natgillin/translations-raw huggingface dataset:
buffer with MgCl2:
(Če se uporablja analiza raztopljenega organskega ogljika, vata ni primerna.)
Tris/HCl (pH8,8 at 25 °C), 160mM (NH4)2SO4, 25mM MgCl2, 0,1 %Tween 20
Posode se postavijo na stresalnik in se ves čas preskusa neprekinjeno stresajo pri zmernih obratih (npr. 100 o/min).
For each PCR (see below 3-5) the special primer as a new combination of “Reaction-Mix” and the adequate needed amount of template DNA for each sample (see above) is needed.
Temperatura (15–20 °C v razponu ± 2 °C) se nadzoruje in posode se zaščitijo pred svetlobo, da se prepreči rast alg.
The respective volumes will be transferred into new tubes using pipettes.
Zagotovi se, da v zraku ni strupenih snovi.
After that all tubes will be closed, stirred (ca.
Fizikalno-kemijski kontrolni preskus (neobvezno)
10 sec) and centrifuged (10 sec, at room temperature).
Če obstaja sum abiotske razgradnje ali mehanizma izgub, kot je hidroliza (težava le pri specifični analizi), izhlapevanje ali adsorpcija, je priporočljivo izvesti fizikalno-kemijski kontrolni preskus.
Now the respective PCR-programmes can be started.
Izvede se lahko z vnosom živosrebrovega (II) klorida (HgCl2) [10] (50– 100 mg/l) v posode s preskusno snovjo, da se ustavi mikrobna dejavnost.
Additionally a positive control (exemplary DNA sample with known activity and clear results) and a negative control (1 μl dest.
Znatno zmanjšanje raztopljenega organskega ogljika ali koncentracije specifične snovi v fizikalno-kemijskem kontrolnem preskusu kaže abiotske mehanizme odstranjevanja.
H2O) will be used in each PCR-programme.
(Če se uporabi živosrebrov klorid, je treba pri analizi raztopljenega organskega ogljika paziti na motnje ali zastrupitev katalizatorja.)
Preparation of the agarose gel (1 %) — During running PCR-programmes:
Število bučk
Solve 3 g agarose in 300 ml 1 × TAE-buffer (1 % agarose gel)
V značilnem poteku preskusa se uporabijo naslednje bučke:
This solution should be boiled using an microwave (ca.
bučki 1 in 2 vsebujeta preskusno snov (preskusno suspenzijo),
2-3 min)
bučki 3 in 4 vsebujeta le morsko vodo (slepi),
Transfer the hot solution into a special casting box, which lies on ice
bučka 5 vsebuje referenčno snov (kontrola postopka),
After ca.
bučka 6 vsebuje preskusno in referenčno snov (kontrola strupenosti) – neobvezna,
20 min the agarose gel is ready to use
bučka 7 vsebuje preskusno snov in sterilizacijsko sredstvo (abiotska sterilna kontrola) – neobvezna.
Storage the agarose gel in 1 × TAE-buffer until the end of the PCR-programmes
Analiza raztopljenega organskega ogljika
Actin-PCR-programme:
Med potekom preskusa se v ustreznih razmikih odvzamejo vzorci za analizo raztopljenega organskega ogljika (Dodatek 1).
This PCR-reaction is aimed to demonstrate that the DNA in the sample is not harmed.
Vzorci se vedno odvzamejo na začetku preskusa (dan 0) in 60. dan.
Special primer:
Za opis časovnega poteka razgradnje je skupaj potrebnih vsaj pet vzorcev.
“Mact1(upper/forward)” → TTC AAC AGC CCT GCC ATG TA
Fiksnega časovnega razporeda vzorčenja ni mogoče določiti, ker se hitrost biološke razgradnje razlikuje.
“Mact2(lower/reverse)” → GCA GCT CAT AGC TCT TCT CCA GGG AG
Za vsak vzorec se določi raztopljeni organski ogljik v dveh ponovitvah.
