natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Assessment of other markers for cytotoxicity or cytostasis (e.g. cell integrity, apoptosis, necrosis, metaphase counting, Proliferation index (PI), cell cycle, nucleoplasmic bridges or nuclear buds) could provide useful additional information, but should not be used in place of either the RPD or RICC.
odber po uplynutí času zodpovedajúceho 1,5 až 2,0-násobku dĺžky bežného bunkového cyklu po začatí ovplyvňovania.
The use of single cultures is particularly relevant when more than 3 concentrations are assessed (see paragraphs 44-45).
ovplyvňovanie počas 3 – 6 hodín;
The results obtained from the independent replicate cultures at a given concentration can be pooled for the data analysis.
odstránenie testovacieho média;
Where cytotoxicity occurs, the test concentrations selected should cover a range from that producing cytotoxicity as described in paragraph 29 and including concentrations at which there is moderate and little or no cytotoxicity.
predĺžené ovplyvňovanie
If the maximum concentration is based on cytotoxicity, the highest concentration should aim to achieve 55 ± 5 % cytotoxicity using the recommended cytotoxicity parameters (i.e. reduction in RICC and RPD for cell lines when cytoB is not used, and reduction in CBPI or RI when cytoB is used to 45± 5 % of the concurrent negative control) (72).
odber na konci času ovplyvňovania.
Care should be taken in interpreting positive results only found in the higher end of this 55 ± 5 % cytotoxicity range (71).
Bunkové línie ovplyvnené bez cytoB
Even if cytotoxicity occurs above the lowest insoluble concentration, it is advisable to test at only one concentration inducing turbidity or with visible precipitate because artifactual effects may result from the precipitate.
(Harmonogramy sú identické s harmonogramami ovplyvňovania uvedenými vyššie s výnimkou toho, že sa nepridáva cytoB).
If no precipitate or limiting cytotoxicity is observed, the highest test concentration should correspond to 10 mM, 2 mg/ml or 2 μl/ml, whichever is the lowest (73) (74) (75).
Na konci ovplyvňovania, ktoré trvá 3 – 6 hodín, sa v monovrstvových kultúrach môžu vyskytovať mitotické bunky (ktoré sú identifikovateľné ako okrúhle a oddeľujúce sa od povrchu).
When the test chemical is not of defined composition, e.g. a substance of unknown or variable composition, complex reaction products or biological materials (UVCB) (76), environmental extract, etc., the top concentration may need to be higher (e.g. 5 mg/ml) in the absence of sufficient cytotoxicity, to increase the concentration of each of the components.
Ak existuje dôkaz o podstatnom náraste počtu mitotických buniek v porovnaní s kontrolami, čo indikuje pravdepodobné zastavenie mitózy, v čase odberu by sa bunky mali zhromaždiť odstredením a pridať späť do kultúry, aby sa zabránilo strate buniek, u ktorých prebieha mitóza a hrozí, že dôjde k vzniku mikrojadier/chromozómovej aberácii.
It should be noted however that these requirements may differ for human pharmaceuticals (93).
Odber buniek a príprava preparátov
Concurrent negative controls (see paragraph 21), consisting of solvent alone in the treatment medium and processed in the same way as the treatment cultures, should be included for every harvest time.
Z každej kultúry by sa bunky mali odoberať a spracúvať zvlášť.
Concurrent positive controls are needed to demonstrate the ability of the laboratory to identify clastogens and aneugens under the conditions of the test protocol used and the effectiveness of the exogenous metabolic activation system (when applicable).
Príprava buniek môže zahŕňať hypotonizáciu, tento krok však nie je potrebný, ak sa dosiahne primerané rozšírenie buniek iným spôsobom.
Examples of positive controls are given in Table 1 below.
Pri príprave preparátov možno použiť rôzne techniky za predpokladu, že sa zabezpečí vysoká kvalita bunkových preparátov na účely vyhodnocovania.
At the present time, no aneugens are known that require metabolic activation for their genotoxic activity (17).
Bunky s neporušenou bunkovou membránou a neporušenou cytoplazmou by sa mali uchovať, aby bolo možné zistiť mikrojadrá a (pri použití metódy s blokovaním cytokinézy) spoľahlivo identifikovať dvojjadrové bunky.
