natgillin/translations-raw huggingface dataset:
At the commencement of the study, the weight variation of animals should be minimal and not exceed ± 20 %.
Preto je možné použiť buď izolované bunky alebo izolované jadrá.
Solid test chemicals should be dissolved or suspended in appropriate vehicles or admixed in diet or drinking water prior to dosing of the animals.
Laboratórium by malo dôkladne vyhodnotiť a potvrdiť platnosť tkanivových metód izolácie samostatných buniek/jadier.
For inhalation exposures, test chemicals can be administered as gas, vapour, or a solid/liquid aerosol, depending on their physicochemical properties (50) (51).
Ako už bolo opísané v bode 40, výskyt niektorých lézií, ktoré spôsobia zlomy v reťazcoch DNA zistené kométovým testom, môže mať len veľmi krátke trvanie (52) (53).
Vehicle
Preto je bez ohľadu na použitú metódu prípravy jednobunkovej/jadrovej suspenzie dôležité, aby sa tkanivá spracovali čo najskôr po tom, ako boli zvieratá usmrtené a umiestnené do podmienok, vďaka ktorým sa zníži potreba odstraňovania lézií (napr. uchovávaním tkaniva pri nízkej teplote).
The vehicle should not produce toxic effects at the dose volumes used, and should not be suspected of chemical reaction with the test chemicals.
Bunkové suspenzie by sa mali až do samotného použitia uchovávať ľadové, aby sa minimalizovali odchýlky medzi vzorkami a dosiahli správne pozitívne a negatívne kontroly.
If other than well-known vehicles are used, their inclusion should be supported with reference data indicating their compatibility in terms of test animals, route of administration and endpoint.
PRÍPRAVA PREPARÁTOV
It should be noted that some vehicles (particularly viscous vehicles) can induce inflammation and increase background levels of DNA strand breaks at the site of contact, particularly with multiple administrations.
Preparáty by sa mali pripravovať čo najskôr (v ideálnom prípade do jednej hodiny) po preparovaní jednej bunky/jadra, pričom teplota a čas medzi smrťou zvieraťa a prípravou preparátov by mali byť prísne kontrolované a validované v laboratórnych podmienkach.
At this time, a group of a minimum of 3 analysable animals of one sex, or of each sex if both are used (see paragraph 32), treated with a positive control substance should normally be included with each test.
Objem bunkovej suspenzie pridanej do agarózy s nízkym bodom topenia (zvyčajne 0,5 – 1,0 %) na prípravu sklíčok by nemal znížiť percentuálny podiel agarózy s nízkym bodom topenia na menej ako 0,45 %.
In future, it may be possible to demonstrate adequate proficiency to reduce the need for positive controls.
Optimálna hustota buniek sa stanoví systémom analýzy obrazu používaným na zápis komét.
If multiple sampling times are used (e.g. with a single administration protocol) it is only necessary to include positive controls at one of the sampling times, but a balanced design should be ensured (see paragraph 48).
Lýza
It is not necessary to administer concurrent positive control substances by the same route as the test chemical, although it is important that the same route should be used when measuring site-of-contact effects.
Aj podmienky lýzy patria ku kritickým premenným veličinám a môžu narúšať zlomy v reťazcoch vyvolané špecifickými typmi modifikácie DNA (niektoré alkylácie DNA a bázické adukty).
The positive control substances should be shown to induce DNA strand breaks in all of the tissues of interest for the test chemical, and EMS is likely to be the positive control of choice since it has produced DNA strand breaks in all tissues that have been studied.
Preto sa odporúča, aby sa pri všetkých preparátoch v rámci pokusu udržiavali pokiaľ možno konštantné podmienky lýzy.
The doses of the positive control substances should be selected so as to produce moderate effects that critically assess the performance and sensitivity of the assay and could be based on dose-response curves established by the laboratory during the demonstration of proficiency.
Po príprave by sa preparáty mali aspoň na jednu hodinu (alebo na noc) ponoriť do lyzačného roztoku pri teplote okolo 2 – 8 °C, tlmenom osvetlení, tzv. žlté svetlo (alebo podmienky odolné proti svetlu), aby nedošlo k ich vystaveniu účinkom bieleho svetla, ktoré môže obsahovať zložky UV žiarenia.
