natgillin/translations-raw huggingface dataset:
The one-step method shall be used where possible, as the one tube assay minimises the risk of cross-contamination as no transfer of content have to be made and it is regarded to be as sensitive as the two-step method.
Eritrociti se odstranijo in vsaka jamica se dvakrat spere z gojiščem L-15.
The primers and assay described in this point, namely the ILA1 or ILA2 primer pair that target segment 8 and which have been found suitable for detection of ISAV in outbreaks and in carrier fish, shall be used.
Vsaka jamica se pregleda pod mikroskopom.
The ILA2 reverse primer does not match isolates from North America and an alternative primer set shall be used in those cases.
Prisotnost skupkov eritrocitov, pritrjenih na površino celic ASK, kaže na predvideno okužbo z ortomiksovirusom.
Forward primer (ILA1): 5′-GGCTATCTACCATGAACGAATC-3′;
Če je hemadsorpcija pozitivna, se takoj opravi test za določitev virusa v skladu s točko II.2.4.
Reverse primer (ILA2): 5′-GCCAAGTGTAAGTAGCACTCC-3′.
Imunofluorescenca (IF)
Cycling conditions: one cycle of 50 °C for 30 minutes, 1 cycle of 94 °C for 15 minutes, 40 cycles of 94 °C for 30 seconds, 55 °C for 30 seconds, 72 °C for 60 seconds; one cycle of 72 °C for 5 min.
Celice ASK (pasaža 65 ali manj) se gojijo na gojišču L-15, ki vsebuje 10-odstotni fetalni goveji serum, 2 % (vol:vol) 200 mM L-glutamina in 0,08 % (vol:vol) 50 mM 2-merkaptoetanola na mikrotitrskih ploščah, in se uporabljajo pri več kot 50-odstotni konfluenci.
Product size 155 bp.
Lahko se uporabijo tudi druge celične linije ali gojišča z dokazano učinkovitostjo.
However, other RT-PCR versions of proven similar efficacy may be used instead.
225 μl supernatanta kulture, ki je domnevno okužena z virusom, se doda v vsako od obeh jamic in premeša, 225 μl pa se prenese v dve drugi jamici, in sicer v razredčitvi 1: 5.
RT-qPCR for ISAV detection
Dve dodatni jamici se ne inokulirata, tako da se lahko uporabita kot kontroli.
The use of RT-qPCR may increase specificity and probably also sensitivity.
Vzorci iz vsake gojilnice in kontrola virusa se tretirajo na ločenih mikrotitrskih ploščah.
The method can be performed more rapidly as no gel electrophoresis step is required and it reduces the risk of cross contamination as it is possible to estimate the amount of viral genomic RNA within the sample tube.
Za kontrolo virusa se uporabi referenčni izolat ISAV.
A drawback of the RT-qPCR assay is that it is often not possible to sequence amplified products.
Mikrotitrske plošče se inkubirajo pri 14 °C ± 2 °C in pregledujejo pod mikroskopom do sedem dni.
However, if there is doubt on the specificity of the amplified product, another ISAV specific assay must be run to verify the result.
Ko se opazi zgodnji CPE ali če se v sedmih dneh CPE ne opazi, je naslednji korak fiksacija.
The assay described in this point, which is an assay that target segment 8, shall be used.
Jamice se sperejo s fosfatno pufrano slanico (PBS) in se z inkubacijo z 80-odstotnim acetonom 20 minut fiksirajo pri sobni temperaturi.
This assay shall cover isolates from the European Union, the European Free Trade Association and North America.
Mikrotitrske plošče se posušijo na zraku in takoj obarvajo ali shranijo največ 24 ur pred barvanjem pri temperaturi 0 °C do 6 °C.
The one-step method shall be used where possible, because the one tube assay minimises the risk of cross-contamination.
