natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Petersen (2003), “Gonad development and vitellogenin production in zebrafish (Danio rerio) exposed to ethinylestradiol and methyltestosterone”, Aquatic Toxicology 65, pp. 397-411.
Preneste horúci roztok do špeciálnej odlievacej schránky, ktorá leží na ľade.
Tyler (2002), “Utility of a juvenile fathead minnow screening assay for detecting (anti-)estrogenic substances”, Environmental Toxicology and Chemistry 21, pp. 319-326.
Po približne 20 min. je agarózový gél pripravený na použitie.
Wang (2007), “Toxicity of the aromatase inhibitor letrozole to Japanese medaka (Oryzias latipes) eggs, larvae and breeding adults”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 145, pp. 533-541.
Agarózový gél skladujte v tlmivom roztoku 1 × TAE až do konca programov PCR.
LeBlanc, and C.V.Sullivan (1999), “Fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin: purification, characterization and quantitative immunoassay for the detection of estrogenic compounds”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 123, pp. 113-125.
Aktínový program PCR:
Porcher (2002), “Development and validation of an enzyme-linked immunosorbent assay to measure vitellogenin in the zebrafish (Danio rerio)”, Environmental Toxicology and Chemistry 21, pp. 1699-1708.
Účelom tejto reakcie PCR je preukázať, že DNA vo vzorke nie je poškodená.
Hatano, H. Mizukami, M. Yamashita, R. Sakakibara, and E. Tamiya (2002), “Development and application of a monoclonal antibody-based sandwich ELISA for quantification of Japanese medaka (Oryzias latipes) vitellogenin”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 132, pp. 161-169.
Špeciálny primer:
Bengtsson (2004), “The juvenile three-spined stickleback (Gasterosteus aculeatus L.) as a model organism for endocrine disruption — II — kidney hypertrophy, vitellogenin and spiggin induction”, Aquatic Toxicology 70, pp. 311-326.
‚Mact1(horný/priamy)‘ → TTC AAC AGC CCT GCC ATG TA
Tatarazako, N., M. Koshio, H. Hori, M. Morita, and T. Iguchi (2004), “Validation of an enzyme-linked immunosorbent assay method for vitellogenin in the medaka”, Journal of Health Science 50, pp. 301-308.
‚Mact2(spodný/reverzný)‘ → GCA GCT CAT AGC TCT TCT CCA GGG AG
Eidem, J.K., H. Kleivdal, K. Kroll, N. Denslow, R. van Aerle, C. Tyler, G. Panter, T. Hutchinson, and A. Goksoyr (2006), “Development and validation of a direct homologous quantitative sandwich ELISA for fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin.
Program:
Ankley (2006), “Evaluation of a commercial kit for measuring vitellogenin in the fathead minnow (Pimephales promelas)”, Ecotoxicology and Environmental Safety 64, pp. 101-105.
Denaturácia
Comparison of vitellogenin in plasma and whole body homogenate from zebrafish (Danio rerio) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)”, Nordic Council of Ministers, TemaNord 2001:597, pp. 48-51.
Teplotná hybridizácia
Porcher, and A. Goksoyr (2004), “Development of quantitative vitellogenin-ELISAs for fish test species used in endocrine disruptor screening”, Analytical and Bioanalytical Chemistry 378, pp. 621-633.
→ 45 s pri 56 °C
Orn, S., S. Yamani, and L. Norrgren (2006), “Comparison of vitellogenin induction, sex ratio, and gonad morphology between zebrafish and Japanese medaka after exposure to 17 alpha-ethinylestradiol and 17 beta-trenbolone”, Archives of Environmental Contamination and Toxicology 51, pp. 237-243.
Elongácia
Scholz, S. and N. Kluver (2009), “Effects of Endocrine Disrupters on Sexual, Gonadal Development in Fish, Sexual Development 3”, pp. 136-151.
→ 1 min. pri 68 °C
Fenske, M., G. Maack, C. Schafers, and H. Segner (2005), “An environmentally relevant concentration of estrogen induces arrest of male gonad development in zebrafish, Danio rerio”, Environmental Toxicology and Chemistry 24, pp. 1088-1098.