Because in vitro mammalian cell tests for genetic toxicity are sufficiently standardised for the short-term treatments done concurrently with and without metabolic activation using the same treatment duration, the use of positive controls may be confined to a clastogen requiring metabolic activation.
Preparáty možno farbiť pomocou rôznych metód, ako je Giemsa alebo fluorescenčné farbivá so špecifickou väzbou na DNA.
In this case a single clastogenic positive control response will demonstrate both the activity of the metabolic activation system and the responsiveness of the test system.
Použitie vhodných fluorescenčných farbív [napr. akridínová oranž (78) alebo Hoechst 33258 plus pyronin-Y (79)] môže eliminovať niektoré umelo vzniknuté štruktúry spojené s používaním farbiva bez špecifickej väzby na DNA.
However, long term treatment (without S9) should have its own positive control, as the treatment duration will differ from the test using metabolic activation.
Ak je potrebné získať mechanistické informácie o tvorbe mikrojadier, možno na identifikáciu ich obsahu použiť protilátky proti kinetochorom, FISH s pancentromérovými sondami DNA alebo značenie in situ pomocou primerov špecifických pre pancentroméru spolu s vhodným DNA – kontrastným farbiacim roztokom (celé chromozómy sa zafarbia, zatiaľ čo acentrické fragmenty chromozómov sa nezafarbia) (16) (17).
If a clastogen is selected as the single positive control for short-term treatment with and without metabolic activation, an aneugen should be selected for the long-term treatment without metabolic activation.
Na odlíšenie klastogénov od aneugénov možno použiť aj iné metódy, pokiaľ sa preukázali ako účinné a boli validované.
Positive controls for both clastogenicity and aneugenicity should be used in metabolically competent cells that do not require S9.
Napríklad v prípade určitých bunkových línií by sa užitočné informácie mohli získať meraním jadier sub-2N ako hypodiploidných javov použitím takých techník, ako je analýza obrazu, laserová skenovacia cytometria alebo prietoková cytometria (80) (81) (82).
Each positive control should be used at one or more concentrations expected to give reproducible and detectable increases over background in order to demonstrate the sensitivity of the test system (i.e. the effects are clear but do not immediately reveal the identity of the coded slides to the reader), and the response should not be compromised by cytotoxicity exceeding the limits specified in this test method.
Morfologické pozorovanie jadier by takisto mohlo poskytnúť indikácie možnej aneuploidie.
Reference chemicals recommended for assessing laboratory proficiency and for the selection of positive controls
Okrem toho test chromozómových aberácií v metafáze vykonaný najlepšie na tom istom type buniek a podľa protokolu s porovnateľnou citlivosťou by mohol byť takisto užitočný na stanovenie toho, či sú mikrojadrá dôsledkom zlomov chromozómov (keďže je známe, že strata chromozómov by sa v teste na chromozómovú aberáciu nezistila).
Aneugens
Všetky preparáty vrátane preparátov z rozpúšťadiel na kontrolu a neovplyvnených (ak sa použijú) a pozitívnych kontrol by sa pred mikroskopickou analýzou frekvencií mikrojadier mali jednotlivo označiť kódom.
Colchicine
V prípade kultúr ovplyvnených cytoB by sa mali analyzovať frekvencie výskytu mikrojadier aspoň v prípade 2000 dvojjadrových buniek na každú koncentráciu a každú kontrolu (83), ktoré sa rovnomerne rozdelia medzi replikátmi, ak sa replikáty použijú.
Vinblastine
V prípade, že sa použije jedna kultúra na každú dávku (pozri bod 28), by sa malo vyhodnotiť aspoň 2000 dvojjadrových buniek na každú kultúru v rámci tejto jednej kultúry (83).
Treatment Schedule
Ak je na hodnotenie pri každej koncentrácii k dispozícii podstatne menej než 1000 dvojjadrových buniek z každej kultúry (v prípade duplicitných kultúr), alebo 2000 (v prípade jednej kultúry) a nezistí sa významný nárast výskytu mikrojadier, test by sa mal zopakovať s použitím väčšieho počtu buniek alebo pri menších cytotoxických koncentráciách, podľa toho, ktorá z týchto dvoch možností je vhodná.
