natgillin/translations-raw huggingface dataset:
specific monoclonal antibodies (namely for VHSV identification, MAb IP5B11 and for IHNV, Hyb 136-3 respectively) shall be diluted in 0,01 M PBST, pH 7,2 in the dilution recommended by the provider of the MAbs; 50 to 100 μl/well shall be added to the fixed monolayer and plates shall be incubated for one hour at 37 °C in a humid chamber;
Kmene a izoláty VHSV, ktoré pri neutralizačných testoch nereagujú, sa identifikujú prostredníctvom IF alebo ELISA.
cover glasses shall be washed gently three times with PBS containing 0,05 % Tween-20 (PBS-T), and the buffer shall be removed completely after the last rinse.
Alternatívne môžu byť použité iné neutralizačné testy s podobnou preukázanou účinnosťou.
The cells shall subsequently be incubated for one hour at 37 °C with fluorescein isothiocyanate (FITC) — or tetramethylrhodamine-5-(and-6-) isothiocyanate (TRITC)-conjugated antibodies against mouse immunoglobulin used as the primary antibody, diluted according to the supplier instructions, washed again in PBS-T, and dried.
Príprava vírusovej RNA
Stained cultures shall be mounted onto glass slides using glycerol saline and examined under incident ultraviolet (UV) light.
Celá práca s RNA sa vykonáva na ľade a s použitím rukavíc.
Use 10 × or 12 × eyepieces and a × 25 or × 40 objective lens with numerical apertures > 0,7 and > 1,3 respectively.
RNA sa extrahuje fenol-chloroformovou metódou alebo pomocou centrifugačných kolón s afinitou k RNA, podľa pokynov výrobcu.
Other IF techniques, with regard to cell cultures, fixation and antibodies of reference quality, of proven similar efficacy may be used instead.
Môžu sa použiť komerčne dostupné súpravy na extrakciu RNA, ktorými sa získa kvalitná RNA vhodná na použitie s protokolmi RT-PCR, ktoré sú podrobne opísané v nasledujúcich bodoch.
Neutralisation
RNA sa resuspenduje v destilovanej vode bez RNázy (konkrétne vode ošetrenej 0,1 % dietyl pyrokarbonátom), alebo vo vhodnom elučnom tlmivom roztoku.
Aliquots of a minimum of two supernatant dilutions shall be mixed and incubated for 60 minutes at 15 °C with equal parts of the following reagents separately:
priamy primer 5′-AGA-GAT-CCC-TAC-ACC-AGA-GAC-3′;
serum containing group specific antibody against VHSV at a 1:50 (vol:vol) dilution;
reverzný primer 5′-GGT-GGT-GTT-GTT-TCC-GTG-CAA-3′.
serum containing group specific antibody against IHNV at a 1:50 (vol:vol) dilution;
Použijú sa tieto cykly (jednokroková RT-PCR): 1 cyklus: 50 °C počas 30 minút; 1 cyklus: 95 °C počas 2 minút; 30 cyklov: 95 °C počas 30 sekúnd, 50 °C počas 30 sekúnd, 72 °C počas 60 sekúnd; 1 cyklus: 72 °C počas 7 minút s namočením pri 4 °C.
pool of antisera against the indigenous serotypes of IPNV at a 1:50 (vol:vol) dilution;
Na zistenie VHSV sa použijú tieto primery:
medium alone (positive control).
VN priamy 5′-ATG-GAA-GGA-GGA-ATT-CGT-GAA-GCG-3′;
From each virus supernatant-serum mixture, at least two cell cultures shall be inoculated with 50 μl each and then incubated at 15 °C.
VN reverzný 5′-GCG-GTG-AAG-TGC-TGC-AGT-TCC-C-3′.
The development of CPE shall be checked as described in point I.5.4.
Použijú sa tieto cykly (jednokroková RT-PCR): 50 °C počas 30 minút, 95 °C počas 15 minút, 35 cyklov pri 94 °C počas 30 sekúnd, 55 °C počas 30 sekúnd a 68 °C počas 60 sekúnd.
VHSV strains and isolates that do not react in neutralisation tests shall be identified by IF or ELISA.
