natgillin/translations-raw huggingface dataset:
DHT is significantly more potent as an androgen than T and is also considered an end-product hormone.
Priprava teh raztopin je opisana v Dodatku II k validacijskemu poročilu (4).
The H295R assay does not measure DHT (see paragraph 10).
Po iniciaciji celične kulture H295R iz izvirne serije ATCC morajo celice rasti pet pasaž (tj. se celice delijo štirikrat).
The enzyme in the steroidogenic pathway which converts androgenic chemicals into oestrogenic chemicals is aromatase (CYP19).
Celice pete pasaže se nato zamrznejo v tekočem dušiku za shranjevanje.
CYP19 converts T into 17β-oestradiol (E2) and androstenedione into oestrone.
Pred zamrzovanjem celic se vzorec prejšnjih celic četrte pasaže preskusi na plošči za kontrolo kakovosti (glej odstavka 36 in 37), da se preveri, ali osnovno proizvajanje hormonov in odziv na pozitivne kontrolne kemikalije izpolnjujeta merila za kontrolo kakovosti preskusa iz tabele 5.
E2 and T are considered end-product hormones of the steroidogenic pathway.
Celice H295R je treba gojiti, zamrzniti in shraniti v tekočem dušiku, da se zagotovi stalna razpoložljivost celic ustrezne pasaže/starosti za gojenje in uporabo.
The specificity of the lyase activity of CYP17 differs for the intermediate substrates among species.
Največje število pasaž po dodajanju nove [15] ali zamrznjene [16] serije celic v kulturo, ki je sprejemljiva za uporabo v preskusu celic H295R, ne sme biti večje od 10.
In the human, the enzyme favours substrates of the Δ5-hydroxysteroid pathway (pregnenolone), whereas substrates in the Δ4-ketosteroid pathway (progesterone) are favoured in the rat (19).
Sprejemljive pasaže za kulture celic iz serije, ki je bila zamrznjena pri pasaži 5, so na primer med 4,5 in 10,5.
Such differences in the CYP17 lyase activity may explain some species-dependent differences in response to chemicals that alter steroidogenesis in vivo (6).
Za celice, ki se gojijo iz teh zamrznjenih serij, je treba upoštevati postopek iz odstavka 19.
The H295 cells have been shown to most closely reflect human adult adrenal enzyme expression and steroid production pattern (20), but are known to express enzymes for both the Δ5-hydroxysteroid and Δ4-ketosteroid pathways for androgen synthesis (7) (11) (13) (15).
Te celice je treba gojiti vsaj štiri (4) dodatne pasaže (pasaža 4,5), preden se uporabijo pri preskušanju.Začetne celice iz zamrznjene zaloge
Steroidogenic pathway in H295R cells.
Postopek za začetek gojenja celic iz zamrznjene zaloge je treba uporabiti, če se nova serija celic odstrani iz hrambe v tekočem dušiku za namen gojenja in preskušanja.
Enzymes are in italics, hormones are bolded and arrows indicate the direction of synthesis.
Podrobnosti o tem postopku so navedene v Dodatku III k validacijskemu poročilu (4).
Gray background indicates corticosteroid pathways/products.
Celice se odstranijo iz hrambe v tekočem dušiku, hitro odtajajo, vstavijo v obogateno gojišče v centrifugirki, centrifugirajo pri sobni temperaturi, ponovno suspendirajo v obogatenem gojišču in prestavijo v bučke.
Sex steroid pathways/products are circled.
Gojišče je treba naslednji dan zamenjati.
CYP = cytochrome P450;
Celice H295R se gojijo v inkubatorju pri 37 °C s 5 % CO2 v atmosferi z zrakom, pri čemer se gojišče obnovi dvakrat do trikrat na teden.
HSD = hydroxysteroid dehydrogenase;
Ko so celice približno 85–90-odstotno konfluentne, jih je treba deliti.
DHEA = dehydroepiandrosterone.
Delitev celic je potrebna, da se zagotovijo zdrave celice, ki rastejo in se ohranijo za opravljanje bioloških preskusov.
The human H295R adreno-carcinoma cell line is a useful in vitro model for the investigation of effects on steroid hormone synthesis (2) (7) (8) (9) (10).
