natgillin/translations-raw huggingface dataset:
The conjugate used in this method is a horseradish peroxidase anti-horse gamma-globulin reacting with the serum of horses, mules and donkeys.
Odstráňte blokujúci roztok a jemne pritlačte platničky na savý materiál.
The method described by Maree & Paweska (2005) [2] uses protein G as conjugate that also reacts with zebra serum.
Skúšobné vzorky
The antigen may be provided by the Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA), Spain, within 4 to 6 months of request.
Testované vzorky séra, pozitívne a negatívne kontrolné séra sa rozpustia 1:25 v PBS + 5 % (w/v) odstredeného mlieka + 0,05 % (v/v) Tween 20, 100 μl/jamku.
Test procedure
Inkubujte hodinu pri teplote 37 °C.
Solid phase
Pri titrácii urobte dvojnásobné riedenie 1: 25 (100 μl/jamku), jedno sérum na jeden stĺpec platničky, a to isté vykonajte s pozitívnou a negatívnou kontrolou.
Coat ELISA plates with recombinant AHSV-4 VP7 diluted in carbonate/bicarbonate buffer, pH 9,6.
Konjugácia
Incubate plates overnight at 4 °C.
Dajte 100 μl/jamku chrenovej peroxidázy (HRP) konjugovanej s anti-konským gama-globulínom rozpusteným v PBS + 5 % mlieku + 0,05 % Tween 20, pH 7,2.
Wash the plates five times with distilled water containing 0,01 % (v/v) Tween 20 (washing solution).
Chromogén/substrát
Gently tap the plates onto absorbent material to remove any residual wash.
Pridajte 200 μl/jamku chromogénového/substrátového roztoku (10 ml 80,6 mM DMAB (dimetyl aminobenzaldehyd) + 10 ml 1,56 mM MBTH (3-metyl-2-benzo-tiazolin hydrazon hydrochlorid) + 5 μl H2O2).
Block the plates with phosphate buffered saline (PBS) pH 7,2 + 5 % (w/v) skimmed milk (Nestlé Dry Skim MilkTM), 200 μl/well, for 1 hour at 37 °C.
Vyvolávanie farby sa zastaví pridaním 50 μl 3N H2SO4 po približne 5 až 10 minútach (predtým, ako sa začne sfarbovať negatívna kontrola).
Remove the blocking solution and gently tap the plates onto absorbent material.
Tiež je možné použiť aj iné chromogény ako ABTS (2,2′-Azino-bis-[3-etylbenzotiazolin-6- kyselina sulfónová], TMB (tetrametyl benzidín) alebo OPD (orto-fenyldiamín).
Test samples
Odčítajte pri 600 nm (alebo 620 nm).
Serum samples to be tested, and positive and negative control sera, are diluted 1 in 25 in PBS + 5 % (w/v) skimmed milk + 0,05 % (v/v) Tween 20, 100 μl per well.
Interpretácia výsledkov
Incubate for 1 hour at 37 °C.
Vypočítajte medznú hodnotu pripočítaním 0,06 k hodnote negatívnej kontroly (0,06 je štandardná odchýlka odvodená zo skupiny 30 negatívnych sér).
For titration, make a twofold dilution series from 1 in 25 (100 μl/well), one serum per plate column, and do the same with positive and negative controls.
Skúšobné vzorky, pri ktorých sa uvádzajú absorpčné hodnoty nižšie než je medzná hodnota, sa považujú za negatívne.
Conjugate
Skúšobné vzorky, pri ktorých sa uvádzajú absorpčné hodnoty vyššie než je medzná hodnota + 0,15, sa považujú za pozitívne.
Dispense 100 μl/well of horseradish-peroxidase (HRP) -conjugated anti-horse gamma-globulin diluted in PBS + 5 % milk + 0,05 % Tween 20, pH 7,2.
Skúšobné vzorky, pri ktorých sa uvádzajú prostredné absorpčné hodnoty, sú nerozhodné a na potvrdenie výsledku je potrebné použiť inú metódu.
