natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Finally, parallel cytotoxicity measurements should be conducted to assess whether luciferase activity induction levels occur at sub-cytotoxic concentrations.
Násobok indukcie aktivity luciferázy sa vypočíta podľa rovnice 1, a celkový maximálny násobok indukcie (Imax) sa vypočíta ako priemer z jednotlivých opakovaní.
Prior to routine use of the ARE-Nrf2 luciferase assay that adheres to this test method, laboratories should demonstrate technical proficiency, using the ten Proficiency Substances listed in Appendix 2.
Rovnica 1:
Performance standards (PS) (28) are available to facilitate the validation of new or modified in vitro ARE-Nrf2 luciferase test methods similar to the KeratinoSens™ assay and allow for timely amendment of this test method for their inclusion.
Násobok indukcie
Mutual Acceptance of Data (MAD) according to the OECD agreement will only be guaranteed for test methods validated according to the PS, if these test methods have been reviewed and included in the corresponding test guideline by OECD.
kde
Currently, the only method covered by this test method is the scientifically valid KeratinoSensTM assay (9) (12) (13) (14).
je hodnota luminiscencie odčítaná v jamke s testovanou chemikáliou
The Standard Operating Procedures (SOP) for the KeratinoSensTM assay is available and should be employed when implementing and using the test method in the laboratory (15).
je hodnota luminiscencie odčítaná v „slepej“ jamke, t. j. bez buniek a ovplyvnenia
Laboratories willing to implement the test method can obtain the recombinant cell line used in the KeratinoSensTM assay by establishing a licence agreement with the test method developer.
je hodnota priemernej luminiscencie odčítaná v jamkách obsahujúcich bunky a (negatívnu) kontrolu s rozpúšťadlom
The following paragraphs provide with a description of the main components and procedures of the ARE-Nrf2 luciferase test method.
hodnota EC1,5 sa vypočíta lineárnou interpoláciou podľa rovnice 2 a celková hodnota EC1,5 sa vypočíta ako geometrický priemer jednotlivých opakovaní.
Preparation of the keratinocyte cultures
Rovnica 2:
A transgenic cell line having a stable insertion of the luciferase reporter gene under the control of the ARE-element should be used (e.g. the KeratinoSens™ cell line).
je najnižšia koncentrácia v μM s viac ako 1,5-násobnou indukciou
Upon receipt, cells are propagated (e.g. 2 to 4 passages) and stored frozen as a homogeneous stock.
je najvyššia koncentrácia v μM s menej ako 1,5-násobnou indukciou
Cells from this original stock can be propagated up to a maximum passage number (i.e. 25 in the case of KeratinoSensTM) and are employed for routine testing using the appropriate maintenance medium (in the case of KeratinoSensTM this represents DMEM containing serum and Geneticin).
je násobok indukcie meraný pri najnižšej koncentrácii s viac ako 1,5-násobnou indukciou (priemer troch jamiek s replikátmi)
For testing, cells should be 80-90 % confluent, and care should be taken to ensure that cells are never grown to full confluence.
je násobok indukcie meraný pri najnižšej koncentrácii s menej ako 1,5-násobnou indukciou (priemer troch jamiek s replikátmi)
One day prior to testing cells are harvested, and distributed into 96-well plates (10000 cells/well in the case of KeratinoSensTM).
Životaschopnosť sa vypočíta pomocou rovnice 3:
Attention should be paid to avoid sedimentation of the cells during seeding to ensure homogeneous cell number distribution across wells.
rovnica 3:
If this is not the case, this step may give raise to high well-to-well variability.
Životaschopnosť
For each repetition, three replicates are used for the luciferase activity measurements, and one parallel replicate used for the cell viability assay.
je hodnota absorbancie MTT odčítaná v jamke s testovanou chemikáliou
Preparation of the test chemical and control substances
je hodnota absorbancie MTT odčítaná v „slepej“ jamke, t. j. bez buniek a ovplyvnenia
The test chemical and control substances are prepared on the day of testing.
je hodnota priemernej absorbancie MTT odčítaná v jamkách obsahujúcich bunky a (negatívnu) kontrolu s rozpúšťadlom
For the KeratinoSensTM assay, test chemicals are dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) to the final desired concentration (e.g. 200 mM).
hodnoty IC50 a IC30 sa vypočítajú lineárnou interpoláciou podľa rovnice 4 a celkové hodnoty IC50 a IC30 sa vypočítajú ako geometrický priemer jednotlivých opakovaní.
