natgillin/translations-raw huggingface dataset:
DNA extraction
Cele ribe se lahko transportirajo v laboratorij, če so med transportom izpolnjene zahteve glede temperature, kot je opisano v odstavku 3 te točke.
The commercially available DNA extraction kits that produce high quality DNA suitable for use with the PCR protocols referred to in point I.2 may be used.
Lahko se pošljejo tudi žive ribe, vendar le pod nadzorom nacionalnega referenčnega laboratorija za bolezni rib in ob upoštevanju dodatnega razkuževanja in vprašanj biološke zaščite pri transportu živih rib.
Agent detection and identification by Polymerase chain reaction (PCR) based methods
Vzorci krvi in epruvete, ki vsebujejo ribja tkiva za virološko preiskavo ali analizo RT-PCR, se dajo v izolirne posode, na primer polistirenske škatle z debelimi stenami, z dovolj ledu ali z zamrzovalnimi elementi za zagotovitev hlajenja vzorcev med transportom v laboratorij.
I.2.1. qPCR for KHV detection
Prepreči se zamrzovanje, pri sprejemu pošiljke pa mora v transportnem škatli še vedno ostati led oz. en ali več zamrzovalnih elementov mora biti še vedno delno ali popolnoma zamrznjen.
For qPCR detection of KHV, the following qPCR assay shall be used:
V izjemnih okoliščinah se lahko vzorci za RT-PCR in vzorci za virološke preiskave zamrznejo in transportirajo v laboratorij pri – 20 °C ali manj.
Forward primer (KHV-86f): 5′- GACGCCGGAGACCTTGTG -3′;
Za analizo tkiv z RT-PCR, ohranjenih v ribonukleinski kislini (RNA)later, se RNK ekstrahira v naslednjih časovnih okvirih, odvisno od temperature shranjevanja vzorcev:
Reverse primer (KHV-163r): 5′- CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT -3′;
vzorci, shranjeni pri – 20 °C: neomejeno.
and probe (KHV-109p): 5′-FAM- CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG -3′.
Če se ribja tkiva transportirajo v fiksirni raztopini za histološko preiskavo, se pošljejo v zatesnjenih epruvetah v posodah, odpornih na udarce.
Cycling conditions: one cycle of 95 °C at 15 minutes, followed by 40 cycles of 94 °C at 15 seconds and 60 °C for 60 seconds.
Prepreči se zamrznitev navedenih vzorcev.
However, other qPCR versions of proven similar efficacy may be used instead.
Na podlagi odobritve diagnostičnega laboratorija se lahko zberejo druga ribja tkiva kot tkiva iz točke I.1 in pripravijo za dodatno preiskavo.
Conventional PCR for KHV detection
Natančne diagnostične metode in postopki za nadzor in potrditev prisotnosti ali izključitev suma na ISA
The assay described in this point targeting the Thymine kinase (TK) gene of KHV shall be used.
Pri laboratorijskih preiskavah za namene pridobitve ali ohranitve določenega zdravstvenega statusa glede ISA, kot je določeno v oddelku I dela 3 Priloge I, ali za namene potrditve prisotnosti ali izključitve suma na ISA v skladu s členom 57(b) Direktive 2006/88/ES z diagnostičnimi metodami iz oddelka II dela 3 Priloge I se uporabljajo natančne metode in postopki iz naslednjih točk od II.1 do II.5.
However, other PCR assays with demonstrated similar sensitivities and specificities to the described assay may be used instead.
1 Pregled vzorcev z RT-PCR
Forward primer (KHV-TKf): 5′-GGGTTACCTGTAC GAG-3′;
Diagnostična metoda, ki se uporablja za presejalni test za ISAV je RT-qPCR.
Reverse primer (KHV-TKr): 5′-CACCCAGTAGATTA TGC-3′.
Rezultati RT-qPCR se lahko razlikujejo glede na pogoje, pod katerimi se test izvaja, zato se v izogib dvomom vključijo ustrezne pozitivne in negativne kontrole ter amplikoni.
Cycling conditions: one cycle of 95 °C for 5 minutes followed by 35 cycles of 95 °C for 30 seconds, 52 °C for 30 seconds, 72 °C for one minute and one cycle of 72 °C for 10 minutes.
Ekstrakcija celotne RNK
Product size should be 409 bp.
Celotna RNK se ekstrahira z metodo s fenol-kloroformom ali centrifugalnimi kolonami za afiniteto do RNK v skladu z navodili proizvajalca.