In order to maximise the probability of detecting an aneugen or clastogen acting at a specific stage in the cell cycle, it is important that sufficient numbers of cells representing all of the various stages of their cell cycles are treated with the test chemical.
Je potrebné zabezpečiť, aby sa nehodnotili dvojjadrové bunky, ktoré majú nepravidelný tvar alebo ktorých jadrá sa veľkosťou výrazne odlišujú.
All treatments should commence and end while the cells are growing exponentially and the cells should continue to grow up to the time of sampling.
Okrem toho dvojjadrové bunky by sa nemali mylne zamieňať s nedostatočne rozšírenými viacjadrovými bunkami.
The treatment schedule for cell lines and primary cell cultures may, therefore, differ somewhat from that for lymphocytes which require mitogenic stimulation to begin their cell cycle (17).
Bunky obsahujúce viac než dve hlavné jadrá by sa nemali analyzovať na prítomnosť mikrojadier, keďže základná frekvencia mikrojadier môže byť v týchto bunkách vyššia (84).
For lymphocytes, the most efficient approach is to start the treatment with the test chemical at 44-48 hours after PHA stimulation, when cells will be dividing asynchronously (6).
Hodnotenie jednojadrových buniek je prijateľné vtedy, ak sa preukáže, že testovaná chemikália zasahuje do pôsobenia cytoB.
Published data (19) indicate that most aneugens and clastogens will be detected by a short term treatment period of 3 to 6 hours in the presence and absence of S9, followed by removal of the test chemical and sampling at a time equivalent to about 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths after the beginning of treatment (7).
V takých prípadoch by mohlo byť užitočné zopakovať test bez CytoB.
However, for thorough evaluation, which would be needed to conclude a negative outcome, all three following experimental conditions should be conducted using a short term treatment with and without metabolic activation and long term treatment without metabolic activation (see paragraphs 56, 57 and 58): Cells should be exposed to the test chemical without metabolic activation for 3-6 hours, and sampled at a time equivalent to about 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths after the beginning of treatment (19),
Hodnotenie jednojadrových buniek spolu s hodnotením dvojjadrových buniek by mohlo poskytnúť užitočné informácie (85) (86), nie je však povinné.
Cells should be exposed to the test chemical with metabolic activation for 3-6 hours, and sampled at a time equivalent to about 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths after the beginning of treatment (19),
V bunkových líniách bez ovplyvnenia pomocou cytoB by sa mali mikrojadrá hodnotiť aspoň v prípade 2000 buniek na koncentráciu a kontrolu (83), ktoré sa rovnomerne rozdelia medzi replikátmi, ak sa replikáty použijú.
Cells should be continuously exposed without metabolic activation until sampling at a time equivalent to about 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths.
V prípade, že sa použije jedna kultúra na koncentráciu (pozri bod 28), by sa malo vyhodnotiť aspoň 2000 buniek na každú kultúru v rámci tejto jednej kultúry.
If it is known or suspected that the test chemical affects the cell cycling time (e.g. when testing nucleoside analogues), especially for p53 competent cells (35) (36) (77), sampling or recovery times may be extended by up to a further 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths (i.e. total 3,0 to 4,0 cell cycle lengths after the beginning of short-term and long-term treatments).
Ak je na hodnotenie pri každej koncentrácii k dispozícii podstatne menej než 1000 buniek na kultúru (v prípade duplicitných kultúr), alebo 2000 (v prípade jednej kultúry) a ak sa nezistí výrazný nárast výskytu mikrojadier, test by sa mal zopakovať s použitím väčšieho počtu buniek alebo pri menších cytotoxických koncentráciách, podľa toho, ktorá z týchto dvoch možností je vhodná.
These options address situations where there may be concern regarding possible interactions between the test chemical and cytoB.
Pri použití cytoB by sa mala určiť hodnota CBPI alebo RI na posúdenie bunkovej proliferácie (pozri dodatok 2) s použitím aspoň 500 buniek na kultúru.
When using extended sampling times (i.e. total 3,0 to 4,0 cell cycle lengths culture time), care should be taken to ensure that the cells are still actively dividing.
