natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Isoelectric focusing of plasmin-treated caseins in the presence of urea and staining of proteins
Metóda je vhodná na citlivé a špecifické zisťovanie prírodného a tepelne upraveného mlieka a kazeinátu v čerstvých a zrejúcich syroch vyrobených z ovčieho mlieka, kozieho mlieka alebo byvolieho mlieka, alebo zo zmesí kozieho, ovčieho a byvolieho mlieka.
Evaluation of stained γ3 and γ2 -casein patterns (evidence of cow's milk) by comparison of the pattern obtained from the sample with those obtained in the same gel from the reference standards containing 0 % and 1 % cow's milk.
Nie je vhodná na zisťovanie falšovania mlieka a syra tepelne upravenými bielkovinovými koncentrátmi z kravskej srvátky.
Unless otherwise indicated, analytical grade chemicals shall be used.
Izolácia kazeínov zo syra a referenčných štandardov
Water shall be double-distilled or of equivalent purity.
Rozpustenie izolovaných kazeínov a prevedenie plazmínového (EC.3.4.21.7) štiepenia
Note: The following details apply to laboratory prepared polyacrylamide gels containing urea, of dimensions 265 × 125 × 0,25 mm.
Izoelektrická fokusácia plazmínovaných kazeínov za prítomnosti močoviny a farbenie bielkovín
Where other sizes and types of gel are used, the separation conditions may have to be adjusted.
Hodnotenie zafarbených γ3 a γ2-kazeínových záznamov (dôkaz prítomnosti kravského mlieka) porovnaním záznamu získaného zo vzorky so záznamami získanými z rovnakého gélu z referenčných štandardných roztokov obsahujúcich 0 % a 1 % kravského mlieka.
Isoelectric focusing
Ak nie je uvedené inak, použijú sa chemikálie analytickej kvality.
Reagents for production of the urea containing polyacrylamide gels
Použije sa dvojnásobne destilovaná voda alebo voda ekvivalentnej čistoty.
Stock gel solution
Poznámka: Nasledujúci podrobný popis použite na laboratórne pripravené polyakrylamidové gély obsahujúce močovinu s rozmermi 265 × 125 × 0,25 mm.
Dissolve:
Ak sa použije iná veľkosť a typ gélu, môže byť potrebná úprava podmienok separácie.
4,85 g acrylamide
Izoelektrická fokusácia
0,15 g N, N′-methylene-bis-acrylamide (BIS)
Reagenty pre výrobu polyakrylamidových gélov obsahujúcich močovinu
48,05 g urea
Zásobný gélový roztok
15,00 g glycerol (87 % w/w),
Vo vode rozpusťte:
in water and make up to 100 ml and store in a brown glass bottle in the refrigerator.
4,85 g akrylamidu
Note: A commercially available pre-blended acrylamide/BIS solution may be used in preference to the quoted fixed weights of the neurotoxic acrylamides.
0,15 g N, N′-metyléndiakrylamidu (BIS)
Where such a solution contains 30 % w/v acrylamide and 0,8 % w/v BIS, a volume of 16,2 ml shall be used for the formulation instead of the fixed weights.
48,05 g močoviny
The shelf life of the stock solution is a maximum of 10 days; if its conductivity is more than 5 μS, de-ionize by stirring with 2 g Amberlite MB-3 for 30 minutes, then filter through a 0,45 μm membrane.
15,00 g glycerolu (87 % hm.)
Gel solution
doplňte vodou do 100 ml a uskladnite vo fľaši z hnedého skla v chladničke.
Prepare a gel solution by mixing additives and ampholytes (*) with the stock gel solution (see 4.1.1).
Poznámka: Namiesto uvedených pevne stanovených hmotností neurotoxických akrylamidov možno použiť komerčne dostupný namiešaný roztok akrylamidu a BIS.
9,0 ml stock solution
Ak takýto roztok obsahuje 30 % hm./obj. akrylamidu a 0,8 % hm./obj. BIS, namiesto uvedených presne stanovených hmotností sa na zmiešanie roztoku použije objem 16,2 ml komerčného roztoku.
24 mg β-alanine
Trvanlivosť zásobného roztoku je maximálne 10 dní; ak je jeho vodivosť väčšia ako 5 μS, deionizujte ho miešaním s 2 g amberlitu MB-3 počas 30 minút a potom ho prefiltrujte cez membránový filter s veľkosťou pórov 0,45 μm.