The DMSO solutions can be considered self-sterilising, so that no sterile filtration is needed.
rovnica 4:
Test chemical not soluble in DMSO is dissolved in sterile water or culture medium, and the solutions sterilised by e.g. filtration.
X je percento zníženia pri koncentrácii, ktorá sa má vypočítať (50 a 30 v prípade IC50 a IC30)
For a test chemical which has no defined molecular weight (MW), a stock solution is prepared to a default concentration (40 mg/mL or 4 % (w/v)) in the KeratinoSensTM assay.
je najnižšia koncentrácia v μM s viac ako x percentným znížením životaschopnosti
In case solvents other than DMSO, water or the culture medium are used, sufficient scientific rationale should be provided.
je najvyššia koncentrácia v μM s menej ako x percentným znížením životaschopnosti
Alternative concentrations may be used upon justification (e.g. in case of cytotoxicity or poor solubility).
Najnižšia koncentrácia s viac ako 1,5-násobnou indukciou aktivity luciferázy je hodnota, ktorá určuje hodnotu EC1,5.
It undergoes the same dilution as described for the master concentrations in paragraph 22, so that the final negative (solvent) control concentration is 1 %, known not to affect cell viability and corresponding to the same concentration of DMSO found in the tested chemical and in the positive control.
Odporúča sa údaje vizuálne skontrolovať pomocou grafov.
The positive control used in the case of the KeratinoSensTM assay is cinnamic aldehyde (CAS No. 14371-10-9, ≥ 98 % purity), for which a series of 5 master concentrations ranging from 0,4 to 6,4 mM are prepared in DMSO (from a 6,4 mM stock solution) and diluted as described for the master concentrations in paragraph 22, so that the final concentration of the positive control range from 4 to 64 μM.
Ak je dvojfázová odozva reprodukovateľná v nezávislom pokuse, zaznamená sa nižšia hodnota EC1,5 (t. j. koncentrácia, pri ktorej bol limit 1,5 prekročený po prvýkrát).
Application of the test chemical and control substances
Nakoniec sa na základe vizuálnej kontroly krivky závislosti reakcie od dávky v prípade testovaných chemikálií vykazujúcich 1,5-násobnú alebo vyššiu indukciu už pri najnižších testovaných koncentráciách 0,98 μM, stanoví hodnota EC1,5, ktorá je nižšia ako 0,98.
For each test chemical and positive control substance, one experiment is needed to derive a prediction (positive or negative), consisting of at least two independent repetitions containing each three replicates (i.e. n = 6).
Pri použití skúšky KeratinoSens™ by mali byť splnené tieto kritériá prijateľnosti.
In case of discordant results between the two independent repetitions, a third repetition containing three replicates should be performed (i.e. n = 9).
Po prvé, indukcia aktivity luciferázy získaná s pozitívnou kontrolou – aldehydom kyseliny škoricovej – by mala byť štatisticky významná nad limitom 1,5 (napr. použitím T-testu) aspoň pri jednej z testovaných koncentrácií (od 4 do 64 μM).
Each independent repetition is performed on a different day with fresh stock solution of test chemicals and independently harvested cells.
Po druhé, hodnota EC1,5 by mala byť v rozmedzí dvoch štandardných odchýlok historického priemeru testovacieho zariadenia (napr. medzi 7 μM a 30 μM podľa súboru validačných údajov) a mala by sa pravidelne aktualizovať.
Cells may come from the same passage however.
Navyše hodnota priemernej indukcie v troch replikátoch v prípade aldehydu kyseliny škoricovej s koncentráciou 64 μM by mala byť medzi 2 a 8.
After seeding as described in paragraph 20, cells are grown for 24 hours in the 96-wells microtiter plates.
Ak toto kritérium nie je splnené, mala by sa dôkladne skontrolovať závislosť reakcie od dávky aldehydu kyseliny škoricovej, pričom testy možno považovať za prijateľné iba v prípade, že je pri pozitívnej kontrole zrejmá jednoznačná závislosť reakcie od dávky pri rastúcej indukcii aktivity luciferázy.