Programme:
Potrebna prostornina vzorcev je odvisna od analitske metode (specifična analiza), uporabljenega analizatorja ogljika in postopka (membranska filtracija ali centrifugiranje), izbranega za tretiranje vzorca pred določanjem ogljika (odstavka 25 in 26).
Cycle (35-times):
Pred vzorčenjem je treba zagotoviti, da je preskusni medij dobro premešan in da se material, prilepljen na steno bučke, raztopi ali suspendira.
Denaturation
Membransko filtracijo ali centrifugiranje je treba izvesti takoj po vzorčenju.
→ 45 sec at 95 °C
Po potrebi se filtrirani ali centrifugirani vzorci shranijo pri 2–4 °C za največ 48 ur ali pod – 18 °C za daljša obdobja (vzorec se pred shranjevanjem zakisa na pH 2, če je znano, da to ne bo vplivalo na snov).
Annealing
Membranski filtri (0,2–0,45 μm) so primerni le, če je zagotovljeno, da med filtriranjem ne izpuščajo ogljika in ne adsorbirajo snovi; npr. polikarbonski membranski filtri.
→ 45 sec at 56 °C
Nekateri membranski filtri so impregnirani s površinsko aktivnimi snovmi za hidrofilizacijo in lahko sprostijo velike količine raztopljenega ogljika.
Elongation
Takšne filtre je treba pripraviti z vrenjem v deionizirani vodi tri zaporedna obdobja, pri čemer eno traja eno uro.
→ 1 min at 68 °C
Po vrenju je treba filtre shraniti v deionizirani vodi.
15 min 68 °C
Prvih 20 ml filtrata se zavrže.
X- and Y-Gene-PCR-programme:
Namesto membranske filtracije se lahko izbere centrifugiranje vzorcev.
The samples with intact DNA will be used in this PCR-programme to detect the X- and Y-Genes.
Centrifugira se 15 minut pri 40000 m.s– 2 (~ 4000 g), po možnosti v ohlajeni centrifugi.
Male DNA should show one double-band and female DNA should show one single band (after staining and gel-electrophoresis).
zdi se, da razlikovanje skupnega organskega ogljika (TOC) od raztopljenega organskega ogljika (TOC/DOC) s centrifugiranjem pri zelo nizkih koncentracijah ni mogoče, saj se bodisi ne odstranijo vse bakterije bodisi se ogljik kot del bakterijske plazme ponovno raztopi.
For this programme-run one positive control for males (XY-sample) and one for females (XX-sample) should be included.
Pri višjih preskusnih koncentracijah (> 10 mg C na liter) se zdi napaka pri centrifugiranju primerljivo majhna.
“PG 17,5” (upper/forward) → CCG GGT GCC CAA GTG CTC CCG CTG
Pogostost vzorčenja
“PG 17,6” (lower/reverse) → GAT CGT CCC TCC ACA GAG AAG AGA
Če se analize izvajajo takoj po vzorčenju, se naslednji čas vzorčenja oceni ob upoštevanju rezultata analitskega določanja.
Cycle (40-times):
Če se vzorci ohranijo (odstavek 24) za poznejšo analizo, je treba odvzeti več kor pet vzorcev, kolikor je potrebno najmanjše število.
→ 45 sec at 55 °C
Zadnji vzorec se analizira najprej, pri čemer je mogoče s postopno ‚vzvratno‘ izbiro ustreznih vzorcev pridobiti dober opis krivulje biološke razgradnje z razmeroma majhnim številom analitskih določitev.
→ 1 min 30 sec at 68 °C
Če do konca preskusa ne pride do razgradnje, ni treba analizirati dodatnih vzorcev, pri čemer se lahko v takem primeru z ‚vzvratno‘ strategijo prihrani veliko analitskih stroškov.
Y-Gene-PCR-programme as “control” for X- and Y-Gene-PCR-programme:
Če se na krivulji razgradnje pred 60. dnem opazi ravnotežje, je treba preskus končati.
This PCR-programme verifies the results of the “X- and Y-Gene-PCR-programme”.
Če je očitno, da se je razgradnja začela pred 60. dnem, vendar ni dosegla ravnotežja, se preskus podaljša za dodatno obdobje.