500 μl ampholyte pH 3,5-9,5
Gélový roztok
250 μl ampholyte pH 5-7
Gélový roztok pripravte zmiešaním aditív a amfolytov (*) so zásobným gélovým roztokom (pozri 4.1.1).
250 μl ampholyte pH 6-8
9,0 ml zásobného roztoku
Mix the gel solution and de-gas for two to three minutes in an ultrasonic bath or in vacuum.
24 mg β-alanínu
Note: Prepare the gel solution immediately prior to pouring it (see 6.2).
500 μl amfolytu pH 3,5 – 9,5
Catalyst solutions
250 μl amfolytu pH 5 – 7
N, N, N′ N′ — tetramethylethylenediamine (Temed)
250 μl amfolytu pH 6 – 8
40 % w/v ammonium persulphate (PER):
Gélový roztok zmiešajte a odplyňte počas dvoch až troch minút v ultrazvukovom kúpeli alebo vo vákuu.
Dissolve 800 mg PER in water and make up to 2 ml.
Poznámka: Gélový roztok pripravte tesne pred jeho použitím (pozri 6.2).
Note: Always use freshly prepared PER solution.
Katalytické roztoky
Contact fluid
N, N, N′, N′-tetrametyletyléndiamín (Temed)
Kerosene or liquid paraffin
40 % hm./obj. peroxodisíran diamónny (PER):
Anode solution
Rozpusťte 800 mg PER vo vode a doplňte vodu do 2 ml.
Dissolve 5,77 g phosphoric acid (85 % w/w) in water and dilute to 100 ml.
Poznámka: Vždy používajte čerstvo pripravený roztok PER.
Cathode solution
Kontaktná kvapalina
Dissolve 2,00 g sodium hydroxide in water and dilute to 100 ml with water.
Kerozín alebo kvapalný parafín
Sample preparation
Anódový roztok
Reagents for protein isolation
Vo vode rozpusťte 5,77 g kyseliny fosforečnej (85 % hm.) a doplňte na 100 ml.
Dilute acetic acid (25,0 ml of glacial acetic acid made up to 100 ml with water)
Katódový roztok
Dichloromethane
Vo vode rozpusťte 2 g hydroxidu sodného a doplňte vodou na 100 ml.
Acetone
Príprava vzorky
Protein dissolving buffer
Reagenty na izoláciu bielkovín
Dissolve
Zrieďte kyselinu octovú (25 ml ľadovej kyseliny octovej doplňte vodou do 100 ml.)
5,75 g glycerol (87 % w/w)
Dichlórmetán
24,03 g urea
Acetón
250 mg dithiothreitol,
Tlmivý roztok rozpúšťajúci bielkoviny
in water and make up to 50 ml
Vo vode rozpusťte
Note: Store in a refrigerator, maximum shelf-life one week.
5,75 g glycerolu (87 % hm.)
Reagents for plasmin cleavage of caseins
24,03 g močoviny
Ammonium carbonate buffer
250 mg (+-)-(R*,R*)-1,4-disulfanylbután-2,3-diolu (dithiothreitolu)
Titrate a 0,2 mol/l ammonium hydrogencarbonate solution (1,58 g/100 ml water) containing 0,05 mol/l ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 1,46 g/100 ml with a 0,2 mol/l ammonium carbonate solution (1,92 g/100 ml water) containing 0,05 mol/l EDTA to pH 8.
doplňte vodou do 50 ml.
Bovine plasmin (EC.
Poznámka: Skladujte v chladničke; maximálna trvanlivosť je jeden týždeň.
3.4.21.7), activity at least 5 U/ml
Reagenty pre plazmínové štiepenie kazeínov
ε-Aminocaproic acid solution for enzyme inhibition
Tlmivý roztok uhličitanu amónneho
Dissolve 2,624 g ε-aminocaproic acid (6 amino-n-hexanoic acid) in 100 ml of 40 % (v/v) ethanol.
