natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Block the plates with phosphate buffered saline (PBS) pH 7,2 + 5 % (w/v) skimmed milk (Nestlé Dry Skim MilkTM), 200 μl/well, for 1 hour at 37 °C.
V vdolbinice dodamo po 200 μl raztopine kromogena/substrata (10 ml 80,6 mM DMAB (dimetil aminobezaldehid) + 10 ml 1,56 mM MBTH (3-metil-2-benzo-tiazolin hidrazon hidroklorid) + 5 μl H2O2).
Remove the blocking solution and gently tap the plates onto absorbent material.
Razvijanje barve se ustavi z dodatkom 50 μl 3N H2SO4 po približno 5 do 10 minutah (preden se začne barvati negativna kontrola).
Test samples
Lahko se uporabijo tudi drugi kromogeni, kot so ABTS (2,2′-azino-bis-[3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kislina]), TMB (tetra-metil benzidin) ali OPD (orto-fenildiamin).
Serum samples to be tested, and positive and negative control sera, are diluted 1 in 25 in PBS + 5 % (w/v) skimmed milk + 0,05 % (v/v) Tween 20, 100 μl per well.
Plošče odčitamo pri 600 nm (ali 620 nm).
Incubate for 1 hour at 37 °C.
Interpretacija rezultatov
For titration, make a twofold dilution series from 1 in 25 (100 μl/well), one serum per plate column, and do the same with positive and negative controls.
Izračunamo mejno vrednost, tako da vrednosti negativne kontrole dodamo 0,06 (0,06 je standardna deviacija, dobljena s skupino 30 negativnih serumov).
Dispense 100 μl/well of horseradish-peroxidase (HRP) -conjugated anti-horse gamma-globulin diluted in PBS + 5 % milk + 0,05 % Tween 20, pH 7,2.
Preiskovani vzorci, ki dajo vrednosti absorbance višje od mejne vrednosti + 0,15, se obravnavajo kot pozitivni.
Chromogen/Substrate
Preiskovani vzorci, ki dajo vmesne vrednosti absorbance, se štejejo za neopredeljive,zato je potrebno za potrditev rezultata uporabiti drugo metodo.
Add 200 μl/well of chromogen/substrate solution (10 ml of 80,6 mM DMAB (dimethyl aminobenzaldehyde) + 10 ml of 1,56 mM MBTH (3-methyl-2-benzo-thiazoline hydrazone hydrochlorid) + 5 μl H2O2).
Blok ELISA za določanje protiteles proti virusu konjske kuge (VKK)
Colour development is stopped by adding 50 μl of 3N H2SO4 after approximately 5 to 10 minutes (before the negative control begins to be coloured).
Kompetitivni blok ELISA je namenjen določanju specifičnih protiteles proti VKK v serumu katere koli vrste enoprstih kopitarjev, tj. konjev, oslov, zeber in njihovih križancev, in preprečuje težave s specifičnostjo, ki se občasno pojavlja pri uporabi indirektne ELISA.
Other chromogens such as ABTS (2,2′-Azino-bis-[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid]), TMB (tetramethyl benzidine), or OPD (ortho-phenyldiamine) can also be used.
Princip testa je blokiranje reakcije med rekombinantnim proteinom VP7, absorbiranim na ploščo ELISA, in z konjugiranim specifičnim monoklonskim protitelesom VKK-VP7 (Mpt).
Read the plates at 600 nm (or 620 nm).
Protitelesa v preiskovanem serumu bodo preprečila reakcijo med antigenom in Mpt, kar bo povzročilo manjšo intenziteto obarvanja.
Interpretation of the results
Ker je Mpt prav tako usmerjeno proti VP7, je test visoko občutljiv in specifičen.
Calculate the cut-off value by adding 0,06 to the value of the negative control (0,06 is the standard deviation derived with a group of 30 negative sera).
Kompetitivni blok ELISA je na voljo na trgu.
Test samples giving absorbance values lower than the cut-off are regarded as negative.
Trdna faza
Test samples giving absorbance values greater than the cut-off + 0,15 are regarded as positive.
V ELISA plošče nanesemo 50–100 ng rekombinantnega VKK-4-VP7, razredčenega v karbonatnem/bikarbonatnem pufru, pH 9,6.
Test samples giving intermediate absorbance values are considered to be inconclusive and a second technique must be employed to confirm the result.
Inkubiramo čez noč pri 4 °C.
