenese na delovno postajo za odstranitev jeter.
Fluorescent bulbs (wide spectrum)
Preveri se, ali so oznake preskusne komore in posode za prenos točne ter potrdi, da sta število rib, ki so bile odstranjene iz preskusne komore, in število rib, ki ostanejo v preskusni komori, skladni s pričakovanji.
Light intensity 10-20 μE/m2/s, 540-1000 lux, or 50-100 ft-c (ambient laboratory levels)
Če spola ni mogoče določiti na podlagi zunanjega videza rib, se odstranijo vse ribe iz preskusne komore.
10-20 μE/m2/s, 540-1000 lux, or 50-100 ft-c (ambient laboratory levels)
V tem primeru je treba spol določiti z opazovanjem spolnih žlez ali sekundarnih spolnih značilnosti pod stereomikroskopom.
Photoperiod (dawn/dusk transitions are optional, however not considered necessary)
Odstranitev jeter
16 h light, 8 h dark
Preskusna riba se iz posode za prenos prenese v raztopino za anestezijo z lovilno mrežico.
12-16 h light, 12-8 h dark
Ko je preskusna riba anestezirana, se prenese na filtrirni papir (ali papirnato brisačo) s pinceto (za splošno rabo).
< 5 g per l
S pinceto se prime glava preskusne ribe, da se prepreči poškodba repa.
Test chamber size
S površine preskusne ribe na filtrirnem papirju (ali papirnati brisači) se obriše voda.
10 l (minimum)
Nato se z majhnimi secirnimi škarjami naredi majhen prečni rez na sredini med ventralnim delom vratu in srednjim trebušnim delom.
2 l (minimum)
V majhen rez se vstavijo secirne škarje, s katerimi se zareže v trebuh od točke pod škržnim plaščem do kranialne strani anusa po sredini trebuha.
5 l (minimum)
Paziti je treba, da se secirne škarje ne vstavijo pregloboko, s čimer se prepreči poškodba jeter in spolnih žlez.
Test solution volume
Pod stereomikroskopom se izvedejo naslednji postopki.
8 l (minimum)
Preskusna riba se s trebušno stranjo navzgor postavi na papirnato brisačo (na voljo je tudi petrijevka ali objektno stekelce).
l (minimum)
Stene trebušne votline se razprejo z natančno pinceto, notranji organi pa se eksteriorizirajo.
4 l (minimum)
Po potrebi je sprejemljiva tudi eksteriorizacija notranjih organov z odstranitvijo ene strani stene trebušne votline.
Volume exchanges of test solutions
Z drugo natančno pinceto se izpostavijo jetra in žolčnik.
Minimum of 6 daily
Nato se prime žolčni vod in odreže žolčnik.
Minimum of 5 daily
Paziti je treba, da se žolčnik ne poškoduje.
Age of test organisms See paragraph 20
Na enak način se prime požiralnik in odstrani prebavni trakt.
See paragraph 20
Paziti je treba, da iz prebavnega trakta ne uide vsebina.
See paragraph 20 12.
Odstranita se repni prebavni trakt iz anusa in trakt iz trebušne votline.
Approximate wet weight of adult fish (g) Females:
Z obrobja jeter se odrežeta masa maščobe in drugo tkivo.
1,5 ± 20 %
Paziti je treba, da se jetra ne opraskajo.
Males:
Z natančno pinceto se prime jetrno portalno polje, jetra pa se odstranijo iz trebušne votline.
2,5 ± 20 %
Jetra se položijo na objektno stekelce.
Females:
Po potrebi se s površine jeter z natančno pinceto odstranita vsa dodatna maščoba in nepomembno tkivo (npr. notranja plast trebušne votline).
0,35 ± 20 %
Teža jeter se izmeri s tarirano 1,5-mililitrsko mikroepruveto z uporabo elektronske analitske tehtnice.
0,65 ± 20 %
Vrednost se zabeleži na delovnem listu (odčitek: 0,1 mg).
0,4 ± 20 %
Potrdijo se identifikacijski podatki na nalepki mikroepruvete.
No. of fish per test vessel
Pokrov mikroepruvete z jetri se zapre.
6 (2 males and 4 females)
Shrani se na rešetki za hlajenje (ali rešetki za zamrzovanje).
10 (5 males and 5 females)
Po odstranitvi enih jeter se instrumenti za seciranje očistijo ali nadomestijo s čistimi.
No. of treatments
Jetra se iz vseh rib v posodi za prenos odstranijo, kot je opisano zgoraj.
