natgillin/translations-raw huggingface dataset:
The pre-incubated cells are removed from the incubator (paragraph 21) and checked under a microscope to assure that they are in good condition (attachment, morphology) prior to dosing.
Keď sa životaschopnosť/cytotoxicita buniek nemeria ihneď, do každej bunky sa pridá 200 μl fosfátovo tlmivého roztoku s Ca2+ a Mg2+.
The cells are placed in a bio-safety cabinet and the supplemented medium removed and replaced with new supplemented medium (1 ml/well).
Média sa do ďalšieho spracovania na analýzu koncentrácií hormónov zmrazia pri teplote – 80 °C (pozri odseky 44 až 46).
DMSO is the preferred solvent for this test method.
T a E2 v médiu udržiavanom v teplote – 80 °C sú všeobecne síce stabilné najmenej po dobu 3 mesiacov, v každom laboratóriu by sa však mala dokumentovať stabilita hormónov počas skladovania.
However, if there are reasons for using other solvents the scientific rationale should be described.
Ihneď po odstránení média sa určuje životaschopnosť/cytotoxicita buniek pre každú expozičnú platničku.
Cells are exposed to the test chemical by adding 1 μl of the appropriate stock solution in DMSO (see Appendix II to the validation report (4)) per 1 ml supplemented medium (well volume).
Určovanie životaschopnosti buniek
This results in a final concentration of 0,1 % DMSO in the wells.
Zvolená skúška životaschopnosti/cytotoxicity buniek sa môže použiť na určenie potenciálneho vplyvu testovanej chemikálie na životaschopnosť buniek.
To assure adequate mixing it is generally preferred that the appropriate stock solution of the test chemical in DMSO is mixed with supplemented medium to yield the desired final concentration for each dose, and the mixture added to each well immediately after removal of old medium.
Skúška by mala byť schopná poskytnúť pravdivú mieru percentuálneho podielu životaschopných buniek v jamke alebo by mala preukázať, že je priamo porovnateľná (lineárna funkcia) so skúškou Live/Dead® [pozri dodatok č. III k validačnej správe (4)].
If this option is used, the concentration of DMSO (0,1 %) should remain consistent among all wells.
Iná skúška, ktorá preukázateľne funguje rovnako dobre, je test MTT [3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyl tetrazolium bromid] (18).
The wells containing the greatest two concentrations are visually assessed for formation of precipitates or cloudiness as an indication of incomplete solubility of the test chemical by using a stereo microscope.
Posúdenie životaschopnosti buniek s použitím uvedených metód je relatívne meranie, ktoré nemusí preukázať lineárne vzťahy s absolútnym počtom buniek v jamke.
If such conditions (cloudiness, formation precipitates) are observed, wells containing the next lesser concentrations are examined as well (and so forth) and concentrations that did not completely go into solution are to be excluded from further evaluation and analysis.
Preto by analytik mal vizuálne subjektívne, paralelne posúdiť každú jamku a mali by sa digitálne odfotografovať kontroly s aplikáciou rozpúšťadla a dve najväčšie necytotoxické koncentrácie, ktoré sa zaarchivujú na neskoršie posúdenie skutočnej hustoty buniek, ak by to bolo potrebné.
The plate is returned to the incubator at 37 °C under a 5 % CO2 in air atmosphere for 48 hours.
Ak by z vizuálneho preskúmania alebo zo skúšky životaschopnosti/cytotoxicity vyplynulo zdanlivé zvýšenie počtu buniek, musí sa toto zvýšenie overiť.
The test chemical plate layout is shown in Table 6.
V prípade, že sa zvýšenie buniek overí, malo by sa to uviesť v protokole z testu.
Stocks 1 -7 show placement of increasing doses of test chemical.
Životaschopnosť buniek sa vyjadruje pomerne k priemernej reakcii v kontrolách s aplikáciou rozpúšťadla, ktorá sa považuje za 100 % životaschopných buniek, a vypočítava sa náležite pre použitú skúšku životaschopnosti/cytotoxicity buniek.