15 min. pri 68 °C
Nagahama (2004), “Two DM domain genes, DMY and DMRT1, involved in testicular differentiation and development in the medaka, Oryzias latipes”, Developmental Dynamics 231, pp. 518-526.
Program PCR na detekciu génov na chromozómoch X a Y
Shinomiya, A., H. Otake, K. Togashi, S. Hamaguchi, and M. Sakaizumi (2004), “Field survey of sex-reversals in the medaka, Oryzias latipes: genotypic sexing of wild populations”, Zoological Science 21, pp. 613-619.
V tomto programe PCR sa vzorky neporušenej DNA použijú na detekciu génov na chromozómoch X a Y.
Kidd (2009), “Interspecies differences in biochemical, histopathological, and population responses in four wild fish species exposed to ethynylestradiol added to a whole lake”, Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 66, pp. 1920-1935.
V tomto programe by sa mala analyzovať aj jedna pozitívna kontrolná vzorka pre samčekov (vzorka XY) a jedna pre samičky (vzorka XX).
Tyler (2006), “Development of chronic tests for endocrine active chemicals — Part 1.
‚PG 17.5‘ (horný/priamy) → CCG GGT GCC CAA GTG CTC CCG CTG
An extended fish early-life stage test for oestrogenic active chemicals in the fathead minnow (Pimephales promelas)”, Aquatic Toxicology 77, pp. 279-290.
‚PG 17.6‘ (dolný/reverzný) → GAT CGT CCC TCC ACA GAG AAG AGA
Petersen, P. Jackson, K. Hylland, L. Norrgren, and P. Bjerregaard (2006), “Detection of endocrine disrupters: Evaluation of a Fish Sexual Development Test (FSDT)”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 144, pp. 57-66.
Cyklus (40-krát):
Andersen, L., K. Kinnberg, H. Holbech, B. Korsgaard, and P. Bjerregaard (2004), “Evaluation of a 40 day assay for testing endocrine disrupters: Effects of an anti-estrogen and an aromatase inhibitor on sex ratio and vitellogenin concentrations in juvenile zebrafish (Danio rerio)”, Fish Physiology and Biochemistry 30, pp. 257-266.
→ 45 s pri 55 °C
Morthorst, J.E., H. Holbech, and P. Bjerregaard (2010), “Trenbolone causes irreversible masculinization of zebrafish at environmentally relevant concentrations”, Aquatic Toxicology 98, pp. 336-343.
→ 1 min. 30 s pri 68 °C
Metcalf (2003), “Effects of the antiandrogens, vinclozolin and cyproterone acetate on gonadal development in the Japanese medaka (Oryzias latipes)”, Aquatic Toxicology 63, pp. 391-403.
Program PCR na detekciu génov na chromozóme Y ako ‚kontrola‘ pre program PCR na detekciu génov na chromozómoch X a Y
Tyler (2004), “Successful detection of (anti-) androgenic and aromatase inhibitors in pre-spawning adult fathead minnows (Pimephales promelas) using easily measured endpoints of sexual development”, Aquatic Toxicology 70, pp. 11-21.
Pomocou tohto programu PCR sa overujú výsledky programu PCR na detekciu génov na chromozómoch X a Y.
Petersen, and P. Bjerregaard (2007), “Effects of the fungicide prochloraz on the sexual development of zebrafish (Danio rerio)”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 145, pp. 165-170.
Na samčích vzorkách by sa mal ukázať jeden pás a na samičích vzorkách by sa nemal ukázať žiadny pás (po zafarbení a gélovej elektroforéze).
Chapter C.14 of this Annex, Fish Juvenile Growth Test.
‚DMTYa (horný/priamy)‘ → GGC CGG GTC CCC GGG TG
Chapter C.4 of this Annex, Ready Biodegradability.