= 3 (plus appropriate controls)
Ko se odstranijo jetra iz vseh rib v posodi za prenos (tj. vseh samcev ali samic v preskusni komori), se vsi vzorci jeter postavijo na rešetko za epruvete z identifikacijsko nalepko in shranijo v zamrzovalniku.
No. vessels per treatment
Če se jetra donirajo za predhodno tretiranje kmalu po odstranitvi, se vzorci prenesejo na naslednjo delovno postajo na rešetki za hlajenje (ali rešetki za zamrzovanje).
4 minimum
Po odstranitvi jeter je telo ribe na voljo za meritev sekundarnih spolnih značilnosti.
2 minimum
Vzorec
No. of fish per test concentration
Vzorci jeter, odvzeti pri preskusnih ribah, se shranijo pri ≤ –70 °C, če se ne uporabijo za predhodno tretiranje kmalu po odstranitvi.
16 adult females and 8 males (4 females and 2 males in each replicate vessel)
Rez se s škarjami naredi neposredno anteriorno na prsno plavut.
10 adult females and 10 males (5 females and 5 males in each replicate vessel)
Slika 2
Feeding regime
V srednjo črto trebuha se s škarjami zareže do točke, ki se nahaja približno 2 mm kranialno na anus.
Live or frozen adult or nauplii brine shrimp two or three times daily (ad libitum), commercially available food or a combination of the above
Slika 3
Brine shrimp nauplii two or three times daily (ad libitum), commercially available food or a combination of the above
Trebušne stene se razširijo s prijemalkami, da se izpostavijo jetra in drugi notranji organi.
None unless DO concentration falls below 60 % air saturation
(Namesto tega se lahko trebušne stene pripnejo s strani.)
Clean surface, well or reconstituted water or dechlorinated tap water
Slika 4
Pre-exposure period
Jetra se neposredno secirajo in odstranijo s prijemalkami.
7 days recommended
Slika 5
Chemical exposure duration
Črevesje se s prijemalkami nežno umakne.
Biological endpoints
Slika 6
survival
Oba konca črevesja in vse pritrditve mezenterija se odrežejo s škarjami.
behaviour
Slika 7 (samica)
sex characteristics
Postopek je enak za samico.
VTG
Slika 8
Test acceptability
Končan postopek.
Dissolved oxygen > 60 % of saturation;
Postopek 2B:
mean temperature of 25 ± 2 °C;
Japonska medaka (Oryzias latipes), predhodno tretiranje jeter za analizo vitelogenina
90 % survival of fish in the controls;
Iz kompleta za metodo ELISA se vzame steklenica pufra za homogenat in ohladi z zdrobljenim ledom (temperatura raztopine: ≤ 4 °C).
measured test concentrations within 20 % of mean measured values per treatment level.
Če se uporabi pufer za homogenat iz sistema EnBio ELISA, se raztopina odtaja pri sobni temperaturi, nato pa se steklenica ohladi z zdrobljenim ledom.
mean temperature of 24 ± 2 °C;
Količina pufra za homogenat za jetra se izračuna na podlagi njihove teže (za homogenat se na miligram teže jeter doda 50 μl homogenata).
mean temperature of 26 ± 2 °C;
Če jetra tehtajo na primer 4,5 mg, je količina pufra za homogenat za jetra 225 μl.
Some chemical characteristics of acceptable dilution water
Za vsa jetra se pripravi seznam količin pufra za homogenat.
< 20 mg/l
Priprava jeter za predhodno tretiranje
< 2 mg/l
Neposredno pred predhodnim tretiranjem se iz zamrzovalnika vzame 1,5-mililitrska mikroepruveta z jetri.
Total organophosphorus pesticides
Jetra samcev je treba predhodno tretirati pred jetri samic, da se prepreči onesnaženje vitelogenina.
Appendix 4A
Poleg tega je treba preskusne skupine predhodno tretirati po naslednjem vrstnem redu:
Spawning substrate for zebrafish
Število 1,5-mililitrskih mikroepruvet z vzorci jeter, vzetih iz zamrzovalnika ob danem času, ne sme presegati števila, ki se lahko hkrati centrifugira.
Spawning tray
Na rešetki za zamrzovanje se 1,5-mililitrske mikroepruvete z vzorci jeter razporedijo glede na številko vzorca (jeter ni treba odtajati).
all glass instrument dish, for example 22 × 15 × 5,5 cm (l × w × d), covered with a removable stainless steel wire lattice (mesh width 2 mm).
Izvedba predhodnega tretiranja
The lattice should cover the opening of the instrument dish at a level below the brim.
Dodajanje homogenizacijskega pufra
On the lattice, spawning substrate should be fixed.