The medium is then removed and replaced with fresh culture medium (150 μl culture medium containing serum but without Geneticin in the case of KeratinoSensTM) to which 50 μl of the 25 fold diluted test chemical and control substances are added.
Napokon by sa pri každom opakovaní pozostávajúcom zo 6 jamiek testovaných v triplikátoch mal dosiahnuť priemerný koeficient odchýlky odčítanej hodnoty luminiscencie v prípade negatívne kontroly DMSO (s rozpúšťadlom), ktorý je nižší ako 20 %.
At least one well per plate should be left empty (no cells and no treatment) to assess background values.
Ak sú odchýlky vyššie, výsledky by sa mali zrušiť.
The treated plates are then incubated for about 48 hours at 37 ± 1 °C in the presence of 5 % CO2 in the KeratinoSensTM assay.
Interpretácia výsledkov a model prognózy
Care should be taken to avoid evaporation of volatile test chemicals and cross-contamination between wells by test chemicals by e.g. covering the plates with a foil prior to the incubation with the test chemicals.
Prognóza sa pri skúške KeratinoSens™ považuje za pozitívnu, ak sú splnené uvedené 4 podmienky v 2 z 2 alebo v tých istých 2 z 3 opakovaní.
the use of a luciferase substrate with sufficient light output to ensure sufficient sensitivity and low variability.
celková závislosť reakcie od dávky (alebo dvojfázová reakcia podľa bodu 33) je v prípade indukcie luciferázy jednoznačná.
After the 48 hour exposure time with the test chemical and control substances in the KeratinoSensTM assay, cells are washed with a phosphate buffered saline, and the relevant lysis buffer for luminescence readings added to each well for 20 min at room temperature.
Navyše aj negatívny výsledok získaný pri koncentráciách < 1000 μM (alebo < 200 μg/ml v prípade testovaných chemikálií s nedefinovanou MH) by sa mal považovať za nejednoznačný (pozri bod 11).
In case alternative settings are used, e.g. depending on the model of luminometer used, these should be justified.
Model prognózy používaný pri skúške KeratinoSens™.
Furthermore, a glow substrate may also be used provided that the quality control experiment of Appendix 3 is successfully fulfilled.
Prognóza KeratinoSens™ by sa mala posudzovať v rámci IATA a v súlade s ustanoveniami bodov 9 a 11.
Cytotoxicity Assessment
V zriedkavých prípadoch môžu byť testované chemikálie, ktoré indukujú aktivitu luciferázy pri úrovniach veľmi blízkych cytotoxicite, pozitívne pri niektorých opakovaniach pri necytotoxických úrovniach (t. j. rozhodujúca koncentrácia EC1,5 je nižšia (<) ako IC30), ako aj pri iných opakovaniach iba pri cytotoxických úrovniach (t. j. rozhodujúca koncentrácia EC1,5 je vyššia (>) ako IC30).
For the KeratinoSensTM cell viability assay, medium is replaced after the 48 hour exposure time with fresh medium containing MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Thiazolyl blue tetrazolium bromide; CAS No. 298-93-1) and cells incubated for 4 hours at 37 °C in the presence of 5 % CO2.
Tieto testované chemikálie sa musia opakovane testovať použitím podrobnejšej analýzy vzťahu medzi reakciou a dávkou s nižším faktorom riedenia (napr. 1,33 alebo √2 (= 1,41) násobné riedenie medzi jamkami), aby sa zistilo, či pri cytotoxických úrovniach došlo k indukcii alebo nie (9).