Ak sa ovplyvňovanie vykonáva bez prítomnosti cytoB, je nevyhnutné preukázať, že bunky v kultúre sa rozdelili, ako sa vysvetľuje v bodoch 24 až 28.
For example, for lymphocytes exponential growth may be declining at 96 hours following stimulation and monolayer cultures of cells may become confluent.
Na to, aby sa pred vykonaním rutinného testu zistilo, či má laboratórium s danou skúškou dostatočné skúsenosti, malo by mať vykonanú sériu pokusov s referenčnými pozitívnymi chemikáliami pôsobiacimi prostredníctvom rôznych mechanizmov (aspoň jedna chemikália s metabolickou aktiváciou a jedna bez metabolickej aktivácie a jedna chemikália pôsobiaca prostredníctvom aneugénneho mechanizmu, pričom všetky sa vyberú zo zoznamu v tabuľke 1) a s rôznymi negatívnymi kontrolami (vrátane neovplyvnených kultúr a rôznych rozpúšťadiel/nosičov).
The suggested cell treatment schedules are summarised in Table 2.
Tento postup sa nepoužije v prípade laboratórií, ktoré majú skúsenosti, t. j. ktoré majú k dispozícii databázu historických údajov, ako sa definuje v bodoch 49 až 52.
These general treatment schedules may be modified (and should be justified) depending on the stability or reactivity of the test chemical or the particular growth characteristics of the cells being used.
Mal by sa preskúmať celý rad vybratých chemikálií na pozitívnu kontrolu (pozri tabuľku 1) s krátkym a dlhým ovplyvňovaním za neprítomnosti metabolickej aktivácie, ako aj s krátkym ovplyvňovaním za prítomnosti metabolickej aktivácie, aby sa preukázala spôsobilosť zistiť klastogénne a aneugénne chemikálie, stanoviť účinnosť systému metabolickej aktivácie a preukázať vhodnosť postupov hodnotenia (mikroskopická vizuálna analýza, prietoková cytometria, laserová skenovacia cytometria alebo analýza obrazu).
Cell treatment and harvest times for the MNvit test
Pri prvom získavaní údajov súvisiacich s distribúciou historických negatívnych kontrol by súbežné negatívne kontroly mali byť v súlade s uverejnenými negatívnymi kontrolnými údajmi, ak takéto údaje existujú.
Lymphocytes, primary cells and cell lines treated with cytoB
S pridávaním ďalších údajov z pokusov k distribúcii kontrol by súbežné negatívne kontroly mali byť v ideálnom prípade v rámci 95 % regulačných medzí tejto distribúcie (87) (88).
Treat for 3-6 hours in the presence of S9;
Laboratóriá by mali použiť metódy kontroly kvality, ako sú regulačné diagramy [napr. tzv. „C-charts“ alebo „X-bar charts“ (88)], s cieľom zistiť variabilitu svojich údajov o pozitívnych a negatívnych kontrolách a preukázať, že metodika je v laboratóriu „pod kontrolou“ (83).
remove the S9 and treatment medium;
Ďalšie odporúčania ako vytárať a využívať historické údaje (t. j. kritériá zaradenia údajov medzi historické údaje a ich vylúčenia z historických údajov a kritériá prijateľnosti v prípade daného pokusu) možno nájsť v literatúre (87).
add fresh medium and cytoB;
Všetky zmeny v experimentálnom protokole by sa mali posúdiť z hľadiska konzistentnosti údajov s databázami existujúcich historických kontrol v laboratóriu.
harvest 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths after the beginning of treatment.
Údaje o negatívnych kontrolách by mali zahŕňať výskyt buniek s mikrojadrami z jednej kultúry alebo zo súhrnu kultúr replikátov, ako sa opisuje v bode 28.
Treat for 3-6 hours;
Súbežné negatívne kontroly by v ideálnom prípade mali byť v rámci 95 % regulačných medzí distribúcie databázy historických negatívnych kontrol laboratória (87) (88).
remove the treatment medium;
V prípade, že údaje o súbežných negatívnych kontrolách nespadajú do 95 % regulačných medzí, môžu byť prijateľné na zaradenie do distribúcie historických kontrol, pokiaľ tieto údaje nie sú extrémne mimo uvedených medzí a pokiaľ existujú dôkazy o tom, že testovací systém je „pod kontrolou“ (pozri bod 50) a dôkazy o tom, že nedošlo k technickému alebo ľudskému zlyhaniu.