The “male-samples” should show one band and the “female-samples” shouldn't show any band (after staining and gel-electrophoresis).
Rezultati analize se zabeležijo na priloženi podatkovni list (Dodatek 2), vrednosti biološke razgradnje za preskusno in referenčno snov pa se izračunajo po naslednji enačbi:
“DMTYa (upper/forward)” → GGC CGG GTC CCC GGG TG
razgradnja v odstotku raztopljenega organskega ogljika ali odstranitev specifične snovi ob času t,
“DMTYd (lower/reverse)” → TTT GGG TGA ACT CAC ATG G
začetna koncentracija raztopljenega organskega ogljika ali specifične snovi v preskusnem mediju,
Staining of the PCR-samples:
koncentracija raztopljenega organskega ogljika ali specifične snovi v preskusnem mediju ob času t,
Staining solution:
začetna koncentracija raztopljenega organskega ogljika ali specifične snovi v slepem vzorcu,
50 % Glycerol
koncentracija raztopljenega organskega ogljika ali specifične snovi v slepem vzorcu ob času t.
0,25 % Bromphenolblue
Razgradnja se navede kot odstotek odstranitve raztopljenega organskega ogljika (končna razgradnja) ali odstranitve specifične snovi (primarna razgradnja) ob času t.
0,25 % Xylenecyanol
Koncentracije raztopljenega organskega ogljika se izračunajo na najbližji 0,1 mg na liter, srednje vrednosti Dt pa se zaokrožijo na najbližji celi odstotek.
Pipette 1 μl of the staining solution into each single tube
Potek razgradnje se grafično prikaže na diagramu, kot je prikazano na sliki ‚Veljavnost in razlaga rezultatov‘.
Start of the Gel-Electrophoresis:
Če je na voljo dovolj podatkov, se iz krivulje izračunata lag faza (tL) in čas do 50-odstotne odstranitve od konca lag faze (t50).
The prepared 1 % agarose gel will be transferred into a gel-electrophoresis-chamber filled with 1 × TAE-Buffer
Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije:
10 - 15 μl of each stained PCR-sample will be pipetted into an agarose gel slot
Preskusna snov:
Also 5 - 15 μl of the 1kb-“Ladder”(Invitrogen) will be pipetted into a separate slot
fizikalna narava in, kadar je to primerno, fizikalno-kemijske lastnosti,
Start the electrophoresis by 200 V
identifikacijski podatki.
Stop after 30-45 min
stanje v zvezi z onesnaženostjo in hranilnimi snovmi (število kolonij, nitrat, amoniak, fosfat, če je ustrezno),
Determination of the bands:
značilnosti vzorca (datum vzorčenja, globina, videz, temperatura, slanost, raztopljeni organski ogljik (neobvezno), čas med odvzemom in uporabo v preskusu),
Clean the agarose gel in distilled H2O
metoda staranja morske vode, če je bila uporabljena,
Now transfer the agarose gel into Ethidium bromide for 15 - 30 min
uporabljena metoda za predhodno tretiranje (filtracija/sedimentacija) morske vode,
After that, a picture of the agarose gel should be taken in an UV-light-box
uporabljena metoda za določitev raztopljenega organskega ogljika,
Finally the samples are analysed in comparison to the positive control-band (or bands) and the ladder
uporabljena metoda za specifično analizo (neobvezno),
Appendix 10
uporabljena metoda za določitev števila heterotrofov v morski vodi (metoda štetja kolonij na ploščah ali alternativni postopek) (neobvezno),
Guidance on tissue sampling for genetic sex determination by PCR method in the three-spined stickleback
druge metode (neobvezno), uporabljene za opis značilnosti morske vode (merjenje ATP itd.).
Tissue sampling and DNA extraction
analitski podatki, navedeni na podatkovnem listu (Dodatek 2),
DNA can be extracted using a variety of commercially available reagents and both manual and automated extraction systems.
potek preskusa razgradnje se grafično prikaže na diagramu, ki kaže lag fazo (tL), naklon in čas (z začetkom ob koncu lag faze) do 50-odstotne odstranitve (t50).