Na seznamu se preveri količina pufra za homogenat, ki ga je treba uporabiti za posamezen vzorec jeter, mikropipeta pa se nastavi (razpon količine: 100–1000 μl) na ustrezno količino.
It should provide structure for the fish to move into.
Na mikropipeto se namesti čista konica.
For example, artificial aquaria plants made of green plastic material are suitable (NB: possible adsorption of the test chemical to the plastic material should be considered).
Pufer za homogenat se vzame iz steklenice za reagent in doda v 1,5-mililitrsko mikroepruveto z jetri.
The plastic material should be leached out in sufficient volume of warm water for sufficient time to ensure that no chemicals may be disposed to the test water.
Pufer za homogenat se v skladu z zgoraj opisanim postopkom doda v vse 1,5-mililitrske mikroepruvete z jetri.
When using glass materials it should be ensured that the fish are neither injured nor cramped during their vigorous actions.
Konice mikropipete ni treba zamenjati z novo.
The distance between the tray and the glass panes should be at least 3 cm to ensure that the spawning is not performed outside the tray.
Če je konica onesnažena ali bi lahko bila onesnažena, jo je treba zamenjati.
The eggs spawned onto the tray fall through the lattice and can be sampled 45-60 min after the start of illumination.
Homogenizacija jeter
The transparent eggs are non-adhesive and can easily be counted by using transversal light.
Na homogenizator mikroepruvete se namesti novo pestilo.
When using five females per vessel, egg numbers up to 20 at a day can be regarded as low, up to 100 as medium and more than 100 as high numbers.
Pestilo se vstavi v 1,5-mililitrsko mikroepruveto.
The spawning tray should be removed, the eggs collected and the spawning tray re-introduced in the test vessel, either as late as possible in the evening or very early in the morning.
Homogenizator mikroepruvete se drži tako, da stisne jetra med površino pestila in notranjo steno 1,5-mililitrske mikroepruvete.
The time until re-introduction should not exceed one hour since otherwise the cue of the spawning substrate may induce individual mating and spawning at an unusual time.
Homogenizator mikroepruvete mora delovati od 10 do 20 sekund.
If a situation needs a later introduction of the spawning tray, this should be done at least 9 hours after start of the illumination.
Med delovanjem se 1,5-mililitrska mikroepruveta ohlaja z zdrobljenim ledom.
At this late time of the day, spawning is not induced any longer.
Pestilo se dvigne iz 1,5-mililitrske mikroepruvete in približno 10 sekund pusti počivati.
Appendix 4B
Nato se izvede vizualni pregled stanja suspenzije.
Spawning substrate for fathead minnow
Če se v suspenziji opazijo deli jeter, se ponovita koraka (3) in (4), da se pripravi zadovoljiv homogenat jeter.
Two or three combined plastic/ceramic/glass or stainless steel spawning tiles and trays are placed in each of the test chamber (e.g., 80 mm length of grey semi-circular guttering sitting on a lipped tray of 130mm length) (see picture).
Suspendirani homogenat jeter se do centrifugiranja hladi na rešetki za zamrzovanje.
Properly seasoned PVC or ceramic tiles have demonstrated to be appropriate for a spawning substrate (Thorpe et al, 2007).
Za vsak homogenat se pestilo zamenja z novim.
It is recommended that the tiles are abraded to improve adhesion.
Vsa jetra se homogenizirajo s pufrom za homogenat v skladu z zgoraj opisanim postopkom.
The tray should also be screened to prevent fish from access to the fallen eggs unless the egg adhesion efficiency has been demonstrated for the spawning substrate used.
Centrifugiranje suspendiranega homogenata jeter
The base is designed to contain any eggs that do not adhere to the tile surface and would therefore fall to the bottom of the tank (or those eggs laid directly onto the flat plastic base).
Temperatura ohlajene komore za centrifugiranje se potrdi pri ≤ 5 °C.
All spawning substrates should be leached for a minimum of 12 hours, in dilution water, before use.
V ohlajeno centrifugo se vstavijo 1,5-mililitrske mikroepruvete s suspendiranim homogenatom jeter (po potrebi se prilagodi ravnotežje).
Appendix 5A
Suspendirani homogenat jeter se 10 minut centrifugira pri 13000 g in ≤ 5 °C.
Assessment of secondary sex characteristics in fathead minnow for the detection of certain endocrine active chemicals
Če pa so supernatanti ustrezno ločeni, se lahko sila in čas centrifugiranja po potrebi prilagodita.
Overview
Po centrifugiranju se preveri, ali so supernatanti ustrezno ločeni (vrhnja plast: lipid, srednja plast: supernatant, spodnja plast: jetrno tkivo).