Následne prebieha reakcia pri teplote 68 °C počas 7 minút.
Other neutralisation tests of proven similar efficacy may be used instead.
Množstvo a špecificita RT-PCR reakcií sa hodnotí pomocou gélovej elektroforézy v 1,5 % agarózovom géli s etídium-bromidom a s pozorovaním pomocou UV transiluminácie.
RT-PCR/RT-qPCR
Pri IHNV možno pozorovať PCR amplikón s veľkosťou 693 bp.
Preparation of viral RNA
V prípade VHSV ide o veľkosť 505 bp.
All work with RNA shall be performed on ice, using gloves.
Výsledky PCR sa môžu líšiť v závislosti od podmienok, v ktorých sa vykonáva, konkrétne môže byť v závislosti od používaného termocykléra potrebné optimalizovať termálne protokoly.
RNA shall be extracted using the phenol-chloroform method or by RNA affinity spin columns, according to the manufacturer's instructions.
Okrem toho môže dôjsť k falošne pozitívnym výsledkom z dôvodu nesprávnej anelácie primeru alebo kontaminácie laboratória.
Commercially available RNA extraction kits that will produce high quality RNA suitable for use with the RT-PCR protocols detailed in the points below may be used.
S cieľom vyhnúť sa akejkoľvek pochybnosti sa preto použijú adekvátne pozitívne a negatívne kontrolné vzorky a sekvenované amplikóny.
RNA shall be re-suspended in distilled RNAse-free water, (namely water treated with 0,1 % diethyl pyrocarbonate) or an appropriate elution buffer.
V prípade primerov VHSV treba venovať osobitnú pozornosť používaniu buniek BF-2, keďže primery môžu reagovať s DNA/RNA tejto bunkovej línie a spôsobiť falošne pozitívne výsledky podobnej veľkosti.
The following primers shall be used for detection of IHNV:
Pri testovaní supernatantu z buniek BF-2 sa sekvenujú všetky fragmenty amplifikované pomocou PCR.
Forward Primer 5′-AGA-GAT-CCC-TAC-ACC-AGA-GAC-3′;
RT-qPCR v prípade VHSV
Reverse Primer 5′-GGT-GGT-GTT-GTT-TCC-GTG-CAA-3′.
V prípade VHSV sa amplifikácia vykonáva s použitím týchto primerov a tejto sondy:
The following cycles shall be used (one-step RT-PCR): 1 cycle: 50 °C for 30 minutes; 1 cycle: 95 °C for 2 minutes; 30 cycles: 95 °C for 30 seconds, 50 °C for 30 seconds, 72 °C for 60 seconds; 1 cycle: 72 °C for 7 minutes and soak at 4 °C.
Priamy primer: 5′-AAA-CTC-GCA-GGA-TGT-GTG-CGT-CC-3′;
The following primers shall be used for detection of VHSV:
Reverzný primer: 5′-TCT-GCG-ATC-TCA-GTC-AGG-ATG-AA-3′;
VN For 5′-ATG-GAA-GGA-GGA-ATT-CGT-GAA-GCG-3′;
a sonda: 5′-FAM-TAG-AGG-GCC-TTG-GTG-ATC-TTC-TG-BHQ1.
VN Rev 5′-GCG-GTG-AAG-TGC-TGC-AGT-TCC-C-3′.
Jednokroková RT-qPCR:
The following cycles shall be used (one-step RT-PCR): 50 °C for 30 minutes, 95 °C for 15 minutes, 35 cycles at 94 °C for 30 seconds, 55 °C for 30 seconds, and 68 °C for 60 seconds.
Každý beh musí obsahovať negatívne vzorové kontrolné vzorky a pozitívne kontrolné vzorky.
Subsequently, the reaction shall be held at 68 °C for 7 minutes.
Podmienky cyklovania: 50 °C počas 30 minút, 95 °C počas 15 minút, 40 cyklov pri 94 °C počas 15 sekúnd, 60 °C počas 40 sekúnd a 72 °C počas 20 sekúnd; v prípade potreby sa tieto podmienky upravia.