Table 6
V prípade skúšky MTT sa môže použiť tento vzorec:
Dosing schematic for the exposure of H295R cells to test chemicals in a 24 well plate
% životaschopných buniek = [reakcia v jamke – priemerná reakcia v jamkách s MeOH (= 100 % mŕtvych)] ÷ [priemerná reakcia v jamkách SC – priemerná reakcia v jamkách s MeOH (= 100 % mŕtvych)]
Stock 4
Jamky so životaschopnosťou nižšou ako 80 % v pomere k priemernej životaschopnosti v kontrolách s aplikáciou rozpúšťadla (= 100 % životaschopnosť) by sa nemali zahrnúť do konečnej analýzy údajov.
Stock 1
Inhibícia steroidogenézy vyskytujúcej sa v prítomnosti takmer 20 % cytotoxicity by sa mala hodnotiť opatrne, aby sa zabezpečilo, že príčinou inhibície nie je cytotoxicita.
Stock1
Analýza hormónov
Stock 5
Každé laboratórium môže na analýzu T a E2 použiť systém merania hormónov podľa vlastného výberu.
Stock 2
Náhradné alikvotné časti média z každej pokusnej skupiny sa môžu použiť na prípravu roztokov tak, aby sa koncentrácia dostala do lineárnej časti štandardnej krivky.
Stock 6
Ako sa uvádza v odseku 29, každé laboratórium by malo pred vykonaním kontroly kvality alebo testovania chemikálií preukázať súlad svojho systému merania hormónov (napr. ELISA, RIA, LC-MS, LC-MS/MS) s kritériami kontroly kvality analýzou obohateného média s pridanou vnútornou kontrolnou vzorkou hormónov.
Stock 3
Aby zložky testovacieho systému nenarúšali meranie hormónov, hormóny bude možno potrebné pred ich meraním extrahovať z média (pozri odsek 30, v ktorom sa uvádzajú podmienky, za ktorých sa extrakcia vyžaduje alebo nevyžaduje).
Stock 7
Odporúča sa vykonať extrakciu podľa postupov uvedených v dodatku č. III k validačnej správe (4).
After 48 hours the exposure plates are removed from the incubator and every well is checked under the microscope for cell condition (attachment, morphology, degree of confluence) and signs of cytotoxicity.
Ak sa na meranie produkcie hormónov používa komerčná testovacia súprava, analýza hormónov by sa mala vykonať podľa popisu v príručkách výrobcu testovacej súpravy.
The medium from each well is split into two equal amounts (approximately 490 μl each) and transferred to two separate vials appropriately labelled (i.e. one aliquot to provide a spare sample for each well).
Väčšina výrobcov má špecifický postup, akým sa vykonávajú analýzy hormónov.
To prevent cells from drying out, medium is removed a row or column at a time and replaced with the medium for the cell viability/cytotoxicity assay.
Riedenia vzoriek sa upravia tak, aby sa očakávané koncentrácie hormónov kontrol s aplikáciou rozpúšťadla pohybovali v strede lineárnej časti štandardnej krivky individuálnej skúšky [dodatok č. III k validačnej správe (4)].
If cell viability/cytotoxicity is not to be measured immediately, 200 μl PBS with Ca2+ and Mg2+ is added to each well.
Hodnoty mimo lineárnej časti štandardnej krivky sa zavrhnú.
The media are frozen at – 80 °C until further processing to analyse hormone concentrations (see paragraphs 44-46).
Konečné koncentrácie hormónov sa vypočítavajú takto:
While T and E2 in medium kept at – 80 °C are generally stable for at least 3 months, hormone stability during storage should be documented within each laboratory.
Príklad:
Immediately after removing the medium, cell viability/cytotoxicity is determined for each exposure plate.
Extrahované:
Cell Viability Determination
450 μl média
A cell viability/cytotoxicity assay of choice can be used to determine the potential impact of the test chemical on cell viability.
Rekonštituované v:
The assay should be able to provide a true measure of the percentage of viable cells present in a well, or it should be demonstrated that it is directly comparable to (a linear function of) the Live/Dead® Assay (see Appendix III to the validation report (4)).
250 μl tlmivého roztoku
An alternative assay that has been shown to work equally well is the MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] test (18).
Testovacie riedenie:
The assessment of cell viability using the above methods is a relative measurement that does not necessarily exhibit linear relationships with the absolute number of cells in a well.