Replicirane jamice se obarvajo z mešanico monoklonskih protiteles (MAb) 3H6F8 in 1OC9F5 proti ISAV ali drugim MAb z dokazano učinkovitostjo in specifičnostjo, razredčijo v PBS in inkubirajo 30 minut pri 37 °C ± 4 °C.
Forward primer: 5′- CTACACAGCAGGATGCAGATGT -3′;
MAb se odstrani, mikrotitrske plošče pa se trikrat sperejo z 0,05-odstotnim Tween 20 v PBS.
Reverse primer: 5′- CAGGATGCCGGAAGTCGAT -3′;
Vsaki jamici se dodajo protitelesa proti mišjim IgG, konjugirana s fluorescein izotiocianatom (FITC), razredčen v PBS, in inkubira 30 minut pri 37 °C ± 4 °C.
and probe: 5′-FAM- CATCGTCGCTGCAGTTC – MGBNFQ-3′.
Vsak laboratorij optimizira razredčitve različnih šarž MAb in konjugata FITC.
Cycling conditions: one cycle of 50 °C for 30 minutes, one cycle of 95 °C for 15 minutes, 40 cycles of 94 °C for 15 seconds, 60 °C for 60 seconds; it shall be adjusted if necessary.
Protitelo se odstrani, mikrotitrske plošče pa se trikrat sperejo z 0,05-odstotnim Tween 20 v PBS.
Sequencing of amplified PCR products
Jamice se takoj pregledajo pod invertnim mikroskopom za fluorescenčno mikroskopijo z ustreznim filtrom za ekscitacijo FITC.
Forward primer (ILAs6-3F): 5′-ATGAGGGAGGTAGCATTGCA -3′;
Test se šteje za pozitivnega, če se opazijo fluorescenčne celice.
Reverse primer (ILAs6-2R): 5′-CATGCTTTCCAACCTGCTAGGA -3′.
Test je veljaven, če je rezultat pozitivnih kontrol pozitiven in rezultat negativnih kontrol negativen.
Cycling conditions (One-step RT-PCR): one cycle of 50 °C for 30 minutes, one cycle of 94 °C for 15 minutes, 40 cycles of 94 °C for 30 seconds, 55 °C for 30 seconds, 72 °C for 60 seconds, one cycle of 72 °C for 5 minutes; it shall be adjusted if necessary.
3 Pregled drugih tkiv
Alternatively, the following method for sequencing HPR in segment 6 may be used:
Metoda iz točke II.2.6 se lahko uporabi za druga ribja tkiva, kot so jetra, vranica in srce, če se lahko na stekelce prenese ustrezna količina endotelnih celic, levkocitov ali limfocitov.
Forward primer: 5′-GAC-CAG-ACA-AGC-TTA-GGT-AAC-ACA-GA-3′;
Postopek barvanja ostane enak za vsako tkivo, čeprav je za nekatera tkiva morda bolje opustiti barvanje s propidijevim jodidom in namesto tega s pomočjo fazne osvetljave določiti vrste celic v odtisu.
Reverse primer: 5′-GAT-GGT-GGA-ATT-CTA-CCT-CTA-GAC-TTG-TA-3′;
Histologija
Product size: 304 nt if HPR0.
Rezine, vstavljene v parafin, se razrežejo na 5 μm in obarvajo s hematoksilinom in eozinom.
RT-PCR assays with similar sensitivities and specificities to the assays described in this point may also be used.
Histološke spremembe v klinično obolelih atlantskih lososih so različne, vendar lahko vključujejo:
The purity of the amplified RT-PCR product shall be checked by gel electrophoresis before sequencing.
