natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Prior to testing it is recommended to ensure having appropriate luminescence measurements, by testing a control plate set-up as described below (triplicate analysis).
Z predbežných analýz vyplynulo, že údaje o obnoviteľnosti (do 72 hodín po expozícii účinkom chemikálie) by mohli zvýšiť prognostický potenciál protokolu 71 INVITTOX, je však potrebné vykonať ďalšie hodnotenie a získať dodatočné údaje, najlepšie ďalším testovaním (6).
Plate setup of first training experiment
Príprava bunkovej monovrstvy
Blank
Monovrstva zložená z buniek MDCK CB997 sa pripraví použitím subkonfluentných buniek pestovaných v kultivačných bankách s DMEM/zmes živín F12 (1x koncentrát s L-glutamínom, 15 mM HEPES, vápnik (v koncentrácii 1,0 – 1,8 mM) a 10 % tepelne inaktivovaný FCS, FBS).
EGDMA Ethylene glycol dimethacrylate (CAS No.: 97-90-5) a strongly inducing chemical
Je dôležité poznamenať, že všetky médiá/roztoky používané počas skúšky FL by mali obsahovať vápnik v koncentrácii medzi 1,8 mM (200 mg/l) a 1,0 mM (111 mg/l), aby sa zaručila tvorba a celistvosť tesných spojov.
CA Cinnamic aldehyde, positive reference (CAS No.: 104-55-2)
Rozsah počtu bunkových pasáží by sa mal kontrolovať, aby sa zaručila rovnomerná a reprodukovateľná tvorba tesných spojov.
The quality control analysis should demonstrate:
Odporúča sa, aby boli bunky v rozmedzí od 3 do 30 pasážovaní po rozmrazení, pretože bunky v tomto rozmedzí pasážovania majú podobnú funkčnosť, čo zvyšuje reprodukovateľnosť výsledkov skúšky.
a clear dose-response in row D, with the Imax > 20 fold above background (in most cases Imax values between 100 and 300 are reached);
Pred vykonaním testovacej metódy FL sa bunky oddelia od banky trypsinizáciou, centrifugujú sa a primeraný počet buniek sa nasadí do inzertov umiestnených v platničkách s 24 jamkami (pozri dodatok 1).
no dose-response in row C and E (no induction value above 1,5 (ideally not above 1,3) due to possible light contamination especially next to strongly active wells in the EGDMA row;
K nasadeniu buniek by sa mali použiť inzerty s priemerom dvanásť mm, s membránou zo zmesi esterov celulózy, s hrúbkou 80 – 150 μm a veľkosťou pórov 0,45 μm.
no statistically significant difference between the rows A, B, C, E, F and G. (i.e. no gradient over plate); and
Pri validačnej štúdii boli použité inzerty Millicell-HA 12 mm.
variability in any of the rows A, B, C, E, F and G and in the DMSO wells in row H should be below 20 % (i.e. stable background).
Vlastnosti typu inzertu a membrány sú dôležité, pretože môžu ovplyvniť rast buniek a chemické väzby.
B.61 Fluorescein Leakage Test Method for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants
Určité typy chemikálií sa môžu viazať na inzertnú membránu Millicell-HA, čo môže ovplyvniť interpretáciu výsledkov.
This test method (TM) is equivalent to OECD test guideline (TG) 460 (2012).
Ak sa použijú iné membrány, mali by sa na preukázanie ich rovnocennosti použiť chemikálie na preukázanie spôsobilosti (pozri dodatok 3).
The Fluorescein Leakage (FL) test method is an in vitro test method that can be used under certain circumstances and with specific limitations to classify chemicals (substances and mixtures) as ocular corrosives and severe irritants, as defined by the United Nations (UN) Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS) (Category 1), Regulation (EC) No1272/2008 on Classification, Labelling and Packaging of Substances and Mixtures (CLP) [19] (Category 1), and the U.S. Environmental Protection Agency (EPA) (Category I) (1)(2).
Chemické väzby na inzertnú membránu sú bežnejšie v prípade katiónových chemikálií, ako napr. benzalkónium-chlorid, ktoré sú priťahované k nabitej membráne (7).