Titrujte roztok 0,2 mol/l hydrogénuhličitanu amónneho (1,58 g/100 ml vody) obsahujúci 0,05 mol/l kyseliny etyléndiamíntetraoctovej (EDTA, 1,46 g/100 ml) s 0,2 mol/l roztokom uhličitanu amónneho (1,92 g/100 ml vody) obsahujúcim 0,05 mol/l EDTA na pH 8.
Standards
Plazmín z kravského mlieka (EC.
Certified reference standards of a mixture of renneted ewe's and goat's skimmed milk containing 0 % and 1 % of cow's milk are available from the Commission's Institute for Reference Materials and Measurements, B-2440 Geel, Belgium
3.4.21.7), s aktivitou najmenej 5 U/ml
Preparation of laboratory interim-standards of buffalo's renneted milk containing 0 % and 1 % of cow's milk
Roztok kyseliny ε-aminohexánovej na inhibíciu enzýmov
Skimmed milk is prepared by centrifuging of either buffalo or bovine raw bulk milk at 37 °C at 2500 g for 20 minutes.
Rozpusťte 2,624 g kyseliny ε-aminohexánovej (kyselina 6-amino-n-hexánová) v 100 ml 40 % (obj.) etanolu.
After cooling the tube and contents rapidly to 6 to 8 °C, the upper fat layer is removed completely.
Referenčné štandardy
For the preparation of the 1 % standard add 5,00 ml of bovine skimmed milk to a 495 ml of buffalo's skimmed milk in a 1 l beaker, adjust the pH to 6,4 by the addition of dilute lactic acid (10 % w/v).
Certifikované referenčné štandardy zmesi odstredeného ovčieho a kozieho mlieka upraveného syridlom s obsahom 0 % a 1 % kravského mlieka sú dostupné v Inštitúte Komisie pre referenčné materiály a merania (Commission's Institute for Reference Materials and Measurements), B-2440 Geel, Belgicko.
Adjust the temperature to 35 °C and add 100 μl of calf rennet (rennet activity 1: 10000, c.
Príprava dočasných laboratórnych štandardných roztokov pre byvolie mlieko upravené syridlom s obsahom 0 % a 1 % kravského mlieka.
3000 U/ml), stir for 1 minute and then leave the beaker covered with an aluminium foil at 35 °C for one hour to allow formation of the curd.
Odstredené mlieko sa pripraví odstredením buď byvolieho, alebo kravského surového mlieka pri podmienkach 37 °C, 2500 g, 20 minút.
After the curd has formed, the whole renneted milk is freeze-dried without prior homogenization or draining of the whey.
Po rýchlom ochladení skúmavky a jej obsahu na 6 až 8 °C sa úplne odstráni horná vrstva tuku.
After freeze-drying it is finely ground to produce a homogeneous powder.
Na prípravu 1 % štandardu pridajte do 495 ml byvolieho odstredeného mlieka 5 ml kravského odstredeného mlieka v kadičke s objemom 1 liter a pridaním zriedenej kyseliny mliečnej (10 % hm./obj.) upravte pH na 6,4.
For the preparation of the 0 % standard, carry out the same procedure using genuine buffalo skimmed milk.
Teplotu nastavte na 35 °C a pridajte 100 μl teľacieho syridla (aktivita syridla 1: 10000, c.
The standards shall be stored at – 20 °C.
3000 U/ml), miešajte 1 minútu a potom kadičku prikryte hliníkovou fóliou a nechajte jednu hodinu odstáť pri teplote 35 °C, aby sa vytvoril tvaroh.
Note: It is advisable to check the purity of the buffalo milk by isoelectric focusing of the plasmin-treated caseins before preparation of the standards.
Po vytvorení tvarohu celé mlieko upravené syridlom vysušte mrazom bez predošlej homogenizácie alebo zliatia srvátky.
Reagents for protein staining
Po vysušení mrazom je roztok vhodný na vytvorenie homogénneho prášku.
Fixative
Na prípravu 0 % štandardného roztoku uskutočnite rovnaký postup s použitím pravého byvolieho odstredeného mlieka.
Dissolve 150 g trichloroacetic acid in water and make up to 1000 ml.
Štandardy sa musia skladovať pri teplote – 20 °C.
Destaining solution
Poznámka: Pred prípravou štandardného roztoku sa odporúča skontrolovať čistotu byvolieho mlieka izoelektrickou fokusáciou plazmínovaných kazeínov.