The % tail DNA in concurrent positive control animals should be consistent with the pre-established laboratory range for each individual tissue and sampling time for that species (see paragraph 16).
Po tejto inkubačnej lehote sa preparáty opláchnu, aby sa pred fázou alkalického rozpletania odstránili zvyšky detergentu a soli.
Examples of positive control substances and some of their target tissues (in rodents) are included in Table 1.
Robí sa to čistenou vodou, neutralizačným alebo fosfátovým tlmivým roztokom.
Substances other than those given in Table 1 can be selected if scientifically justified.
Môže sa použiť aj elektroforézny tlmivý roztok.
Examples of positive control substances and some of their target tissues
Vďaka tomu sa v elektroforéznej komore zachovajú alkalické podmienky.
Substances and CAS RN No.
Rozpletanie a elektroforéza
Ethyl methanesulfonate (CAS RN 62-50-0) for any tissue
Preparáty sa náhodne umiestnia do zariadenia na ponorkovú elektroforézu obsahujúceho dostatočné množstvo roztoku tak, aby boli povrchy preparátov úplne ponorené (aj hĺbka ponoru by mala byť pri každom pokuse konzistentná).
Ethyl nitrosourea (CAS RN 759-73-9) for liver and stomach, duodenum or jejunum
Pri iných typoch elektroforéznych zariadení na účely kométového testu, t. j. s aktívnym chladením, cirkuláciou a vysokokapacitným zdrojom energie, bude mať väčší ponor v roztoku za následok vyšší elektrický prúd, pričom napätie bude naďalej konštantné.
Methyl methanesulfonate (CAS RN 66-27-3) for liver, stomach, duodenum or jejunum, lung and bronchoalveolar lavage (BAL) cells, kidney, bladder, lung, testis and bone marrow/blood
Preparáty by sa do elektroforéznej nádoby mali umiestňovať vyváženým spôsobom, aby sa zmiernili účinky akýchkoľvek trendov alebo okrajových účinkov v nádobe a minimalizovali odchýlky medzi jednotlivými dávkami, t. j. pri každej elektroforéze by mal existovať rovnaký počet preparátov z každého skúmaného zvieraťa vrátane vzoriek z rôznych skupín dávok, negatívnych a pozitívnych kontrol.
N-Methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (CAS RN: 70-25-7) for stomach, duodenum or jejunum
Preparáty by sa mali nechať aspoň 20 minút postáť, aby mohlo dôjsť k rozpleteniu DNA, a potom podrobiť elektroforéze za kontrolovaných podmienok, ktoré umožnia maximalizovať citlivosť a dynamický rozsah testu (napr. dosiahnuť prijateľné úrovne % chvostovej DNA pri negatívnych a pozitívnych kontrolách, ktoré maximalizujú citlivosť).
1,2-Dimethylhydrazine 2HCl (CAS RN 306-37-6) for liver and intestine
Úroveň migrácie DNA je priamo úmerná tak dĺžke trvania elektroforézy, ako aj potenciálu (V/cm).
N-methyl-N-nitrosourea (CAS RN 684-93-5) for liver, bone marrow, blood, kidney, stomach, jejunum, and brain.
Podľa skúšky JaCVAM by to mohlo byť 0,7 V/cm pri najmenej 20 minútach.
A group of negative control animals, treated with vehicle alone, and otherwise treated in the same way as the treatment groups, should be included with each test for every sampling time and tissue.
Dlhšie elektroforézne časy (napr. 30 alebo 40 minút na maximalizáciu citlivosti) obyčajne vedú k výraznejším pozitívnym odozvám v prípade známych mutagénov.
The % tail DNA in negative control animals should be within the pre-established laboratory background range for each individual tissue and sampling time for that species (see paragraph 16).
Dlhšie elektroforézne časy však môžu viesť aj k nadmernej migrácii v kontrolách.