‚DMTYd (dolný/reverzný)‘ → TTT GGG TGA ACT CAC ATG G
Chapter C.37 of this Annex, 21-Day Fish Assay:
Farbenie vzoriek PCR:
A Short Term Screening for Oestrogenic and Androgenic Activity, and Aromatase Inhibition.
Farbiaci roztok:
Schäfers, C., Teigeler, M., Wenzel, A., Maack, G., Fenske, M., Segner, H (2007), “Concentration- and time-dependent effects of the synthetic estrogen, 17 alpha-ethinylestradiol, on reproductive capabilities of the zebrafish, Danio rerio” Journal of Toxicology and Environmental Health-Part A, 70, 9-10 pp 768-779.
0,25 % brómfenolová modrá
Abbreviations and definitions
0,25 % xylén kyanol
Apical endpoint
Pipetou aplikujte 1 μl farbiaceho roztoku do každej skúmavky.
Causing effect at population level
Spustenie gélovej elektroforézy:
Air saturation value
Pripravený 1 % agarózový gél sa prenesie do komory na gélovú elektroforézu naplnenej tlmivým roztokom 1 × TAE.
Biomarker
10 – 15 μl z každej zafarbenej vzorky PCR sa pipetou nanesie na príslušné miesto na agarózovom géle.
Causing effect at individual level
Na samostatné miesto sa pipetou nanesie 5 – 15 μl roztoku 1kb-‚Ladder‘(Invitrogen).
A substance or a mixture.
Spustite elektroforézu pri 200 V.
Days post hatch
Po 30 – 45 minútach ju zastavte.
Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish
Určenie pásov:
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
Vyčistite agarózový gél v destilovanej vode.
Fish weight
Následne preneste agarózový gél do ethídiumbromidu na 15 – 30 minút.
Fish wet weight (blotted dry)
Potom sa má urobiť snímka agarózového gélu v UV svetelnej komore.
FSDT
Vzorky sa napokon analyzujú porovnaním s pozitívnym kontrolným pásom (alebo pásmi) a rebríkom (‚ladder‘).
Fish Sexual Development Test
Dodatok 10
Hypothalamic-pituitary-gonadal axis
Usmernenie na odber vzoriek tkanív na účely určenia genetického pohlavia metódou pcr pri pichľavke sivej
Intersex fish
Odber vzoriek tkanív a extrakcia DNA
Fish with more than one oocyte in testis per 6 sections analysed or spermatogenetic cells in ovaries (yes/no)
DNA možno extrahovať pomocou rôznych komerčne dostupných reaktantov a manuálnych i automatizovaných extrakčných systémov.
Wet weight of fish per volume of water
Ďalej je opísaný protokol používaný v laboratóriu Cefas Weymouth a podľa potreby sú uvedené aj alternatívne prístupy.
Mode of action
Pomocou jemných nožníc sa z každej ryby oddelí malá časť tkaniva (10 – 20 mg) z dorzolaterálnej oblasti (po odstránení hlavy a chvosta na analýzu VTG).
Reverse Transcriptase Polymerase Chain-Reaction
Tkanivo sa vloží do skúmavky a buď sa priamo umiestni do tekutého dusíka (na účely skladovania pri teplote – 80 °C), alebo sa skúmavka naplní 70 % etanolom (na účely prepravy a následného skladovania pri teplote – 4 °C).
Undifferentiated fish
Nožnice sa po každej rybe vyčistia v 70 % etanole a potom v destilovanej vode a usušia papierovou vreckovkou.
Fish with gonads exhibiting no discernible germ cells.
Etanol (ak je prítomný) sa odstráni odsatím a tkanivo sa nechá cez noc digerovať proteinázou K v 400 μl tlmivého roztoku ATL (Qiagen).
Vitellogenin
Alikvotná časť (200 μl) digerovaného tkaniva sa prenesie na 96-jamkový S-blok (Qiagen) a DNA sa vyextrahuje v 96-jamkovom formáte pomocou systému Qiagen Universal BioRobot a súpravy QIamp Investigator BioRobot Kit.
Experimental conditions for the FSDT (freshwater species)
DNA sa eluuje v 50 μl vody bez DNázy a RNázy.
