natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Forward primer (ILAs6-3F): 5′-ATGAGGGAGGTAGCATTGCA -3′;
Cieľom spracovania všetkých inokul s antisérom proti vírusu infekčnej pankreatickej nekrózy (vírus, ktorý sa v niektorých častiach Európy vyskytuje pri 50 % vzoriek rýb) je zabrániť výskytu cytopatického efektu CPE v naočkovaných bunkových kultúrach v dôsledku vírusu IPN.
Reverse primer (ILAs6-2R): 5′-CATGCTTTCCAACCTGCTAGGA -3′.
Takéto ošetrenie sa môže vykonať, aby sa skrátilo trvanie virologických vyšetrení, ako aj počet prípadov, pri ktorých by výskyt CPE musel byť považovaný za potenciálny indikátor ISAV.
Cycling conditions (One-step RT-PCR): one cycle of 50 °C for 30 minutes, one cycle of 94 °C for 15 minutes, 40 cycles of 94 °C for 30 seconds, 55 °C for 30 seconds, 72 °C for 60 seconds, one cycle of 72 °C for 5 minutes; it shall be adjusted if necessary.
Ak vzorky pochádzajú z výrobných jednotiek, ktoré sú považované za jednotky bez výskytu vírusu IPN, ošetrenie inokulom s antisérom proti vírusu IPN sa smie vynechať.
Alternatively, the following method for sequencing HPR in segment 6 may be used:
Naočkovanie na bunkových kultúrach
Forward primer: 5′-GAC-CAG-ACA-AGC-TTA-GGT-AAC-ACA-GA-3′;
Na primárnu izoláciu ISAV sa použijú bunky z obličky lososa atlantického (ASK).
Reverse primer: 5′-GAT-GGT-GGA-ATT-CTA-CCT-CTA-GAC-TTG-TA-3′;
Môžu byť použité aj iné bunkové línie s preukázanou účinnosťou a citlivosťou na izolovanie vírusu ISA, pričom sa zohľadňuje variabilita kmeňa a schopnosť rôznych kmeňov rozmnožovať sa v rôznych bunkových líniách.
Product size: 304 nt if HPR0.
Zdá sa, že bunky ASK podporujú izoláciu a rast doteraz známych izolátov vírusu, pokiaľ sa používa úroveň s nízkou pasážou.
RT-PCR assays with similar sensitivities and specificities to the assays described in this point may also be used.
V bunkách ASK sa môže objaviť výraznejší cytopatický efekt (CPE) ako v iných vnímavých bunkových líniách ako SHK-1 (Salmon head kidney-1).
The purity of the amplified RT-PCR product shall be checked by gel electrophoresis before sequencing.
Bunky ASK (pasáž 65 alebo nižšia) sa kultivujú v prostredí L-15 obsahujúcom 10 % fetálne bovinné sérum, 2 % (vol:vol) 200 mM L-glutamín a 0,08 % (vol:vol) 50 mM 2-merkaptoetanol na viacjamkových platničkách.
If only one pure fragment appears, it shall be purified directly from the PCR reaction.
Suspenzia orgánov ošetrená antisérom sa naočkuje do mladých aktívne rastúcich bunkových kultúr, aby sa dosiahlo konečné riedenie tkanivového materiálu v kultivačnom médiu v pomere 1:1000.
If multiple amplified fragments are present, the fragment of interest shall be purified by gel electrophoresis.
V prípade každého orgánu sa pridá suspenzia 40 μl inokula do jednej jamky obsahujúcej 2 ml kultivačného média.
The purification of PCR fragments from solutions or agarose gels shall be made using PCR fragment affinity spin columns, according to the manufacturer's instructions.
Na účely minimalizácie rizika krížovej kontaminácie sa použijú samostatné platničky s 12 alebo 24 jamkami v prípade vzoriek pochádzajúcich z rôznych fariem s chovom rýb.
Sequencing shall be performed using amplification primers at external specialised sequencing companies.
