natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Reference control C, rep 3
Signalizácia luciferázy je výsledkom aktivácie endogénnych Nrf2 dependentných génov vyvolanej senzibilizátormi, pričom bola preukázaná závislosť signalizácie luciferázy v rekombinantnej bunkovej línii od Nrf2 (27).
Cinnamic aldehyde, rep 3
To umožňuje kvantitatívne merania (luminiscenčnou detekciou) indukcie génu luciferázy použitím dobre známych luminiscenčných substrátov s obsahom luciferázy, ktoré sú ukazovateľom aktivity transkripčného faktora Nrf2 v bunkách následkom expozície účinkom elektrofilných látok.
Sample 1, rep 3
Testované chemikálie sa v skúške KeratinoSens™ považujú za pozitívne, ak vyvolajú takú štatisticky významnú indukciu aktivity luciferázy presahujúcu stanovený limit [t. j. viac ako 1,5-násobne alebo o 50 %) do výšky definovanej koncentrácie, ktorá významne neovplyvní životaschopnosť buniek (t. j. menej ako 1000 μM a pri koncentrácii, ktorá zaručuje životaschopnosť buniek nad 70 % (9) (12)].
Sample 2, rep 3
Na tento účel sa stanoví maximálny násobok indukcie aktivity luciferázy v porovnaní s (negatívnou) kontrolou s rozpúšťadlom (Imax).
Reference control B, rep 4
Okrem toho, keďže bunky sú vystavené pôsobeniu série koncentrácií testovaných chemikálií, by sa koncentrácia potrebná na účely štatisticky významnej indukcie aktivity luciferázy, ktorá prekročí limitnú hodnotu (t. j. hodnotu EC1,5) mala interpolovať z krivky závislosti reakcie od dávky (pozri výpočty v bode 32).
Reference control B, rep 5
Nakoniec by sa mali vykonať paralelné merania cytotoxicity, aby sa posúdilo, či sú indukčné hodnoty aktivity luciferázy pod úrovňou cytotoxických koncentrácií.
Reference control B, rep 6
Pred rutinným použitím skúšky ARE-Nrf2 luciferáza, ktorá zodpovedá požiadavkám tejto testovacej metódy, by mali laboratóriá preukázať technickú spôsobilosť použitím desiatich chemikálií na preukázanie spôsobilosti uvedených v dodatku 2.
B.60 In Vitro Skin Sensitisation: ARE-Nrf2 Luciferase Test Method
Normy výkonnosti (28) sú k dispozícii na to, aby uľahčili validáciu nových alebo modifikovaných in vitro testovacích metód „ARE-Nrf2 luciferáza” podobných skúške KeratinoSens™ a umožnili včasnú úpravu tejto testovacej metódy pre ich zaradenie.
This test method (TM) is equivalent to OECD test guideline (TG) 442D (2015).
Vzájomné uznávanie údajov (MAD) podľa dohody OECD je možné garantovať len v prípade testovacích metód validovaných podľa noriem výkonnosti v prípade, že tieto metódy boli preskúmané a zaradené do príslušných usmernení OECD na vykonávanie testov.
A skin sensitiser refers to a substance that will lead to an allergic response following skin contact as defined by the United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (UN GHS) (1) and Regulation (EC) No 1272/2008 of the European Parliament and of the Council on Classification, Labelling and Packaging of Substances and Mixtures (CLP) [18].
V súčasnosti existuje v rámci tejto testovacej metódy jediná vedecky overená metóda – skúška KeratinoSens™ (9) (12) (13) (14).
This test method provides an in vitro procedure (the ARE-Nrf2 luciferase assay) to be used for supporting the discrimination between skin sensitisers and non-sensitisers in accordance with the UN GHS (1) and CLP.
Ku skúške KeratinoSens™ boli vypracované štandardné prevádzkové postupy a mali by sa používať pri zavádzaní a využívaní tejto testovacej metódy v laboratóriu (15).
The existing knowledge of the chemical and biological mechanisms associated with skin sensitisation has been summarised in the form of an Adverse Outcome Pathway (AOP) (2), going from the molecular initiating event through the intermediate events up to the adverse health effect, i.e. allergic contact dermatitis in humans or contact hypersensitivity in rodents (2) (3).