Japanese medaka (Oryzias latipes)
Ak sa na extrakciu DNA používajú tvrdé tkanivá (napr. chrbtica alebo prsná plutva), môže byť potrebné homogenizovať vzorku v lyzačnom tlmivom roztoku pomocou nástroja na lýzu tkaniva FastPrep® alebo ekvivalentného systému na disrupciu tkaniva.
Zebrafish (Danio rerio)
Alternatíva:
Three-spined Stickleback (Gasterostreus aculeatus)
Tkanivo sa nechá cez noc digerovať proteinázou K v 400 μl lyzačného tlmivého roztoku G2 (Qiagen).
Flow-through or semi-static
DNA sa vyextrahuje z 200 μl digerovaného tkaniva buď pomocou súpravy EZ-1 DNA Easy Tissue Kit a systému EZ-1 Biorobot, alebo pomocou súpravy DNA Easy Tissue Mini Kit.
Fluorescent bulbs (wide spectrum
DNA sa eluuje v objeme 50 μl.
Light intensity
Tkanivá sa spracujú pomocou reaktanta DNAzol.
10-20 μE/m2/s, 540-1080 lux, or 50-100 ft-c (ambient laboratory levels)
Vzorky tkaniva sa 10 minút lyzujú v 1 ml DNAzolu v 1,5 ml mikrocentrifugačnej skúmavke a potom sa odstreďujú pri 13000 ot./min. počas 5 minút, aby sa odstránili všetky tuhé častice.
12-16 h light, 8-12 h dark
Lyzovaná vzorka sa následne prenesie do novej 1,5 ml mikrocentrifugačnej skúmavky obsahujúcej 500 μl 100 % etanolu v kvalite vhodnej na molekulárne analýzy a potom sa odstreďuje pri 13000 ot./min. počas 10 minút, aby sa vyzrážala DNA.
Minimum chamber size
Etanol sa odstráni a nahradí 400 μl 70 % etanolu v kvalite vhodnej na molekulárne analýzy, vzorka sa odstreďuje pri 13000 ot./min. počas 5 minút a peleta DNA sa rozpustí v 50 μl vody bez DNázy a RNázy vhodnej na molekulárne analýzy.
Individual chambers should contain a minimum of 7 l water volume
Znova platí, že ak sa používajú tvrdé tkanivá (prsná plutva), pred extrakciou DNA môže byť potrebné homogenizovať vzorku v lyzačnom tlmivom roztoku pomocou nástroja na lýzu tkaniva FastPrep® alebo ekvivalentného systému na disrupciu tkaniva.
Age of test organisms at start of exposure
DNA sa až do použitia skladuje pri teplote – 20 °C.
Newly fertilised eggs (Early blastula stage)
počas postupov sa musia používať rukavice.
Newly fertilised eggs
Analýza pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR)
No. of eggs per treatment
Vykonajú sa amplifikácie pomocou 2,5 μl extraktu DNA v reakčnom objeme 50 μl pomocou primerov pre lokus Idh (opis: Peichel a kol., 2004.
Minimum 120
Current Biology 1:1416 – 1424):
Minimum 3 (plus appropriate controls)
Priamy primer
No. replicates per treatment
Reverzný primer
Minimum 4 (unless square root allocation to controls)
Vhodné reaktanty na PCR dodávajú mnohí dodávatelia.
Live Artemia, frozen adult brine shrimp, flake food, etc.
Metóda uvedená ďalej sa v súčasnosti používa v laboratóriu Cefas Weymouth.
growth (Fish wet weight, blotted dry) > 120 mg
GoTaq-polymeráza
Length (standard length) > 20mm
Pridajte 47,5 μl do označenej 0,5 ml tenkostennej skúmavky na PCR.
Length (standard length) > 14 mm
Pridajte 2,5 μl purifikovanej DNA do príslušne označenej skúmavky.
Length (standard length) > 20 mm
Zopakujte pre všetky vzorky a negatívnu kontrolnú vzorku.
Sex ratio (% males or females) 30 %-70 %
Prekryte dvoma kvapkami minerálneho oleja.
