natgillin/translations-raw huggingface dataset:
However, if the concentration of the test chemical in solution has been satisfactorily maintained within ± 20 % of the nominal concentration throughout the test, then the results can either be based on nominal or measured values.
Vyhodnotiť sekundárne pohlavné znaky.
Observations and measurements
Narezať tkanivá na analýzu VTG.
Stage of embryonic development
Zafixovať gonády.
The exposure should begin as soon as possible after fertilisation and before cleavage of the blastodisc commences and no later than 12 h post fertilisation to ensure exposure during early embryonic development.
Rezy sa zafarbia hematoxylín-eozínom.
Hatching and survival
Ryby by sa mali usmrtiť bezprostredne pred pitvou.
for eggs:
Odváži sa mokrá hmotnosť ryby.
particularly in the early stages, a marked loss of translucency and change in coloration, caused by coagulation and/or precipitation of protein, leading to a white opaque appearance;
Na prípravu tkanív na analýzu VTG sa ryba môže umiestniť na korkovú dosku na stolík disekčného mikroskopu.
for larvae and juvenile fish:
V prípade dánia pruhovaného sa hlava odreže bezprostredne za prsnou plutvou a chvost bezprostredne za chrbtovou plutvou.
immobility and/or absence of respiratory movement and/or absence of heart-beat and/or white opaque coloration of central nervous system and/or lack of reaction to mechanical stimulus.
V prípade medaky japonskej sa brucho otvorí opatrne vedeným rezom po ventrálnej stredovej čiare od hrudného pletenca po bod tesne kraniálne od análneho otvoru.
However, in accordance with Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes, if abnormalities result in pain, suffering and distress or lasting harm, and death can be reliably predicted, animals should be anaesthetised and euthanised according to the description in paragraph 44 and treated as mortality for data analysis..
Fixačná nádoba sa jemne premiešava päť sekúnd, aby sa z kazety uvoľnili vzduchové bubliny.
These observations will result in some or all of the following data being available for reporting:
Dehydratovať tkanivo tak, aby sa zabezpečil dostatočný prienik parafínu.
cumulative mortality;
Impregnovať tkanivo parafínom, aby sa zachovala celistvosť tkanív a vytvoril pevný povrch umožňujúci mikrotómiu.
numbers of healthy fish at end of test;
Označené kazety s tkanivami sa vyberú z formalínu/etanolu a umiestnia do spracovacieho koša (spracovacích košov).
time to start of hatching and end of hatching;
Spracovací kôš sa vloží do prístroja na spracovanie tkaniva.
length and weight of surviving animals;
Zvolí sa harmonogram spracovania.
numbers of deformed larvae;
Po tom, ako prístroj na spracovanie tkaniva dokončil spracovací cyklus, kôš/koše sa môže/môžu preniesť do zalievacieho zariadenia.
numbers of fish exhibiting abnormal behaviour.
Zalievanie
Sampling of fish
Prvá fáza mikrotómie označovaná ako ‚približovanie‘ (facing) sa vykonáva takto:
Fish sampling is performed at termination of the test.
Správne umiestniť vzorku do stuhnutého parafínu na účely mikrotómie.
Sampled fish should be euthanised with e.g. MS-222 (100-500 mg per l buffered with 200 mg NaHCO3 per l) or FA-100 (4-allyl-2-methoxyphenol: eugenol) and individually measured and weighed as wet weight (blotted dry) or anaesthetised if a blood sample should be taken (see paragraph 49).
Koše s kazetami sa vyberú z prístroja na spracovanie tkaniva a ponoria do prednej komory tepelnej konzoly zalievacieho zariadenia naplnenej parafínom alebo sa kazety prenesú do samostatného parafínového ohrievača.
Sampling for VTG analysis and sex determination via histological evaluation
Prvá kazeta, ktorá sa má zaliať, sa vyberie z prednej komory tepelnej konzoly alebo parafínového ohrievača.
All fish should be sampled and prepared for analysis of sex and VTG.
Kryt kazety sa odstráni a zlikviduje a označenie kazety sa porovná so záznamami o živočíchovi, aby sa pred zaliatím vyriešili prípadné nezrovnalosti.
All fish should be analysed histologically to determine sex.
Vyberie sa zalievacia forma vhodnej veľkosti.