1:10 (aby bola vzorka v lineárnej časti štandardnej krivky)
Therefore, a subjective parallel visual assessment of each well by the analyst should be conducted, and digital pictures of the SCs and the two greatest non-cytotoxic concentrations are to be taken and archived to enable later assessment of true cell density if this should be required.
Testovacia koncentrácia hormónov:
If by visual inspection or as demonstrated by the viability/cytotoxicity assay there appears to be an increase in cell number, the apparent increase needs to be verified.
150 pg/ml (už upravená na koncentráciu na ml testovanej vzorky)
If an increase in cell numbers is verified, this should be stated in the test report.
Výťažnosť:
Cell viability will be expressed relative to the average response in the SCs, which is considered 100 % viable cells, and is calculated as appropriate for the cell viability/cytotoxicity assay that is used.
Konečná koncentrácia hormónov =
For the MTT assay, the following formula may be used:
[Koncentrácia hormónov (na ml) ÷ výťažnosť] (faktor riedenia)
% viable cells = (response in well – average response in MeOH treated [= 100 % dead] wells) ÷ (average response in SC wells – average response in MeOH treated [= 100 % dead] wells)
(150 pg/ml) ÷ (0,89) × (250 μl/450 μl) × 10 = 936,3 pg/ml
Wells with viability lower than 80 %, relative to the average viability in the SCs (= 100 % viability), should not be included in the final data analysis.
Výber testovacích koncentrácií
Inhibition of steroidogenesis occurring in the presence of almost 20 % cytotoxicity should be carefully evaluated to ensure that cytotoxicity is not the cause for the inhibition.
Skúška by sa mala nezávisle vykonať minimálne dvakrát.
Hormone Analysis
Ak sú výsledky prvého pokusu nejednoznačné (t. j. násobná zmena je štatisticky významná z kontroly s aplikáciou rozpúšťadla len v jednej koncentrácii) alebo pozitívna (t. j. násobná zmena v dvoch alebo viacerých hraničiacich koncentráciách je štatisticky významná), test by sa mal opakovať, ako sa uvádza v tabuľke 7, upravením zvolených testovacích koncentrácií.
Each laboratory can use a hormone measurement system of its choice for the analysis of T and E2.
Testovacie koncentrácie v druhom a treťom (v náležitých prípadoch) pokuse by sa mali upraviť na základe výsledkov koncentrácií z prvého pokusu, ktoré vyvolali účinok s použitím intervalov koncentrácií v intervaloch 1/2-log (napr. ak výsledkom pôvodného pokusu s 0,001; 0,01; 0,1; 1; 10; 100; 1000 μM boli indukcie pri 1 a 10 μM, koncentrácie testované pri druhom pokuse by mali byť 0,1; 0,3; 1; 3; 10; 30; 100 μM), pokiaľ sa nemusia použiť nižšie koncentrácie na dosiahnutie LOEC.
Spare aliquots of medium from each treatment group may be used to prepare dilutions to bring the concentration within the linear part of the standard curve.
V druhom prípade by sa v druhom pokuse s použitím 1/2-log stupnice malo použiť najmenej päť koncentrácií menších ako najnižšia koncentrácia testovaná v prvom pokuse.
As noted in paragraph 29, each laboratory should demonstrate the conformance of their hormone measurement system (e.g. ELISA, RIA, LC-MS, LC-MS/MS) with the QC criteria by analysing supplemented medium spiked with an internal hormone control prior to conducting QC runs or testing of chemicals.
Ak sa v druhom pokuse nepotvrdí prvý pokus (t. j. nenastane štatistická významnosť pri predtým pozitívne testovanej koncentrácii ± 1 zvýšenie koncentrácie), vykoná sa tretí pokus s použitím pôvodných testovacích podmienok.
In order to ensure that the components of the test system do not interfere with measurement of hormones, the hormones may need to be extracted from the media prior to their measurement (see paragraph 30 for the conditions under which an extraction is or is not required).
Nejednoznačné výsledky z prvého pokusu sa považujú za negatívne, ak v žiadnom z ďalších dvoch pokusov nie je možné potvrdiť spozorovaný účinok.
It is recommended to conduct extraction following the procedures in Appendix III to the validation report (4).