številne eritrocite v centralnem venoznem sinusu in lamelarnih kapilarah škrg, kjer se lahko tvorijo tudi strdki eritrocitov;
If only one pure fragment appears, it shall be purified directly from the PCR reaction.
multifokalne do konfluentne petehije ali hepatocitno nekrozo ali oboje, nekoliko oddaljene od večjih žil v jetrih; multifokalno kopičenje eritrocitov v razširjenih hepatičnih sinusoidih;
If multiple amplified fragments are present, the fragment of interest shall be purified by gel electrophoresis.
kopičenje eritrocitov v krvnih žilah v lamina propria črevesja in sčasoma tudi krvavitve v lamina propria;
The purification of PCR fragments from solutions or agarose gels shall be made using PCR fragment affinity spin columns, according to the manufacturer's instructions.
stromo vranice, napihnjeno zaradi kopičenja eritrocitov;
Sequencing shall be performed using amplification primers at external specialised sequencing companies.
rahlo multifokalno do obsežno razpršeno intersticijsko krvavitev s tubularno nekrozo na območjih krvavitve, kopičenje eritrocitov v ledvičnih glomerulih;
The results shall be analysed with the search tool BLAST and the sequences shall be compared with other known sequences in the US National Centre for Biotechnical Information (NCBI) nucleotide database.
eritrofagocitozo v vranici in sekundarne krvavitve v jetrih in ledvicah.
Sequencing must eliminate any doubt on the specificity of an amplified RT-PCR product.
5 Imunohistokemija (IHC)
ISAV isolation on cell cultures
Na parafinskih rezinah iz tkiva, fiksiranega v formalinu, se uporabijo poliklonska protitelesa proti nukloproteinu ISAV.
Preparation of samples
Organi, ki se pregledajo, so praledvice in srce (prehodno območje, vključno z vsemi tremi prekati in zaklopkami).
The tissue may be kept at – 80 °C.
Sumljivi primeri zaradi patoloških znakov se preverijo s pozitivno IHC.
The tissue shall only be frozen and thawed once before examination.
Histološke rezine se pripravijo v skladu s standardnimi metodami.
For surveillance and control purposes, the examination shall be undertaken as fast as possible.
Priprava tkivnih rezin
Each sample (tissue pool in transport solution) shall be completely homogenised using a validated homogeniser, centrifuged at 2000 to 4000 × g for 15 minutes at 0 to 6 °C, and the supernatant shall be filtered (0,45 μm) and incubated with an equal volume of a suitably diluted pool of antisera to the indigenous serotypes of IPNV.
Tkiva se fiksirajo v nevtralnem fosfatno pufranem 10-odstotnem formalinu vsaj en dan, dehidrirajo v stopenjskih serijah etanola, zbistrijo v ksilenu in vstavijo v parafin v skladu s standardnimi protokoli.
The titre of the antiserum must be at least 1:2000 in a 50 % plaque neutralisation test.
Približno 5 μm debele rezine (za IHC prenesene na stekelca, prevlečena s poli-L-lizinom) se 20 minut segrevajo na 56 °C do 58 °C (največ 60 °C), razvoskajo v ksilenu, rehidrirajo v stopenjskih serijah etanola ter obarvajo s hematoksilinom in eozinom za patomorfologijo in IHC v skladu s točko 2.
The mixture shall be incubated for one hour at 15 °C.
Postopek barvanja za IHC
This shall represent the inoculum.
Vse inkubacije se izvajajo pri sobni temperaturi na stresalniku-zibki, razen če v temu sklepu ni drugače določeno:
Treatment of all inocula with antiserum to Infectious pancreatic necrosis virus (a virus which in some parts of the Europe occurs in 50 % of fish samples) aims at preventing cytopatic effect (CPE) due to IPN virus from developing in inoculated cell cultures.
antigen se dokaže tako, da rezine 2 × 6 minut vrejo v 0,1 M citratnega pufra s pH 6,0 in se nato 20 minut blokirajo s 5-odstotnim nemastnim mlekom v prahu in 2-odstotnim kozjim serumom v 50 mM TBS (TBS; Tris/HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,6);
To reduce the duration of the virological examinations as well as the number of cases in which occurrence of CPE would have to be considered potentially indicative of ISAV, such treatment may be carried out.
rezine se nato čez noč inkubirajo s primarnim protitelesom (monokulturno kunčje protitelo proti nukleoproteinu ISAV), razredčenim v TBS z 1-odstotnim nemastnim mlekom v prahu, nato pa trikrat sperejo v TBS z 0,1-odstotnim Tween 20;
When samples come from production units which are considered free from IPN, the treatment of inocula with antiserum to IPN virus may be omitted.
za dokazovanje vezanih protiteles se rezine 60 minut inkubirajo s protitelesi, konjugirani z alkalno fosfatazo na kunčji IgG.