Blocking ELISA for the detection of antibodies to African horse sickness virus (AHSV)
Plošče trikrat speremo s fosfatnim pufrom (PBS) 0,1×, ki vsebuje 0,135 M NaCl in 0,05 % (volumski delež) Tween 20 (PBST).
The competitive blocking ELISA is designed to detect specific AHSV antibodies in sera from animals of any equine species, i.e. horses, donkeys, zebra and their crosses, preventing the problem of specificity experienced occasionally using the indirect ELISAs.
S ploščo nežno potolčemo po vpojnem materialu, da odstranimo ostanke spiralne tekočine.
The principle of the test is the blocking of the reaction between the recombinant VP7 protein absorbed to the ELISA plate and a conjugated AHS-VP7 specific monoclonal antibody (Mab).
Preiskovani vzorci in kontrole
Antibody in the test sera will block the reaction between the antigen and the Mab resulting in a reduction in colour.
Preiskovani serumski vzorci ter pozitivni in negativni kontrolni serum se redčijo 1: 5 v razredčilu, ki vsebuje 0,35 M NaCl, 0,05 % (volumski delež), Tween 20 in 0,1 % Kathon, 100 μl na vdolbinico.
Because the Mab is directed against the VP7, the assay will give a high level of sensitivity and specificity.
Za titracijo pripravimo serije dvakratnih razredčin preiskovanih serumov od 1: 10 do 1: 280 preko osmih vdolbinic (100 μl/vdolbinico), en vzorec seruma na stolpec plošče, isto naredimo s pozitivnim in negativnim kontrolnim serumom.
The competitive blocking ELISA is commercially available.
Inkubiramo 1 uro pri 37 °C.
Solid Phase
Plošče petkrat speremo s fosfatnim pufrom (PBS) 0,1×, ki vsebuje 0,135 M NaCl in 0,05 % (volumski delež) Tween 20 (PBST).
Coat ELISA plates with 50-100 ng of recombinant AHSV-4 VP7 diluted in carbonate/bicarbonate buffer, pH 9,6.
V vdolbinice dodamo po 100 μl anti-VP7 Mpt, označenega s hrenovo peroksidazo.
Incubate overnight at 4 °C.
Pred tem je bilo to Mpt razredčeno na 1/5000–1/15000 v 1/1 raztopini stabilizatorja StabiliZyme Select® (SurModics.
Wash the plates three times with phosphate buffered saline (PBS) 0,1× containing 0,135 M NaCl and 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST).
Referenca: SZ03) v destilirani vodi.
Gently tap the plates on to absorbent material to remove any residual wash.
Inkubiramo 30 minut pri 37 °C.
Test samples and controls
V vdolbinice dodamo po 100 μl raztopine kromogena/substrata, tj. 1 ml ABTS (2,2′-azino-bis-[3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kislina]) in 5 mg/ml + 9 ml substratnega pufra (0,1 M fosfatno-citratni pufer s pH 4, ki vsebuje 0,03 % H2O2) ter inkubiramo 10 minut pri sobni temperaturi.
Serum samples to be tested, and positive and negative control sera, are diluted 1 in 5 in diluent containing 0,35 M NaCl, 0,05 % (v/v) Tween 20 and 0,1 % Kathon, 100 μl per well.
Razvoj barve se ustavi z dodatkom 100 μl 2 % (utežni delež) SDS (natrijev dodecil sulfat) v vdolbinico.
For titration, make a twofold dilution series of the test sera from 1 in 10 to 1 in 280 across 8 wells (100 μl/well), one serum per plate column, and do the same with positive and negative controls.
Odčitavanje
Incubate for 1 hour at 37 °C.
V ELISA čitalcu odčitamo pri 405 nm.
Wash the plates five times with phosphate buffered saline (PBS) 0,1× containing 0,135 M NaCl and 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST).
Odstotek blokiranja (OB) v vsakem vzorcu določimo z uporabo naslednje enačbe, pri čemer „Pt“ pomeni protitelesa:
Dispense 100 μl/well of horseradish peroxidase-conjugated Mab anti-VP7.
Ptkontrola
In advance, this Mab has been diluted 1/5000-1/15000 in a 1/1 solution of StabiliZyme Select® Stabilizer (SurModics.
Ptvzorec
Reference: SZ03) in distilled water.
Vzorce, ki kažejo vrednost OB več kot 50 %, je treba obravnavati kot pozitivne na protitelesa proti VKK.
Incubate for 30 minutes at 37 °C.
Vzorce, ki kažejo vrednost OB manj kot 45 %, je treba obravnavati kot negativne na protitelesa proti VKK.