Furthermore, false-positive results may occur because of false primer annealing or contamination.
Prečiščena RNK se ponovno suspendira v destilirani RNaz prosti vodi (tj. v vodi, tretirani z 0,1-odstotnim dietil pirokarbonatom).
However, other PCR versions of proven similar efficacy may be used instead.
Koncentracija in čistost ekstrahirane RNK se oceni z merjenjem optične gostote pri 260 nm in 280 nm.
The first detection in an area shall be confirmed by sequencing or sent to a to a national reference laboratory or to the EU reference laboratory for fish diseases referred to in Annex VI to Directive 2006/88/EC, for immediate identification.
Alternativni pristop je vključitev notranjih kontrol, ki so ciljno usmerjene v virusni genom iz točke II.1.3.
Detailed diagnostic methods and procedures for the surveillance of KHVD
RT-PCR za dokazovanje ISAV
When sampling and laboratory examination for the purpose of obtaining or maintaining certain health statuses with regard to KHVD as set out in Section I of Part 2 of Annex I are carried out using the diagnostic methods set out in Sections II or III of Part 2 of that Annex, the detailed diagnostic methods and procedures set out in the following points II.1 and II.2 of this Part shall apply.
Za amplifikacijo genoma ISAV se lahko uporablja več metod RT-PCR.
If possible, fish that have been kept for a prolonged time period at the virus permissive temperature range (namely, 2 to 3 weeks at 15 °C to 26 °C) shall be sampled.
Dvostopenjska RT-PCR se lahko izvede z reakcijama RT in PCR v dveh ločenih epruvetah.
If possible, samples shall be collected 24 hours but not later than 72 hours after management practices that may reactivate the virus in fish with a carrier status, such as netting or transport, in order to enhance the chance of KHV detection.
Lahko pa se izvede tudi enostopenjska reakcija z dvema reakcijama v eni epruveti.
For the purpose of the surveillance of KHVD, the fish may be sent alive or killed and packed separately in sealed aseptic containers or alternatively frozen organs or organ pieces preserved in 80 % to 100 % alcohol or viral transport medium (to be processed within 48 hours after collection) may be used for testing PCR based methods.
Enostopenjska metoda se uporabi, kadar je to mogoče, ker test z eno epruveto zmanjša tveganje navzkrižne kontaminacije, saj ni potreben prenos vsebine, in ker se šteje za enako občutljivo kot dvostopenjska metoda.
For the surveillance of KHVD, gill and kidney tissue shall be collected.
Uporabijo se začetna oligonukleotida in test iz te točke, in sicer par začetnih oligonukleotidov ILA1 ali ILA2, ki sta ciljno usmerjena v segment 8 in ki sta se izkazala za primerna za dokazovanje ISAV pri izbruhih in v ribah nosilkah.
For the purpose of surveillance of KHVD, pooling shall be avoided where possible.
Protismiselni začetni oligonukleotid ILA2 ne ustreza izolatom iz Severne Amerike, zato se v teh primerih uporabi alternativni komplet začetnih oligonukleotidov.
If pooling is necessary, tissue material from a maximum of two fish may be pooled.
Smiselni začetni oligonukleotid (ILA1): 5′-GGCTATCTACCATGAACGAATC-3′;
Larger samples shall be homogenised in mortar and pestle or stomacher, and subsamples retrieved for DNA extraction before clarification.
Protismiselni začetni oligonukleotid (ILA2): 5′-GCCAAGTGTAAGTAGCACTCC-3′.
Alternatively, subsamples may be collected from each tissue included in the sample and placed in ‘lysis-tubes’.
Pogoji pomnoževanja: en cikel po 30 minut pri 50 °C, 1 cikel po 15 minut pri 94 °C, 40 ciklov po 30 sekund pri 94 °C, 30 sekund pri 55 °C, 60 sekund pri 72 °C; en cikel po 5 minut pri 72 °C. Velikost produkta je 155 bp.
Commercially available DNA extraction kits that produce high quality DNA suitable for use with the PCR protocols set out in point II.2 may be used.
Namesto tega se lahko uporabijo druge različice testa RT-PCR z dokazano podobno učinkovitostjo.
The acceptable tissue medium ratio shall be 1:9 w/v.
RT-qPCR za dokazovanje ISAV
20 to 25 mg tissue material shall be included in the tests.
Uporaba RT-qPCR morda lahko poveča specifičnost in verjetno tudi občutljivost.