Jedna platnička zostane nenaočkovaná, aby slúžila ako negatívna kontrolná vzorka.
The results shall be analysed with the search tool BLAST and the sequences shall be compared with other known sequences in the US National Centre for Biotechnical Information (NCBI) nucleotide database.
Osobitná platnička sa naočkuje referenčným izolátom ISAV ako pozitívna kontrola podľa nasledujúceho postupu.
Sequencing must eliminate any doubt on the specificity of an amplified RT-PCR product.
100 μl zásobného roztoku ISAV (minimálny titer 107 infekčnej dávky pre tkanivovú kultúru v 50 % koncovom bode (TCID50 ml– 1)) sa naočkuje do prvej jamky a premieša.
ISAV isolation on cell cultures
Objem tohto materiálu sa prenesie z prvej jamky do druhej, aby sa získalo riedenie v pomere 1:10 a premieša sa.
Preparation of samples
Tento postup sa opakuje v celej platničke, aby sa získalo šesť riedení v pomere 1:10.
The tissue may be kept at – 80 °C.
Zásobný roztok ISAV sa môže uchovávať pri teplote – 80 °C počas obdobia minimálne dvoch rokov, ale ak sa raz rozmrazí musí sa použiť do troch dní.
The tissue shall only be frozen and thawed once before examination.
Pozornosť sa venuje tomu, aby sa zabránilo krížovej kontaminácii testovacích platničiek s pozitívnym kontrolným materiálom.
For surveillance and control purposes, the examination shall be undertaken as fast as possible.
Aby sa zabránilo tomuto riziku, pripravia sa pozitívne kontrolné vzorky a pracuje sa s nimi oddelene od testovacích platničiek.
Each sample (tissue pool in transport solution) shall be completely homogenised using a validated homogeniser, centrifuged at 2000 to 4000 × g for 15 minutes at 0 to 6 °C, and the supernatant shall be filtered (0,45 μm) and incubated with an equal volume of a suitably diluted pool of antisera to the indigenous serotypes of IPNV.
Uplatňovanie zaradenia pozitívnej kontroly pri každom naočkovaní môže nahradiť test citlivosti buniek ASK voči izolátom ISAV.
The titre of the antiserum must be at least 1:2000 in a 50 % plaque neutralisation test.
Vzorky sa inkubujú pri teplote 15 ± 2 °C počas obdobia maximálne 15 dní.
The mixture shall be incubated for one hour at 15 °C.
Použitím mikroskopu sa dvakrát vyšetrujú bunkové kultúry na zistenie CPE, najskôr v období medzi piatym a siedmym dňom, a potom medzi dvanástym a štrnástym dňom po naočkovaní.
This shall represent the inoculum.
Ak niektorá zmesná vzorka vykazuje CPE, okamžite sa začne postup identifikácie vírusu v súlade s bodom II.2.4.
Treatment of all inocula with antiserum to Infectious pancreatic necrosis virus (a virus which in some parts of the Europe occurs in 50 % of fish samples) aims at preventing cytopatic effect (CPE) due to IPN virus from developing in inoculated cell cultures.
Ak sa do 14 dní nespozoruje žiaden CPE, vykoná sa nepriamy imunofluorescenčný test (IFAT), hemadsorpcia alebo RT-PCR.
To reduce the duration of the virological examinations as well as the number of cases in which occurrence of CPE would have to be considered potentially indicative of ISAV, such treatment may be carried out.
Subkultivácia sa vykonáva v období medzi 13. až 15. dňom.
When samples come from production units which are considered free from IPN, the treatment of inocula with antiserum to IPN virus may be omitted.
Supernatant bunkovej kultúry sa pridá do jamiek, ktoré obsahujú čerstvé bunky v etape aktívneho rastu vo vhodnom zriedení (1/10) na viacjamkových platničkách a inkubuje sa pri teplote 14 ± 2 °C maximálne počas 18 dní.
