natgillin/translations-raw huggingface dataset:
In practice, each laboratory is encouraged to build its own historical control data for males and females and to perform a positive control chemical for estrogenic activity (e.g. 17β-estradiol at 100 ng/l, or a known weak agonist) resulting in increased VTG in male fish, a positive control chemical for aromatase inhibition (e.g. fadrozole or prochloraz at 300 μg/l) resulting in decreased VTG in female fish, and a positive control chemical for androgenic activity (e.g. 17β-trenbolone at 5 μg/l) resulting in induction of secondary sex characteristics in female fathead minnow and medaka.
Meranie
All these data can be compared to available data from the validation studies (1, 2, 3) to ensure laboratory proficiency.
Po fixovaní tela ryby v 10 % neutrálnom tlmenom formalíne najmenej počas 24 hodín sa telo ryby vyberie z kónickej skúmavky a formalín sa otrie filtračným papierom (alebo papierovou utierkou).
In general, VTG measurements should be considered positive if there is a statistically significant increase in VTG in males (p < 0,05), or a statistically significant decrease in females (p < 0,05) at least at the highest dose tested compared to the control group, and in the absence of signs of general toxicity.
Ryba sa položí brušnou stranou nahor.
A positive result is further supported by the demonstration of a biologically plausible relationship between the dose and the response curve.
Potom sa malými pitevnými nožnicami opatrne odreže análna plutva (odporúča sa odrezať análnu plutvu aj s malou časťou opornej kosti pterygiophore).
As mentioned earlier, the VTG decrease may not entirely be of endocrine origin; however a positive result should generally be interpreted as evidence of endocrine activity in vivo, and should normally initiate actions for further clarification.
Oddelená análna plutva sa pinzetou uchopí za prednú časť a položí sa na podložné sklíčko s niekoľkými kvapkami vody.
Gonadal histopathology evaluation may be required by regulatory authorities to determine the reproductive fitness of the test animals and to allow a weight of evidence assessment of the test results.
Potom sa plutva zakryje krycím sklíčkom.
Performance of gonadal histopathology may not be necessary in cases where either, VTG or secondary sex characteristics is positive (i.e. VTG increase or decrease, or induction of secondary sex characteristics).
Pri uchopení análnej plutvy pinzetou treba dávať pozor, aby sa papilárne výbežky nepoškodili.
OECD (2006b).
Počet spojených platničiek s papilárnymi výbežkami sa určí prostredníctvom počítacej komôrky pod biologickým mikroskopom (stojanovým alebo inverzným).
OECD (2007).
Papilárne výbežky sa vykazujú, keď je na zadnom okraji spojenej platničky viditeľné malé zoskupenie výbežkov.
Owens JW (2007).
Do pracovného hárku sa zapíše počet spojených platničiek s papilárnymi výbežkami na každom lúči plutvy (napr. prvý lúč plutvy: 0, druhý lúč plutvy: 10, tretí lúč plutvy: 12 atď.) a súčet týchto počtov sa uvedie do tabuľky programu Excel podľa jednotlivých rýb.
US EPA (2007).
V prípade potreby sa urobí fotografia análnej plutvy a počet spojených platničiek s papilárnymi výbežkami sa určí z tejto fotografie.
OECD (2008).
Po uskutočnení merania sa análna plutva vloží do kónickej skúmavky opísanej v bode 1 a odloží sa.
Sumpter J.P. and S. Jobling (1995).
Obr. 1.
Pawlowski S., et al.
Obrázok znázorňujúci rozdiely medzi pohlaviami, pokiaľ ide o tvar a veľkosť análnej plutvy.
Andersen L., et al (2006).
A, samec; B, samica.
Ankley G.T., et al.
Obr. 2.
Panter G.H., et al.
A: Výbežky na spojených platničkách lúča análnej plutvy.
Parks L.G., et al.
J.P.: spojená platnička; A.S.: axiálny priestor; P.: výbežok.
Part C Pharmacology, toxicology and endocrinology; 123(2):113-25.
B: Distálny koniec lúča plutvy.
Application of an ELISA to quantify vitellogenin concentrations in fathead minnows (Pimephales promelas) exposed to endocrine disrupting chemicals.
Na úplnom konci lúča plutvy sú actinotrichia (Act.).
CEFIC-EMSG research report reference AQ001.
Obr. 3.
CEFIC, Brussels, Belgium.
Fotografia tela ryby, ktorá znázorňuje miesto rezu v prípade, keď sa gonáda fixuje v inom fixačnom roztoku ako 10 % neutrálnom tlmenom formalíne.
Fenske M., et al.
V takom prípade sa telo rozreže žiletkou medzi prednou časťou análnej plutvy a análnym otvorom (červená čiara), hlavová strana tela ryby sa vloží do fixačného roztoku na konzervovanie gonád a chvostová strana tela ryby sa vloží do 10 % neutrálneho tlmeného formalínu.
Development and validation of a homologous zebrafish (Danio rerio Hamilton- Buchanan) vitellogenin enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and its application for studies on estrogenic chemicals.
Papilárne výbežky sa spravidla vyskytujú len u dospelých samcov a nachádzajú sa na lúčoch análnej plutvy od druhého po siedmy alebo ôsmy, počítajúc od zadného konca análnej plutvy (obrázok 1 a 2).
Comp.
Výbežky sa však len zriedka vyskytujú na prvom lúči od zadného konca análnej plutvy.
Biochem.
Tento štandardný operačný postup sa vzťahuje na meranie výbežkov na prvom lúči plutvy (poradové číslo lúča análnej plutvy sa v rámci tohto štandardného operačného postupu vzťahuje na poradie od zadného konca análnej plutvy).
Phys.
ODPORÚČANÉ POSTUPY ODBERU VZORIEK NA ANALÝZU VITELOGENÍNU
C 129 (3): 217-232.
Malo by sa dbať na to, aby sa zabránilo krížovej kontaminácii medzi vzorkami VTG samcov a samíc.
Holbech H., et al.
Postup 1A:
Development of an ELISA for vitellogenin in whole body homogenate of zebrafish (Danio rerio).
Čerebľa potočná, odber krvi z chvostovej žily/tepny
Comparative Biochemistry and Physiology.
Po anestetizovaní sa chvostový pedunkulus čiastočne oddelí čepeľou skalpela a krv z chvostovej tepny/žily sa odoberie heparinizovanou mikrohematokritovou kapilárou.
Part C Pharmacology, toxicology and endocrinology; 130: 119-131 (16) Rose J., et al.
Po odobratí krvi sa rýchlo izoluje plazma odstreďovaním počas 3 minút pri 15000 g (alebo alternatívne počas 10 minút pri 15000 g a teplote 4 °C).
Vitellogenin induction by 17β-estradiol and 17α-ethinylestradiol in male zebrafish (Danio rerio).
V prípade potreby možno po odstredení stanoviť percentuálnu hodnotu hematokritu.
C 131: 531-539.
Plazma sa odoberie z mikrohematokritovej kapiláry, vloží sa do skúmavky na odstreďovanie spolu s 0,13 jednotky aprotinínu (inhibítor proteázy) a uchová sa pri teplote – 80 °C, kým nebude možné stanoviť VTG.
Brion F., et al.
V závislosti od veľkosti čereble potočnej (závisí od pohlavia) sa objem plazmy, ktorú možno odobrať, vo všeobecnosti pohybuje v rozsahu 5 – 60 μl na jednu rybu (Jensen et al. 2001).
Development and validation of an enzyme-linked immunosorbent assay to measure vitellogenin in the zebrafish (Danio rerio).
Postup 1B:
Environmental Toxicology and Chemistry; vol 21: 1699-1708.
Čerebľa potočná, odber krvi zo srdca
Yokota H., et al.
Alternatívne možno krv odobrať srdcovou punkciou heparinizovanou striekačkou (1000 jednotiek heparínu na ml).
Development of an ELISA for determination of the hepatic vitellogenin in Medaka (Oryzias latipes).
Krv sa preloží do skúmaviek Eppendorf (uložených na ľade) a potom sa odstredí (5 minút pri 7000 g a izbovej teplote).
Jpn J Environ Toxicol 4:87–98.
Plazma by sa mala preložiť do čistých skúmaviek Eppendorf (v alikvotných množstvách, ak to objem plazmy umožňuje) a rýchlo zmraziť pri – 80 °C, kým sa nevykoná analýza (Panter et al., 1998).
(19) Tatarazako N., et al.
Postup 2 A:
Journal of Health Science 50:301-308.
Ryžovníčka japonská, vyrezanie pečene
Effects of the androgenic growth promoter 17-beta-trenbolone on fecundity and reproductive endocrinology of the fathead minnow.
Vybratie testovanej ryby zo skúšobnej komory
Environmental Toxicology and Chemistry; 22(6): 1350-60.
Testovaná ryba by sa mala vybrať zo skúšobnej komory malým podberákom.
Seki M, et al (2004).
Treba dávať pozor, aby testovaná ryba nespadla do inej skúšobnej komory.
Fish full life-cycle testing for androgen methyltestosterone on medaka (Oryzias latipes).
Testované ryby by sa zo skupín mali v zásade vyberať v tomto poradí: kontrolná skupina, kontrolná skupina s rozpúšťadlom (ak je to vhodné), skupina s najnižšou koncentráciou, skupina so strednou koncentráciou, skupina s najvyššou koncentráciou a pozitívna kontrolná skupina.
OECD (2010).
Okrem toho by sa mali z jednej skúšobnej komory najskôr vybrať všetci samci, až potom zostávajúce samice.
Guidance Document on Fish Gonadal Histopathology.
Pohlavie každej testovanej ryby sa určí na základe vonkajších sekundárnych pohlavných znakov (napr. tvaru análnej plutvy).
OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 123, Paris.
Testovaná ryba sa vloží do prepravného kontajnera a premiestni sa na pracovisko určené na vyrezanie pečene.
OECD (2000) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures.
Treba skontrolovať správnosť údajov na štítkoch na skúšobnej komore a prepravnom kontajneri, aby sa potvrdilo, že počet rýb, ktoré sa vybrali zo skúšobnej komory, a počet rýb, ktoré v skúšobnej komore zostali, je v súlade s očakávaním.
Paris
Ak pohlavie rýb nemožno určiť na základe ich vonkajšieho vzhľadu, vyberú sa všetky ryby zo skúšobnej komory.
Hutchinson T.H., et al.
V tom prípade by sa pohlavie malo určiť na základe pozorovania gonád alebo sekundárnych pohlavných znakov stereoskopickým mikroskopom.
Aquatic Toxicology, 76; pp.69–92.
Vyrezanie pečene
(2006b).
Testovaná ryba sa preloží z prepravného kontajnera do anestetického roztoku malým podberákom.
Screening and testing for endocrine disruption in fish-biomarkers as “signposts”, not “traffic lights,” in risk assessment.
Po anestetizovaní sa testovaná ryba pinzetou (spotrebného druhu) uloží na filtračný papier (alebo na papierovú utierku).
Environmental Health Perspectives; 114 Suppl 1:106-14.
Rybu treba uchopiť pinzetou za boky hlavy, aby sa zabránilo zlomeniu chvosta.
Miles-Richardson S.R., et al.
Voda z povrchu testovanej ryby sa utrie filtračným papierom (alebo papierovou utierkou).
Effects of waterborne exposure to 17β-estradiol on secondary sex characteristics and gonads of the fathead minnow (Pimephales promelas).
Potom sa pitevnými nožnicami urobí malý priečny zárez medzi časťou brucha v blízkosti hlavy a strednou časťou brucha.
Aquat.
Pitevné nožnice sa vložia do malého rezu a brucho sa rozstrihne pozdĺž stredovej línie od zadného bodu žiabrového krytu po kraniálnu stranu análneho otvoru.
Toxicol.
Treba dávať pozor, aby sa pitevné nožnice nevložili príliš hlboko a nedošlo k poškodeniu pečene a gonád.
47, 129-145.
Ďalšie operácie sa vykonávajú pod stereoskopickým mikroskopom.
Martinovic D., et al.
Testovaná ryba sa položí brušnou stranou nahor na papierovú utierku (použiť možno aj sklenenú Petriho misku alebo podložné sklíčko).
Characterization of reproductive toxicity of vinclozolin in the fathead minnow and co-treatment with an androgen to confirm an anti-androgenic mode of action.
Presnou pinzetou sa rozšíria steny brušnej dutiny a vyberú sa vnútorné orgány.
Environ.
Je takisto prípustné, aby sa v prípade potreby vnútorné orgány vybrali po odstránení jednej bočnej steny brušnej dutiny.
Toxicol.
Ďalšou presnou pinzetou sa odhalí spojená časť pečene a žlčníka.
Chem.
Potom sa uchopí žlčovod a žlčník sa odreže.
27, 478-488.
Treba dávať pozor, aby sa žlčník nepoškodil.
OECD (2006c), Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application, OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.54, OECD, Paris.
Uchopí sa pažerák a rovnako sa od pečene oddelí tráviaci trakt.
(29) US EPA (2008), Peer-Review Results for the Fish Short-Term Reproduction Assay, dated 30 January 2008, US Environmental Protection Agency, Washington DC.
Treba dávať pozor, aby nedošlo k úniku obsahu tráviaceho traktu.
OECD (2012), OECD Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupters, OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 150, OECD, Paris.
Kaudálny tráviaci trakt sa oddelí od análneho otvoru a odstráni z brušnej dutiny.
ABBREVIATIONS & DEFINITIONS:
Z okrajových častí pečene sa odreže tuková hmota a iné tkanivá.
a substance or a mixture
Treba dávať pozor, aby nedošlo k poškrabaniu pečene.
coefficient of variation
Pečeň sa uchopí presnou pinzetou za oblasť brány a vyberie sa z brušnej dutiny.
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
Pečeň sa uloží na podložné sklíčko.
HPG axis
V prípade potreby sa presnou pinzetou odstráni z povrchu pečene akýkoľvek ďalší tuk a cudzie tkanivo (napr. výstelka brucha).
hypothalamic-pituitary-gonadal axis
Hmotnosť pečene sa meria elektronickými analytickými váhami spolu s 1,5 ml mikroskúmavkou predstavujúcou taru.
Loading rate
Hodnota sa zaznamená do pracovného hárku (odčítava sa na 0,1 mg).
the wet weight of fish per volume of water.
Identifikačné údaje na štítku mikroskúmavky sa potvrdia.
MTC
Po vyrezaní jednej pečene treba pitevné nástroje vyčistiť, alebo ich nahradiť čistými.
Maximum Tolerated Concentration, representing about 10 % of the LC50
Uvedeným postupom sa pečeň odoberie zo všetkých rýb v prepravnom kontajneri.
Stocking density
Po vyrezaní pečene zo všetkých rýb v prepravnom kontajneri (t. j. všetkých samcov alebo samíc v skúšobnej komore) sa všetky vzorky pečene uložia do stojanu na skúmavky s identifikačným štítkom a vložia sa do mrazničky.
is the number of fish per volume of water.
Ak sa pečeň dáva na predbežnú úpravu krátko po vyrezaní, vzorky sa na ďalšie pracovisko prenášajú v chladiacom (alebo mraziacom) boxe.
vitellogenin is a phospholipoglycoprotein precursor to egg yolk protein that normally occurs in sexually active females of all oviparous species.
Po vyrezaní pečene je telo ryby k dispozícii na histológiu gonád a meranie sekundárnych pohlavných znakov.
EXPERIMENTAL CONDITIONS FOR THE FISH ENDOCRINE SCREENING ASSAY
Vzorka
(Pimephales promelas)
Ak sa vzorky pečene nepoužijú na predbežnú úpravu krátko po vyrezaní z testovanej ryby, musia sa skladovať pri teplote ≤ – 70 °C.
Medaka (Oryzias latipes)
Nožnicami sa urobí rez tesne pred prsnými plutvami.
Test type
Stredová línia brucha sa nožnicami rozstrihne k bodu približne 2 mm od kraniálnej strany análneho otvoru.
Flow-through
Pomocou pinzety sa rozšíria steny brušnej dutiny a odhalí sa pečeň a ďalšie vnútorné orgány.
Water temperature
(Alternatívne možno steny brušnej dutiny zboku pripevniť).
Illumination quality
Šípka ukazuje na pečeň.
Fluorescent bulbs (wide spectrum)
Pečeň sa priamo vyreže a pinzetou vyberie.
Light intensity
Obrázok 5
10-20 μE/m2/s, 540-1000 lux, or 50-100 ft-c (ambient laboratory levels)
Pinzetou sa črevá jemne odtiahnu.
Photoperiod (dawn / dusk transitions are optional, however not considered necessary) 16 h light, 8 h dark
Obrázok 6
12-16 h light, 12-8 h dark
Obidva konce čriev a akékoľvek mezenteriálne pripojenia sa nožnicami oddelia.
< 5 g per l
Obrázok 7 (samica)
Test chamber size
Postup je v prípade samíc rovnaký.
10 l (minimum)
Obrázok 8
2 l (minimum)
Ukončený postup.
5 l (minimum)
Postup 2 B:
Test solution volume
Ryžovníčka japonská (Oryzias latipes), predbežná úprava pečene na analýzu vitelogenínu
8 l (minimum)
Zo súpravy ELISA sa vyberie fľaša tlmivého roztoku homogenátu a ochladí sa drveným ľadom (teplota roztoku: ≤ 4 °C).
1,5 l (minimum)
Ak sa použije tlmivý roztok homogenátu zo systému EnBio ELISA, nechá sa rozmraziť pri izbovej teplote a potom sa fľaša ochladí drveným ľadom.
4 l (minimum)
Vypočíta sa objem tlmivého roztoku homogenátu pre pečeň na základe jej hmotnosti (pridá sa 50 μl tlmivého roztoku homogenátu na 1 mg hmotnosti pečene).
Volume exchanges of test solutions
Napríklad ak je hmotnosť pečene 4,5 mg, objem tlmivého roztoku homogenátu pre pečeň je 225 μl.
Minimum of 6 daily
Spíše sa zoznam objemov tlmivého roztoku homogenátu pre všetky pečene.
Minimum of 5 daily
Príprava pečene na predbežnú úpravu
Age of test organisms
1,5 ml mikroskúmavka s pečeňou sa z mrazničky vyberie tesne pred predbežnou úpravou.
See paragraph 21
Predbežná úprava pečene samcov by mala predchádzať predbežnej úprave pečene samíc, aby sa zabránilo kontaminácii vitelogenínom.
Approximate wet weight of adult fish (g)
Okrem toho by sa predbežná úprava skupín mala vykonávať v tomto poradí: kontrolná skupina, kontrolná skupina s rozpúšťadlom (ak je to vhodné), skupina s najnižšou koncentráciou, skupina so strednou koncentráciou, skupina s najvyššou koncentráciou a pozitívna kontrolná skupina.
Females: 1,5 ± 20 %
Počet 1,5 ml mikroskúmaviek so vzorkami pečene, ktoré sa v danom čase z mrazničky vyberú, by nemal prekročiť počet, ktorý možno v danom čase odstreďovať.
Males: 2,5 ± 20 %
1,5 ml mikroskúmavky so vzorkami pečene sa uložia do mraziaceho boxu v poradí podľa čísel vzoriek (pečeň netreba rozmrazovať).
Females: 0,35 ± 20 %
Postup predbežnej úpravy
Males: 0,35 ± 20 %
Pridanie tlmivého roztoku homogenátu
Females: 0,65 ± 20 %
Podľa zoznamu sa zistí objem tlmivého roztoku homogenátu, ktorý sa má použiť pre konkrétnu vzorku pečene, a mikropipeta sa nastaví na príslušný objem (rozsah objemu: 100 – 1000 μl).
Males: 0,4 ± 20 %
Na mikropipetu sa nasadí čistá špička.
No. of fish per test vessel
Tlmivý roztok homogenátu sa odoberie z reakčnej banky a pridá sa do 1,5 ml mikroskúmavky s pečeňou.
6 (2 males and 4 females)
Uvedeným postupom sa tlmivý roztok homogenátu pridá do všetkých 1,5 ml mikroskúmaviek s pečeňou.
6 (3 males and 3 females)
Špičku mikropipety netreba meniť za novú.
10 (5 males and 5 females)
Ak je však špička kontaminovaná, alebo by mohla byť kontaminovaná, mala by sa vymeniť.
No. of treatments
Homogenizácia pečene
= 3 (plus appropriate controls)
Na homogenizátor na mikroskúmavky sa nasadí nový piest na homogenizáciu.
No. vessels per treatment
Piest sa vloží do 1,5 ml mikroskúmavky.
4 minimum
Homogenizátor mikroskúmaviek sa drží tak, aby bola pečeň pritlačená medzi povrch piestu a vnútornú stenu 1,5 ml mikroskúmavky.
2 minimum
Homogenizátor sa uvedie do prevádzky na 10 – 20 sekúnd.
No. of fish per test concentration
Počas prevádzky sa 1,5 ml mikroskúmavka chladí drveným ľadom.
16 adult females and 8 males (4 females and 2 males in each replicate vessel)
Piest sa vytiahne z 1,5 ml mikroskúmavky a nechá sa v pokoji približne 10 sekúnd.
12 adult females and 12 males (3 females and 3 males in each replicate vessel)
Potom sa vykoná vizuálna kontrola stavu suspenzie.
10 adult females and 10 males (5 females and 5 males in each replicate vessel)
Ak sa v suspenzii vidno kúsky pečene, operácie 3 a 4 sa zopakujú, tak, aby sa pripravil uspokojivý homogenát pečene.
Feeding regime
Suspendovaný homogenát pečene sa chladí v mraziacom boxe až do odstredenia.
Live or frozen adult or nauplii brine shrimp two or three times daily (ad libitum), commercially available food or a combination of the above
Pre každý homogenát sa piest vymení za nový.
Brine shrimp nauplii two or three times daily (ad libitum), commercially available food or a combination of the above
Uvedeným postupom sa všetky pečene zhomogenizujú s homogenizačným tlmivým roztokom.
Brine shrimp nauplii two or three times daily (ad libitum),commercially available food or a combination of the above
Odstreďovanie suspendovaného homogenátu pečene
None unless DO concentration falls below 60 % air saturation
Treba overiť, či je teplota v chladenej komore centrifúgy ≤ 5 °C.
Dilution water
Do chladenej centrifúgy sa vložia 1,5 ml mikroskúmavky so suspendovaným homogenátom pečene (v prípade potreby sa upraví rovnováha).
Clean surface, well or reconstituted water or dechlorinated tap water
Suspendovaný homogenát pečene sa odstreďuje 10 minút pri 13000 g a teplote ≤ 5 °C.
Pre- exposure period
Ak sú však supernatanty dostatočne oddelené, možno odstredivú silu a čas odstreďovania upraviť podľa potreby.
7-14 days recommended
Po odstredení sa skontroluje, či sú supernatanty primerane oddelené (povrchová vrstva: tuk, stredná vrstva: supernatant, spodná vrstva: tkanivo pečene).
Chemical exposure duration
Ak oddelenie nie je primerané, suspenzia sa opäť odstredí za tých istých podmienok.
Biological endpoints
Všetky vzorky sa vyberú z chladenej centrifúgy a uložia sa v poradí podľa čísel vzoriek v mraziacom boxe.
survival
Treba dať pozor, aby vrstvy oddelené po odstreďovaní znovu neprešli do suspenzie.
behaviour
Odber supernatantu
fecundity
Do stojana na skúmavky sa vložia štyri 0,5 ml mikroskúmavky na uloženie supernatantu.
sex characteristics
Z každého supernatantu (oddeleného ako stredná vrstva) sa mikropipetou odoberie 30 μl a prenesie sa do jednej 0,5 ml mikroskúmavky.
optionally gonadal histopathology
Treba dať pozor na to, aby sa neodobral tuk z povrchovej vrstvy alebo tkanivo pečene zo spodnej vrstvy.
Test acceptability
Supernatant sa odoberie a rozdelí do dvoch ďalších 0,5 ml mikroskúmaviek rovnako, ako už bolo uvedené.