Inoculation on cell cultures
Po zadnjem spiranju se doda Fast Red (1 mg ml– 1) in naftol AS-MX fosfat (0,2 mg ml– 1) z 1 mM levamizolom v 0,1 M TBS (pH 8,2), da se 20 minut razvija.
Atlantic salmon kidney (ASK) cells shall be used for primary ISAV isolation.
Rezine se nato sperejo pod tekočo vodo pred nasprotnim barvanjem s Harrisovim hematoksilinom in namestijo na vodeni medij s pokrivnimi stekelci.
Other cell lines of proven efficacy and sensitivity in isolating ISAV may be used, taking into consideration strain variability and the ability of different strains to replicate in different cell lines.
Pri vsaki nastavitvi se kot kontrole vključijo ISAV pozitivni in ISAV negativne tkivne rezine.
The ASK cells seem to support isolation and growth of the hitherto known virus isolates, as long as a low passage level is used.
Razlaga rezultatov IHC
A more distinct cytopathic effect (CPE) may appear in ASK cells than in other susceptible cell lines like SHK-1 (Salmon head kidney-1).
Rezultati testa IHC se razlagajo, kot je navedeno v točkah (a) in (b):
ASK (pass 65 or lower) cells shall be grown in L-15 medium containing 10 % foetal bovine serum, 2 % (vol:vol) 200 mM L-glutamine, and 0,08 % (vol:vol) 50 mM 2-mercaptoethanol in multi-well plates.
kontrolne rezine se štejejo za pozitivne, če se v kontrolnih rezinah opazi jasno razvidna rdeča (rdečkasta) citoplazemska in intranuklearna obarvanost endotelnih celic v krvnih žilah endokarda.
Antiserum-treated organ suspension shall be inoculated into young actively growing cell cultures to give a final dilution of tissue material to culture medium of 1:1000.
Testna vzorčna rezina se šteje za pozitivno samo, če se ugotovi takšna jasna, intranuklearna rdeča obarvanost endotelnih celic;
For each organ, suspension 40 μl of inoculum shall be added to one well containing 2 ml of culture medium.
kontrolne rezine se štejejo za negativne, če nimajo znatne barvne reakcije.
To minimise the risk of cross-contamination, separate 12- or 24-well plates shall be used for samples from different fish farm sites.
ker je intranuklearna lokalizacija v fazi replikacije virusa značilna za ortomiksovirusni nukleoprotein, sočasna citoplazemska obarvanost pa je pogosto prevladujoča, se citoplazemski in drugi vzorci obarvanosti brez intranuklearne lokalizacije štejejo za nespecifične ali neopredeljive.
One plate shall be left uninoculated to serve as a negative control.
Pozitivne barvne reakcije so običajno najmočnejše pri endotelnih celicah srca in ledvic.
A separate plate shall be inoculated with a reference isolate of ISAV as a positive control, as follows.
Endotelne barvne reakcije znotraj zelo obsežnih hemoragičnih lezij so lahko majhne ali jih ni, morda zaradi lize okuženih endotelnih celic.
One hundred μl of a stock preparation of ISAV (minimum titre 107 Tissue culture infective dose at the 50 % end point (TCID50 ml– 1)) shall be inoculated into the first well and mixed.