Inoculation on cell cultures
Bunkové kultúry sa dvakrát preskúmajú použitím mikroskopu na zistenie CPE, a to medzi piatym a siedmym dňom a medzi štrnástym a osemnástym dňom po naočkovaní.
Atlantic salmon kidney (ASK) cells shall be used for primary ISAV isolation.
Ak sa nespozoruje žiaden CPE medzi 14. až 18. dňom, vykoná sa test hemadsorpcie alebo RT-PCR.
Other cell lines of proven efficacy and sensitivity in isolating ISAV may be used, taking into consideration strain variability and the ability of different strains to replicate in different cell lines.
Ak sa cytotoxicita zistí počas prvých siedmich dní po inkubácii, vykoná sa subkultivácia v tejto etape a bunky sa inkubujú počas 14 až 18 dní, a potom sú znova subkultivované s ďalším obdobím inkubácie 14 až 18 dní.
The ASK cells seem to support isolation and growth of the hitherto known virus isolates, as long as a low passage level is used.
Ak sa cytotoxicita vyskytne po siedmich dňoch, vykoná sa subkultivácia a bunky sú inkubované tak, aby sa dosiahol celkový počet 28 až 36 dní inkubácie od prvého naočkovania.
A more distinct cytopathic effect (CPE) may appear in ASK cells than in other susceptible cell lines like SHK-1 (Salmon head kidney-1).
Ak sa v prvotnej kultúre vyskytne bakteriálna kontaminácia, test sa musí zopakovať použitím homogenátu tkaniva uskladneného pri teplote – 80 °C.
ASK (pass 65 or lower) cells shall be grown in L-15 medium containing 10 % foetal bovine serum, 2 % (vol:vol) 200 mM L-glutamine, and 0,08 % (vol:vol) 50 mM 2-mercaptoethanol in multi-well plates.
Pred naočkovaním sa homogenát tkaniva centrifuguje pri 4000 × g počas 15 až 30 minút pri 0 až 6 °C a supernatant sa filtruje cez 0,22 μm filter.
Antiserum-treated organ suspension shall be inoculated into young actively growing cell cultures to give a final dilution of tissue material to culture medium of 1:1000.
Ak sa počas subkultivácie vyskytne bakteriálna kontaminácia, supernatant sa filtruje cez 0,22 μm filter, naočkuje do čerstvých buniek a inkubuje počas ďalších 14 až 18 dní.
For each organ, suspension 40 μl of inoculum shall be added to one well containing 2 ml of culture medium.
Testy na identifikáciu vírusu
To minimise the risk of cross-contamination, separate 12- or 24-well plates shall be used for samples from different fish farm sites.
Ak sa preukáže výskyt CPE v akomkoľvek štádiu alebo ak je pozitívny hemadsorpčný test, vykoná sa identifikácia vírusu.
One plate shall be left uninoculated to serve as a negative control.
Metódy, ktoré sa môžu zvoliť na identifikáciu ISAV, sú RT-PCR v súlade s bodom II.1 a imunofluorescencia (IF) v súlade s bodom II.2.6.
A separate plate shall be inoculated with a reference isolate of ISAV as a positive control, as follows.
Ak sa predpokladá možná prítomnosť aj iných vírusov, vykonajú sa doplňujúce testy na identifikáciu vírusov.
One hundred μl of a stock preparation of ISAV (minimum titre 107 Tissue culture infective dose at the 50 % end point (TCID50 ml– 1)) shall be inoculated into the first well and mixed.
V prípade, že sa uvedenými testami nepodarilo definitívne identifikovať vírus do jedného týždňa, supernatant sa zašle na okamžitú identifikáciu do:
A volume of this material shall be transferred from the first well to the second well to make a 1:10 dilution and mixed.
referenčného laboratória pre ISASvetovej organizácie pre zdravie zvierat (OIE) alebo
This shall be repeated across the plate to make six 10-fold dilutions.
národného referenčného laboratória alebo referenčného laboratória EÚ pre choroby rýb uvedeného v prílohe VI k smernici 2006/88/ES.