Celice se trikrat sperejo s fosfatnim pufrom s soljo (PBS, brez Ca2+ Mg2+) in odstranijo iz bučk z dodajanjem ustreznega encima za ločevanje, npr. tripsina, v PBS (brez Ca2+ Mg2+).
Changes recorded by the test system in the form of alteration in the production of T and E2 can be the result of a multitude of different interactions of test chemicals with steroidogenic functions that are expressed by the H295R cells.
Priporočeno razmerje subkultivacije je od 1:3 do 1:4.
These include modulation of the expression, synthesis or function of enzymes involved in the production, transformation, or elimination of steroid hormones (12) (13) (14).
Ploščo je treba skrbno označiti.
The H295R assay has several advantages:
Pri pripravi celic H295R za zamrzovanje je treba upoštevati zgoraj opisani postopek delitve celic do faze ponovnega suspendiranja peletov celic na dnu centrifugirke.
It allows for the detection of both increases and decreases in the production of both T and E2;
V tem primeru se peleti celic ponovno suspendirajo v gojišču za zamrzovanje.
It does not require the use of animals;
Število plošč s 24 jamicami, pripravljenih, kot je opisano v odstavku 19, ki bo potrebno, je odvisno od števila kemikalij, ki jih je treba preskusiti, in konfluentnosti celic v posodah za gojenje.
The H295R cell line is commercially available.
Ena bučka (75 cm2) s celicami, ki so 80–90-odstotno konfluentne, bo na splošno zagotovila dovolj celic za 1–1,5 plošče (s 24 jamicami) s ciljno gostoto od 200000 do 300000 celic na mililiter gojišča, zaradi česar bo konfluentnost v jamicah po 24 urah 50–60-odstotna (slika 2).
The principle limitations of the assay are as follows:
To je tipična optimalna gostota celic za proizvajanje hormonov v preskusu.
Its metabolic capability is unknown but probably quite limited;
Pri večjih gostotah se vzorci proizvajanja T in E2 spremenijo.
therefore, chemicals that need to be metabolically activated will probably be missed in this assay.
Priporočljivo je, da se pred prvim izvajanjem preskusa preskusijo različne gostote zasejanja med 200000 in 300000 celicami na ml, za nadaljnje preskuse pa izbere gostota, ki po 24 urah povzroči 50–60-odstotno konfluentnost v jamicah.
Being derived from adrenal tissue, the H295R possesses the enzymes capable of producing the gluco-, and mineral-corticoids as well as the sex hormones;
Mikrofotografija celic H295R pri gostoti zasejanja 50 % v plošči s 24 jamicami za gojenje kulture po 24 urah, posneta na robu jamice (A) in sredi jamice (B)
therefore, effects on the production of gluco-, and mineral corticoids could influence the levels of T and E2 observed in the assay.
Obdukcija starševske(P) živali
It does not measure DHT and, therefore, would not be expected to detect chemicals that inhibit 5α-reductase in which case the Hershberger assay (16) can be used.
Pred parjenjem
The H295R assay will not detect chemicals that interfere with steroidogenesis by affecting the hypothalamic-pituitary-gonadal axis (HPG) axis as this can only be studied in intact animals.
Po parjenju
The purpose of the assay is the detection of chemicals that affect T and E2 production.
2 tedna
T is also an intermediate in the pathway to produce E2.
6 tednov
The assay can detect chemicals that typically inhibit or induce the enzymes of the steroidogenesis pathway.
Brejost
The assay is usually performed under standard cell culture conditions in 24-well culture plates.
Laktacija
Alternatively, other plate sizes can be used for conducting the assay;
Razvoj v maternici
however, seeding and experimental conditions should be adjusted accordingly to maintain adherence to the performance criteria.
Pred odstavitvijo
After an acclimation period of 24 h in multi-well plates, cells are exposed for 48 h to seven concentrations of the test chemical in at least triplicate.
Po odstavitvi
Solvent and a known inhibitor and inducer of hormone production are run at a fixed concentration as negative and positive controls.
Starševska generacija
At the end of the exposure period, the medium is removed from each well.
Kohorta
Cell viability in each well is analysed immediately after removal of medium.
Oznaka
Concentrations of hormones in the medium can be measured using a variety of methods including commercially available hormone measurement kits and/or instrumental techniques such as liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS).