The protocol used at the Cefas Weymouth laboratory is outlined below, and the alternative approaches have been added where appropriate.
Lag faza se lahko grafično oceni, kot je prikazano na sliki v razdelku ‚Veljavnost in razlaga rezultatov‘, ali se ustrezno šteje kot čas, potreben za 10-odstotno razgradnjo,
The scissors are cleaned after each single fish in 70 % ethanol then in distilled water and dried with tissue paper.
Veljavnost in razlaga rezultatov
The ethanol (if present) is removed by aspiration and the tissue is digested overnight with proteinase K in 400 μl of ATL buffer (Qiagen).
Rezultati, pridobljeni z referenčnimi snovmi, npr. natrijevim benzoatom, natrijevim acetatom ali anilinom, morajo biti primerljivi z rezultati, pridobljenimi s krožnim preskusom (3) (glej razdelek ‚Referenčne snovi‘, odstavek 7).
An aliquot (200 μl) of the digest is transferred to a 96-well S-block (Qiagen) and the DNA extracted in a 96-well format using the Qiagen Universal BioRobot and the QIamp Investigator BioRobot kit.
Če so rezultati, pridobljenimi z referenčnimi snovmi, netipični, je treba preskus ponoviti z drugim vzorcem morske vode.
The DNA is eluted in a 50 μl of DNase and RNase free water.
Čeprav rezultatov preskusov zaviranja zaradi prispevka raztopljenega organskega ogljika, ki ga zagotovi preskusna snov, ni vedno mogoče enostavno razlagati, je znatno zmanjšanje stopnje odstranitve skupnega raztopljenega organskega ogljika v primerjavi s stopnjo iz kontrole pozitiven znak za strupene učinke.
If using hard tissues to extract DNA (such as a spine or a pectoral fin) it may be necessary to homogenise the sample in the lysis buffer using a FastPrep® tissue lyser or equivalent tissue disruption system.
Zaradi uporabljenih razmeroma visokih preskusnih koncentracij v primerjavi z večino naravnih sistemov (in zato neugodnim razmerjem med koncentracijami preskusnih snovi in drugih virov ogljika) se metoda šteje za predhodni preskus, ki se lahko uporabi za ugotovitev, ali je snov lahko biološko razgradljiva.
Alternatively,
V skladu s tem nizek rezultat ne pomeni nujno, da preskusna snov v morskem okolju ni biološko razgradljiva, ampak kaže, da bo za to ugotovitev potrebnega več dela.
the tissue is digested overnight with proteinase K in 400 μl of G2 lysis buffer (Qiagen) and DNA is extracted from 200 μl of the digest using either the EZ-1 DNA easy tissue kit and the EZ-1 biorobot or the DNA easy tissue mini kit.
Na spodnji sliki je prikazan teoretičen poskus razgradnje, ki kaže izvedljiv način ocene vrednosti tL (dolžina lag faze) in t50 (časovno obdobje, ki se začne pri tL), potrebnih za 50-odstotno odstranitev.
The DNA is eluted in a 50 μl volume.
Bonferronijev U-preskus
The tissues are processed using the DNAzol reagent.
Ta metoda je različica preskusa v zaprti steklenici (5) za morsko vodo, katere končna različica je bila pripravljena kot rezultat krožnega preskusa, ki ga je za Evropsko komisijo pripravil danski inštitut za kakovost vode (3).
Briefly, tissue samples are lysed in 1ml of DNAzol for 10 minutes in a 1,5 ml micro centrifuge tube and then centrifuged at 13000 rpm for 5 minutes to remove any particulate matter.
Tako kot pri spremljajoči metodi stresanja bučke se rezultati tega preskusa ne smejo obravnavati kot kazalniki lahke biološke razgradljivosti, ampak se morajo uporabiti izrecno za pridobivanje informacij o biološki razgradljivosti snovi v morskih okoljih.
