natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Centrifugation of homogenate
Na analýzu tkanív rýb konzervovaných v činidle na stabilizáciu RNA sa vykoná ďalšia práca v týchto časových rámcoch v prípade vzoriek skladovaných pri rôznych teplotách:
The homogenate shall be centrifuged in a refrigerated centrifuge at 2 °C to 5 °C at 2000 to 4000 × g for 15 minutes and the supernatant collected and may be treated for either four hours at 15 °C or overnight at 4 to 8 °C with antibiotics.
vzorky skladované pri 37 °C: jeden deň;
If the sample has been shipped in a transport medium, the treatment of the supernatant with antibiotics may be omitted.
vzorky skladované pri 25 °C: jeden týždeň;
Where practical difficulties arise, such as incubator breakdown or problems with cell cultures, which make it impossible to inoculate cells within 48 hours after the collection of the fish tissue samples, the supernatant may be frozen at – 80 °C and virological examination may be carried out within 14 days.
vzorky skladované pri 4 °C: jeden mesiac;
If the collected supernatant is stored at – 80 °C within 48 hours after the sampling, it may be reused only once for virological examination.
vzorky skladované pri – 20 °C: na neurčito.
Prior to the inoculation of the cells, the supernatant shall be mixed with equal parts of a suitably diluted pool of antisera to the indigenous serotypes of Infectious pancreatic necrosis (IPN) virus and incubated with this for a minimum of one hour at 15 °C or a maximum of 18 hours at 4 °C.
Zmesné vzorky v činidle na stabilizáciu RNA sa spracúvajú ako samostatné vzorky v činidle na stabilizáciu RNA.
The titre of the antiserum shall be at least 1/2000 in a 50 % plaque neutralisation test.
V prípade zmesných vzoriek v činidle na stabilizáciu RNA množstvo vzorky nesmie prekročiť hodnotu odporúčanú výrobcom na extrakciu so súpravami RNA, ako sú RNeasy Mini kits (Qiagen) alebo podobné súpravy.
Treatment of all inocula with antiserum to IPN virus aims at preventing cytopathic effect (CPE) due to IPN virus from developing in inoculated cell cultures.
Ak sa spájajú väčšie vzorky, je potrebné to zohľadniť a použiť vhodné extrakčné súpravy alebo metódy.
This will reduce the duration of the virological examinations as well as the number of cases in which occurrence of CPE would have to be considered potentially indicative of VHSV or IHNV.
Vzorky odobraté do činidiel na stabilizáciu RNA sa nepoužívajú na kultiváciu buniek.
When samples come from production units, which are considered free from IPN, the treatment of inocula with antiserum to IPN virus may be omitted.
Spájanie vzoriek na RT-qPCR
Sample preparation for RT-PCR and RT-qPCR based surveillance programmes
Keďže dané protokoly RT-qPCR majú podobnú alebo vyššiu citlivosť ako metódy kultivácie buniek, za prijateľné riešenie sa môže považovať, ak sa na PCR použije supernatant z homogenizovaného materiálu tkanív zmesných vzoriek orgánov najviac 10 rýb v médiu na kultiváciu buniek.
If samples were collected in transport medium, the procedure set out in points I.4.2 and I.4.3 shall be carried out.
Vzhľadom na to, že inokulum použité na PCR je v porovnaní s kultiváciou buniek oveľa menšie, sa však všetky tkanivá rýb pred spojením materiálu na extrakciu dôkladne homogenizujú.
After centrifugation, supernatant shall be collected and RNA extracted.
Rovnaká zásada sa uplatňuje aj vtedy, ak sa vzorky odoberajú v činidlách na stabilizáciu RNA.
If further examination is not to be undertaken directly after centrifugation, the samples shall be immediately frozen at – 20 °C or below.
V takom prípade je však často obtiažne vykonať odber reprezentatívneho materiálu až 10 rýb do jednej skúmavky, a preto sa počet rýb v zmesnej vzorke musí znížiť na 2 až 5.