Živali/kohorta
Data are expressed as fold change relative to the solvent control and the Lowest-Observed-Effect-Concentration (LOEC).
Približna starost ob obdukciji (v tednih)
If the assay is negative, the highest concentration tested is reported as the No-Observed-Effect-Concentration (NOEC).
Cilj je 20 legel na skupino
Conclusions regarding the ability of a chemical to affect steroidogenesis should be based on at least two independent test runs.
Presežek
The first test run may function as a range finding run with subsequent adjustment of concentrations for runs 2 and 3, if applicable, if solubility or cytotoxicity problems are encountered or the activity of the chemical seems to be at the end of the range of concentrations tested.
Za razmnoževanje
CULTURE PROCEDURE
Nevrotoksičnost
Cell Line
Imunotoksičnost
The NCI-H295R cells are commercially available from the American Type Culture Collections (ATCC) upon signing a Material Transfer Agreement (MTA) [14].
Rezerva
Introduction
20 M + 20 Ž
Due to changes in the E2 producing capacity of the cells with increasing age/passages (2), cells should be cultured following a specific protocol before they are used and the number of passages since the cells were defrosted as well as the passage number at which the cells were frozen and placed in liquid nitrogen storage should be noted.
10 M + 10 Ž @
The first number indicates the actual cell passage number and the second number describes the passage number at which the cells were frozen and placed in storage.
14 ali 20–25, če je sprožena
For example, cells that were frozen after passage five and defrosted and then were split three times (4 passages counting the freshly thawed cells as passage 1) after they were cultured again would be labelled passage 4.5.
@ en na leglo in skupno predstavniki 20 legel, če je možno
An example of a numbering scheme is illustrated in Appendix I to the validation report (4).
Gojišče se s pipeto nakapa iz bučke, celice pa se trikrat sperejo s sterilnim PBS (brez Ca2+ Mg2+).
Stock medium is used as the base for the supplemented and freezing mediums.
Za ločitev celic od bučke se doda raztopina z encimi (v PBS).
Supplemented medium is a necessary component for culturing cells.
Po ustrezno dolgem ločevanju celic je treba delovanje encima ustaviti z dodajanjem obogatenega gojišča v razmerju trikratnika volumna, uporabljenega za tretiranje z encimom.
Freezing medium is specifically designed to allow for impact-free freezing of cells for long-term storage.
Celice se prestavijo v centrifugirko, centrifugirajo pri sobni temperaturi, supernatant se odstrani, peleti celic pa se ponovno suspendirajo v obogatenem gojišču.
Prior to use, Nu-serum (or a comparable serum of equal properties that has been demonstrated to produce data that meets the test performance and Quality Control (QC) requirements), which is a constituent of supplemented media, should be analysed for background T and E2 concentrations.
Gostota celic se izračuna na primer s hemocitometrom ali števcem celic.
The preparation of these solutions is described in Appendix II to the validation report (4).
Raztopino s celicami je treba razredčiti do želene gostote za nasaditev in skrbno premešati, da se zagotovi homogena gostota celic.
After initiation of an H295R cell culture from an original ATCC batch, cells should be grown for five passages (i.e.the cells are split 4 times).
Celice je treba nasaditi z 1 ml raztopine s celicami na jamico, plošče in jamice pa označiti.
Passage five cells are then frozen in liquid nitrogen for storage.
Zasejane plošče se 24 ur inkubirajo pri 37 °C in 5 % CO2 v atmosferi z zrakom, da se omogoči pritrditev celic na jamice.
Prior to freezing the cells, a sample of the previous passage four cells is run in a QC plate (See paragraph 36 and 37) to verify whether the basal production of hormones and the response to positive control chemicals meet the assay quality control criteria as defined in Table 5.
ZAHTEVE GLEDE KONTROLE KAKOVOSTI
H295R cells need to be cultured, frozen and stored in liquid nitrogen to make sure that there are always cells of the appropriate passage/age available for culture and use.
Ključno je, da se med odmerjanjem v jamice dajo natančne količine raztopin in vzorcev, ker te količine določajo koncentracije, uporabljene v izračunih rezultatov preskusov.
The maximum number of passages after taking a new [15] or frozen [16] batch of cells into culture that is acceptable for use in the H295R assay should not exceed 10.
