natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Reverse primer (KHV-TKr): 5′-CACCCAGTAGATTA TGC-3′.
Ak sa v oblasti, ktorá predtým nebola potvrdená ako pozitívna, objavia pozitívne vzorky, výsledky testu sa potvrdia buď:
Cycling conditions: one cycle of 95 °C for 5 minutes followed by 35 cycles of 95 °C for 30 seconds, 52 °C for 30 seconds, 72 °C for one minute and one cycle of 72 °C for 10 minutes.
sekvenovaním produktu PCR alebo vnorenej PCR zo vzoriek.
Product size should be 409 bp.
Získaná čistá konsenzus sekvencia zodpovedá (najmenej 98 %) týmto referenčným sekvenciám;
Furthermore, false-positive results may occur because of false primer annealing or contamination.
alebo alternatívne sa vzorky môžu poslať do národného referenčného laboratória na potvrdenie.
However, other PCR versions of proven similar efficacy may be used instead.
qPCR na detekciu KHV
The first detection in an area shall be confirmed by sequencing or sent to a to a national reference laboratory or to the EU reference laboratory for fish diseases referred to in Annex VI to Directive 2006/88/EC, for immediate identification.
Použije sa qPCR zodpovedajúca tomuto opisu:
Detailed diagnostic methods and procedures for the surveillance of KHVD
Podmienky cyklovania: jeden cyklus pri 95 °C počas 15 minút, po ktorom nasleduje 50 cyklov pri 94 °C počas 15 sekúnd a 60 °C počas 60 sekúnd.
When sampling and laboratory examination for the purpose of obtaining or maintaining certain health statuses with regard to KHVD as set out in Section I of Part 2 of Annex I are carried out using the diagnostic methods set out in Sections II or III of Part 2 of that Annex, the detailed diagnostic methods and procedures set out in the following points II.1 and II.2 of this Part shall apply.
Výsledky qPCR sa môžu líšiť v závislosti od podmienok, v ktorých sa vykonáva, konkrétne môže byť v závislosti od používaného termocykléra potrebné optimalizovať termálne protokoly.
If possible, fish that have been kept for a prolonged time period at the virus permissive temperature range (namely, 2 to 3 weeks at 15 °C to 26 °C) shall be sampled.
Štandardná PCR na potvrdenie detekcie KHV
If possible, samples shall be collected 24 hours but not later than 72 hours after management practices that may reactivate the virus in fish with a carrier status, such as netting or transport, in order to enhance the chance of KHV detection.
Na potvrdenie prítomnosti infekcie KHV sa použije štandardná vnorená PCR opísaná v nasledujúcej tabuľke 2.1, po ktorej nasleduje sekvenovanie amplifikovaného produktu.
For the purpose of the surveillance of KHVD, the fish may be sent alive or killed and packed separately in sealed aseptic containers or alternatively frozen organs or organ pieces preserved in 80 % to 100 % alcohol or viral transport medium (to be processed within 48 hours after collection) may be used for testing PCR based methods.
Tabuľka 2.1
For the surveillance of KHVD, gill and kidney tissue shall be collected.
Primery a podmienky na vnorenú PCR zameranú na všetky koi herpesvírusy (CyHV-1, CyHV-2 a CyHV-3)
For the purpose of surveillance of KHVD, pooling shall be avoided where possible.
Názov primeru
If pooling is necessary, tissue material from a maximum of two fish may be pooled.
Sekvencia
Larger samples shall be homogenised in mortar and pestle or stomacher, and subsamples retrieved for DNA extraction before clarification.
Podmienky cyklovania
Alternatively, subsamples may be collected from each tissue included in the sample and placed in ‘lysis-tubes’.
Veľkosť produktu
Commercially available DNA extraction kits that produce high quality DNA suitable for use with the PCR protocols set out in point II.2 may be used.
CyHVpol-priamy
The acceptable tissue medium ratio shall be 1:9 w/v.