Stock ISAV may be stored at – 80 °C for at least 2 years but once thawed must be used within 3 days.
Hemadsorpcia
Care shall be taken to prevent cross-contamination of test plates with positive control material.
Keďže množenie ISAV v bunkových kultúrach vždy nevedie k výskytu CPE, každá jamka sa podrobuje testu RT-PCR alebo hemadsorpčnému testu v súlade s týmto bodom alebo testu IF v súlade s bodom II.2.6.
To avoid that risk, positive controls shall be set up and handled separately from test plates.
Z každej jamky sa odoberie médium na kultiváciu buniek, vrátane tých, ktoré sú s pozitívnymi a negatívnymi kontrolnými vzorkami a umiestnia sa do označených sterilných skúmaviek.
A sensitivity test every 6 months of ASK cells towards ISAV isolates may replace the use of including a positive control at each inoculation.
Do každej jamky sa pridá 500 μl 0,2 % (vol:vol) suspenzie premytých červených krviniek zajaca alebo koňa alebo 0,05 % (vol:vol) suspenzie premytých červených krviniek pstruha dúhového alebo lososa atlantického a inkubuje sa pri izbovej teplote počas 45 minút.
Samples shall be incubated at 15 ± 2 °C for up to 15 days.
Červené krvinky sa odstránia a každá jamka sa dvakrát opláchne pomocou roztoku L-15.
Using a microscope, cell cultures shall be examined for CPE twice, between 5 to 7 and 12 to 14 days following inoculation.
Každá jamka sa vyšetrí použitím mikroskopu.
If any pool shows CPE, virus identification procedures shall be initiated immediately in accordance with point II.2.4.
Prítomnosť zhlukov červených krviniek pripojených k povrchu buniek ASK indikuje podozrenie na infekciu orthomyxovírusom.
If no CPE is observed by day 14, an Indirect fluorescent antibody test (IFAT), haemadsorption or RT-PCR shall be performed.
Ak je test hemadsorpcie pozitívny, okamžite sa vykoná test na identifikáciu vírusu v súlade s bodom II.2.4.
Subcultivation shall be carried out between days 13 to 15.
Imunofluorescencia (IF)
Culture supernatant shall be added to wells containing fresh actively growing cells in appropriate dilution (1/10) in multi-well plates and incubated at 14 ± 2 °C for up to 18 days.
Bunky ASK (pasáž 65 alebo nižšia) sa kultivujú v prostredí L-15 obsahujúcom 10 % fetálne bovinné sérum, 2 % (vol:vol) 200 mM L-glutamín a 0,08 % (vol:vol) 50 mM 2-merkaptoetanol na viacjamkových platničkách a používajú pri zhlukovaní presahujúcom 50 %.
Using a microscope, cell cultures shall be examined for CPE twice, between days five to seven and days 14 to 18 following inoculation.
Môžu sa použiť tiež iné bunkové línie alebo rastové médiá s preukázanou účinnosťou.
If no CPE is observed by days 14 to 18, a haemadsorption or an RT-PCR test shall be performed.
225 μl supernatantu kultúry, pri ktorej sa predpokladá infekcia vírusom, sa pridá do každej z dvoch jamiek, premieša sa a 225 μl sa prenesie do dvoch ďalších jamiek pri zriedení 1:5.
If cytotoxicity occurs within the first 7 days of incubation, subcultivation shall be performed at that stage, and the cells shall be incubated for 14 to 18 days and sub cultivated again with a further period of 14 to 18 days incubation.
Dve ďalšie jamky zostanú nenaočkované, aby poslúžili ako kontrolné vzorky.
If cytotoxicity occurs after 7 days, subcultivation shall be performed once and the cells shall be incubated to achieve the total period of 28 to 36 days incubation from the primary inoculation.