Chemical characteristics of an acceptable dilution water
Alternatívne možno použiť termocyklér s vyhrievaným krytom.
CONCENTRATION
Uzavrite kryty.
Particular matter
Vzorky sa denaturovali v termocykléri Peltier PTC-225 pri teplote 94 C ± 2 °C počas 5 minút, potom nasledovalo 39 cyklov pri teplote 94 °C ± 2 °C počas 1 minúty, 55 °C ± 2 °C počas 1 minúty, 72 °C ± 2 C počas 1 minúty a záverečné predĺženie pri teplote 72 °C ± 2 C počas 10 minút.
From test method C.14/Guidance on test concentrations
Príprava agarózového gélu (2 %):
Column (Number of concentrations between 100 and 10, or between 10 and 1) [1]
Tradične sa produkty PCR interpretujú na 20 % agarózovom géle obsahujúcom ethídiumbromid.
A series of three (or more) successive concentrations may be chosen from a column.
Možno použiť aj kapilárne elektroforetické systémy.
Mid-points between concentrations in column (x) are found in column (2x + 1).
Navážte 2 g agarózy do 100 ml tlmivého roztoku 1 × TAE.
The purpose of this section is to describe the procedures that occur prior to the quantification of the VTG concentration.
Gélová elektroforéza:
Other procedures that result in comparable VTG quantification can be used.
Preneste agarózový gél do zariadenia na elektroforézu a ponorte do tlmivého roztoku 1 × TAE.
It is an option to determine the VTG concentration in blood plasma or liver instead of head/tail homogenate.
Pridajte 20 μl z každej vzorky do samostatnej jamky a do náhradnej jamky pridajte marker molekulovej hmotnosti (DNA rebrík 100bp, Promega).
The head and tail are cut of the fish in accordance with the test description.
Elektroforéza sa vykonáva pri 120 V počas 30 – 45 minút.
All dissection instruments, and the cutting board should be rinsed and cleaned properly (e.g. with 96 % ethanol) between handling of each single fish to prevent “VTG pollution” from females or induced males to un-induced males.
Vizualizácia produktov amplifikácie
When a homogenous mass is achieved an amount of 4-10 time the tissue weight of ice-cold homogenisation buffer is added (note the dilution).
Ak bol do agarózového gélu pridaný ehtídiumbromid podľa opisu uvedeného vyššie, produkty DNA sa vizualizujú pod zdrojom UV žiarenia.
The samples are placed on ice until centrifugation at 4 °C at 50000 g for 30 min.
Alternatívne sa agarózový gél pred vizualizáciou zafarbí pokrytím gélu zriedeným roztokom ethídiumbromidu (0,5 μg/ml vo vode) na 30 minút.
Use a pipette to dispense portions of 20 to 50 μl (note the amount) supernatant into at least two tubes by dipping the tip of the pipette below the fat layer on the surface and carefully sucking up the supernatant without fat- or pellet fractions.
Dodatok 11
Place on ice during use
Usmernenie pre postup umelého oplodnenia pichľavky sivej
Homogenisation buffer:50 mM Tris-HCl pH 7,4;
Účelom tohto oddielu je opísať postupy na získanie oplodnených vajíčok pichľavky sivej na použitie v teste FSDT.
12 ml Tris-HCl pH 7,4 + 120 μl Protease inhibitor cocktail (or equivalent protease inhibitor cocktails).TRIS:
Získanie spermií od samčekov
TRIS-ULTRA PURE (ICN)Protease inhibitor cocktail:
Dobre sfarbený samček z požadovanej populácie sa usmrtí.
From Sigma (for mammalian tissue) Product number P 8340.
Z každej strany ryby sa odoberú semenníky.
Guidance for quantification of head & tail homogenate vitellogenin in zebrafish (Danio rerio) (modified from Holbech et al., 2001). other procedures using homologous antibodies and standards can be used
Semenníky sú väčšinou výrazne pigmentované štruktúry tvaru tyče, ktoré sú dobre viditeľné v laterálnej stredovej línii tela.