Pred iniciacijo celične kulture in nadaljnjimi preskušanji mora vsak laboratorij dokazati občutljivost svojega sistema za merjenje hormonov (odstavki 29–31).
For example, acceptable passages for cultures of cells from a batch frozen at passage 5 would be 4.5 through 10.5.
Če je treba uporabiti preskuse meritev hormonov na podlagi protiteles, je treba pred začetkom preskušanja analizirati možen vpliv kemikalij, ki se bodo preskušale, na sistem za merjenje, ki se uporablja za količinsko opredelitev T in E2, kot je opisano v odstavku 32.
For cells started from these frozen batches, the procedure described in paragraph 19 should be followed.
Priporočeno topilo za preskus je DMSO.
These cells should be cultured for at least four (4) additional passages (passage 4.5) prior to their use in testing.Starting Cells from the Frozen Stock
Če se uporabi drugo topilo, je treba določiti naslednje:
The procedure for starting the cells from frozen stock is to be used when a new batch of cells is removed from liquid nitrogen storage for the purpose of culture and testing.
citotoksičnost kot funkcijo koncentracije topila.
Details for this procedure are set forth in Appendix III to the validation report (4).
Priporoča se, da največja dovoljena koncentracija topila ne presega desetkratnika razredčine najmanj citotoksične koncentracije topila.
Cells are removed from liquid nitrogen storage, thawed rapidly, placed in supplemented medium in a centrifuge tube, centrifuged at room temperature, re-suspended in supplemented medium, and transferred to a culture flask.
Pred prvim izvajanjem preskušanja mora laboratorij opraviti zahtevani preskus, kot je opisan v odstavkih 33–35, s katerim dokaže, da je sposoben ohraniti in doseči ustrezno celično kulturo ter preskusne pogoje, ki so potrebni za preskušanja kemikalij.
The medium should be changed the following day.
Ob začetku preskušanja z novo serijo je treba pred uporabo nove serije celic opraviti preskus s kontrolno ploščo, da se ovrednoti delovanje celic, kot je opisano v odstavkih 36 in 37.
The H295R cells are cultivated in an incubator at 37 °C with 5 % CO2 in air atmosphere and the medium is renewed 2-3 times per week.
Učinkovitost sistema za merjenje hormonov
When the cells are approximately 85-90 % confluent, they should be split.
Občutljivost metode, točnost, natančnost in navzkrižna reaktivnost z matriko vzorčenja
Splitting of the cells is necessary to ensure the health and growth of the cells and to maintain cells for performing bioassays.
Vsak laboratorij lahko za analizo proizvajanja T in E2 v celicah H295R uporabi sistem za merjenje hormonov po svoji izbiri, pod pogojem, da izpolnjuje merila uspešnosti, vključno z mejo določljivosti.
The cells are rinsed three times with phosphate-buffered saline (PBS, without Ca2+ Mg2+.) and freed from the culture flask by the addition of an appropriate detachment enzyme, e.g. trypsin, in PBS (without Ca2+ Mg2+).
Meji sta običajno 100 pg/ml za T in 10 pg/ml za E2 ter temeljita na osnovnih ravneh hormonov, opaženih v validacijskih študijah.
Immediately after the cells detach from the culture flask, the enzyme action should be stopped with the addition of supplemented medium at a ratio of 3× the volume used for the enzyme treatment.
Vendar so lahko glede na osnovne ravni hormonov, dosežene v zadevnem laboratoriju, ustrezne višje ali nižje ravni.
Cells are placed into a centrifuge tube, centrifuged at room temperature, the supernatant is removed and the pellet of cells is re-suspended in supplemented medium.
Pred začetkom plošče za kontrolo kakovosti in potekov preskusov mora laboratorij dokazati, da je s preskusom hormonov, ki se bo uporabil, koncentracije hormonov v obogatenem gojišču mogoče izmeriti z ustrezno točnostjo in natančnostjo, da so izpolnjena merila za kontrolo kakovosti iz tabel 1 in 5, in sicer z analizo obogatenega gojišča s primešanim hormonom kot interno kontrolo.
The appropriate amount of cell solution is placed in the new culture flask.
Obogatenemu gojišču se dodajo vsaj tri koncentracije vsakega hormona (npr. 100, 500 in 2500 pg/ml T, 10, 50 in 250 pg/ml E2 ali pa se lahko za najmanjše primešane koncentracije za T in E2 uporabijo in analizirajo najmanjše možne koncentracije na podlagi mej zaznavnosti za izbrani sistem za merjene hormonov).