For the analysis of fish tissues preserved in RNA stabilization reagent, subsequent work shall be carried out within the following time scales for samples stored at different temperatures:
Virologické vyšetrenie na bunkovej kultúre
samples stored at 37 °C: 1 day;
Bunkové kultúry a médiá
samples stored at 25 °C: 1 week;
Bunkové línie BF-2 poteru zo slnečnice modrožiabrovej (Bluegill fry) alebo RTG-2 gonád pstruha dúhového (Rainbow trout gonad) a buď bunky EPC (Epithelioma papulosum cyprini) alebo FHM (čerebľa potočná, Fathead minnow) sa kultivujú pri teplote 20 až 30 °C vo vhodnom médiu, konkrétne v minimálnom základnom médiu podľa Eagla (MEM) alebo v jeho modifikáciách, s prídavkom 10 % séra získaného z plodov hovädzieho dobytka a antibiotík v štandardných koncentráciách.
samples stored at 4 °C: 1 month;
Ak sú bunky kultivované v uzatvorených nádobách, médium sa pufruje hydrogénuhličitanom.
samples stored at – 20 °C: indefinitely
Médium použité na kultiváciu buniek v otvorených jednotkách sa môže tlmiť pomocou tris(hydroxymetyl)aminometánu-HCl (Tris-HCl) (23 mM) a hydrogénuhličitanu sodného (6 mM). pH musí byť 7,6 ± 0,2.
Pooled samples in RNA stabilization reagent shall be treated like single samples in RNA stabilization reagent.
Bunkové kultúry, ktoré sa majú použiť na naočkovanie tkanivového materiálu rýb, musia byť mladé, zvyčajne sa pokiaľ možno použijú jeden deň staré jednovrstvové bunkové kultúry; prijateľné však môžu byť aj bunkové kultúry staré od 4 do 48 hodín.
For samples pooled in RNA stabilization reagent, the sample amount shall not exceed that recommended by the manufacturer for extraction with RNA kits, such as RNeasy Mini kits (Qiagen) or similar.
Bunky musia pri naočkovaní aktívne rásť.
If larger samples are pooled, the extraction kits or methods must reflect this pooling.
Naočkovanie bunkových kultúr
Samples collected in RNA stabilization reagents shall not be used for cell cultivation.
Suspenzia orgánov spracovaná pomocou antibiotík sa naočkuje do bunkových kultúr v dvoch riedeniach, konkrétne primárny roztok a okrem toho jeho riedenie v pomere 1:10, výsledkom čoho sú konečné riedenia tkanivového materiálu v médiu na kultiváciu bufniek v pomere 1:100 a 1:1000 (v danom poradí), s cieľom zabrániť homologickej interferencii.
Pooling of samples for RT-qPCR
Naočkujú sa aspoň dve bunkové línie, ako sa uvádza v bode I.5.1.
As the RT-qPCR protocols given are of similar or higher sensitivity than the cell cultivation methods, it may be acceptable to use supernatant from homogenised fish tissue material of pooled organs from up to 10 fish in cell culture medium for PCR.
Pomer medzi veľkosťou inokula a objemom média na kultiváciu buniek je približne 1:10.
However, due to the much smaller inoculum used for PCR compared to cell cultivation, all fish tissues shall be carefully homogenised before collating material for extraction.
Pri každom roztoku a každej bunkovej línii sa použije bunková plocha s veľkosťou približne aspoň 2 cm2, čo zodpovedá jednej jamke v 24-jamkovej platničke pre bunkové kultúry.
The same principle shall also be applied if samples are collected in RNA stabilization reagents.
Podľa možnosti sa používajú platničky pre bunkové kultúry.
However, in that case it is often difficult to collect representative material from up to 10 fish in one tube, and the number of fish per pool shall therefore be reduced to 2 to 5.