Laboratóriá ochotné zaviesť túto testovaciu metódu môžu získať rekombinovanú bunkovú líniu používanú pri skúške KeratinoSens™ uzavretím licenčnej zmluvy so spoločnosťou, ktorá túto testovaciu metódu vyvinula.
The molecular initiating event is the covalent binding of electrophilic substances to nucleophilic centres in skin proteins.
V nasledujúcich bodoch sú opísané základné zložky a postupy pri testovacej metóde ARE-Nrf2 luciferáza.
The second key event in this AOP takes place in the keratinocytes and includes inflammatory responses as well as gene expression associated with specific cell signalling pathways such as the antioxidant/electrophile response element (ARE)-dependent pathways.
Príprava keratínocytových kultúr
The third key event is the activation of dendritic cells, typically assessed by expression of specific cell surface markers, chemokines and cytokines.
Mala by sa použiť transgénová bunková línia so stabilným reportérovým génom luciferázy kontrolovaným prvkom ARE (napr. bunková línia KeratinoSens™).
The fourth key event is T-cell proliferation, which is indirectly assessed in the murine Local Lymph Node Assay (4).
Po prijatí sa bunky namnožia (napr. na 2 až 4 pasáže) a skladujú zmrazené ako homogénny materiál.
The classical methods based on guinea-pigs, the Magnusson Kligman Guinea Pig Maximisation Test (GMPT) and the Buehler Test (TM B.6 (5)), study both the induction and elicitation phases of skin sensitisation.
Bunky z tohto uskladneného materiálu sa namnožia na maximálny počet pasáží (t. j.
A murine test, the Local Lymph Node Assay (LLNA) (TM B.42 (4)) and its two non-radioactive modifications, LLNA: DA (TM B.50 (6)) and LLNA: BrdU-ELISA (TM B.51 (7)), which all assess the induction response exclusively, have also gained acceptance since they provide advantages over the guinea pig tests in terms of both animal welfare and objective measurement of the induction phase of skin sensitisation.
25 v prípade KeratinoSens™) a podrobia rutinnému testovaniu použitím vhodného udržiavacieho média (v prípade KeratinoSens™ ide o DMEM s obsahom séra a geneticínu).
More recently, mechanistically-based in chemico and in vitro test methods have been considered scientifically valid for the evaluation of the skin sensitisation hazard of chemicals.
Na účely testovania by bunky mali byť z 80 – 90 % konfluentné, pričom treba dbať na to, aby nikdy nedošlo k úplnej konfluencii.
However, combinations of non-animal methods (in silico, in chemico, in vitro) within Integrated Approaches to Testing and Assessment (IATA) will be needed to be able to fully substitute for the animal tests currently in use given the restricted AOP mechanistic coverage of each of the currently available non-animal test methods (2) (3).
Deň pred testovaním sa bunky odoberú a rozdelia na platničky s 96 jamkami (v prípade KeratinoSens™ pripadá na jednu jamku 10000 buniek).
This test method (ARE-Nrf2 luciferase assay) is proposed to address the second key event as explained in paragraph 2.
Treba dbať na to, aby pri dávkovaní nedošlo k sedimentácii buniek a bunky boli do jednotlivých jamiek rozdelené rovnomerne.
Skin sensitisers have been reported to induce genes that are regulated by the antioxidant response element (ARE) (8) (9).
V opačnom prípade môžu jednotlivé jamky vykazovať výrazne odlišné hodnoty.
Small electrophilic substances such as skin sensitisers can act on the sensor protein Keap1 (Kelch-like ECH-associated protein 1), by e.g. covalent modification of its cysteine residue, resulting in its dissociation from the transcription factor Nrf2 (nuclear factor-erythroid 2-related factor 2).
Pri každom opakovaní sa na meranie aktivity luciferázy použijú tri replikáty, pričom jeden paralelný replikát sa použije na skúšku životaschopnosti buniek.
The dissociated Nrf2 can then activate ARE-dependent genes such as those coding for phase II detoxifying enzymes (8) (10) (11).