NATANČNE DIAGNOSTIČNE METODE IN POSTOPKI ZA NADZOR IN POTRDITEV OKUŽBE Z MARTEILIA REFRINGENS
A volume of this material shall be transferred from the first well to the second well to make a 1:10 dilution and mixed.
I. Natančne diagnostične metode in postopki za diagnozo okužbe z Marteilia refringens
This shall be repeated across the plate to make six 10-fold dilutions.
Pri vzorčenju in laboratorijskih preiskavah za namene pridobitve ali ohranitve zdravstvenega statusa glede okužbe z Marteilia refringens, kot je določeno v oddelku I dela 4 Priloge I, ali za potrditev ali izključitev prisotnosti navedene bolezni s seznama v skladu s členom 57(b) Direktive 2006/88/ES z diagnostičnimi metodami iz oddelka II dela 4 Priloge I se uporabljajo natančne diagnostične metode in postopki iz točk I.1, I.2 in I.3 tega dela.
Stock ISAV may be stored at – 80 °C for at least 2 years but once thawed must be used within 3 days.
Odprti ali pred kratkim poginuli posamezni mehkužci se vzorčijo po prioriteti, da se povečajo možnosti izsleditve okuženih živali.
Care shall be taken to prevent cross-contamination of test plates with positive control material.
Ostrige ali klapavice se, ko se enkrat vzorčijo, hranijo pri 4 °C ali na ledu v hladilniku največ 24 ur, če vzorci vključujejo odprte mehkužce, in ne več kot 72 ur, če takih mehkužcev ne vključujejo, v plastični vrečki, skupaj z nalepko s podatki o naravi in poreklu ostrig ali klapavic.
To avoid that risk, positive controls shall be set up and handled separately from test plates.
Odprti ali pred kratkim poginuli mehkužci se hranijo ločeno od drugih mehkužcev.
A sensitivity test every 6 months of ASK cells towards ISAV isolates may replace the use of including a positive control at each inoculation.
Za diagnostiko Marteilia refringens s histologijo se uporabijo 3 mm do 5 mm debele rezine tkiv, vključno s tkivom škrg in srca.
Samples shall be incubated at 15 ± 2 °C for up to 15 days.
Za nekatere teste se uporabi kos prebavne žleze, vključno z odtisi in verižno reakcijo s polimerazo (PCR).
Using a microscope, cell cultures shall be examined for CPE twice, between 5 to 7 and 12 to 14 days following inoculation.
Po sušenju tkiv prebavne žleze na vpojnem papirju se na steklenih preparatih naredi več odtisov.
If any pool shows CPE, virus identification procedures shall be initiated immediately in accordance with point II.2.4.
Preparati se posušijo na zraku, fiksirajo v metanolu ali absolutnem etanolu in obarvajo s komercialno dostopnim kompletom za barvanje krvi, kot je Diff-Quik®/Hemacolor®, v skladu z navodili proizvajalca.
If no CPE is observed by day 14, an Indirect fluorescent antibody test (IFAT), haemadsorption or RT-PCR shall be performed.
Po spiranju s tekočo vodo in sušenju se na preparate namestijo pokrivna stekelca z uporabo primerne sintetične smole.
Subcultivation shall be carried out between days 13 to 15.
Preparati se najprej preučujejo s povečavo × 200, nato pa potopljeni v olje s povečavo × 1000.
Culture supernatant shall be added to wells containing fresh actively growing cells in appropriate dilution (1/10) in multi-well plates and incubated at 14 ± 2 °C for up to 18 days.
Rezultat se šteje za pozitivnega, če se opazijo celice v velikosti do 30 μm–40 μm.
Using a microscope, cell cultures shall be examined for CPE twice, between days five to seven and days 14 to 18 following inoculation.
Citoplazma se obarva bazofilno, jedro pa eozinofilno.
If no CPE is observed by days 14 to 18, a haemadsorption or an RT-PCR test shall be performed.