For the VTG measurements, a sub-sampling of at least 16 fish from each replicate is accepted.
Forma sa podrží pod výpustom dávkovacej konzoly a naplní roztaveným parafínom.
More fish should be analysed for VTG if the results of the sub-sampling turn out to be unclear.
Vzorka sa vyberie z kazety a umiestni do roztaveného parafínu vo forme.
The sampling procedure for VTG and sex determination is dependent on the VTG analysis method:
To sa zopakuje so štyrmi až ôsmimi vzorkami pre každú parafínovú formu.
Head/tail homogenate method for VTG analysis
Pozícia jednotlivých rýb sa označí tak, že ryba č. 1 sa natočí do 180 stupňov vzhľadom na ryby 2 – 4/8.
The fish is euthanised.
Pridá sa ďalší parafín na prekrytie vzorky.
Head and tail of each fish are separated from the body of the fish by cuts made right behind the pectoral fins, and right behind the dorsal fin, using a scalpel (See Figure 1).
Forma s kazetovou základňou sa umiestni na chladiacu platňu kryokonzoly.
The head and tail part from each fish are pooled, weighed and individually numbered, frozen in liquid nitrogen and stored at – 70° or less for VTG analysis.
Po stuhnutí parafínu sa blok (t. j. stvrdnutý parafín obsahujúci tkanivá a kazetovú základňu) vyberie z formy.
The body part of the fish is numbered and fixed in an appropriate fixative for histological evaluation (22).
Mikrotómia Cieľ:
By use of this method VTG and histopathology are evaluated on each individual and a possible change in the VTG level can thus be related to the phenotypic sex of the fish or genetic sex (Japanese medaka and the three-spined stickleback) of the fish.
Narezať a upevniť histologické rezy na účely farbenia.
For further information see guidance for homogenisation (Appendix 5) and guidance for VTG quantification (Appendix 6).
Postupy:
Liver homogenate method for VTG analysis
Parafínový blok sa umiestni do skľučovadla mikrotómu. b) Skľučovadlo sa posúva otáčaním kolieska mikrotómu, pričom sa z parafínového povrchu bloku odrezávajú hrubé rezy, kým nôž nedosiahne zaliate tkanivá.
The liver is dissected out and stored at – 70 °C or below.
Skľučovadlo sa posúva a z bloku sa odrežú viaceré rezy, aby sa odstránili prípadné artefakty vytvorené na reznom povrchu tkaniva pri hrubom rezaní. d) Blok možno vybrať zo skľučovadla a položiť prednou stranou nadol na ľad, aby tkanivo nasiaklo.
Recommended procedures for liver excision and pre-treatment are available in OECD TG 229 (37) or Chapter C.37 of this Annex (38).
Ďalšou fázou mikrotómie je konečné rezanie a pripevnenie rezov tkaniva na podložné sklíčka.
Livers are then individually homogenised as described in OECD TG 229 or Chapter C.37 of this Annex.
Tieto postupy sa vykonávajú takto: a) Ak bol blok uložený na ľade, sníme sa z ľadu a znova sa vloží do skľučovadla mikrotómu.
The supernatant collected is used for measuring VTG with a homologous ELISA technique (see Appendix 6 for an example of quantification in zebrafish or OECD TG 229 (37) for Japanese medaka).
Pre každý súbor rýb sa pripravia tri rezy.
Following this approach, it is also possible to have individual fish data on both VTG and gonad histology.
Druhý a tretí rez sa urobia v odstupoch 50 mikrónov od prvého rezu.
Blood plasma method for VTG analysis
Ak sú ryby zaliate tak, že ich gonády nie sú v rovnakej úrovni rezu, treba urobiť viac rezov, aby sa z každej ryby získalo aspoň šesť rezov s gonádami.
Blood is collected from the anaesthetised fish by cardiac puncture, caudal vein or tail cutting, and centrifuged at 4 °C for plasma collection.
Perom na označovanie podložných sklíčok sa na sklíčko napíše číslo bloku, z ktorého sa podložné sklíčko vyrobilo.
The plasma is stored at – 70 °C or below until use.
Podložné sklíčko sa umiestni do farbiaceho stojana.
The whole fish is euthanised and fixed for histology.