Dilute 500 ml methanol and 200 ml glacial acetic acid to 2000 ml with distilled water.
Reagenty na farbenie bielkovín
Note: Prepare the destaining solution fresh every day; it can be prepared by mixing equal volumes of stock solutions of 50 % (v/v) methanol and 20 % (v/v) glacial acetic acid.
Ustaľovač
Staining solutions
Vo vode rozpusťte 150 g kyseliny trichlóroctovej a doplňte na 1000 ml.
Staining solution (stock solution 1)
Roztok na odfarbovanie
Dissolve 3,0 g Coomassie Brilliant Blue G-250 (C.I. 42655) in 1000 ml 90 % (v/v) methanol using a magnetic stirrer (approximately 45 minutes), filter through two medium-speed folded filters.
Rozrieďte 500 ml metanolu a 200 ml ľadovej kyseliny octovej s destilovanou vodou na 2000 ml.
Staining solution (stock solution 2)
Poznámka: Roztok na odfarbovanie pripravte každý deň čerstvý; môže sa pripraviť zmiešaním rovnakých objemov zásobných roztokov 50 % (obj.) metanolu a 20 % (obj.) ľadovej kyseliny octovej.
Dissolve 5,0 g copper sulphate pentahydrate in 1000 ml 20 % (v/v) acetic acid.
Roztoky na farbenie
Staining solution (working solution)
Roztok na farbenie (zásobný roztok 1)
Mix together 125 ml of each of the stock solutions (4.11.1, 4.11.2) immediately prior to staining.
Rozpusťte 3,0 g Coomassie Brilliant Blue G-250 (C.I. 42655) v 1000 ml 90 % (obj.) metanolu magnetickým miešadlom (miešajte asi 45 minút), prefiltrujte cez dva stredne rýchle skladané filtre.
Note: The staining solution should be prepared on the day that it is used.
Roztok na farbenie (zásobný roztok 2)
EQUIPMENT
V 1000 ml 20 % (obj.) kyseliny octovej rozpusťte 5,0 g pentahydrátu síranu meďnatého.
Glass plates (265 × 125 × 4 mm); rubber roller (width 15 cm); levelling table
Roztok na farbenie (pracovný roztok)
Gel carrier sheet (265 × 125 mm)
Bezprostredne pred farbením zmiešajte 125 ml oboch zásobných roztokov (4.11.1, 4.11.2).
Covering sheet (280 × 125 mm).
Poznámka: Roztok na farbenie by sa mal pripraviť v deň použitia.
Stick on strip of adhesive tape (280 × 6 × 0,25 mm) to each long edge (see Figure 1)
VYBAVENIE
Electrofocusing chamber with cooling plate (e.g. 265 × 125 mm) and suitable power supply (≥ 2,5 kV) or automatic electrophoresis device
Sklenené platničky (265 × 125 × 4 mm); gumený valček (šírka 15 cm); vyrovnávacia tabuľka.
Circulation cryostat, thermostatically controlled at 12 ± 0,5 °C
Fólia na gél (265 × 125 mm)
Centrifuge, adjustable to 3000 g
Krycia fólia (280 × 125 mm).
Electrode strips (≥ 265 mm long)
Na oba dlhé konce upevnite pás lepiacej pásky (280 × 6 × 0,25 mm) (pozri obrázok 1).
Plastic dropping bottles for the anode and cathode solutions
Elektrofokusačná komora s chladiacou doskou (napr. 265 × 125 mm) a vhodným zdrojom energie (≥ 2,5 kV) alebo automatické elektroforézne zariadenie
Sample applicators (10 × 5 mm, viscose or low protein-adsorption filter paper)
Cirkulačný kryostat s termostatickou kontrolou na 12 ± 0,5 °C
Stainless steel or glass staining and destaining dishes (e.g. 280 × 150 mm instrument trays)
Odstredivka nastaviteľná na 3000 g
Adjustable rod homogenizer (10 mm shaft diameter), rpm range 8000 to 20000
Elektródy (≥ 265 mm dlhé)
Film welder
Plastové fľaše s kvapkadlom na anódový a katódový roztok
25 μl micropipettes
Aplikátory vzoriek (10 × 5 mm, viskózový papier alebo papier s nízkou absorpciou bielkovín)
Vacuum concentrator or freeze-dryer
Nerezové alebo sklené misky na farbenie a odfarbovanie (napr. podnosy na nástroje s rozmermi 280 × 150 mm)
Thermostatically controlled water bath adjustable to 35 and 40 ± 1 °C with shaker
Nastaviteľný tyčový homogenizátor (priemer hriadeľa 10 mm), 8000 až 20000 ot/min
Densitometer equipment reading at λ = 634 nm
Zváračka fólií
Isolation of caseins
Mikropipety na 25 μl
Weigh the amount equivalent to 5 g dry mass of cheese or the reference standards into a 100 ml centrifuge tube, add 60 ml distilled water and homogenize with a rod homogenizer (8000 to 10000 rpm).