Purified zebrafish vitellogenin standard [1] is serially diluted to 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10 and 20 ng/ml in dilution buffer (**) and samples are diluted at least 200 times (to prevent matrix effect) in dilution buffer and applied to the plates.
Pomocou jemných nožníc urobte rez s dĺžkou 1 – 1,5 cm jedným strihnutím od kloaky v uhle približne 45 stupňov.
An assay control is applied in duplicate.
Skalpelom urobte malý rez na bočnej strane ryby mierne za panvou a mierne ventrálne od bočných štítkov.
150 μl are applied to each well.
Jemnou pinzetou vyberte semenníky a vložte ich do Petriho misky.
Standards are applied in duplicate and samples in triplicate.
Každý semenník sa pokryje 100 μl čerstvo vyrobeného Hankovho konečného roztoku.
Incubate over night at 4 °C on a shaker.
Semenníky sa nakrájajú na malé kocky pomocou žiletky alebo skalpela.
The plates are washed 5 times with washing buffer (*)
Tým sa uvoľnia spermie a Hankov roztok získa mliečny vzhľad.
HRP coupled to a dextran chain (e.g. AMDEX A/S, Denmark) and conjugated antibodies are diluted in washing buffer;
Tekutina obsahujúca spermie sa pridá do skúmavky, pričom treba dávať pozor, aby sa pri pipetovaní nedostali do skúmavky kúsky semenníkov.
Actual dilution differs by batch and age.
Do skúmavky sa pridá 800 μl Hankovho konečného roztoku a dobre sa premieša.
150 μl are applied to each well and the plates are incubated for 1 hour at room temperature on a shaker.
Ak je to potrebné, samčeka možno zafixovať v 100 % etanole alebo inom požadovanom fixačnom prostriedku.
The plates are washed 5 times with washing buffer (*) and the bottom of the plates is carefully cleaned with ethanol.
To je dôležité najmä vtedy, keď sa v štúdii určuje rodičovský pôvod mláďat.
150 μl TMB plus (***) are applied to each well.
Hoci väčšinu potrebných zásobných roztokov možno pripraviť vopred, zásobný roztok 5 a následne aj konečný roztok by sa mali pripraviť čerstvé v deň použitia.
When the standard curve is fully developed the enzyme activity is stopped by adding 150 μl 0,2 M H2SO4 to each well.
8,00 g
The absorbance is measured at 450 nm (e.g. on a Molecular Devices Thermomax plate reader).
0,40 g
Data are analysed on the associated software (e.g. Softmax).
Destilovaná voda (DV)
Washing buffer:
Zásobný roztok 2
PBS-stock (****)
HPO4 (bezvodý)
Adjust pH to 7,3 and fill to 5 l with millipore H2O.
0,358 g
Store at 4 °C.
0,60 g
Dilution buffer:
Zásobný roztok 3
PBS-Stock (****)
0,72 g
Adjust pH to 7,3 and fill to 1 l with millipore H2O.
50 ml
TMB plus is a “ready-to-use” substrate produced by KemEnTec (Denmark).
Zásobný roztok 4
It is sensitive to light.
1,23 g
PBS stock
Zásobný roztok 5 (čerstvo pripravený)
HPO4 · 2H2O
0,35 g
Adjust pH to 6,8 and fill with millipore H2O to 2 l.
10 ml
Store at room temperature.
Ak už máte pripravené niektoré z uvedených solí, ale s iným obsahom vody (t. j.
Battelle AP4.6.04 (1,18 mg/ml (AAA)), purified according to:
2H2O namiesto bezvodých), môžete ich použiť, najskôr však upravte hmotnosť na základe molekulovej hmotnosti.
Guidance for the preparation of tissue sections for sex determination and staging of gonads
V prípade Hankovho konečného roztoku ich kombinujte v tomto poradí:
The purpose of this section is to describe the procedures that occur prior to the evaluation of histological sections.
zásobný roztok 1
Other procedures that result in similar sex determination and gonadal staging can be used.