Prvé kolo PCR
20 to 25 mg tissue material shall be included in the tests.
1 cyklus:
Surveillance of KHVD by PCR based methods
95 °C počas 2 minút
For the surveillance of KHV, a qPCR shall be used.
40 cyklov:
If positive samples appear in an area not previously confirmed positive, the test results shall be confirmed either:
95 °C počas 30 sekúnd
by sequencing of a PCR or nested PCR product from the samples.
55 °C počas 30 sekúnd
The obtained clean consensus sequence shall match (by at least 98 %) with these reference sequences.
72 °C počas 45 sekúnd
or alternatively, samples may be sent to a national reference laboratory for confirmation.
72 °C počas 10 minút
qPCR for KHV detection
CyHVpol-reverzný
The qPCR described as follows shall be used:
CyHVpol-vnútorný priamy
Cycling conditions: one cycle of 95 °C at 15 minutes, followed by 50 cycles of 94 °C at 15 seconds and 60 °C for 60 seconds.
Druhé kolo PCR
The results of the qPCR may vary depending on the conditions under which it is performed, namely the thermal protocols might need optimisation, depending on the thermal cycler in use.
95 °C počas 2 minút,
Conventional PCR for confirmation of KHV detection
CyHVpol-vnútorný reverzný
For confirmation of the presence of infection with KHV, the generic nested PCR described in the following Table 2.1 shall be used followed by sequencing of the amplified product.
Namiesto nej môžu byť použité verzie PCR s preukázanou podobnou účinnosťou.
Table 2.1
Sekvenovanie môže vykonávať laboratórium alebo sa môže vykonávať v externých spoločnostiach špecializovaných na sekvenovanie.
Primers and conditions for the nested PCR assay targeting all cyprinid herpesviruses (CyHV-1, CyHV-2 and CyHV-3)
Výsledky sekvenovania sa analyzujú zosúladením sekvencií na známe referenčné sekvencie KHV (prístupové čísla v Gen Bank sú AP008984, DQ657948 a DQ177346).
Primer name
Získaná čistá konsenzus sekvencia musí zodpovedať uvedeným referenčným sekvenciám aspoň na 98 %.
Sequence
PODROBNÉ DIAGNOSTICKÉ METÓDY A POSTUPY NA DOHĽAD NAD INFEKČNOU ANÉMIOU LOSOSOV (ISA) A NA POTVRDENIE INFEKČNEJ ANÉMIE LOSOSOV (ISA)
Cycling conditions
I. Postupy odberu vzoriek na účely dohľadu nad ISA a jej kontroly
Product size
Pri vykonávaní odberu vzoriek a laboratórneho vyšetrenia na účely programov dohľadu alebo eradikačných programov podľa časti 3 prílohy I alebo na potvrdenie alebo vylúčenie prítomnosti ISA v súlade s článkom 57 písm. b) smernice 2006/88/ES sa uplatňujú podrobné metódy a postupy uvedené v bodoch I.1, I.2 a I.3 tejto časti.
CyHVpol-forward
Na účely laboratórneho vyšetrenia na zistenie prítomnosti ISA sa vzorky rýb podľa možnosti nespájajú.
First round PCR
Na účely dohľadu nad ISA je však prijateľné spájanie vzoriek 2 až 5 rýb.
1 cycle:
Vzorky na analýzu polymerázovou reťazovou reakciou spojenou s reverznou transkripciou (RT-PCR) sa odoberajú zo všetkých rýb, ktoré sú predmetom odberu vzoriek.
95 °C 2 minutes
Časť zadnej obličky sa z ryby odstráni použitím sterilného nástroja a prenesie sa do mikroskúmavky, ktorá obsahuje 1 ml roztoku konzervujúceho RNA preukázanej účinnosti.
40 cycles:
Tkanivá maximálne z piatich rýb sa môžu odobrať do jednej skúmavky, ktorá obsahuje prepravný roztok, a predstavujú jednu zmesnú vzorku.