The MTT medium is then removed and cells are lysed (e.g. by adding 10 % SDS solution to each well) overnight.
fyzický vzhľad, rozpustnosť vo vode, rozpustnosť v DMSO, molekulová hmotnosť a iné relevantné fyzikálno-chemické vlastnosti, v dostupnom rozsahu;
After shaking, the absorption is measured at i.e. 600 nm with a photometer.
fyzický vzhľad, rozpustnosť vo vode, rozpustnosť v DMSO a iné relevantné fyzikálno-chemické vlastnosti, v dostupnom rozsahu;
The following parameters are calculated in the KeratinoSensTM assay:
fyzický vzhľad, rozpustnosť vo vode, rozpustnosť v DMSO, molekulová hmotnosť a iné relevantné fyzikálno-chemické vlastnosti, v dostupnom rozsahu a podľa potreby;
the maximal average fold induction of luciferase activity (Imax) value observed at any concentration of the tested chemical and positive control;
Negatívna kontrola (nosič)
the EC1,5 value representing the concentration for which induction of luciferase activity is above the 1,5 fold threshold (i.e. 50 % enhanced luciferase activity) was obtained; and
Chemická identifikácia, ako napríklad názov, resp. názvy podľa IUPAC alebo CAS, číslo(-a) CAS a/alebo iné identifikátory;
the IC50 and IC30 concentration values for 50 % and 30 % reduction of cellular viability.
fyzický vzhľad, molekulová hmotnosť a iné relevantné fyzikálno-chemické vlastnosti v prípade, že sa použijú iné negatívne kontroly/nosiče ako tie uvedené v tejto testovacej metóde, a to v dostupnom rozsahu;
Fold luciferase activity induction is calculated by Equation 1, and the overall maximal fold induction (Imax) is calculated as the average of the individual repetitions.
odôvodnenie výberu rozpúšťadla pre každú testovanú chemikáliu.
Equation 1:
Podmienky testovacej metódy
Fold induction
opis použitej testovacej metódy;
Lsample
bunková línia, podmienky jej skladovania a zdroj (napr. zariadenie, z ktorého boli získané);
Lblank
číslo pasáže a miera konfluencie buniek použitých na testovanie;
Lsolvent
metóda stanovenia počtu buniek používaná na dávkovanie pred testovaním a opatrenia, ktorými sa zaručí rovnomerné rozdelenie buniek (pozri bod 20);
where
použitý luminometer (napr. typ/model) vrátane jeho nastavenia, použitého substrátu luciferázy a potvrdenie adekvátnych meraní luminiscencie merania založených na kontrolnom teste opísanom v dodatku 3;
L sample
postup použitý na preukázanie spôsobilosti laboratória vykonávať danú testovaciu metódu (napr. testovaním chemikálií na preukázanie spôsobilosti) alebo na preukázanie reprodukovateľnosti výkonu testovacej metódy aj neskôr.
is the luminescence reading in the test chemical well
Postup vykonania testu
L blank
Počet opakovaní a použitých replikátov;
is the luminescence reading in the blank well containing no cells and no treatment
koncentrácie testovaných chemikálií, postup ich použitia a použitý čas expozície (ak je iný ako odporúčaný)
L solvent
Tabuľkový zápis hodnôt Imax, EC1,5 a životaschopnosti (t. j. hodnôt IC50, IC30) získaných pri testovanej chemikálii a pozitívnej kontrole pri každom opakovaní, ako aj hodnôt priemeru (Imax: priemer; hodnota EC1,5 a hodnoty životaschopnosti: geometrický priemer) a SD vypočítané použitím údajov z každého jednotlivého opakovania a údaj o ratingu testovanej chemikálie podľa modelu prognózy;
is the average luminescence reading in the wells containing cells and solvent (negative) control
koeficient odchýlky získaný odčítaním hodnôt luminiscencie pri negatívnej kontrole pri každom pokuse;
,5 is calculated by linear interpolation according to Equation 2, and the overall EC1,5 is calculated as the geometric mean of the individual repetitions.
graf zobrazujúci krivky závislosti reakcie od dávky z hľadiska aktivity luciferázy a životaschopnosti;
Equation 2:
v uplatniteľnom prípade opis všetkých relevantných pozorovaní.
is the lowest concentration in μM with > 1,5 fold induction
Rozbor dosiahnutých výsledkov pri skúške KeratinoSens™;
is the highest concentration in μM with < 1,5 fold induction
posúdenie výsledkov testovacej metódy v kontexte IATA, ak sú k dispozícii iné relevantné informácie.
is the fold induction measured at the lowest concentration with > 1,5 fold induction (mean of three replicate wells)
K dispozícii na: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html.
is the fold induction at the highest concentration with < 1,5 fold induction (mean of three replicate wells)
OECD Environment, Health and Safety publications, Series on Testing and Assessment No.