Quantity and specificity of the RT-PCR reactions shall be evaluated by gel electrophoresis in 1,5 % agarose gel with ethidium bromide and observed using UV transillumination.
Namiesto toho môžu byť použité iné verzie RT-PCR alebo RT-qPCR s podobnou preukázanou účinnosťou.
A 693 bp PCR amplicon may be observed for IHNV.
RT-qPCR v prípade IHNV
For VHSV, the size shall be 505 bp.
V prípade IHNV sa amplifikácia vykonáva s použitím týchto primerov a sondy:
The results of the PCR may vary depending on the conditions under which it is performed, namely the thermal protocols might need optimisation, depending on the thermal cycler in use.
Priamy primer: 5′- AGA-GCC-AAG-GCA-CTG-TGC-G-3′;
Furthermore, false-positive results may occur because of false primer annealing or laboratory contamination.
Reverzný primer: 5′- TTCTTTGCGGCTTGGTTGA – 3′;
Adequate positive and negative controls and sequence amplicons shall therefore be included to avoid any doubts.
a sonda: 5′ 6FAM-TGAGACTGAGCGGGACA-NFQ/MGB.
For the VHSV primers, special care shall be taken when using BF-2 cells, as the primers may react with the cell line DNA/RNA producing false-positive results of similar size.
Dvojkroková RT-qPCR:
When testing supernatant from BF-2 cells, any amplified PCR fragments shall be sequenced.
Keďže táto skúška závisí od dvojkrokovej amplifikácie, je potrebné venovať osobitnú pozornosť zaobchádzaniu so skúmavkami medzi jednotlivými reakciami, aby sa predišlo kontaminácii.
RT-qPCR for VHSV
Podmienky cyklovania (po kroku RT): 50 °C počas 2 minút, 95 °C počas 10 minút, potom nasleduje 40 cyklov pri 95 °C počas 15 sekúnd a 60 °C počas 1 minúty; v prípade potreby sa tieto podmienky upravia.
For VHSV, amplification shall be performed using the following primers and probe:
Podrobné diagnostické metódy a postupy na potvrdenie alebo vylúčenie podozrenia na VHS alebo IHN alebo oboch chorôb pri podozrení na ohniská
Forward primer: 5′-AAA-CTC-GCA-GGA-TGT-GTG-CGT-CC-3′;
Ak sa na potvrdenie alebo vylúčenie prítomnosti IHN alebo VHS alebo oboch chorôb vyžaduje laboratórne vyšetrenie v súlade s článkom 57 písm. b) smernice 2006/88/ES s použitím diagnostických metód uvedených v bode II.3 časti 1 prílohy I, uplatňujú sa tieto podrobné diagnostické metódy a postupy:
Reverse primer: 5′-TCT-GCG-ATC-TCA-GTC-AGG-ATG-AA-3′;
konvenčná izolácia vírusu s následnou sérumneutralizačnou, imunochemickou alebo molekulárnou identifikáciou vírusu;
and probe: 5′-FAM-TAG-AGG-GCC-TTG-GTG-ATC-TTC-TG-BHQ1.
detekcia vírusu prostredníctvom RT-PCR alebo RT-qPCR;
One-step RT-qPCR:
iné diagnostické techniky, ako sú IFAT, ELISA, RT-PCR, IHC.
Negative template controls and positive controls shall be included on each plate run.
Konvenčná izolácia vírusu s následnou identifikáciou vírusu
Cycling conditions: 50 °C for 30 minutes, 95 °C for 15 minutes, 40 cycles of 94 °C for 15 seconds, 60 °C for 40 seconds, 72 °C for 20 seconds; adjust if necessary.
Výber vzoriek
Other RT-PCR or RT-qPCR versions of proven similar efficacy may be used instead.
Na vyšetrenie sa vyberie aspoň 10 rýb, ktoré majú typické príznaky IHN alebo VHS.
RT-qPCR for IHNV
Pri príprave a zasielaní na účely konvenčnej izolácie vírusu sa dodržiavajú metódy a postupy uvedené v bode I.2.
For IHNV, amplification shall be performed using the following primers and probe:
Pri odbere doplnkového materiálu na účely konvenčnej izolácie vírusu sa dodržiavajú metódy a postupy uvedené v bode I.3.