Surveillance of KHVD by PCR based methods
Ta metoda se lahko izvede hitreje, ker ni potrebna gelska elektroforeza, zmanjšuje pa tveganje navzkrižne kontaminacije, saj je možno oceniti količino virusne genomske RNK v epruveti z vzorcem.
For the surveillance of KHV, a qPCR shall be used.
Pomanjkljivost testa RT-qPCR je, da pogosto ni mogoče sekvencirati amplificiranih pridelkov.
If positive samples appear in an area not previously confirmed positive, the test results shall be confirmed either:
Če pa obstaja dvom o specifičnosti amplificiranega pridelka, je treba za potrditev rezultata izvesti drug specifičen test za ISAV.
by sequencing of a PCR or nested PCR product from the samples.
Uporabi se test, ki je opisan v tej točki in je ciljno usmerjen v segment 8.
The obtained clean consensus sequence shall match (by at least 98 %) with these reference sequences.
Ta test zajema izolate iz Evropske unije, Evropskega združenja za prosto trgovino in Severne Amerike.
or alternatively, samples may be sent to a national reference laboratory for confirmation.
Enostopenjska metoda se uporabi, kadar je to mogoče, ker test z eno epruveto zmanjša tveganje navzkrižne kontaminacije.
qPCR for KHV detection
Smiselni začetni oligonukleotid: 5′- CTACACAGCAGGATGCAGATGT -3′;
The qPCR described as follows shall be used:
Protismiselni začetni oligonukleotid: 5′- CAGGATGCCGGAAGTCGAT -3′;
The results of the qPCR may vary depending on the conditions under which it is performed, namely the thermal protocols might need optimisation, depending on the thermal cycler in use.
Pogoji pomnoževanja: en cikel po 30 minut pri 50 °C, en cikel po 15 minut pri 95 °C, 40 ciklov po 15 sekund pri 94 °C, 60 sekund pri 60 °C; po potrebi se prilagodi.
Conventional PCR for confirmation of KHV detection
Sekvenciranje amplificiranih pridelkov reakcije PCR
For confirmation of the presence of infection with KHV, the generic nested PCR described in the following Table 2.1 shall be used followed by sequencing of the amplified product.
Smiselni začetni oligonukleotid (ILAs6-3F): 5′-ATGAGGGAGGTAGCATTGCA -3′;
Table 2.1
Protismiselni začetni oligonukleotid (ILAs6-2R): 5′-CATGCTTTCCAACCTGCTAGGA -3′.
Primers and conditions for the nested PCR assay targeting all cyprinid herpesviruses (CyHV-1, CyHV-2 and CyHV-3)
Pogoji pomnoževanja (enostopenjska RT-PCR): en cikel po 30 minut pri 50 °C, en cikel po 15 minut pri 94 °C, 40 ciklov po 30 sekund pri 94 °C, 30 sekund pri 55 °C, 60 sekund pri 72 °C, en cikel po 5 minut pri 72 °C; po potrebi se prilagodi.
Primer name
Kot alternativa se lahko uporabi naslednja metoda za sekvenciranje HPR v segmentu 6:
Sequence
smiselni začetni oligonukleotid: 5′-GAC-CAG-ACA-AGC-TTA-GGT-AAC-ACA-GA-3′;
Cycling conditions
protismiselni začetni oligonukleotid: 5′-GAT-GGT-GGA-ATT-CTA-CCT-CTA-GAC-TTG-TA-3′.
First round PCR
Čistost amplificiranega pridelka reakcije RT-PCR se preveri z gelsko elektroforezo pred sekvenciranjem.
1 cycle:
Če se pojavi samo en čisti odsek, se prečisti neposredno iz reakcije PCR.
40 cycles:
Odseki reakcije PCR iz raztopin ali agaroznih gelov se prečistijo z uporabo centrifugalnih kolon za afiniteto do odsekov reakcije PCR v skladu z navodili proizvajalca.
95 °C for 30 seconds
Sekvenciranje se izvede z uporabo začetnih oligonukleotidov za amplificiranje v zunanjih specializiranih podjetjih za sekvenciranje.
55 °C for 30 seconds
Rezultati se analizirajo z iskalnim orodjem BLAST, sekvence pa se primerjajo z drugimi znanimi sekvencami iz podatkovne baze nukleotidov nacionalnega centra ZDA za biotehnične informacije (US National Centre for Biotechnical Information – NCBI).
72 °C for 45 seconds
S sekvenciranjem je treba odpraviti vse dvome o specifičnosti amplificranega pridelka reakcije RT-PCR.