Inkubácia bunkových kultúr
Virological examination on cell culture
Inkubácia naočkovaných bunkových kultúr sa uskutočňuje pri teplote 15 °C počas siedmich až desiatich dní.
Cell cultures and media
Ak sa farba média na kultiváciu buniek mení z červenej na žltú, čo naznačuje okysľovanie média, musí sa vykonať úprava pH sterilným roztokom hydrogénuhličitanu alebo ekvivalentnými látkami na zabezpečenie bunkovej vnímavosti na vírusovú infekciu.
Bluegill fry cell line -2 (BF-2) or Rainbow trout gonad cell line - 2 (RTG-2) and either Epithelioma papulosum cyprini (EPC) or Fathead minnow (FHM) cells shall be grown at 20 to 30 °C in suitable medium, namely Eagle's Minimum essential medium (MEM) or modifications thereof, with a supplement of 10 % foetal bovine serum and antibiotics in standard concentrations.
Aspoň každých šesť mesiacov alebo pri podozrení na zníženú vnímavosť buniek sa vykoná titrácia zmrazených zásob VHSV a IHNV na overenie vnímavosti bunkových kultúr na infekciu.
When the cells are cultivated in closed vials, the medium shall be buffered with bicarbonate.
Podľa možnosti sa použije postup uvedený v oddiele III.
The medium used for cultivation of cells in open units may be buffered with tris(hydroxymethyl)aminomethane-HCl (Tris-HCl) (23 mM) and sodium bicarbonate (6 mM).
Mikroskopia
The pH must be 7,6 ± 0,2.
Naočkované bunkové kultúry sa pravidelne kontrolujú, a to aspoň trikrát týždenne, v súvislosti s výskytom CPE pri 40 až 150-násobnom zväčšení.
The cell cultures to be used for inoculation with fish tissue material shall be young, normally 1 day old cell culture monolayers where possible; however, a range between 4 to 48 hours old may be accepted.
V prípade, ak je pozorovaný CPE, je potrebné okamžite začať postupy na identifikáciu vírusu v súlade s bodom I.6.
The cells must be actively growing at inoculation.
Subkultivácia
Inoculation of cell cultures
Ak sa po primárnej inkubácii 7 až 10 dní nevyvinul CPE, na čerstvých bunkových kultúrach sa vykonáva subkultivácia, pričom veľkosť bunkovej plochy je podobná ploche použitej pri primárnej kultúre.
Antibiotic-treated organ suspension shall be inoculated into cell cultures in two dilutions, namely the primary dilution and, in addition, a 1:10 dilution thereof, resulting in final dilutions of tissue material in cell culture medium of 1:100 and 1:1000, respectively, in order to prevent homologous interference.
Pomerné časti média (supernatantu) zo všetkých kultúr alebo jamiek, ktoré predstavujú primárnu kultúru, sa spoja podľa bunkovej línie 7 až 10 dní po naočkovaní.
At least two cell lines shall be inoculated as referred to in point I.5.1.
Zmesné vzorky sa potom naočkujú do homologických bunkových kultúr v nezriedenom a zriedenom stave, a to 1:10 [čím sa dosiahnu konečné zriedenia supernatantu 1:10 a 1:100 (v danom poradí)], podľa opisu v bode I.5.2.
The ratio between inoculum size and volume of cell culture medium shall be about 1:10.
Alternatívnym spôsobom je, že sa pomerné časti 10 % média, ktoré predstavujú primárnu kultúru, naočkujú priamo do jamky s čerstvou bunkovou kultúrou (konkrétne subkultivácia z jamky do jamky).
For each dilution and each cell line, a minimum of about 2 cm2 cell area, corresponding to one well in a 24-well cell culture tray, shall be utilised.
Naočkovaniu môže predchádzať inkubácia príslušných riedení s antisérom proti vírusu IPN podľa opisu v bode I.4.3.