For the purpose of this test method, severe ocular irritants are defined as chemicals that cause tissue damage in the eye following test chemical administration that is not reversible within 21 days or causes serious physical decay of vision, while ocular corrosives are chemicals that cause irreversible tissue damage to the eye.
Chemické väzby na inzertnú membránu môže zvyšovať čas chemickej expozície a spôsobiť nadhodnotenie toxického potenciálu chemikálie, no zároveň môžu fyzicky znížiť únik fluoresceínu cez inzert naviazaním farbiva na katiónovú chemikáliu spojenú s inzertnou membránou, čo spôsobí podhodnotenie toxického potenciálu chemikálie.
These chemicals are classified as UN GHS Category 1, EU CLP Category 1, or U.S. EPA Category I.While the FL test method is not considered valid as a complete replacement for the in vivo rabbit eye test, the FL is recommended for use as part of a tiered testing strategy for regulatory classification and labelling.
To sa dá ľahko monitorovať vystavením samotnej membrány najvyššej koncentrácii testovanej chemikálie a následne pridaním farbiva s obsahom fluoresceínu sodného pri bežnej koncentrácii na štandardný čas (kontrola bez buniek).
Thus, the FL is recommended as an initial step within a Top-Down approach to identify ocular corrosives/severe irritants, specifically for limited types of chemicals (i.e. water soluble substances and mixtures) (3)(4).
Ak dôjde k naviazaniu nátrium-fluoresceínového farbiva, inzertná membrána sa po zmytí testovaného materiálu javí ako žltá.
It is currently generally accepted that, in the foreseeable future, no single in vitro eye irritation test will be able to replace the in vivo eye test (TM B.5 (5)) to predict across the full range of irritation for different chemical classes.
Preto je nevyhnutné poznať väzobné vlastnosti testovanej chemikálie, aby bolo možné interpretovať vplyv chemikálie na bunky.
However, strategic combinations of several alternative test methods within a (tiered) testing strategy may be able to replace the in vivo eye test (4).
Nasadením buniek do inzertov by sa počas chemickej expozície mala vytvoriť súvislá monovrstva.
The Top-Down approach (4) is designed to be used when, based on existing information, a chemical is expected to have high irritancy potential.
Do každého inzertu by sa malo pridať 1,6 × 105 buniek (400 μl bunkovej suspenzie s hustotou 4 × 105 buniek/ml).
Based on the prediction model detailed in paragraph 35, the FL test method can identify chemicals within a limited applicability domain as ocular corrosives/severe irritants (UN GHS Category 1; EU CLP Category 1; U.S. EPA Category I) without any further testing.
Za týchto podmienok sa súvislá monovrstva v kultúre obyčajne vytvorí po 96 hodinách.
The same is assumed for mixtures although mixtures were not used in the validation.
Inzerty by sa mali pred nasadením vizuálne skontrolovať tak, aby sa zaručilo, že akékoľvek poškodenie zaznamenané pri vizuálnej kontrole uvedenej v bode 30 bolo spôsobené manipuláciou.
Therefore, the FL test method may be used to determine the eye irritancy/corrosivity of chemicals, following the sequential testing strategy of TM B.5 (5).
Bunkové kultúry MDCK by sa mali uchovávať v inkubátoroch vo zvlhčovanej atmosfére pri 5 % ± 1 % CO2 a 37 ± 1 °C.
However, a chemical that is not predicted as ocular corrosive or severe irritant with the FL test method would need to be tested in one or more additional test methods (in vitro and/or in vivo) that are capable of accurately identifying i) chemicals that are in vitro false negative ocular corrosives/severe irritants in the FL (UN GHS Category 1; EU CLP Category 1; U.S. EPA Category I); ii) chemicals that are not classified for eye corrosion/irritation (UN GHS No Category; EU CLP No Category; U.S. EPA Category IV); and/or iii) chemicals that are moderate/mild eye irritants (UN GHS Categories 2A and 2B; EU CLP Category 2; U.S. EPA Categories II and III).
Bunky by nemali byť kontaminované baktériami, vírusmi, mykoplazmami ani hubami.
The purpose of this test method is to describe the procedures used to evaluate the potential ocular corrosivity or severe irritancy of a test chemical as measured by its ability to induce damage to an impermeable confluent epithelial monolayer.