Blok sa vyberie zo skľučovadla a položí prednou stranou nadol na účely skladovania.
Both plasma samples and fish are numbered individually to relate VTG levels to the sex of the fish.
Farbenie, zakrytie krycím sklíčkom a označenie podložného sklíčka
How to cut a fish for measurement of VTG in head/tail homogenate and histological evaluation of the mid section
Zafarbiť rezy na histopatologické vyšetrenie.
Genetic sex determination
Trvalo zakryť pripevnené a zafarbené tkanivá.
A biological sample for the determination of the genetic sex is taken from individual fish in species possessing appropriate markers.
Trvalo identifikovať zafarbené rezy spôsobom, ktorý umožňuje úplnú vysledovateľnosť.
A detailed description is given in Appendix 9 including tissue sampling and sex determination by a PCR-method.
Farbenie a) Pred farbením sa podložné sklíčka cez noc vysušia vzduchom.
Equally, for the three spined stickleback, a description of tissue sampling and a sex determining PCR-method is given in Appendix 10.
Zakrytie krycím sklíčkom
VTG measurement
Krycie sklíčka možno uložiť ručne alebo automaticky.
The measurement of VTG should be based upon a quantitative and analytically validated method.
Približne 0,1 ml upevňovacieho média sa aplikuje do blízkosti konca podložného sklíčka oproti matnému koncu alebo na krycie sklíčko.
Information should be available upon the intra-assay and inter-assay variability of the method used in a given laboratory.
Pri ukladaní na podložné sklíčko sa krycie sklíčko nakloní pod ostrým uhlom.
Considering the variability of VTG measurement, NOECs based on this endpoint alone should be treated with great care.
Každé označenie podložného sklíčka by malo obsahovať tieto informácie.
Different methods are available to assess VTG production in the fish species considered in this assay.
Názov laboratória
A measurement technique that is both relatively sensitive and specific is the determination of protein concentrations via enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
Č. vzorky/č. sklíčka
Homologous antibodies (raised against VTG of the same species) and most important homologous standards should be used.
Chemikália/skupina s danou koncentráciou
Sex determination
Štatistická schéma pre analýzu vitellogenínu
Dependent on the VTG sampling procedure, whole fish or the remaining mid-section of each fish is placed in a pre-labelled processing cassette and fixed in an appropriate fixative for histological determination of sex (optionally also for evaluation of gonadal staging).
Nenormálne v hierarchickej ANOVE
Guidance on fixation and embedding is provided in Appendix 7 as well as in the OECD Guidance Document on the Diagnosis of Endocrine-Related Histopathology of Fish Gonads (22).
Dunnettov test pre hierarchickú ANOVU
The individuals should be placed longitudinally in the paraffin block.
Normalizačná transformácia?
At least six longitudinal sections (3-5 μm in thickness) in a frontal plane including gonadal tissue from both gonads are taken from each individual.
Transformácia na stabilizáciu rozptylu?
The interval between these sections should be approximately 50 μm for males and 250 μm for females.
Nerovnaké rozptyly
However, since each block will often contain males and females (if more than one individual are embedded in each block), the interval between sections from these blocks should be approximately 50 μm until at least six sections of the gonads from each male are obtained.
≤ 3 repl. na konc.
Thereafter, the interval between sections can be increased to approximately 250 μm for the females.
Monotónna
Sections are stained with haematoxylin and eosin and examined by light-microscopy with focus on sex (male, female, intersex or undifferentiated).
≥ 4 repl. na konc. ≤ 3 repl. na konc.
Intersex is defined as presence of more than one oocyte in testis per six sections analysed or spermatogenic cells (yes/no) in ovaries.
Dunnov test ≥ 4 repl. na konc.
Histopathology and staging of ovaries and testis is optional but if investigated, the results should be statistically analyzed and reported.
Zostupný Jonckheereho alebo Williamsov test
It should be noted that some fish species naturally lack a fully developed pair of gonads and only one gonad may be present (e.g. Japanese medaka and occasionally zebrafish).
Nemonotónna
All such observations should be recorded.
Porovnajte kontrolné vzorky pomocou Wilcoxonovho testu alebo t-testu.
Genetic sex determination in individual Japanese medaka is based on the presence or absence of the medaka male-sex determining gene, DMY, which is located on the Y chromosome.