Forward primer: 5′- AGA-GCC-AAG-GCA-CTG-TGC-G-3′;
Príprava vzoriek na vyšetrenie bunkovej kultúry
Reverse primer: 5′- TTCTTTGCGGCTTGGTTGA - 3′;
Pri príprave vzoriek na vyšetrenie bunkovej kultúry na účely konvenčnej izolácie vírusu sa dodržiavajú metódy a postupy uvedené v bode I.4.
and probe: 5′ 6FAM-TGAGACTGAGCGGGACA-NFQ/MGB.
Pri virologickom vyšetrení na účely konvenčnej izolácie vírusu sa dodržiavajú metódy a postupy uvedené v bode I.5.
Two-step RT-qPCR:
Pri identifikácii vírusu na účely konvenčnej izolácie vírusu sa dodržiavajú metódy a postupy uvedené v bode I.6.
As the following assay depends on a two-step amplification, extra care shall be taken when handling the tubes from one reaction to the other in order to prevent contamination.
Detekcia vírusu prostredníctvom RT-qPCR
Cycling conditions (after RT-step): 50 °C for 2 minutes, 95 °C for 10 minutes, followed by 40 cycles of 95 °C for 15 seconds and 60 °C for 1 minutes; adjustments shall be made if necessary.
Pri výbere vzoriek na účely detekcie vírusu prostredníctvom RT-qPCR sa dodržiavajú metódy a postupy uvedené v bode I.1.2.
Detailed diagnostic methods and procedures for the confirmation of or to rule out the suspicion of VHS or IHN or both in suspected outbreaks
Pri príprave a zasielaní na účely detekcie vírusu prostredníctvom RT-qPCR sa dodržiavajú metódy a postupy uvedené v bode I.2.
When a laboratory examination is required to confirm or rule out the presence of IHN or VHS or both in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC using the diagnostic methods set out in point II.3 of Part 1 of Annex I, the following detailed diagnostic methods and procedures shall apply:
Pri odbere doplnkového diagnostického materiálu na účely detekcie vírusu prostredníctvom RT-qPCR sa dodržiavajú metódy a postupy uvedené v bode I.3.
conventional virus isolation with subsequent seroneutralisation, immune-chemical or molecular virus identification;
Príprava vzoriek na RT-qPCR
virus detection by RT-PCR or RT-qPCR;
Pri príprave vzoriek na účely detekcie vírusu prostredníctvom RT-qPCR sa dodržiavajú metódy a postupy uvedené v bode I.6.4.1.
other diagnostic techniques such as IFAT, ELISA, RT-PCR, IHC.
Pri detekcii vírusu prostredníctvom RT-qPCR sa dodržiavajú metódy a postupy uvedené v bodoch I.6.4.1, I.6.4.3 a I.6.4.4.
Conventional virus isolation with subsequent virus identification
Iné diagnostické techniky
Selection of samples
Supernatant pripravený podľa opisu v bode I.4.3. sa môže predložiť na test ELISA, nepriamy imunofluorescenčný test (IFAT) alebo na RT-PCR v súlade s bodom I.6.1, bodom I.6.2 alebo bodom I.6.4 (v uvedenom poradí).
At least 10 fish showing typical signs of IHN or VHS shall be selected for examination.
Tkanivový materiál môže byť podrobený iným diagnostickým technikám, ako je IFAT na rezoch zmrazeného materiálu, imunohistochémia tkaninového materiálu fixovaného formalínom.
The preparation and shipment for the purpose of conventional virus isolation shall follow the methods and procedures laid down in point I.2.
Uvedené rýchle techniky sa doplnia virologickým vyšetrením v súlade buď s bodom II písm. a), alebo bodom II písm. b), do 48 hodín po odbere vzoriek, ak:
The collection of supplementary material for the purpose of conventional virus isolation shall follow the methods and procedures laid down in point I.3.
je zistený negatívny výsledok; alebo
Preparation of samples for cell culture examination
je zistený pozitívny výsledok pri materiáli, ktorý predstavuje prvý prípad IHN alebo VHS.