Chromogen/Substrate
Blokujúca ELISA na zistenie protilátok proti vírusu afrického moru koní (AHSV)
Add 200 μl/well of chromogen/substrate solution (10 ml of 80,6 mM DMAB (dimethyl aminobenzaldehyde) + 10 ml of 1,56 mM MBTH (3-methyl-2-benzo-thiazoline hydrazone hydrochlorid) + 5 μl H2O2).
Kompetitívna blokujúca ELISA je určená na zisťovanie špecifických protilátok AHSV v sérach akýchkoľvek zvierat čeľade koňovité, t. j. koní, somárov, zebier a ich krížencov, ktorou sa zabraňuje problému špecifickosti, ku ktorej občasne dochádza pri použití testu nepriama ELISA.
Colour development is stopped by adding 50 μl of 3N H2SO4 after approximately 5 to 10 minutes (before the negative control begins to be coloured).
Princípom skúšky je blokovanie reakcie medzi rekombinantným proteínom VP7 absorbovaným do platničky ELISA a konjugovanou špecifickou monoklonálnou protilátkou AHS-VP7.
Other chromogens such as ABTS (2,2′-Azino-bis-[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid]), TMB (tetramethyl benzidine), or OPD (ortho-phenyldiamine) can also be used.
Protilátka v skúšobnom sére zablokuje reakciu medzi antigénom a monoklonálnou protilátkou, čo vyústi do zníženia zafarbenia.
Read the plates at 600 nm (or 620 nm).
Keďže monoklonálna protilátka je tiež namierená proti VP7, daná skúška poskytne vysokú hladinu citlivosti a osobitosti.
Interpretation of the results
Kompetitívna blokujúca ELISA je komerčne dostupná.
Calculate the cut-off value by adding 0,06 to the value of the negative control (0,06 is the standard deviation derived with a group of 30 negative sera).
Fáza tuhosti
Test samples giving absorbance values lower than the cut-off are regarded as negative.
Pokryte platničky ELISA rekombinantým AHSV-4 VP7 (50 – 100 ng) rozpusteným v karbonátovom/bikarbonátovom tlmivom roztoku, pH 9,6.
Test samples giving absorbance values greater than the cut-off + 0,15 are regarded as positive.
Inkubujte cez noc pri teplote 4 °C.
Test samples giving intermediate absorbance values are considered to be inconclusive and a second technique must be employed to confirm the result.
Platničky trikrát premyte vo fosfátovom soľnom tlmivom roztoku (PBS) 0,1 × obsahujúcom 0,135 M NaCl a 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST).
Blocking ELISA for the detection of antibodies to African horse sickness virus (AHSV)
Na odstránenie zvyšnej vody platničky jemne pritlačte na savý materiál.
The competitive blocking ELISA is designed to detect specific AHSV antibodies in sera from animals of any equine species, i.e. horses, donkeys, zebra and their crosses, preventing the problem of specificity experienced occasionally using the indirect ELISAs.
Skúšobné vzorky a kontroly
The principle of the test is the blocking of the reaction between the recombinant VP7 protein absorbed to the ELISA plate and a conjugated AHS-VP7 specific monoclonal antibody (Mab).
Testované vzorky séra a pozitívne a negatívne kontrolné séra sa rozpustia v pomere 1:5 v rozpúšťadle obsahujúcom 0,35 M NaCl, 0,05 % (v/v) Tween 20 a 0,1 % Kathon, 100 μl/jamku.
Antibody in the test sera will block the reaction between the antigen and the Mab resulting in a reduction in colour.
Pri titrácii urobte dvojnásobné riedenie testovaného séra od 1:10 do 1:280 v 8 jamkách (100 μl/jamku), jedno sérum na jeden stĺpec platničky, a to isté vykonajte s pozitívnou a negatívnou kontrolou.