Vzorky z každého rybného hospodárstva sa umiestnia na samostatné platničky, ako aj kontrolné vzorky vírusu.
If bacterial contamination occurs in the primary culture, the test shall be set up again using the tissue homogenate stored at – 80 °C.
Kontrola vírusu sa vykoná použitím referenčného izolátu vírusu ISAV.
Prior to inoculation, the tissue homogenate shall be centrifuged at 4000 × g for 15 to 30 minutes at 0 to 6 °C and the supernatant shall be filtered at 0,22 μm.
Platničky sa inkubujú pri teplote 14 ± 2 °C a vyšetrujú sa pod mikroskopom počas maximálne siedmich dní.
If bacterial contamination occurs during the subcultivation step the supernatant shall be filtered at 0,22 μm, inoculated onto fresh cells and incubated for a further 14 to 18 days.
Ak sa zistí predčasný CPE alebo ak sa nezistil žiaden CPE do siedmich dní, potom je ďalším krokom fixácia.
Virus identification tests
Jamky sa premyjú fosfátovým tlmivým fyziologickým roztokom (PBS) a fixujú sa inkubáciou s 80 % acetónom počas f20 minút pri izbovej teplote.
If evidence of CPE is observed at any stage, or if a haemadsorption test is positive, virus identification shall be carried out.
Platničky sa usušia na vzduchu a okamžite sa zafarbia alebo sa skladujú pri teplote 0 – 6 °C maximálne 24 hodín pred zafarbením.
The methods of choice for the identification of ISAV shall be RT-PCR in accordance with point II.1 and Immunofluorescence (IF) in accordance with point II.2.6.
Duplicitné jamky sa zafarbia zmesou monoklonálnych protilátok (MAb) 3H6F8 a 1OC9F5 proti ISAV alebo inou monoklonálnou protilátkou s preukázanou účinnosťou a špecificitou, rozriedia sa v PBS a inkubujú pri teplote 37 ± 4 °C počas 30 minút.
If it is considered that other viruses may be present, supplementary virus identification tests shall be carried out.
MAb sa odstráni a platničky sa trikrát premyjú s 0,05 % Tween 20 v PBS.
If those tests have not resulted in a definitive identification of the virus within 1 week, the supernatant shall be forwarded for immediate identification to:
Konjugát protimyšacieho IgG s fluoresceín-izotio-kyanátom (FITC) zriedený v PBS sa pridá do každej jamky a inkubuje sa pri teplote 37 ± 4 °C počas 30 minút.
the World Organisation for Animal Health (OIE) reference laboratory for ISA, or;
Riedenia rôznych šarží MAb a konjugátu FITC sa v každom laboratóriu optimalizujú.
a national reference laboratory or the EU reference laboratory for fish diseases as referred to in Annex VI to Directive 2006/88/EC.
Protilátka sa odstráni a platničky sa trikrát premyjú 0,05 % Tween 20 v PBS.
Haemadsorption
Jamky sa okamžite vyšetria použitím inverzného mikroskopu, ktorý je vybavený fluorescenčným mikroskopom s filtrom upraveným pre excitáciu FITC.
As replication of ISAV in cell cultures does not always result in a CPE, every well shall be subject to an RT-PCR test or a haemadsorption test in accordance with this point, or an IF test in accordance with point II.2.6.
Test sa považuje za pozitívny, ak sú pozorované fluoreskujúce bunky.
Cell culture medium shall be removed from each well, including those of positive and negative controls, and placed in labelled sterile tubes.
Aby bol test platný, musí sa dosiahnuť pozitívny výsledok pri pozitívnych kontrolných vzorkách a negatívny výsledok pri negatívnych kontrolných vzorkách.
500 μl of a 0,2 % (vol:vol) suspension of washed rabbit or horse red blood cells, or a 0,05 % (vol:vol) suspension of washed rainbow trout or Atlantic salmon red blood cells, shall be added to each well and incubated at room temperature for 45 minutes.