In the absence of historical or published control data showing that no deleterious or genotoxic effects are induced by the chosen vehicle, by the number of administrations or by the route of administration, initial studies should be performed prior to conducting the full study, in order to establish acceptability of the vehicle control.
Napätie by malo pri každom pokuse zostať konštantné a odchýlky v prípade iných parametrov by mali byť v malom a stanovenom rozsahu napr. pri skúške JaCVAM sa pri 0.7 V/cm dosiahol štartovací prúd 300 mA.
Number and Sex of Animals
Hĺbka tlmivého roztoku by sa mala upraviť tak, aby bolo možné dosiahnuť požadované podmienky a zachovať ju počas celého pokusu.
Although there is little data on female animals from which to make comparison between sexes in relation to the comet assay, in general, other in vivo genotoxicity responses are similar between male and female animals and therefore most studies could be performed in either sex.
Hodnoty prúdu na začiatku a na konci elektroforézy by sa mali zaznamenať.
Data demonstrating relevant differences between males and females (e.g. differences in systemic toxicity, metabolism, bioavailability, etc. including e.g. in a range-finding study) encourage the use of both sexes.
Optimálne podmienky pre každé skúmané tkanivo by sa preto v príslušnom laboratóriu mali určovať v priebehu počiatočného preukazovania spôsobilosti.
In this case, it may be appropriate to perform a study in both sexes e.g. as part of a repeated dose toxicity study.
Teplota elektroforézneho roztoku počas rozpletania a elektroforézy by mala zostať nízka, obyčajne 2 – 10 °C (10).
Group sizes at study initiation (and during establishment of proficiency) should be established with the aim of providing a minimum of 5 analysable animals of one sex, or of each sex if both are used, per group (less in the concurrent positive control group — see paragraph 29).
Teplota elektroforézneho roztoku na začiatku rozpletania, začiatku a konci elektroforézy by sa mala zaznamenať.
As a guide to maximum typical animal requirements, a study conducted according the parameters established in paragraph 33 with three dose groups and concurrent negative and positive controls (each group composed of five animals of a single sex) would require between 25 and 35 animals.
Po dokončení elektroforézy by sa preparáty mali aspoň 5 minút ponárať/oplachovať neutralizačným tlmivým roztokom.
TREATMENT SCHEDULE
Gély možno zafarbiť a hodnotiť „čerstvé“ (napr. do 1 – 2 dní), príp. ich dehydrovať na účely neskoršieho hodnotenia (napr. do 1 až 2 týždňov po zafarbení) (56).
Animals should be given daily treatments over a duration of 2 or more days (i.e. two or more treatments at approximately 24 hour intervals), and samples should be collected once at 2-6 h (or at the Tmax) after the last treatment (12).
Tieto podmienky by sa však mali validovať v priebehu preukazovania spôsobilosti, pričom by sa mali získať a osobitne uchovať historické údaje týkajúce sa každej z týchto podmienok.
Samples from extended dose regimens (e.g. 28-day daily dosing) are acceptable.
V druhom prípade by sa preparáty mali dehydrovať ponorením na najmenej 5 minút do absolútneho etanolu, nechať oschnúť na vzduchu a potom až do hodnotenia skladovať buď pri izbovej teplote, alebo v nádobe v chladničke.
Successful combination of the comet and the erythrocyte micronucleus test has been demonstrated (10) (19).
Metódy merania
However careful consideration should be given to the logistics involved in tissue sampling for comet analysis alongside the requirements of tissue sampling for other types of toxicological assessments.
Kométy by sa mali hodnotiť kvantitatívne pomocou automatických alebo poloautomatických systémov analýzy obrazu.
Harvest 24 hours after the last dose, which is typical of a general toxicity study, is not appropriate in most cases (see paragraph 40 on sampling time).
Preparáty sa zafarbia primeraným fluorescenčným farbivom napr. zlatou SYBR, zelenou I (green I), propídium-jodidom alebo etídium-bromidom a merajú pri vhodnom zväčšení (napríklad 200-násobnom) pod epifluorescenčným mikroskopom s vhodnými detektormi alebo na digitálnej kamere (napr. CCD).
The use of other treatment and sampling schedules should be justified (see Appendix 3).