Because the Mab is directed against the VP7, the assay will give a high level of sensitivity and specificity.
Inkubujte hodinu pri teplote 37 °C.
The competitive blocking ELISA is commercially available.
Platničky päťkrát premyte vo fosfátovom soľnom tlmivom roztoku (PBS) 0,1 × obsahujúcom 0,135 M NaCl a 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST).
Solid Phase
Dajte 100 μl/jamku monoklonálnej protilátky anti-VP7 konjugovanej chrenovou peroxidázou.
Coat ELISA plates with 50-100 ng of recombinant AHSV-4 VP7 diluted in carbonate/bicarbonate buffer, pH 9,6.
Táto monoklonálna protilátka bola vopred rozpustená v pomere 1:5000 až 1:15000 v roztoku 1:1 StabiliZyme Select® Stabilizer (SurModics; odkaz: SZ03) v destilovanej vode.
Incubate overnight at 4 °C.
Inkubujte 30 minút pri teplote 37 °C.
Wash the plates three times with phosphate buffered saline (PBS) 0,1× containing 0,135 M NaCl and 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST).
Odčítanie
Gently tap the plates on to absorbent material to remove any residual wash.
Odčítajte pri 405 nm v snímači ELISA.
Test samples and controls
Stanovte blokujúce percento (BP) každej vzorky pomocou nasledujúceho vzorca, kde „Abs“ znamená protilátky:
Serum samples to be tested, and positive and negative control sera, are diluted 1 in 5 in diluent containing 0,35 M NaCl, 0,05 % (v/v) Tween 20 and 0,1 % Kathon, 100 μl per well.
Abskontrolné
For titration, make a twofold dilution series of the test sera from 1 in 10 to 1 in 280 across 8 wells (100 μl/well), one serum per plate column, and do the same with positive and negative controls.
Absvzorka
Incubate for 1 hour at 37 °C.
Vzorky vykazujúce hodnotu BP vyššiu ako 50 % by sa mali považovať za pozitívne pre protilátky AHSV.
Wash the plates five times with phosphate buffered saline (PBS) 0,1× containing 0,135 M NaCl and 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST).
Vzorky vykazujúce hodnotu BP nižšiu ako 45 % by sa mali považovať za negatívne pre protilátky AHSV.
Dispense 100 μl/well of horseradish peroxidase-conjugated Mab anti-VP7.
Vzorky vykazujúce hodnotu BP medzi 45 % a 50 % by sa mali považovať za nerozhodné a musia sa nanovo otestovať.
In advance, this Mab has been diluted 1/5000-1/15000 in a 1/1 solution of StabiliZyme Select® Stabilizer (SurModics.
Ak bude výsledok opäť nerozhodný, zvieratá by sa mali nanovo otestovať na vzorkách odobratých nie skôr ako dva týždne po odobratí vzorky, ktorá sa považovala za nerozhodnú.
Add 100 μl/well chromogen/substrate solution, i.e. 1 ml of ABTS (2,2′-Azino-bis-[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid]) 5 mg/ml + 9 ml of substrate buffer (0,1 M Phosphate-Citrate buffer of pH 4 containing 0,03 % H2O2), and incubate for 10 minutes at room temperature.
Polymerázová reťazová reakcia spojená s reverznou transkripciou v reálnom čase
Colour development is stopped by adding 100 μl/well of 2 % (w/v) SDS (sodium dodecyl sulphate).
Pri testoch na identifikáciu agensa na základe metód nukleových kyselín sa musia zistiť referenčné kmene z deviatich vírusových sérotypov AHSV.
Reading
Metóda opísaná v bode 2.1. je založená na kapitole 2.5.1. oddiele B bode 1.2.
Read at 405 nm in an ELISA reader.
Príručky diagnostických testov a vakcín pre suchozemské zvieratá, vydanie 2016, ktorú schválilo Svetové združenie zástupcov Svetovej organizácie pre zdravie zvierat (OIE) v máji 2012.