Aplikácia testovaných a kontrolných chemikálií
The integrity of trans-epithelial permeability is a major function of an epithelium such as that found in the conjunctiva and the cornea.
Pre každú pokusnú skúšku je potrebné pripraviť nový zásobný roztok testovanej chemikálie a použiť ho do 30 minút od prípravy.
Trans-epithelial permeability is controlled by various tight junctions.
Testované chemikálie by sa mali pripravovať v HBSS s obsahom vápnika (pri koncentrácii 1,0 – 1,8 mM) a bez fenolovej červene, aby sa zabránilo väzbe proteínov zo séra.
Increasing the permeability of the corneal epithelium in vivo has been shown to correlate with the level of inflammation and surface damage observed as eye irritation develops.
Pred testom by sa mala skontrolovať rozpustnosť chemikálie pri 250 mg/ml v HBSS.
In the FL test method, toxic effects after a short exposure time to the test chemical are measured by an increase in permeability of sodium fluorescein through the epithelial monolayer of Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells cultured on permeable inserts.
Ak pri tejto koncentrácii vytvorí chemikália do 30 minút stabilnú suspenziu alebo emulziu (t. j. zostane jednotvárna a neusadí sa ani neoddelí do viac ako jednej fázy), je možné aj naďalej použiť HBSS ako rozpúšťadlo.
The amount of fluorescein leakage that occurs is proportional to the chemical-induced damage to the tight junctions, desmosomal junctions and cell membranes, and can be used to estimate the ocular toxicity potential of a test chemical.
Ak sa však chemikália pri tejto koncentrácii v HBSS nerozpustí, malo by sa zvážiť použitie iných testovacích metód ako FL.
Appendix 1 provides a diagram of MDCK cells grown on an insert membrane for the FL test method.
Použitie ľahkého minerálneho oleja ako rozpúšťadla v prípadoch, že sa chemikália v HBSS nerozpustí, by sa malo posudzovať s rezervou, keďže nie je k dispozícii dostatok údajov zaručujúcich výkonnosť skúšky FL v týchto podmienkach.
Definitions are provided in Appendix 2.
Všetky chemikálie, ktoré sa majú testovať, sa pripravia zo zásobného roztoku v sterilnom HBSS s obsahom vápnika (pri koncentrácii 1,0 – 1,8 mM) a bez fenolovej červene pri piatich fixných hmotnostných koncentráciách: 1, 25, 100,250 mg/ml ako čistý alebo nasýtený roztok.
This test method is based on the INVITTOX protocol No. 71 (6) that has been evaluated in an international validation study by the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM), in collaboration with the US Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the Japanese Center for the Validation of Alternative Methods (JaCVAM).
Pri testovaní chemikálií v tuhej forme by sa mala doplniť aj veľmi vysoká koncentrácia 750 mg/ml.
The FL test method is not recommended for the identification of chemicals which should be classified as mild/moderate irritants or of chemicals which should not be classified for ocular irritation (substances and mixtures) (i.e. GHS Cat.
Chemikália s touto koncentráciou sa môže aplikovať na bunky pipetou s priamym posunutím.
2A/2B, no category; EU CLP Cat.
Ak sa zistí toxicita v rozmedzí od 25 do 100 mg/ml, mali by sa dvakrát otestovať tieto dodatočné koncentrácie: 1, 25, 50, 75 a 100 mg/ml. Hodnota FL20 sa odvodí z týchto koncentrácií za predpokladu, že boli splnené kritériá prijateľnosti.
2, no category; US EPA Cat.
Testované chemikálie sa aplikujú na súvislé monovrstvy buniek po odstránení kultivačného bunkového média a dvojnásobnom premytí sterilným, teplým (37 °C) HBSS s obsahom vápnika (pri koncentrácii 1,0 – 1,8 mM) a bez fenolovej červene.
II/III/IV), as demonstrated by the validation study (3) (7).
Predtým sa vizuálne skontrolovali filtre, aby sa zistili už existujúce poškodenia, ktoré by mohli byť nesprávne pripísané možnej nezlučiteľnosti s testovanými chemikáliami.