Extended treatment
Ak sa použije metóda blokovania cytokinézy, pri hodnotení indukcie mikrojadier sa používajú iba frekvencie dvojjadrových buniek s mikrojadrami (bez ohľadu na počet mikrojadier v bunke).
Treat for 1,5 - 2 normal cell cycle lengths in the presence of cytoB;
Hodnotenie počtu buniek s jedným mikrojadrom, s dvoma alebo viacerými mikrojadrami sa môže popisovať samostatne a mohlo by poskytnúť užitočné informácie, nie je však povinné.
harvest at the end of the treatment period.
Mali by sa stanoviť súbežné merania cytotoxicity a/alebo cytostázy pre všetky ovplyvnené kultúry a kultúry na negatívnu a pozitívnu kontrolu (16).
Cell lines treated without cytoB
Pri všetkých ovplyvnených kultúrach a kontrolných kultúrach by sa mali vypočítať hodnoty CBPI alebo RI ako merania oneskorenia bunkového cyklu pri použití metódy blokovania cytokinézy.
(Identical to the treatment schedules outlined above with the exception that no cytoB is added)
V prípade, že sa nepoužíva cytoB, mali by sa použiť hodnoty RDP alebo RICC (pozri dodatok 2).
For monolayer cultures, mitotic cells (identifiable as being round and detaching from the surface) may be present at the end of the 3-6 hour treatment.
súbežná negatívna kontrola sa považuje za prijateľnú na účely pridania do historickej databázy negatívnych kontrol laboratória, ako sa opisuje v bode 50,
If there is evidence for a substantial increase in the number of mitotic cells compared with controls, indicating likely mitotic arrest, then the cells should be collected by centrifugation and added back to the culture, to avoid losing cells that are in mitosis, and at risk for micronuclei/chromosome aberration, at the time of harvest.
súbežné pozitívne kontroly (pozri bod 50) by mali vyvolať reakcie, ktoré sú zlúčiteľné s reakciami uvedenými v historickej databáze pozitívnych kontrol laboratória a v porovnaní so súbežnou negatívnou kontrolou by mali viesť k štatisticky významnému nárastu,
Cell harvest and slide preparation
mali by byť splnené kritériá bunkovej proliferácie v kontrole rozpúšťadla (pozri body 25 – 27),
Each culture should be harvested and processed separately.
pokiaľ jedna podmienka pokusu neviedla k pozitívnym výsledkom, mali by sa otestovať všetky podmienky pokusu (pozri body 36 – 40),
Cell preparation may involve hypotonic treatment, but this step is not necessary if adequate cell spreading is otherwise achieved.
je analyzovateľný primeraný počet buniek a koncentrácií (body 28 a 44 – 46),
Different techniques can be used in slide preparation provided that high-quality cell preparations for scoring are obtained.
kritériá výberu najvyššej koncentrácie sú v súlade s kritériami opísanými v bodoch 24 – 31.
Cells with intact cell membrane and intact cytoplasm should be retained to allow the detection of micronuclei and (in the cytokinesis-block method) reliable identification of binucleate cells.
Za predpokladu, že sú splnené všetky kritériá prijateľnosti, sa testovaná chemikália pokladá za jasne pozitívnu, ak pri ktorejkoľvek z preskúmaných podmienok pokusu platí, že (pozri body 36 – 39):
The slides can be stained using various methods, such as Giemsa or fluorescent DNA specific dyes.
aspoň jedna z testovaných koncentrácií vykazuje štatisticky významné zvýšenie v porovnaní so súbežnou negatívnou kontrolou (89),
The use of appropriate fluorescent stains (e.g. acridine orange (78) or Hoechst 33258 plus pyronin-Y (79)) can eliminate some of the artifacts associated with using a non-DNA specific stain.
pri hodnotení pomocou vhodného testu trendu je tento nárast aspoň pri jednej testovacej podmienke závislý od dávky (pozri bod 28),
Anti-kinetochore antibodies, FISH with pancentromeric DNA probes, or primed in situ labelling with pancentromere-specific primers, together with appropriate DNA counterstaining, can be used to identify the contents (whole chromosomes will be stained while acentric chromosome fragments will not) of micronuclei if mechanistic information of their formation is of interest (16) (17).
ktorýkoľvek z výsledkov je mimo distribúcie historických údajov negatívnych kontrol (napr. 95 % regulačné medze podľa Poissonovho rozdelenia, pozri bod 52).