Vákuový koncentrátor alebo lyofilizátor
Adjust to pH 4,6 with dil. acetic acid (4.5.1) and centrifuge (5 minutes, 3000 g).
Termostaticky kontrolovaný vodný kúpeľ nastaviteľný na 35 a 40 ± 1 °C, s možnosťou pretrepania
Decant the fat and whey, homogenize the residue at 20000 rpm in 40 ml distilled water adjusted to pH 4,5 with dil. acetic acid (4.5.1), add 20 ml dichloromethane (4.5.2), homogenize again and centrifuge (5 minutes, 3000 g).
Denzitometer umožňujúci meranie pri vlnovej dĺžke λ = 634 nm
Remove the casein layer that lies between the aqueous and organic phases (see Figure 2) with a spatula and decant off both phases.
Izolácia kazeínov
Rehomogenise the casein in 40 ml distilled water (see above) and 20 ml dichloromethane (4.5.2) and centrifuge.
Do odstreďovacej skúmavky s objemom 100 ml odvážte množstvo syra alebo referenčných štandardov zodpovedajúce 5 g sušiny, pridajte 60 ml destilovanej vody a homogenizujte tyčovým homogenizátorom (8000 až 10000 ot/min).
Repeat this procedure until both extraction phases are colourless (two to three times).
Hodnotu pH upravte na 4,6 zriedenou kyselinou octovou (4.5.1) a odstreďte (5 minút, 3000 g).
Homogenize the protein residue with 50 ml acetone (4.5.3) and filter through a medium-speed folded filter paper.
Zlejte tuk a srvátku, rezíduum homogenizujte pri 20000 ot/min v 40 ml destilovanej vody s pH upraveným na 4,5 zriedenou kyselinou octovou (4.5.1), pridajte 20 ml dichlórmetánu (4.5.2), opäť homogenizujte a odstreďte (5 minút, 3000 g).
Wash the residue on the filter with two separate 25 ml portions of acetone each time and allow to dry in the air or a stream of nitrogen, then pulverize finely in a mortar.
Špachtličkou odstráňte vrstvu kazeínu, ktorá sa nachádza medzi vodnou a organickou vrstvou (pozri obrázok 2) a zlejte obe vrstvy.
Note: Dry casein isolates should be kept at –20 °C.
Kazeín znova homogenizujte v 40 ml destilovanej vody (pozri vyššie) a 20 ml dichlórometánu (4.5.2.) a odstreďte.
Plasmin cleavage of β-caseins to intensify γ-caseins
Tento postup opakujte, pokým nebudú obe extrakčné vrstvy bezfarebné (dva až trikrát).
Disperse 25 mg of isolated caseins (6.1.1) in 0,5 ml ammonium carbonate buffer (4.7.1) and homogenize for 20 minutes by e.g. using ultrasonic treatment.
Bielkovinové rezíduum homogenizujte s 50 ml acetónu (4.5.3) a prefiltrujte cez stredne rýchly skladaný filtračný papier.
Heat to 40 °C and add 10 μl plasmin (4.7.2), mix and incubate for one hour at 40 °C with continuous shaking.
Rezíduum z filtra zakaždým zmyte dvoma osobitnými 25 ml dávkami acetónu a nechajte vyschnúť na vzduchu alebo pod prúdom dusíka a potom ho rozdrvte na jemný prášok v mažiari.
To inhibit the enzyme add 20 μl ε-aminoproic acid solution (4.7.3), then add 200 mg of solid urea and 2 mg of dithiothreitol.