Nejednoznačné výsledky sa považujú za pozitívne reakcie (účinok), keď reakciu možno potvrdiť najmenej v jednom ďalšom pokuse so zvýšením koncentrácie ± 1 (pozri oddiel 55 pre postup interpretácie údajov).
If a commercial test kit is being used to measure the hormone production, the hormone analysis should be conducted as specified in the manuals provided by the test kit manufacturer.
Tabuľka 7
Most manufacturers have a unique procedure by which the hormone analyses are conducted.
Rozhodovacia matica pre možné výsledné scenáre
Dilutions of samples need to be adjusted such that expected hormone concentrations for the solvent controls fall within the centre of the linear range of the standard curve of the individual assay (Appendix III to the validation report (4)).
pokus 1
Values outside of the linear portion of the standard curve should be rejected.
pokus 2
Example:
rozhodnutie
Extracted:
scenár
450 μl medium
pozitívne
Reconstituted in:
potvrdené [26]
250 μl assay buffer
ukončenie
Dilution in Assay:
upraviť [27]
1:10 (to bring the sample within the linear range of the standard curve)
nejednoznačné [28]
Hormone Concentration in Assay:
Kvalita kontroly testovacej platničky
150 pg/ml (already adjusted to concentration per ml sample assayed)
Okrem splnenia kritérií pre platničku na kontrolu kvality treba splniť ďalšie kritériá kvality, ktoré sa týkajú prijateľnej variability medzi replikovanými jamkami, opakovanými pokusmi, linearitou a citlivosťou systémov merania hormónov, variabilitou medzi opakovanými meraniami hormónov rovnakej vzorky a percentom výťažnosti vrcholov hormónov po extrakcii média (v náležitých prípadoch; pozri odsek 30 pre požiadavky na extrakciu) a ktoré sa uvádzajú v tabuľke 8.
Recovery:
Údaje by sa mali pohybovať v rámci prijateľných rozsahov vymedzených pre každý parameter, ktorý sa posudzuje na ďalšie hodnotenie.
Final hormone concentration =
Ak tieto kritériá nie sú splnené, v pracovnom hárku treba poznamenať, že kritériá kontroly kvality neboli u predmetnej vzorky splnené, a vzorka by sa mala opäť analyzovať alebo vyradiť zo súboru údajov.
(Hormone concentration (per ml) ÷ recovery) (dilution factor)
Tabuľka 8
(150 pg/ml) ÷ (0,89) × (250 μl/450 μl) × 10 = 936,3 pg/ml
Prijateľné rozsahy a/alebo variabilita (%) pre parametre testovacej platničky skúšky H295R
Selection of test concentrations
(LOQ: limit kvantifikácie systému merania hormónov.
A minimum of two independent runs of the assay should be conducted.
CV: variačný koeficient; SC: kontrola s aplikáciou rozpúšťadla; DPM: dezintegrácia za minútu)
Unless prior information such as information on solubility limits or cytotoxicity provides a basis for selecting test concentrations, it is recommended that the test concentrations for the initial run be spaced at log10 intervals with 10–3 M being the maximum concentration.
Porovnanie medzi
If the chemical is soluble, and not cytotoxic at any of the tested concentrations, and the first run was negative for all concentrations, then it is to be confirmed in one more run using the same conditions as the first run was conducted (Table 7).
Základná produkcia hormónov v SC
If the results of the first run are equivocal (i.e. the fold-change is statistically significant from the SC at only one concentration) or positive (i.e. the fold change at two or more adjacent concentrations is statistically significant), the test should be repeated as indicated in Table 7 by refining the selected test concentrations.
Násobne väčšia ako LOQ
Test concentrations in runs two and three (if applicable) should be adjusted on the basis of the results of the initial run bracketing concentrations that elicited an effect using 1/2-log concentration spacing (e.g. if the original run of 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100, 1000 μM resulted in inductions at 1 and 10 μM, the concentrations tested in the second run should be 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 μM), unless lower concentrations need to be employed to achieve a LOEC.
≥ 5-násobne
In the latter case, at least five concentrations below the lowest concentration tested in the first run should be used in the second run using a 1/2-log scale.