The preparation of samples for cell culture examination for the purpose of conventional virus isolation shall follow the methods and procedures laid down in point I.4.
Postup titrácie na overenie vnímavosti bunkových kultúr na infekciu
The virological examination for the purpose of conventional virus isolation shall follow the methods and procedures laid down in point I.5.
Ak sa vykoná titrácia na overenie vnímavosti bunkových kultúr na infekciu, ako je uvedené v bode I.5.3, dodržiavajú sa postupy uvedené v nasledujúcich odsekoch tohto bodu.
The virus identification for the purpose of conventional virus isolation shall follow the methods and procedures laid down in point I.6.
Použijú sa aspoň dva izoláty VHSV a jeden izolát IHNV.
Virus detection by RT-qPCR
V izolátoch musí byť zastúpená hlavná skupina vírusov v Európskej únii, konkrétne v prípade VHSV jeden patogénny izolát pstruha dúhového v sladkej vode a jeden patogénny izolát kambaly veľkej v slanej vode a v prípade IHNV jeden patogénny kmeň pstruha dúhového z Európskej únie.
The selection of samples for the purpose of virus detection by RT-qPCR shall follow the methods and procedures laid down in point I.1.2.
Použijú sa dobre definované izoláty z členských štátov.
The preparation and shipment for the purpose of virus detection by RT-qPCR shall follow the methods and procedures laid down in point I.2.
Dávky vírusov s nízkymi číslami pasáže sa množia v bankách s bunkovými kultúrami na bunkách BF-2 alebo RTG-2 v prípade VHSV a na bunkách EPC alebo FHM v prípade IHNV.
The collection of supplementary diagnostic material for the purpose of virus detection by RT-qPCR shall follow the methods and procedures laid down in point I.3.
Použije sa médium na kultiváciu buniek s aspoň 10 % sérom.
Sample preparation for RT-qPCR
Na naočkovanie sa použije nízke MOI (< 1).
The sample preparation for the purpose of virus detection by RT-qPCR shall follow the methods and procedures laid down in point I.6.4.1.
V prípade celkového CPE sa vírus získava l5-minútovou centrifugáciou supernatantu bunkovej kultúry pri 2000 × g počas 15 minút, podrobí sa sterilizačnej filtrácii pomocou membránového filtra (0,45 μm) a distribuuje v označených kryoskúmavkách.
The virus detection by RT-qPCR shall follow the methods and procedures laid down in points I.6.4.1, I.6.4.3 and I.6.4.4.
Vírus sa uchováva pri teplote – 80 °C. Týždeň po zmrazení sa tri vialky s každým vírusom nechajú rozmraziť v studenej vode a titrujú sa na svojich príslušných bunkových líniách.
Other diagnostic techniques
Aspoň každých šesť mesiacov alebo ak existuje podozrenie na zníženie vnímavosti bunkovej línie, sa každý izolát vírusu rozmrazí a titruje.
Supernatant prepared as described in point I.4.3 may be submitted to ELISA, Indirect fluorescent antibody test (IFAT), or RT-PCR in accordance with point I.6.1, point I.6.2 or point I.6.4 respectively.
Postupy titrácie musia byť podrobne opísané a vždy musí byť použitý rovnaký postup.
Tissue material may be subjected to other diagnostic techniques, such as IFAT on frozen sections, immunohistochemistry on formalin fixed tissue material.
Titrácia s riedením až do konečného bodu zahŕňa najmenej šesť opakovaní každého kroku riedenia.
Those rapid techniques shall be supplemented with a virological examination in accordance with either point II(a) or point II(b) within 48 hours after sampling, if:
Titre sa porovnajú s predtým získanými titrami.
a negative result is obtained; or
ČASŤ 2 PODROBNÉ DIAGNOSTICKÉ METÓDY A POSTUPY V PRÍPADE DOHĽADU NAD HERPESVIRÓZOU KAPROV KOI (KHVD) A V PRÍPADE JEJ POTVRDENIA
a positive result is obtained with material representing the first case of IHN or VHS.