95 °C for 30 seconds
Hmotnosť tkaniva v jednej vzorke je 0,5 g.
55 °C for 30 seconds
Ak sú ryby príliš malé na to, aby sa získala vzorka požadovanej hmotnosti, môžu byť odobraté časti obličky, srdca, sleziny, pečene alebo pylorického slepého čreva v tomto poradí tak, aby ich hmotnosť bola 0,5 g.
72 °C for 45 seconds
Tkanivo na histologické vyšetrenie sa odoberá iba z čerstvo zabitých rýb s normálnou konštitúciou, ktoré vykazujú klinické príznaky alebo nálezy post-mortem svedčiace o prítomnosti ISA.
72 °C for 10 minutes
Vzorky sa odoberú z akýchkoľvek vonkajších alebo vnútorných lézií, v každom prípade sa však z jednotlivých rýb odoberú vzorky zo zadnej obličky, srdca, pečene, pankreasu, čreva, žiaber a sleziny s použitím skalpela a prenesú sa do slaného tlmiaceho roztoku 8 až 10 % (vol:vol) formalínu.
CyHVpol-reverse
Pomer medzi fixatívom a tkanivom je aspoň 20:1, aby sa zabezpečila spoľahlivá konzervácia tkanív.
CyHVpol-internal forward
Na imunohistochémiu (IHC) sa odoberú vzorky zo zadnej obličky a srdca.
Second round PCR
Tkanivá na virologické vyšetrenie na bunkovej kultúre sa odoberajú zo všetkých rýb, ktoré sú predmetom odberu vzoriek.
95 °C 2 minutes,
Časti pečene, prednej alebo zadnej obličky, srdca a sleziny sa z rýb odoberajú pomocou sterilného nástroja a prenesú sa do plastových skúmaviek obsahujúcich 9 ml transportného média.
CyHVpol-internal reverse
Tkanivá maximálne z piatich rýb sa môžu zbierať do jednej skúmavky, ktorá obsahuje prepravný roztok, a to predstavuje jednu zmesnú vzorku.
PCR versions of proven similar efficacy may be used instead.
Hmotnosť tkaniva v jednej vzorke je 1,0 ± 0,5 g.
Sequencing may be performed by the laboratory or at external specialised sequencing companies.
Odosielanie vzoriek rýb
Sequencing results shall be analysed by aligning the sequences to the known reference sequences of KHV (Gen Bank accession numbers AP008984, DQ657948 and DQ177346).
Takisto sa môžu odosielať aj živé ryby, ale iba pod dohľadom národného referenčného laboratória pre choroby rýb a so zohľadnením dodatočných aspektov dezinfekcie a biologickej bezpečnosti pri preprave živých rýb.
The obtained clean consensus sequence must match at least to 98 % with those reference sequences.
Vzorky krvi a skúmavky, ktoré obsahujú tkanivá rýb určené na virologické vyšetrenie alebo analýzu RT-PCR sa umiestnia do izolovaných nádob, ako sú polystyrénové krabice s hrubými stenami, spolu s dostatočným množstvom ľadu alebo mraziacimi blokmi na účely zaistenia chladenia vzoriek počas prepravy do laboratória.
DETAILED DIAGNOSTIC METHODS AND PROCEDURES FOR THE SURVEILLANCE AND CONFIRMATION OF INFECTIOUS SALMON ANEMIA (ISA)
Nesmie dôjsť k zmrazeniu a v prepravnej nádobe musí byť v čase prijatia stále ľad alebo musí byť čiastočne alebo úplne zmrazený jeden alebo viaceré z mraziacich blokov.
I. Sampling procedures for the surveillance and control of ISA
Za mimoriadnych okolností môžu byť vzorky RT-PCR a vzorky na virologické vyšetrenie rýchlo zmrazené a prepravované do laboratória pri teplote – 20 °C alebo nižšej.