The test method is only applicable to water soluble chemicals (substances and mixtures).
Pri každom pokuse by sa pri každej koncentrácii testovanej chemikálie a kontrol mali použiť aspoň tri replikáty.
The ocular severe irritation potential of chemicals that are water soluble and/or where the toxic effect is not affected by dilution is generally predicted accurately using the FL test method (7).
Chemikália navrhovaná ako PK je Brij 35 (CAS č. 9002-92-0) pri 100 mg/ml.
To categorise a chemical as water soluble, under experimental conditions, it should be soluble in sterile calcium-containing (at a concentration of 1,0-1,8 mM), phenol red-free, Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) at a concentration ≥ 250 mg/ml (one dose above the cut-off of 100 mg/ml).
Táto koncentrácia by mala spôsobiť približne 30 % únik fluoresceínu (prijateľný rozsah úniku fluoresceínu 20 – 40 %, t. j. poškodenie bunkovej vrstvy).
However, if the test chemical is soluble below the concentration 100 mg/ml, but already induces a FL induction of 20 % at that concentration (meaning FL20 < 100 mg/ml), it can still be classified as GHS Cat.
Chemikália navrhovaná ako NK je HBSS (neovplyvnená, slepá kontrola) s obsahom vápnika (pri koncentrácii 1,0 – 1,8 mM) a bez fenolovej červene.
1 or EPA Cat.
Súčasťou každého pokusu by mala byť aj kontrola s maximálnym únikom, aby bolo možné vypočítať hodnoty FL20.
I.
Maximálny únik sa stanoví pomocou kontrolného inzertu bez buniek.
The identified limitations for this test method exclude strong acids and bases, cell fixatives and highly volatile chemicals from the applicability domain.
Stanovenie priepustnosti fluoresceínu
These chemicals have mechanisms that are not measured by the FL test method, e.g. extensive coagulation, saponification or specific reactive chemistries.
Spektrofluorimetrom sa vykonajú merania pri excitačnej vlnovej dĺžke 485 nm a emisnej vlnovej dĺžke 530 nm.
Other identified limitations for this method are based upon the results for the predictive capacity for coloured and viscous test chemical (7).
Citlivosť spektrofluorimetra by sa mala nastaviť tak, aby bol čo najvyšší číselný rozdiel medzi maximálnym FL (inzert bez buniek) a minimálnym FL (inzert so súvislou monovrstvou upravenou NK).
It is suggested that both types of chemicals are difficult to remove from the monolayer following the short exposure period and that predictivity of the test method could be improved if a higher number of washing steps was used.
Vzhľadom na rozdiely v používaných spektrofluorimetroch sa navrhuje, aby sa použila citlivosť, ktorá poskytne intenzitu fluorescencie > 4000 pri kontrole s maximálnym únikom fluoresceínu.
Solid chemicals suspended in liquid have the propensity to precipitate out and the final concentration to cells can be difficult to determine.
Maximálna hodnota FL by nemala byť vyššia ako 9999.
When chemicals within these chemical and physical classes are excluded from the database, the accuracy of FL across the EU, EPA, and GHS classification systems is substantially improved (7).
Maximálna intenzita úniku fluorescencie by mala byť v lineárnom rozsahu použitého spektrofluorimetra.
Based on the purpose of this test method (i.e. to identify ocular corrosives/severe irritants only), false negative rates (see Paragraph 13) are not critical since such chemicals would be subsequently tested with other adequately validated in vitro tests or in rabbits, depending on regulatory requirements, using a sequential testing strategy in a weight of evidence approach (5) (see also paragraphs 3 and 4).
Interpretácia výsledkov a model prognózy
Other identified limitations of the FL test method are based on false negative and false positive rates.
Množstvo FL je úmerné chemicky vyvolanému poškodeniu tesných spojov.
When used as an initial step within a Top-Down approach to identify water soluble ocular corrosive/severe irritant substances and mixtures (UN GHS Category 1; EU CLP Category 1; U.S. EPA Category I), the false positive rate for the FL test method ranged from 7 % (7/103; UN GHS and EU CLP) to 9 % (9/99; U.S. EPA) and the false negative rate ranged from 54 % (15/28; U.S. EPA) to 56 % (27/48; UN GHS and EU CLP) when compared to in vivo results.