Príprava testovanej chemikálie a kontrolných látok
Currently, the only in vitro ARE-Nrf2 luciferase assay covered by this test method is the KeratinoSensTM assay for which validation studies have been completed (9) (12) (13) followed by an independent peer review conducted by the European Union Reference Laboratory for Alternatives to Animal Testing (EURL ECVAM) (14).
Testovaná chemikália a kontrolné látky sa pripravujú v deň testovania.
The KeratinoSensTM assay was considered scientifically valid to be used as part of an IATA, to support the discrimination between skin sensitisers and non-sensitisers for the purpose of hazard classification and labelling (14).
V prípade skúšky KeratinoSens™ sa testované chemikálie rozpustia v dimetylsulfoxide (DMSO) na konečnú želanú koncentráciu (napr. 200 mM).
Laboratories willing to implement the test method can obtain the recombinant cell line used in the KeratinoSensTM assay by establishing a licence agreement with the test method developer (15).
Roztoky DMSO možno považovať za samosterilizujúce, preto nie je potrebná žiadna sterilná filtrácia.
Since activation of the Keap1-Nrf2-ARE pathway addresses only the second key event of the skin sensitisation AOP, information from test methods based on the activation of this pathway is unlikely to be sufficient when used on its own to conclude on the skin sensitisation potential of chemicals.
Testovaná chemikália, ktorá nie je rozpustná v DMSO, sa rozpustí v sterilnej vode alebo kultivačnom médiu a roztoky sa sterilizujú napr. filtráciou.
Therefore, data generated with the present test method should be considered in the context of integrated approaches, such as IATA, combining them with other complementary information e.g. derived from in vitro assays addressing other key events of the skin sensitisation AOP as well as non-testing methods including read-across from chemical analogues.
V prípade testovanej chemikálie, ktorá nemá definovanú molekulovú hmotnosť (MH), sa pripraví zásobný roztok s koncentráciou (40 mg/ml alebo 4 hm. %), ktorá je pre skúšku KeratinoSens™ štandardná.
Examples on how to use the ARE-Nrf2 luciferase test method in combination with other information are reported in literature (13) (16) (17) (18) (19).
Použitie iných rozpúšťadiel ako DMSO, voda alebo kultivačné médium treba náležite zdôvodniť.
This test method can be used to support the discrimination between skin sensitisers (i.e. UN GHS/CLP Category 1) and non-sensitisers in the context of IATA.
Zo zásobných roztokov DMSO testovanej chemikálie sa extrakt sériovo riedi použitím DMSO tak, aby sa získalo 12 základných koncentrácií testovanej chemikálie (od 0,098 do 200 mM pri skúške KeratinoSens™).
This test method cannot be used on its own, neither to sub-categorise skin sensitisers into subcategories 1A and 1B as defined by the UN GHS/CLP nor to predict potency for safety assessment decisions.
V prípade testovanej chemikálie, ktorá nie je rozpustná v DMSO, dochádza k riedeniu na získanie základných koncentrácií použitím sterilnej vody alebo sterilného kultivačného média.
However, depending on the regulatory framework, a positive result may be used on its own to classify a chemical into UN GHS/CLP category 1.
Nezávisle od použitého rozpúšťadla sa základné koncentrácie ďalej 25-krát zriedia v kultivačnom médiu s obsahom séra a nakoniec sa upravia ďalším 4-násobným faktorom riedenia tak, aby bol rozsah konečných koncentrácií testovanej chemikálie pri skúške KeratinoSens™ v rozmedzí od 0,98 do 2000 μM.
Based on the dataset from the validation study and in-house testing used for the independent peer-review of the test method, the KeratinoSensTM assay proved to be transferable to laboratories experienced in cell culture.
Môžu sa použiť aj alternatívne koncentrácie (napr. v prípade cytotoxicity alebo slabej rozpustnosti), ak sa zdôvodnia.
The level of reproducibility in predictions that can be expected from the test method is in the order of 85 % within and between laboratories (14).
Negatívna kontrola (s rozpúšťadlom) používaná pri skúške KeratinoSens™ je DMSO (CAS č. 67-68-5, ≥ 99 % čistoty), ktorá sa dávkuje do šiestich jamiek na každej platničke.