When sampling and laboratory examination are carried out, for the purpose of the surveillance or eradication programmes set out in Part 3 of Annex I or to confirm or rule out the presence of ISA in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC, the detailed methods and procedures set out in points I.1, I.2 and I.3 of this Section shall apply.
Na analýzu RT-PCR tkanív konzervovaných v roztoku Ribonucleic acid (RNA) later sa extrakcia RNA vykonáva v rámci týchto časových rámcov v závislosti od teploty, pri ktorej sa vzorky skladujú:
For the purpose of laboratory examination for the presence of ISA, fish samples shall not be pooled where possible.
vzorky skladované pri – 20 °C: na neurčito.
However, for the purpose of surveillance for ISA, the pooling of 2 to be 5 fish is accepted.
Ak sú tkanivá rýb prepravované vo fixatíve na histologické vyšetrenie, odosielajú sa v utesnených skúmavkách umiestnených do nádob odolných voči nárazom.
Samples for Reverse Transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis shall be taken from all of the fish sampled.
Je potrebné vyvarovať sa zmrazeniu vzoriek.
A piece of mid-kidney shall be removed from the fish using a sterile instrument and transferred to a microfuge tube containing one ml RNA preservative solution of proven efficacy.
Na základe schválenia diagnostického laboratória sa môžu odoberať a na doplnkové vyšetrenie pripravovať tkanivá rýb iné ako tie, ktoré sú uvedené v bode I.1.
Tissue from up to five fish may be collected in one tube of transport solution and shall represent one pooled sample.
Podrobné diagnostické metódy a postupy na účely dohľadu nad ISA a na potvrdenie prítomnosti ISA alebo na vylúčenie podozrenia na ISA
Tissue for histological examination shall only be taken from freshly killed fish with a normal constitution, exhibiting clinical signs or post-mortem findings consistent with the presence of ISA.
Diagnostickou metódou, ktorá sa má používať na skríning ISAV, je RT-qPCR.
Any external or internal lesions shall be sampled and in any case samples of mid-kidney, heart, liver, pancreas, gut, gills and spleen shall be removed from individual fish using a scalpel and transferred to 8 % to 10 % (vol:vol) buffered formol saline.
Keďže výsledky RT-qPCR sa môžu líšiť v závislosti od podmienok, za ktorých sa vykonáva, zahrnú sa adekvátne pozitívne a negatívne kontrolné vzorky a amplikóny s cieľom predísť akýmkoľvek pochybnostiam.
The ratio of fixative to tissue shall be at least 20:1 to ensure satisfactory preservation of the tissues.
Extrakcia celej RNA
For immunohistochemistry (IHC), samples from mid-kidney and heart shall be taken.
Celá RNA sa extrahuje použitím fenol-chloroformovej metódy alebo centrifugačných kolón s afinitou k RNA, podľa pokynov výrobcu.
Tissues for virological examination on cell culture shall be taken from all of the fish sampled.
Purifikovaná RNA sa resuspenduje v destilovanej vode bez RNázy (konkrétne vode ošetrenej 0,1 % dietyl pyrokarbonátom).
Pieces of the liver, anterior or mid-kidney, heart and spleen shall be removed from the fish using a sterile instrument and transferred to plastic tubes containing 9 ml transport medium.
Koncentrácia a čistota extrahovanej RNA sa odhaduje meraním optickej hustoty pri 260 nm a pri 280 nm.
Tissues from up to five fish may be collected in one tube containing transport solution and represent one pooled sample.
Alternatívnym spôsobom môže byť zahrnúť vnútorné kontroly zamerané proti genómu vírusu podľa bodu II.1.3.
The weight of tissue in one sample shall be 1,0 ± 0,5 g.
RT-PCR na detekciu ISAV
Shipment of samples from fish
Na amplifikáciu genómu ISAV možno použiť niekoľko metód RT-PCR.
Whole fish may be transported to the laboratory if the temperature requirements during transportation, as described in paragraph 3 of this point can be fulfilled.