≥ 2,5-násobne
If the second run does not confirm the first run (i.e. statistical significance does not occur at the previously positively tested Live/Deadconcentration ± 1 concentration-increment), a third experiment is to be conducted using the original testing conditions.
Expozičné pokusy – CV v rámci platničky pre SC (replikované jamky)
Equivocal results in the first run are considered negative if the observed effect could not be confirmed in any of the two subsequent runs.
Absolútne koncentrácie
Equivocal results are considered as positive responses (effect) when the response can be confirmed in at least one more run within a ± 1 concentration increment (see section 55 for the Data Interpretation Procedure).
Expozičné pokusy – CV medzi platničkami pre SC (opakované pokusy)
Table 7
Násobná zmena
Decision matrix for possible outcome scenarios
Systém merania hormónov – citlivosť
Run 1
Zistiteľné násobné zníženie v pomere k SC
Run 2
Systém merania hormónov – CV opakovaného merania pre SC [29]
Run 3
Extrakcia média – výťažnosť vnútorného štandardu 3H (v náležitých prípadoch)
Decision
≥ 65 % nominálne
Scenario
ANALÝZA ÚDAJOV A PODÁVANIE SPRÁV
Positive
Analýza údajov
Confirm [26]
Na hodnotenie relatívneho zvýšenia/zníženia chemicky zmenenej produkcie hormónov by sa výsledky mali normalizovať na strednú hodnotu SC každej testovacej platničky a výsledky by sa mali vyjadriť ako zmeny v pomere k SC na každej testovacej platničke.
Stop
Všetky údaje sa vyjadria ako stredná hodnota ± 1 štandardná odchýlka (SD).
Refine [27]
Do analýzy údajov by sa mali začleniť len údaje o hormónoch z jamiek, v ktorých bola cytotoxicita menšia ako 20 %.
Equivocal [28]
Relatívne zmeny by sa mali vypočítavať takto:
Quality Control of the Test Plate
Relatívna zmena = (koncentrácia hormónov v každej jamke) ÷ (stredná koncentrácia hormónov vo všetkých jamkách na kontrolu s aplikáciou rozpúšťadla).
In addition to meeting the criteria for the QC plate, other quality criteria that pertain to acceptable variation between replicate wells, replicate experiments, linearity and sensitivity of hormone measurement systems, variability between replicate hormone measures of the same sample, and percentage recovery of hormone spikes after extraction of medium (if applicable; see Paragraph 30 regarding extraction requirements) should be met and are provided in Table 8.
Ak by z vizuálneho preskúmania jamky alebo zo skúšky životaschopnosti/cytotoxicity popísanej v odseku 42 vyplynulo zdanlivé zvýšenie počtu buniek, musí sa toto zvýšenie overiť.
Data should fall within the acceptable ranges defined for each parameter to be considered for further evaluation.
Pred vykonaním štatistických analýz by sa mali posúdiť predpoklady normality a homogénnosti odchýlok.
Table 8
Ak údaje (násobné zmeny) nie sú normálne distribuované, malo by sa usilovať o transformáciu údajov na priblíženie sa normálnej distribúcii.
Acceptable ranges and/or variation (%) for H295R assay test plate parameters.
Ak sú údaje normálne distribuované alebo sa blížia normálnej distribúcii, rozdiely medzi skupinami koncentrácií chemikálií a kontrolami s aplikáciou rozpúšťadla by sa mali analyzovať s použitím parametrického testu (napr. Dunnettov test), pričom koncentrácia je nezávislá premenná a reakcia (násobná zmena) je závislá premenná.
(LOQ: Limit of Quantification of the hormone measurement system.
Ak údaje nie sú normálne distribuované, mal by sa použiť vhodný neparametrický test (napr. Kruskalov Wallisov test, test Steela Many-one rank).
CV: Coefficient of variation; SC: Solvent Control; DPM: Disintegrations per minute)
Rozdiely sa považujú za významné, ak je p ≤ 0,05.
Comparison Between
Štatistické vyhodnotenia sa vykonávajú na základe priemerných hodnôt pre každú jamku, ktoré predstavujú nezávislé opakované dátové body.