Percento FL pri každej testovanej koncentrácii chemikálie sa vypočíta z hodnôt FL získaných v prípade danej testovanej chemikálie s prihliadnutím na hodnoty FL z NK (odčítané zo súvislej monovrstvy buniek upravenej NK) a kontroly s maximálnym únikom (odčítané ako množstvo FL cez inzert bez buniek).
Chemical groups showing false positive and/or false negative results in the FL test method are not defined here.
Priemerná maximálna intenzita úniku fluorescencie = x
Certain technical limitations are specific to the MDCK cell culture.
Priemerná 0 % intenzita úniku fluorescencie (NK) = y
The tight junctions that block the passage of the sodium-fluorescein dye through the monolayer are increasingly compromised with increasing cell passage number.
Priemerný 100 % únik sa získa odpočítaním priemerného 0 % úniku od priemerného maximálneho úniku,
Incomplete formation of the tight junctions results in increased FL in the non-treated control.
t. j. x – y = z
Therefore, a defined permissible maximal leakage in the non-treated controls is important (see paragraph 38: 0 % leakage).
Percento úniku pre každej fixnej dávke sa získa odpočítaním 0 % úniku od priemernej intenzity fluorescencie z troch meraných replikátov (m) a vydelením tejto hodnoty 100 % únikom, t. j. % FL = [(m – y)/z] × 100 %, kde: m priemerná intenzita fluorescencie z troch replikačných meraní pri danej koncentrácii
As with all in vitro assays there is the potential for the cells to become transformed over time, thus it is vital that passage number ranges for the assays are stated.
% FL percento fluoresceínu, ktoré unikne cez bunkovú vrstvu Na výpočet chemickej koncentrácie spôsobujúcej 20 % FL by sa mala použiť táto rovnica:
The current applicability domain might be increased in some cases, but only after analysing an expanded data set of studied test chemicals, preferably acquired through testing (3).
FLD = [(A – B)/(C – B)] × (MC – MB) + MB kde: D percento inhibície
This test method will be updated accordingly as new information and data are considered.
A % poškodenia (20 % únik fluoresceínu)
For any laboratory initially establishing this assay, the proficiency chemicals provided in Appendix 3 should be used.
M C
Laboratories can use these chemicals to demonstrate their technical competence in performing the FL test method prior to submitting FL assay data for regulatory hazard classification purposes.
koncentrácia (v mg/ml) pre C
The FL test method is a cytotoxicity and cell-function based in vitro assay that is performed on a confluent monolayer of MDCK CB997 tubular epithelial cells that are grown on semi-permeable inserts and model the non-proliferating state of the in vivo corneal epithelium.
C&L: klasifikácia a označovanie
The MDCK cell line is well established and forms tight junctions and desmosomal junctions similar to those found on the apical side of conjunctival and corneal epithelia.
GHS OSN C&L
Tight and desmosomal junctions in vivo prevent solutes and foreign materials penetrating the corneal epithelium.
kategória I
Loss of trans-epithelial impermeability, due to damaged tight junctions and desmosomal junctions, is one of the early events in chemical-induced ocular irritation.
Testovacia metóda FL sa odporúča len na účely identifikácie vo vode rozpustných očných žieravín a silne dráždivých látok (GHS OSN kategória 1, EÚ CLP kategória 1 a US EPA kategória I) (pozri body 1 a 10).
The damage caused by the test chemical to the tight junctions is determined by the amount of fluorescein which leaks through the cell layer within a defined period of time.
Pri každom pokuse by sa mali do tabuľky zapísať údaje z jednotlivých jamiek s replikátmi (napr. hodnoty intenzity fluorescencie a vypočítané percentuálne hodnoty FL pre každú testovanú chemikáliu vrátane klasifikácie).
The amount of sodium-fluorescein dye that passes through the monolayer and the insert membrane into a set volume of solution present in the well (to which the sodium-fluorescein dye leaks in) is determined by measuring spectrofluorometrically the fluorescein concentration in the well.
Okrem toho je potrebné pri každom pokuse zaznamenať v prípade každého merania replikátov aj priemerné hodnoty ± štandardné odchýlky.