The lysed sample is then transfered to a new 1,5 ml micro centrifuge tube containing 500 μl of 100 % molecular grade ethanol and then centrifuged at 13000 rpm for 10 minutes to precipitate the DNA.
Predhodno določena količina preskusne snovi se raztopi v preskusnem mediju v koncentraciji, ki je običajno 2– 10 mg preskusne snovi na liter (uporabi se lahko ena koncentracija ali več).
The ethanol is removed and replaced with 400 μl of 70 % molecular grade ethanol, centrifuged at 13000 rpm for 5 minutes and the DNA pellet is dissolved in 50 μl molecular DNase and RNase free water.
Raztopina se v polni zaprti steklenici hrani v temi v kopeli ali posodi s konstantno temperaturo, ki se vzdržuje na ± 1 °C v razponu 15–20 °C.
Again, when using the hard tissues (pectoral fin) it may be necessary to homogenise the sample in the lysis buffer using a FastPrep® tissue lyser or equivalent tissue disruption system prior to extracting the DNA.
Kadar je cilj študije simulacija okoljskih razmer, se lahko preskusi izvedejo izven običajnega temperaturnega razpona, če se nadzor temperature ustrezno prilagodi.
The DNA is stored at – 20 °C until required.
Razgradnji sledijo analize kisika v 28-dnevnem obdobju.
gloves must be worn during the procedures.
Krožni preskus je pokazal, da v večini primerov zaradi resnih motenj ne bi bilo mogoče zbrati koristnih informacij, če bi se preskus podaljšal na več kot 28 dni.
Polymerase chain reaction (PCR) analysis
Slepe vrednosti biokemijske potrebe po kisiku (BPK) so bile verjetno pretirano visoke zaradi rasti po stenah, ki jo povzroča pomanjkanje mešanja, in nitrifikacije.
Amplifications were performed using 2,5 μl of the DNA extract in a 50 μl reaction volume using the Idh locus primers (as described by Peichel et al., 2004.
Zato je priporočeno trajanje preskusa 28 dni, če pa slepe vrednosti biokemijske potrebe po kisiku ostanejo v okviru 30-odstotne meje (odstavka 15 in 40), se lahko preskus podaljša.
Current Biology 1:1416-1424):
Empirična formula je potrebna, da se lahko izračuna teoretična potreba po kisiku (TPK) (glej dodatek 3);
Forward primer
v nasprotnem primeru je treba določiti kemijsko potrebo snovi po kisiku (KPK), ki se šteje za referenčno vrednost.
Reverse primer
Uporaba kemijske potrebe po kisiku je manj zadovoljiva, ker nekatere snovi v preskusu kemijske potrebe po kisiku ne oksidirajo popolnoma.
There are numerous suppliers of suitable PCR reagents.
Topnost snovi mora biti vsaj 2 mg/l, čeprav se načeloma lahko preskusijo tudi manj topne snovi (npr. z ultrazvočnim razbijanjem) in hlapne snovi.
The method outlined below is that currently used at the Cefas Weymouth laboratory.
Informacije o strupenosti snovi za bakterije, kot se na primer meri v kratkotrajnih preskusih respiracije (4), so lahko zelo koristne pri izbiri primernih preskusnih koncentracij in so lahko bistvene za pravilno razlago nizkih vrednosti biološke razgradnje.
Preparation of the “Reaction Mix” (50 μl per sample):
Vendar take informacije niso vedno zadostne za razlago rezultatov, dobljenih v preskusu biološke razgradnje, pri čemer je ustreznejši postopek, ki je opisan v odstavku 27.
A mastermix is prepared as follows.
Za ta namen se lahko uporabi (na primer) anilin, natrijev acetat ali natrijev benzoat.
This can be prepared in advance and stored frozen at – 20 °C until required.
Pri teh snoveh se mora v razumnem času pojaviti vsaj 60-odstotna razgradnja (njihove teoretične potrebe po kisiku), sicer se priporoča, da se preskus ponovi z drugim vzorcem morske vode.
Make sufficient mastermix for a negative control (molecular biology grade water only).