The accuracy (77 % - 155/201), sensitivity (78 % - 71/91) and specificity (76 % - 84/110) of the KeratinoSensTM assay for discriminating skin sensitisers (i.e. UN GHS/CLP Cat.
Prejde rovnakým riedením ako v prípade základných koncentrácií, ktorý je opísaný v bode 22, a to tak, aby výsledná negatívna kontrola (s rozpúšťadlom) bola 1 %, pričom je o nej známe, že neovplyvňuje životaschopnosť buniek a má rovnakú koncentráciu ako DMSO zistenú v testovanej chemikálii a pozitívnej kontrole.
1) from non-sensitisers when compared to LLNA results were calculated by considering all of the data submitted to EURL ECVAM for evaluation and peer-review of the test method (14).
V prípade testovanej chemikálie nerozpustnej v DMSO, ktorá sa riedila vo vode, sa musí koncentrácia DMSO vo všetkých jamkách upraviť na 1 % tak, ako v prípade ostatných testovaných chemikálií a kontrolných látok.
These figures are similar to those recently published based on in-house testing of about 145 substances (77 % accuracy, 79 % sensitivity, 72 % specificity) (13).
Pozitívnou kontrolou používanou pri skúške KeratinoSens™ je aldehyd kyseliny škoricovej (CAS č. 14371-10-9, s čistotou ≥ 98 %), z ktorého sa v DMSO (zásobný roztok s koncentráciou 6,4 mM) pripravia série 5 základných koncentrácií v rozmedzí od 0,4 do 6,4 mM a zriedia postupom opísaným pri základných koncentráciách v bode 22 tak, aby sa konečná koncentrácia pozitívnej kontroly pohybovala od 4 do 64 μM.
The KeratinoSensTM assay is more likely to under predict chemicals showing a low to moderate skin sensitisation potency (i.e. UN GHS/CLP subcategory 1B) than chemicals showing a high skin sensitisation potency (i.e. UN GHS/CLP subcategory 1A) (13) (14).
Môžu sa použiť aj iné pozitívne kontroly, najlepšie také, ktoré umožnia dosiahnuť hodnotu EC1,5 pri strednom rozsahu, ak existujú predchádzajúce údaje, z ktorých sa dajú odvodiť porovnateľné kritériá prijateľnosti vykonania testu.
Taken together, this information indicates the usefulness of the KeratinoSensTM assay to contribute to the identification of skin sensitisation hazard.
Použitie testovanej chemikálie a kontrolných látok
However, the accuracy values given here for the KeratinoSensTM assay as a stand-alone test method are only indicative since the test method should be considered in combination with other sources of information in the context of an IATA and in accordance with the provisions of paragraph 9 above.
Pri každej testovanej chemikálii a pozitívnej kontrole je potrebné vykonať jeden pokus na odvodenie prognózy (pozitívnej alebo negatívnej), ktorý pozostáva najmenej z dvoch nezávislých opakovaní s každým z troch replikátov (t. j. n = 6).
Furthermore when evaluating non-animal methods for skin sensitisation, it should be kept in mind that the LLNA as well as other animal tests, may not fully reflect the situation in the species of interest i.e. humans.
Ak sa výsledky z dvoch nezávislých opakovaní nezhodujú, je potrebné vykonať tretie opakovanie s tromi replikátmi (t. j. n = 9).
The term “test chemical” is used in this test method to refer to what is being tested and is not related to the applicability of the ARE-Nrf2 luciferase test method to the testing of substances and/or mixtures.
Každé nezávislé opakovanie sa vykoná v iný deň, s čerstvým zásobným roztokom testovaných chemikálií a s nezávisle odobratými bunkami.
On the basis of the current data available the KeratinoSensTM assay was shown to be applicable to test chemicals covering a variety of organic functional groups, reaction mechanisms, skin sensitisation potency (as determined with in vivo studies) and physico-chemical properties (9) (12) (13) (14).
Bunky však môžu pochádzať z tej istej pasáže.
Mainly mono-constituent substances were tested, although a limited amount of data also exist on the testing of mixtures (20).