Viability is calculated by Equation 3:
OECD, Paris.
Equation 3:
Kapitola B.42 tejto prílohy: Kožná senzibilizácia: lokálna skúška lymfatických uzlín.
Viability
Kapitola B.50 tejto prílohy: Kožná senzibilizácia: lokálna skúška lymfatických uzlín: DA.
Vsample
Kapitola B.51 tejto prílohy: Kožná senzibilizácia: lokálna skúška lymfatických uzlín: BrdU-ELISA.
Vblank
Recommendation on the KeratinoSens™ assay for skin sensitisation testing, 42 pp.
Vsolvent
K dispozícii na webovej lokalite: http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/our_labs/eurl-ecvam/eurl-ecvam-recommendations/recommendation-keratinosens-skin-sensitisation.
V sample
DB-ALM (INVITTOX) (2013) Protocol 155: KeratinoSens™, 17 pp.
is the MTT-absorbance reading in the test chemical well
K dispozícii na webovej lokalite: http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/beta/index.cfm/methodsAndProtocols/index
V blank
OECD Guidelines for Chemical Testing No.
is the MTT-absorbance reading in the blank well containing no cells and no treatment
Tento pojem sa často používa zameniteľne s pojmom „zhoda“ a označuje podiel správnych výsledkov testovacej metódy (29).
V solvent
antioxidačný reakčný element (nazývaný aj EpRE – elektrofilný reakčný element) je reakčný element, ktorý sa v prípade mnohých cytoprotektívnych génov a génov fázy II nachádza v „upstream“ oblasti promótoru.
is the average MTT-absorbance reading in the wells containing cells and solvent (negative) control
Ak sa aktivuje prostredníctvom Nrf2, napomáha transkripčnú indukciu týchto génov.
and IC30 are calculated by linear interpolation according to Equation 4, and the overall IC50 and IC30 are calculated as the geometric mean of the individual repetitions.
interpolovaná koncentrácia v prípade 1,5-násobnej indukcie luciferázy.
Equation 4:
koncentrácia vyvolávajúca zníženie životaschopnosti buniek o 30 %.
X is the % reduction at the concentration to be calculated (50 and 30 for IC50 and IC30)
koncentrácia vyvolávajúca zníženie životaschopnosti buniek o 50 %.
is the lowest concentration in μM with > x % reduction in viability
maximálny faktor indukcie aktivity luciferázy v porovnaní s (negatívnou) kontrolou s rozpúšťadlom nameraný pri ktorejkoľvek koncentrácii testovanej chemikálie.
is the highest concentration in μM with < x % reduction in viability
je senzorový proteín (Kelch-like ECH-associated protein 1), ktorý dokáže regulovať aktivitu Nrf2.
is the % viability at the lowest concentration with > x % reduction in viability
Za podmienok bez indukcie vyhľadáva senzorový proteín Keap1 transkripčný faktor Nrf2, pričom dochádza k ubikvitinácii a proteolytickej degradácii v proteazóme.
is the % viability at the highest concentration with < x % reduction in viability
Kovalentná modifikácia rezíduí reakčného cysteínu v proteíne Keap1 spôsobená malými molekulami môže viesť k oddeleniu Nrf2 od Keap1 [8) (10) (11)].
For each concentration showing > 1,5 fold luciferase activity induction, statistical significance is calculated (e.g. by a two-tailed Student's t-test), comparing the luminescence values for the three replicate samples with the luminescence values in the solvent (negative) control wells to determine whether the luciferase activity induction is statistically significant (p < 0,05).
nukleárny faktor [(erythroid-derived 2)-like 2] je transkripčný faktor, ktorý je súčasťou antioxidačnej reakčnej dráhy.
The lowest concentration with > 1,5 fold luciferase activity induction is the value determining the EC1,5 value.
Ak Nrf2 nie je ubikvitinovaný, začne sa tvoriť v cytoplazme a presúva sa do jadra, kde sa v prípade mnohých cytoprotektívnych génov spája v „upstream“ oblasti promótoru s ARE a spustí ich transkripciu (8) (10) (11).
It is checked in each case whether this value is below the IC30 value, indicating that there is less than 30 % reduction in cellular viability at the EC1,5 determining concentration.