Determine the blocking percentage (BP) of each sample by applying the following formula, where “Abs” stands for antibodies:
Akákoľvek metóda detekcie polymerázovej reťazovej reakcie spojenej s reverznou transkripciou použitá na testovanie vzoriek, buď krvi, alebo sleziny, musí byť v kontexte smernice 2009/156/ES rovnocenná alebo musí presiahnuť citlivosť metodík opísaných v bode 2.
Abscontrol
Inaktivovaný vírus sérotypov 1 až 9 referenčných kmeňov možno získať z referenčného laboratória Európskej únie alebo referenčného laboratória OIE pre africký mor koní, Algete, Španielsko.
Abssample
Extrakcia vírusovej RNA
Samples showing a BP value higher than 50 % should be considered as positive for AHSV antibodies.
Na zaistenie správnej reakcie je potrebné zo vzorky extrahovať RNA AHSV vysokej kvality.
Samples showing a BP value lower than 45 % should be considered as negative for AHSV antibodies.
Extrakciu nukleových kyselín z klinických vzoriek možno vykonať rôznymi internými a komerčne dostupnými metódami.
Samples showing a BP value between 45 % and 50 % should be considered as inconclusive and must be retested.
V rámci komerčných súprav sa na izoláciu RNA používajú rôzne prístupy.
If the result is again inconclusive, the animals should be retested on samples taken not earlier than two weeks after the sample which was considered to be inconclusive was taken.
Väčšina z nich je založená na týchto postupoch:
PART B
fenol-chloroformová extrakcia nukleových kyselín,
Identification of the agent
adsorpcia nukleových kyselín na filtračný systém,
Real-time Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction (rRT-PCR)
adsorpcia nukleových kyselín na systém magnetických lôžok.
Agent identification tests based on nucleic acid methods must detect reference strains from the nine virus serotypes of the AHSV.
Príklad internej extrakcie RNA je uvedený nižšie:
The method described in point 2.1 is based on point 1.2 of Section B in Chapter 2.5.1 of the Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Edition 2016 as adopted by the World Assembly of Delegates of the OIE in May 2012.
1 g vzorky tkaniva sa homogenizuje v 1 ml denaturovaného roztoku (4 M tiokyanatan guanidínu, 25 mM citranu sodného, 0,1 M 2-merkaptoetanolu, 0,5 % sarkosyl).
Any RT-PCR detection method used for the testing of samples, either blood or spleen, in the context of Directive 2009/156/EC must perform equal to or exceed the sensitivity of the methodologies described in point 2.
Do supernatantu sa po centrifugácii pridá 1 μg RNA z kvasiniek, 0,1 ml 2 M citranu sodného s pH 4, 1 ml fenolu a 0,2 ml chloroformu/zmesi izoamylalkoholu (49:1).
Inactivated virus of serotypes 1 to 9 reference strains may be obtained from the European Union Reference Laboratory or the OIE Reference Laboratory for African horse sickness, Algete, Spain.
Suspenzia sa silno pretrasie a schladí na ľade na 15 minút.
Extraction of viral RNA
Po centrifugácii je RNA prítomná vo vodnej fáze extrahovaná fenolom, vyzrážaná etanolom a resuspendovaná v sterilnej vode.
To assure a good reaction it is necessary to extract from the sample an AHSV RNA of high quality.
Postup pri polymerázovej reťazovej reakcii spojenej s reverznou transkripciou v reálnom čase
The extraction of nucleic acids from clinical samples can be performed by a variety of in-house and commercially available methods.
Polymerázová reťazová reakcia spojená s reverznou transkripciou v reálnom čase špecifická pre skupinu podľa Agüero et al., 2008 [3]
Commercial kits use different approaches for RNA isolation.
Polymerázová reťazová reakcia spojená s reverznou transkripciou v reálnom čase špecifická pre skupinu je zameraná na VP7 AHSV a možno ňou zistiť všetky v súčasnosti známe cirkulujúce sérotypy a kmene AHSV.