Pri krožnem preskusu za Evropsko komisijo, kjer so bili vzorci morske vode odvzeti na različnih lokacijah in v različnih časovnih obdobjih, sta bila lag faza (tL) in čas do 50-odstotne razgradnje (t50), ki ne vključuje lag faze, od 0 do 2 dni oziroma od 1 do 4 dni za natrijev benzoat.
Volume (stock conc.)/ sample
Za anilin sta bili vrednosti tL in t50 od 0 do 7 dni oziroma od 2 do 12 dni.
® Reaction Buffer
OBNOVLJIVOST
Nucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Obnovljivost metod je bila določena s krožnim preskusom za Evropsko komisijo (3).
0,5 μl (25 mM each)
Običajna laboratorijska oprema in:
250 μM each
uporabijo se lahko BPK-steklenice s steklenimi zamaški in prostornino 250–300 ml ali steklenice z ozkim grlom in prostornino 250 ml;
Forward Primer
več dvo-, tri- ali štirilitrskih steklenic z oznakami za litre za pripravo preskusa in polnjenje BPK-steklenic;
0,5μl (0,1 nmol/μl)
vodna kopel ali prostor s konstantno temperaturo za shranjevanje steklenic pri konstantni temperaturi (± 1 °C), kjer ni svetlobe;
Reverse Primer
oprema za analizo raztopljenega kisika;
2,0μM
membranski filtri, 0,2–0,45 μm (neobvezno);
Molecular biology grade water
oprema za specifično analizo (neobvezno).
GoTaq polymerase
V temeljito očiščeno posodo se odvzame vzorec morske vode in prenesite v laboratorij, po možnosti v enem ali dveh dneh po odvzemu.
Dispense 47,5 μl to a labelled 0,5 ml thin walled PCR tube.
Zagotovi se, da temperatura vzorca med prevozom ne bo znatno presegla temperature, ki bo uporabljena v preskusu.
Add 2,5 μl of the purified DNA to the appropriately labelled tube.
Natančno se opredeli lokacija vzorčenja in opiše njeno stanje v zvezi z onesnaženostjo in hranilnimi snovmi.
Repeat for all samples and the negative control.
V opredelitev se zlasti pri obalnih ali onesnaženih vodah vključita število heterotrofnih mikrobnih kolonij ter določitev koncentracij raztopljenega nitrata, amoniaka in fosfata.
Over lay with 2 drops of mineral oil.
videz vzorca – moten itd.,
Alternatively, use a thermal cycler with a heated lid.
raztopljeni organski ogljik (DOC),
Close the lids.
Če se ugotovi, da je vsebnost raztopljenega organskega ogljika v vzorcu visoka ali če se zdi, da bi bila slepa biokemijska potreba po kisiku po 28 dneh več kot 30 % potrebe referenčne snovi, se priporoča, da se morska voda pred uporabo stara približno en teden.
Samples were denatured in a Peltier PTC-225 thermal cycler at 94 ± 2 °C for 5 minutes followed by 39 cycles of 94 ± 2 °C for 1 minute, 55 ± 2 °C for 1 minute, 72 ± 2 °C for 1 minute, and a final extension of 72 ± 2 °C for 10 minutes.
Staranje vzorca poteka v aerobnih pogojih pri preskusni temperaturi in v temi ali difuzni svetlobi.
Preparation of the agarose gel (2 %):
Krožni preskus (3) ni pokazal razlike med možnostjo razgradnje staranih in sveže odvzetih vzorcev morske vode.
Traditionally the PCR products are resolved on a 20 % agarose gel containing ethidium bromide.
Morska voda se pred uporabo tretira tako, da se odstranijo grobi delci, npr. s filtriranjem skozi najlonski filter ali filter papir (ne membranski filter ali filter GF/C) ali s sedimentacijo in odlivanjem.
Capillary based electrophoresis systems can also be used.
Uporabljeni postopek je treba navesti.
Weigh 2 g agarose in 100 ml 1 × TAE-buffer
Če se izvede staranje, je treba izvesti tudi predhodno tretiranje.