Bunky možno zaradiť do troch kategórií opísaných v atlase kométových snímok (57), a to hodnotiteľné, nehodnotiteľné a tzv. ježe (hedgehog) (ďalšie podrobnosti sú uvedené v bode 56).
For example single treatment with multiple sampling could be used however, it should be noted that more animals will be required for a study with a single administration study because of the need for multiple sampling times, but on occasions this may be preferable, e.g. when the test chemical induces excessive toxicity following repeated administrations.
Na účely výpočtu % chvostovej DNA by sa mali hodnotiť iba hodnotiteľné bunky (jasne vymedzená hlava a chvost, bez interferencie so susednými bunkami), aby sa zabránilo artefaktom.
Whatever way the test is performed, it is acceptable as long as the test chemical gives a positive response or, for a negative study, as long as direct or indirect evidence supportive of exposure of, or toxicity to, the target tissue(s) has been demonstrated or if the limit dose is achieved (see paragraph 36).
Frekvenciu výskytu nehodnotiteľných buniek netreba zapisovať do protokolu.
Test chemicals also may be administered as a split dose, i.e., two treatments on the same day separated by no more than 2-3 hours, to facilitate administering a large volume.
Frekvencia výskytu „ježov“ by sa mala určovať na základe vizuálneho hodnotenia (keďže im chýba jasne definovaná hlava, čo sťažuje ich detekciu analýzou obrazu) minimálne 150 buniek na vzorku (ďalšie podrobnosti sú uvedené v bode 56) a zvlášť zapísať.
Under these circumstances, the sampling time should be scheduled based on the time of the last dosing (see paragraph 40).
Všetky preparáty určené na analýzu vrátane negatívnych a pozitívnych kontrol by mali byť nezávisle označené kódmi a hodnotené ako „slepé“, aby hodnotiteľ nepoznal spôsob ich ovplyvnenia.
Dose Levels
Z každej vzorky (jedno tkanivo na zviera) by sa malo analyzovať najmenej 150 buniek (s výnimkou „ježov“ – pozri bod 56).
If a preliminary range-finding study is performed because there are no suitable data available from other relevant studies to aid in dose selection, it should be performed in the same laboratory, using the same species, strain, sex, and treatment regimen to be used in the main study according to current approaches for conducting dose range-finding studies.
Hodnotenie 150 buniek na zviera s minimálne 5 zvieratami na jednu dávku (menej pri súbežnej pozitívnej kontrole – pozri bod 29) poskytuje podľa analýzy Smith et al., 2008 (5) primeranú štatistickú výpovednú hodnotu.
The study should aim to identify the maximum tolerated dose (MTD), defined as the dose inducing slight toxic effects relative to the duration of the study period (for example, clear clinical signs such as abnormal behaviour or reactions, minor body weight depression or target tissue cytotoxicity), but not death or evidence of pain, suffering or distress necessitating euthanasia.
Ak sa používajú preparáty, mohlo by ísť o hodnotenie 2 alebo 3 preparátov na vzorku, ak je v skupine päť zvierat.
For a non-toxic test chemical, with an administration period of 14 days or more, the maximum (limit) dose is 1000 mg/kg bodyweight/day.
Pozorovania by sa mali vykonať vo viacerých oblastiach preparátu s hustotou, ktorá zaručí, že nedôjde k prekrývaniu chvostov.
For administration periods of less than 14 days the maximum (limit) dose is 2000 mg/kg bodyweight/day.
Okraje preparátov by sa nemali hodnotiť.
For certain types of test chemicals (e.g. human pharmaceuticals) covered by specific regulations these limits may vary.
Zlomy v reťazcoch DNA možno v kométovom teste merať nezávislými sledovanými parametrami, ako je % objemu chvostovej DNA, dĺžka a tzv. tail moment.
Chemicals that exhibit saturation of toxicokinetic properties, or induce detoxification processes that may lead to a decrease in exposure after long-term administration, may be exceptions to the dose-setting criteria and should be evaluated on a case-by-case basis.
Všetky tri merania možno vykonať použitím vhodného systému so softvérom na analýzu obrazu.