Add 100 μl/well chromogen/substrate solution, i.e. 1 ml of ABTS (2,2′-Azino-bis-[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid]) 5 mg/ml + 9 ml of substrate buffer (0,1 M Phosphate-Citrate buffer of pH 4 containing 0,03 % H2O2), and incubate for 10 minutes at room temperature.
Vzorce, ki kažejo vrednost OB med 45 % in 50 %, je treba obravnavati kot neopredeljive in jih je treba ponovno testirati.
Colour development is stopped by adding 100 μl/well of 2 % (w/v) SDS (sodium dodecyl sulphate).
Če je rezultat ponovno neopredeljiv, je treba živali ponovno testirati z vzorci, ki se ne odvzamejo prej kot dva tedna po odvzemu vzorca, ki je bil obravnavan kot neopredeljiv.
Reading
DEL B
Read at 405 nm in an ELISA reader.
Identifikacija povzročitelja
Determine the blocking percentage (BP) of each sample by applying the following formula, where “Abs” stands for antibodies:
Verižna reakcija s polimerazo z reverzno transkripcijo v realnem času (rRT-PCR)
Abscontrol
Testi za identifikacijo povzročitelja na osnovi metod z uporabo nukleinske kisline morajo zaznati referenčne seve iz devetih serotipov VKK.
Abssample
Metoda, opisana v točki 2.1, temelji na točki 1.2 oddelka B poglavja 2.5.1 Priročnika diagnostičnih testov in cepiv za kopenske živali, izdaja 2016, ki jo je maja 2012 sprejela generalna skupščina delegatov OIE.
Samples showing a BP value higher than 50 % should be considered as positive for AHSV antibodies.
Katera koli metoda RT-PCR za določanje, uporabljena pri testiranju vzorcev krvi ali vranice v okviru Direktive 2009/156/ES, mora biti enako ali bolj občutljiva od metod iz točke 2.
Samples showing a BP value lower than 45 % should be considered as negative for AHSV antibodies.
Referenčne seve inaktiviranih virusov serotipov 1 do 9 je mogoče pridobiti od referenčnega laboratorija Evropske unije ali referenčnega laboratorija OIE za konjsko kugo, Algete, Španija.
Samples showing a BP value between 45 % and 50 % should be considered as inconclusive and must be retested.
Ekstrakcija virusne RNK
If the result is again inconclusive, the animals should be retested on samples taken not earlier than two weeks after the sample which was considered to be inconclusive was taken.
Za zagotovitev dobre reakcije je treba iz vzorca ekstrahirati RNK VKK visoke kakovosti.
PART B
Ekstrakcija nukleinskih kislin iz kliničnih vzorcev se lahko izvaja z vrsto notranjih in komercialno dostopnih metod.
Identification of the agent
Komercialni kompleti uporabljajo različne pristope za izolacijo RNK.
Real-time Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction (rRT-PCR)
Večina temelji na enem izmed naslednjih postopkov:
Agent identification tests based on nucleic acid methods must detect reference strains from the nine virus serotypes of the AHSV.
ekstrakcija nukleinskih kislin s fenol-kloroformom,
The method described in point 2.1 is based on point 1.2 of Section B in Chapter 2.5.1 of the Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Edition 2016 as adopted by the World Assembly of Delegates of the OIE in May 2012.
adsorpcija nukleinskih kislin na filtrirni sistem,
Any RT-PCR detection method used for the testing of samples, either blood or spleen, in the context of Directive 2009/156/EC must perform equal to or exceed the sensitivity of the methodologies described in point 2.
adsorpcija nukleinskih kislin na sistem z magnetnimi nizi.
Inactivated virus of serotypes 1 to 9 reference strains may be obtained from the European Union Reference Laboratory or the OIE Reference Laboratory for African horse sickness, Algete, Spain.
Primer notranje ekstrakcije RNK je naveden spodaj:
Extraction of viral RNA
1 g vzorca tkiva homogeniziramo v 1 ml denaturirane raztopine (4 M gvanidinijev tiocianat, 25 mM natrijev citrat, 0,1 M 2-merkaptoetanol, 0,5 % sarkozil).
To assure a good reaction it is necessary to extract from the sample an AHSV RNA of high quality.
Po centrifugiranju supernatantu dodamo 1 μg RNK kvasovk, 0,1 ml 2 M natrijevega acetata s pH 4, 1 ml fenola in 0,2 ml alkoholne mešanice kloroforma/izoamila (49/1).