Vyšetrenie iných tkanív
The red blood cells shall be removed and each well shall be washed twice with L-15 medium.
Technika uvedená v bode II.2.6 sa môže použiť na iné rybie tkanivá, ako je pečeň, slezina a srdce pod podmienkou, že sa na platničku môže uložiť dostatočné množstvo endotelových buniek, leukocytov a lymfocytov.
Each well shall be examined using a microscope.
Farbenie je rovnaké pre všetky tkanivá, ale u niektorých tkanív sa odporúča nepoužívať značenie propidiumjodidom a uprednostniť fázové osvetlenie, aby sa identifikovali druhy buniek prítomné vo vzorke.
The presence of clusters of red blood cells attaching to the surface of ASK cells shall be indicative of presumptive infection with an orthomyxovirus.
Histológia
If a haemadsorption test is positive, a virus identification test shall be performed immediately in accordance with point II.2.4.
Rezy zaliate parafínom sa nakrájajú na kúsky veľkosti 5 μm a zafarbia sa použitím hematoxylínu a eozínu.
Immunofluorescence (IF)
Histologické zmeny pri klinicky chorých lososoch atlantických sú variabilné, ale môžu zahŕňať:
ASK (pass 65 or lower) shall be grown in a L-15 medium containing 10 % foetal bovine serum, 2 % (vol:vol) 200 mM L-glutamine, and 0,08 % (vol:vol) 50 mM 2-mercaptoethanol in multi-well plates and used at greater than 50 % confluence.
mnohé erytrocyty v centrálnom žilovom splave a lamelárnych kapilárach žiaber, kde sa takisto môžu tvoriť zrazeniny erytrocitov;
Other cell lines or growth medium of proven efficacy may also be used.
multifokálne až splývajúce petechie alebo nekrózu hepatocytov alebo oboje v určitej vzdialenosti od väčších ciev v pečeni; multifokálna akumulácia erytrocytov v dilatovaných pečeňových sínusoidách;
225 μl of putative virus-infected culture supernatant shall be added to each of two wells, mixed and 225 μl transferred to two further wells, namely a 1:5 dilution.
akumulácia erytrocytov v krvných cievach intestinálneho lamina propria a napokon krvácanie do lamina propria;
Two additional wells shall be left uninoculated to act as controls.
stróma sleziny distendovaná akumuláciou erytrocytov;
Samples from each fish farm site shall be handled on separate plates, as shall the virus control.
mierne multifokálne až extenzívne difúzne intersticiálne krvácanie s tubulárnou nekrózou v oblastiach krvácania, akumulácia erytrocytov v glomerule v obličke;
A virus control shall be established using a reference isolate of ISAV.
erytrofagocytóza v slezine a sekundárne krvácania v pečeni a obličke.
Plates shall be incubated at 14 ± 2 °C and examined microscopically for up to 7 days.
Imunohistochémia (IHC)
When early CPE is observed, or if no CPE is observed within 7 days, the next step shall be fixation.
Polyklonálna protilátka proti nukleoproteínu ISAV sa použije na parafínových rezoch z tkaniva fixovaného formalínom.
Wells shall be washed with Phosphate buffered saline (PBS) and fixed by incubation with 80 % acetone for 20 minutes at room temperature.
Orgány, ktoré majú byť vyšetrené, sú zadná oblička a srdce (prechodová oblasť vrátane všetkých troch komôr a chlopní).
Plates shall be air-dried and stained immediately or stored at 0 to 6 °C for no more than 24 hours prior to staining.
Prípady podozrenia z dôvodu patologických príznakov sa overia pozitívnou IHC.
Replicate wells shall be stained with a mix of monoclonal antibodies (MAb) 3H6F8 and 1OC9F5 against ISAV, or other MAb of proven efficacy and specificity, diluted in PBS and incubated at 37 ± 4 °C for 30 minutes.
Histologické rezy sa pripravujú v súlade so štandardnými metódami.