For both acute and sub-acute versions of the comet assay, in addition to the maximum dose (MTD, maximum feasible dose, maximum exposure or limit dose) a descending sequence of at least two additional appropriately spaced dose levels (preferably separated by less than √10) should be selected for each sampling time to demonstrate dose-related responses.
Na vyhodnotenie a interpretáciu výsledkov (12) (40) (41) (42) sa však odporúča použiť % chvostovej DNA (tiež známe ako % hustoty na chvoste), ktoré je dané hustotou fragmentov DNA na chvoste vyjadrenou ako percento z celkovej hustoty buniek (13).
However, the dose levels used should also preferably cover a range from the maximum to one producing little or no toxicity.
Poškodenie tkaniva a cytotoxicita
When target tissue toxicity is observed at all dose levels tested, further study at non-toxic doses is advisable (see paragraphs 54-55).
Pozitívne nálezy v kométovom teste nemusia byť nutne výsledkom genotoxicity, keďže aj toxicita cieľového tkaniva môže mať za následok nárast migrácie DNA (12) (41).
Studies intending to more fully investigate the shape of the dose-response curve may require additional dose group(s).
A naopak, nízka alebo mierna cytotoxicita je často výsledkom známych genotoxínov (12), z čoho vyplýva, že pri samotnom kométovom teste nie je možné rozlíšiť migráciu DNA vyvolanú genotoxicitou od migrácie vyvolanej cytoxocitou.
Administration of Doses
Ak sú však pozorované nárasty migrácie DNA, odporúča sa preskúmať jeden alebo viacero ukazovateľov cytotoxicity, čo môže pomôcť pri interpretácii zistení.
In any case the route should be chosen to ensure adequate exposure of the target tissue(s).
Nárasty migrácie DNA v prítomnosti jasných dôkazov cytotoxicity by sa mali interpretovať opatrne.
Intraperitoneal injection is generally not recommended since it is not a typical relevant route of human exposure, and should only be used with specific justification (e.g. some positive control substances, for investigative purposes, or for some drugs that are administered by the intraperitoneal route).
Bolo navrhnutých mnoho meraní cytotoxicity, spomedzi ktorých sa za najvhodnejší spôsob merania toxicity tkaniva považujú histopatologické zmeny.
The volume should not exceed 1 ml/100 g body weight, except in the case of aqueous solutions where 2 ml/100g body weight may be used.
Pozorované javy, ako je zápal, bunková infiltrácia, apoptózové alebo nekrotické zmeny, sú spájané s nárastom migrácie DNA, no validačná skúška JaCVAM (12) potvrdila, že neexistuje žiadny konečný zoznam histopatologických zmien, ktoré sa vždy spájajú so zvýšenou migráciou DNA.
The use of volumes greater than this (if permitted by animal welfare legislation) should be justified.
Aj zmeny v klinických chemických ukazovateľoch (napr. AST, ALT) môžu poskytnúť užitočné informácie o poškodení tkaniva, pričom do úvahy je možné vziať aj ďalšie ukazovatele, napr. aktiváciu kaspázy, farbivo TUNEL, farbivo Annexin V atď.
Wherever possible different dose levels should be achieved by adjusting the concentration of the dosing formulation to ensure a constant volume in relation to body weight at all dose levels.
Existuje však len obmedzené množstvo publikovaných údajov o použití spomínaných ďalších ukazovateľov v štúdiách in vivo, pričom niektoré sú viac a iné menej spoľahlivé.
Sampling Time
„Ježe“ (alebo tiež hedgehogs, clouds alebo ghost cells) sú bunky, ktoré vytvárajú mikroskopický obraz pozostávajúci z malých alebo neexistujúcich hláv a veľkých, rozptýlených chvostov, a považujú sa za bunky s ťažkým poškodením, hoci etiológia „ježov“ je neistá (pozri dodatok 3).
The sampling time is a critical variable because it is determined by the period needed for the test chemicals to reach maximum concentration in the target tissue and for DNA strand breaks to be induced but before those breaks are removed, repaired or lead to cell death.