Dvojkroková RT-PCR, pričom kroky reakcií RT a PCR prebiehajú v dvoch oddelených skúmavkách.
Whole fish shall be wrapped in absorbent paper and shipped in a plastic bag, chilled as described in that paragraph.
Môže sa však takisto vykonať jednokroková reakcia, kde dané dve reakcie prebiehajú v jednej skúmavke.
Live fish may also be shipped, but only under the supervision of the National reference laboratory for fish diseases and taking into account the additional disinfection and biosecurity issues when transporting live fish.
Vždy, keď je to možné, sa použije jednokroková metóda, keďže pri skúške s jednou skúmavkou sa minimalizuje riziko krížovej kontaminácie, keďže sa nemusí uskutočniť prenos obsahu, a táto metóda sa považuje za rovnako citlivú ako dvojkroková metóda.
Blood samples and tubes containing fish tissues for virological examination or RT-PCR analysis shall be placed in insulated containers, such as thick-walled polystyrene boxes, together with sufficient ice or freeze blocks to ensure chilling of the samples during transportation to the laboratory.
Použijú sa primery a skúška, ktoré sú opísané v tomto bode, konkrétne pár primerov ILA1 alebo ILA2, ktoré sú zamerané na segment 8 a ktoré sa považujú za vhodné na detekciu ohnísk ISAV a pri rybách, ktoré sú prenášačmi.
Freezing shall be avoided and ice must still be present in the transport box at receipt of the shipment or one or more of the ‘freeze blocks’ must still be partly or completely frozen.
Reverzný primer ILA2 nezodpovedá izolátom zo Severnej Ameriky a v uvedených prípadoch sa použije alternatívny súbor primerov.
In exceptional circumstances, RT-PCR samples and samples for virological examination may be snap-frozen and transported to the laboratory at – 20 °C or below.
Priamy primer (ILA1): 5′-GGCTATCTACCATGAACGAATC-3′;
For RT-PCR analysis of tissues preserved in Ribonucleic acid(RNA)later, RNA extraction shall be carried out within the following time frames depending on the temperature the samples are stored at:
Reverzný primer (ILA2): 5′-GCCAAGTGTAAGTAGCACTCC-3′.
samples stored at – 20 °C: indefinitely.
Podmienky cyklovania: jeden cyklus pri 50 °C počas 30 minút, 1 cyklus pri 94 °C počas 15 minút, 40 cyklov pri 94 °C počas 30 sekúnd, 55 °C počas 30 sekúnd a 72 °C počas 60 sekúnd; jeden cyklus pri 72 °C počas 5 min. Veľkosť produktu 155 bp.
If fish tissues are transported in fixative for histological examination, they shall be shipped in leak proof tubes in impact-resistant containers.
Namiesto nej však môžu byť použité iné verzie RT-PCR s preukázanou podobnou účinnosťou.
Freezing of those samples shall be avoided.
RT-qPCR na detekciu ISAV
Subject to the approval of the diagnostic laboratory, fish tissues other than those referred to in point I.1 may be collected and prepared for supplementary examination.
Používanie RT-qPCR môže zvýšiť špecificitu a pravdepodobne aj citlivosť.
Detailed diagnostic methods and procedures for the surveillance and for the confirmation of the presence of or to rule out the suspicion of ISA
Metódu možno vykonať rýchlejšie, keďže sa nevyžaduje gélová elektroforéza, a znižuje sa ňou riziko krížovej kontaminácie, keďže je možné odhadnúť množstvo vírusovej genómovej RNA v skúmavke so vzorkou.
When laboratory examination for the purpose of obtaining or maintaining a certain health status with regard to ISA as set out in Section I of Part 3 of Annex I, or for the purpose of the confirmation of the presence of or to rule out a suspicion of ISA in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC, are carried out, using the diagnostic methods set out in Section II of Part 3 of Annex I, the detailed methods and procedures set out in the following points II.1 to II.5 shall apply.