The extraction of nucleic acids from clinical samples can be performed by a variety of in-house and commercially available methods.
Suspenzijo temeljito pretresemo in pustimo 15 minut hladiti na ledu.
Commercial kits use different approaches for RNA isolation.
Po centrifugiranju RNK, prisotno v vodni fazi, ekstrahiramo s fenolom, precipitiramo z etanolom in ponovno suspendiramo v sterilni vodi.
Most are based on one of the following procedures:
Postopek RT-PCR v realnem času
Phenol-chloroform extraction of nucleic acids;
RT-PCR v realnem času, specifična za skupino, po Agüero in sod., 2008 [3]
Adsorption of nucleic acids to filter system;
Ta RT-PCR v realnem času, specifična za skupino, cilja VKK-VP7 in lahko določi vse znane serotipe VKK in seve, ki trenutno krožijo.
Adsorption of nucleic acids to magnetic beads system.
Zaporedja začetnih oligonukleotidov in sonde za določanje virusov vrste VKK:
An example of an in-house RNA extraction is given below:
smiselni začetni oligonukleotid 5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′
1 g of tissue sample is homogenised in 1 ml of denaturing solution (4 M guanidium thiocyanate, 25 mM sodium citrate, 0,1 M 2-mercaptoethanol, 0,5 % sarcosyl).
protismiselni začetni oligonukleotid 5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′
After centrifugation, 1 μg of yeast RNA, 0,1 ml of 2 M sodium acetate pH 4, 1 ml of phenol and 0,2 ml of chloroform/isoamyl alcohol mixture (49/1) are added to the supernatant.
sonda MGB-TaqMan 5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′
The suspension is vigorously shaken and cooled on ice for 15 minutes.
Osnovno koncentracijo začetnega oligonukleotida razredčimo na delovno koncentracijo 8 μM („delovna raztopina začetnega oligonukleotida 8 μM“), sonda pa se razredči na delovno koncentracijo 50 μM („delovna raztopina sonde 50 μM“).
After centrifugation, the RNA present in the aqueous phase is phenol extracted, ethanol precipitated and resuspended in sterile water.
Načrt testne plošče je treba zasnovati in naložiti v programsko opremo za PCR v realnem času.
Real-time RT-PCR Procedure
Z uporabo načrta kot vodila dodamo 2,5 μl vsake 8 μM delovne raztopine začetnega oligonukleotida v vsako vdolbinico, ki bo vsebovala vzorce RNK ter pozitivne in/ali negativne kontrole (končna koncentracija sonde bo 1 μM v 20 μl mešanice RT-PCR.
This group-specific real-time RT-PCR targets VP7 of the AHSV and is able to detect all known AHSV serotypes and strains currently circulating.
2 μl izolirane RNK (preiskovani vzorci in pozitivna kontrola) ali 2 μl RNaz proste vode iz kontrol z negativno reakcijo zmešamo s smiselnimi in protismiselnimi začetnimi oligonukleotidi.
It has been employed with very good results by the participating national reference laboratories of the European Union Member States in the proficiency tests annually organised by the European Union Reference Laboratory for the period 2009-2015.
To mešanico denaturiramo s segrevanjem pri 95 °C za 5 minut, čemur sledi hitro hlajenje z ledom za najmanj 5 minut.
Moreover, in an international ring trial organised in 2015 in the framework of the OIE reference laboratories network this protocol was ranked very high amongst others.
Ustrezno količino glavne mešanice za enostopenjsko RT-PCR v realnem času za število vzorcev, ki jih testiramo, pripravimo po navodilih proizvajalca.
Primer and probe sequences for the detection of AHSV species viruses:
V vsako vdolbinico, ki vsebuje vzorce RNK, dodamo po 0,1μl delovne raztopine sonde 50 μM (končna koncentracija sonde bo 0,25 μM v vsaki vdolbinici, ki vsebuje vzorce RNK).
forward Primer 5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′
13 μl glavne mešanice za enostopenjsko RT-PCR v realnem času dodamo v vsako vdolbinico na PCR plošči, ki vsebuje denaturirane začetne oligonukleotide in RNK.
reverse Primer 5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′
Ploščo postavimo v termopomnoževalnik v realnem času, programiran za reverzno transkripcijo in amplifikacijo/fluorescenčno detekcijo cDNK.