Pre ich vzhľad sú merania % chvostovej DNA analýzou obrazu nespoľahlivé, preto by sa „ježe“ mali vyhodnocovať osobitne.
The persistence of some of the lesions that lead to the DNA strand breaks detected by the comet assay may be very short, at least for some chemicals tested in vitro (52) (53).
Výskyt „ježov“ by sa mal zaznamenať a uviesť do protokolu, pričom akýkoľvek relevantný nárast, ktorý sa považuje za následok testovanej chemikálie, by sa mal dôsledne preskúmať a interpretovať.
In the absence of kinetic data a suitable compromise for the measurement of genotoxicity is to sample at 2-6 h after the last treatment for two or more treatments, or at both 2-6 and 16-26 h after a single administration, although care should be taken to necropsy all animals at the same time after the last (or only) dose.
Potom sa určí priemer z priemerov za jednotlivé zvieratá, aby sa získal priemer za skupinu.
Information on the appearance of toxic effects in target organs (if available) may also be used to select appropriate sampling times.
Všetky tieto hodnoty by sa mali zapísať do protokolu.
General clinical observations related to the health of the animals should be made and recorded at least once a day preferably at the same time(s) each day and considering the peak period of anticipated effects after dosing (54).
Môžu sa použiť aj alternatívne prístupy (pozri bod 53), ak sú vedecky a štatisticky opodstatnené.
At least twice daily, all animals should be observed for morbidity and mortality.
Štatistické analýzy možno urobiť použitím rôznych prístupov (58) (59) (60) (61).
For longer duration studies, all animals should be weighed at least once a week, and at completion of the test period.
Pri výbere štatistických metód, ktoré sa majú použiť, by sa mala na základe skutočností uvedených v spomínaných odkazoch na literatúru zvážiť potreba transformácie údajov (napr. logaritmicky alebo druhou odmocninou) a/alebo pripočítania malého čísla (napr. 0,001) ku všetkým (dokonca aj nenulovým) hodnotám, aby sa minimalizovali účinky nulových bunkových hodnôt.
Food consumption should be measured at each change of food and at least weekly.
Podrobnosti o analýze interakcií medzi spôsobom ovplyvnenia a pohlavím zvierat v prípade použitia oboch pohlaví, ako aj následná analýza údajov pri zistení, prípadne nezistení rozdielov, sú uvedené v dodatku 2.
Animals exhibiting non-lethal indicators of excessive toxicity should be euthanized prior to completion of the test period, and are generally not used for comet analysis.
V protokole by mali byť uvedené aj údaje o toxicite a klinických príznakoch.
Tissue Collection
súbežná negatívna kontrola sa považuje za prijateľnú a môže sa doplniť do databázy historických údajov z negatívnych kontrol laboratória, ako je opísané v bode 16,
Since it is possible to study induction of DNA strand breaks (comets) in virtually any tissue, the rationale for selection of tissue(s) to be collected should be clearly defined and based upon the reason for conducting the study together with any existing ADME, genotoxicity, carcinogenicity or other toxicity data for the test chemicals under investigation.
súbežné pozitívne kontroly (pozri bod 29) by mali vyvolať odozvy, ktoré sú zlučiteľné s odozvami získanými v databáze historických údajov z pozitívnych kontrol a v porovnaní so súbežnou negatívnou kontrolou predstavujú štatisticky významný nárast,
Important factors for consideration should include the route of administration (based on likely human exposure route(s)), the predicted tissue distribution and absorption, the role of metabolism and the possible mechanism of action of the test chemicals.
bol analyzovaný adekvátny počet buniek a dávok (bod 52 a body 36 – 38),
The liver has been the tissue most frequently studied and for which there are the most data.
kritériá výberu najvyššej dávky sú v súlade s kritériami opísanými v bode 36.
Therefore, in the absence of any background information, and if no specific tissues of interest are identified, sampling the liver would be justified as this is a primary site of xenobiotic metabolism and is often highly exposed to both parent substance(s) and metabolite(s).
Za predpokladu, že boli splnené všetky kritériá prijateľnosti sa testovaná chemikália považuje za jednoznačne pozitívnu, ak: