natgillin/translations-raw huggingface dataset:
This solution should be boiled using an microwave (ca.
Referenčnú látku otestujte vo zvyčajnej počiatočnej koncentrácii zodpovedajúcej 20 mg DOC/l.
2-3 min)
Ak sa používajú zásobné roztoky testovanej a/alebo referenčnej látky, zabezpečte, aby sa výrazne nezmenila slanosť média morskej vody.
Transfer the hot solution into a special casting box, which lies on ice
Ak možno očakávať alebo nemožno vylúčiť toxické účinky, môže byť vhodné zahrnúť do koncepcie testu inhibičný pokus v duplikáte.
After ca.
Pridajte testovanú a referenčnú látku do rovnakej nádoby, pričom koncentrácia referenčnej látky je zvyčajne rovnaká ako v kontrolnom teste (t. j.
20 min the agarose gel is ready to use
20 mg DOC/l), aby sa umožnilo porovnanie.
Storage the agarose gel in 1 × TAE-buffer until the end of the PCR-programmes
(Ak sa používa analýza DOC, vatové uzávery sú nevhodné.)
Actin-PCR-programme:
Vložte nádoby do trepačky a počas celého testu nepretržite pretrepávajte pri miernej rýchlosti (napr. 100 ot./min.).
Special primer:
Zabezpečte, aby vzduch neobsahoval toxické materiály.
“Mact1(upper/forward)” → TTC AAC AGC CCT GCC ATG TA
Fyzikálno-chemický kontrolný test (voliteľný)
“Mact2(lower/reverse)” → GCA GCT CAT AGC TCT TCT CCA GGG AG
Ak existuje podozrenie na abiotickú degradáciu alebo mechanizmy straty, ako je hydrolýza (problém len v prípade špecifickej analýzy), prchanie alebo adsorpcia, odporúča sa vykonať fyzikálno-chemický kontrolný pokus.
Programme:
Možno ho vykonať pridaním chloridu ortutnatého (HgCl2) [10] (50 – 100 mg/l) do nádob s testovanou látkou, aby sa zastavila mikrobiálna činnosť.
Cycle (35-times):
Významný pokles hodnoty DOC alebo koncentrácie konkrétnej látky vo fyzikálno-chemickom kontrolnom teste nasvedčuje existencii mechanizmov abiotickej eliminácie.
Denaturation
(Ak sa použije chlorid ortutnatý, pozornosť v analýze DOC by sa mala venovať interferenciám alebo otrave katalyzátorom).
→ 45 sec at 95 °C
Počet baniek
Annealing
V typickom teste sa použijú tieto banky:
Elongation
banky 3 a 4 obsahujúce len morskú vodu (slepé),
→ 1 min at 68 °C
banka 5 obsahujúca referenčnú látku (kontrola postupu),
15 min 68 °C
banka 6 obsahujúca testovanú a referenčnú látku (kontrola toxicity) – voliteľná,
X- and Y-Gene-PCR-programme:
banka 7 obsahujúca testovanú látku a sterilizačné činidlo (abiotická sterilná kontrola) – voliteľná.
The samples with intact DNA will be used in this PCR-programme to detect the X- and Y-Genes.
Analýza DOC
Male DNA should show one double-band and female DNA should show one single band (after staining and gel-electrophoresis).
V priebehu testu odoberajte vo vhodných intervaloch vzorky na analýzu DOC (dodatok 1).
For this programme-run one positive control for males (XY-sample) and one for females (XX-sample) should be included.
Vždy odoberte vzorky na začiatku testu (0. deň) a v 60. deň.
“PG 17,5” (upper/forward) → CCG GGT GCC CAA GTG CTC CCG CTG
Na opis priebehu degradácie v čase je potrebných celkovo minimálne päť vzoriek.
“PG 17,6” (lower/reverse) → GAT CGT CCC TCC ACA GAG AAG AGA
Nemožno uviesť žiadny pevný harmonogram odberu vzoriek, lebo miera biodegradácie sa líši.
Cycle (40-times):
Na každej vzorke vykonajte stanovenie DOC v duplikáte.
→ 45 sec at 55 °C
Požadovaný objem vzoriek závisí od analytickej metódy (špecifická analýza), použitého analyzátora uhlíka a postupu (membránová filtrácia alebo odstredenie) zvolených na úpravu vzorky pred stanovením uhlíka (body 25 a 26).
→ 1 min 30 sec at 68 °C
Pred odberom vzoriek zabezpečte, aby bolo testovacie médium dobre premiešané a aby sa prípadný materiál prilepený na stene banky rozpustil alebo suspendoval.
Y-Gene-PCR-programme as “control” for X- and Y-Gene-PCR-programme:
Membránovú filtráciu alebo odstredenie vykonajte ihneď po odbere vzorky.
This PCR-programme verifies the results of the “X- and Y-Gene-PCR-programme”.
Ak je to potrebné, filtrované alebo odstredené vzorky skladujte pri teplote 2 – 4 °C maximálne 48 hodín alebo pri teplote nižšej ako –18 °C v prípade dlhšieho skladovania (ak je známe, že to nebude mať vplyv na testovanú látku, pred uskladnením roztok okyslite na pH 2).
The “male-samples” should show one band and the “female-samples” shouldn't show any band (after staining and gel-electrophoresis).
Membránové filtre (0,2 – 0,45 μm) sú vhodné, ak sa zabezpečí, aby neuvoľňovali uhlík ani neadsorbovali látku vo fáze filtrácie, napr. polykarbonátové membránové filtre.
“DMTYa (upper/forward)” → GGC CGG GTC CCC GGG TG
Niektoré membránové filtre sú impregnované povrchovo aktívnymi látkami na hydrofilizáciu a môžu uvoľňovať značné množstvo rozpusteného uhlíka.
“DMTYd (lower/reverse)” → TTT GGG TGA ACT CAC ATG G
Tieto filtre pripravte prevarením v deionizovanej vode v troch po sebe nasledujúcich hodinových intervaloch.
Staining of the PCR-samples:
Po prevarení skladujte filtre v deionizovanej vode.
Staining solution:
Prvých 20 ml filtrátu zlikvidujte.
50 % Glycerol
Ako alternatívu k membránovej filtrácii možno vykonať odstredenie vzoriek.
0,25 % Bromphenolblue
Odstreďujte pri 40000 m.s– 2 (~ 4000 g) počas 15 minút, podľa možnosti v chladenej centrifúge.
0,25 % Xylenecyanol
Oddelenie celkového obsahu organického uhlíka (TOC) od DOC (TOC/DOC) odstreďovaním nefunguje pri veľmi nízkych koncentráciách, lebo buď sa neodstránia všetky baktérie, alebo sa uhlík ako súčasť bakteriálnej plazmy znovu rozpustí.
Pipette 1 μl of the staining solution into each single tube
Pri vyšších testovaných koncentráciách (> 10 mg C na liter) je chyba odstreďovania pomerne nižšia.
Start of the Gel-Electrophoresis:
Frekvencia odberu vzoriek
The prepared 1 % agarose gel will be transferred into a gel-electrophoresis-chamber filled with 1 × TAE-Buffer
Ak sa analýzy vykonávajú ihneď po odbere vzoriek, čas ďalšieho odberu vzoriek určite s ohľadom na výsledok analytického stanovenia.
10 - 15 μl of each stained PCR-sample will be pipetted into an agarose gel slot
Ak sa vzorky konzervujú (bod 24) na neskoršiu analýzu, odoberte viac vzoriek ako požadovaný minimálny počet päť.
Also 5 - 15 μl of the 1kb-“Ladder”(Invitrogen) will be pipetted into a separate slot
Najskôr analyzujte posledné vzorky, pričom postupným ‚spätným‘ výberom vhodných vzoriek na analýzu možno s pomerne malým počtom analytických stanovení získať dobrý opis biodegradačnej krivky.
Start the electrophoresis by 200 V
Ak do konca testu nedošlo k žiadnej degradácii, nie je potrebné analyzovať žiadne ďalšie vzorky, a v takej situácii môže ‚spätná‘ stratégia ušetriť značné náklady na analýzu.
Stop after 30-45 min
Ak sa plató degradačnej krivky pozoruje pred 60. dňom, test ukončite.
Determination of the bands:
Ak degradácia zjavne začala do 60. dňa, ale nedosiahla plató, predĺžte experiment o ďalšie obdobie.
Clean the agarose gel in distilled H2O
Zaznamenajte analytické výsledky na priloženú kartu údajov (dodatok 2) a vypočítajte hodnoty biodegradácie pre testovanú a referenčnú látku podľa rovnice:
Now transfer the agarose gel into Ethidium bromide for 15 - 30 min
degradácia ako percentuálna eliminácia DOC alebo špecifickej látky v čase t,
After that, a picture of the agarose gel should be taken in an UV-light-box
počiatočná koncentrácia DOC alebo špecifickej látky v testovacom médiu,
Finally the samples are analysed in comparison to the positive control-band (or bands) and the ladder
koncentrácia DOC alebo špecifickej látky v testovacom médiu v čase t,
Appendix 10
počiatočná koncentrácia DOC alebo špecifickej látky v slepej vzorke,
Guidance on tissue sampling for genetic sex determination by PCR method in the three-spined stickleback
koncentrácia DOC alebo špecifickej látky v slepej vzorke v čase t.
Tissue sampling and DNA extraction
Degradáciu uveďte ako percentuálnu elimináciu DOC (úplnú degradáciu) alebo elimináciu špecifickej látky (primárnu degradáciu) v čase t.
DNA can be extracted using a variety of commercially available reagents and both manual and automated extraction systems.
Vypočítajte koncentrácie DOC s presnosťou na 0,1 mg na liter a priemery hodnôt Dt zaokrúhlite na najbližšie celé percento.
The protocol used at the Cefas Weymouth laboratory is outlined below, and the alternative approaches have been added where appropriate.
Priebeh degradácie graficky znázornite v diagrame uvedenom na obrázku v oddiele ‚Validita a interpretácia výsledkov‘.
With fine scissors, a small piece of tissue (10-20 mg) from the dorsolateral area (after removing the head and tail for VTG analysis), is removed from each individual fish.
Ak máte dostatok údajov, vypočítajte z krivky lag fázu (tL) a čas potrebný na dosiahnutie 50 % eliminácie od konca lag fázy (t50).
The tissue is added into a tube and either placed directly in liquid nitrogen (for storage at – 80 °C) or filled with 70 % ethanol (for transport and subsequent storage at 4 °C).
Protokol o skúške musí obsahovať tieto informácie:
The scissors are cleaned after each single fish in 70 % ethanol then in distilled water and dried with tissue paper.
Testovaná látka:
The ethanol (if present) is removed by aspiration and the tissue is digested overnight with proteinase K in 400 μl of ATL buffer (Qiagen).
fyzikálny charakter a v prípade potreby fyzikálno-chemické vlastnosti,
An aliquot (200 μl) of the digest is transferred to a 96-well S-block (Qiagen) and the DNA extracted in a 96-well format using the Qiagen Universal BioRobot and the QIamp Investigator BioRobot kit.
identifikačné údaje.
The DNA is eluted in a 50 μl of DNase and RNase free water.
stav znečistenia a živín (počet kolónií, dusičnany, amóniové ióny, fosforečnany, ak je to vhodné),
If using hard tissues to extract DNA (such as a spine or a pectoral fin) it may be necessary to homogenise the sample in the lysis buffer using a FastPrep® tissue lyser or equivalent tissue disruption system.
charakteristiky vzorky [dátum odberu vzorky, hĺbka, vzhľad, teplota, slanosť, DOC (voliteľné), čas medzi odberom a použitím v teste],
Alternatively,
použitá metóda zretia morskej vody (ak sa použije),
the tissue is digested overnight with proteinase K in 400 μl of G2 lysis buffer (Qiagen) and DNA is extracted from 200 μl of the digest using either the EZ-1 DNA easy tissue kit and the EZ-1 biorobot or the DNA easy tissue mini kit.
metóda použitá na predúpravu (filtrácia/sedimentácia) morskej vody,
The DNA is eluted in a 50 μl volume.
metóda použitá na stanovenie DOC,
The tissues are processed using the DNAzol reagent.
metóda použitá na špecifickú analýzu (voliteľné),
Briefly, tissue samples are lysed in 1ml of DNAzol for 10 minutes in a 1,5 ml micro centrifuge tube and then centrifuged at 13000 rpm for 5 minutes to remove any particulate matter.
metóda použitá na určenie počtu heterotrofov v morskej vode (metóda počítania na miske alebo alternatívny postup) (voliteľné),
The lysed sample is then transfered to a new 1,5 ml micro centrifuge tube containing 500 μl of 100 % molecular grade ethanol and then centrifuged at 13000 rpm for 10 minutes to precipitate the DNA.
iné metódy (voliteľné) použité na stanovenie vlastností morskej vody (merania ATP atď.).
The ethanol is removed and replaced with 400 μl of 70 % molecular grade ethanol, centrifuged at 13000 rpm for 5 minutes and the DNA pellet is dissolved in 50 μl molecular DNase and RNase free water.
analytické údaje uvedené na karte údajov (dodatok 2),
Again, when using the hard tissues (pectoral fin) it may be necessary to homogenise the sample in the lysis buffer using a FastPrep® tissue lyser or equivalent tissue disruption system prior to extracting the DNA.
priebeh testu degradácie sa graficky znázorňuje v diagrame zobrazujúcom lag fázu (tL), sklon a čas (od konca lag fázy) na dosiahnutie 50 % eliminácie (t50).
The DNA is stored at – 20 °C until required.
Lag fázu možno graficky odhadnúť podľa obrázka v oddiele ‚Validita a interpretácia výsledkov‘ alebo jednoducho uviesť ako čas potrebný na 10 % degradáciu,
gloves must be worn during the procedures.
percentuálna degradácia odmeraná po 60 dňoch alebo na konci testu.
Polymerase chain reaction (PCR) analysis
Rozbor výsledkov
Amplifications were performed using 2,5 μl of the DNA extract in a 50 μl reaction volume using the Idh locus primers (as described by Peichel et al., 2004.
Validita a interpretácia výsledkov
Current Biology 1:1416-1424):
Výsledky získané použitím referenčných látok, napr. benzoanu sodného, octanu sodného alebo anilínu, by mali byť porovnateľné s výsledkami získanými v kruhovom teste (3) (pozri oddiel ‚Referenčné látky‘, bod 7).
Forward primer
Ak sú výsledky získané s použitím referenčných látok atypické, test by sa mal zopakovať s použitím inej vzorky morskej vody.
Reverse primer
Hoci interpretácia výsledkov testov inhibície nemusí byť vždy jednoduchá vzhľadom na príspevok testovanej látky k DOC, výrazné zníženie celkovej miery eliminácie DOC v porovnaní s kontrolnou vzorkou je pozitívnou známkou toxických účinkov.
There are numerous suppliers of suitable PCR reagents.
Vzhľadom na pomerne vysoké použité testované koncentrácie v porovnaní s väčšinou prírodných systémov (a teda nepriaznivý pomer medzi koncentráciami testovaných látok a iných zdrojov uhlíka) sa metóda má považovať za predbežnú skúšku, ktorú možno použiť na stanovenie, či látka je alebo nie je ľahko biodegradovateľná.
The method outlined below is that currently used at the Cefas Weymouth laboratory.
V súlade s tým ani nízky výsledok nemusí nutne znamenať, že testovaná látka nie je biodegradovateľná v morskom prostredí, ale poukazuje na to, že na stanovenie tejto skutočnosti je potrebné vykonať ďalší výskum.
Preparation of the “Reaction Mix” (50 μl per sample):
Na nasledujúcom obrázku je uvedený príklad teoretického pokusu s degradáciou, ktorý znázorňuje uskutočniteľný spôsob odhadu hodnôt tL (dĺžka ‚lag fázy‘) a t50 (časový interval začínajúci pri tL potrebný na dosiahnutie 50 % eliminácie).
A mastermix is prepared as follows.
Ne- úspešné
This can be prepared in advance and stored frozen at – 20 °C until required.
Neparametrické testy
Make sufficient mastermix for a negative control (molecular biology grade water only).
Táto metóda je variantom testu uzavretej fľaše (5) s morskou vodou.
Volume (stock conc.)/ sample
Vypracovala sa na základe kruhového testu, ktorý pre Európsku komisiu (EK) uskutočnil dánsky Ústav pre kvalitu vody (3).
® Reaction Buffer
Tak ako v prípade sprievodnej metódy trepačkovej banky pre morskú vodu, výsledky tohto testu sa nepovažujú za ukazovatele ľahkej biodegradovateľnosti, ale majú sa použiť najmä na získanie informácií o biodegradovateľnosti látok v morskom prostredí.
Nucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Vopred stanovené množstvo testovanej látky sa rozpustí v testovacom médiu v koncentrácii zvyčajne 2 – 10 mg testovanej látky na liter (možno použiť jednu alebo viac koncentrácií).
0,5 μl (25 mM each)
Tento roztok sa uchováva v naplnenej uzavretej fľaši v tme v kúpeli alebo v komore s konštantnou teplotou regulovanou na ± 1 °C v rozsahu 15 – 20 °C.
250 μM each
V prípadoch, keď je cieľom štúdie simulovať situácie v životnom prostredí, sa testy môžu uskutočniť aj mimo tohto normálneho rozsahu teplôt za predpokladu, že sa vhodne upraví regulácia teploty.
Forward Primer
Po degradácii nasleduje analýza kyslíka počas 28-dňového obdobia.
0,5μl (0,1 nmol/μl)
V kruhovom teste sa ukázalo, že ak test trval dlhšie ako 28 dní, vo väčšine prípadov sa nezískali žiadne užitočné informácie v dôsledku závažných interferencií.
Reverse Primer
Hodnoty biochemickej spotreby kyslíka (BSK) v slepých vzorkách boli príliš vysoké pravdepodobne v dôsledku rastu na stenách spôsobeného nedostatkom miešania a v dôsledku nitrifikácie.
2,0μM
Odporúčaná dĺžka je preto 28 dní, ale ak hodnota BSK v slepých vzorkách zostane v rámci hranice 30 % (body 15 a 40), test sa môže predĺžiť.
Molecular biology grade water
Vyžaduje sa empirický vzorec na výpočet teoretickej spotreby kyslíka (ThOD) (pozri dodatok 3).
GoTaq polymerase
Ak nie je k dispozícii, musí sa stanoviť chemická spotreba kyslíka (ChSK) látky, ktorá bude slúžiť ako referenčná hodnota.
Dispense 47,5 μl to a labelled 0,5 ml thin walled PCR tube.
Použitie ChSK je menej uspokojivé, lebo niektoré látky sa v teste ChSK úplne neoxidujú.
Add 2,5 μl of the purified DNA to the appropriately labelled tube.
Rozpustnosť látky by mala byť aspoň 2 mg/l, hoci v zásade možno testovať aj menej rozpustné látky (napr. pomocou ultrazvuku), ako aj prchavé látky.
Repeat for all samples and the negative control.
Informácie o toxicite látky pre baktérie, napríklad údaje namerané v krátkodobých testoch spotreby kyslíka (4), môžu byť veľmi užitočné pri výbere vhodných testovaných koncentrácií a môžu byť rozhodujúce na správnu interpretáciu nízkych hodnôt biodegradácie.
Over lay with 2 drops of mineral oil.
Tieto informácie však nie sú vždy dostatočné na interpretáciu výsledkov získaných v teste na biologickú odbúrateľnosť a vhodnejší je postup opísaný v bode 27.
Alternatively, use a thermal cycler with a heated lid.
Na tieto účely možno použiť (napríklad) anilín, octan sodný či benzoan sodný.
Close the lids.
V rozumnom čase musí dôjsť k aspoň 60 % (z ich ThOD) degradácii týchto látok, inak sa odporúča, aby sa test zopakoval s použitím inej vzorky morskej vody.
Samples were denatured in a Peltier PTC-225 thermal cycler at 94 ± 2 °C for 5 minutes followed by 39 cycles of 94 ± 2 °C for 1 minute, 55 ± 2 °C for 1 minute, 72 ± 2 °C for 1 minute, and a final extension of 72 ± 2 °C for 10 minutes.
V kruhovom teste EK, v ktorom sa vzorky morskej vody odobrali z rôznych miest a v rôznych obdobiach roka, trvala lag fáza (tL) 0 – 2 dni a čas na dosiahnutie 50 % degradácie (t50) okrem lag fázy bol 1 – 4 dni pre benzoan sodný.
Preparation of the agarose gel (2 %):
Pre anilín bola hodnota tL 0 – 7 dní a hodnota t50 2 – 12 dní.
Traditionally the PCR products are resolved on a 20 % agarose gel containing ethidium bromide.
REPRODUKOVATEĽNOSŤ
Capillary based electrophoresis systems can also be used.
Opakovateľnosť metód sa stanovila v kruhovom teste EK (3).
Weigh 2 g agarose in 100 ml 1 × TAE-buffer
Bežné laboratórne vybavenie a:
Heat in a microwave (ca.
možno použiť 250 – 300 ml fľaše na meranie BSK so sklenenými uzávermi alebo 250 ml fľaše s úzkym hrdlom so sklenenými uzávermi;
2-3 min) to dissolve the agarose.
viaceré dvojlitrové, trojlitrové a štvorlitrové fľaše s litrovými značkami na prípravu pokusu a na naplnenie fliaš na meranie BSK;
Add 2 drops of ethidium bromide final concentration 0,5 μg/ml
vodný kúpeľ alebo miestnosť s konštantnou teplotou na udržiavanie fliaš pri konštantnej teplote (± 1 °C) s vylúčením svetla;
Transfer the hot solution into the gel casting equipment.
zariadenie na analýzu rozpusteného kyslíka;
Allow the gel to harden
membránové filtre 0,2 – 0,45 μm (voliteľné);
Load 20 μl of each sample to a separate well, adding a molecular weight marker (100 bp DNA ladder, Promega) to a spare well.
Počas prepravy nedovoľte, aby teplota vzorky výrazne presiahla teplotu, aká sa použije v teste.
Electrophoresis is performed at 120 V for 30-45 minutes.
Presne identifikujte miesto odberu vzorky a opíšte jeho stav z hľadiska znečistenia a živín.
Visualisation of the amplification products
Najmä v prípade pobrežných alebo znečistených vôd zahrňte do tejto charakterizácie počet heterotrofných mikrobiálnych kolónií a stanovenie koncentrácie rozpustených dusičnanov, amónnych iónov a fosforečnanov.
If the ethidium bromide was incorporated in to the agarose gel as described above, the DNA products are visualised under a UV source.
vzhľad vzorky – zakalená atď.,
Alternatively the agarose gel is stained by covering the gel in a dilute solution of ethidium bromide (0,5 μg/ml in water) for 30 minutes prior to visualisation.
rozpustený organický uhlík (DOC),
Appendix 11
Ak sa zistí vysoký obsah DOC vo vzorke alebo ak sa usúdi, že hodnota BSK v slepej vzorke by po 28 dňoch bola vyššia ako 30 % hodnoty referenčných látok, odporúča sa, aby sa morská voda nechala pred použitím zrieť približne jeden týždeň.
Guidance for artificial fertilisation procedure for the three-spined stickleback
Nechajte vzorku zrieť za aeróbnych podmienok pri testovacej teplote a v tme alebo pri difúznom osvetlení.
The purpose of this section is to describe the procedures to obtain fertilised eggs from the three-spined stickleback in view of using them in the FSDT.
V kruhovom teste (3) sa nezistili žiadne rozdiely medzi degradačným potenciálom vyzretých a čerstvo odobratých vzoriek morskej vody.
Procedures
Pred použitím predupravte morskú vodu tak, aby sa odstránili hrubé častice, napr. filtráciou cez nylonový filter alebo hrubý papierový filter (nie membránový ani GF-C filter) alebo sedimentáciou a dekantáciou.
Obtaining sperm from the males
Použitý postup uveďte do správy.
A well-coloured male of the desired population is euthanised.
Ak nechávate vzorku zrieť, túto predúpravu vykonajte až potom.
The testes are dissected from each side of the fish.
Pripravte tieto zásobné roztoky s použitím reaktantov analytickej čistoty:
The testes are generally heavily pigmented, rod shaped structures that are readily apparent at the lateral midline of the body.
Pridajte 1 ml každého z uvedených zásobných roztokov na liter predupravenej morskej vody.
Use either of the following methods:
Nasýtenú koncentráciu rozpusteného kyslíka ako funkciu slanosti a teploty možno odčítať z nomogramu priloženého k tejto testovacej metóde (dodatok 4).
Using a pair of fine scissors, begin at the cloaca and make a 1-1,5 cm incision with a single snip angled at about 45 degrees.
Stanovte (voliteľne) počet heterotrofov tvoriacich kolónie v testovacom médiu morskej vody (a podľa možnosti aj v pôvodnej vzorke morskej vody), napr. spočítaním na miske s použitím morského agaru.
Use a scalpel to make a small incision in the side of the fish slightly posterior to the pelvis and just ventral of the lateral plates.
Príprava testovacích fliaš
The testes are removed using fine forceps and placed into a petri dish.
Vykonajte všetky potrebné úpravy vrátane zretia a predúpravy morskej vody pri zvolenej testovacej teplote 15 – 20 °C, pričom zabezpečte čistotu, ale nie sterilnosť, všetkého skla.
Each testis is covered with 100 μl freshly made Hank's final solution.
Pripravte skupiny fliaš na stanovenie BSK testovanej a referenčnej látky v sérii súbežných pokusov.
The testes are finely diced by using a razor blade or scalpel.
Všetky analýzy vykonajte v duplicitných fľašiach (slepé vzorky, referenčná a testovaná látka), t. j. pripravte dve fľaše pre každé stanovenie.
This will release sperm and give the Hank's solution a milky appearance.
Analýzy vykonajte minimálne v 0., 5., 15. a 28. deň (štyri stanovenia).
The fluid containing sperm is added into a tube, while trying not to include any pieces of testes tissue when pipetting.
Na účely analýz kyslíka si štyri stanovenia vyžadujú celkovo 3 × 2 × 4 = 24 fliaš (slepá vzorka, referenčná a testovaná látka), a teda približne 8 litrov testovacieho média (na jednu koncentráciu testovanej látky).
800 μl of Hank's final solution are added into the tube and mixed well.
Pripravte samostatné roztoky testovanej a referenčnej látky vo veľkých fľašiach s dostatočným objemom (bod 11) tak, že najskôr pridáte testovanú a referenčnú látku do čiastočne naplnených veľkých fliaš buď priamo, alebo prostredníctvom koncentrovaného zásobného roztoku.
If required, the male can be preserved by fixing in 100 % ethanol or other desired fixative.
Pridajte ďalšie testovacie médium, aby sa dosiahli požadované konečné koncentrácie.
This is particularly important if the study is assigning parental origin of offsprings.
Ak sa používajú zásobné roztoky testovanej a/alebo referenčnej látky, zabezpečte, aby sa výrazne nezmenila slanosť média morskej vody.
Although most of the stock solutions required can be made in advance, stock 5 and subsequently the final solution, should be made up fresh on the day of use.
Koncentrácie testovanej a referenčnej látky zvoľte s ohľadom na:
Stock 1
rozpustnosť rozpusteného kyslíka v morskej vode pri použitej testovacej teplote a slanosti (pozri priložený nomogram – dodatok 4);
8,00 g
očakávanú biodegradovateľnosť testovanej látky.
0,40 g
Ak sa morská voda nenechá zrieť, spotreba kyslíka samotnej morskej vody (spotreba kyslíka v slepej vzorke) môže byť 2 mg O2/l alebo vyššia.