Dissolved oxygen ≥ 60 % of saturation; mean temperature of 25 ± 2 °C; 90 % survival of fish in the controls; measured test concentrations within 20 % of mean measured values per treatment level.
Zvyšok supernatantu sa odoberie mikropipetou (ak je to možné: ≥ 100 μl).
Dissolved oxygen ≥ 60 % of saturation; mean temperature of 26 ± 2 °C; 90 % survival of fish in the controls; measured test concentrations within 20 % of mean measured values per treatment level.
Prenesie sa do poslednej 0,5 ml mikroskúmavky.
SOME CHEMICAL CHARACTERISTICS OF ACCEPTABLE DILUTION WATER
0,5 ml mikroskúmavka sa uzavrie a na štítok sa napíše objem supernatantu.
COMPONENT
Bezprostredne potom sa mikroskúmavky ochladia v mraziacom boxe.
CONCENTRATIONS
Špička mikropipety sa vymení za novú pre každý supernatant.
< 20 mg/l
Ak na špičku prilne veľké množstvo tuku, treba ju ihneď vymeniť za novú, aby sa zabránilo kontaminácii pečeňového extraktu tukom.
< 2 mg/l
Všetky odstredené supernatanty sa uvedeným postupom prenesú do štyroch 0,5 ml mikroskúmaviek.
Unionised ammonia
Po prenesení supernatantu do 0,5 ml mikroskúmaviek sa tieto uložia do stojana s identifikačným štítkom a potom sa okamžite zmrazia v mrazničke.
< 1 μg/l
Ak sa koncentrácie VTG merajú ihneď po predbežnej úprave, jedna 0,5 ml mikroskúmavka (s 30 μl supernatantu) sa vloží do chladeného stojanu na skúmavky a potom sa premiestni na pracovisko, kde sa vykonáva test ELISA.
< 10 μg/l
V takom prípade sa zostávajúce mikroskúmavky uložia do stojanov a zmrazia v mrazničke.
Total organophosphorus pesticides
Po odbere supernatantu sa zvyšok primerane zlikviduje.
< 50 ng/l
Uskladnenie vzoriek
< 25 ng/l
0,5 ml mikroskúmavky so supernatantom homogenátu pečene sa udržiavajú pri teplote ≤ – 70 °C, až kým sa nepoužijú na test ELISA.
Appendix 4A
Postup 3 A:
SPAWNING SUBSTRATE FOR ZEBRAFISH
Danio pruhované, odber krvi z chvostovej žily/tepny
Spawning tray
Bezprostredne po anestéze sa chvostový pedunkulus priečne nareže a heparinizovanou mikrohematokritovou kapilárou sa odoberie krv z chvostovej tepny/žily.
all glass instrument dish, for example 22 × 15 × 5,5 cm (l × w × d), covered with a removable stainless steel wire lattice (mesh width 2mm).
Objem krvi sa pohybuje v rozsahu od 5 do 15 mikrolitrov v závislosti od veľkosti rýb.
The lattice should cover the opening of the instrument dish at a level below the brim.
Do mikrokapiláry sa pridá rovnaký objem tlmivého roztoku aprotinínu (6 mikrogramov/ml vo fosfátovom tlmivom fyziologickom roztoku) a z krvi sa odstreďovaním oddelí plazma (5 minút pri 600 g).
On the lattice, spawning substrate should be fixed.
Plazma sa odoberie do testovacích skúmaviek a udržiava sa pri teplote –20 °C, až kým sa nezačne analyzovať na prítomnosť VTG alebo iných skúmaných proteínov.
It should provide structure for the fish to move into.
Postup 3 B:
For example, artificial aquaria plants made of green plastic material are suitable (NB: possible adsorption of the test chemical to the plastic material should be considered).
Danio pruhované, odber krvi srdcovou punkciou
The plastic material should be leached out in sufficient volume of warm water for sufficient time to ensure that no chemicals may be disposed to the test water.
S cieľom zabrániť zrážaniu krvi a degradácii proteínov sa vzorky odoberajú do fosfátového tlmivého fyziologického roztoku (PBS) obsahujúceho heparín (1000 jednotiek/ml) a inhibítor proteázy aprotinín (2 TIU/ml).