MGB-TaqMan probe 5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′
Pogoji amplifikacije vključujejo prvi korak z reverzno transkripcijo pri 48 °C za 25 minut, čemur sledi 10 minut pri 95 °C („vroč zagon“) in 40 ciklov po 15 sekund pri 95 °C, 35 sekund pri 55 °C in 30 sekund pri 72 °C (ali 40 ciklov po 2 sekundi pri 97 °C in 30 sekund pri 55 °C, če se uporabijo reagenti in termopomnoževalnik, ki omogočajo hitre reakcije).
Primer stock concentration is diluted to a working concentration of 8 μM (“primer working stock 8 μM”) whereas probe is diluted to a working concentration of 50 μM (“probe working stock 50 μM”).
Podatke o fluorescenci pridobimo ob koncu koraka pri 55 °C.
A test plate layout should be designed and loaded into the real time PCR machine software.
Test ni veljaven, če pridobimo atipične krivulje amplifikacije, in ga je treba ponoviti.
Using the layout as a guide, 2,5 μl of each primer working stock 8 μM is added to each well that will contain RNA samples, positive and/or negative controls (final concentration of the primer will be 1 μM in the 20 μl RT-PCR mix).
Vzorce štejemo za pozitivne, če je vrednost Ct (številka cikla, pri katerem fluorescenca, ki nastane pri reakciji, seka fluorescenčne prage) enaka ali nižja od določenega praga Ct (35) v 40 ciklih PCR (Ct ≤ 35).
The plate is held on ice.
Vzorce štejemo za neopredeljive, če je vrednost Ct višja od določenega praga Ct (35) v 40 ciklih PCR (CT > 35).
2 μl of isolated RNA (test samples and positive control), or 2 μl of RNAse-free water in negative reaction controls, is mixed with forward and reverse primers.
Vzorce štejemo za negativne, če pridobimo horizontalno krivuljo amplifikacije, ki ne seka linije praga v 40 ciklih PCR.
This mixture is denatured by heating at 95 °C for 5 minutes, followed by rapid cooling on ice for at least 5 minutes.
RT-PCR v realnem času, specifična za skupino, po Guthrie in sod., 2013 [4]
An appropriate volume of real time one-step RT-PCR master mix for the number of samples to be tested is prepared following manufacturer's instructions.
RT-PCR v realnem času z uporabo sond za prenos energije fluroescenčne resonance je namenjena določanju nukleinske kisline VKK.
0,1 μl of probe working stock 50 μM is added to each well containing RNA samples (final concentration of the probe will be 0,25 μM in each well containing RNA samples).
Opisana RT-PCR za VKK je bila zasnovana z uporabo zaporedij iz različnih sevov VKK, ki trenutno krožijo na terenu (Quan in sod., 2010 [5]).
13 μl of real time one-step RT-PCR master mix is distributed in each well on the PCR plate containing the denatured primers and RNA.
Spodaj so opisani nekateri osnovni koraki, kot so jih opisali Guthrie in sod.
The plate is placed in a real time thermal cycler programmed for reverse transcription and cDNA amplification/fluorescence detection.
, ki se lahko spreminjajo glede na posebne lokalne zahteve/zahteve za posamezni primer ter uporabljene komplete in opremo.
Amplification conditions consist of a first reverse-transcription step at 48 °C for 25 minutes, followed by 10 minutes at 95 °C (“hot start”) and 40 cycles of 15 seconds at 95 °C, 35 seconds at 55 °C and 30 seconds at 72 °C (or 40 cycles at 97 °C for 2 seconds and 55 °C for 30 seconds if reagents and thermocycler allowing fast reactions are used).
smiselni začetni oligonukleotid 5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′
Fluorescence data are acquired at the end of the 55 °C step.
protismiselni začetni oligonukleotid 5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′
The assay is considered not valid if atypical amplification curves are obtained, and must be repeated.
sonda MGB-TaqMan 5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′
Samples are considered positives, if the Ct value (cycle number at which the fluorescence generated within a reaction crosses the fluorescence threshold) is lower than or equal to the defined Ct threshold (35) within 40 PCR cycles (Ct ≤ 35).
Osnovne raztopine začetnih oligonukeotidov in sonde se pripravijo v 25× koncentraciji pri 5 μΜ za smiselne in protismiselne začetne oligonukleotide ter pri 3 μΜ za sondo.
Samples are considered inconclusive, if the Ct value is higher than the defined Ct threshold (35) within 40 PCR cycles (Ct > 35).
Načrt testne plošče je treba zasnovati in naložiti v programsko opremo za PCR v realnem času.
Samples are considered negative, if a horizontal amplification curve is obtained which does not cross the threshold line within 40 PCR cycles.