Most are based on one of the following procedures:
Sekvencie primerov a sond na zistenie prítomnosti vírusov druhov AHSV:
Phenol-chloroform extraction of nucleic acids;
priamy primer 5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′
Adsorption of nucleic acids to filter system;
reverzný primer 5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′
Adsorption of nucleic acids to magnetic beads system.
TaqMan MGB sonda 5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′
An example of an in-house RNA extraction is given below:
Koncentrácia vzorky primeru sa rozpustí na pracovnú koncentráciu 8 μM („pracovná vzorka primeru 8 μM“) a sonda sa rozpustí na pracovnú koncentráciu 50 μM („pracovná vzorka sondy 50 μM“).
1 g of tissue sample is homogenised in 1 ml of denaturing solution (4 M guanidium thiocyanate, 25 mM sodium citrate, 0,1 M 2-mercaptoethanol, 0,5 % sarcosyl).
Je potrebné navrhnúť usporiadanie testovacej platničky, ktorá sa vloží do softvéru v stroji na polymerázovú reťazovú reakciu v reálnom čase.
After centrifugation, 1 μg of yeast RNA, 0,1 ml of 2 M sodium acetate pH 4, 1 ml of phenol and 0,2 ml of chloroform/isoamyl alcohol mixture (49/1) are added to the supernatant.
Použitím daného usporiadania ako vodidla sa 2,5 μl každej pracovnej vzorky primeru 8 μM pridá do každej jamky, ktorá bude obsahovať vzorky RNA, pozitívne a/alebo negatívne kontroly (konečná koncentrácia primeru bude 1 μM v 20 μl zmesi RT-PCR).
The suspension is vigorously shaken and cooled on ice for 15 minutes.
Platnička je uložená na ľade.
After centrifugation, the RNA present in the aqueous phase is phenol extracted, ethanol precipitated and resuspended in sterile water.
S priamym a reverzným primerom sa zmieša 2 μl izolovanej RNA (skúšobné vzorky a pozitívna kontrola) alebo 2 μl vody bez obsahu RNázy v negatívne reagujúcich kontrolách.
Real-time RT-PCR Procedure
Táto zmes sa denaturuje ohrevom na 95 °C počas 5 minút, po čom nasleduje rýchle ochladenie na ľade počas aspoň 5 minút.
This group-specific real-time RT-PCR targets VP7 of the AHSV and is able to detect all known AHSV serotypes and strains currently circulating.
Platnička sa umiestni do termocykléru v reálnom čase naprogramovaného na reverznú transkripciu a zistenie amplifikácie/fluorescencie cDNA.
It has been employed with very good results by the participating national reference laboratories of the European Union Member States in the proficiency tests annually organised by the European Union Reference Laboratory for the period 2009-2015.
Podmienky amplifikácie pozostávajú z kroku prvej reverznej transkripcie pri teplote 48 °C počas 25 minút, po čom nasleduje 10 minút pri teplote 95 °C („hot start“) a 40 cyklov po 15 sekúnd pri teplote 95 °C, 35 sekúnd pri teplote 55 °C a 30 sekúnd pri teplote 72 °C (alebo 40 cyklov pri teplote 97 °C po 2 sekundy a pri teplote 55 °C po 30 sekúnd, ak sa použijú reagenty a termocyklér umožňujúci rýchle reakcie).
Moreover, in an international ring trial organised in 2015 in the framework of the OIE reference laboratories network this protocol was ranked very high amongst others.
Údaje o fluorescencii sa získajú pri konečnom kroku pri teplote 55 °C.