Po nadávkovaní opísanom v bode 20 sa bunky kultivujú 24 hodín v platničkách s 96 jamkami.
The test method is nevertheless technically applicable to the testing of multi-constituent substances and mixtures.
Potom sa médium odstráni a nahradí čerstvým kultivačným médiom (v prípade skúšky KeratinoSens™ je to150 μl kultivačného média s obsahom séra bez geneticínu), do ktorého sa pridá 50 μl 25-násobne zriedenej testovanej chemikálie a kontrolných látok.
However, before use of this test method on a mixture for generating data for an intended regulatory purpose, it should be considered whether, and if so why, it may provide adequate results for that purpose.
Na každej platničke s jamkami sa nechá aspoň jedna jamka prázdna (bez buniek a bez ovplyvnenia), aby sa skontrolovali pozaďové hodnoty.
Moreover, when testing multi-constituent substances or mixtures, consideration should be given to possible interference of cytotoxic constituents with the observed responses.
Ovplyvnené platničky s jamkami sa potom inkubujú 48 hodín pri teplote 37 ± 1 °C za prítomnosti 5 % CO 2 v prípade skúšky KeratinoSens™.
The test method is applicable to test chemicals soluble or that form a stable dispersion (i.e. a colloid or suspension in which the test chemical does not settle or separate from the solvent into different phases) either in water or DMSO (including all of the test chemical components in the case of testing a multi-constituent substance or a mixture).
Treba dbať na to, aby sa zabránilo vyparovaniu prchavých testovaných chemikálií a krížovej kontaminácii medzi jamkami s testovanými chemikáliami. napr. zakrytím platničiek fóliou pred ich inkubáciou.
Test chemicals that do not fulfil these conditions at the highest final required concentration of 2000 μM (cf. paragraph 22) may still be tested at lower concentrations.
Merania aktivity luciferázy
In such a case, results fulfilling the criteria for positivity described in paragraph 39 could still be used to support the identification of the test chemical as a skin sensitiser, whereas a negative result obtained with concentrations < 1000 μM should be considered as inconclusive (see prediction model in paragraph 39).
Na odčítanie správnych hodnôt luciferázy sú kľúčové tri faktory:
In general substances with a LogP of up to 5 have been successfully tested whereas extremely hydrophobic substances with a LogP above 7 are outside the known applicability of the test method (14).
výber citlivého luminometra,
For substances having a LogP falling between 5 and 7, only limited information is available.
použitie misky s dostatočnou výškou, aby sa zabránilo miernej krížovej kontaminácii a
Negative results should be interpreted with caution as substances with an exclusive reactivity towards lysine-residues can be detected as negative by the test method.
použitie substrátu luciferázy s dostatočným svetelným výkonom na zaručenie dostatočnej citlivosti a nízkej variability.
Furthermore, because of the limited metabolic capability of the cell line used (21) and because of the experimental conditions, pro-haptens (i.e. chemicals requiring enzymatic activation for example via P450 enzymes) and pre-haptens (i.e. chemicals activated by auto-oxidation) in particular with a slow oxidation rate may also provide negative results.
Pred testovaním je potrebné skontrolovať vybavenie na vykonanie skúšky opísané v dodatku 3, aby sa zabezpečilo splnenie týchto troch bodov.
Test chemicals that do not act as a sensitiser but are nevertheless chemical stressors may lead on the other hand to false positive results (14).
Po 48-hodinovej expozícii s testovanou chemikáliou a kontrolnými látkami pri skúške KeratinoSens™ sa bunky opláchnu fosfátovým tlmivým fyziologickým roztokom a na účely odčítania luminiscenčných hodnôt sa do každej jamky pridá pri izbovej teplote na 20 minút príslušný lyzačný tlmivý roztok.
Furthermore, highly cytotoxic test chemicals cannot always be reliably assessed.
Platničky s bunkovým lyzátom sa potom umiestnia do luminometra, ktorý je pri skúške KeratinoSens™ naprogramovaný tak, aby: i) do každej jamky pridal substrát luciferázy (t. j.
Finally, test chemicals that interfere with the luciferase enzyme can confound the activity of luciferase in cell-based assays causing either apparent inhibition or increased luminescence (22).