The amount of fluorescein leakage (FL) is calculated with reference to fluoresence intensity (FI) readings from two controls: a blank control, and a maximum leakage control.
číslo CAS chemikálie, ak je známe;
The percentage of leakage and therefore amount of damage to the tight junctions is expressed, relative to these controls, for each of the set concentrations of the test chemical.
čistota a zloženie látky alebo zmesi (v hmotnostných percentách), pokiaľ je táto informácia k dispozícii;
Then the FL20 (i.e. concentration that causes 20 % FL relative to the value recorded for the untreated confluent monolayer and inserts without cells), is calculated.
fyzikálno-chemické vlastnosti relevantné na vykonanie štúdie (napr. fyzikálny stav, prchavosť, pH, stabilita, rozpustnosť vo vode, chemická trieda);
The FL20 (mg/ml) value is used in the prediction model for identification of ocular corrosives and severe irritants (see paragraph 35).
prípadná úprava testovaných/kontrolných chemikálií pred testovaním (napr. zahriatie, rozomletie);
Preparation of the cellular monolayer
Sem by mali zahrnuté úvahy o sfére použiteľnosti a obmedzeniach testovacej metódy.
The monolayer of MDCK CB997 cells is prepared using sub-confluent cells growing in cell culture flasks in DMEM/Nutrient Mix F12 (1x concentrate with L-glutamine, 15 mM HEPES, calcium (at a concentration of 1,0-1,8 mM) and 10 % heat-inactivated FCS/FBS).
Opis použitého systému buniek vrátane osvedčenia o pravosti a stave mykoplazmy bunkovej línie;
Importantly, all media/solutions used throughout the FL assay should contain calcium at a concentration between 1,8 mM (200 mg/l) and 1,0 mM (111 mg/l) to ensure tight junction formation and integrity.
podrobnosti o použitom testovacom postupe;
Cell passage number range should be controlled to ensure even and reproducible tight junctions formation.
použitá koncentrácia (koncentrácie) testovanej látky;
Preferably, the cells should be within the passage range 3-30 from thawing because cells within this passage range have similar functionality, which aids assay results to be reproducible.
dĺžka expozície účinkom testovanej chemikálie;
Prior to performing the FL test method, the cells are detached from the flask by trypsinisation, centrifuged and an appropriate amount of cells is seeded into the inserts placed in 24-well plates (see Appendix 1).
dĺžka inkubácie fluoresceínom;
Twelve mm diameter inserts with membrane of mixed cellulose esters, a thickness of 80-150 μm and a pore size of 0,45 μm, should be used to seed the cells.
opis použitých hodnotiacich kritérií.
In the validation study, Millicell-HA 12 mm inserts were used.
odkaz na historické údaje daného modelu (napr. negatívne a pozitívne kontroly, referenčné chemikálie, ak existujú);
The properties of the insert and membrane type are important as these may affect cell growth and chemical binding.
informácie o technickej spôsobilosti preukázanej laboratóriom.
Certain types of chemicals may bind to the Millicell-HA insert membrane, which could affect the interpretation of results.
Uvedenie údajov týkajúcich sa individuálnych testovaných chemikálií a kontrol pri každom pokuse a meraní každého replikátu (vrátane individuálnych výsledkov, priemerných hodnôt a štatistických odchýlok);
Proficiency chemicals (see Appendix 3) should be used to demonstrate equivalency if other membranes are used.
odvodená klasifikácia, resp. klasifikácie s prihliadnutím na použitý model prognózy a/alebo rozhodovacie kritériá;
Chemical binding to the insert membrane is more common for cationic chemicals, such as benzalkonium chloride, which are attracted to the charged membrane (7).
Jej súčasťou by mali byť úvahy o nejednoznačných záveroch (bod 35: FL20 > 100 mg/ml) a ďalšom testovaní.
Chemical binding to the insert membrane may increase the chemical exposure period, leading to an over-estimation of the toxic potential of the chemical, but can also physically reduce the leakage of fluorescein through the insert by binding of the dye to the cationic chemical bound to the insert membrane, leading to an under-estimation of the toxic potential of the chemical.
Záver