Primer and probe sequences for the detection of AHSV species viruses:
Ak sa získajú atypické amplifikačné krivky, skúška sa nepovažuje za platnú a treba ju zopakovať.
forward Primer 5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′
Vzorky sa považujú za pozitívne v prípade, ak hodnota Ct (číslo cyklu, pri ktorom fluorescencia vytvorená pri reakcii prekročí prahovú hodnotu fluorescencie) bude nižšia než stanovená prahová hodnota Ct (35) v rámci 40 cyklov polymerázovej reťazovej reakcie (Ct ≤ 35) alebo jej rovná.
reverse Primer 5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′
Vzorky sa považujú za nerozhodné v prípade, ak hodnota Ct bude vyššia ako stanovená prahová hodnota Ct (35) v rámci 40 cyklov polymerázovej reťazovej reakcie (Ct ≥ 35).
MGB-TaqMan probe 5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′
Vzorky sa považujú za negatívne v prípade, ak sa získa horizontálna amplifikačná krivka, ktorá neprekročí líniu prahovej hodnoty v rámci 40 cyklov polymerázovej reťazovej reakcie.
Primer stock concentration is diluted to a working concentration of 8 μM (“primer working stock 8 μM”) whereas probe is diluted to a working concentration of 50 μM (“probe working stock 50 μM”).
Polymerázová reťazová reakcia spojená s reverznou transkripciou v reálnom čase špecifická pre skupinu podľa Guthrie et al., 2013 [4]
A test plate layout should be designed and loaded into the real time PCR machine software.
Polymerázová reťazová reakcia spojená s reverznou transkripciou v reálnom čase pomocou sond FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) na zistenie nukleovej kyseliny AHSV.
Using the layout as a guide, 2,5 μl of each primer working stock 8 μM is added to each well that will contain RNA samples, positive and/or negative controls (final concentration of the primer will be 1 μM in the 20 μl RT-PCR mix).
Opísaná skúška polymerázovej reťazovej reakcie spojenej s reverznou transkripciou AHSV bola navrhnutá pomocou sekvencií zo širokého množstva v súčasnosti cirkulujúcich voľne sa vyskytujúcich kmeňov AHSV (Quan et al., 2010 [5]).
The plate is held on ice.
Zároveň zahŕňa originálnu syntetickú externú kontrolnú skúšku na overenie správneho fungovania komponentov skúšky.
An appropriate volume of real time one-step RT-PCR master mix for the number of samples to be tested is prepared following manufacturer's instructions.
reverzný primer 5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′
0,1 μl of probe working stock 50 μM is added to each well containing RNA samples (final concentration of the probe will be 0,25 μM in each well containing RNA samples).
TaqMan MGB sonda 5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′
13 μl of real time one-step RT-PCR master mix is distributed in each well on the PCR plate containing the denatured primers and RNA.
Pracovné roztoky zmesi primeru a sondy sú vytvorené v koncentrácii 25 × v 5 μΜ pre priame primery a 3 μΜ pre sondu.
The plate is placed in a real time thermal cycler programmed for reverse transcription and cDNA amplification/fluorescence detection.
Je potrebné navrhnúť usporiadanie testovacej platničky, ktorá sa vloží do softvéru v stroji na polymerázovú reťazovú reakciu v reálnom čase.
Amplification conditions consist of a first reverse-transcription step at 48 °C for 25 minutes, followed by 10 minutes at 95 °C (“hot start”) and 40 cycles of 15 seconds at 95 °C, 35 seconds at 55 °C and 30 seconds at 72 °C (or 40 cycles at 97 °C for 2 seconds and 55 °C for 30 seconds if reagents and thermocycler allowing fast reactions are used).
Použitím daného usporiadania sa do príslušných jamiek platničky pridá 5 μl vzoriek RNA vrátane testovacích vzoriek a pozitívnych a negatívnych kontrol.
Fluorescence data are acquired at the end of the 55 °C step.
RNA sa denaturuje ohrevom na 95 °C počas 5 minút, po čom nasleduje rýchle ochladenie na ľade počas aspoň 3 minút.
The assay is considered not valid if atypical amplification curves are obtained, and must be repeated.