Poznámka: Suché izoláty kazeínu by sa mali skladovať pri – 20 °C.
Note: To obtain more symmetry in the focused casein bands it is advisable to freeze-dry the solution after adding the ε-aminocaproic acid and then dissolving the residues in 0,5 ml protein dissolving buffer (4.6).
Plazmínové štiepenie β-kazeínov na intenzifikáciu γ-kazeínov
Preparation of the urea containing polyacrylamide gels
V 0,5 ml tlmivého roztoku uhličitanu amónneho (4.7.1.) rozpusťte 25 mg izolovaných kazeínov (6.1.1.) a 20 minút ich homogenizujte napr. použitím ultrazvuku.
With the aid of a few drops of water roll the gel carrier sheet (5.2) onto a glass plate (5.1), removing any extraneous water with paper towel or tissue.
Zohrejte ich na 40 °C a pridajte 10 μl plazmínu (4.7.2), premiešajte a inkubujte 1 hodinu pri teplote 40 °C za stáleho pretrepávania.
Roll the cover sheet (5.3) with spacers (0,25 mm) onto another glass plate in the same way.
Na inhibovanie enzýmu pridajte 20 μl roztoku kyseliny ε-aminohexánovej (4.7.3) a následne pridajte 200 mg pevnej močoviny a 2 mg (2R,3S)-1,4-disulfanylbután-2,3-diolu (dithiothreitolu).
Lay the plate horizontally on a levelling table.
Poznámka: Na dosiahnutie väčšej symetrie vo fokusovaných kazeínových pásoch je vhodné roztok po pridaní kyseliny ε-aminohexánovej mrazom vysušiť a rezíduá potom rozpustiť v 0,5 ml tlmivého roztoku rozpúšťajúceho bielkoviny (4.6.)
Add 10 μl Temed (4.1.3.1) to the prepared and de-aerated gel solution (4.1.2), stir and add 10 μl PER-solution (4.1.3.2), mix thoroughly and immediately pour out evenly onto the centre of the cover sheet.
Príprava polyakrylamidových gélov s obsahom močoviny
Place one edge of the gel carrier plate (sheet side down) on the cover sheet plate and lower it slowly so that a gel film forms between the sheets and spreads out regularly and free of bubbles (Figure 3).
Pomocou niekoľkých kvapiek vody rozbaľte fóliu na gél (5.2) na sklenenú platničku (5.1) a prebytočnú vodu odstráňte papierovým obrúskom.
Carefully lower the gel carrier plate completely using a thin spatula and place three more glass plates on top of it to act as weights.
Na ďalšiu platničku rozložte rovnakým spôsobom kryciu fóliu (5.3) s rozpernými vložkami (0,25 mm).
After polymerization is complete (about 60 minutes) remove the gel polymerized onto the gel carrier sheet along with the cover sheet by tipping the glass plates.
Platničku horizontálne položte na vyrovnávaciu tabuľku.
Clean the reverse of the carrier sheet carefully to remove gel residues and urea.
Do pripraveného a odvzdušneného gélového roztoku (4.1.2) pridajte 10 μl Temedu (4.1.3.1), premiešajte a pridajte 10 μl roztoku PER (4.1.3.2), dôkladne premiešajte a ihneď rovnomerne nalejte na stred krycej fólie.
Weld the gel sandwich into a film tube and store in a refrigerator (maximum six weeks).
Jeden okraj platničky s gélom (s fóliou otočenou smerom dole) položte na platničku s krycou fóliou a pomaly ju pritlačte tak, aby sa medzi platničkami vytvorila rovnomerne rozotretá gélová vrstva bez bubliniek (obrázok 3).
Note: The cover sheet with the spacers can be re-used.
Pomocou tenkej špachtle opatrne pritlačte doštičku s gélom po celom povrchu a na vrch umiestnite ďalšie tri sklenené doštičky ako závažie.
The polyacrylamide gel can be cut to smaller sizes, recommended when there are few samples or if an automatic electrophoresis device is used (two gels, size 4,5 × 5 cm).
Po ukončení polymerizácie (približne 60 minút) odstráňte gél polymerizovaný na fólii na gél spolu s krycou fóliou tak, že sklenené doštičky nakloníte.
lsoelectric focusing
Opačnú stranu fólie na gél pozorne očistite, aby ste odstránili zvyšky gélu a močovinu.