Nevýhodou skúšky RT-qPCR je, že často nie je možné sekvenovanie amplifikovaných produktov.
Examination of samples by RT-PCR
Ak však existujú pochybnosti o špecifickosti amplifikovaného produktu, musí sa vykonať ďalšia ISAV-špecifická skúška na overenie výsledku.
The diagnostic method to be used for the screening for ISAV shall be RT-qPCR.
Použije sa skúška opísaná v tomto bode, ktorá je skúškou zameranou na segment 8.
As the results of the RT-qPCR can vary depending on the conditions under which it is performed, adequate positive and negative controls and amplicons shall be included to avoid any doubts.
Táto skúška zahŕňa izoláty z Európskej únie, Európskeho združenia voľného obchodu a Severnej Ameriky.
Total RNA extraction
Jednokroková metóda sa použije vždy, keď je to možné, pretože pri skúške s jednou skúmavkou sa minimalizuje riziko krížovej kontaminácie.
Total RNA shall be extracted using the phenol-chloroform method or RNA affinity spin columns, according to the manufacturer's instructions.
Priamy primer: 5′- CTACACAGCAGGATGCAGATGT -3′;
Purified RNA shall be re-suspended in distilled RNase-free water (namely water treated with 0,1 % diethyl pyrocarbonate).
Reverzný primer: 5′- CAGGATGCCGGAAGTCGAT -3′;
The concentration and purity of the extracted RNA shall be estimated by measuring the optical density at 260 nm and at 280 nm.
a sonda: 5′-FAM- CATCGTCGCTGCAGTTC – MGBNFQ-3′.
An alternative approach may be to include internal controls targeted against the virus genome as referred to in point II.1.3.
Podmienky cyklovania: jeden cyklus pri 50 °C počas 30 minút, jeden cyklus pri 95 °C počas 15 minút, 40 cyklov pri 94 °C počas 15 sekúnd, 60 °C počas 60 sekúnd; v prípade potreby sa tieto podmienky upravia.
RT-PCR for ISAV detection
Sekvenovanie amplifikovaných produktov PCR
Several RT-PCR methods may be used for ISAV genome amplification.
Priamy primer (ILAs6-3F): 5′-ATGAGGGAGGTAGCATTGCA -3′;
A two-step RT-PCR may be performed whereby the RT and the PCR reactions steps are run in two separate tubes.
Reverzný primer (ILAs6-2R): 5′-CATGCTTTCCAACCTGCTAGGA -3′.
However, a one-step reaction, where the two reactions are run in one tube, may also be performed.
Podmienky cyklovania (jednokroková RT-PCR): jeden cyklus pri 50 °C počas 30 minút, jeden cyklus pri 94 °C počas 15 minút, 40 cyklov pri 94 °C počas 30 sekúnd, 55 °C počas 30 sekúnd, 72 °C počas 60 sekúnd a jeden cyklus pri 72 °C počas 5 minút; v prípade potreby sa tieto podmienky upravia.
The one-step method shall be used where possible, as the one tube assay minimises the risk of cross-contamination as no transfer of content have to be made and it is regarded to be as sensitive as the two-step method.
Alternatívne sa môže použiť táto metóda na sekvenovanie HPR v segmente 6:
The primers and assay described in this point, namely the ILA1 or ILA2 primer pair that target segment 8 and which have been found suitable for detection of ISAV in outbreaks and in carrier fish, shall be used.
Priamy primer: 5′-GAC-CAG-ACA-AGC-TTA-GGT-AAC-ACA-GA-3′;
The ILA2 reverse primer does not match isolates from North America and an alternative primer set shall be used in those cases.
Reverzný primer: 5′-GAT-GGT-GGA-ATT-CTA-CCT-CTA-GAC-TTG-TA-3′;.
Forward primer (ILA1): 5′-GGCTATCTACCATGAACGAATC-3′;
Veľkosť produktu: 304 nt v prípade HPR0.