Podľa pokynov výrobcu sa pre niekoľko vzoriek, ktoré sa budú testovať, pripraví príslušný objem zmesi „master mix“ v jednom kroku na polymerázovú reťazovú reakciu spojenú s reverznou transkripciou v reálnom čase.
Samples are considered positives, if the Ct value (cycle number at which the fluorescence generated within a reaction crosses the fluorescence threshold) is lower than or equal to the defined Ct threshold (35) within 40 PCR cycles (Ct ≤ 35).
1 μl 25 × pracovného roztoku zmesi primeru-sondy (z bodu 2.2.1 vyššie) sa zahrnie do zmesi „master mix“ s cieľom dosiahnuť konečnú koncentráciu každej jamky 200 nM pre každý primer a 120 nM pre sondu.
Samples are considered inconclusive, if the Ct value is higher than the defined Ct threshold (35) within 40 PCR cycles (Ct > 35).
20 μl zmesi „master mix“ sa rozdelí do každej jamky na platničke polymerázovej reťazovej reakcie, ktorá obsahuje denaturovanú RNA.
Samples are considered negative, if a horizontal amplification curve is obtained which does not cross the threshold line within 40 PCR cycles.
Platnička sa umiestni do termocykléru v reálnom čase naprogramovaného na reverznú transkripciu a zistenie amplifikácie/fluorescencie cDNA podľa odporúčania výrobcov.
Group-specific real-time RT-PCR by Guthrie et al., 2013 [4]
Podmienky amplifikácie pozostávajú napríklad z kroku prvej reverznej transkripcie pri teplote 48 °C počas 10 minút, po čom nasleduje 10 minút pri teplote 95 °C a 40 cyklov po 15 sekúnd pri teplote 95 °C a 45 sekúnd pri teplote 60 °C.
Real-time RT-PCR using fluorescence resonance energy transfer (FRET) probes to detect nucleic acid of AHSV.
Vzorky sa považujú za pozitívne v prípade, ak normalizovaná fluorescencia pre skúšku AHSV polymerázovej reťazovej reakcie spojenej s reverznou transkripciou prekročí prahovú hodnotu 0,1 pri 36 cykloch polymerázovej reťazovej reakcie vo všetkých replikátoch vzorky.
Kits for the one-step real-time PCR are available commercially.
CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, 646 – 650.
Below are some basic steps as described by Guthrie et al.
Metódy, 125 (1), 55 – 65.
, which can be modified depending upon local/case-specific requirements, kits used and equipment available.
2013; 189(1):30-5.
forward Primer 5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′
Metódy 167, 45 – 52.
reverse Primer 5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′
Väčšina národných referenčných laboratórií členských štátov Európskej únie navyše používa metódy polymerázovej reťazovej reakcie spojenej s reverznou transkripciou v reálnom čase, a to aj na účely diagnostiky afrického moru koní, ktoré sa ukázali ako vhodné na ciele v ročnom testovaní spôsobilosti, ktoré sa vykonávalo v rokoch 2009 až 2014.
MGB-TaqMan probe 5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′
V správe sa takisto uvádza, že mimo Únie existuje niekoľko referenčných laboratórií OIE a ďalších laboratórií so špecifickými odbornými znalosťami o africkom more koní, ktoré zaviedli aspoň jednu metódu polymerázovej reťazovej reakcie spojenej s reverznou transkripciou v reálnom čase na zistenie genómu afrického moru koní.
Primer and probe mix stock solutions are made up in a 25× concentration at 5 μΜ for the forward and reverse primers and 3 μΜ for the probe.
Agüero M., Gomez-Tejedor C., Angeles Cubillo M., Rubio C., Romero E. a Jimenez-Clavero A. (2008).
A test plate layout should be designed and loaded into the real-time PCR machine software.
Diagnostická presnosť dvojitej skúšky kvantitatívnej polymerázovej reťazovej reakcie spojenej s reverznou transkripciou v reálnom čase na detekciu vírusu afrického moru koní.