Líšia sa?
The genotypic sex of medaka can be identified by sequencing the DMY gene from DNA extracted from for instance a piece of anal fin or dorsal fin.
Je prítomná kontrolná vzorka s rozpúšťadlom i bez neho.
The presence of DMY indicates a XY (male) individual regardless of phenotype, while the absence of DMY indicates a XX (female) individual regardless of phenotype (23).
Štatistická schéma pre analýzu pomeru pohlaví
Guidance for tissue preparation and PCR method is given in Appendix 9.
Ak sú rozptyly homogénne (*), na stanovenie NOEC použite Dunnettov test, inak Tamhaneho-Dunnettov (T3) test
The genetic sex determination in individual three-spined stickleback is also performed via a PCR method, described in Appendix 10.
Dunnov alebo Mannov-Whitneyho U-test s Bonferroniho-Holmovou úpravou na stanovenie NOEC Áno
The occurrence of intersex (for definition, see Appendix 1) should be reported.
Sú údaje normálne rozdelené?
Secondary sexual characteristics
Sú údaje v súlade s monotónnou reakciou na dávku?
Secondary sexual characteristics are under endocrine control in species like the Japanese medaka;
(‡) Alebo iný dohodnutý kontrolný výber
therefore observations of physical appearance of the fish should if possible be made at the end of the exposure.
Arkussínusová transformácia druhej odmocniny
In the Japanese medaka, the papillary formation on the posterior part of the anal fin in females is androgen sensitive.
(+) V prípade menej než piatich pokusných jednotiek na aplikovanú koncentráciu by sa mal použiť exaktný Jonckheereho-Terpstrov alebo Mannov-Whitneyho test, ak je k dispozícii
Chapter C.37 of this Annex (38) provides relevant photographs of male secondary sex characteristics and androgenised females.
Skombinujte kontrolné vzorky
It is important that the strongest valid statistical test determine the endpoint.
Vyraďte kontrolnú vzorku s vodou (‡)
The replicate is the experimental unit but intra-replicate variability should be included in the statistical testing.
Porovnajte kontrolné vzorky pomocou t-testu.
A decision flow-chart is available in Appendix 8 to help with the most appropriate statistical test to use based on the characteristic of the data obtained from the test.
Používa sa rozpúšťadlo? s
Statistical significance level is 0,05 for all endpoints included.
Dodatok 9
Proportions of sex and genetic sex
Usmernenie na odber vzoriek tkanív na účely určenia genetického pohlavia a na účely určenia genetického pohlavia metódou PCR
The proportions of sex should be analysed for significant effect (NOEC/LOEC approach) of exposure by Jonckheere-Terpstra (Trend test) if a monotone dose-response exists.
Odber vzoriek tkanív, ich príprava a skladovanie pred určením genetického pohlavia metódou PCR pri medake (pripravené Laboratóriom pre vodné organizmy spoločnosti Bayer CropScience AG)
If non-monotonicity is found then a pair wise test should be applied:
Jemnými nožnicami sa odstrihne análna alebo chrbtová plutva každej jednotlivej ryby a umiestni sa do skúmavky naplnenej 100 μl extrakčného tlmivého roztoku 1 (podrobnosti o príprave tlmivého roztoku nájdete ďalej).
Use Dunnett's test if normality and homogenous variance can be obtained.
Nožnice sa po každej rybe vyčistia v kadičke naplnenej destilovanou vodou a usušia papierovou vreckovkou.
Use Tamhane-Dunnett if heterogeneous variance is present.
Tkanivá z plutiev sa následne homogenizujú mikrotrubičkovým teflónovým piestikom, aby sa dosiahla lýza buniek.
Otherwise use exact Mann-Whitney test with Bonferroni-Holm adjustment.
Pre každú skúmavku sa použije nový piestik, aby nedošlo ku kontaminácii.
A flow chart describing the statistics of the proportions of sex is placed in Appendix 8.
Piestiky sa cez noc umiestnia do 0,5 M NaOH, 5 minút sa oplachujú v destilovanej vode a až do ich použitia sa skladujú v etanole alebo sterilnom prostredí po sterilizácii v autokláve.
The proportions of sex should be presented in tables as concentration proportions ± SD of males, females, intersex and undifferentiated.