Relevantnosť zohľadňuje presnosť (zhodu) testovacej metódy (29).
It is recommended that data are visually checked with the help of graphs.
Hodnotí sa vypočítaním vnútrolaboratórnej a medzilaboratórnej reprodukovateľnosti a vnútrolaboratórnej opakovateľnosti (29).
If no clear dose-response curve is observed, or if the dose-response curve obtained is biphasic (i.e. crossing the threshold of 1,5 twice), the experiment should be repeated to verify whether this is specific to the test chemical or due to an experimental artefact.
zhoda výsledkov získaných testovaním tej istej chemikálie s použitím toho istého skúšobného protokolu (pozri spoľahlivosť) (29).
In case the biphasic response is reproducible in an independent experiment, the lower EC1,5 value (the concentration when the threshold of 1,5 is crossed the first time) should be reported.
podiel všetkých pozitívnych/aktívnych chemikálií správne klasifikovaných testovacou metódou.
In the rare cases where a statistically non-significant induction above 1,5 fold is observed followed by a higher concentration with a statistically significant induction, results from this repetition are only considered as valid and positive if the statistically significant induction above the threshold of 1,5 was obtained for a non-cytotoxic concentration.
Ide o presnosť testovacej metódy, ktorá poskytuje kategorizačné výsledky a musí sa zohľadniť pri hodnotení relevantnosti testovacej metódy (29).
Finally, for test chemicals generating a 1,5 fold or higher induction already at the lowest test concentration of 0,98 μM, the EC1,5 value of < 0,98 is set based on visual inspection of the dose-response curve.
replikát obsahujúci všetky zložky testovacieho systému okrem testovanej chemikálie, ale vrátane použitého rozpúšťadla.
The following acceptance criteria should be met when using the KeratinoSensTM assay.
Používa sa na zistenie základnej spätnej reakcie vzoriek ovplyvnených testovanou chemikáliou rozpustenou v tom istom rozpúšťadle.
First, the luciferase activity induction obtained with the positive control, cinnamic aldehyde, should be statistically significant above the threshold of 1,5 (e.g. using a T-test) in at least one of the tested concentrations (from 4 to 64 μM).
podiel všetkých negatívnych/neaktívnych chemikálií správne klasifikovaných testovacou metódou.
Second, the EC1,5 value should be within two standard deviations of the historical mean of the testing facility (e.g. between 7 μM and 30 μM based on the validation dataset) which should be regularly updated.
Ide o presnosť testovacej metódy, ktorá poskytuje kategorizačné výsledky a musí sa zohľadniť pri hodnotení relevantnosti testovacej metódy (29).
In addition, the average induction in the three replicates for cinnamic aldehyde at 64 μM should be between 2 and 8.
Testovacia metóda nie je nikdy platná v absolútnom zmysle, ale len vo vzťahu k vymedzenému účelu (29).
If the latter criterion is not fulfilled, the dose-response of cinnamic aldehyde should be carefully checked, and tests may be accepted only if there is a clear dose-response with increasing luciferase activity induction at increasing concentrations for the positive control.
Kožná senzibilizácia in vitro: testovacia metóda „ARE-Nrf2 luciferáza“
Finally, the average coefficient of variation of the luminescence reading for the negative (solvent) control DMSO should be below 20 % in each repetition which consists of 6 wells tested in triplicate.
Pred rutinným použitím tejto testovacej metódy by mali laboratóriá preukázať technickú spôsobilosť tým, že správne získajú očakávanú prognózu výsledku skúšky KeratinoSens™ v prípade 10 chemikálií na preukázanie spôsobilosti odporúčaných v tabuľke 1 a získaním hodnôt EC1,5 a IC50, ktoré spadajú do príslušného referenčného rozsahu pre najmenej 8 z 10 látok na preukázanie spôsobilosti.
If the variability is higher, results should be discarded.
Tieto látky na preukázanie spôsobilosti boli vybrané tak, aby reprezentovali rozsah reakcií na nebezpečenstvo kožnej senzibilizácie.
Interpretation of results and prediction model
Ďalším kritériom výberu bola komerčná dostupnosť, dostupnosť kvalitnej referenčnej vzorky in vivo a kvalitných údajov in vitro zo skúšky KeratinoSens™.