Basal hormone production in SCs
Predpokladá sa, že pre veľké odstupy medzi dávkami v prvom pokuse (stupnica log10) nebude v mnohých prípadoch možné popísať jasné vzťahy medzi koncentráciou a reakciou, keď najväčšie dve dávky budú v lineárnej časti esovitej krivky.
Fold-greater than LOQ
Preto sa v prípade prvého pokusu alebo iných súborov údajov, kde sa vyskytuje tento stav (napr. keď nemožno odhadnúť maximálnu účinnosť), použije štatistika pevnej premennej typu I, ako sa už opísalo.
≥ 5-fold
Ak v lineárnej časti krivky ležia viac ako dva dátové body a keď možno vypočítať maximálne účinnosti – ako sa predpokladá pre niektoré z druhých pokusov, ktoré sa vykonali s použitím polologaritmických rozostupov medzi expozičnými koncentráciami –, mal by sa na výpočet účinných koncentrácií (napr. EC50 a EC20) použiť probitový, logitový alebo iný vhodný regresný model.
≥ 2,5-fold
Pokus sa považuje za nezávislý, ak sa vykonal v iný deň s použitím nového súboru roztokov a kontrol.
Exposure Experiments — Within Plate CV for SCs (Replicate Wells)
Rozpätie koncentrácií použitých v druhých a tretích pokusoch (ak boli potrebné) sa môže prispôsobiť na základe výsledkov prvého pokusu, aby bol lepšie vymedzený rozsah pre vzťah medzi dávkou a reakciou s LOEC (pozri odsek 47).
Absolute Concentrations
Obrázok č. 3
Exposure Experiments — Between Plate CV for SCs (Replicate Experiments)
Príklad prezentácie a hodnotenia údajov získaných počas vykonania skúšky H295R v grafickom a tabuľkovom formáte.
Fold-Change
Hviezdičky označujú štatisticky významné rozdiely v porovnaní s kontrolou s aplikáciou rozpúšťadla (p< 0,05).
Hormone Measurement System — Sensitivity
najnižšia koncentrácia s pozorovaným účinkom;
Detectable fold-decrease relative to SC
maximálna zmena:
Hormone Measurement System — Replicate Measure CV for SCs [29]
maximálna sila reakcie pozorovanej pri akejkoľvek koncentrácii v pomere k priemernej reakcii SC (= 1)
Medium Extraction — Recovery of Internal 3H Standard (If Applicable)
Pregnenolón
DPM
OH Pregnenolón
≥ 65 % Nominal
Progesterón
To evaluate the relative increase/decrease in chemically altered hormone production, the results should be normalised to the mean SC value of each test plate, and results expressed as changes relative to the SC in each test plate.
Testosterón Estrón
All data are to be expressed as mean ± 1 standard deviation (SD).
eoxykortikosterón
Only hormone data from wells where cytotoxicity was less than 20 % should be included in the data analysis.
Deoxykortizol
Relative changes should be calculated as follows:
Kortikosterón
Relative Change = (Hormone concentration in each well) ÷ (Mean hormone concentration in all solvent control well).
Kortizol
If by visual inspection of the well or as demonstrated by the viability/cytotoxicity assay described in paragraph 42 there appears to be an increase in cell number, the apparent increase needs to be verified.
Aldosterón
Prior to conducting statistical analyses, the assumptions of normality and variance homogeneity should be evaluated.
Chemikália
Normality should be evaluated using standard probability plots or other appropriate statistical method (e.g. Shapiro-Wilk's test).
Maximálna zmena
If the data are normally distributed or approximate a normal distribution, differences between chemical concentration groups and SCs should be analysed using a parametric test (e.g. Dunnett's Test) with concentration being the independent, and response (fold-change) being the dependent variable.
Letrozol
If data are not normally distributed, an appropriate non-parametric test should be used (e.g. Kruskal Wallis, Steel's Many-one rank test).
ásobná
Differences are considered significant at p ≤ 0,05.
Postup interpretácie údajov
Statistical evaluations are done based on average values for each well that represent independent replicate data points.
Testovaná chemikália sa považuje za pozitívnu, ak je násobná indukcia štatisticky odlišná (p ≤ 0,05) od kontroly s aplikáciou rozpúšťadla pri dvoch hraničiacich koncentráciách v najmenej dvoch nezávislých pokusoch (tabuľka č. 7).