Set the cooling thermostat to 12 °C.
Gélový ‚sendvič‘ zvarte do fólie a uskladnite stočený do rúrky v chladničke (maximálne šesť týždňov).
Wipe off the reverse of the gel carrier sheet with kerosene, then drip a few drops of kerosene (4.2) onto the centre of the cooling block.
Poznámka: Kryciu fóliu s rozpernými vložkami možno znovu použiť.
Then roll the gel sandwich, carrier side down, onto it, taking care to avoid bubbles.
Polyakrylamidový gél možno rozrezať na menšie kúsky, čo sa odporúča vtedy, ak je málo vzoriek, alebo ak sa používa automatické elektroforézne zariadenie (dva gély s rozmermi 4,5 × 5 cm).
Wipe off any excess kerosene and remove the cover sheet.
Izoelektrická fokusácia
Soak the electrode strips with the electrode solutions (4.3, 4.4), cut to gel length and place in the positions provided (distance of electrodes 9,5 cm).
Chladiaci termostat nastavte na 12 °C.
Conditions for isoelectric focusing:
Opačnú stranu fólie na gél očistite kerozínom, potom kvapnite niekoľko kvapiek kerozínu (4.2) do stredu chladiaceho bloku.
Gel size 265 × 125 × 0,25 mm
Potom naň položte gélový sendvič, s fóliou otočenou smerom nadol, a vyhnite sa pritom vzniku bubliniek.
Step
Prebytočný kerozín zotrite a odstráňte kryciu fóliu.
Voltage
Elektródové pásy ponorte do elektródových roztokov (4.3, 4.4), odrežte na dĺžku gélu a umiestnite na dané miesta (vzdialenosť elektród 9,5 cm).
Current
Podmienky izoelektrickej fokusácie:
Power
Rozmer gélu 265 × 125 × 0,25 mm
Volt-hours
Krok
Pre-focusing
Napätie
maximum
Prúd
Final focusing
Predbežná fokusácia
Note: If thickness or width of the gels are changed, the values for current and power have to be suitably adjusted (e.g. double the values for electric current and power if a 265 × 125 × 0,5 mm gel is used).
maximálne
Example of a voltage programme for an automatic electrophoresis device (2 gels of 5,0 × 4,5 cm), electrodes without strips applied directly to the gel
konštantný 4
Temp.
Fokusácia vzorky
Focusing
Záverečná fokusácia
Place sample applicator in step 2 at 0 Vh.
Poznámka: Ak sa zmení hrúbka alebo šírka gélov, hodnoty prúdu a výkonu sa musia vhodne upraviť (napr. dvojnásobok hodnoty pre elektrický prúd a výkon, ak sa používa gél s rozmermi 265 × 125 × 0,5 mm).
Remove sample applicator in step 2 at 30 Vh.
Príklad programu napätia pre automatické elektroforézne zariadenie (2 gély s rozmermi 5 × 4,5 cm), elektródy bez pásov sa prikladajú priamo na gél.
Protein staining
Teplota
Protein fixation
Fokusácia
Remove the electrode strips immediately after turning off the power and put the gel immediately into a staining/destaining dish filled with 200 ml fixative (4.9); leave for 15 minutes, shaking continuously.
Aplikátor vzorky vložte v kroku 2 pri 0 Vh.
Pour off the destaining solution and fill the dish with 250 ml staining solution (4.11.3); allow to stain for 45 minutes with gentle shaking.
Ustálenie bielkovín
Destaining the gel plate
Ihneď po vypnutí zariadenia odstráňte elektródové pásy a gél ihneď vložte do misky na farbenie/odfarbovanie naplnenej ustaľovačom (4.9.) v objeme 200 ml; za stáleho pretrepávania nechajte pôsobiť 15 min.
Pour off the staining solution, wash the gel plate twice using a 100 ml destaining solution (4.10) each time, then shake with 200 ml destaining solution for 15 minutes and repeat the destaining step at least two or three times until the background is clear and uncoloured.
Umývanie a farbenie gélovej platničky
Then rinse the gel plate with distilled water (2 × 2 minutes) and dry in the air (2 to 3 hours) or with a hairdryer (10 to 15 minutes).
Odfarbenie gélovej platničky