Z uporabo načrta kot vodila dodamo v ustrezne vdolbinice plošče po razporeditvi 5 μl vzorcev RNK, vključno s preiskovanimi vzorci ter pozitivnimi in negativnimi kontrolami.
The AHSV RT-PCR assay described was designed using sequences from a wide variety of currently circulating field strains of AHSV (Quan et al., 2010 [5]).
1 μl 25× osnovne raztopine začetnih oligonukleotidov in sonde (iz točke 2.2.1 zgoraj) vključimo v glavno mešanico, da dobimo končno koncentracijo v vsaki vdolbinici 200 nM za vsak začetni oligonukleotid in 120 nM za vsako sondo.
It also incorporates a proprietary synthetic external control assay to verify proper functioning of the assay components.
20 μl glavne mešanice dodamo v vsako vdolbinico na plošči PCR, ki vsebuje denaturirano RNK.
Kits for the one-step real-time PCR are available commercially.
Ploščo postavimo v termopomnoževalnik v realnem času, programiran za reverzno transkripcijo in amplifikacijo/fluorescenčno detekcijo cDNK, kot to predlagajo proizvajalci.
Below are some basic steps as described by Guthrie et al.
Pogoji amplifikacije vključujejo na primer prvi korak z reverzno transkripcijo pri 48 °C za 10 minut, čemur sledi 10 minut pri 95 °C in 40 ciklov po 15 sekund pri 95 °C ter 45 sekund pri 60 °C.
, which can be modified depending upon local/case-specific requirements, kits used and equipment available.
Vzorce štejemo za pozitivne, če normirana fluorescenca pri testu RT-PCR za VKK preseže prag 0,1 pred 36. ciklom PCR pri vseh ponovitvah vzorca.
forward Primer 5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′
Vzorce štejemo za neopredeljive, če normirana fluorescenca pri testu RT-PCR za VKK preseže prag 0,1 med 36. in 40. ciklom PCR pri kateri koli od ponovitev vzorca.
reverse Primer 5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′
Vzorce štejemo za negativne, če normirana fluorescenca pri testu RT-PCR za VKK ne preseže praga 0,1 pred 40. ciklom PCR pri vseh ponovitvah vzorca in če normirana fluorescenca pri lastniškem sintetičnem testu za zunanji nadzor preseže prag 0,1 pred 33. ciklom PCR.“
MGB-TaqMan probe 5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′
CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, 646–650.
Primer and probe mix stock solutions are made up in a 25× concentration at 5 μΜ for the forward and reverse primers and 3 μΜ for the probe.
Methods, 125 (1), 55–65.
A test plate layout should be designed and loaded into the real-time PCR machine software.
2013;189(1):30–5
Using the layout as a guide, 5 μl of RNA samples, including test samples and positive and negative controls, are added to appropriate wells of the plate following the layout.
Methods 167, 45–52.
The RNA is denatured by heating at 95 °C for 5 minutes, followed by rapid cooling on ice for at least 3 minutes.
Poleg tega večina nacionalnih referenčnih laboratorijev v državah članicah Evropske unije uporablja metode RT-PCR v realnem času, vključno za diagnosticiranje konjske kuge, ki po letnih preverjanjih usposobljenosti, izvedenih med letoma 2009 in 2014, dokazano ustrezajo namenu.
An appropriate volume of real-time one-step RT-PCR master mix for the number of samples to be tested is prepared, following the manufacturer's instructions.
V poročilu je tudi navedeno, da zunaj Unije obstajajo številni referenčni laboratoriji OIE in drugi laboratoriji s posebnim strokovnim znanjem o konjski kugi, ki izvajajo vsaj eno od metod RT-PCR v realnem času za določanja genoma virusa konjske kuge.
1 μl of 25× primer probe mix stock solution (from point 2.2.1 above) is included in the master mix to give a final concentration in each well of 200 nM for each primer and 120 nM of the probe.
Metoda, ki so jo opisali Guthrie in sod.
20 μl of the master mix is distributed in each well on the PCR plate containing the denatured RNA.
Agüero M., Gomez-Tejedor C., Angeles Cubillo M., Rubio C., Romero E. in Jimenez-Clavero A. (2008).
The plate is placed in a real-time thermal cycler programmed for reverse transcription and cDNA amplification/fluorescence detection as suggested by the manufacturers.
Diagnostic accuracy of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay for detection of African horse sickness virus (Diagnostična natančnost dvojne kvantitativne verižne reakcije s polimerazo z reverzno transkripcijo v realnem času za določanje virusa konjske kuge).