Tkanivo z plutvy možno skladovať aj bez extrakčného tlmivého roztoku 1 na suchom ľade a potom v chladničke pri teplote – 80 °C, aby nedošlo k degenerácii DNA.
Statistical significance should be highlighted.
Extrakcia však funguje lepšie, ak sa zároveň extrahuje DNA (pokyny na manipuláciu sú uvedené vyššie, vzorky sa po skladovaní pri teplote – 80 °C majú pred naplnením tlmivého roztoku do skúmaviek rozmraziť na ľade).
Examples are presented in the FSDT Phase 2 validation report (42).
Po homogenizácii sa všetky skúmavky umiestnia do vodného kúpeľa a varia 15 minút pri teplote 100 °C.
Genetic sex should be reported as percentage of phenotypic sex reversal of males, females, intersex and undifferentiated.
Potom sa do každej skúmavky pipetou pridá 100 μl extrakčného tlmivého roztoku 2 (podrobnosti o príprave tlmivého roztoku nájdete ďalej).
VTG concentrations
Vzorky sa 15 minút skladujú pri izbovej teplote a v priebehu skladovania sa občas jemne pretrepú rukou.
VTG concentrations should be analysed for significant effect (NOEC/LOEC approach) of exposure.
Potom sa všetky skúmavky znova umiestnia do vodného kúpeľa a varia 15 minút pri teplote 100 °C.
The Dunnett test is preferable to the t-test with Bonferroni correction.
Až do ďalšej analýzy sa skúmavky zmrazia na teplotu – 20 °C.
Where a Bonferroni correction is used, the Bonferroni-Holm correction is preferable.
Príprava tlmivého roztoku
Allowance should be made for log-transformation of VTG to achieve normality and variance homogeneity.
Tlmivý roztok na PCR 1:
Next, if the concentration-response is consistent with monotonicity, then the JonckheereTerpstra test is preferable to any of the above.
500 mg N-lauroylsarkozínu (napr. Merck KGaA, Darmstadt, Nemecko),
If t-tests or Dunnett's test is used, there is no need for a ANOVA significance F-test in order to proceed.
pridajte 100 ml dest.
For details see the flow chart in Appendix 8.
→ sterilizujte v autokláve.
Results should be reported in tables as concentration means ± SD for males, females, intersex and undifferentiated separately.
Tlmivý roztok na PCR 2:
Statistical significance for phenotypic females and phenotypic males should be highlighted.
20 g Chelex (napr. Biorad, Mníchov, Nemecko),
Test chemical actual concentrations
nechajte nasiaknuť v 100 ml dest.
The actual chamber concentrations of the test chemical should be analysed in frequencies described in paragraph 34.
Určenie genetického pohlavia metódou PCR pri medake (pripravené Laboratóriom pre vodné organizmy spoločnosti Bayer CropScience AG a centrom Universität Würzburg Biozentrum)
Results should be reported in tables as mean concentration ± SD on replicate basis as well as on concentration basis with information on number of samples and with outliers from the mean treatment concentration ± 20 % highlighted.
Pripravené a zmrazené skúmavky (opísané v predchádzajúcom oddiele) sa rozmrazia na ľade.
Examples can be found in the FSDT Phase 2 validation report (42).
Potom sa odstredia s použitím Eppendorfovej odstredivky (30 s pri max. rýchlosti pri izbovej teplote).
The test results should be interpreted with caution where measured test chemical concentrations in test solutions occur at levels near the detection limit of the analytical method.
Na analýzu PCR sa použije čistý supernatant oddelený od zrazeniny.
Relevant physical-chemical properties;
Je bezpodmienečne nevyhnutné zabrániť tomu, aby sa akékoľvek stopy látky Chelex (nachádzajúce sa na zrazenine) preniesli do reakcie PCR, lebo to naruší pôsobenie ‚Taq‘-polymerázy.
chemical identification data including purity and analytical method for quantification of the test chemical.
Supernatant sa použije priamo alebo sa môže skladovať zmrazený (– 20 C) a na účely ďalších analýz sa môže znova rozmraziť vo viacerých cykloch bez toho, aby to malo negatívny vplyv na DNA.