50 μl), ii) počkal 1 sekundu a iii) na 2 sekundy zlúčil aktivitu luciferázy.
For example, phytoestrogen concentrations higher than 1 μM were reported to interfere with the luminescence signals in other luciferase-based reporter gene assays due to over-activation of the luciferase reporter gene (23).
Ak sa použijú alternatívne nastavenia, napr. v závislosti od použitého modelu luminometra, mali by sa zdôvodniť.
As a consequence, luciferase expression obtained at high concentrations of phytoestrogens or similar chemicals suspected of producing phytoestrogen-like over-activation of the luciferase reporter gene needs to be examined carefully (23).
Okrem toho je možné použiť aj luminiscenčný substrát za predpokladu, že bol úspešne vykonaný pokus na kontrolu kvality opísaný v dodatku 3.
In cases where evidence can be demonstrated on the non-applicability of the test method to other specific categories of test chemicals, the test method should not be used for those specific categories.
Hodnotenie cytotoxicity
In addition to supporting discrimination between skin sensitisers and non-sensitisers, the KeratinoSensTM assay also provides concentration-response information that may potentially contribute to the assessment of sensitising potency when used in integrated approaches such as IATA (19).
Pri skúške životaschopnosti buniek KeratinoSens™ sa médium po 48 hodinách expozície nahradí čerstvým médiom s obsahom MTT, t. j.
However, further work preferably based on reliable human data is required to determine how KeratinoSensTM assay results can contribute to potency assessment (24) and to sub-categorisation of sensitisers according to UN GHS/CLP.
2,5-difenyl-3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)tetrazólium-bromidu alebo tiazolylovej modrej tetrazólium-bromidu; (CAS č. 298-93-1), pričom bunky sa inkubujú 4 hodiny pri teplote 37 °C v prítomnosti 5 % CO2.
The ARE-Nrf2 luciferase test method makes use of an immortalised adherent cell line derived from HaCaT human keratinocytes stably transfected with a selectable plasmid.
MTT médium sa potom odstráni a bunky sa cez noc lyzujú (napr. pridaním 10 % roztoku SDS do každej jamky).
The cell line contains the luciferase gene under the transcriptional control of a constitutive promoter fused with an ARE element from a gene that is known to be up-regulated by contact sensitisers (25) (26).
Po pretrepaní sa fotometrom zmeria absorpcia pri 600 nm.
The luciferase signal reflects the activation by sensitisers of endogenous Nrf2 dependent genes, and the dependence of the luciferase signal in the recombinant cell line on Nrf2 has been demonstrated (27).
Pri skúške KeratinoSens™ sa vypočítavajú tieto parametre:
This allows quantitative measurement (by luminescence detection) of luciferase gene induction, using well established light producing luciferase substrates, as an indicator of the activity of the Nrf2 transcription factor in cells following exposure to electrophilic substances.
hodnota maximálneho priemerného násobku indukcie aktivity luciferázy (Imax) pozorovaná pri každej koncentrácii testovanej chemikálie a pozitívnej kontroly;
Test chemicals are considered positive in the KeratinoSens™ assay if they induce a statistically significant induction of the luciferase activity above a given threshold (i.e. > 1,5 fold or 50 % increase), below a defined concentration which does not significantly affect cell viability (i.e. below 1000 μM and at a concentration at which the cellular viability is above 70 % (9) (12)).
hodnota EC1,5 predstavujúca koncentráciu, pri ktorej dochádza k indukcii aktivity luciferázy prekračujúcej limitnú hodnotu 1,5-násobku (t. j.
For this purpose, the maximal fold induction of the luciferase activity over solvent (negative) control (Imax) is determined.
50 % zvýšenú aktivitu luciferázy) a
Furthermore, since cells are exposed to series of concentrations of the test chemicals, the concentration needed for a statistically significant induction of luciferase activity above the threshold (i.e. EC1,5 value) should be interpolated from the dose-response curve (see paragraph 32 for calculations).
hodnoty koncentrácie IC50 a IC30 pre 50 % a 30 % zníženie životaschopnosti buniek.