Other methods for differentiation between clastogens and aneugens may be used if they have been shown to be effective and validated.
Ak sú splnené všetky tieto kritériá, testovaná chemikália sa pokladá za chemikáliu schopnú vyvolať chromozómové zlomy a/alebo zvýšenie či zníženie ich počtu v tomto testovacom systéme.
For example, for certain cell lines the measurements of sub-2N nuclei as hypodiploid events using techniques such as image analysis, laser scanning cytometry or flow cytometry could also provide useful information (80) (81) (82).
Odporúčania týkajúce sa najvhodnejších štatistických metód možno takisto nájsť aj v literatúre (90) (91) (92).
Morphological observations of nuclei could also give indications of possible aneuploidy.
Za predpokladu, že sú splnené všetky kritériá prijateľnosti, sa testovaná chemikália pokladá za jasne negatívnu, ak pri všetkých preskúmaných podmienkach pokusu platí, že (pozri body 36 – 39):
Moreover, a test for metaphase chromosome aberrations, preferably in the same cell type and protocol with comparable sensitivity, could also be a useful way to determine whether micronuclei are due to chromosome breakage (knowing that chromosome loss would not be detected in the chromosome aberration test).
všetky výsledky sú v rámci rozdelenia historických údajov negatívnych kontrol (napr. 95 % regulačné medze podľa Poissonovho rozdelenia, pozri bod 52).
All slides, including those of the solvent and the untreated (if used) and positive controls, should be independently coded before the microscopic analysis of micronucleus frequencies.
Testovaná chemikália sa pokladá za chemikáliu neschopnú vyvolať chromozómové zlomy a/alebo zvýšenie či zníženie ich počtu v tomto testovacom systéme.
Appropriate techniques should be used to control any bias or drift when using an automated scoring system, for instance, flow cytometry, laser scanning cytometry or image analysis.
Neexistuje požiadavka na potvrdenie jasnej pozitívnej alebo negatívnej reakcie.
Regardless of the automated platform is used to enumerate micronuclei, CBPI, RI, RPD, or RICC should be assessed concurrently.
V prípade, že reakcia nie je jasne negatívna ani jasne pozitívna, ako sa opisuje vyššie v texte, a/alebo s cieľom pomôcť pri stanovení biologickej relevantnosti výsledku by sa údaje mali vyhodnotiť na základe odborného posúdenia a/alebo ďalšieho skúmania.
In cytoB-treated cultures, micronucleus frequencies should be analysed in at least 2000 binucleate cells per concentration and control (83), equally divided among the replicates, if replicates are used.
Užitočné by mohlo byť hodnotenie dodatočných buniek (v prípade potreby) alebo zopakovanie pokusu prípadne s použitím pozmenených podmienok pokusu [napr. odstup koncentrácií, iné podmienky metabolickej aktivácie (t. j. koncentrácia S9 alebo pôvod S9)].
In the case of single cultures per dose (see paragraph 28), at least 2000 binucleate cells per culture (83) should be scored in this single culture.
V zriedkavých prípadoch neumožní súbor údajov ani po ďalšom skúmaní vyvodiť záver o pozitívnom alebo negatívnom výsledku, a preto sa pokus uzavrie ako pokus „s nejasným výsledkom“.
If substantially fewer than 1000 binucleate cells per culture (for duplicate cultures), or 2000 (for single culture), are available for scoring at each concentration, and if a significant increase in micronuclei is not detected, the test should be repeated using more cells, or at less cytotoxic concentrations, whichever is appropriate.
Testované chemikálie, ktoré v teste MNvit indukujú mikrojadrá, môžu mať tento účinok preto, že indukujú chromozómový zlom, ich stratu alebo kombináciu oboch javov.