Ak sa na na potvrdenie prítomnosti KHVD alebo na vylúčenie podozrenia na KHVD vyžaduje laboratórne vyšetrenie v súlade s článkom 57 písm. b) smernice 2006/88/ES s použitím diagnostických metód uvedených v oddiele III časti 2 prílohy I, uplatňujú sa tieto podrobné diagnostické metódy a postupy uvedené v bodoch I.1 – I.2 tejto časti:
Low MOI for inoculation (< 1) shall be used.
Môžu sa použiť komerčne dostupné súpravy na extrakciu DNA, ktorými sa získava kvalitná DNA vhodná na použitie s protokolmi PCR uvedenými v bode I.2.
1 week after freezing, three replicate vials with each virus shall be thawed under cold water and titrated on their respective cell lines.
Na detekciu KHV prostredníctvom qPCR sa použije táto skúška qPCR:
At least every 6 months, or if it is suspected that the susceptibility of a cell line has decreased, each virus isolate shall be thawed and titrated.
Priamy primer (KHV-86f): 5′- GACGCCGGAGACCTTGTG -3′;
Titration procedures must be described in detail and the same procedure followed each time.
Reverzný primer (KHV-163r): 5′- CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT -3′;
Titration by end point dilution shall include at least six replicates at each dilution step.
a sonda (KHV-109p): 5′-FAM- CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG -3′.
The titres shall be compared with previously obtained titres.
Podmienky cyklovania: jeden cyklus pri 95 °C počas 15 minút, po ktorom nasleduje 40 cyklov pri 94 °C počas 15 sekúnd a 60 °C počas 60 sekúnd.
If the titre of any of the three virus isolates drops by a factor of 2 logs or more, compared with the initial titre, the cell line shall no longer be used for surveillance purposes.
Alternatívne však môžu byť použité iné verzie qPCR s podobnou preukázanou účinnosťou.
If different cell lines are kept in the laboratory each line shall be examined separately.
Konvenčné PCR na detekciu KHV
Records shall be kept for a period of at least 10 years.
Použije sa skúška opísaná v tomto bode zameraná na gén pre tymidínkinázu (TK) KHV.
DETAILED DIAGNOSTIC METHODS AND PROCEDURES FOR THE SURVEILLANCE AND CONFIRMATION OF KHV DISEASE (KHVD)
Namiesto nej sa môžu použiť iné skúšky PCR s preukázanou podobnou citlivosťou a osobitosťami, aké má opísaná skúška.
I. Detailed diagnostic methods and procedures for the confirmation of the presence of or to rule out the suspicion of KHVD
Priamy primer (KHV-TKf): 5′-GGGTTACCTGTAC GAG-3′;
When a laboratory examination is required for the purpose of confirmation of the presence of or to rule out the suspicion of KHVD in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC, using the diagnostic methods set out in Section III of Part 2 of Annex I, the detailed diagnostic methods and procedures set out in points I.1 – I.2 of this Part shall apply.
Reverzný primer (KHV-TKr): 5′-CACCCAGTAGATTA TGC-3′.
Preparation of samples from fish
Podmienky cyklovania: jeden cyklus pri 95 °C počas 5 minút, po ktorom nasleduje 35 cyklov pri 95 °C počas 30 sekúnd, 52 °C počas 30 sekúnd, 72 °C počas jednej minúty a jeden cyklus pri 72 °C počas 10 minút.
For diagnostic purposes the fish (sent alive or killed and packed separately in sealed aseptic containers) or alternatively frozen organs or organ pieces preserved in 80 % to absolute ethanol or viral transport medium (to be processed within 48 hours after collection) may be used for testing with conventional PCR or qPCR based methods.
Veľkosť produktu by mala byť 409 bp.
For the detection of KHV, gill and kidney shall be collected; in addition spleen, encephalon and intestine may be included in an additional separated sample.
Okrem toho môžu nastať falošne pozitívne výsledky z dôvodu nesprávnej teplotnej hybridizácie primeru alebo kontaminácie.
In acute cases, tissue material of up to five fish may be pooled.
Namiesto nej však môžu byť použité iné verzie PCR s preukázanou podobnou účinnosťou.