1,0 ml
With a few exceptions, these procedures are similar for Japanese medaka (JMD) and zebrafish (ZF).
zásobný roztok 2
Euthanasia, Necropsy, and Tissue Fixation
0,1 ml
Objectives:
zásobný roztok 3
Provide for the humane sacrifice of fish.
8,6 ml
Obtain necessary body weights and measurements.
zásobný roztok 4
Evaluate secondary sex characteristics.
zásobný roztok 5
Dissect tissues for VTG analysis.
Pred použitím dobre premiešajte.
Fixation of the gonads.
Oplodnenie
Procedures:
V požadovanej populácii sa identifikujú veľké gravidné samičky.
Fish should be sacrificed immediately prior to necropsy.
Samičky sú pripravené na vytláčanie až vtedy, keď vidíte vajíčka vyčnievať z kloaky.
Therefore, unless multiple prosectors are available, multiple fish should not be sacrificed simultaneously.
Pripravené samičky majú typickú polohu ‚hlava hore‘.
Using the small dip net, a fish is removed from the experimental chamber and transported to the necropsy area in the transport container.
Jemne prejdite prstom alebo palcom po bočnej strane ryby smerom k chvostu, aby ste podporili vypudenie vačku s vajíčkami do novej Petriho misky.
The fish is placed in the euthanasia solution.
Zopakujte to aj na druhej strane a vráťte rybu do nádrže.
The fish is removed from the solution when there is cessation of respiration and the fish is unresponsive to external stimuli.
Vajíčka možno rozptýliť (aby tvorili jednu vrstvu) pomocou jemného štetca.
The fish is wet weighed.
Je dôležité snažiť sa vystaviť spermiám čo najviac vajíčok, preto je užitočné maximalizovať povrchovú plochu vajíčok.
For preparation of tissues for VTG analysis, the fish can be placed on a corkboard on the stage of a dissecting microscope.
Uchovávajte vajíčka vlhké tak, že okolo nich uložíte vlhkú vreckovku (je dôležité, aby sa vajíčka priamo nedotýkali vody, lebo to môže viesť k predčasnému stvrdnutiu choriónu, čím by sa znemožnilo oplodnenie).
For zebrafish the head is cut right behind the pectoral fin and tail is cut right behind the dorsal fin.
Existujú veľké rozdiely v počte vajíčok, ktoré sú jednotlivé samičky schopné vytvoriť, ale v priemere možno z jednej gravidnej samičky ľahko získať približne 150 vajíčok.
For Japanese medaka the abdomen is opened via a carefully made incision that extends along the ventral midline from the pectoral girdle to a point just cranial to the anus.
25 μl spermií v Hankovej zmesi sa štetcom rovnomerne rozotrie na celý povrch vajíčok.
Using the small forceps and small scissors, the liver is carefully removed.
Vajíčka po začiatku oplodňovania rýchlo stvrdnú a zmenia farbu (do minúty).
Specimen for VTG analysis are placed in eppendorf tubes and immediately frozen in liquid nitrogen.
Ak je odhadovaný počet vajíčok vyšší ako 150, postup zopakujte.
The carcass including the gonads is placed into a pre-labelled plastic tissue cassette, which is transferred into Davidson's or Bouin's fixative.
Podobne ak vajíčka nestvrdnú do jednej minúty, pridajte trochu viac spermií.
The volume of fixative should be at least 10 times the approximated volume of the tissues.
Pridaním väčšieho množstva spermií sa nemusí nevyhnutne zvýšiť miera oplodnenia.
The fixative container is gently agitated for five seconds to dislodge air bubbles from the cassette.
Vajíčka a roztok spermií by sa mali nechať ‚interagovať‘ aspoň 15 minút a oplodnené vajíčka by sa mali umiestniť do expozičných akvárií do 1,5 hodiny od oplodnenia.
All tissues remain in Davidson's fixative overnight, followed by transfer to individual containers of 10 % neutral buffered formalin the next day.
Postup sa opakuje s použitím ďalšej samičky, kým sa nezíska želaný počet vajíčok.