Test procedure used (e.g. flow-through semi-static/renewal);
Príprava ‚reakčnej zmesi‘ (25 μl na vzorku):
test design including test concentrations, method of preparation of stock solutions (in an Annex), frequency of renewal (the solubilising agent and its concentration should be given, when used);
Objem
The nominal test concentrations, the means of the measured values and their standard deviations in the test chambers and the method by which these were attained (the analytical method used should be presented in an Annex);Evidence that the measurements refer to the concentrations of the test chemical in true solution;
Konečná koncentrácia
Water quality within test chambers:
Templátová DNA
Detailed information on feeding (e.g. type of food(s), source, amount given and frequency and analyses for contaminants (e.g. PCBs, PAHs and organochlorine pesticides) if relevant.
0,5 μl – 2 μl
Evidence that controls met the validity criteria:
10 × tlmivý roztok na PCR s MgCl2
data on hatching rate should be presented in tables as percentage per replicate and per concentration.
2,5 μl
Outliers from the acceptance criteria (in controls) should be highlighted.
Nukleotidy (každý spomedzi dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Survival should be presented as percentage per replicate and per concentration.
Priamy primer (10 μM) (pozri ďalej 3 – 5)
Outliers from the validity criteria (in controls) should be highlighted;
0,5 μl
Clear indication of the results obtained on the different endpoints observed:
Reverzný primer (10 μM) (pozri ďalej 3 – 5)
embryo survival and hatching success;
Voda (kvalita na PCR)
external abnormalities;
do 25 μl
length and weight;
Taq E-polymeráza
VTG measurements (ng/g homogenate, ng/ml plasma or ng/mg liver);
0,3 μl
gonadal histology, sex ratio, genetic sex data;
10 × tlmivý roztok na PCR s MgCl2:
incidence of any unusual reactions by the fish and any visible effects produced by the test chemical.
670 mM Tris/HCl (pH 8,8 pri 25 °C), 160 mM (NH4)2SO4, 25 mM MgCl2, 0,1 % Tween 20
The results should be presented as mean values ± standard deviation (SD) or standard error (SE).
Na každú analýzu PCR (pozri ďalej 3 – 5) je potrebný špeciálny primer ako nová kombinácia ‚reakčnej zmesi‘ a primeraného potrebného množstva templátovej DNA pre každú vzorku (pozri vyššie).
Statistics should be reported as a minimum as NOEC and LOEC and confidence intervals.
Príslušné objemy sa pipetami prenesú do nových skúmaviek.
The statistical flow chart (Appendix 8) should be followed.
Potom sa všetky skúmavky uzavrú, premiešajú (približne 10 s) a odstredia (10 s pri izbovej teplote).
Sumpter, 1996, “Inhibition of testicular growth in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) exposed to estrogenic alkylphenolic chemicals”, Environmental Toxicology and Chemistry 15, pp. 194-202.
Teraz možno spustiť príslušné programy PCR.
Sumpter, J.P. and S. Jobling, 1995, “Vitellogenesis As A Biomarker for Estrogenic Contamination of the Aquatic Environment”, Environmental Health Perspectives 103, pp. 173-178.
Okrem toho sa v každom programe PCR použije pozitívna kontrolná vzorka (exemplárna vzorka DNA so známym pôsobením a jasnými výsledkami) a negatívna kontrolná vzorka (1 μl dest. vody).
Hutchinson, S. Maddix, and H. Trip (1999), “An in vivo testing system for endocrine disruptors in fish early life stages using induction of vitellogenin”, Environmental Toxicology and Chemistry 18, pp. 337-347.
Príprava agarózového gélu (1 %) – počas vykonávania programov PCR:
Pedersen, and P. Bjerregaard (2001a), “Development of an ELISA for vitellogenin in whole body homogenate of zebrafish (Danio rerio)”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 130, pp. 119-131.
Rozpustite 3 g agarózy v 300 ml tlmivého roztoku 1 × TAE (1 % agarózový gél).
Andersen, L., P. Bjerregaard, and B. Korsgaard (2003), “Vitellogenin induction and brain aromatase activity in adult male and female zebrafish exposed to endocrine disrupters”, Fish Physiology and Biochemistry 28, pp. 319-321.
Tento roztok sa musí povariť v mikrovlnnej rúre (približne 2 – 3 min.).