Furthermore, non-lethal samples such as blood, gill swabs, gill biopsy, mucus scrape may be used in certain cases (namely very valuable fish may be used in the case of the suspicion of the presence of KHV).
Prvé zistenie v oblasti sa potvrdí sekvenovaním alebo sa pošle na okamžitú identifikáciu do národného referenčného laboratória alebo referenčného laboratória EÚ pre choroby rýb uvedeného v prílohe VI k smernici 2006/88/ES.
DNA extraction
Podrobné diagnostické metódy a postupy dohľadu v prípade KHVD
DNA shall be extracted in accordance with standard procedures.
Pri výkone odberu vzoriek a laboratórneho vyšetrenia na účely získania alebo udržania určitých zdravotných štatútov v súvislosti s KHVD podľa oddielu I časti 2 prílohy I s použitím diagnostických metód stanovených v oddieloch II alebo III časti 2 uvedenej prílohy sa uplatňujú podrobné diagnostické metódy a postupy uvedené v nasledujúcich bodoch II.1 a II.2 tejto časti.
The commercially available DNA extraction kits that produce high quality DNA suitable for use with the PCR protocols referred to in point I.2 may be used.
Ak je to možné, odoberú sa vzorky rýb, ktoré boli dlhší čas držané v teplotnom rozsahu priaznivom pre vírus (konkrétne dva až tri týždne pri teplote 15 °C až 26 °C).
Agent detection and identification by Polymerase chain reaction (PCR) based methods
Ak je to možné, vzorky sa odoberú 24 hodín, ale nie neskôr ako 72 hodín, po postupoch riadenia, ktoré môžu vírus reaktivovať pri rybách so štatútom prenášača, ako je odchyt rýb do sietí alebo doprava, s cieľom zvýšiť šancu detekcie KHV.
I.2.1. qPCR for KHV detection
Na účely dohľadu nad KHVD sa môžu na testovanie metódami založenými na PCR zasielať ryby živé alebo zabité a balené oddelene v zapečatených aseptických nádobách alebo mrazené orgány, alebo časti orgánov konzervované v 80 % až 100 % alkohole alebo vo vírusovom transportnom médiu (je potrebné ich spracovať do 48 hodín po odbere).
For qPCR detection of KHV, the following qPCR assay shall be used:
Pri dohľade nad KHVD sa odoberú žiabre a obličky.
Forward primer (KHV-86f): 5′- GACGCCGGAGACCTTGTG -3′;
Na účely dohľadu nad KHVD je podľa možností potrebné čo najviac sa vyhýbať spájaniu vzoriek.
Reverse primer (KHV-163r): 5′- CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT -3′;
Ak je spájanie nevyhnutné, môže sa spojiť tkanivový materiál najviac z dvoch rýb.
and probe (KHV-109p): 5′-FAM- CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG -3′.
Väčšie vzorky sa homogenizujú v trecej miske a roztieradle alebo v homogenizátori stomacher a čiastkové vzorky sa získajú na extrakciu DNA pred objasnením.
Cycling conditions: one cycle of 95 °C at 15 minutes, followed by 40 cycles of 94 °C at 15 seconds and 60 °C for 60 seconds.
Alternatívnym spôsobom môže byť odobranie čiastkových vzoriek z každého tkaniva zaradeného do vzorky a ich umiestnenie v skúmavkach na lýzu.
However, other qPCR versions of proven similar efficacy may be used instead.
Môžu sa použiť komerčne dostupné súpravy na extrakciu DNA, ktorými sa získava kvalitná DNA vhodná na použitie s protokolmi PCR, ktoré sú uvedené v bode II.2.
Conventional PCR for KHV detection
Prijateľný pomer medzi tkanivom a médiom je 1:9 w/v.
The assay described in this point targeting the Thymine kinase (TK) gene of KHV shall be used.
Do testov sa zahrnie 20 až 25 mg tkanivového materiálu.
However, other PCR assays with demonstrated similar sensitivities and specificities to the described assay may be used instead.
Dohľad nad KHVD prostredníctvom metód založených na PCR
Forward primer (KHV-TKf): 5′-GGGTTACCTGTAC GAG-3′;
Na účely dohľadu nad KHV sa použije qPCR.