Cell culture trays shall be used where possible.
Potom sa vykoná inkubácia naočkovaných kultúr počas 7 až 10 dní pri teplote 15 °C a kontrola v súlade s bodom I.5.4.
Incubation of cell cultures
Ak sa toxický CPE vyskytne počas prvých troch dní inkubácie, v tejto fáze sa vykoná subkultivácia, ale bunky sa potom inkubujú sedem dní a opäť subkultivujú a inkubujú ďalších sedem dní.
The inoculated cell cultures shall be incubated at 15 °C for seven to 10 days.
Ak sa toxický CPE vyvinie po troch dňoch, bunky sa prenášajú len jeden raz a inkubujú tak, aby bolo dosiahnutých celkovo 14 dní od primárneho naočkovania.
If the colour of the cell culture medium changes from red to yellow indicating medium acidification, pH adjustment with sterile bicarbonate solution or equivalent substances shall be performed to ensure cell susceptibility to virus infection.
Počas posledných siedmich dní inkubácie nesmie byť zistený žiadny dôkaz toxicity.
At least every 6 months or if decreased cell susceptibility is suspected, titration of frozen stocks of VHSV and IHNV shall be performed to verify the susceptibility of the cell cultures to infection.
Ak napriek ošetreniu antibiotikami dôjde k bakteriálnej kontaminácii, subkultivácii predchádza centrifugácia pri 2000 to 4000 × g počas 15 až 30 minút pri teplote 2 až 5 °C alebo filtrácia supernatantu cez 0,45 μm filter (membrána s nízkou väzbou bielkovín) alebo oba tieto kroky.
The procedure set out in Section III shall be used, if possible.
Okrem toho subkultivácia uplatňuje rovnaké postupy ako postupy opísané pri toxickom CPE vo štvrtom odseku tohto bodu.
Microscopy
Ak sa nevyskytne CPE, test sa môže vyhlásiť za negatívny.
Inoculated cell cultures shall be inspected regularly, at least three times a week, for the occurrence of CPE at 40 to 150 × magnification.
Identifikácia vírusu
If obvious CPE is observed, virus identification procedures in accordance with point I.6 shall be initiated immediately.
Ak bol zistený dôkaz prítomnosti CPE v bunkovej kultúre, médium (supernatant) sa odoberie a vyšetrí jednou alebo viacerými z týchto techník: imunoenzymatická reakcia (ELISA), imunofluorescencia (IF), neutralizácia, RT-PCR alebo RT-qPCR.
Subcultivation
Ak tieto testy neumožnia definitívnu identifikáciu vírusu do jedného týždňa, supernatant sa odošle do národného referenčného laboratória alebo referenčného laboratória EÚ pre choroby rýb uvedeného v prílohe VI k smernici 2006/88/ES na okamžitú identifikáciu.
If no CPE has developed after the primary incubation for 7 to 10 days, subcultivation shall be performed to fresh cell cultures utilising a cell area similar to that of the primary culture.
Sendvičová ELISA s dvojitou protilátkou sa vykoná s cieľom identifikovať izolát vírusu.
Aliquots of medium (supernatant) from all cultures or wells constituting the primary culture shall be pooled according to cell line 7 to 10 days after inoculation.
Mikrotitračné platničky sú potiahnuté 50 μl/jamku (0,9 pg) imunoglobulínmi (Ig) prečistenými vysokokvalitným proteínom A z králičieho antiséra proti IHNV alebo VSHV, ktoré sú rozpustené v uhličitanovom tlmivom roztoku (pH 9,6) s obsahom 15 mM azidu sodného, a inkubujú sa od 18 hodín do 2 týždňov pri teplote 4 °C.
The pools shall then be inoculated into homologous cell cultures undiluted and diluted 1:10 (resulting in final dilutions of 1:10 and 1:100, respectively, of the supernatant) as described in point I.5.2.