Heat in a microwave (ca.
Iz analitsko čistih reagentov se pripravijo naslednje založne raztopine.
2-3 min) to dissolve the agarose.
Na liter predhodno tretirane morske vode se doda 1 ml vsake od zgornjih založnih raztopin.
Add 2 drops of ethidium bromide final concentration 0,5 μg/ml
Nasičena koncentracija raztopljenega kisika kot funkcija slanosti in temperature se lahko odčita iz nomograma, priloženega tej preskusni metodi (Dodatek 4).
Transfer the hot solution into the gel casting equipment.
Število heterotrofov, ki v preskusnem mediju morske vode tvorijo kolonije (in po možnosti tudi v izvirnem vzorcu morske vode), se (neobvezno) določi npr. s štetjem kolonij na ploščah, za kar se uporabi morski agar.
Allow the gel to harden
Priprava preskusnih steklenic
Gel-Electrophoresis:
Izvedejo se vsi potrebne priprave, vključno s staranjem in predhodno tretiranje morske vode pri izbrani preskusni temperaturi med 15 in 20 °C, ter zagotovi čistost, vendar ne sterilnost steklene posode.
Transferred the agarose gel to the electrophoresis equipment and submerge in 1 × TAE-buffer
Pripravijo se skupine BPK-steklenic za določanje biokemijske potrebe po kisiku preskusne in referenčne snovi v sočasnih preskusnih nizih.
Load 20 μl of each sample to a separate well, adding a molecular weight marker (100 bp DNA ladder, Promega) to a spare well.
Vse analize se izvedejo na dveh steklenicah (slepi vzorci, referenčna in preskusna snov), tj. za vsako določanje se pripravita dve steklenici.
Electrophoresis is performed at 120 V for 30-45 minutes.
Analize se izvajajo vsaj na dan 0 ter 5., 15. in 28. dan (štiri določitve).
Visualisation of the amplification products
Pri analizah kisika je za štiri določitve skupaj potrebnih 3 × 2 × 4 = 24 steklenic (slepi vzorec, referenčna in preskusna snov) in zato približno 8 litrov preskusnega medija (za eno koncentracijo preskusne snovi).
If the ethidium bromide was incorporated in to the agarose gel as described above, the DNA products are visualised under a UV source.
V ustrezno velikih steklenicah (odstavek 11) se pripravijo ločene raztopine preskusne in referenčne snovi, tako da se v delno napolnjene velike steklenice najprej neposredno ali s koncentrirano založno raztopino dodata preskusna in založna snov.
Alternatively the agarose gel is stained by covering the gel in a dilute solution of ethidium bromide (0,5 μg/ml in water) for 30 minutes prior to visualisation.
Preskusni medij se dodaja, dokler ne nastanejo končne želene koncentracije.
Appendix 11
Če se uporabijo založne raztopine preskusnih in/ali referenčnih sovi, je treba zagotoviti, da se slanost medija morske vode ne spremeni bistveno.
Guidance for artificial fertilisation procedure for the three-spined stickleback
Koncentracije preskusne in referenčne snovi se izberejo ob upoštevanju:
The purpose of this section is to describe the procedures to obtain fertilised eggs from the three-spined stickleback in view of using them in the FSDT.
topnosti raztopljenega kisika v morski vodi pri prevladujoči preskusni temperaturi in slanosti (glej priloženi nomogram v Dodatku 4);
Procedures
pričakovane biološke razgradljivosti preskusne snovi.
Obtaining sperm from the males
Poraba kisika morske vode same (respiracija v slepem vzorcu) je lahko 2 mg O2/l ali več, če morska voda ni starana.
A well-coloured male of the desired population is euthanised.
Zato se za zagotovitev ostanka znatne koncentracije kisika po oksidaciji preskusne snovi za snovi, ki bi se morale v preskusnih pogojih popolnoma razgraditi (kot so referenčne snovi), uporabi začetna koncentracija preskusne snovi, ki je približno 23 mg/l (odvisno od teoretične potrebe po kisiku).