72 °C for 10 minutes
2 Izolacija ISAV na celičnih kulturah
CyHVpol-reverse
Priprava vzorcev
CyHVpol-internal forward
Tkivo se lahko hrani pri – 80 °C.
Second round PCR
Tkivo se zamrzne in odmrzne samo enkrat pred preiskavo.
95 °C 2 minutes,
Za namene nadzora in kontrole se preiskava opravi čim hitreje.
CyHVpol-internal reverse
Vsak vzorec (združeno tkivo v transportni raztopini) se popolnoma homogenizira, pri čemer se uporabi potrjen homogenizator, centrifugiran 15 minut na 2000 × g do 4000 × g pri 0 °C do 6 °C, supernatant pa se filtrira (0,45 μm) in inkubira z enako količino primerno razredčenih združenih protiserumov proti avtohtonim serotipom virusa IPNV.
PCR versions of proven similar efficacy may be used instead.
Titer protiseruma mora biti vsaj 1: 2000 pri nevtralizacijskem testu 50-odstotne redukcije plakov.
Sequencing may be performed by the laboratory or at external specialised sequencing companies.
Mešanica se inkubira eno uro pri 15 °C.
Sequencing results shall be analysed by aligning the sequences to the known reference sequences of KHV (Gen Bank accession numbers AP008984, DQ657948 and DQ177346).
To predstavlja inokulum.
The obtained clean consensus sequence must match at least to 98 % with those reference sequences.
Namen tretiranja vseh inokulumov s protiserumom proti virusu nalezljive nekroze trebušne slinavke (virus, ki se v nekaterih delih Evrope pojavlja pri 50 % vzorcev rib) je preprečiti razvoj citopatskega efekta (CPE) zaradi virusa IPN na inokuliranih celičnih kulturah.
DETAILED DIAGNOSTIC METHODS AND PROCEDURES FOR THE SURVEILLANCE AND CONFIRMATION OF INFECTIOUS SALMON ANEMIA (ISA)
Takšno tretiranje se lahko opravi za skrajšanje viroloških preiskav in zmanjšanje števila primerov, pri katerih bi bilo treba pojav CPE šteti za potencialni znak ISAV.
I. Sampling procedures for the surveillance and control of ISA
Ko vzorci prihajajo iz proizvodnih enot, ki veljajo za proste IPN, se tretiranje inokulumov s protiserumom proti virusu IPN lahko izpusti.
When sampling and laboratory examination are carried out, for the purpose of the surveillance or eradication programmes set out in Part 3 of Annex I or to confirm or rule out the presence of ISA in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC, the detailed methods and procedures set out in points I.1, I.2 and I.3 of this Section shall apply.
Inokulacija celičnih kultur
For the purpose of laboratory examination for the presence of ISA, fish samples shall not be pooled where possible.
Za izolacijo primarnega ISAV se uporabijo celice ledvic atlantskega lososa (ASK).
However, for the purpose of surveillance for ISA, the pooling of 2 to be 5 fish is accepted.
Uporabijo se lahko druge celične linije z dokazano učinkovitostjo in občutljivostjo pri izolaciji ISAV, ob upoštevanju variabilnosti sevov in sposobnosti različnih sevov, da se replicirajo v različnih celičnih linijah.
Samples for Reverse Transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis shall be taken from all of the fish sampled.
Videti je, da celice ASK podpirajo izolacijo in rast doslej znanih izolatov virusov, dokler se uporablja nizka raven pasaže.
A piece of mid-kidney shall be removed from the fish using a sterile instrument and transferred to a microfuge tube containing one ml RNA preservative solution of proven efficacy.
Pri celicah ASK se lahko pojavi bolj izrazit citopatski efekt (CPE) kot pri drugih dovzetnih celičnih linijah, kot je SHK-1 (predledvice lososa (Salmon head kidney-1)).
The weight of tissue in one sample shall be 0,5 g.
S protiserumom obdelana suspenzija organov se inokulira v mlade celične kulture v fazi aktivne rasti za pridobitev končnega razredčenega tkivnega materiala na gojišču s kulturami 1: 1000.
When the fish are too small to obtain a sample of the required weight, pieces of kidney, heart, spleen, liver or pyloric caeca may be taken, in that order of preference, to make up 0,5 g.
Za vsak organ se v eno jamico, ki vsebuje 2 ml gojišča s kulturami, doda suspenzija 40 μl inokuluma.
Tissue for histological examination shall only be taken from freshly killed fish with a normal constitution, exhibiting clinical signs or post-mortem findings consistent with the presence of ISA.