Na riediacej platničke sa každá vzorka s obsahom 1 % Triton X-100 a pozitívne kontrolné vzorky zriedia tlmivým roztokom (konkrétne fosfátovým tlmivým fyziologickým roztokom (PBS)-T-BSA, 1 % BSA) v týchto štyroch pomeroch riedenia: neriedený, 1:4, 1:16, 1:64.
Alternatively, aliquots of 10 % of the medium constituting the primary culture shall be inoculated directly into a well with fresh cell culture (namely, well to well subcultivation).
Platničky ELISA sa premyjú PBS s obsahom 0,05 % Tween-20 (PBS-T) a z riediacej platničky sa na premytú a potiahnutú platničku ELISA prenesie 50 μl každého riedenia.
The inoculation may be preceded by pre-incubation of the dilutions with the antiserum to IPN virus at appropriate dilution as described in point I.4.3.
Platničky ELISA sa potom inkubujú počas 30 minút pri teplote 37 °C.
The inoculated cultures shall then be incubated for 7 to 10 days at 15 °C and inspected in accordance with point I.5.4.
Platničky sa následne premyjú a inkubujú počas 30 minút pri teplote 37 °C so špecifickými monoklonálnymi protilátkami (na identifikáciu VHSV sa použije MAb IP5B11 a na identifikáciu IHNV sa použije Hyb 136-3, v danom poradí).
If toxic CPE occurs within the first 3 days of incubation, subcultivation shall be performed at that stage, but the cells shall then be incubated for 7 days and sub cultivated again with further 7 days incubation.
Na platničku ELISA sa prenesie 50μl králičích protimyšacích protilátok konjugovaných s chrenovou peroxidázou, zriedených v pomere 1:1000 v PBS-T-BSA.
When toxic CPE develops after 3 days, the cells shall be passed once and incubated to achieve the total of 14 days from the primary inoculation.
Nakoniec, po opätovnom premytí, sa vyvolajú reakcie pridaním ortofenyléndiamínu (OPD) v množstve 50 μl/jamku.
There must be no evidence of toxicity in the final 7 days of incubation.
Platničky ELISA sa inkubujú počas 20 minút pri izbovej teplote v tme a reakcia sa zastaví pridaním 100 μl 0,5 M H2SO4/jamku.
If bacterial contamination occurs despite treatment with antibiotics, subcultivation shall be preceded by centrifugation at 2000 to 4000 × g for 15 to 30 minutes at 2 to 5 °C, or filtration of the supernatant through a 0,45 μm filter or both (low protein-binding membrane).
Absorbancia sa monitoruje pri vlnovej dĺžke 492 a 620 nm v zariadení na čítanie platničiek ELISA.
In addition to this, subcultivation shall follow the same procedures as described for toxic CPE in the fourth paragraph of this point.
Vzorky sa označia ako pozitívne alebo negatívne porovnaním hodnôt testovaných vzoriek s hodnotami absorbancie pozitívnach a negatívnych kontrol.
If no CPE occurs, the test may be declared negative.
Vo všeobecnosti sa vzorky s kombinovanou absorbanciou (A) < 0,5 pri nezriedenom materiáli považujú za negatívne, vzorky s hodnotami A medzi 0,5 a 1,0 sa považujú za podozrivé a vzorky s hodnotami A > 1,0 sa považujú za pozitívne.
Virus identification
Namiesto verzií ELISA, ktoré sú uvedené v tomto bode, sa môžu použiť iné verzie ELISA s preukázanou podobnou účinnosťou.
If evidence of CPE has been observed in a cell culture, medium (supernatant) shall be collected and examined by one or more of the following techniques: Enzyme-linked immunosorbent essay (ELISA), Immunofluorescence (IF), neutralisation, RT-PCR or RT-qPCR.
Imunofluorescencia – IF
If these tests have not allowed definitive identification of the virus within 1 week, the supernatant shall be forwarded to the national reference laboratory or to the EU reference laboratory for fish diseases referred to in Annex VI to Directive 2006/88/EC for immediate identification.