MAb shall be removed and plates washed three times with 0,05 % Tween 20 in PBS.
Príprava rezov tkaniva
Anti-mouse IgG Fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugate diluted in PBS shall be added to each well and incubated at 37 ± 4 °C for 30 minutes.
Tkanivá sú fixované v neutrálnom 10 % formalíne tlmenom fosfátom minimálne počas jedného dňa, dehydrované v sérii koncentrácií etanolu, vyčistené v xyléne a zaliate v parafíne, v súlade so štandardnými protokolmi.
The dilutions of different batches of MAb and FITC conjugate shall be optimised in each laboratory.
Približne 5 μm hrubé rezy (v prípade IHC umiestnené na sklenené sklíčka potiahnuté poly-L-lysinom, sa zahrejú na 56 °C až 58 °C (maximálne 60 °C) počas 20 minút, odparafínujú v xyléne, rehydratujú prostredníctvom série koncentrácií etanolu a farbia hematoxylínom a eozínom na účely patomorfológie a IHC v súlade s bodom 2.
Antibody shall be removed and plates shall be washed three times with 0,05 % Tween 20 in PBS.
Postup farbenia v prípade IHC
Wells shall be examined immediately using an inverted microscope set up for fluorescence microscopy with a suitable filter for excitation of FITC.
Všetky inkubácie sa vykonávajú pri izbovej teplote na trepačke, pokiaľ to nie je stanovené inak v tomto rozhodnutí:
A test shall be considered positive if fluorescent cells are observed.
antigén sa získava tak, že sa rezy varia v 0,1 M citrátovom tlmivom roztoku s pH 6,0 počas 2 × 6 minút, potom nasleduje blokovanie s 5 % odtučneným sušeným mliekom a 2 % kozím sérom v 50 mM TBS (TBS; Tris/HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,6) počas 20 minút;
For a test to be valid, the positive controls shall score positive and the negative controls shall score negative.
rezy sa potom v noci inkubujú s primárnou protilátkou (monošpecifická zajačia protilátka proti nukleoproteínu ISAV) zriedenou v TBS s 1 % odtučneným sušeným mliekom, po čom nasledujú tri premytia v TBS s 0,1 % Tween 20;
Examination of other tissues
na účely detekcie viazaných protilátok sa rezy inkubujú s králičími protilátkami IgG konjugovanými s alkalickou fosfatázou počas 60 minút.
The technique referred to in point II.2.6 may be applied to other fish tissues such as liver, spleen and heart providing a reasonable quantity of endothelial cells, leucocytes or lymphocytes can be deposited on the slide.
Po poslednom premytí sa pridá Fast Red (1 mg ml– 1) a naftol AS-MX fosfát (0,2 mg ml– 1) s1 mM Levamisole v 0,1 M TBS (pH 8,2) a nechá sa 20 minút reagovať.
The staining procedure shall remain the same for each tissue, although for some tissues it may be preferable to omit the propidium iodide staining and rely on the phase illumination to identify the cell types present in the imprint.
Rezy sa potom opláchnu vodou z vodovodu predtým, ako sa kontrastne zafarbia s Harrisovým hematoxylínom a montujú sa vodným montovacím médiom.
Histology
Rezy tkaniva pozitívne na ISAV a negatívne na ISAV sa zahrnú ako kontrolné vzorky pri každej testovacej súprave.
Paraffin-embedded sections shall be cut at 5 μm and stained using haematoxylin and eosin.
Výklad
Histological changes in clinically diseased Atlantic salmon are variable, but may include the following:
Výsledky testu IHC sa vykladajú podľa písm. a) a b):
numerous erythrocytes in the central venous sinus and lamellar capillaries of the gills, where erythrocyte thrombi also may be formed;
kontrolné rezy sa považujú za pozitívne, ak sa pozoruje, že kontrolné rezy majú jasne viditeľne červené (červenkasté) cytoplazmické a intranukleárne zafarbenie endotelových buniek v krvných cievach endokardu.