Za zmanjšanje tveganja navzkrižne kontaminacije se za vzorce iz različnih gojilnic uporabijo ločene 12- ali 24-jamične mikrotitrske plošče.
Any external or internal lesions shall be sampled and in any case samples of mid-kidney, heart, liver, pancreas, gut, gills and spleen shall be removed from individual fish using a scalpel and transferred to 8 % to 10 % (vol:vol) buffered formol saline.
Ena mikrotitrska plošča se ne inokulira, tako da se lahko uporabi kot negativna kontrola.
The ratio of fixative to tissue shall be at least 20:1 to ensure satisfactory preservation of the tissues.
Posebna mikrotitrska plošča se z referenčnim izolatom ISAV kot pozitivna kontrola inokulira na naslednji način.
For immunohistochemistry (IHC), samples from mid-kidney and heart shall be taken.
100 μl osnovnega pripravka ISAV (minimalni titer 107 50-odstotna infektivna doza (TCID50 ml– 1)) se inokulira v prvo jamico in premeša.
Tissues for virological examination on cell culture shall be taken from all of the fish sampled.
Količina tega materiala se prenese iz prve jamice v drugo za pridobitev razredčitve 1: 10 in premeša.
Pieces of the liver, anterior or mid-kidney, heart and spleen shall be removed from the fish using a sterile instrument and transferred to plastic tubes containing 9 ml transport medium.
To se ponovi po celotni mikrotitrski plošči za šest desetkratnih razredčitev.
Tissues from up to five fish may be collected in one tube containing transport solution and represent one pooled sample.
Osnovni pripravek ISAV se lahko shrani pri – 80 °C vsaj dve leti, ko pa je odmrznjen, ga je treba uporabiti v treh dneh.
The weight of tissue in one sample shall be 1,0 ± 0,5 g.
Paziti je treba, da se prepreči navzkrižna kontaminacija testnih mikrotitrskih plošč s pozitivnim kontrolnim materialom.
Shipment of samples from fish
V izogib navedenemu tveganju se pripravijo pozitivne kontrole, z njimi pa se ravna ločeno od testnih mikrotitrskih plošč.
Whole fish may be transported to the laboratory if the temperature requirements during transportation, as described in paragraph 3 of this point can be fulfilled.
Test občutljivosti celic ASK na izolate ISAV vsakih šest mesecev lahko nadomesti vključitev pozitivne kontrole pri vsaki inokulaciji.
Whole fish shall be wrapped in absorbent paper and shipped in a plastic bag, chilled as described in that paragraph.
Vzorce inkubiramo do 15 dni pri 15 °C ± 2 °C.
Live fish may also be shipped, but only under the supervision of the National reference laboratory for fish diseases and taking into account the additional disinfection and biosecurity issues when transporting live fish.
Celične kulture se dvakrat pregledajo pod mikroskopom na pojav CPE med 5. in 7. dnem ter med 12. in 14. dnem po inokulaciji.
Blood samples and tubes containing fish tissues for virological examination or RT-PCR analysis shall be placed in insulated containers, such as thick-walled polystyrene boxes, together with sufficient ice or freeze blocks to ensure chilling of the samples during transportation to the laboratory.
Če kateri koli združeni vzorec pokaže CPE, se takoj začne postopek za določitev virusa v skladu s točko II.2.4.
Freezing shall be avoided and ice must still be present in the transport box at receipt of the shipment or one or more of the ‘freeze blocks’ must still be partly or completely frozen.
Če se do 14. dneva CPE ne opazi, se opravi indirektni fluorescenčni test za dokazovanje protiteles (IFAT), hemadsorpcija ali RT-PCR.
In exceptional circumstances, RT-PCR samples and samples for virological examination may be snap-frozen and transported to the laboratory at – 20 °C or below.
Subkultivacija se opravi med 13. in 15. dnem.
For RT-PCR analysis of tissues preserved in Ribonucleic acid(RNA)later, RNA extraction shall be carried out within the following time frames depending on the temperature the samples are stored at:
Supernatant kulture se doda v jamice, ki vsebujejo sveže celice v fazi aktivne rasti v ustrezni razredčitvi (1/10) na mikrotitrskih ploščah, in inkubira do 18 dni pri 14 °C ± 2 °C.
samples stored at – 20 °C: indefinitely.
Celične kulture se dvakrat pregledajo pod mikroskopom na pojav CPE med 5. in 7. dnem ter med 14. in 18. dnem po inokulaciji.