Identifikácia patogénov VHSV a IHNV uvedených v zozname sa vykoná infikovaním buniek v čiernych „Black“ 96-jamkových platničkách, bežných 24-jamkových platničkách alebo na krycích sklíčkach do 24-jamkových platničiek.
A double antibody sandwich ELISA shall be performed in order to identify the virus isolate.
Ak sa VHSV alebo IHNV alebo oba zistia infikovaním buniek na krycích sklíčkach, uplatňuje sa tento protokol:
Microwell plates shall be coated with 50 μl/well (0,9 pg) of proven quality protein-A purified immunoglobulins(Ig) from rabbit antisera against IHNV or VSHV diluted in carbonate buffer (pH 9,6) containing 15 mM sodium azide and incubated from 18 hours to 2 weeks at 4 °C.
krycie sklíčka sa vysejú bunkami s hustotou, ktorá povedenie k zhlukovaniu medzi 60 % a 90 % po 24 hodinách od kultivácie.
On a dilution plate, each sample containing 1 % Triton X-100 and the positive controls shall be diluted with buffer solution (namely, phosphate buffered saline (PBS)-T-BSA, 1 % BSA) in a 4-fold dilution: undiluted, 1:4, 1:16, 1:64.
Na tento účel sa podľa možnosti použijú bunky EPC z dôvodu ich silnej priľnavosti k skleným povrchom, pričom však môžu byť použité aj iné bunkové línie, ako je BF-2, RTG-2 alebo FHM.
The ELISA plates shall be washed in PBS containing 0,05 % Tween-20 (PBS-T) and 50 μl of each dilution shall be transferred from the dilution plate to the washed and coated ELISA-plate.
150 μl supernatantu bunkovej kultúry v dvoch rozdielnych riedeniach (1:10 and 1:1000) sa naočkuje duplicitne na jednodňové jednovrstvové bunkové kultúry a inkubuje pri teplote 15 °C počas 24 hodín;
ELISA plates shall then be incubated for 30 minutes at 37 °C.
médium na kultiváciu buniek sa následne odstráni a infikované jednovrstvové bunkové kultúry sa fixujú 0,5 ml ľadového vodného acetónového roztoku (80 % vol:vol).
Subsequently plates shall be washed and incubated for 30 minutes at 37 °C with specific monoclonal antibodies (namely for VHSV identification MAb IP5B11 and for IHNV Hyb 136-3, respectively).
Fixácia sa uskutoční v digestóriu počas 15 minút pri izbovej teplote, potom sa acetónový roztok odstráni a krycie sklíčka sa aspoň 30 minút sušia na vzduchu.
50 μl of horseradish-peroxidase (HRP) conjugated rabbit anti mouse antibodies diluted 1:1000 in PBS-T-BSA shall be transferred to the ELISA plate.
V tejto fáze sa platničky buď ihneď spracujú alebo skladujú pri teplote – 20 °C na ďalšie použitie;
Finally, after renewed washing the reactions shall be developed adding 50 μl/well of ortho-phenylenediamine (OPD).
špecifické monoklonálne protilátky (na identifikáciu VHSV sa použije monoklonálna protilátka MAb IP5B11 a na identifikáciu IHNV sa použije Hyb 136-3, v danom poradí) sa zriedia v 0,01 M PBST, pH 7,2, v pomere odporučenom dodávateľom týchto monoklonálnych protilátok; 50 až 100 μl/jamku sa pridá k fixovanej jednovrstve a platničky sa inkubujú počas jednej hodiny pri teplote 37 °C vo vlhkej komore;
The ELISA plates shall be incubated for 20 minutes at room temperature in the dark and the reaction shall be stopped by adding 100 μl/well 0,5 M H2SO4.
krycie sklíčka sa trikrát jemne premyjú PBS s obsahom 0,05 % Tween-20 (PBS-T) a tlmivý roztok sa po poslednom premytí úplne odstráni.