Opazijo se bledi siji okrog velikih, močno obarvanih (refrakcijskih) granulah, pri večjih celicah pa celice znotraj celic.
If cytotoxicity occurs within the first 7 days of incubation, subcultivation shall be performed at that stage, and the cells shall be incubated for 14 to 18 days and sub cultivated again with a further period of 14 to 18 days incubation.
Ta metoda ni specifična za določeno vrsto parazitov.
If cytotoxicity occurs after 7 days, subcultivation shall be performed once and the cells shall be incubated to achieve the total period of 28 to 36 days incubation from the primary inoculation.
Rezine tkiv, ki vključujejo škrge, prebavno žlezo, plašč in gonado, se vsaj 24 ur fiksirajo v Davidsonovem fiksativu, čemur sledi običajni postopek za parafinsko histologijo in barvanje, na primer s hematoksilinom in eozinom.
If bacterial contamination occurs in the primary culture, the test shall be set up again using the tissue homogenate stored at – 80 °C.
Opazujejo se na vedno večjih povečavah do × 1000.
Prior to inoculation, the tissue homogenate shall be centrifuged at 4000 × g for 15 to 30 minutes at 0 to 6 °C and the supernatant shall be filtered at 0,22 μm.
Rezultat se šteje za pozitivnega, če se opazijo celice v velikosti od 4 μm do 40 μm.
If bacterial contamination occurs during the subcultivation step the supernatant shall be filtered at 0,22 μm, inoculated onto fresh cells and incubated for a further 14 to 18 days.
V zgodnjih fazah so celice večjedrne in sferične do podolgovate oblike.
Virus identification tests
V glavnem se najdejo v epitelu požiralnika in želodcu ter včasih v labialnih palpah.
If evidence of CPE is observed at any stage, or if a haemadsorption test is positive, virus identification shall be carried out.
Sporulacija vključuje delitev celic v celicah ter poteka v cevkah in kanalih prebavne žleze.
The methods of choice for the identification of ISAV shall be RT-PCR in accordance with point II.1 and Immunofluorescence (IF) in accordance with point II.2.6.
Med sporulacijo se pojavijo refrakcijske granule, ki pa jih v zgodnjih fazah ni možno opaziti.
If it is considered that other viruses may be present, supplementary virus identification tests shall be carried out.
V poznih fazah okužbe se opazijo prosti sporangiji v lumnu prebavnega trakta.
If those tests have not resulted in a definitive identification of the virus within 1 week, the supernatant shall be forwarded for immediate identification to:
Granule so lahko izrazito oranžne do izrazito rdeče barve.
the World Organisation for Animal Health (OIE) reference laboratory for ISA, or;
Lahko se uporabijo kompleti za ekstrakcijo DNK, ki so na voljo komercialno in običajno zagotavljajo visokokakovostno DNK, primerno za uporabo s protokoli PCR, kot je opisano v točki I.3.2.
a national reference laboratory or the EU reference laboratory for fish diseases as referred to in Annex VI to Directive 2006/88/EC.
Razvitih in objavljenih je bilo več protokolov PCR.
Haemadsorption
Uporabita se začetna oligonukleotida PCR, ciljno usmerjena v regijo notranjega prepisanega vmesnika (ITS1), ker lahko amplificirata samo Marteilia refringens.
As replication of ISAV in cell cultures does not always result in a CPE, every well shall be subject to an RT-PCR test or a haemadsorption test in accordance with this point, or an IF test in accordance with point II.2.6.
PCR se izvede na količini 50 μl.
Cell culture medium shall be removed from each well, including those of positive and negative controls, and placed in labelled sterile tubes.
Mešanice za PCR vsebujejo pufer (500 mM KCl, 100 mM Tris/HCl [pH 9,0 pri 25 °C] in 1-odstotni Triton® X-100), 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM mešanice dNTP, 1 μM smiselnega in protismiselnega začetnega oligonukleotida, 0,02 enoti μl– 1 Taq DNK polimeraze ter 10 ng–100 ng ekstrahirane DNK.