If fish tissues are transported in fixative for histological examination, they shall be shipped in leak proof tubes in impact-resistant containers.
Če se do 14.– 18. dneva CPE ne opazi, se opravi hemadsorpcija ali RT-PCR.
Freezing of those samples shall be avoided.
Če se v prvih sedmih dneh inkubacije pojavi citotoksičnost, se v navedeni fazi opravi subkultivacija, celice se inkubirajo 14 do 18 dni in se ponovna subkultivacija z nadaljnjim obdobjem inkubacije 14–18 dni.
Subject to the approval of the diagnostic laboratory, fish tissues other than those referred to in point I.1 may be collected and prepared for supplementary examination.
Če se citotoksičnost pojavi po sedmih dneh, se subkultivacija opravi enkrat, celice pa se inkubirajo, da se doseže skupaj 28 do 36 dni inkubacije od primarne inokulacije.
Detailed diagnostic methods and procedures for the surveillance and for the confirmation of the presence of or to rule out the suspicion of ISA
Če se v primarni kulturi pojavi bakterijska kontaminacija, se test ponovno pripravi z uporabo homogenata, shranjenega pri – 80 °C.
When laboratory examination for the purpose of obtaining or maintaining a certain health status with regard to ISA as set out in Section I of Part 3 of Annex I, or for the purpose of the confirmation of the presence of or to rule out a suspicion of ISA in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC, are carried out, using the diagnostic methods set out in Section II of Part 3 of Annex I, the detailed methods and procedures set out in the following points II.1 to II.5 shall apply.
Pred inokulacijo se homogenat tkiva centrifugira 15 do 30 minut na 4000 × g pri 0 °C do 6 °C, supernatant pa se filtrira pri 0,22 μm.
Examination of samples by RT-PCR
Če se med subkultivacijo pojavi bakterijska kontaminacija, se supernatant filtrira pri 0,22 μm, inokulira na sveže celice in inkubira nadaljnjih 14 do 18 dni.
The diagnostic method to be used for the screening for ISAV shall be RT-qPCR.
Testi za določitev virusa
As the results of the RT-qPCR can vary depending on the conditions under which it is performed, adequate positive and negative controls and amplicons shall be included to avoid any doubts.
Če se v kateri koli fazi opazijo dokazi za CPE ali če je hemadsorpcija pozitivna, se izvede določanje virusa.
Total RNA extraction
Za določanje ISAV se izbereta RT-PCR v skladu s točko II.1 in imunofluorescenca (IF) v skladu s točko II.2.6.
Total RNA shall be extracted using the phenol-chloroform method or RNA affinity spin columns, according to the manufacturer's instructions.
Če obstaja sum na prisotnost drugih virusov, se izvedejo dodatni testi za določitev virusa.
Purified RNA shall be re-suspended in distilled RNase-free water (namely water treated with 0,1 % diethyl pyrocarbonate).
Če z navedenimi testi v enem tednu ni bilo možno dokončno določiti virusa, se supernatant za takojšnjo določitev pošlje:
The concentration and purity of the extracted RNA shall be estimated by measuring the optical density at 260 nm and at 280 nm.
referenčnemu laboratoriju za ISA Svetovne organizacije za zdravje živali (OIE) ali
An alternative approach may be to include internal controls targeted against the virus genome as referred to in point II.1.3.
nacionalnemu referenčnemu laboratoriju ali referenčnemu laboratoriju EU za bolezni rib, kot je določeno v Prilogi VI k Direktivi 2006/88/ES.
RT-PCR for ISAV detection
Hemadsorpcija
Several RT-PCR methods may be used for ISAV genome amplification.
Replikacija ISAV v celičnih kulturah ne privede vedno do CPE, zato se na vsaki jamici opravi RT-PCR ali hemadsorpcija v skladu s to točko ali imunofluorescenca v skladu s točko II.2.6.
A two-step RT-PCR may be performed whereby the RT and the PCR reactions steps are run in two separate tubes.
Gojišče celične kulture se odstrani iz vsake jamice, vključno s tistimi s pozitivnimi in negativnimi kontrolami, ter prenese v označene sterilne epruvete.
However, a one-step reaction, where the two reactions are run in one tube, may also be performed.
V vsako jamico se doda 500 μl 0,2-odstotne (vol:vol) suspenzije spranih eritrocitov kuncev ali konjev ali 0,05-odstotne (vol:vol) suspenzije spranih eritrocitov šarenk ali atlantskega lososa in inkubira 45 minut pri sobni temperaturi.