The amount of cell solution should be adjusted so that the cells are confluent within 5-7 days.
Izmerjene koncentracije hormonov neekstrahiranih vzorcev morajo biti znotraj 30 % nominalnih koncentracij, razlika med ponovnimi meritvami istega vzorca pa ne sme presegati 25 % (glej tudi tabelo 8 za dodatna merila kontrole kakovosti).
The recommended sub-cultivation ratio is 1:3 to 1:4.
Če so ta merila kontrole kakovosti izpolnjena, se šteje, da je izbrani preskus meritve hormonov dovolj točen in natančen ter ne reagira navzkrižno s sestavinami v gojišču (matrika vzorca) tako, da bi se lahko pričakoval znaten vpliv na rezultat preskusa.
The plate should be carefully labelled.
V tem primeru ekstrakcija vzorcev pred merjenjem hormonov ni potrebna.
The cells are now ready to be used in the assay and excess cells should be frozen in liquid nitrogen as described in paragraph 20.
Če merila kakovosti iz tabel 1 in 8 niso izpolnjena, lahko pride do znatnih vplivov matrike in je treba izvesti preskus z ekstrahiranim primešanim gojiščem.
Freezing H295R Cells (preparing cells for liquid nitrogen storage)
Primer postopka ekstrakcije je opisan v Dodatku II k validacijskemu poročilu (4).
To prepare H295R cells for freezing, the procedure described above for splitting cells should be followed until the step for re-suspending the pellet of cells in the bottom of the centrifuge tube.
Meritve koncentracij hormonov v ekstrahiranih vzorcih je treba trikrat ponoviti [17].
Here, the pellet of cells is re-suspended in freezing medium.
Če je mogoče dokazati, da sestavine gojišča po ekstrakciji ne vplivajo na metodo zaznavanja hormonov, kot je opredeljeno z merili kontrole kakovosti, je treba vse nadaljnje preskuse izvesti z uporabo ekstrahiranih vzorcev.
The solution is transferred to a cryogenic vial, labelled appropriately, and frozen at – 80 °C for 24 hours after which the cryogenic vial is transferred to liquid nitrogen for storage.
Če po ekstrakciji meril kontrole kakovosti ni mogoče izpolniti, uporabljeni sistem za merjenje hormonov ni primeren za namen preskusa steroidogeneze celic H295R in je treba uporabiti drugo metodo za zaznavanje hormonov.Umeritvena krivulja
Plating and Pre-incubation of Cells for Testing
Koncentracije hormonov v kontrolnih vzorcih s topilom (KVT) morajo biti znotraj linearnega dela umeritvene krivulje.
The number of 24-well plates, prepared as outlined in paragraph 19, that will be needed depends on the number of chemicals to be tested and the confluency of the cells in the culture dishes.
Najbolje je, da so vrednosti kontrolnih vzorcev s topilom blizu sredine linearnega dela, da se omogoči merjenje povzročanja in zaviranja sinteze hormonov.
As a general rule, one culture flask (75 cm2) of 80-90 % confluent cells will supply sufficient cells for one to 1,5 (24-well) plates at a target density of 200000 to 300000 cells per ml of medium resulting in approximately 50-60 % confluency in the wells at 24 hours (Figure 2).
Ustrezno se izberejo razredčine gojišča (ali ekstraktov), ki jih je treba izmeriti.
This is typically the optimal cell density for hormone production in the assay.
Linearno povezavo je treba določiti z ustreznim statističnim pristopom.
At higher densities, T as well as E2 production patterns are altered.
Preskus vpliva kemikalij
Before conducting the assay the first time, it is recommended that different seeding densities between 200000 and 300000 cells per ml be tested, and the density resulting in 50-60 % confluency in the well at 24 hours be selected for further experiments.
Če se bodo za merjenje hormonov uporabljali preskusi na podlagi protiteles, kot so encimskoimunski preskusi (ELISA) in radioimunski preskusi (RIA), je treba za vsako kemikalijo preskusiti možen vpliv na sistem za merjenje hormonov, ki se bo uporabil, preden se začne dejansko preskušanje kemikalij (Dodatek III k validacijskemu poročilu (4)), ker lahko nekatere kemikalije vplivajo na te preskuse (17).