Reverse primer (ILA2): 5′-GCCAAGTGTAAGTAGCACTCC-3′.
Môžu sa použiť aj skúšky RT-PCR s podobnou citlivosťou a osobitosťami, ako má skúška opísaná v tomto bode.
Cycling conditions: one cycle of 50 °C for 30 minutes, 1 cycle of 94 °C for 15 minutes, 40 cycles of 94 °C for 30 seconds, 55 °C for 30 seconds, 72 °C for 60 seconds; one cycle of 72 °C for 5 min.
Pred sekvenovaním sa skontroluje čistota amplifikovaného produktu RT-PCR pomocou gélovej elektroforézy.
Product size 155 bp.
Ak sa objaví len jeden čistý fragment, purifikuje sa priamo z reakcie PCR.
However, other RT-PCR versions of proven similar efficacy may be used instead.
Ak je prítomných viacero amplifikovaných fragmentov, fragment, ktorý je predmetom záujmu, sa purifikuje gélovou elektroforézou.
RT-qPCR for ISAV detection
Purifikácia fragmentov PCR od roztokov alebo agarózových gélov sa uskutoční s použitím centrifugačných kolón s afinitou k PCR fragmentu, podľa pokynov výrobcu.
The use of RT-qPCR may increase specificity and probably also sensitivity.
Sekvenovanie sa vykonáva použitím amplifikovaných primerov v externých spoločnostiach špecializovaných na sekvenovanie.
The method can be performed more rapidly as no gel electrophoresis step is required and it reduces the risk of cross contamination as it is possible to estimate the amount of viral genomic RNA within the sample tube.
Výsledky sekvenovania sa analyzujú nástrojom vyhľadávania BLAST a sekvencie sa porovnávajú s ostatnými známymi sekvenciami v databáze nukleotidov národného centra USA pre biotechnologické informácie (US National Centre for Biotechnical Information – NCBI).
A drawback of the RT-qPCR assay is that it is often not possible to sequence amplified products.
Sekvenovaním sa musí odstrániť akákoľvek pochybnosť o špecifickosti amplifikovaného produktu RT-PCR.
However, if there is doubt on the specificity of the amplified product, another ISAV specific assay must be run to verify the result.
Izolácia ISAV na bunkových kultúrach
The assay described in this point, which is an assay that target segment 8, shall be used.
Príprava vzoriek
This assay shall cover isolates from the European Union, the European Free Trade Association and North America.
Tkanivo sa môže uchovávať pri teplote – 80 °C.
The one-step method shall be used where possible, because the one tube assay minimises the risk of cross-contamination.
Tkanivo sa pred vyšetrením zmrazí a rozmrazí iba raz.
Forward primer: 5′- CTACACAGCAGGATGCAGATGT -3′;
Na účely dohľadu a kontroly sa vyšetrenie uskutoční čo najskôr.
Reverse primer: 5′- CAGGATGCCGGAAGTCGAT -3′;
Každá vzorka (zmes tkaniva v prepravnom roztoku) sa úplne homogenizuje použitím validovaného homogenizátora, centrifuguje sa pri 2000 až 4000 × g počas 15 minút pri teplote 0 až 6 °C a supernatant sa filtruje (0,45 μm) a inkubuje rovnakým objemom zmesi vhodne zriedeného antiséra proti indigénnym sérotypom IPNV.
and probe: 5′-FAM- CATCGTCGCTGCAGTTC – MGBNFQ-3′.
Titer antiséra musí byť aspoň 1:2000 v 50 % plakovom neutralizačnom teste.
Cycling conditions: one cycle of 50 °C for 30 minutes, one cycle of 95 °C for 15 minutes, 40 cycles of 94 °C for 15 seconds, 60 °C for 60 seconds; it shall be adjusted if necessary.
Zmes sa inkubuje počas jednej hodiny pri teplote 15 °C.
Sequencing of amplified PCR products
To prestavuje inokulum.