The absorbance shall be monitored at a wavelength of 492 and 620 nm in an ELISA reader.
Bunky sa potom inkubujú počas jednej hodiny pri teplote 37 °C s protilátkami proti myšiemu imunoglobulínu konjugovanými s fluorescenčným izotiokyanátom (FITC) alebo tetrametylrodamín-5-(and-6-) izotiokyanátom (TRITC), použitých ako primárna protilátka, zriedených podľa pokynov dodávateľa, potom sa opäť premyjú PBS-T a sušia.
Samples shall be designated positive or negative after comparing the test results to the absorbance values for the positive and negative controls.
Farbené kultúry sa montujú na podložných sklíčkach s použitím roztoku glycerínu a vyšetrujú pod dopadajúcim ultrafialovým (UV) svetlom.
In general, samples with combined absorbance (A) < 0,5 for undiluted material shall be considered negative, samples with A values between 0,5 and 1,0 shall be considered suspicious and samples with A values > 1,0 shall be considered positive.
Používajú sa okuláre 10 × alebo 12 × a šošovky objektívu × 25 alebo × 40 s numerickou apertúrou > 0,7 a > 1,3 (v danom poradí).
Other ELISA versions with a proven similar efficacy may be used instead of those referred to in this point.
Pokiaľ ide o bunkové kultúry, fixáciu a protilátky referenčnej kvality, môžu byť alternatívne použité iné metódy IF s podobnou preukázanou účinnosťou.
Immunofluorescence- IF
Neutralizácia
The identification of listed pathogens VHSV and IHNV shall be performed by infecting cells in ‘Black’ 96-well plates, conventional 24-well plates or cover slips into 24-well plates.
Bunky sa z odobratého supernatantu odstránia centrifugáciou (2000 až 4000 × g) alebo membránovou filtráciou (0,45 μm) s membránou s nízkou väzbou bielkovín a supernatant sa zriedi v pomere 1:100 and 1:10000 v médiu na kultiváciu buniek.
When IHNV or VHSV or both are identified by infecting cells on cover slips, the following protocol shall apply:
Pomerné časti minimálne dvoch riedení supernatantu sa zmiešajú a inkubujú počas 60 minút pri teplote 15 °C s rovnakými časťami nasledovných činidiel osobitne:
cover slips shall be seeded with cells at a density leading to between 60 % and 90 % confluence after 24 hours of cultivation.
sérum obsahujúce skupinovo špecifickú protilátku proti VHSV pri riedení 1:50 (obj:obj);
EPC cells shall be used where possible for this purpose because of their strong adherence to glass surfaces, but other cell lines such as BF-2, RTG-2 or FHM may be used as well.
sérum obsahujúce skupinovo špecifickú protilátku proti IHNV pri riedení 1:50 (obj:obj);
150 μl cell culture supernatant in two different dilutions (1:10 and 1:1000) shall be inoculated in duplicate onto 1-day-old monolayers and incubated at 15 °C for 24 hours;
zmesné antiséra proti indigénnym sérotypom IPNV pri zriedení 1:50 (obj:obj);
subsequently, cell culture medium shall be removed, and the infected cell monolayers fixed with 0,5 ml ice-cold, aqueous acetone solution (80 % vol:vol).
samotné médium (pozitívna kontrola).
Fixation shall take place in fume hood for 15 minutes at room temperature, then the acetone solution shall be removed and the cover glasses shall be air dried for at least 30 minutes.
Z každej zmesi vírusového supernatantu a séra sa naočkujú aspoň dve bunkové kultúry (každá 50 μl) a potom sa inkubujú pri teplote 15 °C.
At this stage, the plates shall either be processed immediately or stored at – 20 °C for further use;
Vývoj CPE sa kontroluje podľa opisu v bode I.5.4.