Photomicrograph of H295R cells at a seeding density of 50 % in a 24 well culture plate at 24 hours taken at the edge (A) and centre (B) of a well
Če se z analizo hormonov ugotovi prisotnost vpliva, ki je enak ali večji od 20 % osnovne proizvodnje hormonov T in/ali E2, je treba opraviti preskus vpliva kemikalij na preskus hormonov (kot je opisan v oddelku 5.0 Dodatka III k validacijskemu poročilu (4)) pri vseh razredčinah kemijskih založnih raztopin, da se opredeli odmerek, pri katerem se pojavi znaten (≥ 20 %) vpliv.
Necropsy P animals
Če je vpliv manjši od 30 %, se rezultati lahko popravijo za vpliv.
Pre-mating
Če vpliv preseže 30 %, so podatki neveljavni, pri čemer je treba podatke pri teh koncentracijah zavreči.
Post-mating
Če se znaten vpliv preskusne kemikalije na sistem za merjenje hormonov pojavi pri več kot eni necitotoksični koncentraciji, je treba uporabiti drug sistem za merjenje hormonov.
2 weeks
Da se prepreči vpliv zaradi kontaminacije s kemikalijami, se priporoča, da se hormoni iz gojišča ekstrahirajo z ustreznim topilom, pri čemer so možne metode navedene v validacijskem poročilu (4).
6 weeks
Merila uspešnosti za sisteme za merjenje hormonov
Pregnancy
Merilo
Lactation
Občutljivost metode merjenja
In-utero development
Meja določljivosti (LOQ)
Pre-weaning
Učinkovitost ekstrakcije hormonov (samo, kadar je ekstrakcija potrebna)
Post-weaning
Povprečne stopnje izkoristka (na podlagi treh ponovitev meritev) primešanih količin hormonov od dodane količine ne smejo odstopati za več kot 30 %.
Parental generation
Vpliv kemikalij (samo za sisteme na podlagi protiteles)
Cohort
Znatna (≥ 30 % osnovne proizvodnje zadevnega hormona) navzkrižna reaktivnost s hormoni, ki jih proizvedejo celice, se ne sme pojaviti [19] [20].
Designation
Preskus usposobljenosti laboratorija
Animals/cohort
Pred preskušanjem neznanih kemikalij je treba s preskusom usposobljenosti laboratorija dokazati, da je laboratorij usposobljen za doseganje in ohranitev ustrezne celične kulture ter preskusnih pogojev, ki so potrebni za uspešno izvedbo preskusa.
Approximate age at necropsy (weeks)
Ker je uspešnost preskusa neposredno povezana z osebjem laboratorija, ki opravlja preskus, je treba te postopke delno ponoviti, če se osebje v laboratoriju zamenja.
Target is 20 litters per group
Ta preskus usposobljenosti bo izveden pod enakimi pogoji, kot so navedeni v odstavkih 38 do 40, z izpostavitvijo celic 7 naraščajočim koncentracijam močnih, zmernih in šibkih povzročiteljev in zaviralcev ter negativni kemikaliji (glej tabelo 2).
Surplus
Za vse kemikalije se vodijo ločene plošče, kot je prikazano v tabeli 6.
Reproductive
Vsak dnevni preskus s kemikalijami za preskušanje usposobljenosti mora vključevati eno ploščo za kontrolo kakovosti (tabela 4, odstavka 36–37).
Neurotoxicity
Kemikalije za preverjanje usposobljenosti in koncentracije izpostavljenosti
Immunotoxicity
Kemikalija za preskušanje usposobljenosti
Spares
Preskusne koncentracije (μM)
20 M + 20 F
Prokloraz
10 M + 10 F @
Atrazin
14 or 20-25 if triggered
Aminoglutetimid
The medium is pipetted off the culture flask, and the cells are rinsed 3 times with sterile PBS (without Ca2+Mg2+).
Izpostavljenost celic H295R kemikalijam za preskus usposobljenosti se izvede v ploščah s 24 jamicami med preskusom usposobljenosti laboratorija.
An enzyme solution (in PBS) is added to detach the cells from the culture flask.
Vsi odmerki preskusne kemikalije se odmerjajo v μM.