500 μl of a 0,2 % (vol:vol) suspension of washed rabbit or horse red blood cells, or a 0,05 % (vol:vol) suspension of washed rainbow trout or Atlantic salmon red blood cells, shall be added to each well and incubated at room temperature for 45 minutes.
Po petminutni denaturaciji DNK pri 94 °C se 30 ciklov izvede na naslednji način: denaturacija eno minuto pri 94 °C, prileganje eno minuto pri 55 °C ter elongacija eno minuto pri 72 °C na kilobazni par.
The red blood cells shall be removed and each well shall be washed twice with L-15 medium.
Izvede se končni postopek elongacije za 10 minut pri 72 °C.
Each well shall be examined using a microscope.
Za dokazovanje Marteilia refringens se PCR izvede z začetnima oligonukleotidoma, ki sta ciljno usmerjena v regijo ITS1 (5′-CCG-CAC-ACG-TTC-TTC-ACT-CC-3′ in 5′-CTC-GCG-AGT-TTC-GAC-AGA-CG-3′).
The presence of clusters of red blood cells attaching to the surface of ASK cells shall be indicative of presumptive infection with an orthomyxovirus.
Pozitivne kontrole sestojijo iz genomske DNK iz močno okužene živali gostiteljice ali plazmidne DNK, vključno s ciljno regijo.
If a haemadsorption test is positive, a virus identification test shall be performed immediately in accordance with point II.2.4.
Negativne kontrole sestojijo iz genomske DNK iz neokuženih živali gostiteljic in reagentov PCR brez ciljne DNK.
Immunofluorescence (IF)
Pozitiven rezultat je pozitivna amplifikacija PCR ob pričakovani velikosti (412 bp), pri čemer so vse negativne kontrole negativne, vse pozitivne kontrole pa pozitivne.
ASK (pass 65 or lower) shall be grown in a L-15 medium containing 10 % foetal bovine serum, 2 % (vol:vol) 200 mM L-glutamine, and 0,08 % (vol:vol) 50 mM 2-mercaptoethanol in multi-well plates and used at greater than 50 % confluence.
Razvitih in objavljenih je bilo več protokolov ISH.
Other cell lines or growth medium of proven efficacy may also be used.
Uporabi se sonda, ki je ciljno usmerjena v malo podenoto genskega kompleksa rRNK, ker je bil opravljen pregled skladnosti s histologijo.
225 μl of putative virus-infected culture supernatant shall be added to each of two wells, mixed and 225 μl transferred to two further wells, namely a 1:5 dilution.
Rezine tkiv, ki vključujejo škrge in prebavno žlezo, se vsaj 24 ur fiksirajo v Davidsonovem fiksativu, čemur sledi običajni postopek za parafinsko histologijo.
Two additional wells shall be left uninoculated to act as controls.
Odrežejo se 5 μm velike rezine in prenesejo na preparate, prevlečene z aminoalkilsilanom, ki se nato čez noč pečejo v pečici pri 40 °C.
Samples from each fish farm site shall be handled on separate plates, as shall the virus control.
Rezine se razvoskajo tako, da se za 10 minut potopijo v ksilen.
A virus control shall be established using a reference isolate of ISAV.
Ta korak se ponovi samo enkrat, nato pa se topilo odstrani, tako da se dvakrat zaporedoma po 10 minut potopi v kopeli z absolutnim etanolom.
Plates shall be incubated at 14 ± 2 °C and examined microscopically for up to 7 days.
Rezine se potem dehidrirajo, tako da se potopijo v stopenjske serije etanola.
When early CPE is observed, or if no CPE is observed within 7 days, the next step shall be fixation.
Rezine se 30 minut tretirajo s proteinazo K (100 μg ml– 1) v pufru TE (Tris [50 mM], EDTA [10 mM]) pri 37 °C.